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TWI399172B - A method for preparing a water-soluble and biodegradable antibacterial agent - Google Patents

A method for preparing a water-soluble and biodegradable antibacterial agent Download PDF

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TWI399172B
TWI399172B TW099133718A TW99133718A TWI399172B TW I399172 B TWI399172 B TW I399172B TW 099133718 A TW099133718 A TW 099133718A TW 99133718 A TW99133718 A TW 99133718A TW I399172 B TWI399172 B TW I399172B
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aqueous solution
peptide
solution
sodium hypochlorite
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TW099133718A
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TW201215319A (en
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Chunyi Li
Kenyuan Chang
Chiachang Liu
Yingnan Tsai
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Far Eastern New Century Corp
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
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Description

一種製備具水溶性及生物可分解性抗菌劑之方法
本發明係有關於一種製備具水溶性及生物可分解性抗菌劑之方法，特別是一種包含鹵胺官能基之多胜肽氯化物之製備方法。
在我們生活的周遭環境中，甚至於人體上，我們都可以自其中發現至少數千種的微生物存在。在這些微生物中，有些對人類有益，有些則是有害的，其中有益的微生物，人類可利用其生產製造所需的食物或化學品，而有害的微生物則可能會在食品或藥品的加工、貯存及運輸過程中，或是在消費者使用時，造成其破壞，甚至是會使人體內組織受到感染。因此，為避免此種有害微生物對人類可能造成之危害，在我們生活周遭及各種應用上，抗菌劑之需求便應運而生。目前已知有多種的抗菌劑被開發出，並被廣泛使用於各種生活應用中。
目前所發展的各式抗菌劑中，有一類抗菌劑為含有鹵胺(N-halamine)化合物成分之抗菌劑，其對於細菌、黴菌及病毒等，都具有相當良好的抗菌功效。習知，鹵胺化合物是指含有N-X之鹵胺官能基(X可以為Cl、Br或I)的化合物，其可利用含胺、醯胺，或者醯亞胺基團等官能基的化合物，經氧化劑(如次鹵酸鹽)氧化作用而得。該類型化合物中的N-X官能基，於微生物存在下，在水中受水分子的作用下會緩慢解離，而釋放出具有氧化作用的鹵素離子，同時此化合物中的N-X官能基則會被還原成為N-H官能基。此被游離釋放出具有氧化作用之鹵素離子，可以殺死細菌、黴菌等微生物。此類鹵胺化合物於解離出鹵素離子殺死微生物後，通常可再藉由前述之次鹵酸鹽處理，使其中的N-H官能基再度被氧化為N-X官能基，使其殺菌功能得以再生。習知，鹵胺化合物因具有殺菌速度快、殺菌效率高、具長效性、安定性佳，及具抗菌能力可再生等優點，故極適用於家庭、商業和醫療場所的消毒。
