TWI316962B - Somatic pluripotent cells - Google Patents

Description

1316962 五、發明說明（1) 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於一種培養的動物體細胞，更特別地， 本發明係有關於一種具有正常核塑之培養的動物體細胞。 【先前技術】 多功能胚胎幹細胞(plurpotent embryonic stem, ES )是由早期的哺乳類胚胎衍生而來。它們在體内（i η vivo)可分化成所有的細胞系統（cell lineages)，並 且，當它們在體外被誘發時，也可分化成大部分的細胞形 式。由於其多功能的特性，一般相信胚胎幹細胞對於治療 退化或遺傳疾病有很大的希望。道德因素阻礙了人類幹細 胞在研究與治療上的使用。非胚胎來源的 (η ο η - e m b r y ο n i c 〇 r i g i η) 多功能細胞（例如：體細胞）將 避免這層障礙。 曾經有報告指出，有一些體細胞可以發育成不相關之 組織形式（unrelated tissue types) 的細胞，然而，其 發育功能是有限的。因此必須使體細胞具有不受限的發育 功能。 【發明内容】 本發明之一型態的特色係在提供一個具有正常核型 (karyotype)之培養的動物體細胞，並且當該細胞在體外 被誘發時，會發育成一個胚胎體（embryoid body)，亦即 一個可更進一步發育成具有器官特色之結構的細胞團 (c e 1 1 u 1 a r m a s s )。此類結構的例子包括原腸 (primordial gut )，其結構表現出規則的收縮與舒張。由

1316962 五、發明說明（2) 於該培養細胞的來源為非胚胎的或非生殖細胞系 (non germ-line)的’所以稱之為體細胞（somatic)。 本發明之另一型態的特色在提供一個具有正常核型之 培養的動物體細胞，並且當該細胞被引入嚴重聯合免疫缺 陷病（severely combined immunodeficient， SCID)小鼠 時’會發展成畸舱瘤（teratoma)。崎胎瘤是一種包含了 所有從三種胚胎初發層衍生之組織的腫瘤，這三種胚胎初 發層即外胚層（ectoderm)、中胚層（mesoderm)和内胚層 (endoderm)。該組織的例子包括：角膜晶體（corneal lens)和發育中的表皮（devei〇ping epj_dermis)(外胚 層）’軟骨（cartilage)和橫紋肌（striated muscle)(中 胚層）’以及肝和胃腸道（gastr〇intestinal tracts) (内胚層）。在一實施例中，當此培養的動物體細胞在體外 被誘發時，可發育成胚胎體（embry〇id body)。在另一實 施例中’該培養的細胞未表現階段特異性胚胎抗原_】 (stage-specific embryonic antigen-1， SSEA-1)，亦即 SSEA-1 陰性（SSEA-1 negative)。 本發明之另一型態中，如同以上所述，本發明的特色 在提供一種產生多功能動物細胞的方法。該方法包括： (1)從動物組織分離出體細胞；（2)在飢餓狀態（starving condition)下培養該分離的細胞；和（3)在培養的細胞當 中鐘別和集結多功能細胞。當此集結的多功能細胞被引入 S C I D小鼠’該細胞會發育成畸胎瘤。體細胞可從哺乳類動 物分離出來’包括人類。利用此方法任何適當的組織都可

l〇57-5323-PF(Nl).Ptd 第5頁 1316962 五、發明說明（3) 分離出體細胞。此類組織的例子包括：臍帶血 (umbilical cord blood)，骨髓（b〇ne marrow)，羊水 (amniotic fluid)，脂肪組織（adip〇se tissue)，胎盤 (placenta)，和週邊血液（peripheral bl〇〇d)。 為了產生多功能細胞，必須在不適合細胞生長的饑餓 條件下培養分離的細胞，例如：在含有〇. 5%至2%血清 (serum)的飢餓培養基（starving medium)中培養5 —1〇 天；或在含有10%至20%血清的一般培養基（regular medium)中培養7-21天，而不更換介質。一般培養基含有 促進細胞增生的營養和因子，飢餓培養基則含較少的營養 和因子。5亥營養包括血清和企清替代物（s e r u m replacements);而因子包括胰島素（insulin)，表皮生 長因子（epidermal growth factors, EGF)，酸性成纖維 細胞生長因子（acidic fibroblast growth factors， aFGF) ’和驗性成纖維細胞生長因子（basic f ibr〇bias1： growth factors，bFGF)。在仇餓狀態下培養的細胞當 中’我們可以根據其形態學和胚胎幹細胞表面標誌 (cell-surface markers)(例如：階段特異性胚胎抗原-1 陰性）等特性來鑑定出多功能細胞並將其集結。 令人意外地，本發明的多功能體細胞可在飢餓狀態下 產生。本發明的其他特色與優點將會在以下的實施方式和 申請專利範圍中呈現。 【實施方式】 本發明係有關於培養的動物體細胞。這些細胞是多功

