CN119768689A - 强毒性淀粉样蛋白寡聚体的诊断用途 - Google Patents

Abstract

一种新的强毒性淀粉样蛋白寡聚体Aβo*3F作为靶标用于诊断早期和中晚期阿尔茨海默病(AD)及AD源性轻度认知障碍(MCI)的用途，Aβo*3F被3F抗体特异性结合，存在于AD患者和AD源性MCI患者的脑脊液(CSF)、血液和/或脑组织中，且水平在AD患者、MCI患者和健康老年人的CSF、血液和/或脑组织中呈现极显著差别，为超强毒性寡聚体，是Aβ寡聚体混合物中最主要的毒性成分，具有强烈的致病作用，在AD的发生和发展中起着关键作用。

Description

强毒性淀粉样蛋白寡聚体的诊断用途 技术领域

本发明涉及强毒性淀粉样蛋白寡聚体的诊断用途。具体而言，本发明涉及新的强毒性淀粉样蛋白寡聚体Aβo*3F作为靶标用于诊断早期和中晚期阿尔茨海默病(AD)及AD源性轻度认知障碍(MCI)的用途。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD，俗称老年性痴呆)是一种慢性神经退行性疾病，目前全球大约有5000万AD患者，迄今为止，没有任何特异性的有效治疗药物和手段，已给人类带来沉重负担。AD的发展时程较长，起初患者无明显临床症状，逐步发展为记忆减退、性格行为发生变化，后期AD患者脑内的神经元广泛死亡，大脑显著萎缩，治疗药物难以起效。近几年的临床试验表明，对于早期发现、早期有预警的AD患者进行早期干预，可延缓AD的发展，而要实现对AD患者的早期治疗和干预，首先应及时准确地鉴别诊断出AD患者，但目前尚无理想的早期诊断方法和技术应用于临床。研究表明，诱发AD发生发展的β淀粉样蛋白(Aβ)变化早在临床症状出现15～20年之前就已经出现。

AD的病理特征为脑内Aβ聚集形成的老年斑和tau蛋白聚集形成的神经纤维缠结。Aβ可聚集成寡聚体、前纤维和成熟的纤维。Aβ寡聚体是最具神经毒性的聚集体形式，报道较多的为Aβ二聚体、三聚体、ADDL等形式。Aβ寡聚体按照分子量大小可分为低分子量和高分子量两种类型，并且高分子量寡聚体具有更大的神经细胞毒性。Aβ二聚体是最小的Aβ寡聚体，一般认为Aβ二聚体可能是Aβ寡聚体的基本组成单元。Aβ二聚体在AD患者和AD转基因小鼠的大脑中含量升高，且在SDS和强变性剂中稳定，具有一定的神经毒性。除Aβ二聚体外，Aβ三聚体也被认为是多种Aβ寡聚体如六聚体和十二聚体的聚集单元，Aβ三聚体在AD患者和AD转基因小鼠大脑中出现较早，但Aβ三聚体与Aβ斑块沉积之间没有显著相关性，且其毒性目前还存在争议。另外，Aβ寡聚体还能够通过进一步聚集形成直径约为12nm的球形低聚物(ASPD)和直径为5-6nm的可扩散寡聚体(ADDL)。此两种形式的聚合物均被认为是具有独特构象且具有神经毒性的Aβ寡聚体。目前，尽管已有多种Aβ寡聚体形式被发现，然而具体哪种或哪些Aβ 寡聚体毒性最大，且对AD的发生发展起到主要作用尚未可知。而且，特异检测寡聚体，特别是毒性寡聚体的方法十分有限，获得特异结合毒性淀粉样蛋白寡聚体的抗体尤其困难，这严重限制了针对Aβ寡聚体的临床检测和治疗制剂的开发。

大量研究表明，神经退行性疾病的严重程度与患者脑内的淀粉样蛋白寡聚体水平密切相关，Aβ寡聚体通过引起功能性神经元死亡、认知损伤和痴呆，在AD的发生和发展中发挥关键作用，但Aβ寡聚体种类繁多，可通过多种作用机制影响中枢神经的功能，各种Aβ寡聚体间毒性各异，在大小、构象、聚集方式、毒性以及在脑内出现的时间上也存在很大的差异。尽管许多研究表明一些Aβ寡聚体，如二聚体、三聚体、ADDL等能够发挥神经毒性作用，但当前对于真正能够起到关键致病作用的Aβ寡聚体的形式了解还不够深入。因此，确定与AD发生发展关系密切的关键毒性寡聚体，可为AD的早期预警和早期诊断提供理想标志物，也可为AD的治疗提供理想靶标。

除影像检测外，特异性生物标志物是AD临床诊断和检测的基础。目前，业界比较认可的AD诊断标志物主要为脑脊液(CSF)中Aβ42、Aβ40、总的tau蛋白(T-Tau)和磷酸化的tau蛋白(P-Tau)等。其他标志蛋白也时有报道，如sAPPα、sAPPβ、BACE1、Aβ寡聚物、总Aβ、轴突和突触类标记物等。这些CSF标记物具有较高的诊断准确性，联合AD其他诊断指标，可使AD的诊断敏感度和特异性达到85-90％。与CSF相比，血液易于获取，侵袭性小，是临床检测的理想样本来源。目前，已有多项研究开始联合应用外周血蛋白、脂质和代谢物等的含量来区分AD患者和正常人群，如外周血细胞膜上的Aβ42二聚体含量、可解聚Aβ42纤维的血浆凝溶胶蛋白(GSN)及GSN的主要降解酶MMP3含量等。最近，检测外周血中的特异性成分如Tau181、Tau217、Aβ含量也成为研究的热点。

主流的AD生化检测方法主要集中在对CSF中Aβ以及Tau蛋白标志物的测定上。大量研究表明，在正常人发展成为早期认知障碍(MCI)及AD患者的过程中，CSF中Aβ42单体水平逐渐降低，Aβ42寡聚体和T-Tau水平逐渐升高，而P-Tau与Aβ42比值变化更加明显。但是，获取CSF样本需要做腰椎穿刺，损伤较大，MCI患者和轻度AD患者往往难以接受。此外，由于CSF样本前处理和检测方法不统一，导致不同厂家、不同实验室的检测结果差别巨大，严重限制了该类方法的临床推广应用。相比CSF而言，基于血液的检测成本较低、依从性高。但是，血液中可用于AD诊断检测的标记物含量低、种类少，并且受外周组织和器官的影响大，阻碍了AD诊断方法的研发。目前，国际上最前沿的方法是通过液质联用(LC-MS)以及单分子免疫分析技术(Simoa)检测血 液中Aβ42与Aβ40的比值，以及P-Tau181、P-Tau217等蛋白的含量。血液里的这些指标虽然具有一定的诊断意义，但特异性差，单一指标不能很好地区分目标人群，其原因在于对Aβ或磷酸化Tau蛋白的检测是对其总量的检测，其中包含有它们的单体及其多种多样的毒性各异的聚集物。单体和许多类型的寡聚体细胞毒性小，但它们的含量高，对Aβ总体水平数值贡献大，严重干扰了毒性大、具有关键致病作用的淀粉样蛋白寡聚体的检测，而只有毒性大的寡聚体才与AD发生发展直接相关，它的出现和水平高低直接精准关联着患者脑部病理变化，对该类寡聚体的特异检测才更有价值和意义。

因此，本领域仍然存在对血液中特定Aβ寡聚体含量进行高灵敏度和高特异性检测用以诊断AD的迫切需求。

发明内容

本发明的一个方面涉及一种诊断受试者是否患有早期和中晚期AD或AD源性MCI或处于患有AD的风险中的方法，所述方法包括如下步骤:

a)任选地，提供来自受试者的待检测样品，

b)使检测所述受试者样品中Aβo*3F的存在和/或水平的试剂与受试者样品接触，

c)检测所述受试者样品中Aβo*3F的存在和/或水平，

其中，所述受试者样品中Aβo*3F的存在和/或水平指示了所述受试者患有AD或AD源性MCI，其中所述Aβo*3F是与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱(SEC)分析，其分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ ID NO：17-22所示。

在一些实施方案中，所述受试者为疑似患有AD或AD源性MCI的患者，优选地，所述受试者为人、非人灵长类动物、猫或犬。

在一些实施方案中，所述诊断方法还包括临床神经心理学和神经影像学评估步骤，优选地，神经影像学是Aβ-PET扫描成像和/或tau-PET。更优选地，神经影像学是3F-PET扫描成像，即基于3F的免疫PET成像，用于识别和检测受试者脑中Aβo*3F的存在和/或水平。

在一些实施方案中，所述诊断方法还包括检测所述受试者样品中tau水平的变化，优选地，所述tau水平为tau总水平或者磷酸化tau水平。

本发明的第二方面涉及一种诊断受试者是否患有早期和中晚期AD或AD源性MCI或处于患有AD的风险中的试剂盒，其包含检测受试者样品中Aβo*3F的存在和/或水平 的试剂，其中所述Aβo*3F是与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱分析，其分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ ID NO：17-22所示。

在一些实施方案中，受试者样品是进行所述诊断时从受试者现场获取的样品。在一些实施方案中，受试者样品是受试者在先前的诊断程序中获取的样品。

在一些实施方案中，所述分子排阻色谱分析利用Superdex 200 10/300GL分子筛色谱柱进行。

在一些实施方案中，Aβo*3F存在于获自受试者的脑脊液样品中。在一些实施方案中，利用免疫沉淀和分子排阻色谱分析受试者的脑脊液样品并测得Aβo*3F的分子量。

在一些实施方案中，所述方法或试剂盒涉及或包括Aβo*3F的富集试剂，所述Aβo*3F的富集试剂包括特异性结合Aβo*3F的结合剂，优选地，特异性结合Aβo*3F的结合剂是特异性结合Aβo*3F的抗体，优选地，所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体或其抗原结合片段，更优选地，所述抗原结合片段选自scFv、F(ab')2、Fab2、Fab、Fab’、Fv、Fd、dAb、骆驼抗体、纳米抗体、双抗体或双特异性抗体。通过所述Aβo*3F的富集试剂，受试者样品中的Aβo*3F可以被有效富集，以用于后续程序。

在一些实施方案中，检测Aβo*3F的存在和/或水平的试剂包括特异性结合Aβo*3F或Aβ聚集物的第一结合剂，优选地，特异性结合Aβo*3F或Aβ聚集物的第一结合剂是特异性结合Aβo*3F或Aβ聚集物的抗体，优选地，所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体或其抗原结合片段，更优选地，所述抗原结合片段选自scFv、F(ab')2、Fab2、Fab、Fab’、Fv、Fd、dAb、骆驼抗体、纳米抗体、双抗体或双特异性抗体。在一些实施方案中，特异性结合Aβo*3F或Aβ聚集物的第一结合剂是特异性结合Aβo*3F或Aβ聚集物的scFv或全长抗体。

在一些实施方案中，所述第一结合剂与允许其检测的检测剂连接。

在一些实施方案中，所述Aβo*3F可以用3F抗体的K98R突变体进行检测和定义，用K98R突变体检测到的Aβ寡聚体经检测与3F抗体检测到的Aβ寡聚体一致，均为Aβo*3F，但K98R突变体与Aβo*3F结合的亲和力高于3F，可以更灵敏地检测Aβo*3F的存在与否并可以更灵敏地诊断神经退行性疾病如AD。

在一些实施方案中，特异性结合Aβo*3F或Aβ聚集物的第一结合剂是3F抗体或其K98R突变体。

在一些实施方案中，检测Aβo*3F的存在和/或水平的试剂还包括第二结合剂，所述 第二结合剂与所述第一结合剂特异性结合，优选地，所述第二结合剂是特异性结合所述第一结合剂的抗体，优选地，所述特异性结合所述第一结合剂的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体或其抗原结合片段，更优选地，所述抗原结合片段选自scFv、F(ab')2、Fab2、Fab、Fab’、Fv、Fd、dAb、骆驼抗体、纳米抗体、双抗体或双特异性抗体，优选地，所述特异性结合所述第一结合剂的抗体与允许其检测的检测剂连接。在一些实施方案中，所述特异性结合所述第一结合剂的抗体是全长抗体。