習知抗菌型鹵胺化合物之開發，以Worley等人之研究最具代表性，其所帶領之研究團隊已開發出許多種具抗菌性之鹵胺化合物，但均係以環狀鹵胺化合物(cyclic N-halamine compound)為主體，其揭示之結構，例如有oxazolidinones(US5902818)、imidazolidinones(US5126057)、hydantoins和spirocyclic amines等。這些結構經次氯酸鹽處理後，皆可得到N-Cl官能基而具有抗菌之功效，但不論是該等單體或是聚合物，皆有不易溶於水之問題，致使其應用領域，甚至於抗菌性，皆受到限制。
另一方面，基於對環境的保護，一般來說抗菌劑系統，現大多傾向於使用水相系統取代有機溶劑，藉以降低有機溶劑對環境的危害。
為了可應用於水相系統，Worley等人思及，於聚合物之側鏈接上親水性基團，從而得到水溶性較高的抗菌物質。一般是利用四級銨鹽(quaternary ammonium salt)做為該親水性基團，藉以提升其對水的溶解度。例如，Worley等人開發了一種以矽氧烷(siloxane)為骨架，分別接上環狀鹵胺化合物hydantoin與四級銨鹽結構之抗菌高分子(US7335373)。其中，siloxane與hydantoin對水的溶解度非常差，而該抗菌高分子對水的溶解度主要以四級銨鹽來提升，但四級銨鹽並不具抗菌功效，因此此類抗菌劑需較長時間接觸才可達到足夠的抗菌效果。雖然Worley等人對其環狀鹵胺化合物之水溶性做了改善，設計出此種結構之抗菌高分子，但其仍有不完全溶於水之問題，使用上仍須藉由於水中添加少量的醇類，以幫助此抗菌高分子溶解，然而此舉並無法完全解決有機溶劑可能會對環境造成危害之疑慮。另一方面，此抗菌高分子之結構乃係藉由化學合成而得，合成過程中及合成後，仍或多或少會使用到有機溶劑並可能產生不必要之副產物，因此生產過程中對環境亦會造成一定的危害。再者，此種抗菌高分子需特別合成，且需經過多道製備製程，因此其價格勢必昂貴。此可從Worley等人已揭示此類化合物技術多年，但至今仍未有大量產品上市，可得證。
因此，開發一種具生物相容性、無毒性、可再生之抗菌能力、製備方式簡易，且價格便宜之水溶性抗菌物質係有其必要的。
本發明之主要目的係提供一種製備具高水溶性且具生物可分解性之抗菌劑的方法。
根據本發明所指出之製備生物可分解之抗菌水溶液的方法，包含下列步驟：(a)提供一多胜肽化合物，使其溶於一水溶液中，以形成一多胜肽水溶液；(b)提供一次氯酸鈉水溶液；(c)將該次氯酸鈉水溶液加入該多胜肽水溶液中形成一混合液；以及(d)於室溫下使該混合液混合至少1分鐘，以使該多胜肽化合物與該次氯酸鈉水溶液中之次氯酸鈉反應，藉以形成一多胜肽氯化物。
上述步驟中，其中所述之該多胜肽氯化物具有至少一個N-Cl鹵胺官能基。特別的是，該多胜肽化合物係為一聚麩氨酸或聚天冬氨酸，且該多胜肽酸氯化物為一聚麩氨酸氯化物或聚天冬氨酸氯化物。
根據本發明所指出之製備方法，其具有製程無毒性、不需使用有機溶劑，因此不會對環境造成危害。另外，本發明製備方法尚具有製程簡便(因無需藉由繁雜耗時之化學合成製程)、產率高且成本低廉…等優點。
此外，根據本發明製備方法即可輕易地製得具有高殺菌效率、長效性，及抗菌性可再生等優點之抗菌劑，。
故而本發明所述之製備方法已可充分解決習知製備包含環狀鹵胺化合物成分之抗菌劑，於合成時需使用大量有機溶劑、該化合物無法單純利用水相系統作為溶劑，且不具有生物可分解性易對環境造成危害等問題。
