TWI570136B

TWI570136B - Peptides with potent analgesic effects and their use

Info

Publication number: TWI570136B
Application number: TW102118254A
Authority: TW
Inventors: Chenlung Lin
Original assignee: Well Resources Ltd
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2017-02-11
Also published as: AU2012380940A1; EP2855506A1; KR101853254B1; TW201615657A; HUE033389T2; US9422336B2; US20170196947A1; JP6097824B2; AU2012380940B2; KR20150018835A; JP2015519341A; TWI549969B; NZ702151A; CA2874258C; US20150218214A1; US9839666B2; TW201402615A; PL2855506T3; PT2855506T; CN104321337B

Description

具強效鎮痛作用之肽及其用途

本發明涉及蛋白質鑑定和藥學領域。特別地，它涉及具有強效鎮痛作用和抗流感病毒作用的天然肽、編碼其的多核苷酸、其製備及用途和含有該肽的藥物組成物。

疼痛是通常由強烈或損害性刺激引起的不愉快的感覺。國際疼痛研究協會(International Association for the Study of Pain)將「疼痛」廣泛定義為『與實際或潛在組織損害相關的或根據此類損害描述的不愉快的感覺和情緒體驗』(Pain 1979；6：247-8)。疼痛是美國醫生會診的最常見原因(Raj PP.Taxonomy and classification of pain.In：Niv D，Kreitler S，Diego B，Lamberto A.The Handbook of Chronic Pain.Nova Biomedical Books 2007)。它是許多醫學病況中的主要症狀，並且可以顯著干擾個人的生活品質和一般功能(Breivik H，Borchgrevink PC，Allen SM，Rosseland LA，Romundstad L，Hals EK，Kvarstein G，Stubhaug A.Assessment of pain.Br J Anaesth.2008；101(1)：17-24)。在大多數情況下，疼痛通常是短暫的，僅持續直到傷害性刺激被去除或潛在損害或病理現象已痊癒。然而，一些疼痛病況例如類風濕性關節炎、周圍神經病變、癌症和特發性疼痛可以持續數年。持續長時間的疼痛被稱為「慢性的」，並且快速消退的疼痛被稱為「急性的」。常規地，在急性和慢性疼痛之間的區別以從發作開始的無固定的間期(arbitrary interval)判定；兩個最常用的標記是自疼痛發作以後3個月和6個月(Turk DC，Okifuji A.Pain terms and taxonomies of pain.In：Bonica JJ，Loeser JD，Chapman CR，Turk DC，Butler SH.Bonica's management of pain.Hagerstwon，MD：Lippincott Williams & Wilkins；2001)，惟一些研究者已將從急性到慢性疼痛的轉換設定為12個月(Spanswick CC，Main CJ.Pain management：an interdisciplinary approach.Edinburgh：Churchill Livingstone 2000)。其他人將「急性」適用於持續少於30天的疼痛，「慢性」適用於超過6個月的疼痛，以及「亞急性」適用於持續一到六個月的疼痛(Thienhaus O，Cole BE.Classification of pain.In：Weiner R.Pain management：a practical guide for clinicians.Boca Raton：CRC Press；2002)。

在人中，外周疼痛(peripheral pain)的察覺在游離神經末梢開始。多型疼痛受體和高閾值機械感受器(mechanoreceptors)察覺傷害性刺激例如強機械力、H⁺、K⁺、化學物質和溫度。在察覺刺激後，疼痛的知覺從外周傳送到脊髓(即脊髓丘腦束)，隨後在對側上行前經由前白質連合(anterior white commissure，在脊髓中)交叉且穿過(decussate and cross)。在達到腦前，脊髓丘腦束分成橫向新脊髓丘腦束和中間舊脊髓丘腦束(Skevington，S.M.Psychology of pain.Chichester，UK：Wile 1995；第18頁)，隨後在丘腦的腹後外側核終止，在其中它們在軀體感覺皮質的樹突上形成突觸。除了引起疼痛的傷害性刺激外，對於人的外周神經的損傷通常導致持續性神經性疼痛病況，其特徵在於自發地、通常為灼痛、異常性疼痛(對於非傷害性刺激的疼痛反應)和痛覺過敏(對於傷害性刺激過大的疼痛反應)。儘管交感神經阻滯療法有時對於疼痛緩解是有效的，指示神經性疼痛至少部分藉由交感神經系統中的活性維持，但許多患者無反應。類鴉片類對於神經病理性疼痛的有效性也是有限的(Rowbotham MC.Ann Neurol 1994；35：S46-S49)，並且存在一些爭論。

急性疼痛通常用藥物例如鎮痛藥和麻醉藥進行控制。然而，慢性疼痛或神經性疼痛的控制困難得多。許多藥物幫助緩解急性疼痛，並且一般而言，它們可以分成非類鴉片類和類鴉片類藥物。非類鴉片類藥物包括非類固醇抗炎藥(NSAID)例如乙醯水楊酸(阿司匹林)和COX-2(環氧化酶-2)抑制劑。在NSAID中的術語『非類固醇』用於區分這些藥物與類固醇，其在廣泛範圍的其他效應中具有類似的類花生酸抑制、抗炎作用。作為鎮痛藥，NSAID 是罕見的，因為它們是非麻醉藥。NSAID通常適應症為用於治療其中存在疼痛和炎症的急性或慢性病況。