在一些实施方案中，所述检测剂选自化学发光标记、电化学发光标记、发色团、荧光标记、荧光素型标记、伞形酮、丽丝胺、花菁、德克萨斯红、BODIPY(英杰公司)或其类似物、顺磁性标记、放射性标记、生物素、链霉亲和素/生物素、亲和素/生物素、半抗原、地高辛、金属络合物、金属、酶、胶体金或其组合。在一些实施方案中，所述检测剂选自化学发光标记、电化学发光标记、发色团、荧光标记、放射性标记、酶、或其组合。在一些实施方案中，所述检测剂是化学发光标记或电化学发光标记。

在一些实施方案中，所述检测选自化学发光测定、电化学发光测定、酶联免疫吸附测定、免疫荧光测定、免疫组织化学测定、免疫色谱测定、放射免疫测定、单分子免疫分析技术(Simoa)、流式细胞术、细胞分选术、免疫沉淀测定、免疫扩散测定、斑点印迹测定、Western印迹、蛋白质芯片、正电子发射断层术和/或单光子发射计算机断层术，优选地，所述试剂盒包括实施选自化学发光测定、电化学发光测定、酶联免疫吸附测定、免疫荧光测定、免疫组织化学测定、免疫色谱测定、放射免疫测定、单分子免疫分析技术、流式细胞术、细胞分选术、免疫沉淀测定、免疫扩散测定、斑点印迹测定、Western印迹和/或蛋白质芯片的检测所需的试剂、材料、容器和/或装置，优选地，所述酶联免疫吸附测定选自直接酶联免疫吸附测定、间接酶联免疫吸附测定、直接夹心酶联免疫吸附测定以及间接夹心酶联免疫吸附分析。

在一些实施方案中，所述受试者样品选自受试者的细胞、组织、器官和/或体液，优选地，所述体液选自全血、血浆、血清、脑脊液、淋巴液、唾液、滑液、支气管肺泡灌洗液、痰、腹水、尿液、羊水、腹膜液、心包液、精液和/或阴道分泌物，优选地，所述体液选自全血、血浆、血清和/或脑脊液。

在一些实施方案中，所述特异性结合Aβo*3F的富集试剂或第一结合剂被附着至固体支持物上。

在一些实施方案中，所述方法还包括检测对照样品的步骤，和/或所述试剂盒还含有对照样品，所述对照样品来自健康受试者或未患有AD和AD源性MCI的受试者。

在一些实施方案中，所述特异性结合Aβo*3F的抗体为针对Aβo*3F进行免疫所获得多克隆抗体和/或单克隆抗体或其抗原结合片段，优选地，所述抗体为人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、绵羊抗体或非人灵长类动物抗体。

在一些实施方案中，基于MSD电化学发光方法，健康人群的脑脊液中Aβo*3F的浓度为Aβ42o*3F:80.44±20.88pg/ml、Aβ40o*3F:24.35±5.08pg/ml；和/或血浆中Aβo*3F的浓度为Aβ42o*3F:71.63±36.8pg/ml、Aβ40o*3F:2.24±0.92pg/ml；MCI人群的血浆中Aβo*3F的浓度为Aβ42o*3F:112.93±25.02pg/ml、Aβ40o*3F:4.64±1.43pg/ml；AD患者人群的脑脊液中Aβo*3F的浓度为Aβ42o*3F:264.8±42.26pg/ml、Aβ40o*3F:85.74±10.62pg/ml，和/或血浆中Aβo*3F的浓度为Aβ42o*3F:159.44±36.8pg/ml、Aβ40o*3F:14.0±5.59pg/ml；或

基于化学发光方法，健康人群的血浆中Aβ42o*3F的浓度为68.02±39.17pg/ml；MCI人群的血浆中Aβ42o*3F的浓度为124.5±12.57pg/ml；AD患者人群的血浆中Aβ42o*3F的浓度为205.75±50.96pg/ml。在一些实施方案中，所述MSD电化学发光方法如说明书实施例7所述进行。在一些实施方案中，所述化学发光方法如说明书实施例8所述进行。

在一些实施方案中，基于MSD电化学发光方法和化学发光方法，所述检测的灵敏度低至0.5pg/ml。

在一些实施方案中，特异性结合Aβo*3F的抗体是特异性针对Aβo*3F的不同表位的多种抗体，例如分别特异性针对Aβo*3F的2个、3个、4个、5个或更多个不同表位的2种、3种、4种、5种或更多种抗体。

在一些实施方案中，从样本中富集Aβo*3F的步骤利用特异性结合Aβo*3F的抗体的免疫沉淀法进行。

换言之，在前期研究中，本发明人利用噬菌体显示技术在国际上率先筛选出了特异结合Aβ寡聚体的全人源单链抗体W20(参见CN101463082A)，3F抗体(氨基酸序列如SEQ ID No.23所示)是W20抗体的改进形式，其相对于W20抗体，与Aβ寡聚体的亲和力显著提高，能够更显著地抑制Aβ的聚集和Aβ寡聚体诱导的神经细胞毒性，更有效地改善AD模型小鼠的认知和记忆功能，降低小鼠脑内的病理变化。更有意义的是，该抗体特异识别的Aβ寡聚体为超强毒性寡聚体，是Aβ寡聚体混合物中最主要的毒性成分，具有强烈的致病作用，在AD的发生和发展中起着关键作用，3F识别的强毒性寡聚体存在于AD患者和AD源性MCI患者的CSF、血液和/或脑组织中，且其水平在AD 患者、MCI患者和健康老年人三类人群的CSF、血液和/或脑组织呈现极显著差别，因此可精确区分出AD患者、MCI患者和健康老年人群。该种毒性寡聚体也存在于AD转基因小鼠中，并与AD转基因小鼠的发病直接相关。本发明中将3F识别的强毒性Aβ寡聚体称为AβO*3F，可采用免疫沉淀(使用3F抗体)从Aβ寡聚体混合物中分离而来，其典型特征为Aβ高分子量寡聚体，基于分子排阻色谱(SEC)分析，其分子量大小约为588kDa，直径约为10nm，对神经元有强毒性作用，其毒性比Aβ寡聚体混合物毒性高200倍以上。Aβo*3F可激活小胶质细胞和星形胶质细胞，分泌大量的炎症因子。

附图说明

图1显示了免疫沉淀制备Aβo*3F、Aβ*6E10和Aβ-ID示意图。

图2显示了Aβo*3F的分子量大小和形态表征：

A：ThT检测Aβ聚集状态；

B：Dot blot检测不同孵育条件得到的寡聚体与3F、A11和6E10抗体的结合情况；

C：10μM Aβ孵育0-4天得到的Aβos与3F抗体的亲和力；

D：Western blot检测sAβo*3F的条带分布；

E：分子排阻色谱(SEC)分析sAβo*3F分子量大小；sAβo*3F和SEC标准品的SEC分析(Superdex 200 10/300)，SEC标准品：1.甲状腺球蛋白(669kDa)，2.铁蛋白(440kDa)，3.醛缩酶(158kDa)，4.伴清蛋白(75kDa)，5.卵清蛋白(44kDa)，6.碳酸酐酶(29kDa)；

F：根据SEC标准品分子量和洗脱体积拟合线性方程(Y)，和相关系数(r2)；

G：Western blot检测mAβo*3F的条带分布；

H：SEC分析mAβo*3F分子量大小；

I：Western blot检测hAβo*3F的条带分布。

图3显示了Aβo*3F的神经细胞毒性作用：

A：sAβos对N2a细胞毒性的IC50；

B：sAβo*3F对N2a细胞毒性的IC50；

C：MTT法比较sAβos、sAβo*3F和sAβ-ID对N2a细胞的神经毒性；

D：mAβo*3F对N2a细胞和原代神经元毒性的IC50；

E：MTT法比较mAβ*6E10、mAβo*3F和mAβ-ID对原代神经元的细胞毒性；

F：hAβo*3F对原代神经元毒性的IC50；

G：MTT法比较hAβ*6E10、hAβo*3F和hAβ-ID对原代神经元的细胞毒性。

图4显示了Aβo*3F对胶质细胞的细胞因子表达水平的影响：

A：mAβo*3F对小胶质细胞的TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平的影响；

B：mAβo*3F对原代星形胶质细胞的TNF-α、iNos、IL-1β、IL-6表达水平的影响；

C：mAβo*3F对原代星形胶质细胞的TSP1、Gpc4和Gpc6表达水平的影响。

图5显示了Aβo*3F对小鼠认知的影响和对脑内神经元的损伤作用：

A：新事物识别实验中各组小鼠的认知指数；

B：Y迷宫实验中各组小鼠在新臂的持续时间；

C：Golgi染色检测小鼠神经元树突棘的密度；

D：对C中树突棘密度的统计分析；

E：尼氏染色检测小鼠海马区神经元的数量，比例尺：20μm；

F、G：通过Image J软件对DG区(F)和CA1区(G)神经元数量进行统计分析。

图6显示了Aβo*3F激活小鼠脑内的胶质细胞产生神经炎症：

A：免疫组织化学实验检测小鼠海马DG区和CA1区小胶质细胞的活化程度，比例尺：20μm；

B：免疫组织化学实验检测小鼠海马DG区和CA1区星形胶质细胞的活化程度，比例尺：20μm；

C、D：用Image J软件量化DG区(C)和CA1区(D)Iba-1阳性小胶质细胞的面积；

E、F：用Image J软件量化DG区(E)和CA1区(F)GFAP阳性星形胶质细胞的面积；

G、H：ELISA检测小鼠海马区IL-6(G)和IL-1β(H)的表达水平。

图7显示了电化学发光法检测AD患者CSF和血浆中Aβo*3F水平：A、B：MSD法检测AD患者和健康人群(Con)的CSF中分离出的Aβo*3F中相应的Aβ42(A)和Aβ40(B)的水平；

C、D：MSD法检测轻度认知障碍(MCI)、AD和健康人群(Con)的血浆中分离出的Aβo*3F中相应的Aβ42(C)和Aβ40(D)的水平。

图8显示了化学发光法检测AD患者、MCI患者和健康人群血浆中Aβo*3F水平。

图9显示了通过检测CSF或血浆样本中Aβo*3F水平用于AD诊断。

图10显示了3F抗体重链98位K突变成R后，与Aβo*3F寡聚体结合的亲和力得到进一步提升，提示该优化的单链抗体可以用于更好诊断的Aβo*3F寡聚体的存在并进而用于更好地诊断AD。

具体实施方式

定义

除非另外指明，否则权利要求和说明书中使用的术语如下文所示进行定义。

除非本文中另外定义，否则与本文所述的本发明方法和组合物结合使用的科学和技术术语应具有本领域中的普通技术人员通常所理解的含义。另外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。通常，与以下结合使用的命名法和以下技术为本领域中众所周知且常用的那些：本文所述的生物化学、免疫学酶学、分子与细胞生物学、微生物学、遗传学和多肽化学。

除非另外指明，否则本文所述的方法和技术通常是根据本领域中众所周知的常规方法并且如在本说明书中通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述来执行的。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992，以及至2002年的增刊)；Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)；Taylor和Drickamer,Introduction to Glycobiology,Oxford Univ.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual,Worthington Biochemical Corp.,Freehold,N.J.；Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,第I卷,CRC Press(1976)；Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,第II卷,CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)。

本文提及的所有出版物、专利和其他参考文献均以特此引用的方式整体并入本文。

除非另外指示，否则以下术语应理解成具有以下含义。

术语“处于患有阿尔茨海默病的风险中”是指具有患有阿尔茨海默病的风险，例如家族遗传史、衰老、不良生活方式如饮酒等。

术语“Aβ-PET扫描成像”是指β-淀粉样蛋白正电子发射断层扫描。

术语“tau-PET扫描成像”是指tau蛋白正电子发射断层扫描。

术语“3F-PET扫描成像”是指基于3F抗体的免疫正电子发射断层扫描。术语“Aβo*3F”是指与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱(SEC)分析，其分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ ID NO：17-22所示。

术语“Aβ42o*3F”是指Aβo*3F中Aβ42寡聚体部分。

术语“Aβ40o*3F”是指Aβo*3F中Aβ40寡聚体部分。

在一些实施方案中，本公开的化学发光标记选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯及其衍生物。

在一些实施方案中，本公开的发色团选自三联吡啶钌。

在一些实施方案中，本公开的荧光标记选自稀土螯合物或其衍生物、异硫氰酸酯、罗丹明、藻胆素、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、异硫氰酸荧光素或AlexaFluor染料。

在一些实施方案中，本公开的荧光素型标记选自荧光素、荧光素酶，如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶。

