TWI531580B

TWI531580B - 用以偵測子宮內膜異位之專一性ａ１ａｔ單株抗體

Info

Publication number: TWI531580B
Application number: TW101101539A
Authority: TW
Inventors: 楊維中; 王惠鈞; 陳水聰; 呂肯奮; 彭明棋
Original assignee: 台北醫學大學; 中央研究院
Priority date: 2011-01-14
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2016-05-01
Also published as: ES2704978T3; PL2663865T3; CN103649327A; WO2012097299A9; DK2663865T3; CN103649327B; TW201237045A; TR201900706T4; WO2012097299A2; EP2663865A2; EP2663865B1; EP2663865A4; HUE042016T2

Description

用以偵測子宮內膜異位之專一性A1AT單株抗體

本揭示內容是有關於檢驗和/或偵測子宮內膜異位之技術領域。特別是，本揭示內容係指可辨識甲1型-胰蛋白酶(alpha 1-antitrypsin，A1AT)之單株抗體、產生此單株抗體之融合瘤，以及此單株抗體於個體之血清檢體內檢驗和/或偵測子宮內膜異位的用途。

子宮內膜異位的疾病特徵在於子宮內膜組織出現在子宮以外的區域，例如，原本應該生長在子宮內部的腺體和間質細胞，卻生長於子宮外部區域，同時仍然保有與正常子宮內膜相同之生理形式。

子宮內膜異位不易察覺，往往要到患者於生理期出現疼痛或發燒症狀，才會藉由實際檢查患者腹腔而發現並確認子宮內膜異位的存在。由於患者經常輕忽子宮內膜異位所產生的症狀，因而延遲醫生檢驗的時機，造成病況複雜。儘管目前有數種方法可用來檢驗子宮內膜異位，然而，病人對於某些檢測方法接受度低、或部分方法對於偵測特定類型子宮內膜異位之敏感度不足。舉例來說，雖然以腹腔鏡來檢驗及判斷子宮內膜異位相當可靠，但是患者對於此種侵入性檢測方法之接受度並不高。諸如陰道超音波(Vaginal ultrasonic)或核磁共振檢查(nuclear resonance imaging，MRI)測定之類的其他方法，則僅能檢測大於2公分的類纖維瘤(fibroid)或巧克力囊腫(chocolatecyst)，且其敏感度尚不足以用來偵測子宮內膜異位。此外，雖然已知可用一種血清生物標記，CA125，來檢驗子宮內膜異位(Barbieri R. L.,Fertil. Steril. 45: 767-769,1986)，然而其偵測敏感度僅有15%。

在2008年7月15日核准之楊等人的美國專利第7,399,598號，揭示一種藉由偵測一群18至40歲女性血清檢體內甲1型-胰蛋白酶和/或其片段之含量，來檢測子宮內膜異位的方法。然而，此專利所揭示的偵測方法是利用習知的免疫墨點分析來進行。有鑒於此，本領域亟需一種改良方法其具有足夠的敏感度、且能以可信賴的方式及早偵測出子宮內膜異位。

本揭示內容為一種可辨識甲1型-抗胰蛋白酶之單株抗體、生產此抗體之融合瘤，以及其於生物檢體中(例如，一個體之血清檢體)檢驗和/或偵測子宮內膜異位之用途。

本揭示內容之一態樣是可專一性地與A1AT同形異構物結合之單株抗體。

依據其他實施方式，提供分別可與AAT1和AAT2結合之2A7和2C8單株抗體。此AAT1和AAT2兩者皆為A1AT之同形異構物，且AAT1和AAT2兩者於一個體之一生物性檢體中的分子量分別約為72和58千道耳頓(kDa)。所述2A7或2C8單株抗體，皆可被A1AT之一抗原表位(epitope)所辨識，該抗原表位具有一與序列編號：3之序列至少90%相同之胺基酸序列；較佳是，此2A7或2C8單株抗體可被具有一序列編號：27之胺基酸序列的A1AT抗原表位所辨識。所述單株抗體2A7或2C8分別為IgG1。

依據一較佳實施方式，上述生物性檢體可以是活組織切片檢體(biopsy sample)、全血檢體(whole blood sample)、血漿檢體(plasma sample)、血清檢體(serum sample)、腹腔液(peritoneal fluid)、或上述經過純化或過濾後的檢體形式。於一較佳實施例中，所述生物性檢體是血清檢體。

本揭示內容之另一態樣為提供一種可生產前述單株抗體2A7之融合瘤(hybridoma)細胞，其已於2012年1月5日寄存於我國生物資源保存及研究中心(新竹市，台灣)，編號為：BCRC960440。

本揭示內容之再一態樣為提供一種可生產前述單株抗體2C8之融合瘤細胞，其已於2012年1月5日寄存於我國生物資源保存及研究中心(新竹市，台灣)，編號為：BCRC960441。

依據本揭示內容之其他態樣，提供一種上述單株抗體的用途，包括在一個體之生物檢體中偵測子宮內膜異位的方法和/或套組。

根據本揭示內容之一實施方式，提供一種使用本揭示內容之抗體來檢驗子宮內膜異位之方法。此方法包括以下步驟：採取一個體之一生物性檢體；讓該生物性檢體與一2A7或2C8單株抗體接觸；以及偵測個別與AAT1或AAT2結合之2A7或2C8單株抗體；其中該2A7或2C8單株抗體，可分別被具有一序列編號：27之胺基酸序列的A1AT抗原表位所辨識；此外，於生物性檢體中該AAT1和AAT2之分子量分別約72和58kDa。

所述生物性檢體可以是活組織切片檢體、全血檢體、血漿檢體、血清檢體、腹腔液或上述經過純化或過濾後的檢體形式。於一較佳的實施例中，所述生物性檢體是血清檢體。

本揭示內容之範疇亦涵蓋於個體之生物性檢體中偵測子宮內膜異位之檢測套組。

依據一實施方式，此套組包含至少一種本發明之單株抗體；至少一試劑，其適用於個體之生物檢體中偵測與AAT1或AAT2結合之2A7或2C8單株抗體；以及與套組相關之說明書，其指示如何使用該套組；其中所述之2A7或2C8單株抗體，可以被一A1AT抗原表位所辨識，此A1AT抗原表位具有一與序列編號：3序列90%相同之胺基酸序列，較佳是此A1AT抗原表位具有一序列編號：27之胺基酸序列。此外，此A1AT同形異構物，即AAT1與AAT2，其分子量分別為約72和58 kDa。