阿司匹林通常用作鎮痛藥以緩解較小病痛和疼痛，用作解熱藥以減輕發熱，或用作抗炎藥物。阿司匹林對於遲鈍的搏動性疼痛作用良好，但它對於由大多數肌肉痙攣、脹氣(bloating)、內臟膨脹(visceral distension)和急性皮膚刺激引起的疼痛是無效的。作為手術後止痛藥，阿司匹林次於一種NSAID--布洛芬，並且具有更高的胃腸道毒性。此外，阿司匹林也具有許多禁忌和不希望的效應；例如，阿司匹林的使用在患有消化性潰瘍、輕度糖尿病或胃炎的人中需要謹慎。即使不存在這些病況中的任何一個，仍存在胃出血的增加危險。NSAID的其他種類是COX-2選擇性抑制劑，其直接靶向COX-2--負責炎症和疼痛的酶。關於COX-2的靶向選擇性減少消化性潰瘍的危險，並且是塞來考昔、羅非昔布和這類藥物的其他成員的主要特點。COX-2抑制劑也具有不良作用，最主要是腎衰竭的危險增加，並且一些結果已顯示藉由血栓素的相對增加在心臟病發作、血栓形成和中風的危險中的增加。值得注意的是，羅非昔布(通常稱為萬絡)由於這些考慮在2004年下市。

鎮痛藥的可替代種類是類鴉片類藥物。類鴉片類是藉由與類鴉片類受體結合起作用的影響精神的化學物質，該類鴉片類受體主要在中樞和外周神經系統和胃腸道中發現。這些器官系統中的受體介導類鴉片類的有利作用和副作用。阿片類的鎮痛作用是由於疼痛的感覺減少、對於疼痛的反應減少以及增加的疼痛耐受。類鴉片類已長期用於治療急性疼痛(例如手術後疼痛)，並且在安寧照護中在減輕晚期病況例如癌症和變性病況例如類風濕性關節炎的嚴重、慢性、傷殘性疼痛上是極其重要的。然而，類鴉片類應非常謹慎地用於慢性非癌症疼痛中。不一定需要高劑量以控制晚期或終末期疾病的疼痛。耐受(使得生物體對鎮痛和其他作用更少反應的身體反應)非常可能發生，使得類鴉片類成為用於疼痛控制的最後選擇。

根據上文討論，明確的是存在開發新類別的有效非耐受性和非鎮靜性鎮痛藥用於控制嚴重急性疼痛和慢性疼痛的迫切需要。

從具有由病毒痘苗病毒(Vaccinia variolae)接種引起的炎症的兔的皮膚組織中提取的生物活性劑的混合物，其含有針對激肽釋放酶-激肽系統的抑制劑，已用於治療疼痛數十年(K.Ono，A.Inoue和M.Nakamuro.Jpn Pharmacol Ther，1981；9：299-307)。藥理學和臨床實驗顯示由兔的皮膚製備的生物活性劑的此類混合物針對所有種類的有症狀的神經痛；腰痛；膽絞痛(cholecystagia)；咽痛；動脈栓塞疼痛；創傷、燒傷和燙傷引起的急性疼痛；手術中或手術後疼痛；消化性潰瘍痛；痛經；分娩後的陣痛；頭痛；由多種腫瘤誘發的疼痛等等具有鎮痛作用。研究還顯示生物活性劑的這種混合物可以有效促進巨噬細胞的啟動，顯著抑制II型過敏反應(allergic reaction)中的抗補體活性。該效應與劑量具有線性相關。因此該藥物對抑制與免疫關聯的炎症反應和改善免疫功能具有作用。此外，在大鼠中連續28天腹膜內施用由兔的皮膚製備的藥物後，沒有大鼠死亡且在尿、眼、血液生物化學、病理學和解剖學檢查中沒有由藥物誘發的變化。因此，此類鎮痛藥物具有很少的毒性作用(參見美國專利公開號：20110003009)。然而，儘管關於藥物設計和藥物開發的肽研究是新藥開發中最有希望的領域之一，但不存在這個領域中的研究者集中於尋找混合物中的活性蛋白質成分的報導，即使此類混合物已進入市場數十年且具有用於止痛的良好作用。因此，一種或多種活性成分的鑑定將幫助理解一種或多種作用機制，並且負責鎮痛作用的確切組分的純化將促進用於臨床使用的充分描述的(well-delineated)一種或多種藥物的製備。

A型流感病毒是病毒的正黏病毒科中的屬。A型流感病毒的所有亞型的毒株已從野生鳥類中分離，儘管疾病是稀有的。A型流感病毒的一些分離物在馴養家禽中和罕見地在人中引起嚴重的疾病("Avian influenza("bird flu")-Fact sheet".WHO.)。偶然地，病毒從野生水鳥傳播到馴養家禽，並且這可能引起暴發或產生人流感流行(Klenk，等人(2008)."Avian Influenza：Molecular Mechanisms of Pathogenesis and Host Range".Animal Viruses：Molecular Biology.Caister Academic Press & Kawaoka Y，ed.(2006).Influenza Virology：Current Topics.Caister Academic Press)。A型流感病毒是反義、單鏈、分段的RNA病毒。存在幾個亞型，根據H數目(關於血凝素類型)和N數目(關於神經胺酸酶類型)命名。存在至少16種不同的H抗原(H1至H16)和九種不同的N抗原(N1至N9)。不同的流感病毒編碼不同的血凝素和神經胺酸酶蛋白質；例如H5N1病毒指定A型(A型)流感亞型，其具有5型血凝素(H)蛋白質和1型神經胺酸酶(N)蛋白質。此外，每個病毒亞型已突變成具有不同致病情況的多個毒株(virulent strain)；一些對於一個物種是致病的但對於其他不是，並且一些對於多個物種是致病的。理論上，這些蛋白質的144個不同組合是可能的("Influenza Viruses".Centers for Disease Control and Prevention.2005年11月18日)。一些變異株經鑑定且根據它們類似的分離株，因此推測為共同譜系(例子：福建類流行感冒病毒(Fujian flu virus-like))，根據其一般宿主(例子：人流行感冒病毒)，根據其亞型(例子：H3N2)以及根據其致命性(例子：LP，低致病性)進行命名。因此，來自類似於分離株A/福建/411/2002(H3N2)的流行感冒被稱為福建流行感冒、人流行感冒或H3N2流行感冒。