為了達到上述目的，根據本發明所揭示之製備方法包含下列步驟：提供一多胜肽化合物，使其溶於一水溶液中，以形成一多胜肽水溶液。另外，提供一次氯酸鈉水溶液，接著將該次氯酸鈉水溶液加入該多胜肽水溶液中形成一混合液。隨後，於室溫下使該混合液混合至少1分鐘，以使該多胜肽化合物與該次氯酸鈉水溶液中之次氯酸鈉反應，進而形成一多胜肽氯化物。其中，該多胜肽氯化物具有至少一個N-Cl鹵胺官能基。
為使熟習本發明領域之技藝者便於瞭解本發明所揭示之技術，請配合參閱第一圖，其揭露本發明之製備具水溶性及生物可分解性抗菌劑之方法，該方法包含下列步驟：首先，形成一多胜肽水溶液(10)，其可藉由提供一多胜肽化合物，使其溶於一水溶液中而製得。另外，提供一次氯酸鈉水溶液(12)。
習知，多胜肽化合物係為由複數個胺基酸單元藉由胜肽鍵連接所形成之聚合物。可應用於本發明中之多胜肽化合物的來源並無特別的限制，其可藉由天然物質經微生物發酵而得，亦可藉由自天然物中分離所得，故其基本上係為天然無毒性之物質。另外，隨著現代科技的發展，亦可依需要，使用習知胜肽合成儀(Peptide Synthesizer)合成所需之胜肽序列。
另外，多胜肽化合物最終降解產物為對環境無害的氨、二氧化碳和水，因此其係為具生物可分解性且環境友好型之化合物，故以其做為原料無習知化學合成之抗菌化合物的缺點。但因多胜肽化合物結構主鏈上之胜肽鍵易受微生物、真菌等作用而斷裂，斷裂後之寡胜肽或胺基酸單體對微生物而言乃係一營養源，故習知之多胜肽化合物非但不具有抗菌性，反而易滋養細菌的成長。但經本發明製備方法改質後，即可賦予習知的多胜肽化合物具有抗菌性。
可應用於本發明中之多胜肽化合物，其種類基本上並無特別限制，但考量原料取得便利性，較佳為聚麩氨酸及聚天冬氨酸，分別具有下述之化學結構式(I)與(II)：
其中m≧n。
可應用於本發明中之多胜肽水溶液，其製備方式並無特別的限制，只要是任何習知可將多胜肽化合物配製成水溶液之方式皆可。例如，可將多胜肽化合物加入純水中攪拌至其完全溶解，藉以配製成所需之操作濃度。
前述多胜肽水溶液之操作濃度與次氯酸鈉水溶液濃度並無特別的限制，只要該多胜肽水溶液與該次氯酸鈉水溶液反應後所形成之多胜肽氯化物可以達到一最低N-Cl鹵胺官能基含量濃度即可。接著，將該次氯酸鈉水溶液加入該多胜肽水溶液中形成一混合液(14)。為便於操作上之方便性，於上述混合液中，多胜肽水溶液中之多胜肽化合物總量以100重量份計時，該次氯酸鈉水溶液中之次氯酸鈉添加量較佳為5~100重量份，更佳為35~50重量份。
最後，使該混合液混合反應(16)，以使該多胜肽化合物與該次氯酸鈉水溶液中之次氯酸鈉反應，進而形成一多胜肽氯化物。其中，該多胜肽氯化物具有至少一個N-Cl鹵胺官能基。
前述之N-Cl鹵胺官能基含量濃度，係指所有N-Cl鹵胺官能基重量相對於該多胜肽氯化物總重量之百分比例。於本發明中所述之最低N-Cl鹵胺官能基含量濃度，較佳為不低於0.3wt%，更佳為介於0.3~15wt%範圍內，即能發揮抗菌之功效。另外，當本發明多胜肽氯化物溶於水中配製成抗菌劑時，其上之N-Cl之鹵胺官能基於抗菌劑中之含量不小於100ppm時，即可具有抗菌之功效；又以200~10000ppm為較佳。
前述之混合反應時間較佳為至少1分鐘，更佳為至少30分鐘，最佳為90~180分鐘，以使該混合液中之多胜肽化合物與次氯酸鈉水溶液中之次氯酸鈉有足夠的時間反應至足以形成具有最低抗菌效果之多胜肽氯化物。
根據本發明所述之製備方法，係藉由將多胜肽化合物與次氯酸鈉水溶液中之次氯酸鈉反應，將多胜肽化合物中之N-H官能基氧化成N-Cl之鹵胺官能基。熟習本發明領域之技藝者藉由本發明所揭示之內容，即可輕易的推知，N-Cl之鹵胺官能基中的Cl，亦可以Br或I替代。因此，可利用同樣具有氧化效力之其餘種類鹵化劑取代次氯酸鈉水溶液中之次氯酸鈉以和多胜肽化合物反應。
