KR20210011274A - 플라비바이러스 외피 단백질 도메인 ⅲ에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 - Google Patents
플라비바이러스 외피 단백질 도메인 ⅲ에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 감염 진단용 조성물; 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 감염 진단용 키트 및 플라비바이러스 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 하이브리도마 세포로부터 생산되는 단일클론항체는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에만 특이적으로 높은 결합 친화도를 가지는 반면, 동시에 플라비바이러스 속(genus)에 해당하지 않는 다른 모기 매개 바이러스의 외피 단백질과는 반응하지 않기 때문에, 이러한 단일클론항체는 플라비바이러스 검출 또는 플라비바이러스 감염증의 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 이와 같은 특성을 이용하여 본 발명의 하이브리도마 세포로부터 생산되는 단일클론항체는 플라비바이러스 감염증의 치료 예후 관찰, 플라비바이러스 또는 플라비바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ의 검출 및 정량적 분석 등과 관련된 기술의 개발에도 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 조성물; 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 키트; 상기 단일클론항체를 이용하여 플라비바이러스를 검출하는 방법 및 플라비바이러스의 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다.
플라비바이러스(Flavivirus)는 분류학적으로는 플라비비리데과(Flaviviridae family)의 하위 속(Genus)인 플라비바이러스속(Flavivirus)에 해당하는 양성 단일가닥의 RNA 바이러스(Positive single-stranded RNA virus)를 의미한다. 생태학적으로는 모기 매개 바이러스(Mosquito-borne virus)와 진드기 매개 바이러스(Tick-borne virus)로 구분할 수 있으며, 항원성(Antigenicity)이 서로 다른 70여 종의 바이러스가 포함되어 있으며, 사람과 동물에게 심한 질병을 일으키는 바이러스가 많다. 대표적인 플라비바이러스로는 지카 바이러스(Zika virus), 뎅기 바이러스(Dengue virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 세인트루이스 뇌염 바이러스(St. Louis encephalitis virus) 등이 있다(감염병실험실진단, 질병관리본부 국립보건연구원 (2005), Rodenhuis-Zybert et al., Cell. Mol. Life Sci . (2010) Vol. 67, pp. 2773-2786.).
지구온난화에 의한 열대, 아열대, 온대 지역의 확대로 인해 플라비바이러스의 주요 숙주(Host)인 각다귀속(Aedes genus)에 해당하는 모기의 서식지가 확대되고 있기 때문에, 모기 매개 바이러스에 대한 경계가 확대되고 있다(Kraemer et al., eLife (2015) Vol. 4, pp. e08347.). 각다귀속 모기의 분포로 미루어 짐작해보면 아시아, 중남미, 북미, 오세아니아, 아프리카 대륙 등의 여러 국가들이 플라비바이러스의 감염 위험에 노출되어 있는 것으로 추정할 수 있으며, 인구로 보면 전 세계 인구 중 약 40%(25억명)의 인구가 플라비바이러스의 감염 위험에 노출되어 있는 것으로 추정할 수 있다. 플라비바이러스에 감염된 환자의 약 80% 정도는 불현성 감염이며, 증상은 3-7일 정도 경미하게 진행된다고 알려져 있다. 또한 주요 증상은 반점구진성 발진이며, 관절통, 근육통, 결막염, 발열, 두통 등이 동반될 수 있다고 알려져 있으며, 아직까지 특별한 예방주사나, 백신, 치료제는 없는 것으로 알려져 있다. 따라서 신속한 조기 진단을 통한 충분한 휴식 및 수분 섭취나 진통제 및 해열제 복용이 매우 중요하다고 할 수 있다.
플라비바이러스(Flavivirus)는 모두 공통의 구조를 가지고 있다. 구형(Spherical)의 구조로 크기는 40~65 nm 이며, 약 11,000개 내외의 염기(Base)로 구성되어 있다. 보다 자세하게는 정이십면체형의 캡시드 단백질(Icosahedral-like nucleocapsid protein)과 외피 단백질(Envelope protein)은 대칭을 이루고 있는 구조이며, 플라비바이러스의 외형은 전자현미경으로 관찰이 가능하다. 플라비바이러스를 구성하는 단백질은 크게 구조단백질(Structural protein)과 비구조단백질(Non-structural protein)로 분류할 수 있으며, 구조단백질에는 캡시드 단백질(Capsid protein, C), 전구체 막 단백질(Precursor membrane protein, prM), 막 단백질(Membrane protein, M), 외피 단백질(Envelope protein, E) 등이 있으며, 비구조단백질에는 비구조단백질 1(Non-structural protein 1, NS1), 비구조단백질 2A(NS2A), 비구조단백질 2B(NS2B), 비구조단백질 3(NS3), 비구조단백질 4A(NS4A), 비구조단백질 4B(NS4B), 비구조단백질 5(NS5) 등이 있다. 아직까지 모든 단백질의 기능이나 역할이 규명되지는 않았지만, 전구체 막 단백질, 외피 단백질, 비구조단백질 1, 비구조단백질 2A 및 2B의 일부, 비구조단백질 4A 및 4B의 일부가 바이러스 외부에 노출되어 있는 것으로 파악되고 있다 (https://viralzone.expasy.org/6756?outline=all_by_species). 따라서 항체를 이용한 면역분석법(Immunoassay)을 통해 플라비바이러스를 검출하거나 플라비바이러스의 감염증을 진단하고자 할 경우, 플라비바이러스의 외부에 위치되어 있어 항체와의 접근 및 결합(또는 반응)이 용이한 외피 단백질(E), 비구조단백질 1(NS1), 비구조단백질 2A(NS2A) 및 2B(NS2B), 비구조단백질 4A(NS4A) 및 4B(NS4B) 등이 유용한 바이오마커(타겟, 목표물질)라고 할 수 있다.