透過以下的詳細說明與附隨之申請專利範圍將可更了解本揭示內容的這些及其他特徵。需知以上的概述及以下的詳細說明僅為例示，用來闡述本揭示內容，而非用以限制本揭示內容之範疇。

所述實施方式與專有名詞是為了闡述發明內容之用，並非用以限制本揭示內容範疇。本揭示內容範疇也涵蓋並未特意揭示於此，但習知技藝人士在閱讀過本揭示內容後可輕易推知的其他實施方式。

以下為本說明書中所用特定名詞的說明：

本揭示內容所使用之單數形式的「一」和「該」包含複數參照物，除非文義另有規定，此外，本揭示內容所使用的和「一個或多個」亦包含一、二、三或以上之複數參照物。

在本揭示內容中「抗體(antibodyor antibodies)」一詞為習知技藝人士所熟悉的名詞，代表結合至已知抗原之分子或該些分子的活性片段，特別是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子之活性部位，即，具有一結合部位的分子，該結合部位可透過免疫專一性(immune-specifically)方式與抗原結合。依據本發明所述之免疫球蛋白可以是任一型式(即，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)或任一類(即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任一次類之免疫球蛋白分子。

「單株抗體(monoclonal antibody)」一詞為習知技藝人士所熟悉的名詞，代表一種於實驗室內以單一選殖株(clone)大量生產製造之抗體且所述抗體僅能辨識單一抗原。典型製造單株抗體之方式，係藉由融合一正常短生命週期之抗體生產的B細胞和一生長快速之細胞(例如，一不朽細胞(immortal cell))，其所產生之雜交細胞或融合瘤，可快速複製並從其中產生一可大量生產所述單株抗體的選殖株。

以下將詳細說明本發明可辨識甲1型-抗胰蛋白酶(即，A1AT)之單株抗體、製造該單株抗體之融合瘤細胞，以及其於一生物檢體內(如，一個體之血清檢體)檢驗和/或偵測子宮內膜異位之用途。

根據本揭示內容之一態樣，提供一種可與A1AT同形異構物專一性結合的單株抗體。根據一實施方式，，可以藉由內醣苷酶(endoglycosidase)消化移除A1AT上的N-醣苷鏈(N-glycan chains)而製造出所述A1AT同形異構物。內醣苷酶為一種酵素，其可以從醣蛋白中釋放出寡醣(oligosaccharides)，或僅裂解多醣鏈之間的殘基(這些殘基並非末端殘基)。適合的內醣苷酶包含，但不限於，內醣苷酶D、F、F1、F2、G或H。於一實施例中，以PNGase F來釋放並移除A1AT上之N-醣苷鏈。根據一較佳實施方式，兩種A1AT之同形異構物分子量分別為72和58 kDa。分子量分別約為72和58 kDa之A1AT同形異構物，分別被命名為「AAT1」和「AAT2」，在本文中被當作可與抗A1AT單株抗體結合之抗原，或用以於一個體之生物性檢體內偵測和/或檢驗子宮內膜異位。

為了生產所需之單株抗體，先以一適當劑量之A1AT對實驗動物(例如，小鼠(mice)、大鼠(rat)或兔子)進行初次免疫。一般而言，當以A1AT免疫實驗動物時，應先將佐劑和A1AT混合均勻再予以施用。本發明之佐劑實例包含，弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)(FCA)、弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)(FIA)和氫氧化鋁佐劑(aluminum hydroxide adjuvant)。然而，主要是藉由一靜脈注射(intravenous)、皮下注射(subcutaneous)、腹膜內注射(intraperitoneal)或肌肉注射(intramuscular)之方式注射抗原以進行免疫，且免疫期間，並沒有特別限制。可以在數天至數週之期間內進行免疫，較佳為於2至3週內，施作用1至10次，較佳為2至5次。一旦抗體效價之吸光值達到2或更高時(因免疫作用之故)，即將實驗動物靜置2至6個月，較佳為4至6個月，更佳為6個月，直至抗體效價吸光值降低至0.05-1，較佳為0.05-0.5，更佳為0.05的量為止。

接著，實施多次的重複免疫(re-immunization)，較佳是於數週的時間內重複刺激實驗動物2至5次。在最終免疫後數天內，較佳為3至5天內，移除實驗動物的脾細胞和區域性淋巴結。並且，在開始免疫後即須定期採取實驗動物的血液檢體，以離心分離出血清。藉由適當的檢測方法測量血清內的抗體效價，這些檢測方法包含，但不限於，酵素免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、酵素免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)或放射性免疫分析(radio immunoassay，RIA)。於一較佳實施例中，係藉由ELISA分析法偵測抗體之效價。接著，對那些會對A1AT同形異構物(其係依據下述步驟製造)產生高抗體效價之實驗動物進行最終免疫。

抗體生產(Antibody-producing)細胞，係由上述被免疫動物之脾臟細胞和區域性淋巴結或其類似物所製備而來。在製造抗體生產細胞的過程中，盡可能將組織碎片和紅血球全部移除。可以使用紅血球去除劑(erythrocyte remover)商品來達成此目的。此外，亦可使用氯化銨(ammonium chloride)及Tris緩衝液。