根據本發明製備方法所製得之抗菌劑，於微生物存在下，在水中受水分子的作用下抗菌劑中的多胜肽氯化物會緩慢解離，而游離釋放出具有氧化作用的鹵素離子，該鹵素離子可以殺死細菌、黴菌等微生物，因此可獲致抗菌之功效。
另外，於本發明製備方法中，因次氯酸鈉水溶液為氧化劑，故前述混合液溫度較佳保持於室溫下，以避免高溫造成劇烈反應而釋放氯氣的可能性。
前述使該混合液混合反應(16)的步驟中，為使多胜肽化合物與次氯酸鈉水溶液中之次氯酸鈉反應較為快速，可進一步對該混合液施予以外力使其擾動。例如，可藉由磁石攪拌、搖勻、葉片攪拌等，熟習技藝者所熟知之任何其他可施加之方式，本發明之應用範圍並不限於此舉。
為使本發明製備方法有較佳之製備效果，前述混合液之pH值較佳係介於6~8之範圍內；當於pH值過高之鹼性環境下，易導致多胜肽化合物與次氯酸鈉水溶液中之次氯酸鈉反應速度慢，氧化程度差而效果不彰；而當pH低於6時，易使反應速度提升，進而造成肽鍵(amide bond)的斷裂及分子量的下降，致使多胜肽化合物的結構受到破壞。
為控制前述混合液之pH值於反應過程中可保持於前述較佳之範圍內，可選擇性地於該混合液中添加一pH值緩衝劑藉以調節混合液之pH值。
可應用於本發明中之pH值緩衝劑並無特別的限制，包含但不僅限於，磷酸水溶液、氯化銨水溶液、醋酸水溶液、磷酸氫鈉水溶液、磷酸氫二鈉水溶液、苯甲酸水溶液，或上述溶液之混合液。
根據本發明製備方法所製得之抗菌劑，為避免其中所含有之多胜肽氯化物因濃度過高而易與水反應，因而釋放出氯氣，多胜肽氯化物於抗菌劑中之濃度以不大於10wt%為較佳。
熟習本發明領域中之技藝者，通過本發明所揭示之內容，當可瞭解到，依據本發明製備方法所製得之多胜肽氯化物，亦可將其製備成固態物。例如，可藉由習知之溶劑-非溶劑方法(solvent-nonsolvent)，將多胜肽氯化物析出，再將多胜肽氯化物乾燥後，即可得到多胜肽氯化物之固體粉末。溶劑-非溶劑方法係利用多胜肽氯化物對非溶劑之溶解度極低或不可溶之特性，添加非溶劑後會誘導多胜肽氯化物於水中析出，形成一相分離態。可應用於本發明中溶劑-非溶劑方法之非溶劑，必須與水互溶，但多胜肽氯化物對其溶解度極低而可析出。非溶劑在此可舉出的例子，包含但不僅限於，異丙醇、甲醇、乙醇、丙酮或乙腈。
以下列舉數個實施例以更詳盡闡述本發明之方法，然其僅為例示說明之用，並非用以限定本發明，本發明之保護範圍當以後附之申請專利範圍所界定者為準。
實施例
N-Cl鹵胺官能基含量濃度之測定
N-Cl鹵胺官能基於聚麩氨酸氯化物之含量濃度之測定方式係以一滴定方式進行，包含下列步驟：
1.　首先取5g的硫代硫酸鈉(Aldrich，US)以純水稀釋至200ml，配製成硫代硫酸鈉滴定液。
2.　秤取經氧化反應後之聚麩氨酸氯化物0.5g，再加入1g的碘化鉀粉體(Aldrich，US)及40ml的純水並持續進行攪拌至粉體完全溶解，必要時可添加少量的醋酸作為催化劑。
3.　將步驟2中的混合物以步驟1中之硫代硫酸鈉滴定液進行滴定，並以澱粉試劑(Aldrich，US)作為指示劑，當溶液由紅棕色轉為無色透明時，即表示已達滴定終點，記錄下所使用硫代硫酸鈉滴定液之體積。
4.　滴定之反應方程式，如下式(a)所述：
NCl +2I - +H + →Cl - +NH +I 2
I 2 +2S 2 O 3 2- →2I - +S 4 O 6 2- 　(a)
根據此反應方程式，藉由硫代硫酸鈉滴定液所使用之莫耳數，可得知N-Cl鹵胺官能基於每克聚麩氨酸氯化物之含量濃度。N-Cl鹵胺官能基於聚天冬氨酸氯化物之含量濃度之測定，可依上述之滴定方式測定，僅需將聚麩氨酸氯化物取代為聚天冬氨酸氯化物即可。
製備具不同N-Cl鹵胺官能基含量濃度之聚麩氨酸氯化物
實施例1：