플라비바이러스 검출기술 및 플라비바이러스 감염증 진단기술은 크게 1) 항원-항체 반응을 이용하는 면역진단법(Immunodiagnostics), 2) 바이러스의 핵산(유전자)을 검출하는 분자진단법(Molecular diagnostics), 3) 직접적인 바이러스 배양법과 같이 3가지로 분류할 수 있다. 이 중에서도 면역분석법은 '항체'를 보유하고 있다면, 분자진단법이나 바이러스 배양법에 비해 바이러스 분석방법이 비교적 간단하고 분석에 소요되는 시간이 매우 짧기 때문에 신속한 검출이 가능하다는 장점이 있다. 면역분석법도 검출하고자하는 물질의 종류에 따라 혈청학적(또는 항체) 검출법(Serological (or antibody) detection) 및 항원 검출법(Antigen detection)으로 다시 세분화 할 수 있다. 미국의 CDC (Centers for disease control and prevention)에서는 플라비바이러스 검출 또는 플라비바이러스 감염증 진단을 위해 여러 가지 방법을 제시하고 있지만, 면역분석법에서는 혈청학적 검출법인 MAC-ELISA (IgM antibody capture ELISA)를 플라비바이러스 감염 여부 확인을 위한 표준 진단법으로 권고하고 있는 상황이다.
플라비바이러스와 같은 모기 매개 바이러스인 알파바이러스속(Alphavirus genus)에 해당하는 치쿤군야(Chikungunya virus)와 마찬가지로 감염 초기에는 발열, 발진, 구토, 근육통 등의 공통적인 증상을 나타내 감염증을 구별하기 어렵다. 그러나 플라비바이러스의 감염증의 정도가 심한 경우에는 전혀 다른 질병을 나타낼 수 있기 때문에, 다른 모기 매개 바이러스와의 정확한 구별이 필요하다(Patterson et al., West J. Emerg. Med . (2016) Vol. 17, pp. 671-679., Honein et al., JAMA (2017) Vol. 317, pp. 59-68., Attar, Nat. Rev. Micro. (2016) Vol. 14, pp. 62., Cao-Lormeau et al., Lancet (2016) Vol. 387, pp. 1531-1539.).
하지만 모기 매개 바이러스는 구조적으로 유사하기 때문에, 바이러스 감염으로 인해 체내에 생성된 IgM나 IgG와 같은 이뮤노글로불린(Immunoglobulin)을 검출하는 혈청학적 검출법은 궁극적으로 플라비바이러스만을 특이적으로 검출하기 어렵다는 단점이 있다. 또한 IgM의 경우 지카 바이러스 감염 즉시 생성되는 것이 아니라 수 일에 걸쳐 생성되기 때문에 조기 진단이 어렵고, IgG의 경우에는 IgM보다 생성되는데 시간이 더 오래 걸리며 최초 감염이 아닌 경우 이전의 감염으로 인해 체내에 생성된 항체일 수 있어 위양성(False-positive)의 결과를 초래할 수 있다. 그렇기 때문에 플라비바이러스를 구성하는 특정 단백질을 바이오마커나 타겟(목표물질)로 정하여, 오직 플라비바이러스의 단백질과 결합할 수 있는 단일클론항체를 이용한 항원 검출법이 플라비바이러스의 검출 및 플라비바이러스 감염증의 진단에 유리하다고 할 수 있다.
이에 본 발명자들은 별도의 플라비바이러스의 배양과정 없이 플라비바이러스의 검출이나 플라비바이러스 감염 진단을 위해, '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 개발하였으며, 본 발명의 단일클론항체를 이용하는 경우 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ-단일클론항체 복합체(항원-항체 복합체)'에 대한 반응분석으로부터 짧게는 수 분의 시간 이내에, 길게는 수 시간 이내에 손쉽게 플라비바이러스 검출이나 플라비바이러스에 감염되었는지에 대한 진단이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용하여 플라비바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용하여 플라비바이러스 감염증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 IgG1 이소타입일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 0.1 내지 100 나노몰(nM)의 해리상수로 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 본 발명의 단일클론항체 이외에 표지체와 축합된 항체; 및 발색기질을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지체는 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼리성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase, AP), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose oxidase), 루시퍼라아제(Luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(Malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase), 콜로이드 금(Colloidal gold), 금속 나노입자(Metal nanoparticle), 실리카 나노입자(Silica nanoparticle), 유기 형광물질(Organic fluorescent material), 형광 단백질(Fluorescent protein), 양자점(Quantum dot), 방사성 물질(Radioactive material), 방사성 동위원소(Isotope), 색소(Dye), 탄소나노튜브(Carbon nantube), 그래핀(Graphene) 및 풀러렌(Fullerene)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발색기질은 DAB (diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 플라비바이러스의 존재를 확인하고자 하는 시료와 접촉시켜 항원-항체 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 플라비바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시료를 준비하는 단계; 상기 시료에 본 발명의 단일클론항체를 적용하는 단계; 및 항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 플라비바이러스 감염증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 플라비바이러스 감염이 의심되는 대상의 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 세포파쇄물, 체액, 타액, 뇌척수액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예예 있어서, 상기 항원-항체 반응은 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay) 및 육안 측정법(Visual assessment)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 하이브리도마 세포로부터 생산되는 단일클론항체는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에만 특이적으로 높은 결합 친화도를 가지는 반면, 동시에 플라비바이러스 속(Genus)에 해당하지 않는 다른 모기 매개 바이러스의 외피 단백질과는 반응하지 않기 때문에, 이러한 단일클론항체는 플라비바이러스 검출 또는 플라비바이러스 감염증의 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 이와 같은 특성을 이용하여 본 발명의 하이브리도마 세포로부터 생산되는 단일클론항체는 플라비바이러스 감염증의 치료 예후 관찰, 플라비바이러스 또는 플라비바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ의 검출 및 정량적 분석 등과 관련된 기술의 개발에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 3종 플라비바이러스의 항원(Antigen)인 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ', '뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ', '웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동을 수행한 다음 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 단백질을 염색한 결과 사진이다.