立即將上述製成之抗體生產細胞與不朽細胞(即，骨髓瘤細胞(myeloma cell))融合，以產生融合瘤細胞(hybridoma cell)，其可半永恆的(semi-eternally)持續性地增殖，同時並製造出抗體。可使用衍生自動物(如，小鼠)之常用的細胞株來達成此一目的。可用於本發明之細胞株，應當無法存活於HAT選擇性培養基(成分包含次黃嘌呤(hypoxanthine)、胸腺嘧啶(thymidine)以及胺喋呤(aminopterin))中，但當所述細胞與可生產抗體的細胞融合後，則應可生長於該培養基中。骨髓瘤細胞之實例包含，但不限於，小鼠骨髓瘤細胞株(mouse myeloma cell line)(即，骨髓瘤FO細胞(myeloma FO cells))以及人類骨髓瘤細胞株(human myeloma cell line)(即，Karpas 707H)。

細胞融合通常是在一細胞融合促進劑(即，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，其平均分子量為200至20,000道爾頓(Daltons)或其類似物)存在下，將脾細胞或淋巴結細胞與一市售的骨髓瘤細胞混合。或者，可在採用電流刺激(例如，電穿孔(electroporation)的市售細胞融合裝置中進行細胞融合。待細胞融合後，將細胞稀釋且培養於HAT培養基中。

從上述融合細胞中選出欲求的融合瘤，能夠在HAT培養基中存活的融合細胞將可以形成細胞群落。收集每一培養孔之上清液，並且偵測其中是否有AAT1或AAT2(即，藉由前述步驟製備而成之A1AT之同形異構物)抗體效價。可以利用ELISA、EIA或RIA檢測來確認抗體效價之方法。一旦檢測出抗體效價成陽性之培養孔，則將該培養孔內所含細胞，培養於HT培養基(亦即，不含有胺喋呤)中。經過一段時間的培養，再次確認其上清液的抗體效價。將最終選定之細胞進行選殖以取得單一細胞。將會對AAT1或AAT2表現出高度專一性的選殖株大量增殖至一定程度以建立融合瘤。

依據本揭示內容之較佳實施例，有三株融合瘤被選定。其中二株，可分別產生單株抗體2A7和2C8，並且分別與AAT1和AAT2結合。

可以藉由已知方法分離或製備出上述融合瘤所製造的單株抗體。舉例而言，可藉由以低血清濃度之培養基培養融合瘤，收取其培養基的上清液來獲取抗體。此外，亦可以將融合瘤注入至動物腹腔內，然後收集動物的腹水以製備出抗體。可藉由親和性管柱(affinity column)、膠體過濾色層分析(gel filtration chromatography)、離子交換樹脂(ion exchange chromatography)或其類似之方法來純化或分離抗體。此外，亦可以適當的應用或組合使用上述這些已知方法來獲取抗體。

根據本揭示內容之一實施方式，由所選定選殖株產生的單株抗體係可專一性結合AAT1(即，A1AT之同形異構物，其分子量約72 kDa)。此單株抗體是一種IgG1，且在本文中稱為「2A7」。

依據本揭示內容之其他實施方式，由所選定選殖株產生的單株抗體係可專一性的結合AAT2(即，A1AT之同形異構物，其分子量約58 kDa)。此單株抗體是一種IgG1，且在本文中稱為「2C8」。

由於AAT1和AAT2可當成生物標記，用來偵測和/或檢驗一個體之子宮內膜異位；因此，可將本揭示內容之單株抗體用於一方法或將其組合成套組，以於一生物性檢體(即，該個體之一血清檢體或抹片檢體)中偵測子宮內膜異位。

根據本發明之一實施方式，可讓上述任一單株抗體與一生物性檢體反應並測量其中的A1AT同形異構物(即，AAT1或AAT2)，並以所偵測結果作為子宮內膜異位的檢測指標。可使用習知的免疫分析方法來執行上述的檢測方法。

為了達成此目標，可從疑似患有子宮內膜異位之個體或進行健康檢查的個體身上來採取生物性檢體。這些生物性檢體可以是活組織切片檢體、全血檢體、血漿檢體、血清檢體、尿液檢體、腹腔液、上述經過純化或過濾後的檢體形式。讓上述生物性檢體與本揭示內容之單株抗體反應。可藉由一般ELISA或墨點(dot-blot)分析來檢測子宮內膜異位或偵測生物性檢體中AAT1及AAT2之含量。

根據本揭示內容其他實施方式，可將抗A1AT同形異構物(如，AAT1或AAT2)之抗體用於一種子宮內膜異位偵測套組內或作為可偵測AAT1或AAT2之試劑。

因此，本案發明也涵蓋AAT1或AAT2檢測套組，其能以高敏感性個別地偵測生物性檢體內之AAT1或AAT2之含量。本發明套組包含，至少一選自2A7和2C8之單株抗體；至少一試劑，其適用於偵測一個體生物性檢體中分別與AAT1和AAT2結合之2A7和2C8；以及一與套組相關之說明書，用以指示如何使用該套組。所述生物性檢體包含，但不限於，活組織切片檢體、全血檢體、血漿檢體、血清檢體或上述經過純化或過濾後的檢體形式。此套組之元件包含：一容器；2A7或2C8單株抗體；用以偵測生物性檢體之試劑；以及一放在該容器內的說明，用以說明如何使用該單株抗體來偵測該生物檢體中的A1AT。此說明可以是錄音帶、CD、VCD或DVD。此套組更包含一陰性控制組，以顯示一個體中A1AT之正常含量。

為了決定出可被本發明2A7或2C8單株抗體辨識之A1AT抗原表位，將完整的A1AT胜肽全長(共具有418個胺基酸)分為26個連續性片段，且每一片段間具有重覆的胺基酸殘基。每個胜肽片段含有約20個人類A1AT之胺基酸殘基。可以依據習知技藝任何標準胜肽合成步驟合成上述這些A1AT衍生胜肽。依據一實施方式，可以藉由固相胜肽合成器(solid-phase peptide synthesizer)(ABI433A peptide synthesizer,Applied Biosystems Inc.,Life Technologies Corp.,Foster City,CA,USA)並依據製造商所提供的流程合成上述這些A1AT衍生胜肽。將所合成胜肽命名為P-1(序列編號：1)，P-2(序列編號：2)，P-3(序列編號：3)，P-4(序列編號：4)，P-5(序列編號：5)，P-6(序列編號：6)，P-7(序列編號：7)，P-8(序列編號：8)，P-9(序列編號：9)，P-10(序列編號：10)，P-11(序列編號：11)，P-12(序列編號：12)，P-13(序列編號：13)，P-14(序列編號：14)，P-15(序列編號：15)，P-16(序列編號：16)，P-17(序列編號：17)，P-18(序列編號：18)，P-19(序列編號：19)，P-20(序列編號：20)，P-21(序列編號：21)，P-22(序列編號：22)，P-23(序列編號：23)，P-24(序列編號：24)，P-25(序列編號：25)以及P-26(序列編號：26)，其詳述於實施例1之表1內。