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能的’因為當它們在體外被誘發時會發育成胚胎體，或者 當它們被引入SC I D小鼠，則會發育成畸胎瘤。該細胞擁有 正常細胞所具備的所有染色體（chr〇m〇s〇mes)，並且無顯 著的改變。換句話說，它們具有正常的核型。 該細胞具備未分化之胚胎幹細胞的表型 (phenotypes)特徵。舉例來說，它們在培養基中會自然 地开》成平坦的球狀集群（flattened spheroid colonies)，在未分化之胚胎幹細胞的培養物中發現相似 的集群。（參見ThomSon j. et al.，Science， 282 : 1 1 45-1 1 47， 1 998.)。該細胞也可顯示出未分化之胚 胎幹細胞的抗原特性，例如：未表現專一階段胚胎抗原 (SSEA)-l ，但表現出SSEA-3 ，SSEA-4 ，TRA-l-60 ， TRA-1-81，和O^ct-4 Q〇ct 是轉錄因子（transcripti〇n factors)的一員，對於多功能細胞的發育有決定性的影 響。Oct 4專一地表現在哺乳動物的生殖細胞系 1 ine)細胞和幹細胞，並且對於維持細胞的多功能性是必 要的。（參見Nichols J. et ai.， Cell， 95:379_391， 1998)。 該細胞也可具有高度的端粒酵素（telomerase)活性。 端粒酵素是一種核糖核蛋白（rib〇nucle〇pr〇tein)，在細 胞複製期間，會增加端粒重覆（tel〇mere repeats)至染 色體末端，藉此維持端粒與染色體的長度。在生殖細胞系 細胞、幹細胞、和胚胎組織中已經發現端粒酵素的高度表 現，但在體細胞中則未發現。因此，在每一次細胞分裂之

1316962 五、發明說明（5) -- 後，體細胞中的端粒（和染色體）會變得較短。最後，經過 有限的生命週期（life span)，由於失去染色體的去氧核 糖核酸（DNA)，體細胞便進入衰老期。由於回復的端粒酵 素表現延長了體細胞的生命週期，本發明之細胞顯現的高 度端粒酵素活性暗示其生命週期與幹細胞相當。 本發明的多功能細胞可經由下列步驟產生：自動物組 織分離出體細胞，在飢餓狀態下培養此分離的細胞，以及 鑑疋和集結培養的細胞。該多功能細胞可從間葉 (mesenchymal)幹細胞製得，而此間葉幹細胞則是利用下 述只施例2的方法或習知技術中類似的方法，從臍帶企， 骨髓，羊水，脂肪組織，胎盤，或週邊血液細胞等部位分 離出來。使用的方法可參考以下著作：EricesA. et al·’ British J. Haematol·， 109:235-242， 2000，

Pittenger M. et al., Science, 284:143-147, 1999, Safford K. et al., Biochem. Biophy. Research

Comm·, 294:371-379， 2002，和 Erickson G. et al·，

Biochem. Biophy. Research Comm., 290:763-769, 2002。將間葉幹細胞培養在含有丨0_2〇%幹細胞篩選的 (ES-screened)胎牛血清（fetal bovine serum，FBS) 和驗性成纖維細胞生長因子之曱型修飾的最低基本培養基 (alpha-modified MEM)中，或上述的飢餓狀態中。在飢 餓狀態下將間葉幹細胞轉變成多功能細胞不需要細胞融 合’也不需要細胞核轉移（nucleus transferring)。經 過飢餓過程之後，根據細胞的形態學（例如：細胞大小和