도 2는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되어 순수 분리ㆍ정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 공통적으로 결합하는 단일클론항체를 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동을 수행 한 다음, 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 단일클론항체를 염색한 결과 사진이다.
도 3은 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주로부터 생성된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 공통적으로 결합하는 단일클론항체의 이소타입(Isotype)을 확인한 결과이다.
도 4a 내지 4c는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주로부터 생성된 '플라비바이러스 3종의 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 각각에 대한 단일클론항체의 해리상수(Dissociation constant, KD)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주로부터 생성된 단일클론항체의 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 특이도(specificity)를 확인하기 위해, 플라비바이러스에 속하는 지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ(ZIKV-EDⅢ), 뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ(DENV-EDⅢ), 웨스트나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ(WNV-EDⅢ) 및 알파바이러스에 속하는 치쿤군야 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅱ(CHIKV-EDⅡ)에 대한 상기 단일클론항체와의 반응성을 확인한 그래프이다.
도 2는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되어 순수 분리ㆍ정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 공통적으로 결합하는 단일클론항체를 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동을 수행 한 다음, 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 단일클론항체를 염색한 결과 사진이다.
도 3은 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주로부터 생성된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 공통적으로 결합하는 단일클론항체의 이소타입(Isotype)을 확인한 결과이다.
도 4a 내지 4c는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주로부터 생성된 '플라비바이러스 3종의 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 각각에 대한 단일클론항체의 해리상수(Dissociation constant, KD)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주로부터 생성된 단일클론항체의 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 특이도(specificity)를 확인하기 위해, 플라비바이러스에 속하는 지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ(ZIKV-EDⅢ), 뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ(DENV-EDⅢ), 웨스트나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ(WNV-EDⅢ) 및 알파바이러스에 속하는 치쿤군야 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅱ(CHIKV-EDⅡ)에 대한 상기 단일클론항체와의 반응성을 확인한 그래프이다.
본 발명은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서 용어 '단일클론항체'란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프(Epitope))에 대해 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 본 발명의 단일클론항체는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 특이적으로 결합하므로, '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 인식하는 단백질 분자이다.
본 발명의 용어 '하이브리도마 세포'란, 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포로, 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG) 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종세포가 융합되어, 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포 속에 통합시킨 세포 또는 세포주를 의미한다.
본 발명자들은 별도의 플라비바이러스의 배양과정 없이 플라비바이러스의 검출 또는 플라비바이러스 감염증의 진단을 위해, '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 대한 연구를 진행하였고, 그 결과 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 생산하는 하이브리도마 세포를 구축하고, 이를 이용하여 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 특이적 단일클론항체를 생산하였다.
본 발명에서는 생산된 하이브리도마 세포주 중 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'와 높은 반응성을 보이는 세포주를 1차 선별하였으며, 계대배양을 거쳐 이들 중 생존능을 상실했거나 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 반응성이 없는 하이브리도마 세포주를 제외하는 과정을 거쳐, 본 발명의 하이브리도마 세포주를 2차 선별하였다. 이후, 상기 세포주가 생산하는 단일클론항체의 이소타입 및 해리상수를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 하이브리도마 세포주에서 생산된 단일클론항체는 IgG1 이소타입을 가지면서, '지카 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅲ'에 대해서는 (0.151±0.001) 나노몰(nM), '뎅기 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅲ'에 대해서는 (19.410±1.977) 나노몰(nM), '웨스트 나일 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅲ'의 대해서는 (8.525±0.468) 나노몰(nM)의 해리상수 값을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 단일클론항체는 '플라비바이러스 속(genus)에 속하는 대표적인 바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ에 우수한 결합친화도를 갖는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 단일클론항체의 플라비바이러스 검출 특이성을 살펴보기 위하여, 다른 속(Genus)에 해당되나 같은 숙주(Host)인 각다귀 속(Aedes genus)의 모기를 이용하는 알파바이러스 속(Alphavirus genus)에 해당하는 치쿤군야 바이러스(Chikungunya virus)의 외피 단백질에 대한 결합(또는 반응) 여부를 확인한 결과, 본 발명의 단일클론항체는 다른 속(Genus)에 해당되는 바이러스의 외피 단백질과는 결합(반응)하지 않으며, '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에만 특이적으로 결합(반응)하는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 IgG1 이소타입(Isotype)의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 'Hybridoma JZE3-1'로 명명하였고, 이들 세포주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2019년 7월 5일자로 기탁하였으며, 2019년 7월 11일자로 기탁번호 KCTC18776P를 부여받았다.
따라서 본 발명은, 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 조성물; 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 키트; 상기 단일클론항체를 이용한 지카 바이러스 검출방법 및 플라비바이러스 감염 진단방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'는 서열번호 1(지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ), 서열번호 2(뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ) 또는 서열번호 3(웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ)의 아미노산으로 이루어진 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체 및 돌연변이체뿐만 아니라 단백질의 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함할 수 있다.