此技藝領域中任何習知技藝之人可藉由能預測多胜肽序列之改變對於其構型之影響的方法(即，電腦模擬程式)，而來修飾上述這些合成胜肽，因此基於本文揭示資訊來「設計」或「修飾」A1AT之衍生胜肽，並透過測試此一經修飾後之A1AT衍生胜肽，來定出哪些被修飾後之A1AT衍生胜肽仍保有其預期功能或構形。可專一性地修飾致些A1AT衍生胜肽來改變與其生理活性無關之胜肽特徵。舉例而言，可置換或刪除半胱氨酸(cystein)殘基，以避免不必要的雙硫聯結。同樣地，於此研究中，可以改變和/或刪除特定胺基酸，且此變動不影響其胜肽之生理活性(即，此胜肽於免疫分析中能與單株抗體2A7或2C8結合之特性)。因此，本發明包括合成A1AT衍生胜肽之功能性等價衍生物，包括，具有保留性置換胺基酸之胜肽。保留性置換之胺基酸包含以下群組內之胺基酸置換：(a)M、I、L、V;(b)F、Y、W;(c)K、R、H;(d): A、G;(e)S、T;(f)Q、N;(g)E、D；以及(h)C、M。

依據本發明一特定實施方式，此A1AT衍生胜肽及全長之A1AT會彼此競爭，以與單株抗體2A7或2C8結合，因此，可決定出能被本發明單株抗體辨識之A1AT衍生胜肽(即，A1AT抗原表位)。可以藉由已知技術偵測其與抗體的結合，例如放射性免疫分析(radio immunoassay，RIA)、酵素免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、三明治免疫分析法(“sandwich”immunoassay)、原位免疫分析(in situ immunoassays)(即，利用膠質金(colloidal gold)、酵素或放射性同位素標記(radioisotope labels))、西方墨點法(western blot)、凝集分析(agglutination assay)(即，膠體凝集分析(gel agglutination assay)、血液凝集分析(hemagglutination assay)等)、補體結合抑制試驗(complement fixation assay)、免疫螢光分析(immunofluorescence assay)以及免疫電泳分析(immunoelectrophoresis assay)等。於一實施方式中，係藉由ELISA分析來測定抗體結合。2A7和2C8單株抗體皆可被A1AT衍生胜肽所辯識，特別是，可被AIAT合成胜肽P-3(序列編號：3)所辨識。

較佳是，此A1AT合成胜肽包含一與序列編號：3至少90%相同之胺基酸序列。更佳為，此合成的A1AT胜肽包含一與序列編號：3至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。在一最佳實施例中，此AIAT合成胜肽為一具有序列編號：27之胺基酸序列。在本文中，序列的「相同度」是指相較於具有一特定長度之目標胜肽序列來說，在一多胜肽之連續線性排列的序列中，相同胺基酸殘基的數目。在此所稱序列之「相同度(idemtity)」，為比較兩個各別之序列，其胺基酸殘基之相同程度。舉例而言，相同度100%意指比對兩個不同分子之20個胺基酸殘基序列，其20個殘基皆相同。

以下實施例是用來闡明本揭示內容特定態樣並幫助習知技藝者了解並實施本揭示內容。但本揭示內容範疇並不限於這些實施例中。

實施例

本揭示內容之單株抗體(monoclonal antibodies,mAbs)、用以製造mAbs之融合瘤及其用途，將進一步闡述於下列實施例當中，但本揭示內容範疇並不限於這些實施例中。

實施例1　抗原之製備

本實施例檢體採集對象為患有子宮內膜異位之女性，經告知同意後採取其血清檢體。以4倍體積之冰丙酮(含10%(w/v)三氯醋酸(trichloracetic acid,TCA))沉澱血清檢體。將混合物置放於-20℃下90分鐘，接著於4℃下以轉速15,000 x g的速度離心20分鐘，收集沉澱物。再以冰冷的丙酮清洗沉澱物，以轉速15,000 x g的速度再次離心20分鐘。去除上清液，以復水緩衝液(rehydration buffer)(7M尿素(urea)、4% CHAPS([3-(3-膽胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷磺酸鹽)、2M硫脲(thiourea)、0.002%溴酚藍(bromophenol blue)以及65 mM二硫赤鮮醇(dithioerythritol,DTE)將沉澱物溶解。

以PNGase F處理上述復水緩衝液內所含的蛋白質，以移除蛋白質之N-醣苷鏈(N-glycan chains)，再藉由西方墨點法(Western blot)鑑定經消化後之蛋白質。簡言之，以等量之蛋白質檢體進行電泳(10% SDS-PAGE)，接著利用半乾式系統(Bio-Rad semi-dry system)將其轉漬至PVDF膜(Minipore)上。以TBS緩衝液(含5%脫脂牛奶)(20mM Tris-base、0.5M氯化鈉以及pH 8.0)阻斷非特異性之結合，待1小時過後，以含有抗人類1-抗胰蛋白酶抗體(anti-human　1-antitrypsin antibody)(即，AAT704抗體,Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,California)之TBS緩衝液(含0.1%脫脂牛奶)，於4℃下，隔夜培養。以TBST緩衝液(含0.1% Tween-20之TBS緩衝液)清洗10分鐘，重複清洗三次後，將其浸泡於另一溶液中，該溶液為TBS緩衝液(含0.1%脫脂牛奶)，其含有一經適當溶度稀釋之鹼性磷酸酶-共軛山羊抗小鼠IgG二級抗體(alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody)或辣根過氧化酵素共軛山羊抗小鼠IgG抗體(horse radish peroxidase(HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG antibody)，於室溫下處理1小時。將轉漬膜以TBST緩衝液及TBS緩衝液大量清洗10分鐘後，再加入NBT/BCIP，其與AP相互作用或以DAB/H₂O₂處理，其可與HRP相互作用而呈色。上述結果繪示於第1圖中。