『人流感病毒』通常指在人中廣泛傳播的亞型。在所有毒株中，H1N1、H1N2和H3N2是目前在人中傳播的唯一已知的A型流感病毒亞型(CDC，USA：Key Facts About Avian Influenza(Bird Flu)and Avian Influenza A (H5N1)Virus)。關於流感的治療包括回應疾病流感而使用的一系列藥物和療法。治療可以直接靶向流感病毒自身；或相反它們可以僅提供疾病症狀的緩解，而生物體自身的免疫系統作用於從感染恢復(Montalto NJ，Gum KD，Ashley JV(2000)."Updated treatment for influenza A and B".Am Fam Physician 62(11)：2467-76)。針對流感病毒使用的抗病毒藥的兩個主要類別是神經胺酸酶抑制劑，例如紮那米韋和奧司他韋，或病毒M2蛋白質抑制劑例如金剛烷胺和金剛乙胺。如果在感染後不久服用，這些藥物可以減少症狀的嚴重性，並且還可以服用以減少感染危險。然而，已出現對這兩類藥物具有藥物抗性的病毒毒株。如同細菌抗生素抗性的發展，這可以起因於這些藥物的過度使用。例如，基於這些藥物在2009 H1N1「豬流感」神經胺酸酶(NA)獲得達菲抗性(His274Tyr)突變的情況下這些藥物的表現評估，近期研究強調關於增加奧司他韋(達菲)庫存與另外的抗病毒藥物包括紮那米韋(Relenza)的迫切需要，該達菲抗性(His274Tyr)突變目前在季節性H1N1毒株中是普遍的(Venkataramanan Soundararajan，Kannan Tharakaraman，Rahul Raman，S.Raguram，Zachary Shriver，V.Sasisekharan，Ram Sasisekharan(2009)."Extrapolating from sequence-the 2009 H1N1 'swine' influenza virus".Nature Biotechnology 27(6)：510-3)。另一個例子是在金剛烷胺治療的情況下，其可以導致抗性病毒的快速產生，並且這些藥物的過度使用已可能促成抗性的擴展(Lynch JP，Walsh EE(April 2007)."Influenza：evolving strategies in treatment and prevention".Semin Respir Crit Care Med 28(2)：144-58)。

然而，與此同時，在不存在涉及藥物的較多使用的情況下，已出現對於神經胺酸酶抑制劑抗性的少數毒株且傳播，並且藥物抗性毒株隨之出現的頻率顯示與這些藥物的使用量的很少關聯(Lackenby A，Thompson CI，Democratis J(December 2008)."The potential impact of neuraminidase inhibitor resistant influenza".Curr.Opin.Infect.Dis.21(6)：626-38)。實驗室研究也已顯示可能是這些藥物的次最佳劑量作為預防措施的使用促成藥物抗性的發展(Lackenby A，Thompson CI，Democratis J(December 2008)."The potential impact of neuraminidase inhibitor resistant influenza".Curr.Opin.Infect.Dis.21(6)：626-38)。尋找具有效力和更少副作用的更加新的類別的抗流感病毒已成為生物醫學團體的挑戰。

本發明的一個目的是提供SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的鎮痛肽、其變體和衍生物。令人驚訝的是，這種肽還顯示抗A型流感病毒活性。

本發明的另一個目的是提供編碼該肽、其變體和/或衍生物的多核苷酸。

本發明的再另一個目的是提供該肽、其變體和/或衍生物的製備和用途。

在一態樣中，本發明提供了包含SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的分離肽、其保守變體、其活性片段及其活性衍生物。較佳的是，該肽具有SEQ ID NO：5所示胺基酸序列。

在另一態樣中，本發明提供了這樣的分離肽，其與SEQ ID NO：5所示胺基酸序列共用至少50%同源性，例如至少60%同源性、至少70%同源性、至少80%同源性或至少90%同源性，且具有鎮痛和/或抗A型流感病毒活性。

在另一態樣中，本發明提供了這樣的分離肽，其包含與SEQ ID NO：5所示胺基酸序列相比較具有一到七個(例如一、二、三、四、五、六或七個)保守胺基酸置換的胺基酸序列，且具有鎮痛和/或抗A型流感病毒活性。

在另一態樣中，本發明說明書揭示的肽、其變體和/或衍生物藉由化學合成獲得。

在另一態樣中，本發明提供了包含與選自下述的核苷酸序列共用至少50%同源性的核苷酸序列的分離多核苷酸：(a)編碼包含SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的肽、其變體和/或衍生物的核苷酸序列，和(b)與(a)的核苷酸序列互補的多核苷酸；其中該肽、其變體和/或衍生物具有鎮痛和/或抗A型流感病毒活性。

在另一態樣中，本發明提供了分離的多核苷酸，其編碼包含SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的肽。

