KR100879079B1 - 다능성 체세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 정상적 핵형을 가지는 배양된 동물 체세포로서, 시험관내에서 유도되면 배아체로 발생하고 또는 SCID 마우스에 도입되면 기형종으로 발생하는 세포를 제시한다. 또한 그러한 세포의 제조 방법을 제시한다.

체세포, 다능성, ES 세포, 핵형, 기형종, 배아체, 배아 항원-1 네거티브, SCID 마우스

Description

다능성 체세포 {SOMATIC PLURIPOTENT CELLS}

본 출원은 미국특허 가출원 번호 제60/398,883호를 우선권으로 주장하여 2002년 7월 26일에 출원되었으며, 상기 가출원 명세서는 본 명세서에 참고 문헌으로 병합된다.

다능 배아 줄기(ES) 세포는 초기 포유류 배아로부터 유래된다. 이들 세포는 생체내에서 모든 세포계로 분화될 수 있으며, 시험관내에서 유발되면 대부분의 세포형으로 분화될 수 있다. 이들 세포의 다능성으로 인해 ES 세포는 퇴행성 질환 또는 유전적 질환의 치료에 있어서 큰 유망성을 가지는 것으로 믿어진다. 이제까지 윤리적 고려로 인해 인간의 ES 세포를 연구 및 치료에 이용하는 것이 곤란하였다. 무배아 기원의 다능 세포(예를 들면 체세포)가 이러한 장애를 피해가게 할 것이다.

일부의 체세포가 무혈통 조직형(unrelated tissue type) 세포로 발생할 수 있다고 보고된 바 있다. 그러나, 그들 세포의 발생 잠재력은 제한되어 있다. 따라서 비제한적 발생 잠재력을 가진 체세포에 대한 요구가 있다.

한 측면에서, 본 발명은 정상적 핵형(karyotype)을 가지며 시험관내에서 유발되었을 때 배아체(embryoid body), 즉 기관의 특징을 갖는 구조로 더욱 발생할 수 있는 세포체로 발생할 수 있는 동물의 배양된 체세포를 특징으로 한다. 그러한 구조의 예로는 규칙적인 수축과 이완을 나타내는 원장(primordial gut)이 포함된다. 배양된 세포는 비배아(non-embryonic) 기원 또는 비배선(non-germ-line) 기원인 것이기 때문에 체세포인 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 정상적 핵형을 가지며, 중증의 복합 면역결핍(severely combined immunodeficient; SCID) 마우스에 도입하였을 때 기형종(teratoma)으로 발생하는 동물의 배양된 체세포를 특징으로 한다. 기형종은 세 가지 배아층, 즉 외배엽, 중배엽 및 내배엽 모두로부터 유도되는 조직을 함유한다. 상기 조직의 예로는 각막 렌즈 및 발생하는 표피(외배엽), 연골 및 횡문근(중배엽), 그리고 간 및 위장관(내배엽)이 포함된다. 일 실시예에서, 배양된 체세포는 시험관내에서 유도되면 배아체로 발생할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 배양된 세포는 단계 특이적 배아 항원-1(state-specific embryonic antigen-1; SSEA-1)를 발현하지 않는, 즉 SSEA-1 네거티브이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 앞에 기재된 바와 같은 동물의 다능 세포를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (1) 동물의 조직으로부터 체세포를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 세포를 기아 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (3) 상기 배양된 세포 중 다능 세포를 동정하고 농후배양하는 단계를 포함한다. 농후배 양된 다능 세포는 SCID 마우스에 도입되면 기형종으로 발생한다. 체세포는 인간을 포함하는 포유류로부터 분리될 수 있다. 이 방법에서 사용하기 위한 체세포를 분리하는 데에는 임의의 적합한 조직을 이용할 수 있다. 그러한 조직의 예로는 제대혈(umbilical cord blood), 골수, 양막액(amniotic fluid), 지방 조직, 태반, 및 말초혈이 포함된다.