第1圖為在有或無可移除蛋白質的N-聚醣鏈之N-聚醣鏈酵素(PNGase F))處理後之蛋白質抗原(其係分離自患有子宮內膜異位之女性)的西方墨點法分析結果。觀察結果發現有兩種A1AT之同形異構物的蛋白質帶，其分子量分別為72和58 kDa，並分別命名為AAT1和AAT2。

實施例2　單株抗體之生產

2.1　以甲1型-胰蛋白酶免疫動物並測其抗體效價量

以甲1型-胰蛋白酶(A1AT，購自Sigma Inc)為小鼠進行免疫，於一段約4星期之期間內，分別施以30微克/動物之劑量2至6次。經2次加強劑量後，每週採集小鼠的血液檢體，並立即離心分離出血清。將分離後之血清進行系列稀釋，接著以西方墨點法(Western Blot)測量其抗體效價。

2.2　製備抗體生產細胞

挑選具有欲求抗體效價之實施例2.1之動物(即，於西方墨點法中，血清檢體之稀釋濃度為1:5,000，呈現陽性反應)進行融合由脾臟細胞、免疫動物之區域性淋巴結中製備出抗體生產細胞，並且依據洪等人所述之步驟(J Immunol Methods 120: 151-157(1989))融合抗體生產細胞和骨髓瘤FO細胞株，而產生融合瘤。簡言之，以無血清之PMI-1640培養基(含有聚乙二醇(PEG)(分子量約1,500 Da))，混合1x10⁶細胞/毫升之脾臟細胞或淋巴結細胞與2x10⁶細胞/毫升之融合瘤細胞。待融合後，以習知的方式(如，利用限制稀釋)複製該些雜交細胞。

2.3　建立融合瘤

於細胞融合後之10-14天，依據實施例2.2所述之步驟讓所選取的細胞形成細胞群落。收集每一培養皿上群落-陽性(colony-positve)孔之上清液，並且以ELISA測定實施例1之AAT1或AAT2抗體效價是否存在。當抗體-陽性孔經確認過後，將該些細胞移至24-孔或12-孔盤並且以HT培養基(即，不含有胺喋呤成份之HAT培養基，稱為HT培養基)置換原培養基。

取該些最終選定培養孔中所含的細胞，進行選殖以得到單一細胞。簡言之，以含有20%胎牛血清之RPMI 1640培養基稀釋細胞上清液，以約0.5-2細胞/孔之細胞濃度，接種至96-孔盤中。以越低的細胞量接種至96-孔盤，其接種單一細胞至單孔內的機率就越高。於接種後7-10天，收集培養皿之上清液並且測定其抗體效價。此外，所選定的選殖株，其對於AAT1或AAT2具有高度專一性，相對的對於AAT1或AAT2之類似物則具有低度的交叉反應，並進一步的將所述選殖株進行一定程度的增殖以形成融合瘤。易言之，選定及培養3株可生產所需單株抗體的選殖株，其中兩株所生產的抗體可以高親和性方式專一性地與AAT2結合，已將其中一株選殖株寄存於我國生物資源保存及研究中心(新竹市，台灣)，編號為：BCRC960440；另一株融合瘤所生產的抗體可以高親和性方式專一性地與AAT1結合，同樣的，此株融合瘤亦已寄存於我國生物資源保存及研究中心(新竹市，台灣)，編號為：BCRC960441。

2.4　製造單株抗體

藉由下述方法從實施例2.3所建立的融合瘤中純化及製造對AAT1或AAT2具有專一性的單株抗體。將約10⁶至10⁷之融合瘤細胞注射至小鼠腹腔內以大量擴增融合瘤細胞。經1至2週後，採集每一隻小鼠之腹水以收集單株抗體。藉由G蛋白質(protein G)純化，輔以硫酸銨(NH₄)₂SO₄沉澱而取得IgG抗體。

經上述方式製成的單株抗體對於AAT1以及AAT2具有高親和力，且其分別為IgG1之同形異構物，分別命名為2C8以及2A7。

實施例3　利用實施例2之單株抗體偵測子宮內膜異位

以免疫墨點法分析實施例2之單株抗體2A7和2C8的專一性。

在此實施例中，血清檢體來自於受告知並經其同意而提供檢體的235位女性。將這些受測者分成五組。其中，控制組由48位未罹患子宮內膜異位症之孕齡女性所組成；Endo(+)GnRh(-) I/II組，由89位患有輕度(或早期)骨盆腔子宮內膜異位且未接受性腺刺激素釋放素(gonadotropin-releasing hormone,GnRh)治療之女性所組成；Endo(+)GnRh(-) III/IV組，由16位患有重度骨盆腔子宮內膜異位且未接受GnRH治療之女性所組成；子宮肌腺症群，由23位患有子宮肌腺症(adenomyosis)之女性所組成；最後，Endo(+)GnRh(+)組，由59位患有骨盆腔子宮內膜異位且接受過GnRh治療之女性所組成。

為進行墨點分析，將5 ng血清(係來自於上述女性受測者之檢體)轉漬至PVDF膜上，接著以5%脫脂牛奶進行阻斷作用，於4℃，放置隔夜，加入小鼠單株抗A1AT抗體(實施例2之2A7或2C8)(1:1000稀釋)至PVDF膜上，於室溫下，培養1小時。以TBST緩衝液大量沖洗，接著加入含有色素源用以呈色之DAB溶液(包含10毫升PBS、0.5毫升氯化鎳(NiCl₂)、10微升過氧化氫(H₂O₂)以及0.2毫克DAB粉末)。反應點的強度可用來反映由所示A1AT抗體偵測到之A1AT的含量多寡。此外，可將不同含量之A1AT轉漬至膜上，以作為內部控制組。所述各點的強度係利用圖像處理軟體(Scion,USA)進行定量分析。結果繪示於第2圖中。