取10.0克之聚麩氨酸(Polyglutamic acid,PGA-Na+ ,Mw~2,000,000，味丹，台灣)置於250 ml單頸瓶中，加入90 ml純水使其溶解，配得一聚麩氨酸水溶液。再添加4g濃度為12.65wt%次氯酸鈉水溶液以形成一混合液。於室溫下持續攪拌該混合液30分鐘，以使聚麩氨酸與次氯酸鈉反應。將反應後之混合液置於分液漏斗中，以異丙醇析出聚麩氨酸氯化物，將其分離出分液漏斗後，置於真空烘箱中進行乾燥。乾燥後的產物為白色至淡黃色的粉末，將其溶於水中可完全溶解。將乾燥後的聚麩氨酸氯化物以硫代硫酸鈉進行滴定，最終求得每克聚麩氨酸氯化物中所含N-Cl鹵胺官能基含量濃度。
實施例2~6：
實施方式如實施例1中所述，但將次氯酸鈉水溶液，分別以12、20、28、36及40g之重量添加入聚麩氨酸水溶液。於室溫下持續攪拌混合液30分鐘，以使聚麩氨酸與次氯酸鈉反應。將反應後之混合液置於分液漏斗中，以異丙醇析出聚麩氨酸氯化物，將其分離出分液漏斗後，置於真空烘箱中進行乾燥。乾燥後的產物為白色至淡黃色的粉末，將其溶於水中可完全溶解。將乾燥後的聚麩氨酸氯化物以硫代硫酸鈉進行滴定，最終求得每克聚麩氨酸氯化物中所含N-Cl鹵胺官能基含量濃度。
實施例7~8：
實施方式與配比如實施例1中所述，但將於室溫下攪拌混合液時間分別延長至90及180分鐘，待反應時間達到後，同樣地將反應後之混合液置於分液漏斗中，以異丙醇析出聚麩氨酸氯化物，將其分離出分液漏斗後，置於真空烘箱中進行乾燥。乾燥後的產物為白色至淡黃色的粉末，將其溶於水中可完全溶解。將乾燥後的聚麩氨酸氯化物以硫代硫酸鈉進行滴定，最終求得每克聚麩氨酸氯化物中所含N-Cl鹵胺官能基含量濃度。
實施例9：
實施方式如實施例1中所述，但將次氯酸鈉水溶液以80g之重量添加入聚麩氨酸水溶液。並同時將於室溫下攪拌混合液時間延長至1440分鐘。待反應時間達到後，將反應後之混合液置於分液漏斗中，以異丙醇析出聚麩氨酸氯化物，將其分離出分液漏斗後，置於真空烘箱中進行乾燥。乾燥後的產物為白色至淡黃色的粉末，將其溶於水中可完全溶解。將乾燥後的聚麩氨酸氯化物以硫代硫酸鈉進行滴定，最終求得每克聚麩氨酸氯化物中所含N-Cl鹵胺官能基含量濃度。
實施例10：
取5.0克之聚麩氨酸置於500 ml單頸瓶中，加入167 ml純水使其溶解，配得一聚麩氨酸水溶液。再添加54g濃度為4.89wt%次氯酸鈉水溶液，並以0.5 N之磷酸水溶液將pH值調整於6~8之間，形成一混合液。於室溫下持續攪拌混合液1分鐘，以使聚麩氨酸與次氯酸鈉反應。將反應後之混合液置於分液漏斗中，以異丙醇析出聚麩氨酸氯化物，將其分離出分液漏斗後，置於真空烘箱中進行乾燥。乾燥後的產物為白色至淡黃色的粉末，將其溶於水中可完全溶解。將乾燥後的聚麩氨酸氯化物以硫代硫酸鈉進行滴定，最終求得每克聚麩氨酸氯化物中所含N-Cl鹵胺官能基含量濃度。
實施例11~12：
實施方式與配比如實施例10中所述，但將於室溫下攪拌混合液時間分別延長至5及10分鐘，待反應時間達到後，同樣地將反應後之混合液置於分液漏斗中，以異丙醇析出聚麩氨酸氯化物，將其分離出分液漏斗後，置於真空烘箱中進行乾燥。乾燥後的產物為白色至淡黃色的粉末，將其溶於水中可完全溶解。將乾燥後的聚麩氨酸氯化物以硫代硫酸鈉進行滴定，最終求得每克聚麩氨酸氯化物中所含N-Cl鹵胺官能基含量濃度。
製備具不同N-Cl鹵胺官能基含量濃度之聚天冬氨酸氯化物
實施例13：
取10.0克之聚天冬氨酸(Polyaspartic acid,PASP,Mw~5000，泰和水處理，中國)置於500 ml單頸瓶中，加入80 ml純水使其溶解，配得一聚天冬氨酸水溶液。再添加94g濃度為6.84wt%次氯酸鈉水溶液以形成一混合液。於室溫下持續攪拌混合液12小時，以使聚天冬氨酸與次氯酸鈉反應。將反應後之混合液置於分液漏斗中，以乙醇析出聚天冬氨酸氯化物，將其分離出分液漏斗後，置於真空烘箱中進行乾燥。乾燥後的產物為白色至淡黃色的粉末，將其溶於水中可完全溶解。將乾燥後的聚天冬氨酸氯化物以硫代硫酸鈉進行滴定，最終求得每克聚天冬氨酸氯化物中所含N-Cl鹵胺官能基含量濃度。