在一些实施方案中，所述顺磁性标记包括但不限于含有铝(Al)、钡(Ba)、钙(Ca)、铈(Ce)、镝(Dy)、铒(Er)、铕(Eu)、钆(Gd)、钬(Ho)、铱(Ir)、锂(Li)、镁(Mg)、锰(Mn)、钼(Mo)、钕(Nd)、锇(Os)、氧(O)、钯(Pd)、铂(Pt)、铑(Rh)、钌(Ru)、钐(Sm)、钠(Na)、锶(Sr)、铽(Tb)、铥(Tm)、锡(Sn)、钛(Ti)、钨(W)、钒(V)和锆(Zi)并且特别是Co⁺²、CR⁺²、Cr⁺³、Cu⁺²、Fe⁺²、Fe⁺³、Ga⁺³、Mn⁺³、Ni⁺²、Ti⁺³、V⁺³和V⁺⁴的顺磁离子的化合物。

在一些实施方案中，所述放射性标记选自锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、铼-186、铼-188和钇-90。

在一些实施方案中，所述半抗原选自多糖或类脂。

在一些实施方案中，所述金属络合物选自三联吡啶钌。

在一些实施方案中，所述金属选自钌。

在一些实施方案中，本公开的酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-D-葡萄糖苷酶、尿素酶、己糖激酶、苹果酸酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、蔗糖酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、杂环氧化酶、链霉亲和素-β-D-吡喃半乳糖缀合物和/或链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物。

在一些实施方案中，用于电化学发光测定的是三联吡啶钌。

在一些实施方案中，用于生物素化的检测抗体的检测剂是抗生物素蛋白、链霉亲和 素-HRP或链霉亲和素-β-D-吡喃半乳糖(SBG)。在某些实施方案中，检测剂的读出是荧光测定的或比色的。例如但不限于，可以使用四甲基联苯胺和过氧化氢作为读出。在某些实施方案中，如果检测剂是链霉亲和素-HRP，则读出可以通过使用四甲基联苯胺和过氧化氢而是比色的。备选地，在某些实施方案中，试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷可以用作读出。例如但不限于，如果检测剂是SBG，则读出可以通过使用试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷而是荧光测定的。

在某些实施方案中，检测剂例如SBG可以以约50至约500pM的浓度使用。例如但不限于，检测剂可以以下列浓度使用：约50至约100pM、约50至约150pM、约50至约200pM、约50至约250pM、约50至约300pM、约50至约350pM、约50至约400pM、约50至约450pM、约100至约500pM、约150至约500pM、约200至约500pM、约250至约500pM、约300至约500pM、约350至约500pM、约400至约500pM、约450至约500pM、约100至约400pM或约200至约400pM。在某些实施方案中，检测剂可以以约100pM至约400pM的浓度使用，例如，SBG可以以约110pM，约155pM或约310pM的浓度使用。在某些实施方案中，SBG可以以约310pM的浓度使用。在某些实施方案中，检测剂，例如，HRP，可以以约1/10至约1/1000的稀释度使用。例如，但不限于，检测剂可以以下列稀释度使用：约1/10至约1/100，约1/10至约1/500，约1/100至约1/1000或约1/500至约1/1000的稀释度。在某些实施方案中，检测剂可以约1/100至约1/1000的稀释度使用，例如，HRP可以约1/100或约1/500的稀释度使用。本领域技术人员根据检测剂的类型，在不超出常规实验的情况下，可以容易地确定检测剂的使用浓度。

在一些实施方案中，作为酶显色基质，例如，在选择辣根过氧化物酶(HRP)作为酶标记的情况下，作为基质，可使用包含3-氨基-9-乙基咔唑、5-氨基水杨酸、4-氯-1-萘酚、邻苯二胺、2，2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、3，3-二氨基联苯胺、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺、联甲氧基苯胺或3，3'-二甲氧基联苯胺的溶液。并且，在选择碱性磷酸酶作为酶标记的情况下，作为基质，可使用包含5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、硝基蓝四唑或对硝基苯酚磷酸盐的溶液。并且，在选择β-D-葡萄糖苷酶作为酶标记的情况下，作为基质，可使用包含邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷或5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的溶液。此外，可使用在本领域中公知的多种酶及酶显色基质。

在某些实施方案中，本公开的方法可以包括用封闭缓冲液封闭第一结合剂。在某些实施方案中，封闭缓冲液可包括PBS、牛血清白蛋白(BSA)和/或杀生物剂，例如ProClin^TM (Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO)。在某些实施方案中，该方法可以包括多个洗涤步骤。在某些实施方案中，用于洗涤的溶液通常是缓冲液(例如“洗涤缓冲液”)，例如，但不限于包括去污剂(例如吐温20)的PBS缓冲液。例如，但不限于，可以在封闭后洗涤第一结合剂和/或可以将样品与第一结合剂分离以(例如通过洗涤)去除未结合的材料。

在一些实施方案中，本发明的诊断方法具有低至约0.5pg/mL的检测灵敏度，例如约1.0pg/mL、1.5pg/mL、2.0pg/mL、2.5pg/mL、3.0pg/mL、3.5pg/mL、4.0pg/mL、4.5pg/mL、5.0pg/mL、5.5pg/mL、6.0pg/mL、7.5pg/mL、8.0pg/mL、8.5pg/mL、9.0pg/mL、9.5pg/mL、10.0pg/mL、15pg/mL、20pg/mL、25pg/mL、30pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、150pg/mL、200pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、750pg/mL、1000pg/mL、1500pg/mL、2000pg/mL、3000pg/mL、5000pg/mL或更高。

在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括第一容器，其含有特异性结合Aβo*3F的富集试剂或第一结合剂。

在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括第二容器，其含有与所述第一结合剂特异性结合的第二结合剂。

术语“第二结合剂与所述第一结合剂特异性结合”是指第二结合剂特异性结合第一结合剂如抗体的抗体类别。如，第一结合剂为小鼠抗Aβo*3F IgG，则第二结合剂可以为兔抗小鼠IgG。

在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括第三容器，其含有对照样品。

在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括一个或更多个其他的容器，其包含实施所述检测所需的其他试剂、材料。

在一些实施方案中，所述特异性结合Aβo*3F的富集试剂或第一结合剂或与所述第一结合剂特异性结合的第二结合剂被附着至固体支持物上。在一些实施方案中，所述固体支持物选自聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、琼脂糖、纤维素、硝化纤维、代血浆、交联葡萄糖、Sepharose、脂质体、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、斑粝岩、过滤纸、离子交换树脂、塑料薄膜、塑料管、聚(甲基乙烯基醚/马来酸)共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物、尼龙、金属、玻璃、玻璃珠或磁性粒子等。此外，作为其他固体支持物的还有细胞培养板、酶联免疫吸附分析板、电化学发光分析板、管以及聚合物性膜。上述固体支持物可具有如球形(微珠)、圆柱形(试管或孔内面)、平面形(片、试条)等任意形态。

在一些实施方案中，本公开的试剂盒为用于进行酶联免疫吸附测定(ELISA)的试剂 盒，其包括进行ELISA所需的部分或全部试剂、材料、容器和/或装置。本领域技术人员知晓如何基于本公开的检测受试者样品中Aβo*3F的存在和/或水平的试剂而制备相应的ELISA试剂盒。在一些实施方案中，所述ELISA试剂盒包括预包被Aβo*3F抗体、HRP标记Aβ抗体、标准品、洗液、底物等。

在一些实施方案中，本公开的试剂盒为用于进行免疫荧光测定的试剂盒，其包括进行免疫荧光测定所需的部分或全部试剂、材料、容器和/或装置。本领域技术人员知晓如何基于本公开的检测受试者样品中Aβo*3F的存在和/或水平的试剂而制备相应的免疫荧光测定试剂盒。在一些实施方案中，所述免疫荧光测定试剂盒是电化学发光免疫测定。在一些实施方案中，所述免疫荧光测定试剂盒是时间分辨免疫荧光测定。在一些实施方案中，所述免疫荧光测定试剂盒包括预包被Aβo*3F抗体的电化学发光板、钌标记的Aβ抗体、标准品、读取缓冲液等。

在一些实施方案中，本公开的试剂盒为用于进行胶体金法测定的试剂盒，其包括进行胶体金法测定所需的部分或全部试剂、材料、容器和/或装置。本领域技术人员知晓如何基于本公开的检测受试者样品中Aβo*3F的存在和/或水平的试剂而制备相应的胶体金法测定试剂盒。在一些实施方案中，所述胶体金法测定试剂盒是胶体金试纸条。在一些实施方案中，所述胶体金法测定试剂盒包括胶体金标记的Aβo*3F抗体、Aβ抗体、对照抗体等。

在一些实施方案中，本公开的试剂盒为用于进行放射免疫测定的试剂盒，其包括进行放射免疫测定所需的部分或全部试剂、材料、容器和/或装置。本领域技术人员知晓如何基于本公开的检测受试者样品中Aβo*3F的存在和/或水平的试剂而制备相应的放射免疫测定试剂盒。在一些实施方案中，所述放射免疫测定试剂盒包括放射性同位素标记的Aβo*3F抗体、Aβo*3F标准品等。

术语“抗体”是指免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的具有结合到抗原的表位上的能力的片段。天然存在的抗体典型地包含四聚体，其通常由至少两条重(H)链和至少两条轻(L)链构成。免疫球蛋白包括如下同种型：IgG、IgA、IgM、IgD以及IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型，IgA可分为IgA₁和IgA₂亚型。轻链根据恒定区的不同分为κ链和λ链。本发明的抗体可以具有任何同种型。同种型的选择通常由希望的效应物功能(如ADCC诱导)来决定。示例性同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用人轻 链恒定域κ或λ中任一者。如果需要，可以通过已知方法转换本发明抗体的类别。例如，最初是IgG的本发明抗体可以类别转换为本发明的IgM抗体。此外，类别转换技术可以用来将一个IgG亚类转化成另一亚类，例如从IgGl转换为IgG2。因此，本发明抗体的效应物功能可以通过同种型切换变为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体，以用于各种治疗用途，条件是所述抗体的C1q结合活性降低或消除。在一些实施方案中，本发明的抗体是IgM或IgG1、2、3或4型抗体。如果抗体的氨基酸序列相对于其他同种型与该同种型大部分同源，则该抗体属于特定同种型。

在本文中，术语“抗体”以最广泛意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于完整抗体和抗体的抗原结合片段。

“可变区”或“可变结构域”是抗体的重链或轻链中参与抗体与其抗原的结合的结构域。抗体的每条重链由重链可变区(本文中简称为VH)和重链恒定区(本文中简称为CH)构成，重链恒定区通常由3个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(本文中缩写为CL)组成。重链和轻链可变区典型地负责抗原识别，而重链和轻链恒定域可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)、Fc受体和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。重链和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合区。VH和VL区可以进一步细分成称作“互补性决定区(CDR)”的超变区(HVR)，它们中间穿插着更保守的称为“骨架区”(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR域和四个FR域构成，按以下顺序从氨基末端排到羧基末端：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

术语“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”(在本文中与超变区“HVR”可以互换使用)即指抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。在本文中，重链的三个CDR称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链的三个CDR称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。

应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。

术语“单抗”、“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体 分子制剂，指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即包含个体抗体的群体除可能少量存在的天然发生的突变之外是相同的。常规的单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。在某些实施方案中，单克隆抗体可以由多于一种Fab域构成，由此增加对多于一种靶标的特异性。术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”并不受限于任何具体的产生方法(例如，重组的、转基因的、杂交瘤等)。

本发明还包括“双特异性抗体”，其中本发明的抗体是靶向一种以上表位的二价或多价双特异性框架的一部分(例如第二表位可以包含主动转运受体的表位，这样使得该双特异性抗体将展现出跨生物屏障(如血脑屏障)的改进的胞转作用)。因此，在另外的实施方案中，本发明抗体的单价Fab可以连接到另外的靶向不同蛋白的Fab或scfv，以产生双特异性抗体。双特异性抗体可以具有双重功能，例如由本发明赋予的治疗功能和可以结合到受体分子以增强跨生物屏障(如血脑屏障)转移的转运功能。术语“双抗”、“双功能抗体”“双特异性抗体”、“bispecific antibody”或“BsAb”是指拥有2个不同的抗原结合位点，从而可以同时与两个靶抗原结合，在发挥抗体靶向性的同时具有介导另外一种特殊功能的作用，所介导的特殊功能效应分子还可以是毒素、酶、细胞因子、放射核素等，双特异性抗体结合抗原的两条臂可分别来自Fab、Fv、ScFv或dSFv等。