如第2圖所繪示，可發現患有輕微或重度子宮內膜異位及具有子宮肌腺症之受測者體內含有顯著量的A1AT同形異構物。這些A1AT同形異構物可被實施例之單株抗體2C8(第2A圖)和2A7(第2B圖)偵測及辨識。

為了對照，以另一種生物標記(即，CA125)進行試驗，以推知其是否可有效地偵測子宮內膜異位。如第3圖所示，雖然患有重度子宮內膜異位或子宮肌腺症之受測者，其表現出高量的CA125，然而相較於控制組、患有輕微階段的子宮內膜異位或患有骨盆腔子宮內膜異位且接受過GnRh治療之受測者來說，患有輕微子宮內膜異位之受測者，其CA125含量並無顯著不同。此結果顯示，對於偵測子宮內膜異位來說，相較於本發明之單株抗體，CA125是一種較差的生物標記。

實施例4　實施例2之單株抗體、CA125及已知的A1AT抗體之間的偵測效果比較

為了確認實施例2之單株抗體用於早期偵測子宮內膜異位之敏感性、專一性和/或準確性，特進行實施例3之結合試驗，並且與CA125和其他可取得的化抗A1AT抗體商品(即，AAT704，購自於Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,California,USA)互相相較。

血液檢體來自於受告知並經其同意提供檢體的女性共48位，進一步依據個別受測者的疾病階段而分為4組，其控制組由8位健康孕齡女性組成；Endo(I/II)組為89位患有輕微(第I或II期)子宮內膜異位之受測者；Endo(III/IV)為16位患有重度(第III或IV期)子宮內膜異位之受測者；以及50位患有子宮肌腺症之受測者。

每一抗體於血清檢體中偵測子宮內膜異位抗原(實施例1之AAT1或AAT2)之敏感度及專一性，係依據每一墨點分析之接受方操作特性曲線(receiver operation characteristic，ROC)上的切斷值高低(cut-off level)來決定。曲線下之區域約略為被正確分類的百分比。此外，ROC曲線之切斷值係由(1-敏感性)²+(1-專一性)²之最小值來決定。

表1總結了以實施例2之單株抗體、CA125或AAT704用來檢驗或偵測血清檢體(係來自於上述受測者之檢體)內是否存有子宮內膜異位抗原的敏感度、專一性和準確度。

以實施例2之單株抗體來偵測各階段的子宮內膜異位，其整體偵測敏感度遠高於AAT704或CA125。關於敏感度，於各病程階段，本發明之2C8和2A7抗體敏感度皆高於90%；至於CA125，其於診斷早期子宮內膜異位之敏感度只有20%，然而，對診斷重度子宮內膜異位來說，其敏感度則增加至約68%。相較於AAT704，其診斷早期子宮內膜異位之敏感度(高於70%)高過診斷重度子宮內膜異位(僅約13%)。有關於專一性，2C8和2A7對診斷各階段之子宮內膜異位表現至少93%之專一性；然而，CA125和AAT704之專一性則分別只有約92%和50-90%。

表1

實施例5　以實施例2之單株抗體來偵測患有子宮內膜異位且經GnRh治療之受測者血清檢體內A1AT同形異構物之含量

在此實施例中，以實施例2之單株抗體(2C8和2A7)，偵測患有子宮內膜異位之受測者，經GnRh處理過後，血清中A1AT之含量，以確認實施例1之A1AT確實可作為偵測子宮內膜異位的優良指標。依據實施例3所述步驟，以免疫墨點法來測定各單株抗體與相應的A1AT同形異構物間之結合情形進行。結果繪示於第4圖。

第4A圖和第4B圖清楚地顯示，以實施例2之單株抗體2C8或2A7來偵測血清中A1AT含量時，其中，相較於患有子宮內膜異位但未經GnRh治療之受測者來說，患有子宮內膜異位且經GnRh治療後之受測者檢體中A1AT之含量，明顯下降。

類似的結果也出現在患有子宮肌腺症相較於子宮內膜異位症且經GnRh治療之女性身上，來說，以單株抗體2C8所測得的該些受測者血清內A1AT含量明顯下降(第4C圖)。

此實施例揭示確定至少AAT2，分子量為58 kDa之A1AT同形異構物，可以作為偵測是否有子宮內膜異位發生之優良生物標記，並可藉由本揭示內容之單株抗體2C8或2A7有效地偵測。

實施例6　決定實施例2之單株抗體的抗原表位

6.1　製備A1AT合成胜肽

為了確定可被實施例2之單株抗體辨識出來的A1AT抗原表位，將A1AT分為26個胜肽片段，其係以自動固相胜肽合成器(ABI433A peptide synthesizer,Applied Biosystems Inc.,Life Technologies Corp.,Foster City,CA,USA)所製備合成。胜肽之製備，係利用N-9-茀基甲氧基羰基(N-9-fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc))之化學標準程序進行製備。此外，每一胜肽之一級序列已揭示於表2。

此外，以反相高效液相層析法(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)及半製備性十八烷基(semi-prerapative octadecyl)(C18)管柱，來純化所合成的A1AT胜肽。其中，RP-HPLC之移動相是含0.1%三硫醋酸(trifluoroacetic acid,TFA)之乙晴(cetonitrile)/水溶劑系統)。以波長220 nm測定，記錄及定量每一波峰。收集每次純化後之洗出液，並將相同成分分劃匯集在一起，在真空狀況下冷凍乾燥。最後以RP-HPLC分析測定各個收集的胜肽之最終濃度，其純度可以高達95%以上。將合成之胜肽存放於-20℃備用。

可進一步藉由電噴灑游離質譜法(electrospray ionization mass spectroscopy,ESI-MS)測定純化之A1AT合成胜肽的分子量。