實施例14：
取10.0克之聚天冬氨酸置於500 ml單頸瓶中，加入80 ml純水使其溶解，配得一聚天冬氨酸水溶液。再添加188g濃度為6.84wt%次氯酸鈉水溶液以形成一混合液。於室溫下持續攪拌混合液12小時，以使聚天冬氨酸與次氯酸鈉反應。將反應後之混合液置於分液漏斗中，以乙醇析出聚天冬氨酸氯化物，將其分離出分液漏斗後，置於真空烘箱中進行乾燥。乾燥後的產物為白色至淡黃色的粉末，將其溶於水中可完全溶解。將乾燥後的聚天冬氨酸氯化物以硫代硫酸鈉進行滴定，最終求得每克聚天冬氨酸氯化物中所含N-Cl鹵胺官能基含量濃度。
實施例15：
取10.0克之聚天冬氨酸置於500 ml單頸瓶中，加入50 ml純水使其溶解，配得一聚天冬氨酸水溶液。再添加70.2g濃度為9.23wt%次氯酸鈉水溶液以形成一混合液。於室溫下持續攪拌混合液3小時，以使聚天冬氨酸與次氯酸鈉反應。將反應後之混合液置於分液漏斗中，以乙醇析出聚天冬氨酸氯化物，將其分離出分液漏斗後，置於真空烘箱中進行乾燥。乾燥後的產物為白色至淡黃色的粉末，將其溶於水中可完全溶解。將乾燥後的聚天冬氨酸氯化物以硫代硫酸鈉進行滴定，最終求得每克聚天冬氨酸氯化物中所含N-Cl鹵胺官能基含量濃度。
實施例配比、反應時間、及N-Cl鹵胺官能基含量濃度之結果彙整如同表1、表2中所述。
抗菌測試
大多數抗菌劑之抗菌活性測試乃係經由對抗廣範圍的微生物包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性微生物來評估。本發明之試驗菌液乃係金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ，BCRC Number 15211)及大腸桿菌(Escherichia coli ，BCRC Number 11446)。其中，該金黃色葡萄球菌係一革蘭氏陽性菌，而大腸桿菌係一革蘭氏陰性菌。
A.　菌株之培養
由一保存的瓊脂培養基上挑選出一單一菌落(single colony)之金黃色葡萄球菌及大腸桿菌，分別將其接種至一含有2000μL之LB肉湯培養液(LB broth)之15 mL離心管中，接著將該離心管震盪歷時10分鐘，充分散浮菌體後，繼而將所形成的庫存(stock)菌液以LB肉湯培養液進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)，以得到具有不同稀釋倍數(10-1 、10-2 、10-3 、10-4 以及10-5 倍)之經稀釋之菌液。之後，將100 μL具有不同稀釋倍數的金黃色葡萄球菌及大腸桿菌之菌液分別接種至不同的瓊脂培養基上並以三角玻璃棒予以均勻地塗佈。接著，將塗佈有菌液之瓊脂培養基置於37℃的培養箱中進行培養，歷時14~24小時後，即可觀察不同稀釋倍數之菌液經塗盤後之生長情形，並可數出agar範圍(20~300CFU)之菌落形成單位，此一步驟可確定細菌於此環境下可正常生長。再根據經計算的瓊脂培養基的菌落形成單位，取適量庫存菌液以滅菌水調整菌液濃度，以得到一濃度為106 ~107 CFU/mL之試驗菌液。
B.　抗菌定性測試
將上述兩種試驗菌液(金黃色葡萄球菌及大腸桿菌)取100 μL，分別接種至不同之瓊脂培養基上並以三角玻璃棒予以均勻地塗佈。接著，將實施例1~15所配製之多胜肽氯化物(聚麩氨酸氯化物及聚天冬氨酸氯化物)及未處理之多胜肽化合物分別製造成一錠狀物，並分別將它們水平地貼在上述塗佈有試驗菌液的瓊脂培養基上，繼而將該等瓊脂培養基置於37℃的培養箱中進行培養，歷時14~24小時後，觀察該等錠狀物表面及其周圍。以肉眼即可明顯看出在多胜肽氯化物錠狀物的表面及其周圍沒有菌落形成，而多胜肽錠狀物的表面及其周圍則有菌落形成。