术语“抗体的抗原结合片段”指能够与表位结合的抗体的片段、部分、区域或结构域(例如可经由切割、重组、合成等获得)。抗原结合片段可以含有该类抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR域，并且尽管能够结合到所述表位，仍可以展现出不同的特异性、亲和力或选择性。优选地，抗原结合片段含有所述抗体的所有6个CDR域。抗体的抗原结合片段可以是单条多肽链(例如，scFv)的一部分或包含单条多肽链，或者可以是两条或更多条多肽链(各自具有氨基末端和羧基末端)(例如，双抗体、Fab片段、F(ab')₂片段等)的一部分或包含两条或更多条多肽链。

本发明所包括的抗原结合片段的实例包括(a)Fab'或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(b)F(ab')₂片段，包含两个由二硫键在铰链结构域连接的Fab片段的二价片段；(c)由VH区和CHl域组成的Fd片段；(d)由抗体单臂的VL区和VH区组成的Fv片段；(e)单链抗体(single chain Fv，scFv)，用基因工程方法将抗体VH和VL通过一段链接肽连接而成的重组蛋白；(f)dAb片段(Ward等人，Nature，341，544-546(1989))，其基本上由VH区组成并且也称为结构域抗体(Holt等人，Trends Biotechnol.，2i(ll):484-90)；(g)骆驼或纳米抗体(Revets等人，Expert Opin Biol Ther.，5(l):111-24)以及(h)分离的互补决定区(CDR)。

在一些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段是单链抗体。在一些实施方案中，本发明提供了单链Fv(scFv)，其中本发明的抗体的Fv中的重链和轻链由柔性肽接头(典型地为约10、12、15或更多个氨基酸残基)连接成单条肽链。产生此类抗体的方法描述于例如US 4,946,778；Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113，Rosenburg和Moore ed.，Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)；Bird等人，Science,242，423-426(1988)；Huston等人，PNAS USA 85，5879-5883(1988)和McCafferty等人，Nature,348，552-554(1990)。如果仅使用单个VH和VL，单链抗体是单价的；如果使用两个VH和VL，则是二价的；或如果使用两个以上VH和VL，则是多价的。

在一些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段是嵌合抗体。术语“嵌合抗体”，指重链和/或轻链的一部分与来自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列是相同或同源的，而链的其余部分与来自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段的相应序列是相同的或同源的，只要它们展现出期望的生物学活性。本发明提供了来自人抗体的可变区抗原结合序列。因此，本文主要关注的嵌合抗体包括具有一个或多个人抗原结合序列(如CDR)并含有一个或多个来自非人抗体的序列如FR或C区序列的抗体。此外，本文所述的嵌合抗体是包含一种抗体类别或亚类的人可变区域抗原结合序列以及来自另一个抗体类别或亚类的另一个序列如FR或C区序列的抗体。

在一些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段是人源化抗体。术语“人源化抗体”指其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。

在一些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段是人抗体或全人抗体。术语“人抗体”或“全人抗体”(“humAb”或“HuMab”)指包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变域和恒定域的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点特异性诱变或在基因重排期间或在体内通过体细胞突变引入的突变)。

变体抗体也包括在本发明范围之内。因此，申请中所列举的序列的变体也包括在本发明范围之内。可以通过使用本领域已知的方法获得具有改良的亲和性的抗体序列的其他变体并且这些变体也包括在本发明范围之内。例如，氨基酸替换可用于获得具有进一步改良的亲和性的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化可用于改善抗体生产中的表达 系统的翻译效率。

这样的变体抗体序列与申请中列举的序列具有70％或更多(例如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高)的序列同源性。这样的序列同源性是相对于参考序列(即，申请中列举的序列)的全长计算获得的。

本发明中的氨基酸残基的编号是根据 或Kabat,E.A.，Wu,T.T.，Perry,H.M.，Gottesmann,K.S.&Foeller,C.,(1991),Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公开号91-3242，美国卫生与公众服务部；Chothia,C.&Lesk,A.M.,(1987),Canonical structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins.,J.Mol.Biol.,196,901-917进行的。在没有明确指明的情况下，本发明中的氨基酸残基的编号是根据Kabat编号系统进行。

抗体或其抗原结合片段“特异性地”结合另一分子的区域(即，表位)是指，它相对于另外的表位与该表位更加频繁地、更加快速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力或亲合力反应或结合。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段以至少10^-7M的亲和力结合人淀粉样蛋白，尤其是其毒性形式，例如10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或更高。优选地，抗体或其抗原结合片段在生理条件下(例如，在体内)结合。因此，特异性结合淀粉样蛋白尤其是其毒性形式是指该抗体或其抗原结合片段以上述特异性和/或在这样的条件下结合到淀粉样蛋白尤其是其毒性形式上的能力。适合于确定所述结合的方法是本领域已知的。

在抗体与指定抗原结合的背景下，术语“结合”通常是指以对应于约10^-6M或更小的K_D的亲和力结合，该K_D比该抗体对与除指定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力低至少10倍，如低至少100倍、至少1,000倍。

如本文所用，术语“k_d”(sec-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值又称为k_off值。

如本文所用，术语“k_a”(M-1 x sec-1或1/Msec)是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数。

如本文所用，术语“K_D”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数并且通过k_d除以k_a获得。

如本文所用，术语“K_A”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的结合平衡常数并且通过k_a除以k_d获得。

通过本领域已知的任何技术产生本发明的抗体，如但不限于任何化学、生物学、遗 传学或酶学技术，可单独使用或组合使用。通常，知道期望序列的氨基酸序列，本领域技术人员可通过用于产生多肽的标准技术容易地产生所述抗体。例如，可以使用公知的固相方法合成这些抗体，优选使用市售的肽合成装置(如Applied Biosystems,Foster City,California制造的装置)并遵循制造商的说明书合成这些抗体。或者，可以通过本领域熟知的重组DNA技术合成本发明的抗体。例如，在将编码抗体的DNA序列并入表达载体并将这些载体导入合适的表达所需抗体的真核或原核宿主中后，可以获得作为DNA表达产物的抗体，之后可以使用已知技术从宿主分离抗体。

可以通过包含任何“适合”数目的经修饰的氨基酸和/或与偶联取代基结合来修饰本发明的抗体及其抗原结合片段。在这种情况下，“适合”通常由至少基本上保留与非衍生化亲本抗体相关的淀粉样蛋白尤其是其毒性形式选择性和/或淀粉样蛋白尤其是其毒性形式特异性的能力决定。包含一个或多个经修饰的氨基酸在例如增加多肽血清半衰期、降低多肽抗原性或增加多肽储存稳定性中可以是有利的。对一种或多种氨基酸进行修饰，例如，在重组生产的过程中与翻译同时进行或在翻译之后进行(例如，在哺乳动物细胞表达过程中在N-X-S/T基序上的N-连接的糖基化作用)，或通过合成手段进行修饰。经修饰的氨基酸的非限制性实例包括糖基化的氨基酸、硫酸化的氨基酸、异戊二烯化(例如，法尼基化、香叶基-香叶基化)的氨基酸、乙酰化的氨基酸、酰化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、羧基化的氨基酸、磷酸化的氨基酸等。进行氨基酸修饰的参考文献在本领域中司空见惯，参见例如Walker,(1998),Protein Protocols On CD-Rom,Humana Press,Totowa,New Jersey。经修饰的氨基酸可以例如选自糖基化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、法尼基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、偶联到脂质部分的氨基酸或偶联到有机衍化剂的氨基酸。

本发明的抗体及其抗原结合片段还可以通过共价偶联到聚合物而化学修饰，以增加其循环半衰期。示例性聚合物以及将它们连接到肽的方法参见例如US 4,766,106；US 4,179,337；US 4,495,285和US 4,609,546。另外的示例性聚合物包括聚氧乙基化的多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如，分子量在约1,000～40,000D之间，如在约2,000～20,000D之间，例如约3,000～12,000D的PEG)。

本发明的抗体及其抗原结合片段可以在不同细胞系中产生，如人细胞系、非人哺乳动物细胞系和昆虫细胞系，例如CHO细胞系、HEK细胞系、BHK-21细胞系、鼠类细胞系(如骨髓瘤细胞系)、纤维肉瘤细胞系、PER.C6细胞系、HKB-11细胞系、CAP细胞系和HuH-7人细胞系(Dumont等人，2015,Crit Rev Biotechnol.,Sep.18,1-13.，其内 容通过引用并入本文)。

通过常规免疫球蛋白纯化方法适当地将本发明的抗体与培养基分离，所述方法如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法。

术语“受试者”是指温血动物，优选哺乳动物(包括人、家畜和农场动物、动物园动物、运动动物或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等)，更优选人。在一个实施方案中，受试者可以是“患者”，即，温血动物，更优选是人，其正在等待接受或正在接受医疗护理或将是医疗程序、或疾病发展监测的对象。在一个实施方案中，受试者是成年人(例如18岁以上的受试者)。在另一个实施方案中，受试者是儿童(例如，18岁以下的受试者)。在一个实施方案中，受试者是年龄大于55、60、65、70、75、80、85、90岁或更大岁数的老年人。在一个实施方案中，受试者是男性。在另一个实施方案中，受试者是女性。

术语“健康受试者”是指未患有任何疾病或病况的受试者或指未患有任何神经退行性疾病的受试者。

术语“未患有阿尔茨海默病的受试者”是指经正规医疗程序确认未患有阿尔茨海默病的受试者，例如根据美国国立老化研究所与阿尔茨海默病协会制定的规范所确定的未患有轻度认知功能障碍(MCI)及AD痴呆的受试者。在一些实施方案中，未患有阿尔茨海默病的受试者是健康受试者。

下文将通过实施例来具体描述本发明的技术方案，这些实施例是描述性、例证性的，而不意味着限制。下述实施例中所用的试剂，如无特殊标注，均可从试剂公司如Sigma Aldrich、Merck容易地商购，所述试验方法，如无特殊备注，均可以从教科书如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Press,New York中找到。

实施例

实施例1与3F特异性结合的Aβ寡聚体的获取

1.1实验材料和方法

1.1.1实验材料

Protein A磁珠：Bio-RAD，#1614833

Protein G磁珠：Bio-RAD，#1614023

Protein A/G琼脂糖凝胶：Abmart，#A10001S

6E10抗体：Biolegend，#803002

人源Aβ42检测试剂盒：Immuno-Biological Laboratories

1.1.2主要溶液

(1)50mM氢氧化钠(pH 10.0)；

(2)20mM磷酸盐缓冲液(PBS)：pH 7.4；

(3)0.1％PBST：含0.1％Tween-20的PBS；

(4)20mM甘氨酸洗脱液(pH 2.0)；

(5)1M Tris中和液：pH 10.0；

备注：实施例2、3、4、5和6中提及但未给出来源的相关试剂和溶液与实施例1中的相同。

1.2小鼠脑匀浆制备

APP/PS1小鼠用戊巴比妥钠深度麻醉，经心脏灌注含有肝素(10U/mL)的冰冷PBS后处死取脑。向脑组织中加入1mL RIPA强裂解剂(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，用Tissue LyserⅡ组织研磨器以30Hz的频率破碎8min，4℃，14000rpm离心30min，收集上清液。在免疫沉淀之前，将脑匀浆加入到100μL Protein A/G-琼脂糖凝胶中，4℃孵育1h去除小鼠脑匀浆中内源性IgG，再将脑匀浆加入到交联了APP抗体的Protein A磁珠中，去除小鼠脑内源性APP。

1.3抗体与磁珠交联

首先将3F和6E10抗体分别与Protein A或Protein G磁珠交联，具体交联步骤为：

(1)取200μL Protein A或Protein G磁珠，用2mL 0.1％PBST洗三次，每次都充分混匀磁珠，再放在磁力架上，弃掉上清液；

(2)将50μg 3F或6E10抗体加入到磁珠中，室温摇晃反应30min使磁珠与抗体充分结合，然后用0.1％PBST洗三次；

(3)磁珠用交联缓冲液(0.2M三乙醇胺，pH 8.2)清洗一次，然后将12mg DMP溶解到2mL交联缓冲液中，加入到磁珠中，室温摇晃反应1h。反应结束后，将交联液弃掉，加入2mL封闭缓冲液(0.1M乙醇胺，pH8.2)清洗一次，然后再加入2mL封闭 缓冲液，室温封闭2h；