다능 세포를 제조하기 위해서 분리된 세포를 세포의 성장에 불리한 기아 조건(starving condition) 하에서, 예를 들면 0.5% 내지 2%의 혈청을 함유하는 기아 배지 중에 5 내지 10일간, 또는 10% 내지 20%의 혈청을 함유하는 통상의 배지 중에 7 내지 21일 간, 배지를 바꾸지 않 배양한다. 통상의 배지는 영양물 및 세포 증식을 촉진하는 인자를 함유한다. 기아 배지는 영양물 및 세포 증식을 위한 인자가 낮다. 영양물에는 혈청과 혈청 대체물이 포함되고, 상기 인자에는 인슐린, 표피 성장 인자(epidermal growth factor; EGF), 산성 섬유아세포 성장 인자(acidic fibroblast growth factor; aFGF), 및 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 포함된다. 기아 조건에서 배양된 세포 중에서 다능 세포는 예를 들면 형태학 및 세포 표면 표지(marker)(예를 들면, SSEA-1 네거티브)에 의거하여 동정되고 농후배양될 수 있다.

본 발명의 다능 체세포가 기아 조건 하에서 제조될 수 있다는 것은 예상 밖의 일이었다. 본 발명의 다른 특징이나 이점은 이하의 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명백할 것이다.

[상세한 설명]

본 발명은 배양된 동물 체세포에 관한 것이다. 이들 세포는 시험관내에서 유도되면 배아체로 발생되고, 또는 SCID 마우스에 도입되면 기형종으로 발생되기 때문에 다능성이다. 이들 세포는 정상 세포의 염색체 특징을 모두 가지며, 인지할만한 변화를 갖지 않는다. 다시 말하면 이들 세포는 정상적 핵형(karyotype)을 가진다.

상기 세포는 미분화 ES 세포에 특징적인 표현형(phenotype)을 가진다. 일 실시예에서, 상기 세포는 배양에서 납작한 회전 타원체(spheroid) 콜로니를 자발적으로 형성한다. 미분화 ES 세포의 배양에서 유사한 콜로니가 발견되었다. 참고 자료 예로는 Thomson J. 외의 Science, 282:1145-1147, 1998이 있다. 상기 세포는 미분화 ES 세포의 특징인 항원 특성을 나타낼 수 있는 바, 예를 들면 특이적 단계 배아 항원-1(SSEA-1)을 발현하지 않고 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, 및 Oct-4를 발현할 수 있다. Oct는 다능 세포의 발생에 매우 중요한 전사인자의 한 부류이다. 포유류 배선 세포 및 줄기 세포에서 특이적으로 발현하는 Oct-4는 상기 세포의 다능성을 유지하는 데 필수적이다(참고예: Nichols J. 외, Cell, 95:379-391, 1998).

상기 세포는 또한 높은 수준의 텔로머라아제(telomerase) 활성을 가진다. 텔로머라아제는 세포 복제 도중에 염색체의 말단에 텔로미어(telomere) 반복물을 부가함으로써 텔로미어 및 염색체의 길이를 유지하는 리보핵산단백질이다. 텔로머라아제의 고수준 발현은 배선 세포, ES 세포, 및 배아 조직에서는 발견되었지만 체세포에서는 발견되지 않았다. 그 결과, 텔로미어(및 염색체)는 각각의 세포 분열 후, 체세포 내에서 길이가 짧아진다. 최종적으로 유한한 수명 기간 후, 체세포는 염색체 DNA의 상실로 인해 노화기(senescence)에 들어간다. 체세포애서 복구된 텔로머라아제 발현이 그들의 수명 기간을 연장하므로, 본 발명의 세포에서 고수준의 텔로머라아제 활성은 상기 세포의 수명이 ES 세포의 수명과 같음을 시사한다.