C.　抗菌定量測試
本試驗乃係依據動態接觸ASTM E2149之抗菌基準來進行評估，本試驗係將上述兩種試驗菌液(金黃色葡萄球菌及大腸桿菌)分別稀釋10倍，使其濃度調整為105 ~106 CFU/mL，作為本試驗之試驗菌液。
各稱取實施例1~12所配製之多胜肽氯化物125mg及多胜肽化合物125mg作為對照組，接種5mL之試驗菌液進行培養。
經培養24小時後，分別測定多胜肽氯化物及對照組接種菌液後未經培養之菌數(A)，及多胜肽氯化物及對照組經培養後之菌數(B)。將上述所得菌數經計算後，其抗菌活性(antibacterial activity)可藉由下列方程式(b)而被計算出來：
其中，A表示：接種菌液後未經培養之菌數；B表示：接種菌液後經培養24小時之菌數。當B遠大於A時，即代表不具抗菌活性。實施例1~15及對照組之抗菌活性如下表3、表4所示。
D.　抗菌定量測試
本試驗乃係依據靜態接觸AATCC 100之抗菌基準來進行評估。將實施例1~12所製得的多胜肽氯化物及對照組利用含浸壓吸方法分別處理在棉布上，並裁切成大小為2×2 cm2 的方形試片，分別將它們水平地貼在一為50 mL之血清瓶的底部上，接種20 μL之106 ~107 CFU/mL試驗菌液(金黃色葡萄球菌及大腸桿菌)。當試驗菌液與該等方形試片接觸後，立刻以20 mL的滅菌水將沖洗該等方形試片，測定其接種菌液後未經培養之菌數(A)。再取一組已接種試驗菌液之方形試片，於試驗菌液與該等方形試片接觸後，進行培養24小時後，測定其經培養之菌數(B)。
其多胜肽氯化物及對照組之抗菌活性(antibacterial activity)可依據上述方程式(b)而被計算出來。實施例1~15及對照組的抗菌活性被顯示於下表4、表5中，表5、表6中之菌落密度(CFU/cm2 )乃係指於2 x 2 cm2 範圍內計數所得之菌落數除以該範圍面積而得到之數值。
由表3、表4、表5，及表6可知，根據本發明製備方法所製得之多胜肽氯化物被證實對於革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌具有良好之抗菌活性。並且，根據本發明製備方法可以輕易地藉由次鹵酸鹽氧化處理而製得抗菌聚合物。因此，本發明提供一種簡單之製備具有抗菌功效之抗菌劑之方法。
E.　最小抗菌濃度之抗菌定量測試
本試驗乃係依據動態接觸ASTM E2149之抗菌基準來進行評估。取實施5之聚麩氨酸氯化物，分別配製成測試濃度0.1~10wt%之聚麩氨酸氯化物水溶液(詳列於表7)，分別測定其及對照組之聚麩氨酸之抗菌活性。由表7得知，當聚麩氨酸氯化物測試濃度為0.1wt%時，即於聚麩氨酸氯化物水溶液中包含100ppm之N-Cl鹵胺官能基，尚有95.2%之抗菌活性；當聚麩氨酸氯化物測試濃度為10 wt%時，即於聚麩氨酸氯化物水溶液中包含10000ppm之N-Cl鹵胺官能基，抗菌活性大於99.9%。
由表7可知，當N-Cl鹵胺官能基於水溶液中之含量為100ppm時，即可抑制細菌之成長。因此，根據本發明製備方法所製得之抗菌劑，N-Cl鹵胺官能基於該抗菌劑之含量不小於100ppm，即具有抗菌之功效。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，並非用以限定本發明實施之範圍，任何熟習技藝者，在不脫離本發明之精神及範圍內，所作之簡單的等效變化或修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
10．．．形成一多胜肽水溶液
12．．．提供一次氯酸鈉水溶液
14．．．將次氯酸鈉水溶液加入多胜肽水溶液中形成一混合液
16．．．使該混合液混合反應
第一圖係本發明之製作流程圖
10．．．形成一多胜肽水溶液