본 발명의 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적인 단일클론항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 융합 방법(Fusion method)에 의해 제조될 수 있다(K
hler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol. (1981) Vol. 73, pp. 3-46. 참조). 단일클론 항체를 분비하는 '하이브리도마 세포주'를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(Limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득하고 나서, '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 효소면역흡착분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 또는 웨스턴블럿 분석법으로 선별하고, 표준 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다. 상기 생체내 대량배양은 하이브리도마 세포주를 마우스의 복강에 주사하여 고농도의 항체 생산을 유도한 후, 복수액(Ascites)에서 분리하는 것을 의미한다.
상기 하이브리도마 세포주가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용하거나, 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 90% 이상)로 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 항원 컬럼 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(Ascites)에서 분리할 수 있다.
한편, 항원을 검출하기 위해 단일클론항체를 사용하는 경우의 유용한 점은 단일 에피토프, 즉 항원결정부위를 인지함으로써 특정한 상호작용을 갖는다는 것이다. 이와 같이 항원과 항체간의 상호작용에 관여하는 에피토프를 맵핑(Mapping)하기 위해 다양한 접근 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 파아지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하여 바이오패닝, 항원 폴리펩타이드를 프로테아제로 분해하여 생성된 단편을 면역블럿팅하여 스크리닝함으로써 에피토프 서열을 포함하는 단편을 결정, 활성화된 막 또는 폴리에틸렌 핀과 같은 고체상에 고정된 펩타이드 어레이를 스크리닝, 에피토프 서열내의 각각의 아미노산 서열 잔기의 중요성을 가용성 펩타이드를 사용한 경쟁적 ELISA 검정방법 등이 있다.
상기 단일클론항체의 항원과의 결합 친화성은 통상의 방법에 따라 결정할 수 있으며, 이러한 방법으로는 특별히 제한하지는 않으나, 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay), 육안 측정법(Visual assessment)을 통해 항원과의 결합을 측정할 수 있다.
본 명세서에서는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 항체로서, 전체 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1)및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다(Cellular and Molecular Immunology 9th Edition, Abbas A. K. et al., 2017).
항체 분자의 '기능적인 단편'이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2, 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(Hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 이루고 있다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제 공개특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. dsFv(이쇄 Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 scFv(단쇄 Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 dsFv와 같이 다이머(dimer)와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 제한 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 발명의 일구체예에 있어서, 본 발명의 단일클론항체는 IgG1 이소타입일 수 있으며, 상기 단일클론항체는 0.1 내지 100 나노몰(nM)의 해리상수로 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포를 제공할 수 있다.
상기 하이브리도마 세포주는, '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 사용하여 마우스를 면역화시키는 단계; 상기 면역화시킨 마우스의 비장세포를 골수종 세포와 융합하여 배양하는 단계; 및 융합된 하이브리도마 세포주에서 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 단백질에 특이적인 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계를 통해 제조될 수 있다.
본 발명의 하이브리도마 세포주를 통해 생산한 단일클론항체는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 특이적으로 인식함으로, 이러한 단일클론항체는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 또는 플라비바이러스의 검출 및 플라비바이러스 감염증의 진단을 위한 용도로 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스 검출용 조성물을 제공할 수 있으며, 나아가 플라비바이러스의 감염 여부를 확인/진단(플라비바이러스 감염증 진단)할 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 상기 플라비바이러스 감염 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 단일클론항체를 이용하여 플라비바이러스의 존재 여부 및 플라비바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있으며, 또한, 플라비바이러스의 감염이 의심되는 생물학적 시료를 대상으로 하여 통상의 항원-항체반응의 분석법을 사용할 수 있다. 항원-항체 반응은 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay), 육안 측정법(Visual assessment) 등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
웨스턴 블로팅(Western blotting)은, 생물학적 시료 중에 존재하는 해당 단백질을 확인하기 위한 유용한 방법이다. 예를 들어, 장기 조직 유래의 추출액 등의 생체 시료액을 아크릴아미드 겔(gel) 전기 영동 시킨 뒤, PVDF 멤브레인에 전이하고, 해당 단백질 또는 해당 펩타이드를 인식하는 항체와 반응시키고, 이로부터 생성되는 면역 복합체를 표지된 제2항체를 이용하여 검출하는 것이다.
면역 염색법은 조직 및 세포에 있어서 대상 폴리펩티드(polypeptide)의 발현 부위를 해석하기 위하여 유효한 방법으로, 예를 들어, 슬라이드글라스 상에 고정되는 조직 절편, 세포 등을 본 발명의 항체와 반응시키고, 이로부터 생성되는 면역 복합체를 표지된 제2항체를 이용하여 검출하는 것에 따라 실시한다.
한편, 생물학적 시료 중에서 특정 단백질의 존재여부는 시료를 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정함으로써 확인할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 '항원-항체 복합체'란 생물학적 시료 중의 특정 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 '생물학적 시료' 또는 '시료'는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료를 말한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료 또는 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 세포파쇄물, 체액, 타액, 뇌척수액 및 소변 등에서 선택된 어느 하나일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리 할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 검출용(진단용) 조성물은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 특이적인 본 발명의 단일클론항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약 및 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 특이적인 다른 종류의 다클론 또는 단일클론항체를 추가로 포함할 수 있다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 상기 항원-항체반응의 분석법의 방법과 동일한 방법으로도 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 검출용(진단용) 조성물은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 검출 또는 플라비바이러스의 감염증 진단을 위한 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공할 수 있다.
본 발명의 검출용(진단용) 조성물은 검출(진단)의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 공지된 다양한 방법을 이용하여 적합한 담체 또는 지지체상에 고정된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(Flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명은 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스 검출용 키트 또는 플라비바이러스의 감염 진단을 위한 키트를 제공한다.