1057-5323-PF(Nl).ptd 第8頁 1316962 、發明說明（6) =狀）酵素的活性（e n z y m a t i c a c t i v i t y)(例如：驗性 碟酸酵素（alkaline phosphatase)和端粒酵素），和表 面標§4 (例如：SSEA-1陰性，SSEA-3陽性，和SSEA-4陽 ί1生）’可鑑定出多功能體細胞。被鑑定的細胞則利用習知 技術中任何適當的細胞分離技術集結起來。例如：當細胞 傾向於形成群集’則可利用微量吸管在 顯微鏡下直接取出群集。如果要更快速地取得大量的細 胞’則可利用螢光活化細胞分選系統 (fluorescence-activated cell sorting, FACS)，例 f _利用與不同螢光標記接合的抗階段特異性胚胎抗原_3 單株彳几體’抗階段特異性胚胎抗原_ 4單株抗體和抗階段特 異，胚胎抗原-丨單株抗體，就可集結階段特異性胚胎抗原 -3陽性’階段特異性胚胎抗原_4陽性，和階段特異性胚胎 抗原-1陰性細胞。這些細胞將可更進一步地被檢視其多功 能性。 我們可利用任何適當的方法來檢測該細胞的多功能 性，例如：利用以下實施例5所描述的體内畸胎瘤形成測 疋（in vivo teratoma-forming assay)。由於畸胎瘤包 έ所有二種胚胎勒發層的衍生物，所以當一細胞有能力形 成畸胎瘤時’即表示該細胞是多功能的。另外，我們也可 使用以下實施例6描述的體外胚胎體形成測定u n v i tr0 embryoid body-forming assay)。胚胎體的形成即表示該 細胞是多功能的。 本發明的細胞可多方面地被應用。該細胞可用以治療

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退=或遺傳性疾病，避免人體胚胎操縱的道德考量。如此 一來，我們可從一個缺少對於組織或器官 (functl〇nal gene) ^ ^ ^ , , 功能細胞之後’冑可51人編媽有該基因之功能 ΐ τ i之表現核酸載體至該細胞中。此載體可透過不同的 技術傳入細胞，包括：磷酸鈣共沉澱法（caicium p^sihar c〇 一precipitati〇n)，二乙氨乙基—葡聚糖-介 導轉 * (DEAE-dextran-mediated transfecti〇n)，微脂 粒感染（ilp〇fection)，電穿孔法（electr〇p〇rati〇n)， 顯微微量注射法（microinjecti〇n)，或病毒介導技術 (virus-meditated techniques)。必須選擇不影響細胞多 功旎性的方法。有關此類技術的描述可參考以下專利， 如：美國專利申請書第5, 591，625號和美國專利申請書1 2 0 0 2 0 1 2 7 7 1 5號。在傳送作用基因進入細胞之後，可利用 習知技術將細胞移植回病人身上。由於該細胞是由病人產 生口此不會引起免疫排斥（immune rejection)。在適 當的情況下，該移植的細胞可發育成功能性的組織或器 官。為了促進其發育，可對病人施與因子（fact〇rs)以 誘導細胞的發育。此類因子可以是小分子化合物，胜肽 (pept ides) ’和核酸。其例子包括轉化生長因子冷 (transfoi'ming growth factor 0)，促進骨生成之蛋白 質（bone morphogenic proteins)，和神經生長因子 (nerve growth factor)，但不僅限於此。 本發明的細胞也可用以研究胚胎發育或分化的機制。