12．．．提供一次氯酸鈉水溶液
14．．．將次氯酸鈉水溶液加入多胜肽水溶液中形成一混合液
16．．．使該混合液混合反應

Claims (15)

  1. 一種製備生物可分解之抗菌劑的方法，包含下列步驟：(a)提供一多胜肽化合物，使其溶於一水溶液中，以形成一多胜肽水溶液；(b)提供一次氯酸鈉水溶液；(c)將該次氯酸鈉水溶液加入該多胜肽水溶液中形成一混合液，該混合液之pH值為6~8；以及(d)使該混合液混合不低於1分鐘，以使該多胜肽化合物與該次氯酸鈉水溶液中之次氯酸鈉反應，形成一具有至少一個N-Cl鹵胺官能基之多胜肽氯化物，其中，該多胜肽化合物為一聚麩氨酸或聚天冬氨酸，且該多胜肽氯化物為一聚麩氨酸氯化物或聚天冬氨酸氯化物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該多胜肽水溶液中之該多胜肽化合物總量以100重量份計時，該次氯酸鈉水溶液中之次氯酸鈉添加量為5~130重量份。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該多胜肽水溶液中之該多胜肽化合物總量以100重量份計時，該次氯酸鈉水溶液中之次氯酸鈉添加量為35~50重量份。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該多胜肽氯化物具有0.3~15 wt%之該N-Cl鹵胺官能基。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該抗菌劑包含有不低於100ppm之該N-Cl鹵胺官能基。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該抗菌劑包含有100~10000ppm之該N-Cl鹵胺官能基。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該抗菌劑包含有 200~10000ppm之該N-Cl鹵胺官能基。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該混合液中進一步包含一pH值緩衝劑。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該pH值緩衝劑為磷酸水溶液、氯化銨水溶液、醋酸水溶液、磷酸氫鈉水溶液、磷酸氫二鈉水溶液、苯甲酸水溶液，或上述溶液之混合液。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該混合液於室溫下的混合反應的時間為不低於30分鐘。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該混合液於室溫下的混合反應的時間為90~180分鐘。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該步驟(d)中進一步包括一對該混合液施予以外力使其擾動之步驟。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該步驟(d)之後進一步包括：(e)添加非溶劑以析出該多胜肽氯化物之步驟。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該非溶劑為異丙醇、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈或該等之混合物。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該步驟(d)中之該反應係於室溫下進行。
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