상기 검출용(진단용) 키트는 본 발명의 단일클론항체 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등을 포함할 수 있다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다. 또한 검출용(진단용) 키트는 본 발명의 단일클론항체와 여기에 적용될 시료 중의 항원(항원결정부위)과의 반응을 확인할 수 있는 표지체를 추가로 포함할 수 있다.
상기 표지체의 종류에 따라 당업자에게 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로는 육안, 검출장비, 검출시약 등을 이용할 수 있다. 상기 검출시약은 검사하고자 하는 대상물질(Analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지 시약(Labeled reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분을 포함할 수 있다. 표지된 검출시약은 이미 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 이러한 표지의 예는 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타제, 퍼옥시다제 등으로서, 보다 구체적인 예로는 효소 기질과 결합하여 함께 사용되는 알칼리성 포스파타제와 양고추 퍼옥시다제 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 3,3',5,5' -테트라메틸벤지딘, 4-메톡시-1-나프톨, 4-클로로-1-나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도체와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플로우레세인 (Fluorescein), 피코빌리프로틴(Phycobiliprotein), 로다민(Rhodamine)등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등이 있다. 일예로, 표지수단으로는 효소의 경우 HRP (Horseradish peroxidase)가 있으며, 형광물질로는 FITC (Fluorescein isothiocyanate)가, 발광물질로는 루미놀(Luminol), 이소루미놀 및 루시게닌(Lucigenin)이, 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표지 수단에 의한 표지 여부는 효소의 기질이나, 형광, 발광또는 방사선을 측정하기 위한 도구를 이용하여 확인 가능하다.
본 발명의 일구체예에 있어서, 상기 키트는 기질과의 반응에 의하여 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체접합체, 상기 표지체와 발색반응하는 발색 기질 용액 및 각 반응단계에 사용할 세척액을 추가로 포함할 수 있다.
상기 2차 항체접합체의 표지체는 효소, 발광체, 형광체, 발색체, 전기화학 탐침, 분광용 탐침, 탄소 구조체를 포함하며, 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼리성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase, AP), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose oxidase), 루시퍼라아제(Luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(Malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase), 콜로이드 금(colloidal gold), 금속 나노입자(Metal nanoparticle), 실리카 나노입자(Silica nanoparticle), 유기 형광물질(Organic fluorescent material), 형광 단백질(Fluorescent protein), 양자점(Quantum dot), 방사성 물질(Radioactive material), 방사성 동위원소(Isotope), 색소(Dye), 탄소나노튜브(Carbon nantube), 그래핀(Graphene) 및 풀러렌(Fullerene)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
상기 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, DAB (diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine)의 발색기질 등을 사용할 수 있다. 하나의 예로, TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다.
상기 세척액은 단계에 따라 증류수, TBS (Tris buffered saline) 트윈 완충용액, PBS (Phosphate buffered saline) 트윈 완충용액, NaCl, 트윈-20 (Tween-20), 트리톤 X-100 (Triton X-100) 등을 사용할 수 있다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 반응기에 넣어 3 내지 6회 세척한다.
또한, 본 발명은 시료를 준비하는 단계; 상기 시료에 본 발명의 단일클론항체를 적용하는 단계; 및 항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 플라비바이러스 감염을 진단하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 시료는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 검출하고자 하는 분석 대상 물질로서 플라비바이러스이 의심되는 동물이나 환자의 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 세포파쇄물, 체액, 타액, 뇌척수액 및 소변 등을 예시할 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 항원-항체 반응은 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay), 육안 측정법(Visual assessment)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
나아가 본 발명은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어, '약학적 조성물'은 유효성분으로서 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 포함하는 조성물로서, 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제 등의 다른 화학적 성분을 추가로 포함할 수 있다. 약학적 조성물의 목적은 생물체에 화합물의 투여를 용이하게 하는데 있다. 여기서, 용어 '유효성분'은 생물학적 효과의 원인이 될 수 있는 펩타이드 또는 항체 제제를 말한다. 용어 '약학적으로 허용가능한 담체'는 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 이러한 용어에는 보조제가 포함된다. 적합한 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액들 중 어느 한 가지(예를 들어, 인산완충액) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다. 용어 '부형제'는 활성 성분의 투여를 더욱 용이하게 하기 위하여 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 말한다. 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 전분의 여러가지 당류, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 기름 및 폴리에틸렌 글리콜 등이 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 인간 뿐 아니라 플라비바이러스에 감염될 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양 등의 가축의 플라비바이러스 감염증을 예방 및 치료할 수 있는 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 단일클론항체는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 특이적으로 결합하여 이들의 발현 또는 기능을 억제할 수 있으므로 플라비바이러스에 의해 야기되는 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
폴리아크릴아미드
겔 전기영동(
Polyacrylamide
gel electrophoresis)을 통한 '
플라비바이러스
외피 단백질 도메인 Ⅲ'의 확인
'플라비바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ'로는 지카 바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ, 뎅기 바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ, 웨스트 나일 바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ를 각각 준비하였다.
플라비바이러스의 단백질을 암호화하는 약 3,000~4,000개 아미노산 중에서 '지카 바이러스 외피 단백질 Ⅲ'는 107개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 준비하였으며, 본 발명의 '지카 바이러스 외피 단백질 Ⅲ'의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시하였다.
'뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'는 104개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 준비하였으며, 본 발명의 '뎅기 바이러스 외피 단백질 Ⅲ'의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시하였다.
'웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'는 109개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 준비하였으며, 본 발명의 '웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 Ⅲ'의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시하였다.