1316962 五、發明說明（8) 我們可將此類細胞視為模式系統（m 〇 d e 1 s y s t e m)，而鑑 疋誘導多功能細胞發育成特定組織或器官的狀態。此外， 我們可利用先前描述（例如：S h e η M. e t a 1.， ^evel〇pment，1 24:429_42，i 9 9 7 )之分化的互補核酸篩 ^ (differential cDNA screening)來分離胚胎發育期 間扮演重要角色的基因。我們可從被誘導發育成如上述之 胚胎體的多功能細胞中’準備互補核酸殖系基因庫（cDNA 1 ibrary)。該基因庫被覆蓋在兩組複製過濾板（repl ica ters)之間’一組過濾板（A組）利用未誘發細胞製得 的互補核酸篩選，另一組（B組）利用相當數量之誘發細 胞製得的互補核酸篩選。利用習知技術，用以篩選此基因 庫的互補核酸可以被標記和顯現。然後可以從該基因庫中 選擇在B組表現出較強（相較於a組）雜交訊號的互補核酸 轉瘦株（cDNA Cl0nes)。這些互補核酸將誘發細胞中過度 表現的基因譯成密碼。反之亦然，在未誘發之多功能細胞 中過度表現的基因可被分離出來。同樣地，在上述的飢餓 過程之前或之後，也可以分離細胞中過度表現的基因。而 更進一步地研究所有這些分離的基因則可定義其個別過程 之規則。 4足非人類動物產生的多功能細胞可利用如Campbe 11 K’ et al·’ Nature， 380:64-66， 1 996.文章中所描述的 f法’ ^展成動物的器官或轉殖株。因此，這些細胞對於 龍物或豕畜產業有極大的價值，並且可用以保護瀕臨絕種 的動物。

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範圍之下，可對該發明作各種修飾。此 外，/、他貝，例也包含在下列的申請專利範圍之内。 大路有—些實施例被詳加描述，’然而，在不違背 寺疋的實施例僅用以§兒明本發明，但並非用以限 制本發明之揭露。若沒有更進一步的詳述，一般相信熟悉 此技藝人士，在以該描述為基礎的情況下，能全然利用本 毛明所有在此引用的出版品全部併入參考文獻。 實施例1 利用免疫細胞化學染色（Immun〇cyt〇chemistry staining) 檢查細胞標誌。 將胚胎幹細胞表面標諸染色之前，必須於2 〇使用4 % 聚甲醛（paraformaldehyde)將細胞固定1 〇分鐘。將細胞 骨架蛋白（cytoskeletal proteins)染色之前，必須於 -2 0 °C使用曱醇將細胞固定2分鐘，並且以〇. 1 %非離子性 界面活性劑Triton X-100將其穿孔化。將其他細胞内分子 染色之前，必須於2 0 °C使用4 %聚曱醛將細胞固定1 〇分 鐘，並且以0.1% Triton X-100將其穿孔化。 將固定的細胞在一阻斷溶液（blocking solution) 中置放3 0分鐘，此阻斷溶液與培養初始抗體者相同，其中 包含了磷酸鹽緩衝液生理食鹽水（phosphate-buffered sal ine，PBS)，1% 胎牛血清（BSA)，和 Γ/。血清（Sigma, St. Loui s，M0)。然後該細胞被連續培養60分鐘，每一個 伴隨初始抗體的細胞在阻斷溶液，生物素化抗小鼠第二抗 體(biotinylated anti-mouse secondary antibody) ’

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及鍊酶親和素偶聯的馬蘿蔔過氧化物酵素 (strepavidin-conjugated horseradish per〇xidase)當 中會被適當地稀釋。在每一個步驟之間都以含有3 %胎牛 A清的磷酸鹽緩衝液生理食鹽水沖洗丨〇分鐘。當細胞以二 氨基聯苯胺呈色劑（diaminobenzidine Chromagen) (Vector Laboratories Inc.，CA)培養時，馬蘿 _ 過氧 化物酵素活性即會顯現。經過此顯現作用之後，便可在顯 微鏡之下檢視該細胞並將其攝影記錄。 實施例2 自骨髓和臍帶血分離出間葉幹細胞。 人體骨髓自 Bio Whittaker 公司（Walkersville，MD) 購得，臍帶也在供應個體同意下取得。為了分離間葉幹細 胞’使用Ficol-paque ((1 = 1.077 g/ml，Amersham Biosciences’ Piscataway，NJ)密度梯度法（詳述請參 考.Erices A.et al·， British J. Haematol.， 109:235-242， 2000 或Pittenger M. et al.， Science， 284:143-147， 1999)自人體骨髓或臍帶血中準備單核細 胞0 將分離的單核細胞引入組織培養JKI中，使其濃度約為 1 X 106個細胞/每平方公分，該培養皿中含有一般介 質’帶有20%幹細胞筛選用胎牛血清（ES cell-screened FBS) (Hyclone，Logan, UT)的曱型修飾最低基本培養基 (alpha-modified minimum essential medium， MEM) ， 4 ng/m 1驗性成纖維細胞生長因子，i 〇 〇 u/m 1盤尼西林和i 〇 〇