在另一態樣中，本發明提供了包含上述多核苷酸的載體、和用該載體或多核苷酸轉形的宿主細胞。

在另一態樣中，本發明提供了用於產生具有SEQ ID NO：5所示肽的活性的肽的方法，其包括：(a)在表現條件下培養上述轉形的宿主細胞；(b)從培養物中分離本發明的肽。

在另一態樣中，本發明提供了刺激、促進且拮抗SEQ ID NO：5所示肽活性的化合物。

在另一態樣中，本發明提供了包含有效量的本發明的肽、其變體和/或衍生物、以及藥學可接受的載體的藥物組成物。這種藥物組成物可以用於治療或緩解個體中與疼痛相關的疾病和/或症狀。在本文中，與疼痛相關的疾病和/或症狀包括但不限於選自下述者：所有種類的有症狀的神經痛；腰痛；膽絞痛；咽痛；動脈栓塞疼痛；創傷；燒傷和燙傷引起的急性疼痛；手術中或手術後疼痛；消化性潰瘍痛；痛經；分娩後的陣痛；頭痛；由多種腫瘤誘發的疼痛。這種藥物組成物還可以用於抑制個體中的A型流感病毒活性。A型流感病毒在本文中較佳為選自H5N1和H1N1。

在另一個方面，本公開內容提供了用於治療受試者中與疼痛相關的疾病和/或症狀的方法，該方法包括給個體施用有效量的本文該肽、其變體和/或衍生物。

在另一態樣中，本發明提供了用於抑制個體中的A型流感病毒活性的方法，其中該方法包括給個體施用有效量的本發明的肽、其變體和/或衍生物。

在另一態樣中，本發明提供了本發明的肽、其變體和/或衍生物在製備用於治療或緩解個體中與疼痛相關的疾病和/或症狀的藥物中的用途。

在另一態樣中，本發明提供了本發明的肽、其變體和/或衍生物在製備用於抑制個體中的A型流感病毒活性的藥物中的用途。

本發明的其他態樣根據發明的教示對於技術人員是顯而易見的。

本說明書中提及的所有出版物引用至本文作為參考，其程度與每個個別出版物特別地且個別地指出整體引用作為參考相同，除非另有具體說明。

下述圖舉例說明了實施方式，並且不限制在申請專利範圍中定義的本發明的範圍。

圖1. 用於從由痘苗病毒接種誘發的炎性兔皮膚的粗提取物中篩選肽/小肽水準的鎮痛劑的流程的圖示。

圖2. 一種或多種功能肽的鑑定。顯示了雙倍帶電離子m/z 772.745的MS/MS譜。胺基酸序列SEQ ID NO：5由在y-和b-片段離子系列中的MS差異測定，並且匹配兔α1-抗蛋白酶的殘基1-14。

圖3. 肽5(SEQ ID NO：5)具有優於其他肽的最好的疼痛緩解作用，並且可與1mg嗎啡相比較，如藉由由乙酸的腹膜內注射誘發的疼痛發作的顯著延遲所顯示的(n=6)。註：在肽5相對於肽1、2、3、4或6之間p<0.005；在肽5相對於嗎啡之間p<0.05；和對照：單獨的水。

圖4. 序列SEQ ID NO：5所示的肽5還引起在乙酸注射後30分鐘內總扭體次數的顯著減少(n=6)。註：在肽5相對於肽1、2、3、4或6之間p<0.001；在肽5相對於嗎啡之間p<0.05；對照：單獨的水。

圖5. 肽5具有神經源性起源的強效鎮痛作用。在熱刺激中，用2mg序列SEQ ID NO：5所示的肽5(DEAQETAVSSHEQD)腹膜內注射的處理顯著降低溫度誘發的坐骨神經損傷的肢體疼痛(痛覺過敏)。資料表示為時間(秒)中的平均值±SD。N=6。注：在第5、10或30天時在未處理和處理的受損同側肢體之間**p<0.005(藉由ANOVA)。

圖6. 序列SEQ ID NO：5所示的肽5具有對於含或不含神經損傷的肢體的熱異常性疼痛的有效作用。在機械刺激中，用2mg序列SEQ ID NO：5所示的肽腹膜內注射的處理顯著降低坐骨神經損傷的肢體的熱異常性疼痛。資料表示為von Frey金屬絲(von Frey hair)閾值(以克表示)中的平均SD。N=6/時間點。註：在第5、10或30天時在未處理和處理的損傷同側肢體之間**p<0.005(藉由 ANOVA)。

圖7. 序列SEQ ID NO：5所示的肽5具有在體外抑制H5N1和H1N1病毒複製中的有效作用。將序列SEQ ID NO：5所示的肽5溶解於純水中並且加入(0、0.001、0.01、0.1、1和10μM)單層MDCK細胞中，該MDCK細胞同時由5,000pfu/ml的H5N1(左圖)或H1N1病毒(右圖)的多個毒株感染。在3天後，人工計數噬斑數目，並且針對未處理的對照(即0μM)標準化。