'플라비바이러스 3종의 외피 단백질 도메인 Ⅲ'는 순수 분리/정제를 위해 C-말단(C-terminal)에 폴리히스티딘이(Polyhistidine) 연결된 형태(His-tagged)를 이용하였으며, Ni-NTA 레진(Nickel-nitrilotriacetic acid resin)을 사용하여 친화크로마토그래피(Affinity chromatography) 방법으로 '플라비바이러스 외피 단백질 Ⅲ'를 순수 분리/정제하였다. 분리/정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)을 통해 확인하였다.
이들 항원(Antigen)이 높은 순도(purity)로 존재하는지, 알려진 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'의 분자량(Molecular weight)인 약 10~15 킬로달톤(Kilodalton, kDa) 부근에 위치하는지를 확인하기 위해 15% 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 단백질 전기영동을 수행하였다. 이후 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 염색하고, 탈색용액을 이용하여 탈색반응을 진행한 다음 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 확인하였다.
그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 단백질 사이즈 마커(Size marker)와 비교했을 때, '플라비바이러스 3종의 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 모두 10~15 kDa 부근에 존재하는 것을 확인할 수 있었기 때문에 순수 분리/정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'임을 확인할 수 있었다.
<
실시예
2>
효소면역흡착검사(ELISA)를 위한 '
플라비바이러스
외피 단백질 도메인 Ⅲ'가 코팅된 플레이트의 제조
96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰(Well)에 1 ㎍/㎖ 농도로 희석된 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ', '뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ', '웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 각각 서로 다른 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% Tween-20을 포함하고 있는 PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.4) (PBS/T) 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척해 주었다. 다음 블로킹(Blocking)을 위해 1% 소혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 웰에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다.
<
실시예
3>
마우스 면역화 및 항체의
역가
(Antibody titer) 측정
상기 <실시예 1>을 통해 확인된 3종의 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 중, '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 30 ㎍을 PBS 용액을 이용하여 250 ㎕가 되도록 희석시킨 다음, 같은 부피의 Complete Freund's Adjuvant와 섞어주어 에멀젼(Emulsion) 형태로 만든 다음 생후 6주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내로 주사하여 1차 면역화를 수행하였다. 1차 면역화 수행으로부터 2주 후에는 Complete Freund's Adjuvant 대신 Incomplete Freund's Adjuvant를 이용하여 같은 방법 및 실험조건으로 2차 면역화를 수행하였다. 2차 면역화로부터 2주 후에 마우스의 꼬리 정맥으로부터 10 ㎕의 혈액을 채취하여 마우스 체내에 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 항체가 충분히 생성되었는지에 대한 역가(Antibody titer)를 측정하였다.
Indirect ELISA 방식으로 마우스 혈액 내 항체의 역가를 측정하였으며, 상기 <실시예 2>로부터 준비된 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'가 코팅된 효소면역흡착검사용 플레이트에 1/102, 1/103, 1/104의 비율로 희석된 마우스 혈액 100 ㎕씩을 각각의 웰(well)에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 3회 세척하였다. 이후 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP) 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG(Goat anti-mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H2SO4 용액을 100 ㎕씩 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다.
혈액 내에 존재하는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 항체의 역가('지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 반응성)에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과 면역화가 잘 이루어진 것으로 판단되어 최종적으로 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 30 ㎍을 PBS 용액에 희석하여 별도의 Adjuvant 없이 면역반응 극대화를 위한 부스터 주입(Booster injection)을 수행하였다.
<
실시예
4>
세포융합을 통한
하이브리도마
(
Hybridoma
) 세포주 제작
세포융합은 기존에 잘 알려진 하이브리도마 생산기술(K
hler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol . (1981) Vol. 73, pp. 3-46.)을 통해 이루어졌다. 상기 <실시예 3>에서 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'가 면역화된 마우스로부터 비장(Spleen)을 적출한 다음, 조직분쇄기로 비장을 분쇄하여 RPMI 1640 배지에 현탁하여 비장세포(Splenocyte)를 계수하였다. 다음 37℃, 5% CO2의 세포배양기에서 배양한 T75 플라스크에 있는 마우스 골수종세포(Myeloma, Sp2/0-Ag14)를 회수하여 RPMI 1640 배지에 현탁하여 같은 방법으로 계수하였다. 계수한 마우스의 비장세포와 골수종세포가 세포수를 기준으로 5:1이 되도록 하나의 50 ㎖ 튜브에 옮겨 담은 뒤, 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포에 50%의 PEG1500 (polyethylene glycol) 1 ㎖를 처리한 다음, 39 ㎖의 37℃ RPMI 1640 배지를 천천히 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시켜 세포융합이 일어나도록 하였다. 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수한 다음, HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine)을 함유하고 있는 RPMI 1640 배지(HAT 배지)를 이용하여 적절한 수의 세포가 되도록 현탁한 다음 세포배양용 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰에 100 ㎕씩 분주해주었다. 이후 37℃, 5% CO2의 조건으로 세포배양기 내에서 배양하였다.
<
실시예
5>
고반응성
하이브리도마
세포주의 선별
상기 <실시예 4>를 통해 융합된 세포를 7일 이상 배양한 다음, 육안이나 현미경을 통해 융합세포가 군락을 형성하여 자라는 것을 확인한 다음, 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰(well)에 있던 기존 HAT 배지를 교체하여 상기 <실시예 4>와 같은 조건에서 3일간 추가적으로 배양하였다. 이후 96-웰(96-well) 세포 배양 플레이트 내에 존재하는 각각의 웰(well)에 존재하는 배지를 취하여 상기 <실시예 2>에서 제조된 효소면역흡착검사용 플레이트를 사용하여 <실시예 3>과 같은 방법으로 Indirect ELISA를 수행하였다.