1057-5323-PF(Nl).ptd 第13頁 1316962 五、發明說明（11)

Vg/ml 硫酸鍊黴素（streptomycin) (Invitrogen,

Car 1 sbad, CA)。培養兩個禮拜之後，許多細胞黏附在培 養皿上，這些形態上相同的細胞會以兩倍的時間（約3 2至 3 6小時）自我更新。 這些黏附的細胞再進一步地以上述之免疫細胞化學染 色檢視其特徵。對抗CD34和CD45 (heamatopoeitic系 (heamatopoei tic lineage) 的細胞表面抗原）的抗體是 從Bacton Dickinson 公司（Mountain View, CA)購得。染 色的結果顯示細胞對於CD34和CD4呈陰性的反應，表示該 細胞不屬於造血系。此外，根據已知的方法（詳述請參考

Pittenger M. et al.， Science， 284:143-147， 1999)， 使用適當的培養基，可使細胞被誘發分化成骨細胞 (osteocytes)、軟骨細胞(chondrocytes) 和月旨肪細胞 (adipocytes)。分化的骨細胞利用鈣結節染色法（von Kossa)分析；分化的軟骨細胞利用沙黃〇 (Safranin 0) 染色；脂肪細胞利用油紅〇 (〇i 1 Red 0) 染色。上述的方 法可參考Colter D. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:784卜7845，200 1.。這些結果指出分離的細胞是 間葉幹細胞（Prockop D. et al.，Nature，276:71-74， 1 9 9 7 ·)。但是，由於這些細胞在被引入SC ID小鼠後，無法 發育成畸胎瘤，或者當其被誘發時，無法發育成胚胎體， 因此其發育潛能是有限的。參見以下的實施例5和實施例 6 ° 實施例3

1057-5323-PF(Nl).ptd 第14頁 1316962 五、發明說明（12) 上述之分離的間葉幹細胞在飢餓狀態下培養以產生多 功能細胞。

將間葉幹細胞培養在實施例2所描述的一般培養基中3 至5個繼代（passages)。然後，將該細胞置於含有胎 牛血清但缺乏鹼性成纖維細胞生長因子的曱型修飾最低基 本培養基（飢餓培養基）中5至7天；或選擇將細胞培養在 一般培養基中兩星期而不更換培養基。在上述的飢餓過程 中，以顯微鏡每日觀察細胞，並未發現細胞融合的現象。 在飢餓過程末期，培養物中出現球狀、平坦的群集。使用 微量吸管挑出每一個群集，並且將未分化狀態之群集培養 於小鼠飼養細胞（feeder ceUs)(例如：施予絲裂黴素 之小鼠胎兒成纖維細胞（mit〇mycin_treated m〇use ST〇 cells) (ATCC CRL- 1 5 0 3 ))或小鼠胚胎的纖維母細胞 (fibroblast cells)上，而其培養基為含有2〇%幹細胞 篩選的胎牛血清、4 ng/ml鹼性成纖維細胞生長因子和〇. 1毫摩爾一酼基乙醇（2_mercapt〇ethan〇1)的…關培養 基（Iscove’s modified Dulbecc〇’s medium)。從每一個 群集挑出的細胞可維持在未分化狀態，並且持續增生超過 四個月（或超過1 5個繼代）。

實施例4 檢視從群集中取得之細胞的形態學、細胞標誌表現、 酵素活性和核型。 在光學顯微鏡或掃描式電子顯微鏡（scanning electron microscope)下檢視細胞。若以掃描式電子顯微