(4)封闭结束后，用PBS将磁珠洗三次，然后用0.1M甘氨酸(pH2.5)洗脱磁珠一次，反应5min，再用0.1％PBST将磁珠洗三次，将磁珠浸在含0.02％NaN₃的PBST中，4℃保存。

1.4 Aβo*3F的体外制备

将1mg Aβ42、Aβ40或其他形式的Aβ(中肽生化有限公司)溶于1mL 100％六氟异丙醇(HFIP)，涡旋5min，水浴超声10min后，分装到EP管中，过夜挥发溶剂，并放于-20℃保存。在使用之前，将HFIP处理分装的Aβ溶解在50mM NaOH中，浓度为1mg/mL，涡旋3-5min，超声1min，然后用预冷的PBS稀释至10μM。4℃，21000g离心30-40min，丢弃沉淀部分(约为起始体积的5％)，得到Aβ单体。将Aβ单体在25℃静止孵育2天，将其与交联了3F抗体的Protein A磁珠4℃孵育过夜。第二天，磁珠用0.1％PBST洗三遍后，用20-100mM甘氨酸(pH 2.0)洗脱3-5min，洗脱两次，洗脱液用1M Tris中和到pH 7，得到sAβo*3F(体外制备的Aβo*3F)。

1.5 APP/PS1小鼠脑匀浆以及AD患者CSF中Aβo*3F的分离制备

为了制备3F特异性识别的Aβos(Aβo*3F)，将APP/PS1小鼠脑匀浆以及AD患者CSF样品(来自郑州大学第一附属医院，签署知情同意书并获得了郑州大学第一附属医院伦理审查委员会批准)与交联了3F抗体的Protein A磁珠4℃孵育过夜。第二天，磁珠用0.1％PBST洗三遍后，用20mM-100mM甘氨酸(具体使用20mM，pH 2.0)洗脱3min，洗脱两次，洗脱液用1M Tris中和到pH 7，得到APP/PS1小鼠脑内的Aβo*3F(mAβo*3F，AD小鼠脑内分离的Aβo*3F)，或AD患者CSF中提取的Aβo*3F(hAβo*3F，AD患者脑脊液分离的Aβo*3F)。3F免疫耗竭后的Aβ聚集体混合物被称为Aβ-ID，分别是sAβ-ID(体外制备)、mAβ-ID(APP/PS1小鼠脑内分离制备)和hAβ-ID(AD患者CSF中分离制备)，用作对照。

Aβ聚集体混合物Aβ*6E10是通过将APP/PS1小鼠脑匀浆或AD患者CSF与交联了6E10抗体的Protein G磁珠混合，4℃反应过夜，然后用20mM-100mM甘氨酸(具体使用20mM，pH 2.0)洗脱3-5min(具体为3min)，洗脱两次，洗脱液用1M Tris中和到pH 7,得到APP/PS1小鼠脑内的Aβo*6E10(mAβo*6E10，AD小鼠脑内分离的Aβo*6E10)，或AD患者CSF中提取的Aβo*6E10(hAβo*6E10，AD患者CSF内分离的Aβo*6E10)(图1)。免疫沉淀得到的Aβ浓度通过Aβ检测试剂盒进行测定。

实施例2 Aβo*3F分子量大小和形态表征

2.1实验材料和方法

2.1.1实验材料

Aβ多肽：中肽生化；

Superdex 200 10/300GL分子筛：GE Healthcare；

A11抗体：Invitrogen，#AHB0052；

分子筛蛋白marker：GE healthcare；

3-8％Tris-Acetate预制胶：Invitrogen；

碳膜支持铜网：中科科仪；

醋酸双氧铀：中科科仪；

ECL化学发光试剂盒：Pierce Biotechnology；

ThT检测试剂：Sigma-Aldrich；

硝酸纤维素膜：Millipore。

2.1.2实验仪器

AKTA蛋白层析仪：GE Healthcare Life Science，USA；

蛋白电泳仪：Bio-rad，USA；

蛋白转膜系统：Bio-rad，USA；

HT7700透射电镜：Hitachi，日本；

Safire2^TM酶标仪：Tecan Group，瑞士；

Amersham Imager 680成像系统：GE，USA。

2.1.3主要溶液

(1)20mM TBS缓冲液：称取2.4g Tris，8g氯化钠，用去离子水溶解，用稀盐酸调pH到7.5，并定容到1L。

(2)0.1％TBST：将1mL Tween-20加入1L TBS中，搅拌20min。

(3)ThT溶液：用50mM PB(磷酸盐缓冲液，pH＝6.5)溶液配制100X ThT母液(500μM)，使用时用50mM PB(PH＝6.5)稀释为1X。

(4)5％脱脂牛奶。

(5)电泳缓冲液：将30g Tris、144g Glycine和10g SDS溶解，以去离子水定容至1L，稀释10倍使用。

(6)5×非还原型上样缓冲液(10mL)：2mL 10％SDS，0.6mL 1M Tris-HCl(pH6.8)，5mL甘油，1mL 1％溴酚蓝，以去离子水定容至10mL。

(7)转膜缓冲液：将30g Tris、144g Glycine溶解于去离子水中，并定容至1L，稀释10倍使用。

2.2 Aβ单体、寡聚物和纤维的制备和表征

Aβ单体、寡聚物和纤维的制备同1.4。将Aβ单体在25℃静止孵育0-4天，每隔24h用ThT检测Aβ的聚集状态，具体操作如下：用PBS缓冲液将Aβ样品稀释至10μM，然后将190μL ThT检测液和10μL待测样品在黑色酶标板中充分混匀，并使用Safire2^TM酶标仪测量荧光，激发波长为440nm，发射波长为480nm。结果显示，随着孵育时间的增加，Aβ样品的ThT读数逐渐增大，表明Aβ单体逐渐向寡聚体、纤维形式聚集(图2的A图)。

Dot blot实验用于评估不同抗体与Aβ单体和聚集体的结合情况。将Aβ样品点在硝酸纤维素膜上，用5％脱脂牛奶室温封闭1h。将膜与不同的检测抗体室温孵育1-2h，然后用0.1％TBST洗涤三次，每次5min，并加入HRP标记的二抗室温孵育1h。用0.1％TBST洗涤三次，每次5min，膜上加入ECL化学发光液，使用Amersham Imager 680成像系统进行显色，并用Image J软件对印迹的大小以及光密度进行定量分析。结果显示，6E10是一个广泛结合Aβ单体、寡聚体和纤维的抗体，其可以与10μM、20μM的Aβ结合，而且结合情况无明显差异。3F与A11抗体都不与Aβ单体结合，而且3F与A11抗体结合不同的寡聚体类型，3F主要与10μM Aβos结合，而A11抗体主要结合20μM Aβos，表明3F与A11识别不同的寡聚体构象(图2的B图)。此外，通过统计孵育0-4天得到的10μM Aβos与3F的亲和力显示，10μM孵育2天得到的Aβos(sAβos，体外制备的Aβos)与3F的亲和力最高，因此，后续实验就采用该寡聚体(sAβo*3F，体外制备的Aβo*3F)与3F进行免疫沉淀(图2的C图)。

2.3 sAβo*3F的分子量表征

首先用Western blot对sAβo*3F的分子量大小进行检测。具体操作如下：将Aβ样品加样到15％SDS-PAGE凝胶电泳或者3-8％Tris-Acetate凝胶中。对于Tris-Acetate凝胶，样品在上样前与Novex^TM Tris-Glycine样品缓冲液混合。电泳在Tris-Glycine电泳缓冲液(含0.5mM DTT、1mM ATP和5mM MgCl2)中进行，4℃，150V电泳4h。对于Western blot，将SDS-PAGE或Tris–Acetate凝胶分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用5％脱脂牛奶将膜室温封闭1-2h，加检测抗体(6E10)4℃孵育过夜，然后用0.1％ TBST将膜洗涤三次，每次5min，并与相应的二抗(HRP标记的山羊抗小鼠二抗)室温反应1h。TBST洗涤三次后，膜上覆盖ECL显色液，在Amersham Imager 680成像系统中显色，并通过Image J软件对蛋白条带进行量化。

SDS-PAGE实验结果显示，sAβo*3F主要由两种分子量的寡聚体组成，一个分子量大约为12kDa，一个分子量大于180kDa；而native-PAGE结果显示，sAβo*3F主要由一个分子量约为500kDa的寡聚体组成，两种电泳结果出现差异可能是由于SDS的影响(图2的D图)。

为了进一步确定sAβo*3F的分子量大小，将500μL sAβo*3F或100μL SEC Marker上样到与AKTA pure系统相连的Superdex 200 10/300GL分子筛色谱柱中。色谱柱预先用Tris-Gly缓冲液平衡，以0.5mL/min的流速洗脱。通过与Marker比对发现sAβo*3F的分子量大小为588kDa(图2的E、F图)。

2.4 mAβo*3F的分子量大小和形态表征

将APP/PS1小鼠脑内的Aβo*3F进行提取(mAβo*3F，AD小鼠脑内分离的Aβo*3F)，并对其分子量大小进行分析。与sAβo*3F结果一致，mAβo*3F在SDS-PAGE中呈现出两条带，分子量大小分别为12kDa和大于180kDa，而在native-PAGE中，mAβo*3F只有一个分子量约为500kDa的条带(图2的G图)。SEC结果显示，mAβo*3F分子量为588kDa(图2的H图)。此外，将10μL Aβo*3F滴在200目铜网上吸附20min，滤纸吸干，2％醋酸双氧铀负染30s，滤纸吸干后风干。在投射电子显微镜(TEM，日立H7700，日本)下以120kV的工作电压在100,000×倍数下检查样品。结果显示，mAβo*3F是直径约为10nm的颗粒(图2的H图)。

2.5 AD患者CSF中的Aβo*3F的分子量表征

AD患者CSF中提取的Aβo*3F(hAβo*3F，人AD患者脑脊液分离的Aβo*3F)分子量大小和分布与sAβo*3F和mAβo*3F结果一致，hAβo*3F在native-PAGE中只有一个条带，分子量约为500kDa，而在SDS-PAGE中有两个分子量为12kDa和大于180kDa的条带(图2的I图)。

实施例3 Aβo*3F的神经毒性检测

3.1实验材料

N2a细胞：国家实验细胞资源共享服务平台(NICR)；

D-聚赖氨酸氢溴酸盐(PDL)：Sigma-Aldrich

B27补充剂(50×)：Thermo Fisher Scientific

Neurobasal^TM-A培养基：Gibco

70μm尼龙细胞滤网：BD Bioscience

3.2原代神经元培养

将孕14至15天的C57BL/6(购自北京华富康生物科技股份有限公司)胎鼠脑取出，在HBSS(Hank's平衡盐溶液)中剥离血脑膜，并用镊子将分离的海马和皮层剪碎。将碎组织块转移到15mL离心管中，600rpm离心3min，向沉淀中加入10mL稀释10倍的胰酶消化液(含DNaseⅠ)，37℃消化10min，每5min轻轻颠倒几下。消化结束后，用40mL DMEM培养基(含10％FBS)终止胰酶消化反应，并将细胞悬液通过70μm细胞筛网去除未消化的组织块。1200rpm离心10min收集细胞，并用DMEM培养基重悬细胞，铺到12孔板中。2-4h后换成Neurobasal培养基(含B27、0.5mM L-谷氨酰胺、0.5％青霉素和链霉素)，继续培养7-9天用于后续实验。

3.3 sAβo*3F的细胞毒性检测

本实验主要采用MTT法来检测Aβ聚集体对神经元的毒性。具体操作如下：将N2a细胞培养在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中。培养皿中的细胞经胰酶消化，离心，培养基重悬后，接种在96孔板中，每孔约5000个细胞/100μL培养基。12h后，用一系列浓度梯度的sAβo*3F、sAβos处理细胞，同时将相同体积的溶剂加入到细胞中作对照。72h后，向每个孔中添加25μL 5mg/mL MTT。37℃继续培养3h后，吸掉培养基，加入150μL DMSO。用MD-M5酶标仪测量570nm和630nm处的吸光度。每个样品和对照使用六个重复孔的平均值，每个实验重复三次。通过将添加样品孔的吸光度(经背景校正)除以添加溶剂孔的吸光度(经背景校正)来计算细胞活力。