그 결과 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'와 높은 반응성을 보이는 웰(well)에 존재하는 하이브리도마를 선별하였으며, 추가적으로 24-웰 플레이트(24-well plate) 및 6-웰 플레이트(6-well plate)에서의 계대배양을 거쳐 생존능 및 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 반응성을 같은 방법으로 확인하였다. 생존능을 상실했거나 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 반응성이 없는 하이브리도마를 제외한 후, '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 높은 반응성을 보이는 하이브리도마 세포주들을 선별하였다. 선별된 하이브리도마 세포주들은 단일클론의 하이브리도마 세포주를 얻기 위해 서브-클로닝(Sub-cloning) 및 클로닝(Cloning) 과정을 진행하였다.
<
실시예
6>
단일클론항체
(Monoclonal antibody)의 생산, 분리/정제 및 확인
선별된 단일클론의 하이브리도마 세포주로부터 다량의 단일클론항체를 얻기 위해 마우스의 복강 내로 하이브리도마 세포주를 주입하여 복수(Ascites)가 생성되도록 유도하였다. 이는 단일클론항체 획득을 위해 본 실시예에서 수행한 것일 뿐, 생체 외 세포배양(In vitro cell culture)을 통해서도 단일클론항체의 획득이 가능하다. 상기 마우스로부터 획득한 복수에 존재하는 불순물 제거 및 혈청(Serum)의 분리를 위해 3,000 rpm에서 10분간 원심분리를 수행한 후 주사기 필터를 통해 필터링을 수행하였다.
상기의 과정으로부터 준비된 혈청에 포함된 단일클론항체인 이뮤노글로불린 G (Immunoglobulin G, IgG)만을 선택적으로 분리/정제하기 위해 준비된 배지를 20 mM KH2PO4 (pH 7.4) 용액으로 평형화 되어 있는 아가로즈(agarose)-Protein G 레진(resin)이 충진(packing)되어 있는 컬럼(column)에 흘려주었다. 혈청을 모두 흘려준 다음, 다시 20 mM KH2PO4 (pH 7.4)를 이용하여 비특이적으로 결합되어 있거나 끼어있는 단일클론항체 이외의 불순물들을 제거해 주었다. 이후 0.1 M Glycine (pH 2.8) 용액을 흘려주어 Protein G와 결합되어 있는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 용출시켜주었으며, 용출되는 즉시 pH 중화(Neutralization)를 위해 1 M Tris-HCl (pH 7.4) 용액을 용출액의 1/3에서 1/5 정도의 부피 비율(Volume ratio)이 되도록 섞어주었다. 이후 단일클론항체 용출액의 버퍼(용액)를 교환해주기 위해 PBS 용액을 이용하여 4℃에서 16시간 이상 투석을 2회 수행하였다. 투석이 완료된 단일클론항체는 주사기 필터를 통해 응집물(aggregate)을 제거한 다음, 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이후 '도 2'에 나타낸 바와 같이 <실시예 1>과 같은 조건으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여 쿠마시 블루 염색을 통해 고순도의 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 확인하였다.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 50 kDa 부위와 25 kDa 부위에서 각각 항체의 중쇄(Heavy chain)와 경쇄(Light chain)만을 관찰할 수 있었기 때문에, 단일클론항체의 분리/정제가 잘 이루어졌다고 판단하였다.
<
실시예
7>
단일클론항체의
이소타입
(
Isotype
) 확인 및
해리상수
(Dissociation constant, K
D
) 측정
상기 <실시예 6>으로부터 순수 분리/정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체의 이소타입을 확인하기 위해, 마우스 IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM에 각각 특이적으로 결합하는 염소(Goat)의 항체를 1 ㎍/㎖의 농도가 되도록 PBS (pH 7.4) 용액을 이용하여 희석시킨 다음 효소면역흡착검사용 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(well)을 3회 세척해 주었다. 다음은 블로킹(Blocking)을 위해 1% 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 웰(well)에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음 PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다. 그 다음 상기 <실시예 6>으로부터 준비된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 100 ㎕ 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켜주었으며, 반응이 끝난 후 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG (Goat anti-mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰(Well)에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H2SO4 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 이소타입 반응성에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과는 도 3에서 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 6>으로부터 분리/정제된 단일클론항체의 이소타입은 IgG1임을 확인할 수 있었다.
한편, 상기 <실시예 6>으로부터 순수 분리/정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체의 해리상수(Dissociation constant, KD) 또는 결합친화도(Binding affinity)를 측정하기 위해 상기 <실시예 2>로부터 제조된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'가 코팅되어 있는 효소면역흡착검사용 플레이트를 준비하였다. 상기 단일클론항체를 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해서는 100 나노몰(nM)의 몰농도(Molar concentration)로 부터 PBS 용액을 이용하여 1/2씩 연속적으로 희석하여 0 nM을 포함한 총 16가지 서로 다른 농도의 단일클론항체를 준비하였으며, '뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 및 '웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해서는 2,000 나노몰(nM) (=2 마이크로몰(μM))의 몰농도(Molar concentration)로 부터 PBS 용액을 이용하여 1/2씩 연속적으로 희석하여 0 nM을 포함한 총 16가지 서로 다른 농도의 단일클론항체를 준비하였으며, 이들을 각각의 웰에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액인 0.5 N H2SO4 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 서로 다른 농도의 단일클론항체에 대한 반응성의 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 6>으로부터 분리/정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체의 해리상수는 '지카 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅲ'에 대해서는 (0.151±0.001) 나노몰(nM), '뎅기 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅲ'에 대해서는 (19.410±1.977) 나노몰(nM), '웨스트 나일 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅲ'의 대해서는 (8.525±0.468) 나노몰(nM) 임을 확인할 수 있었다.