1316962 五、發明說明（13)

鏡檢視’則需施行以下步驟：將細胞培養在再生用聚酯薄 膜（Melinex film)上’再以2%四氧化锇（〇smi龍 tetroxide (w/v))固定之，然後在4它下置放於？11 7. 4的 磷酸鹽緩衝液中1 6小時’最後經由分級的乙醇系列 (graded ethanol series)脫水。在使用液體二氧化碳 (liquid carbon dioxide) 和以鉻濺射鍍膜…叩“” coating with chromium) 的臨界點乾燥法 (critical-point drying)之後，以Leo 982 (LEO

ElektiOnenmikroskopie GmbH，Germany)掃描式電子顯 微鏡檢視細胞，其電場發射設定為2千伏特（k V)(見 Bozzola J· etal·，1992.)。掃描式電子顯微鏡的樣品 準備方法參照 ’ Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists, pp. 40-62. Jones and Publishers，Boston. 〇 如同Thomson J. e*t al.，Science，282:1145-1147， 1998 文章中所述，顯微 照相的結果顯示該細胞的形態與未分化的幹細胞相似。 同時，也以上述的免疫細胞化學染色顯示該細胞的特 徵。自愛何華大學的Developmental Studies Hybridoma Bank (Iowa city, ΙΑ)取得對抗階段特異性胚胎抗原-i (MC-480，1:50)，階段特異性胚胎抗原-3 (MC-631， 1:50) ’和階段特異性胚胎抗原-4 (MC-813-70，1:50)的 抗體。自Santa Cruz Biotechnology 公司（Santa Cruz， CA)取得抗腫瘤排斥抗原— no (anH-TRA — uo)和抗腫 瘤排斥抗原-1-81 (anti-TRA-1-81)抗體。結果顯示該細

1057-5323-PF(Nl).ptd 第16頁 1316962 ------- 五、發明說明（14) 〜 胞對於階段特異性胚胎抗原-1為陰性反應，而對階段特異 性胚胎抗原-3、階段特異性胚胎抗原_4、抗腫瘤排斥抗原 -1-60和抗腫瘤排斥抗原—丨_81為陽性反應。如同 Reubinoff B. et al., Nature Biotechnol., 18:+3 99-4 04，2000.文章中所述，轉錄因子〇ct_4的表現也 能藉由反轉錄聚合酵素連鎖反應（reverse ΐι^ηβειΜρΐ^οη-ΡΠΟ 而損測到。 利用 Sigma 86-R 套組（Sigma 86 - R kit) (Sigma，

St · Lou 1 s，MO)可偵測到細胞的鹼性磷酸酵素 (alkaline phosphatase)活性，該細胞展現高度的鹼性 磷酸酵素活性。同時，利用TRAPaze ELSIA端粒酵素檢測 也可偵測該細胞的端粒酵素活性（參考：Kim N. et a 1.，

Science，266:2 0 1 1 -20 1 5， 1 994.)，其結果顯示該細胞具 有高度的端粒酵素活性。 使用已知的方法（參考：ISCN 1 995: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (F. M i te1 man, ed. ) Karger, Sasel (1 9 9 5 ))確定該細胞的核型。簡而言之，在取出該細胞之 前，細胞以1 : 4稀釋度次培養（s u b c u 11 u r e d) 1 2小時。將該 細胞收集在胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA)中， 並在秋水仙素（c ο 1 c e m i d)中培養1. 5小時，然後以低張的 氯化鉀（KC1)溶解，再以酸或醇固定。利用已知的方法（見 Freshney，R in " Culture of animal cells—A manual of basic technique" 3rd edition. A John Wiley &

1057-5323-PF(Nl).ptd 第17頁 1316962 五、發明說明（15)