表2　A1AT之合成胜肽

6.2　以墨點分析建立抗原表位之圖譜

於此實施例中，以墨點法來鑑定可被實施例2之任一單株抗體識別之A1AT抗原表位。簡言之，將實施例6.1之A1AT合成胜肽分別轉漬於硝化纖維膜上(10微克/點)，待所述纖維膜風乾後，將該膜浸泡於TBS-T溶液(含5% BSA)(TBS含0.05% Tween 20，其包含20 mM Tris氯化氫、150 mM氯化鈉，pH 7.5)內以阻斷非專一性結合的區域，置放於室溫下0.5至1小時。將該些點與實施利2之單株抗體(1:1,000稀釋)，於室溫下，培養至少30分鐘。以TBS-T清洗該膜，重複清洗3次。加入共軛有辣根過氧化酵素(1:3,000倍稀釋)之二次抗體(例如，山羊抗小鼠IgG)至各點上，於室溫下培養30分鐘。以TBS-T清洗該膜，重複清洗3次，接著以TBS清洗一次。將ECL試劑噴到每個點上處理1分鐘，接著在暗房中將X-光軟片曝光。將每個點之訊號與標準液比較。本實驗使用兩種漂準液，分別為A1AT(0.5微克)和N蛋白標準液(1微克)，結果分別繪示於第5圖及第6圖。

如第5圖所示，單株抗體2A7對胜肽10、11、8或24的反應性約為1-2倍，對胜肽3、5、9、12、14、21以及26的反應性則超過2倍以上。類似地，單株抗體2C8對於胜肽3、10、11或18的反應性約為1-2倍，對於胜肽5、9、12、14、21或26的反應性則超過2倍以上(第6圖)。

6.3　以競爭性ELISA分析抗原表位

對實施例6.2之胜肽3、14和21施以競爭酵素連結免疫分析(competitive enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA))，藉此決定出可被實施例2之單株抗體辨識之A1AT抗原表位。簡言之，於96孔盤中，混合多種不同濃度之實施例2之單株抗體(2A7或2C8)與胜肽3、14和21，使其於4℃下產生複合物，接著以PBS緩衝液清洗複合物，重複清洗共3次。

加入有辣根過氧化酵素共軛之二次抗體(例如，山羊抗小鼠IgG)，於室溫下培養1小時。接著以PBS清洗培養盤3次，將TMB(3,3,5,5’-四甲基聯苯胺)受質溶液添加至每個孔洞中，將此混合物培養於37℃，5分鐘，避光處理，最後加入終止液(即，0.1N鹽酸)至每個孔中，將96孔盤以微量盤偵測系統在波長450 nm下進行偵測。A1AT：實施例2之單株抗體：胜肽之莫耳比例分別為約1: 0.5: 1、1: 0.5: 2、1: 0.5: 3、1: 0.5: 5、1: 0.5: 10、1: 0.5: 20、1: 0.5: 50以及1: 0.5: 100。結果繪示於第7圖及第8圖。

如第7圖及第8圖所示，胜肽3能夠與實施例2之單株抗體競爭A1AT，隨著胜肽濃度增加其結合能力則跟著下降。此結果顯示，單株抗體2A7和2C8皆辨識同一A1AT抗原表位，即，胜肽3。

6.4　胜肽3之衍生胜肽

有鑒於上述實施例6.3之結果，基於胜肽3之序列而設計出一段較短、僅含有10個胺基酸殘基之胜肽(即，胜肽27或簡稱P-27)，即，H₂N-SLYRQLAHQS-COOH(序列編號：27，相當於A1AT之60-69號胺基酸殘基)，且進一步以上述之墨點法進行分析。結果顯示在第9、10圖中。如第9圖所示，胜肽27可與單株抗體2A7結合，相較於控制組，其反應性增加了約2倍；類似的，胜肽27也可與單株抗體2C8結合，相較於控制組，其反應性增加了約1倍。

當可理解上述實施方式與實施例僅為例示，且熟習此技藝者可對齊進行各種修飾。上文提出之說明書、實施例與資料的目的在於使本說明書的結構完備，並作為實作本發明之例示。雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本揭示內容，任何熟習此技藝者，在不脫離本揭示內容之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本揭示內容之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

為讓本揭示內容之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1圖繪示出依據本揭示內容之一實施方式，以西方墨點分析，自健康女性或患有子宮內膜異位女性所分離之A1AT的結果，其中A1AT係有或無經由N-醣苷消化酵素(PNGase F)進行前處理；此外，圖示中的「C」表示控制組；「Endo」表示其血清蛋白係採集自患有子宮內膜異位之女性；

第2圖繪示出以實施例2之(A)2C8或(B) 2A7單株抗體量測一個體內所表現出來之A1AT含量的免疫墨點分析之定量結果。這些個體被分成5組，控制組由28位未患有子宮內膜異位症之女性所組成；Endo(+)GnRh(-) I/II組，由89位患有輕度子宮內膜異位之女性所組成；Endo(+)GnRh(-) III/IV組，由16位患有重度之子宮內膜異位之女性所組成；子宮肌腺症群組，由23位患有子宮內膜異位且轉移至腹膜腔之女性所組成；最後，Endo(+)GnRh(+)組，由59位患有骨盆腔子宮內膜異位且接受過GnRh治療之女性所組成。*表示統計學上具有顯著性(P值＜0.05)；

第3圖繪示出以CA125作為指標測量個體內所表現出來之A1AT含量的免疫墨點分析結果。該些個體被分成5組，控制組由28位未患有子宮內膜異位症之女性所組成；Ecdo(+)GnRh(-) I/II組，由81位患有輕度子宮內膜異位之女性所組成；Ecdo(+)GnRh(-) III/IV組，由16位患有重度之子宮內膜異位之女性所組成；子宮肌腺症群組，由22位患有子宮內膜異位且轉移至腹膜腔之女性所組成；最後，Endo(+)GnRh(+)組，由54位患有骨盆腔子宮內膜異位且接受過GnRh治療之女性所組成。*表示統計學上具有顯著性(P值＜0.05)；