MTT结果显示sAβo*3F对细胞活力的半抑制浓度(IC50)约为0.186nM，而免疫沉淀前的sAβos的IC50约为63.26nM，两者IC50相差340倍(图3的A、B图)。此外，将0.5nM sAβo*3F加入到N2a细胞中可造成66％的细胞死亡，而同浓度的sAβos和sAβ-ID则无明显的神经毒性作用。当sAβos浓度达到200nM时，才可产生70％细胞毒性，而此时sAβ-ID的神经毒性只能达到32％(图3的C图)。这些结果表明，sAβo*3F是一种具有强神经毒性的寡聚体。

3.4 mAβo*3F的细胞毒性检测

MTT法检测mAβo*3F对N2a细胞的IC50约为0.111nM；对原代神经元细胞的IC50约为0.057nM(图3的D图)。具体地，0.5nM mAβo*3F可造成78％的原代神经 元细胞死亡，而同浓度的mAβ*6E10和mAβ-ID则没有明显的细胞毒性；当浓度提高到200nM时，mAβ*6E10可产生54％的神经毒性，而mAβ-ID的神经毒性只有20％(图3的E图)。

3.5 hAβo*3F的细胞毒性检测

MTT检测hAβo*3F对原代神经元的IC50约为0.076nM(图3的F图)。具体地，将0.2nM hAβo*3F加入到原代神经元中可减少68％的细胞活力，而hAβ*6E10和hAβ-ID在此浓度下对神经元存活没有显著影响；当浓度增加到40nM时，hAβ*6E10使细胞活力降低66％，而hAβ-ID仅可降低40％的细胞活力(图3的G图)。

实施例4 Aβo*3F对胶质细胞的细胞因子表达水平的影响

4.1实验材料和方法

4.1.1实验材料

BV2细胞：NICR

反转录试剂盒：康为世纪

UltraSYBR Mixture(Low ROX)：康为世纪

4.1.2实验仪器

7500Fast实时定量PCR仪：Applied Biosystems

T100 Thermal Cycler PCR仪：BIO-RAD

NanoDrop微量分光光度计：Quawell

4.2 Aβo*3F可提升小胶质细胞炎症因子的表达水平

将BV2细胞培养在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中。培养皿中的细胞经胰酶消化，离心，培养基重悬后，接种在12孔板中，每孔约5×10^5个细胞/mL培养基。12h后，用不同的Aβ样品处理BV2细胞，同时将相同体积的溶剂加入到细胞中作对照。48h后，通过荧光定量PCR(qPCR)检测细胞内促炎因子的表达水平。具体操作如下：常规方法制得细胞总mRNA并使用微量分管光度计测定mRNA浓度。根据反转录试剂盒说明书进行反转录得到cDNA，然后使用EasyQuick RT MasterMix检测目标基因的表达水平。所用引物如下：

mTNF-α：5’-GATTATGGCTCAGGGTCCAA-3’(SEQ ID NO：1)，

5’-GCTCCAGTGAATTCGGAAAG-3(SEQ ID NO：2)；

mIL-1β：5’-CCCAAGCAATACCCAAAGAA-3’(SEQ ID NO：3)，

5’-GCTTGTGCTCTGCTTGTGAG-3’(SEQ ID NO：4)；

mIL-6：5’-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3’(SEQ ID NO：5)，

5’-TTGCCATTGCACAACTCTTT-3’(SEQ ID NO：6)；

GAPDH：5’-TGAATACGGCTACAGCAACA-3’(SEQ ID NO：7)，

5’-AGGCCCCTCCTGTTATTATG-3’(SEQ ID NO：8)。

qPCR结果显示，0.3nM mAβo*3F、200nM mAβ*6E10和200nM mAβ-ID可诱导小胶质细胞促炎因子的表达水平显著增加，包括TNF-α、IL-6和IL-1β，但0.3nM mAβ*6E10或0.3nM mAβ-ID则无明显刺激作用(图4的A图)。

4.3原代星形胶质细胞培养

取1-2天龄C57BL/6新生鼠，在75％酒精中浸泡消毒后取出大脑浸泡于HBSS缓冲液中，剥除血脑膜，将大脑用组织剪剪碎，置于15mL离心管中，600rpm离心3min，向沉淀中加入10mL稀释10倍的胰酶消化液(含DNaseⅠ)，37℃消化10min，每5min轻轻颠倒几下。消化结束后，用40mL DMEM培养基(含10％FBS)终止胰酶消化反应，并将细胞悬液通过70μm细胞筛网去除未消化的组织块。1200rpm离心10min收集细胞，用DMEM培养基重悬细胞，并将细胞铺于T-75培养瓶中，在37℃下用DMEM培养基培养5-7天。每2-3天更换一次培养基。细胞培养7天后用胰酶消化，将细胞铺到12孔板中使用。

4.4 Aβo*3F可刺激星形胶质细胞炎症因子的表达

用不同的Aβ样品处理原代星形胶质细胞，qPCR探究其对原代星形胶质细胞的炎症因子表达水平的影响，具体操作步骤同4.2。所用引物如下：

miNos：5’-CACCTGGAACAGCACTCTCT-3’(SEQ ID NO：9)，

5’-CTTTGTGCGAAGTGTCAGTG-3’(SEQ ID NO：10)；

mTNF-α：SEQ ID NO：1和2；

mIL-1β：SEQ ID NO：3和4；

mIL-6：SEQ ID NO：5和6；

GAPDH：SEQ ID NO：7和8。

结果显示，0.3nM mAβo*3F、200nM mAβ*6E10和200nM mAβ-ID可导致原代星形胶质细胞的促炎因子表达水平显著提高，包括TNF-α、IL-6、IL-1β和iNos，但0.3nM mAβ*6E10或0.3nM mAβ-ID对星形胶质细胞的炎症因子的表达水平无明显影响(图4的B图)。

4.5 Aβo*3F破坏星形胶质细胞介导的突触生成。

星形胶质细胞可以通过分泌突触因子如TSP1和Gpc4/6来诱导突触形成。将mAβo*3F加入到原代星形胶质细胞中，以qPCR检测星形胶质细胞的多种突触因子表达水平的变化。所用引物如下：

mGpc4：5’-CTGGAGGGTCCTTTCAACATT-3’(SEQ ID NO：11)，

5’-GACATCAGTAACCAGTCGGTC-3’(SEQ ID NO：12)；

mGpc6：5’-TAGTCCTGTATTGGCAGCCAC-3’(SEQ ID NO：13)，

5’-GGCTAATGTCTATAGCAGGGAA-3’(SEQ ID NO：14)；

mTSP1：5’-GGTAGCTGGAAATGTGGTGCGT-3’(SEQ ID NO：15)，

5’-GCACCGATGTTCTCCGTTGTGA-3’(SEQ ID NO：16)；

GAPDH：SEQ ID NO：7和8。

结果显示，0.3nM mAβo*3F和200nM mAβ*6E10处理细胞可显著降低TSP1和Gpc4/6的表达水平，而0.3nM mAβ*6E10或0.3nM mAβ-ID无明显作用。只有当mAβ-ID的浓度增加到200nM时，才可降低星形胶质细胞的Gpc4表达水平(图4的C图)。

实施例5 Aβo*3F对小鼠认知的影响和脑内神经元的损伤作用

5.1实验材料和方法

5.1.1实验材料

快速Golgi染色试剂盒：FD NeuroTechnologies

尼氏染色试剂盒：索莱宝

5.1.2实验仪器

脑立体定位注射系统：中国医学科学院

Y迷宫设备：中国医学科学院

新事物识别设备：中国医学科学院

5.2实验动物

3月龄C57BL/6小鼠。所有小鼠饲养在22±2℃和45％±10％湿度的洁净室中，均可随意进食和饮水，并按照12h光照和12h黑暗进行循环。所有动物实验均按照《中 国公共卫生服务实验动物的护理和使用指南》进行，涉及小鼠的实验均得到了清华大学动物保护和使用委员会的批准。

5.3脑立体定位注射

3月龄C57BL/6小鼠随机分为6组，每组6-8只，分别是：注射2.5nM(45.5pg)mAβo*3F组，注射2.5nM(45.5pg)mAβ*6E10组，注射2.5nM(45.5pg)mAβ-ID组，注射600nM(10.9ng)mAβ*6E10组，注射600nM(10.9ng)mAβ-ID组，以及注射Tris-Gly溶剂的对照组。将小鼠用氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)的混合麻醉剂深度麻醉后，固定在脑立体定位注射台上，将小鼠脑部皮肤沿中线剪开，露出头骨，利用立体定位仪定位注射部位：以前囟(bregma)为起点，AP＝-1.7mm，ML＝±1.0mm，DV＝-1.5mm。用颅钻沿定位点开颅后，进行双侧注射，每半脑注射4μL，注射速度为0.4mL/min。注射结束后，继续留针3min，使样品完全吸收。用无菌生理盐水清洗手术部位并缝合切口。术后对小鼠状态进行监测并提供术后护理。在立体定位注射24h后开始检测小鼠的行为和认知能力，然后解剖小鼠进行生理生化分析。

5.4 Aβo*3F严重损伤了小鼠的记忆能力

新事物识别实验和Y迷宫实验被应用于检测小鼠的认知能力变化。

5.4.1新事物识别实验

新事物识别实验是基于小鼠对新的、不熟悉的物体表现出更多的互动这一自发倾向而设计的实验。实验主要分为三个阶段：

(1)熟悉环境阶段，准备一个宽40cm×深40cm×高40cm的白色盒子，在盒子里没有物体的情况下，允许每只小鼠自由地探索盒子5min。1h后给小鼠注射Aβ样品；

(2)训练阶段，24h后，盒子里放置两个完全相同的物体，将每只小鼠放在与第一阶段相同的盒子里，允许小鼠自由探索5min。记录小鼠嗅探和接触每个物体的次数；

(3)测试阶段，训练6h后，将右侧物体换成一个材质，颜色，形状都不相同的一个新物体，让小鼠继续自由探索5min，记录小鼠对于这两个物体的嗅探和触碰的次数，以此来检测小鼠的记忆能力。辨别指数是通过以下计算公式确定的：(新物体的次数–旧物体的次数)/(新物体的次数+旧物体的次数)。

结果显示，与对照组相比，2.5nM mAβo*3F和600nM mAβ*6E10处理的小鼠对新事物的辨别指数显著下降，而其他Aβ处理组的小鼠对新事物的辨别指数与对照组相比则无显著差异，表明Aβo*3F显著降低了小鼠的记忆能力(图5的A图)。

5.4.2 Y迷宫实验

新事物识别实验后，小鼠的空间记忆能力通过Y迷宫实验来检测。Y迷宫是由三条完全一样的臂组成，每条臂之间有120度的角度。每条臂的尺寸是8cm×30cm×15cm(宽×长×高)。实验主要分为两个阶段：

(1)训练阶段，将三条臂随机的命名为A、B、C，A、B臂在实验阶段全程开放，而C作为新臂，在训练阶段是封闭的。从A臂中放入后，每只小鼠允许在A、B臂中自由探索10min；

(2)训练1h后，将C臂打开，再次按顺序将小鼠从A臂中放入，允许小鼠在A、B、C臂中探索5min，分析小鼠在三个臂中的停留时间。所有的试验过程都通过安装在Y迷宫上方的摄像机进行记录。

结果显示，2.5nM mAβo*3F和600nM mAβ*6E10处理的小鼠在新臂的持续时间与对照组小鼠相比显著减少。而注射2.5nM mAβ*6E10、2.5nM mAβ*ID和600nM mAβ*ID的小鼠与对照组相比无显著差异。这表明mAβo*3F，而不是mAβ*6E10或mAβ-ID，在低浓度时就会引起小鼠严重的记忆障碍，对于mAβ*6E10，只有当浓度增加到600nM时，才能使小鼠出现类似程度的记忆损伤(图5的B图)。