註：

對於A/越南/1194/04(H5N1)：

(1)在無處理和用0.1μM處理之間無統計學意義

(2)在無處理和用1μM處理之間p<0.01

(3)在無處理和用10μM處理之間p<0.001

而對於A/香港/97(H5N1)和A/鵝/台中/Q156/05(H5N1)：

(1)在無處理和用0.1μM處理之間p<0.05

(2)在無處理和用1μM處理之間p<0.005

(3)在無處理和用10μM處理之間p<0.001

對於大範圍流行的H1N1/2009：

(1)在無處理和0.01μM之間無統計學意義

(2)在無處理和用0.1μM處理之間p<0.05

(3)在無處理和用1μM處理之間p<0.005

(4)在無處理和用10μM處理之間p<0.001

對於A/台灣/01/86(H1N1)：

(1)在無處理和用0.01μM處理之間p<0.05

(2)在無處理和用0.1μM處理之間p<0.01

(3)在無處理和用1μM處理之間p<0.005

(4)在無處理和用10μM處理之間p<0.001。

本發明的肽、藥物組成物、用途和方法的實施方式旨在示例說明而不是限制性的。修飾和變化可以藉由本領域技術人員根據上述教示進行，特別是可以涉及維持就鎮痛和/或抗A型流感病毒效應而言的接近天然功能的肽中的變化者。因此，應當理解可以在描述的範圍內揭露的特定實施方式中做出變化。

如本文使用的，SEQ ID NO：5所示胺基酸序列的肽是兔α1-抗蛋白酶F的片段。

如本文使用的，術語『分離的』指已從原始環境中分離的物質。對於天然存在的物質，原始環境是天然環境。例如，在活細胞中以天然存在狀態的多核苷酸和肽不是分離或純化的。然而，如果相同多核苷酸和肽已與天然伴隨其的其他組分分離，那麼它們是分離或純化的。

本發明的肽可以是重組、天然或合成肽，較佳為重組肽。本發明的肽可以是純化的天然產物或化學合成的產物。可替代地，它可以使用重組技術由原核或真核宿主產生，例如細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞。根據重組生產中使用的宿主，肽可以是醣基化或非醣基化的。

如本文使用的，術語『衍生物』和『變體』意指基本上保留與DEAQETAVSSHEQD的天然肽的相同生物功能或活性的肽。

如本文使用的，本文使用的術語『衍生物』包括但不限於(i)其中胺基酸殘基中的一個或多個包括取代基者，(ii)其中肽與另一種化合物例如增加肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合者，(iii)其中另外的胺基酸融合至肽者，例如引導或分泌序列或用於純化肽或前蛋白的序列，或(iv)其中肽藉由一些修飾進行修飾者。基於本文的教示，此類衍生物是本領域技術人員已知的。

如本文使用的，術語『修飾』(其通常不改變基本序列)包括肽的體內或體外化學衍生，例如乙醯化或羧基化。還包括的是醣基化的修飾，例如修飾肽的醣基化模式產生的那些，該修飾在其合成或加工過程中或在進一步的加工步驟中，例如藉由使肽暴露於醣基化酶(例如哺乳動物醣基化或去醣基化酶)。還包括的是具有磷酸化胺基酸殘基例如磷酸酪胺酸、磷酸絲胺酸、磷酸蘇胺酸的序列，以及為改善蛋白酶解降解的抗性或最佳化可溶性性質而修飾的序列。

如本文使用的，術語『變體』包括但不限於幾個胺基酸的缺失、插入和/或置換，較佳為幾個保守的胺基酸置換(一般為1-7、較佳為1-6、更佳為1-5、再更佳為1-4、還更佳為1-3、最佳為1-2個)，和在肽的C末端、N 末端或內部的一個或多個胺基酸(一般小於20、較佳為小於10、更佳為小於5個)的添加。例如，當胺基酸殘基由相似或類似殘基置換，例如由保守或非保守的胺基酸殘基(較佳為保守胺基酸殘基)置換時，蛋白質功能通常是未改變的。進一步地，在C末端和/或N末端一個或多個胺基酸的添加通常不改變蛋白質功能。

如本文使用的，術語『保守胺基酸置換』意指與DEAQETAVSSHEQD的胺基酸序列相比較，藉由用具有基本上相同或相似性質的胺基酸置換至多7、較佳為至少6、更佳為5且最佳為至多3個胺基酸形成的肽。較佳的是，這些保守突變體藉由根據表1的置換形成。

本發明的多核苷酸可以以DNA和RNA的形式。DNA包括以單鏈或雙鏈形式的cDNA、基因組DNA和合成DNA等。本發明的多核苷酸可以是簡併序列(degenerate sequence)。如本文使用的，術語『簡併序列』意指由於密碼子的簡併性，編碼相同蛋白質的不同序列。

術語『編碼肽的多核苷酸』包括編碼該肽的多核苷酸和包含額外和/或非編碼序列的多核苷酸。

編碼本文該肽的多核苷酸可以藉由PCR擴增、重組方法和合成方法進行製備。對於PCR擴增，藉由基於本文揭露的核苷酸序列尤其是ORF設計引子，且使用商購可得或藉由本領域的常規技術製備的cDNA庫作為模板，可以獲得該序列。一旦獲得序列，就可以藉由重組方法產生許多序列。通常，將該序列複殖到載體內，隨後將其轉形到宿主細胞內。使用常規技術從擴增的宿主細胞中分離序列。

本發明進一步涉及包含本發明的多核苷酸的載體、用本發明的載體或多核苷酸轉形的遺傳改造的宿主細胞、和藉由重組技術用於產生肽的方法。

重組肽可以使用本發明的多核苷酸序列，藉由常規重組DNA技術表現或產生(Science，1984；224：1431)。一般地，它包括下述步驟：(1)用編碼肽的多核苷酸或含有多核苷酸的載體轉染或轉形合適的宿主細胞；(2)在合適的培養基中培養宿主細胞；(3)從培養基或細胞中分離或純化蛋白質。