본 발명의 다능 세포는 동물의 조직으로부터 체세포를 분리하고, 상기 분리된 세포를 기아 조건 하에서 배양하고, 상기 배양된 세포 중 다능 세포를 동정하고 농후배양함으로써 제조될 수 있다. 다능 세포는 하기 실시예 2에 기재된 방법 또는 그와 유사한 공지의 방법을 이용하여, 예를 들면, 제대혈, 골수, 양막액, 지방 조직, 태반, 또는 말초 혈구로부터 분리되는 간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)로부터 제조될 수 있다. 참고 자료로는, Erices A. 외, British J. Haematol., 109:235-242, 2000, Pittenger M. 외, Science, 284:13-147, 1999, Safford K. 외, Biochem, Biophy. Research Comm., 294:371-379, 2002, 및 Erickson G. 외, Biochem. Biophy. Research Comm., 290:763-769, 2002 등이 있다. 간엽 줄기 세포는 10-20% ES-스크린된 소태아 혈청(FBS) 및 bFGF를 함유하는 알파 변형 MEM 중에 유지되거나 앞에 기재된 기아 조건 하에서 배양될 수 있다. 기아 조건 하에서 간엽 줄기 세포를 다능 세포로 변환하는 데에는 세포 융합과 핵 전달 어느 것도 필요하지 않다. 기아 조건에서의 공정 후, 다능 체세포는 그 형태(예; 세포 크기 및 형상), 효소 활성도(예; 알칼리성 포스파타아제 및 텔로머라아제), 및 표면 표지(예; SSEA-1 네거티브, SSEA-3 포지티브, 및 SSEA-4 포지티브)에 따라 동정될 수 있다. 동정된 세포는 공지된 세포 분리 기술 중 임의의 적합한 기술을 이용하여 농후배양될 수 있다. 예를 들면, 세포는 콜로니를 형성하는 경향이 있으므로, 현미경 하에 마이크로피펫을 이용하여 콜로니를 직접 채취할 수 있다. 많은 양의 세포를 보다 신속하게 농후배양하려면 형광활성 세포분류(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 기술을 이용할 수 있다. 예를 들면, 상이한 형광 라벨로 연결된 안티-SSEA-3 단일클론 항체, 안티-SSEA-4 단일클론 항체, 및 안티-SSEA-1 단일클론 항체를 SSEA-3 포지티브, SSEA-4 포지티브, 및 SSEA-1 네거티브인 세포를 농후배양하는 데 이용한다. 이들 세포를 다능성에 대해 추가로 시험할 수 있다.

세포의 다능성 테스트는 임의의 적합한 방법을 이용하여 행해질 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예 5에 기재된 바와 같이 생체내 기형종 형성 분석을 이용한다. 기형종은 세가지 배아층 모두의 유도체를 함유하기 때문에 하나의 세포가 기형종을 형성하는 능력이 있다는 것은 그 세포가 다능성임을 나타내는 것이다. 이와는 달리, 하기 실시예 6에 기재된 바와 같이 시험관내 배아체 형성 분석을 이용할 수 있다. 배아체를 형성한다는 것은 그 세포가 다능성임을 나타내는 것이다.

본 발명의 세포는 다양한 방식으로 이용될 수 있다. 인간 배아 조작에 대한 윤리적 고려를 피하면서, 퇴행성 질환 또는 유전적 질환을 치료하는 데 상기 세포를 이용할 수 있다. 그러기 위해서는 예를 들면 조직 또는 기관의 적절한 발생에 필수적인 기능성 유전자가 부족한 환자로부터 간엽 줄기 세포를 분리할 수 있다. 다능 세포를 제조한 후, 그 세포 속으로 유전자의 기능적 버전을 코딩하는 발현 핵산 벡터를 도입할 수 있다. 벡터는 인산칼슘 공침법, DEAE-덱스트란 매개 트랜스 팩션, 리포팩션(lipofection), 일렉트로포레이션(electroporation), 마이크로인젝션, 또는 바이러스 매개 기술을 포함하는 다양한 기술을 통해 세포 내에 도입될 수 있다. 세포의 다능성에 영향을 주지 않는 방법이 바람직하다. 그러한 기술에 대한 기재는, 예를 들면, 미국특허 제5,591,625호 및 미국출원 제20020127715호에서 찾을 수 있다. 기능성 유전자를 세포 내에 전달한 후, 공지의 방법을 이용하여 그 세포를 환자에게 다시 이식할 수 있다. 세포가 환자로부터 제조되기 때문에 상기 치료는 면역 거부를 일으키지 않는다. 적합한 조건 하에서, 이식된 세포는 기능성 조직 또는 기관 내부로 발생할 수 있다. 이 발생을 촉진하기 위해 환자에게 세포 발생을 유도하는 인자를 투여할 수 있다. 그러한 인자는 소분자 화합물, 펩타이드 및 핵산일 수 있다. 예를 들면 변형 성장인자 β, 골 형태형성 단백질, 및 신경 성장인자가 포함되며, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 세포는 또한 배아의 발생/분화 기작을 연구하는 데 유용하다. 모델 시스템으로서 그러한 세포를 이용하여 다능 세포의 발생을 유도하여 특정 조직이나 기관으로 만들기 위한 조건을 확인할 수 있다. 또한, 예를 들면 Shen M. 외, Development, 124:429-42,1997에 기재된 바와 같이 차별적 cDNA 스크리닝을 이용하여 배아 발생 기간중 역할을 하는 유전자를 분리할 수 있다. 예를 들면 전술한 배아체로 발생하도록 유도된 다능 세포로부터 cDNA 라이브러리(library)를 제조할 수 있다. 상기 라이브러리는 2세트의 복제 필터(replica filter) 상에 평판배양된다. 그 중 한 세트의 필터(세트 A)는 유도되지 않은 세포로부터 얻어진 cDNA로 스크리닝되고, 다른 세트의 필터(세트 B)는 유도된 세포로부터 얻어진 cDNA의 비교량으로 스크리닝된다. 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용되는 cDNA는 공지된 방법을 이용하여 표지되고 가시화될 수 있다. 다음에, 라이브러리로부터 세트 A보다 세트 B에서 더 강한 혼성 신호를 나타내는 cDNA 클론을 선택할 수 있다. 이들 cDNA 클론은 유도된 세포에서 과잉 발현되는 유전자를 코딩한다. 반대로, 유도되지 않은 다능 세포에서 과잉 발현되는 유전자가 분리될 수 있다. 마찬가지로, 전술한 기아 공정 전후에 세포에서 과잉 발현된 유전자도 분리할 수 있다. 이러한 분리된 모든 유전자는 각 공정에서의 그들의 역할을 정의하기 위해 더욱 연구될 수 있다.