<
실시예
8> 다른 속(Genus)의 모기 매개 바이러스 외피 단백질과의 교차반응 확인
상기 <실시예 6>을 통해 분리/정제된 단일클론항체가 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에만 특이적으로 결합(또는 반응)하면서, 플라비바이러스와 같은 숙주(Host)인 각다귀 속(Aedes genus)의 모기를 이용하는 알파바이러스(Alphavirus)의 외피 단백질에는 결합(또는 반응)하지 않는지 확인하기 위해 상기 <실시예 2>의 과정과 같은 방법으로 제조된 효소면역흡착검사용 플레이트를 사용하였다. 상기 <실시예 6>을 통해 분리/정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 100 nM의 농도로 100 ㎕씩 플라비바이러스에 속하는 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ, 뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ, 웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ 및 알파바이러스에 속하는 치쿤군야 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅱ가 각각 코팅되어 있는 플레이트에 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 참고로, 알파바이러스의 경우 알파바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅱ가 외피 단백질 Ⅲ의 역할을 한다고 알려져 있어, 본 실험에서는 알파바이러스에 속하는 치쿤군야 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅱ를 사용하였다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(well)을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H2SO4 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 서로 다른 단백질에 대한 단일클론항체의 반응성 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 6>으로부터 분리/정제된 단일클론항체가 다른 바이러스의 외피 단백질과는 결합(반응)하지 않으며, '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에만 특이적으로 결합(반응)하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 하이브리도마 세포주를 'Hybridoma JZE3-1'로 명명하였으며, 'Hybridoma JZE3-1'로부터 생산된 단일클론항체는 해리상수가 0.1 내지 100 나노몰(nM) 범위로 결합친화도가 매우 높고, 다른 모기 매개 바이러스의 외피 단백질에는 결합하지 않는 동시에 플라비바이러스의 외피 단백질 도메인 III에만 결합하는 단일클론항체로 특정지었다. 따라서 본 발명자들은 'Hybridoma JZE3-1' 세포주의 추가적인 배양 후에 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2019년 7월 5일자로 세포기탁을 진행하였으며, 기탁기관으로부터 2019년 7월 11일자 기탁번호 KCTC18776P를 부여받았다.
이제까지 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Monoclonal antibody with specificity for the envelope protein
domain III of flaviviruses, hybridoma cell line producing the
same and use thereof
<130> NPDC-80117
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide sequence of Zika Virus Envelope Protein Domain III
<400> 1
Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro
1 5 10 15
Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly
20 25 30
Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln
35 40 45
Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr
50 55 60
Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe
65 70 75 80
Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His
85 90 95
His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys
100 105
<210> 2
<211> 104
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide sequence of Dengue Virus Envelope Protein Domain III
<400> 2
Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile
1 5 10 15
Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly
20 25 30
Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys
35 40 45
Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu
50 55 60
Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser
65 70 75 80
Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe
85 90 95
Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln
100
<210> 3
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide sequence of West Nile Virus Envelope Protein Domain
III
<400> 3
Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe
1 5 10 15
Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu Leu
20 25 30
Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser Ser Val
35 40 45
Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn
50 55 60
Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu
65 70 75 80
Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Glu Gln
85 90 95
Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile
100 105
Claims (13)
- 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
- 제1항에 있어서,
상기 단일클론항체는 IgG1 이소타입인 것을 특징으로 하는 단일클론항체. - 제1항에 있어서,
상기 단일클론항체는 0.1 내지 100 나노몰(nM)의 해리상수로 플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ에 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체. - 플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포.
- 제1항의 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 조성물.
- 제1항의 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 키트.
- 제6항에 있어서,
상기 키트는 제1항의 단일클론항체 이외에 표지체와 축합된 항체; 및 발색기질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트. - 제7항에 있어서,
상기 표지체는 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼리성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase, AP), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose oxidase), 루시퍼라아제(Luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(Malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase), 콜로이드 금(colloidal gold), 금속 나노입자(Metal nanoparticle), 실리카 나노입자(Silica nanoparticle), 유기 형광물질(Organic fluorescent material), 형광 단백질(Fluorescent protein), 양자점(Quantum dot), 방사성 물질(Radioactive material), 방사성 동위원소(Isotope), 색소(Dye), 탄소나노튜브(Carbon nantube), 그래핀(Graphene) 및 풀러렌(Fullerene)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트. - 제7항에 있어서,
상기 발색기질은 DAB (diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트. - 제1항의 단일클론항체를 플라비바이러스의 존재를 확인하고자 하는 시료와 접촉시켜 항원-항체 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 플라비바이러스를 검출하는 방법.
- 시료를 준비하는 단계;
상기 시료에 제1항의 단일클론항체를 적용하는 단계; 및
항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 플라비바이러스 감염증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - 제11항에 있어서,
상기 시료는 플라비바이러스 감염이 의심되는 대상의 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 세포파쇄물, 체액, 타액, 뇌척수액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법. - 제11항에 있어서,
상기 항원-항체 반응은 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay) 및 육안 측정법(Visual assessment)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
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| KR102008609B1 (ko) * | 2018-01-29 | 2019-10-21 | 충북대학교 산학협력단 | 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 특이 항체를 생산하는 하이브리도마 및 이로부터 생성된 항체, 이의 용도 |
-
2019
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| KR102008609B1 (ko) * | 2018-01-29 | 2019-10-21 | 충북대학교 산학협력단 | 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 특이 항체를 생산하는 하이브리도마 및 이로부터 생성된 항체, 이의 용도 |
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Emerging Microbes & Infections (2017) 6, e89* * |
| Vaccine. 2017 July 24, 35(33) 4287-4294 * |
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