在本發明中，本文該多核苷酸序列可以插入重組表現載體內。術語『表現載體』意指細菌質體質體、噬菌體、酵母質體、植物病毒或哺乳動物細胞病毒例如腺病毒、反轉錄病毒或本領域已知的任何其他媒介物。任何質體或載體都可以用於構築重組表現載體，只要它可以複製且在宿主中是穩定的。表現載體的一個重要特點是表現載體一般含有複製起點、啟動子、標記基因以及轉譯調節組分。

已知方法可以用於構築含有本文該序列和合適的轉錄/轉譯調節組分的表現載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。將DNA序列有效連接至表現載體中的合適啟動子，以導引mRNA的合成。示例性啟動子是大腸桿菌的lac或trp啟動子；A噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子；HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTR(長末端重複)和一些其他已知啟動子，其控制原核細胞、真核細胞或病毒中的基因表現。表現載體可以進一步包含用於起始轉譯的核糖體結合位點、轉錄終止子等。

如本文使用的，術語『宿主細胞』包括原核生物例如細菌；低等真核生物例如酵母；高等真核生物例如哺乳動物細胞。代表性例子是細菌細胞例如大腸桿菌、鏈黴菌屬、鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞例如酵母；植物細胞；昆蟲細胞例如果蠅S2或Sf9；動物細胞例如CHO、COS或Bowes黑素瘤等。

如本文使用的，術語『鎮痛作用』包括『抗痛覺過敏作用』和『抗異常性疼痛作用』。然而，這三個術語可以分開使用，因為它們指涉不同疾病或模式中的疼痛緩解。

如本文使用的，術語『個體』包括人、非人哺乳動物 (例如牛、綿羊、兔、犬、小鼠、大鼠、猴等)和馴養家禽。

本發明還提供了包含與藥學可接受的載體組合的安全和有效量的本發明之肽、其變體和/或衍生物的藥物組成物。此類載體包括但不限於鹽水、緩衝溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇或其組合。藥物製劑應適合於遞送方法。藥物組成物可以以注射劑的形式，其藉由常規方法進行製備，使用生理鹽水或含有葡萄糖或輔助物質的其他水溶液。以片劑或膠囊形式的藥物組成物可以藉由常規方法進行製備。藥物組成物例如注射劑、溶液、片劑和膠囊應在無菌條件下製造。活性成分以治療有效量施用，例如約1μg-50mg/kg體重或更多/天。此外，本發明的肽可以連同其他治療劑一起施用。

先前實驗證據顯示藉由痘苗病毒接種誘發的炎性兔皮膚的粗提取物可以發揮其對鎮痛的藥理學作用。為了鑑定用於疼痛緩解的確切組分，如藉由其親本試劑AGC®證實的，我們藉由使用奈米LC-MS/MS利用蛋白質組學方法以測定在質荷比(m/z)中的差異。藉由複雜的化學純化和資料庫搜索，本案發明人鑑定了DEAQETAVSSHEQD的肽序列，其具有強效鎮痛、抗痛覺過敏、抗異常性疼痛和抗A型流感病毒作用。

本發明進一步藉由下述實施例舉例說明。這些實施例僅意圖為舉例說明本發明，但不限制本發明的範圍。對於下述實施例中的實驗方法，它們在常規條件下執行，例如由Sambrook等人在Molecule Cloning：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989中描述的那些，或如藉由製造商說明的，除非另有說明。

實施例實施例1：肽鑑定 A.樣品製備

如Y.Imai，K.Saito，S.Maeda等人Inhibition of the release of bradykinin-like substances into the perfusate of rat hind paw by neurotropin.Jpn J Pharmacol 1984，36：104-106所述製備從具有由病毒痘苗病毒(Vaccinia variolae)接種引起的炎症的兔皮膚組織中提取的生物活性劑的混合物，並且由Vanworld Pharmaceutical Co Ltd(如皋，中國)提供，具有AGC®(10U/mL，25mL/小瓶)的商品名稱。將約200μL AGC®的粗製劑在真空離心管中乾燥。將凍乾材料用100μL含有8M尿素和0.5M二硫蘇糖醇(DTT)的0.5M碳酸氫銨緩衝液(pH 8.5)在37℃重組配置1小時，並且當加入10μL 0.5M碘乙醯胺(IAM)用於烷基化時，在黑暗條件下在4℃重組配置另外2小時。接著，隨後將所得到的溶液用0.2μg胰蛋白酶在37℃消化18小時，並且隨後藉由10%三氟乙酸(TFA)/H₂O將胰蛋白酶消化的溶液酸化至pH 3.0值。在反應後，將完全酸化的溶液應用於用200μL 0.1% TFA/H₂O (pH 3.0)預平衡的反相C18管柱上。再將管柱用200μL 0.1% TFA/H₂O(pH 3.0)洗滌，並且隨後在室溫用溶於0.1% TFA中從50%到100%的逐步乙腈梯度沖提。