5.5 Aβo*3F显著降低了小鼠神经元的树突棘密度

使用FD快速Golgi染色试剂盒对小鼠的大脑样本进行染色。在解剖小鼠前24h，将试剂盒中的A和B溶液进行1：1混合，避光保存。将小鼠处死后，无需灌流，直接取脑，将大脑沿中线分为左右半脑，左半脑用PBS冲掉表面的血液，用滤纸吸干组织表面的溶液，然后将组织放入到提前配置好的A+B溶液中。24h后换液一次，室温避光放置2周，在浸泡期间，每周对组织进行两次轻轻上下颠倒以取得最佳结果。2周后，将组织转移到C溶液中，24h后换液一次，室温避光放置5天。然后，用冷冻切片机在-22℃获得100μm厚的冷冻切片。待切片室温自然干燥后，开始染色。首先将切片用Milli-Q水洗涤两次，每次4min，然后配置染色工作液，将切片置于染色工作液中染色15min，用Milli-Q水洗涤两次，每次5min。染色结束后，用50％、75％、95％和100％的乙醇对切片进行脱水，每个浓度梯度脱水4min。然后将切片放于二甲苯中，并进行中性树脂封片观察。使用Olympus倒置显微镜的100×镜头物镜观察海马CA1区神经元的树突和树突棘。树突棘密度是由Image J软件分析确定(树突密度＝树突棘数量/树突长度)。

通过计算树突棘密度发现，与对照组相比，2.5nM mAβo*3F和600nM mAβ*6E10处理的小鼠脑CA1区神经元的树突棘密度显著下降，但2.5nM mAβ*6E10、2.5nM mAβ- ID或600nM mAβ-ID则对小鼠脑神经元树突棘密度无显著作用(图5的C、D图)。

5.5 Aβo*3F显著减少小鼠海马区神经元数量

5.5.1石蜡包埋和切片

行为学实验结束后，用戊巴比妥钠(50mg/kg)对小鼠进行深度麻醉，并经心脏灌注含有肝素(10U/mL)的冰冷PBS，最后处死解剖。将小鼠的大脑取出后，沿中线分为左右半脑，左半脑浸泡在4％多聚甲醛中固定48h后，进行乙醇梯度脱水：50％、70％、80％、90％乙醇各1h。100％乙醇1h，重复一次，然后50％二甲苯30min，重复一次。脱水后将组织浸泡在石蜡中4h，进行组织包埋。用石蜡组织切片机得到5μm的组织切片。

5.5.1尼氏染色

5μm石蜡切片在60℃加热30min后，浸泡在100％二甲苯、50％二甲苯、100％酒精中各10min，75％乙醇、50％乙醇、30％乙醇和去离子水中各5min进行切片脱蜡。然后根据尼氏染色说明书，在切片上滴加甲酚紫溶液，56℃加热反应1h，室温分化1-3min至背景接近于无色后，用梯度酒精脱色(70％、95％和100％；各20秒)，并浸泡在二甲苯中，中性树脂进行封片后，用显微镜采集数据并分析。结果显示，2.5nM mAβo*3F和600nM mAβ*6E10会造成小鼠脑内CA1区和DG区的神经元数量显著减少，而2.5nM mAβ*6E10、2.5nM mAβ-ID或600nM mAβ-ID则对神经元数量没有显著影响(图5的E、F、G图)。

实施例6 Aβo*3F激活小鼠脑内的胶质细胞产生神经炎症

6.1实验材料和方法

6.1.1实验材料

抗GFAP抗体：Cell Signaling Technology，#3670

抗Iba-1抗体：GeneTex，#GTX101495

BCA试剂盒：Thermo Fisher Scientific

RIPA强裂解液索莱宝

蛋白酶抑制剂：Millipore

磷酸酶抑制剂(100×)：索莱宝

小鼠IL-1β检测试剂盒：Biolegend

小鼠IL-6检测试剂盒：Biolegend

6.1.2实验仪器

MD-M5酶标仪：Molecular Devices，USA

Tissue LyserⅡ组织研磨器：Qiagen

6.1.3免疫组织化学

将脱蜡后的5μm石蜡切片浸泡在柠檬酸抗原修复液(3g柠檬酸三钠、0.4g柠檬酸溶于去离子水中，定容至1L)中，水浴煮沸15min，并室温自然冷却。抗原修复后，用PBS洗涤切片3次，每次5min，然后用80％(vol/vol)含有0.3％H₂O₂的甲醇固定切片并去除内源性的过氧化氢酶。然后PBS洗涤3次，每次5min，将切片放在0.3％Triton X-100穿透液中，室温穿透20min，PBS洗涤3次，每次5min。切片用10％驴血清室温封闭1h后，加入相应的一抗4℃孵育过夜。第二天，切片用PBS洗涤3次，每次5min后，加入相应二抗，室温孵育1h，并用PBS洗涤3次后显色，观察。

6.2 Aβo*3F可激活小胶质细胞和星形胶质细胞

通过对海马区小胶质细胞标志物Iba-1进行染色发现，2.5nM mAβo*3F，600nM mAβ*6E10可显著激活海马DG区和CA1区域的小胶质细胞，增加小胶质细胞中Iba-1的表达水平，但是2.5nM mAβ*6E10或mAβ-ID处理小鼠没有显著作用(图6的A、C、D图)。而且，2.5nM mAβo*3F和600nM mAβ*6E10能显著地诱导DG区的小胶质细胞进入到胞体变大、分支变少的阿米巴样状态，这是代表小胶质细胞处于过度激活的状态(图6的A图)。通过对小鼠海马区星形胶质细胞标志物GFAP进行染色发现，2.5nM mAβo*3F和600nM mAβ*6E10注射到小鼠脑内，激活了海马DG区和CA1区的星形胶质细胞，增加了海马区GFAP的表达水平(图6的B、E、F图)。

6.3 Aβo*3F增加了小鼠脑海马区的炎症因子水平

按照制造商的说明书，分别使用IL-6和IL-1βELISA试剂盒检测小鼠脑中的炎症因子(IL-6和IL-1β)水平。简单地说，将脑匀浆稀释一定倍数加入到ELISA板中，板上预先包被了相应的捕获抗体，然后加入相应的检测抗体和二抗。以TMB为底物，采用MD-M5酶标仪在450nm处测定吸光度。结果显示，小鼠注射2.5nM mAβo*3F、600nM mAβ*6E10和600nM mAβ-ID后可显著增加海马区IL-1β和IL-6的水平，而注射2.5nM mAβ*6E10或2.5nM mAβ-ID的小鼠脑内IL-1β和IL-6的水平与对照组无显著差异(图6的G、H图)。

实施例7 AD患者CSF和血浆中Aβo*3F水平检测(MSD方法)

7.1实验材料与方法

7.1.1实验材料

Aβ多因子检测试剂盒(4G8)：Meso Scale Diagnostics

7.1.2实验仪器

MSD-S600电化学发光检测仪 Meso Scale Diagnostics，USA

7.2 AD患者血浆和CSF中Aβo*3F水平检测

为了评估3F特异性识别的Aβos(Aβo*3F)与AD患者发病机制之间的相关性，测试了从AD患者的CSF和血浆中分离的Aβo*3F含有的Aβ42和Aβ40的水平。

本研究所使用的人血浆和CSF样本均得到郑州大学第一附属医院伦理审查委员会批准，所有受试者在参加研究之前都签署了书面知情同意书。本研究中所使用的受试者样本的基本信息如下：收集了20例平均年龄为73.3岁(年龄范围为57-84岁)的轻度认知障碍(MCI)患者，20例平均年龄为69.4岁(年龄范围为52-85岁)的AD患者，以及20例平均年龄为70.9岁(年龄范围为65-78岁)健康人的血浆样本。此外，还收集了7名AD患者的CSF样本，他们的平均年龄为68岁(年龄范围为59-77岁)和7名非痴呆症受试者的CSF样本，他们的平均年龄为66.3岁(年龄范围为48-79岁)。

为了提取AD患者和健康老年人血浆和CSF中的Aβo*3F，首先将人血浆或CSF样本加入到100μL Protein A/G-琼脂糖凝胶中，4℃孵育1h去除内源性IgG，然后将样品与交联了3F抗体的Protein A磁珠常温孵育2h。第二天，磁珠用0.1％PBST洗三遍后，用20mM甘氨酸(pH 2.0)洗脱3min，洗脱两次，洗脱液用1M Tris中和到pH 7。免疫沉淀提取得到的Aβo*3F浓度用MSD Aβ多因子检测试剂盒(4G8)进行检测。结果显示，与健康老年人相比，AD患者CSF和血浆中Aβo*3F含有的Aβ42和Aβ40的水平都显著增加(图7)。此外，MCI患者血浆中Aβo*3F含有的Aβ42和Aβ40的水平也显著高于对照组，而且都随着AD病理发展而逐渐升高(图7的C、D图)。这些结果表明，AD患者和AD源性MCI患者CSF和血浆中Aβo*3F的水平显著高于健康老年人，且与AD病理发展趋势密切相关，说明Aβo*3F可作为AD诊断，尤其是AD早期诊断的生物标志物。使用GraphPad Prism 8软件中one-way ANOVA伴随Tukey’s多重比较检验的统计方法进行统计，95％置信区间，*代表P<0.05，表示具有显著的统计学差异；**代表P<0.01，表示具有非常显著的统计学差异；***代表P<0.001，表示具有极显著的统计学差异；****代表P<0.0001，表示具有极显著的统计学差异。

实施例8 AD患者和MCI患者血浆中Aβo*3F水平检测(化学发光法)

8.1实验材料与方法

8.1.1实验材料

102抗体：北京热景生物技术有限公司

8.1.2实验仪器

MG60 pro化学发光检测仪：北京热景生物技术有限公司，北京

8.2 AD患者血浆中Aβo*3F水平检测

为了评估3F特异性识别的Aβos(Aβo*3F)与AD患者发病机制之间的相关性，测试了从AD患者的血浆中分离的Aβo*3F含有的Aβ42的水平。

本研究所使用的人血浆和CSF样本均得到郑州大学第一附属医院伦理审查委员会批准，所有受试者在参加研究之前都签署了书面知情同意书。本研究中所使用的受试者样本的基本信息如下：收集了3例平均年龄为65.6岁(年龄范围为62-75岁)的AD患者，3例平均年龄为63.3岁(年龄范围为62-65岁)的MCI患者，以及3例平均年龄为63.6岁(年龄范围为61-65岁)健康人的血浆样本。

为了提取AD患者和健康老年人血浆的Aβo*3F，首先将人血浆样本加入到200μL Protein A-琼脂糖凝胶中，常温孵育15min去除内源性IgG，然后将样品与包被了3F抗体的JSR磁珠常温孵育2h。第二天，磁珠用0.1％PBST洗三遍后，用20mM甘氨酸(pH 2.2)洗脱5min，洗脱两次，洗脱液用1M Tris中和到pH 7。免疫沉淀提取得到的Aβo*3F浓度用3F-102检测试剂盒进行检测。结果显示，与健康老年人相比，AD患者血浆中Aβo*3F含有的Aβ42的水平都显著增加(图8)。此外，MCI患者血浆中Aβo*3F含有的Aβ42的水平也显著高于对照组(图8)。这些结果表明，AD患者和MCI患者血浆中Aβo*3F的水平显著高于健康老年人，说明Aβo*3F可作为AD诊断，尤其是AD早期诊断的生物标志物。

实施例9通过检测CSF或血浆中Aβo*3F水平进行AD诊断

将实施例7中的人血浆和CSF样本打乱重新编号，交予不知情的实验人员按照实施例7的方法用交联了3F抗体的Protein A磁珠对样本中的Aβo*3F进行富集，用MSD Aβ多因子检测试剂盒(4G8)检测样本中Aβo*3F含有的Aβ42和Aβ40的水平。结果显示，样本中Aβo*3F所含Aβ42和Aβ40的量与AD的病理呈正相关，通过该方法检测 人血浆和CSF样本中Aβo*3F的水平，能够将AD、MCI患者与健康人样本显著区分开(图9)。

实施例10用于检测Aβo*3F寡聚体的抗体的优化

将3F抗体的第100位氨基酸K突变为R(不算入为了表达为单链抗体而引入的MA残基时，为抗体编号的第98位，该变体命名为K98R突变体，序列如SEQ ID NO：24所示)，研究了K98R突变体与Aβo*3F寡聚体的结合。使用方法如下。

将上述Aβ寡聚体按100ng/孔包被至96孔板，4℃包被过夜。次日用3％的BSA室温封闭2h，PBST洗涤2遍后拍干备用。稀释K98R突变体和3F，从1μg/ml开始，行倍比稀释，共14个梯度。将稀释好的上述抗体溶液加入至包被上述Aβ寡聚体的ELISA板中，做平行复孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干。加入1:10000稀释的羊抗人IgG-HRP，37℃孵育45min，PBST洗涤3次，拍干。加入TMB显色液显色15分钟左右，终止液终止后，OD₄₅₀nm下读数，数值用graphpad进行分析比较并作图处理。