第4A圖及4B圖繪示出以2C8(A)和2A7(B)單株抗體自患有子宮內膜異位且接受過GnRh治療之女性所採集之血清檢體中偵測出其血清中A1AT之含量；

第4C圖繪示出，以2C8單株抗體自患有子宮肌腺症且接受過GnRh治療之女性所採集之血清檢體中偵測出血清中的A1AT含量；

第5圖繪示出依據本發明一實施方式，2A7單株抗體對實施例6.1之A1AT合成胜肽之反應性的結果，其中以A1AT(0.5微克)and N標準蛋白(1微克)作為標準液；

第6圖繪示出依據本發明一實施方式2C8單株抗體對實施例6.1之A1AT合成胜肽之反應性的結果，其中以A1AT(0.5微克) and N標準蛋白(1微克)作為標準液；

第7圖繪示出依據本發明一實施方式，以A1AT與合成胜肽3、14或21共同競爭與2A7單株抗體之結合的結果，其中A1AT：2A7單株抗體：合成胜肽之莫耳比分別為1: 0.5: 1、1: 0.5: 2、1: 0.5: 3、1: 0.5: 5、1: 0.5: 10、1: 0.5: 20、1: 0.5: 50以及1: 0.5: 100；以及

第8圖繪示出依據本發明一實施方式，以A1AT和合成胜肽3、14或21共同競爭與2C8單株抗體之結合結果，其中A1AT：2A7單株抗體：合成胜肽之莫耳比例分別為1: 0.5: 1、1: 0.5: 2、1: 0.5: 3、1: 0.5: 5、1: 0.5: 10、1: 0.5: 20、1: 0.5: 50以及1: 0.5: 100；

第9圖繪示出依據本發明一實施方式，2A7單株抗體與不同量(1、5、10或20 μg)之合成胜肽，包括胜肽3、胜肽21及胜肽27與2A7反應之反應性的結果，並以PBS溶液做為控制組；

第10圖繪示出依據本發明一實施方式2C8單株抗體與不同量(1、5、10或20 μg)之合成胜肽，包括胜肽3、胜肽21及胜肽27與2C8反應之反應性的結果，並以PBS溶液做為控制組。

<110>　台北醫學大學

中央研究院

楊維中

王惠鈞

陳水聰

呂肯奮

彭明棋

<120>　用以偵測子宮內膜異位之專一性A1AT單株抗體

<130>　P2676-PCT

<160>　27

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　20

<212>　PRT

<213>　合成序列

<400>　1

<210>　2

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　2

<210>　3

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　3

<210>　4

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>合成序列

<400>　4

<210>　5

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　5

<210>　6

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　6

<210>　7

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　7

<210>　8

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　8

<210>　9

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　9

<210>　10

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　10

<210>　11

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　11

<210>　12

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　12

<210>　13

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　13

<210>　14

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　14

<210>　15

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　15

<210>　16

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　16

<210>　17

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　17

<210>　18

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　18

<210>　19

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　19

<210>　20

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

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<210>　21

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　21

<210>　22

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　22

<210>　23

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　23

<210>　24

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　24

<210>　25

<211>　20

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　25

<210>　26

<211>　19

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　26

<210>　27

<211>　10

<212>　蛋白質

<213>　合成序列

<400>　27

Claims

一種單株抗體，其係可於一個體之一生物性檢體中專一性地結合至分子量約72kDa或58kDa之甲1型-胰蛋白酶(alpha 1-antitrypsin，A1AT)同形異構物之一抗原表位，其中該抗原表位包含一序列編號：27之胺基酸序列。
如請求項1所述之單株抗體，其中該抗原表位具有一序列編號：3之胺基酸序列。
如請求項1所述之單株抗體，其中該抗體是一種IgG1。
如請求項1所述之單株抗體，其中該生物性檢體是一活組織切片檢體(biopsy sample)、一全血檢體(whole blood sample)、一血漿檢體(plasma sample)、一血清檢體(serum sample)、一腹腔液(peritoneal fluid)、一尿液(urine)或上述檢體經過純化或過濾後的檢體形式。
如請求項4所述之單株抗體，其中該生物性檢體是該血清檢體。
一種檢驗一個體是否罹患子宮內膜異位的方法，包含取一個體之生物性檢體；使請求項1所述之單株抗體與該生物檢體接觸；以及偵測請求項1的單株抗體是否會與該生物性檢體中分子量約72kDa或58kDa之A1AT同形異構物結合。
如請求項6所述之方法，其中該生物性檢體是一活組織切片檢體、一全血檢體、一血漿檢體、一血清檢體、一腹腔液、一尿液、上述經過純化或過濾後的檢體形式。
如請求項7所述之方法，其中該生物性檢體是該血清檢體。
一種於一個體之一生物性檢體中偵測一分子量約72kDa或58kDa之A1AT同形異構物的檢測套組，包含該請求項1所述之單株抗體；一試劑，其可用來偵測該請求項1的單株抗體是否會與該生物性檢體中分子量約72kDa或58kDa之A1AT同形異構物結合；以及一說明書，用以指示如何使用該套組。
如請求項9所述之檢測套組，其中該生物性檢體是一活組織切片檢體、一全血檢體、一血漿檢體、一血清檢體、一腹腔液、一尿液、上述經過純化或過濾後的檢體形式。
如請求項10所述之檢測套組，其中該生物性檢體是該血清檢體。
一種可製造出如請求項1所述之單株抗體的融合瘤，其寄存編號為：BCRC960440，所生產出來的單株抗體係可專一性地結合至分子量約72kDa或58kDa之A1AT同形異構物之該包含序列編號：27之胺基酸序列的該抗原表位上。
一種可製造出如請求項1所述之單株抗體的融合瘤，其寄存編號為：BCRC960441，所生產出來的單株抗體係可專一性地結合至分子量約72kDa或58kDa之A1AT同形異構物之該包含序列編號：27之胺基酸序列的該抗原表位上。