B.奈米-LC-MS/MS分析

將洗脫組分收集，在真空離心機中乾燥，並且隨後在10μL 0.1%甲酸(FA)的H₂O溶液中重組配置，並且藉由LTQ Orbitrap XL(Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA)分析。反相奈米-LC分離在Agilent 1200系列奈米流(nanoflow)系統(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)上執行。將總共10μL來自沖提組分的樣品裝載到Agilent Zorbax XDB C18預處理管柱(0.35mm，5μm)上，隨後使用C18管柱(i.d.75μm X 25-cm，3μm，Micro Tech，Fontana，CA)分離。使用的移動相是(A)0.1% FA和(B)0.1% FA的100% CAN溶液。應用以300nL/分鐘的流速經過90分鐘的時段從5%到35%(B)的線性梯度。肽藉由將1.8Kv的電壓應用於注射針以陽離子模式進行分析。MS以資料依賴性模式操作，其中使用30毫秒/掃描的速率用在Orbitrap(R=60 000以m/z 400)中的m/z 300-2000完全掃描。選擇在LTQ中對於斷裂具有35%的標準化碰撞能量值的六個最強烈峰。應用30秒的重複持續時間，以排除來自對於斷裂的再選擇的相同m/z離子。將同樣藉由還原、烷基化和脫鹽處理的，作為對照的重組配置液體酸化且實施如上提及的奈米-LC-MS/MS分析，除了胰蛋白酶消化外。

C.資料庫搜索和鑑定

通過使用MASCOT搜索程式(http：//www.matrixscience.com；Hirosawa等人，1993)在NCBI資料庫中針對動物分類學搜索確切匹配，通過來自奈米LC-MS/MS譜轉換的峰列表鑑定肽。前體離子和碎片離子的品質耐受設為0.8Da。執行搜索以允許作為脲基甲基化(carbamidomethylation)(C)的固定修飾，並且不存在作為酶的胰蛋白酶。所得到的鑑定具有統計上顯著的(P0.05)肽得分(基於組合的MS和MS/MS譜)和最佳離子得分(基於MS/MS譜)。

D.結果

伴隨或不伴隨胰蛋白酶消化生成的蛋白質片段的質譜模式隨後用於與在資料庫中保存的先前已知的蛋白質的質譜模式比較，其可以用於鑑定完整(intact)蛋白質(蛋白質ID)的肽序列。因此，我們可以藉由散彈槍(shotgun)分析達到肽的廣泛覆蓋，闡明肽或小肽的表現概況，且鑑定序列以及生物化學表徵。在這個工作中使用的方法的流程圖和用其生物化學表徵鑑定的所有肽在表2中列出。檢測到來自MS/MS分析的代表性肽峰(圖2)，導致藉由MASCOT搜索的確信蛋白質鑑定。顯示了雙倍帶電離子m/z 772.745的MS/MS譜。SEQ ID NO：5所示胺基酸序列(DEAQETAVSSHEQD)由在y-和b-片段離子系列中的MS差異測定，並且匹配兔α1-抗蛋白酶的殘基1-14，其不同於人、小鼠或牛中的α1-抗蛋白酶。此外，它還與其他鎮痛有關肽包括類鴉片類激動劑DAGO不共用同源性。根據計算預測，它是線性的且不太可能具有如α-螺旋、β-摺板、β-轉角或彎曲區域的結構。

實施例2：體內鎮痛作用

肽使用固相Fmoc化學法在Mission Biotech Co.(MB，臺北，臺灣)的商業設施合成，且藉由反相高效液相純化至>90%的純度且藉由MS驗證。最終肽產物溶解於DMSO中用於實驗使用。

對於小鼠急性內臟疼痛模型，稱重20-25克的C57BL/6雄性小鼠用1mg嗎啡(作為陽性對照)或合成肽1-6(SEQ ID NO：1-6，各2mg)腹膜內注射。其後三十分鐘，小鼠隨後用1ml 1%乙酸腹膜內注射。記錄第一次扭體的發作和在隨後30分鐘內的扭體頻率。

序列SEQ ID NO：5所示的肽5(14個胺基酸的肽)具有可與1mg嗎啡比較的相似疼痛緩解作用，如縮爪的延遲潛伏期(圖3)和在30分鐘內測量的減少總扭體發作(圖4)所示。

實施例3：抗痛覺過敏作用

使用稱重20-25克的C57BL/6雄性小鼠。手術程序在氟烷(Halothane)(2-3%)麻醉下執行。如已描述的(Malmberg AB和Basbaum AI.Pain 1998；76：215-222)，藉由用9-0絲線繫成約坐骨神經1/3至1/2直徑的緊密結紮做出部分坐骨神經損傷。在具有假手術的小鼠中，使坐骨神經暴露但未結紮。隨後在熱測試和von Frey金屬絲測試前，使小鼠習慣於測試環境至少1小時。在熱測試中，測定縮爪潛伏期作為疼痛指示劑。在von Frey測試中，調整刺激強度，以在正常小鼠中給出10秒縮回潛伏期，而在不存在反應的情況下的截止值是20秒。von Frey金屬絲的機械敏感性藉由上下範例(up-down paradigm)進行評估(Chaplan等人，J Neurosci Methods 1994；53：53-66)。關於測試範例的纖維選擇為0.3-克。

序列SEQ ID NO：5所示的肽5就其在接受坐骨神經結紮的小鼠中的抗痛覺過敏作用進行測試。平行比較在手術後第5、10和30天來自假手術小鼠和神經損傷小鼠的熱測試的結果。結果明確證實具有神經損傷的肢體具有痛覺過敏，如藉由與對側肢體或假手術的肢體的縮爪潛伏期相比較，確認顯著減少的縮爪潛伏期(圖5)。此外，2mg序列SEQ ID NO：5所示的肽5的腹膜內注射(標記為『處理的』)確實可以顯著增加對於熱誘發的疼痛的耐受，如藉由與給予DMSO溶劑的對照小鼠(標記為『未處理的』)相比較，確認縮爪潛伏期的增加(圖5)。