Sons, Inc· New York ( 1 994)，pp 205-209 )可分析細胞 的中期（me t apha s e s )。其結果顯示該細胞具有人類所有的 46個染色體，與正常的人類染色體相較之下並無顯著差 異。 實施例5 為了測試實施例3中細胞的多功能性，需進行畸胎瘤 形成測定（teratoma-forming assay)。 將大約1 X 1 05個細胞植入SCID小鼠的後腿肌肉組 織，在植入後6 - 8週觀察到畸胎瘤。取出畸胎瘤並進行組 織檢查（檢查方法參照Thomson J. et al.，Science， 282:1145-1147， 1998)。所有檢查的腫瘤都包含從三種胚 胎初發層衍生的組織，包括：發育中的胃腸道 (gastrointestinal tract)(内胚層）；軟骨、骨（bone) 和橫紋肌（中胚層）；和角膜晶體、斷裂的角蛋白 (fragmented keratin)和發育中的表皮（外胚層）。實施例 2為對照組，該組的間葉幹細胞未在SC ID小鼠身上發育成 畸胎瘤。 實施例6 以胚胎體形成測定（embryoid body-f〇rming assay) 測試實施例3細胞的多功能性。 將該細胞培養在非鍍膜的細菌培養皿（n〇n_c〇ated bacteriologic Petri dishes)中 4 至6 天，該細胞數增加 並在懸浮液中形成球狀體（胚胎體）。將胚胎體轉移至3塗 佈0 . 1 %明膠（g e 1 a t i η )的室載玻片 '

1057-5323-PF(Nl).ptd 第18頁 1316962 五、發明說明（16) (chamber-sl ides)。經過一星期的培養，有許多叢集 (c 1 u s t e r s )自球狀體產生。而在超過1 2小時的時間y'中， 每一叢集都呈現每一循環5-7秒之規律的收縮與舒張，而 此機械的活動與從幹細胞發育而來的似腸道器官 (gut-like organ)(原生腸道）類似（參考Yamada 丁 al’，Stem Cells， 20:41-49， 2002.)。相對地，當間 幹細胞在同樣的狀態下被誘發’並不會發育成胚胎茱 【其他實施方式】 所有在本專利說明書中所揭露的特色可以任何方 合，每一個在此專利說明書中所揭露的特色可以另—，， 供相同、相等或相似目的之特色所取代。因此， =提 Ϊ:例否則每-個揭露的特色只是-般相等或相似特2 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然1 限=本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本；明：以 和犯圍内，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明；月砷 範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。x 保護

1057-5323-PF(Nl).ptd 第19頁 1316962 圖式簡單說明 第20頁 1057-5323-PF(Nl).ptd

Claims (1)

1. I316pT^l 六、申—-一

   修正 1. 一種產生多功能動物細胞的方法，該方法包含： 自動物之組織分離出間葉幹細胞； 在叙餓狀態下培養此分離的細胞；以及 在培養的細胞當中鑑定和集結多功能細胞； 其中’當該多功能細胞引入嚴重聯合免疫缺陷症（s c〗D)小 鼠’該細胞會發育成畸胎瘤； 該多功能細胞為階段特異性胚胎抗原_丨陰性；以及 該培養步驟為：將細胞置放在含有〇 . 5 %到2 %血清的培養基 中5至10天’或置放在含有1〇%到20%血清的培養基中7至21 天而不更換培養基。 2. 如申請專利範圍第1項所述之產生多功能動物細胞 的方法’其中該動物為一哺乳動物。 3 ·如申請專利範圍第2項所述之產生多功能動物細胞 的方法’其中該哺乳動物為人類。 4·如申請專利範圍第2項所述之產生多功能動物細胞 的方法，其中該組織為臍帶血、骨髓、羊水、脂肪組織、 胎盤或週邊血液。 5.如申請專利範圍第1項所述之產生多功能動物細胞 的方法’其中培養步驟為：將細胞置放在含有0.5%血清的 培養基中5至7天’或置放在含有2〇%血清的培養基中兩星 期而不更換培養基。 6 ·如申請專利範圍第4項所述之產生多功能動物細胞 的方法，其中培養步驟為：將細胞置放在含有〇5%血清的 培養基中5至7天，或置放在含有2〇%血清的培養基中兩星

   1199-5323X1-PF4(Nl).ptc 第21頁 1316962 案號 91133962 曰 修正 六、申請專利範圍 期而不更換培養基 11111 第22頁 1199-5323Xl-PF4(Nl).ptc