结果如图10所示，实验表明，K98R突变体与Aβo*3F寡聚体的结合亲和力得到进一步提升，提示该突变体与Aβo*3F寡聚体更高的结合力将有助于更灵敏地检测受试者体内Aβo*3F寡聚体的存在，从而更早期地诊断受试者是否罹患神经退行性相关疾病。本发明人考虑了导致该结果的原因，发现按照IMGT编号进行编号时，第98位氨基酸也是3F抗体的重链CDR3的残基(按照IMGT编号，3F抗体的重链/轻链CDR序列分别为：CDR-H1：GFTFSSYA(SEQ ID NO：25)；CDR-H2：ISNLGLTT(SEQ ID NO：26)；CDR-H3：AKTTSRFDY(SEQ ID NO：27)；CDR-L1：QSISSY(SEQ ID NO：28)；CDR-L2：KAS；CDR-L3：QNSAVRPVT(SEQ ID NO：29))。本发明人同时将其他几条变体序列也进行了K98R的突变，结果类似(数据未显示)。

等同方案

虽然本文已经描述和示出了本发明的多个实施方案，但本领域普通技术人员将容易预想到用于实现本文所述的功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且认为每一个这样的变化和/或修改均在本发明的范围内。更广泛地，本领域技术人员将容易理解，本文所述的所有参数、材料和设定意为示例性的，并且实际的参数、材料和/或设定将取决于使用本发明的教导的具体应用。本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同 方案。因此，应当理解，前述实施方案和实施例仅通过示例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等同方案的范围内，本发明可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。如果这样的特征、系统、物品、材料和/或方法不是相互冲突的话，则两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料和/或方法的任意组合包括在本发明的范围内。

本发明说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为意指如此结合的元素的“任一或两者”，即在一些情况下结合存在而在其他情况下不结合存在的元素。除了由“和/或”从句具体标识的元素之外，可以任选地存在其他元素，无论与那些具体标识的元素相关或不相关，除非另外明确指出。因此，作为非限制性示例，当与开放式语言例如“包含”结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施方案中可以指有A没B(任选地包括除B之外的其他元素)；在另一个实施方案中，指有B没A(任选地包括除A之外的元素)；在又一个实施方案中，指有A和B两者(任选地包括其他元素)；等等。

如本文在说明书和权利要求中所用，“或”应理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分隔列表中的项时，“或”或“和/或”应理解为包含性的，即包括多个元素或元素列表的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地，其他未列出的项。只有明确指出相反的术语，例如“仅其一”或“正好其一”，或当用于权力要求中时，“由……组成”将指包含多个元素或元素列表的正好一个元素。通常，当前面有排他性术语，例如“任一”、“其一”、“仅其一”或“正好其一”时，本文所用的术语“或”应该仅理解为表示排他性的替代方案(即，“一个或另一个但不是两者”)。“基本上由……组成”用于权利要求中时，应具有其在专利法领域中的普通含义。

如本文在说明书和权利要求中所用，指代一个或多个元素的列表时，短语“至少一个”应理解为意指选自所述元素列表的任意一个或多个元素中的至少一个元素，但不一定包括所述元素列表中具体列出的每个元素的至少一个，并且不排除所述元素列表中元素的任意组合。这个定义还允许除短语“至少一个”指代的元素列表中具体标识的元素之外的元素可以任选地存在，无论与那些具体标识的元素相关或不相关。因此，作为非限制性示例，在一个实施方案中，“A和B的至少一个”(或等价地，“A或B的至少一个”，或等价地，“A和/或B的至少一个”)可以指至少一个，任选地包括多于一个A，不存在B(并且任选地包括除B之外的元素)；在另一个实施方案中，指至少一个，任选地包括多于一个B，不存在A(并且任选地包括除A之外的元素)；在又一个实施方案中，指至少一个，任选地包括多于一个A，和至少一个，任选地包括多于一个B(并 且任选地包括其他元素)；等等。

在权利要求以及上述说明书中，所有连接词，例如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“拥有”等理解为是开放式的，即意味着包括但不限于。仅连接词“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭式或半封闭式的连接词。

在权利要求中使用顺序术语，例如“第一”、“第二”、“第三”等来修改权利要求元素本身并不意味着一个权利要求元素相对于另一个权利要求元素的任何优先级、优先性或顺序，或一个方法中动作进行的时间顺序，而仅仅用作将具有某一名称的一个权利要求元素与具有相同名称的另一个元素区分开(但用于序数术语)的标签，以区分权利要求元素。

Claims (19)

1. 一种诊断受试者是否患有早期和中晚期阿尔茨海默病(AD)或AD源性轻度认知障碍(MCI)或处于患有AD的风险中的方法，所述方法包括如下步骤:

   a)任选地，提供来自受试者的待检测样品，

   b)使检测所述受试者样品中Aβo*3F的存在和/或水平的试剂与受试者样品接触，

   c)检测所述受试者样品中Aβo*3F的存在和/或水平，

   其中，所述受试者样品中Aβo*3F的存在和/或水平指示了所述受试者患有AD或AD源性MCI，其中所述Aβo*3F是与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱分析，其分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ ID NO：17-22所示。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者为疑似患有AD或AD源性MCI的患者，优选地，所述受试者为人、非人灵长类动物、猫或犬。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其还包括临床神经心理学和神经影像学评估步骤，优选地，神经影像学是Aβ-PET扫描成像和/或tau-PET。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其还包括检测所述受试者样品中tau水平的变化，优选地，所述tau水平为tau总水平或者磷酸化tau水平。
5. 一种诊断受试者是否患有AD或AD源性MCI或处于患有AD的风险中的试剂盒，其包含检测受试者样品中Aβo*3F的存在和/或水平的试剂，其中所述Aβo*3F是与3F抗体特异性结合的Aβ寡聚体，基于分子排阻色谱分析，其分子量约588kDa，所述3F抗体的轻重链CDR序列分别如SEQ ID NO：17-22所示。
6. 根据权利要求1-4任一项所述的方法或权利要求5所述的试剂盒，其涉及或包括Aβo*3F的富集试剂，所述Aβo*3F的富集试剂包括特异性结合Aβo*3F的结合剂，优选地，特异性结合Aβo*3F的结合剂是特异性结合Aβo*3F的抗体，优选地，所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体或其抗原结合片段，更优选地，所述抗原结合片段选自scFv、F(ab')2、Fab2、Fab、Fab’、Fv、Fd、dAb、骆驼抗体、纳米抗体、双抗体或双特异性抗体。
7. 根据权利要求1-6任一项所述的方法或试剂盒，其中检测Aβo*3F的存在和/或水平的试剂包括特异性结合Aβo*3F或Aβ聚集物的第一结合剂，优选地，特异性结合Aβo*3F或Aβ聚集物的第一结合剂是特异性结合Aβo*3F或Aβ聚集物的抗体，优选地，所述抗 体是单克隆抗体、多克隆抗体或其抗原结合片段，更优选地，所述抗原结合片段选自scFv、F(ab')2、Fab2、Fab、Fab’、Fv、Fd、dAb、骆驼抗体、纳米抗体、双抗体或双特异性抗体。
8. 根据权利要求7所述的方法或试剂盒，其中所述第一结合剂与允许其检测的检测剂连接。
9. 根据权利要求7所述的方法或试剂盒，其中检测Aβo*3F的存在和/或水平的试剂还包括第二结合剂，所述第二结合剂与所述第一结合剂特异性结合，优选地，所述第二结合剂是特异性结合所述第一结合剂的抗体，优选地，所述特异性结合所述第一结合剂的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体或其抗原结合片段，更优选地，所述抗原结合片段选自scFv、F(ab')2、Fab2、Fab、Fab’、Fv、Fd、dAb、骆驼抗体、纳米抗体、双抗体或双特异性抗体，优选地，所述特异性结合所述第一结合剂的抗体与允许其检测的检测剂连接。
10. 根据权利要求8或9所述的方法或试剂盒，其中所述检测剂选自化学发光标记、电化学发光标记、发色团、荧光标记、荧光素型标记、伞形酮、丽丝胺、花菁、德克萨斯红、BODIPY(英杰公司)或其类似物、顺磁性标记、放射性标记、生物素、链霉亲和素/生物素、亲和素/生物素、半抗原、地高辛、金属络合物、金属、酶、胶体金或其组合。
11. 根据权利要求1-10任一项所述的方法或试剂盒，其中所述检测选自化学发光测定、电化学发光测定、酶联免疫吸附测定、免疫荧光测定、免疫组织化学测定、免疫色谱测定、放射免疫测定、单分子免疫分析技术(Simoa)、流式细胞术、细胞分选术、免疫沉淀测定、免疫扩散测定、斑点印迹测定、Western印迹、蛋白质芯片、正电子发射断层术和/或单光子发射计算机断层术，优选地，所述试剂盒包括实施选自化学发光测定、电化学发光测定、酶联免疫吸附测定、免疫荧光测定、免疫组织化学测定、免疫色谱测定、放射免疫测定、单分子免疫分析技术、流式细胞术、细胞分选术、免疫沉淀测定、免疫扩散测定、斑点印迹测定、Western印迹和/或蛋白质芯片的检测所需的试剂、材料、容器和/或装置，优选地，所述酶联免疫吸附测定选自直接酶联免疫吸附测定、间接酶联免疫吸附测定、直接夹心酶联免疫吸附测定以及间接夹心酶联免疫吸附分析。
12. 根据权利要求1-11任一项所述的方法或试剂盒，其中所述受试者样品选自受试者的细胞、组织、器官和/或体液，优选地，所述体液选自全血、血浆、血清、脑脊液、淋巴液、唾液、滑液、支气管肺泡灌洗液、痰、腹水、尿液、羊水、腹膜液、心包液、精液和/或阴道分泌物，优选地，所述体液选自全血、血浆、血清和/或脑脊液。
13. 根据权利要求7-12任一项所述的方法或试剂盒，其中所述特异性结合Aβo*3F的 第一结合剂被附着至固体支持物上。
14. 根据权利要求1-13任一项所述的方法或试剂盒，其中所述方法还包括检测对照样品的步骤，和/或所述试剂盒还含有对照样品，所述对照样品来自健康受试者或未患有AD的受试者。
15. 根据权利要求6-14任一项所述的方法或试剂盒，其中所述特异性结合Aβo*3F的抗体为针对Aβo*3F进行免疫所获得多克隆抗体和/或单克隆抗体或其抗原结合片段，优选地，所述抗体为人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、绵羊抗体或非人灵长类动物抗体。
16. 根据权利要求1-15任一项所述的方法或试剂盒，其中，基于MSD电化学发光方法，健康人群的脑脊液中Aβo*3F的浓度为Aβ42o*3F：80.44±20.88pg/ml、Aβ40o*3F：24.35±5.08pg/ml；和/或血浆中Aβo*3F的浓度为Aβ42o*3F：71.63±36.8pg/ml、Aβ40o*3F：2.24±0.92pg/ml；轻度认知障碍人群的血浆中Aβo*3F的浓度为Aβ42o*3F：112.93±25.02pg/ml、Aβ40o*3F：4.64±1.43pg/ml；AD患者人群的脑脊液中Aβo*3F的浓度为Aβ42o*3F：264.8±42.26pg/ml、Aβ40o*3F：85.74±10.62pg/ml，和/或血浆中Aβo*3F的浓度为Aβ42o*3F：159.44±36.8pg/ml、Aβ40o*3F：14.0±5.59pg/ml；或

    基于化学发光方法，健康人群的血浆中Aβ42o*3F的浓度为68.02±39.17pg/ml；轻度认知障碍人群的血浆中Aβ42o*3F的浓度为124.5±12.57pg/ml；AD患者人群的血浆中Aβ42o*3F的浓度为205.75±50.96pg/ml。
17. 根据权利要求1-16任一项所述的方法或试剂盒，其中，基于MSD电化学发光方法和化学发光方法，所述检测的灵敏度低至0.5pg/ml。
18. 根据权利要求7-17任一项所述的方法或试剂盒，其中特异性结合Aβo*3F的抗体是特异性针对Aβo*3F的不同表位的多种抗体，例如分别特异性针对Aβo*3F的2个、3个、4个、5个或更多个不同表位的2种、3种、4种、5种或更多种抗体。
19. 根据权利要求6所述的方法或试剂盒，其中从样本中富集Aβo*3F的步骤利用特异性结合Aβo*3F的抗体的免疫沉淀法进行。