實施例4：抗異常性疼痛作用

使用實施例3中的相同動物模式。序列SEQ ID NO：5所示的肽5就其在接受坐骨神經結紮的小鼠中的抗異常性疼痛作用進行測試。平行比較在手術後第5、10和30天來自假手術小鼠和神經損傷小鼠的機械刺激(von Frey測試)的結果。結果明確證實具有神經損傷的肢體具有超異常性疼痛，如藉由與對側肢體或假手術的肢體相比較，確認顯著降低的von Frey閾值(圖6)。此外，2mg序列SEQ ID NO：5所示的肽5的腹膜內注射(標記為『處理的』)確實可以顯著增加對於機械刺激的耐受，如藉由與給予純水的對照小鼠相比較(標記為『未處理的』)，確認von Frey閾值的增加(圖6)。

實施例5：抗病毒作用 A.病毒和細胞

H5N1分離物A/越南/1194/04和A/香港/97得自Department of Microbiology，the University of Hong Kong。使用3×10⁵ TCID₅₀病毒用於實驗。A/台灣/01/86 (H1N1)也以3×10⁵ TCID₅₀用於實驗。H5N1實驗在生物安全水準(BSL)3+防範設施中進行。病毒原種(stock viruses)的等分試樣貯存於-80℃。Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞得自美國菌種保存中心(ATCC，Manassas，VA，USA)，且維持在補充有10%胎牛血清和1%抗生素(青黴素/鏈黴素)的達爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM)中。50%組織培養感染劑量(TCID₅₀)在37℃溫育3天後的MDCK細胞中進行測定，並且該值藉由Reed和Muench的方法進行計算(Reed LJ，Muench H.A simple method for estimating fifty percent endpoints.American Journal of Hygiene.1938；27：493-497)。為了測定序列SEQ ID NO：5所示的肽5在抑制病毒複製中的有效性，將所得pfu/ml與接種的最初pfu/ml比較(除以接種的最初pfu/ml)，且表示為最初效價(其為5×10³pfu/ml)的百分比。

B.藉由噬斑測定的病毒效價測定

此處使用的所有病毒最初在MDCK細胞上定量，以測定感染效價(噬斑形成單位/mL，pfu/ml)。簡言之，使MDCK細胞在24孔盤中生長成單層，在用序列SEQ ID NO：5所示的肽5(0.001、0.01、0.1、1和10μM)處理後用病毒以5×10³pfu/ml進行感染。在長滿的MDCK細胞上在37℃ 1小時結合後，將未結合的病毒用PBS輕輕洗滌，並且用1：1 Noble Agar(1.8%)和2x DME-F12 (補充有Glutamax(Invitrogen，Carlsbad，CA)、ITS(Invitrogen)和3μg/ml乙醯化胰蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO))覆蓋。在允許瓊脂固化後，在用結晶紫固定且在每個稀釋度計數噬斑數目前，將盤在37℃溫育~72小時。在3天後，人工計數噬斑數目，並且針對未處理對照(即0μM)標準化。

C.序列SEQ ID NO：5所示的肽5在體外抑制流感病毒H5N1和H1N1複製

為了檢查序列SEQ ID NO：5所示的肽5針對流感病毒H5N1和H1N1複製的抑制作用，將連續稀釋的序列SEQ ID NO：5所示的合成肽5補充到在24孔板中的單層MDCK細胞培養物，該單層MDCK細胞培養物已暴露於5000 pfu/ml的H5N1 A/越南/1194/04、A/香港/97和A/鵝/台中/Q156/05或H1N1。在3天後，計數具有每個藥物濃度的病毒噬斑數目，並且將噬斑數目針對未處理對照標準化(圖7)。顯示序列SEQ ID NO：5所示的肽5具有在體外抑制H5N1和H1N1病毒複製的有力效應。

本文描述的實施方式的態樣可以以其他形式體現或以其他方式執行，而不悖離其精神或基本特徵。本發明因此在所有方面視為示例說明性的而不是限制性的，並且在等效意義和範圍內的所有改變預期在其中包含。

<110> 永林有限公司(WELL RESOURCES LIMITED)

<120> 肽及其用途

<130> FPCH12160031P

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(11)

<223> 兔α1-抗蛋白酶F的殘基1-11

<400> 1

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(12)

<223> 兔α1-抗蛋白酶F的殘基1-12

<400> 1

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(13)

<223> 兔α1-抗蛋白酶F的殘基1-13

<400> 1

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(13)

<223> 兔α1-抗蛋白酶F的殘基2-14

<400> 1

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(14)

<223> 兔α1-抗蛋白酶F的殘基1-14

<400> 1

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(12)

<223> 兔α1-抗蛋白酶F的殘基3-14

<400> 1

Claims

一種肽在製備用於治療或緩解個體中與疼痛相關的疾病和/或症狀的藥物中的用途，其中該肽由SEQ ID NO：5所示胺基酸序列所組成。
如申請專利範圍第1項的用途，其中該與疼痛相關的疾病和/或症狀選自所有種類的有症狀的神經痛；腰痛；膽絞痛；咽痛；動脈栓塞疼痛；創傷、燒傷和燙傷引起的急性疼痛；手術中或手術後疼痛；消化性潰瘍痛；痛經；分娩後的陣痛；頭痛和由多種腫瘤誘發的疼痛。
如申請專利範圍第1-2項中任一項的用途，其中該個體選自人、非人哺乳動物和馴養家禽。
如申請專利範圍第1-2項中任一項的用途，其中該肽藉由化學合成獲得。
如申請專利範圍第1-2項中任一項的用途，其中該肽是分離的肽。