인간 이외의 동물로부터 제조된 다능 세포는 예를 들면 Campbell K. 외, Nature, 380:64-66, 1996에 기재된 방법을 이용하여 동물의 기관 또는 클론으로 발생시키는 데 이용될 수 있다. 따라서, 이들 세포는 애완 동물 및 가축 산업용으로 유용하며, 멸종 위기의 동물을 보존하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 여러 가지 실시예를 설명하였다. 그러나 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형을 행할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서 다른 실시예도 후속하는 청구의 범위에 포함된다.

이하의 실시예는 단지 예시적이며, 어떤 방식으로도 본 발명의 나머지 부분을 제한하는 것이 아닌 것으로 해석되어야 한다. 추가의 수고를 들이지 않고도 당업자는 본 명세서에 기초하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있다고 믿어진다. 본 명세서에 인용된 모든 문헌은 그 전체가 참고 자료로 수록된다.

실시예 1

세포 표지를 시험하기 위해 면역세포화학 염색을 실시하였다.

세포면 표지를 염색하기 위해 4% 파라포름알데히드로를 사용하여 세포를 20℃에서 10분간 고정하였다. 세포골격 단백질의 염색을 위해 메탄올을 사용하여 -20℃에서 2분간 고정하고, 0.1% 트리톤 X-100을 이용하여 10분간 삼투화(permeabilize)하였다. 다른 세포내 분자를 염색하기 위해, 세포를 4% 파라포름알데히드로 20℃에서 10분간 고정하고, 0.1% 트리톤 X-100으로 10분간 삼투화하였다.

고정된 세포를 인산염 완충 식염수(PBS), 1% 소혈청 알부민(BSA), 및 1차 항체를 생육한 종과 동일한 종으로부터 채취한 1% 혈청(미국 미주리주 세인트루이스 소재 Sigma사)을 함유하는 블록킹 용액 중에서 30분간 배양하였다. 이어서, 상기 블록킹 용액 중에 적당히 희석한 1차 항체, 바이오티닐화된(biotinylated) 안티-마우스 2차 항체, 및 스트레파비딘-공액화(strepavidin-conjugated) 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase)를 사용하여 순차적으로 60분간씩 세포를 배양하였다. 각 단계 사이에 0.3% BAS 함유 PBS로 10분간 세포를 세척하였다. 디아미노벤지딘 크로마겐(미국 캘리포니아주 소재 Vector Laboratories Inc.)을 사용하여 배양함으로써 겨자무 과산화효소 활성을 가시화했다. 가시화 후, 현미경으로 세포를 검사하고 사진을 촬영했다.

실시예 2

골수 및 제대혈로부터 간엽 줄기 세포를 분리했다.

사람의 골수는 BioWhittaker, Inc.(미국 매릴랜드주 워커스빌 소재)로부터 구입했다. 제대혈은 명시적 동의 하에 대상으로부터 입수하였다. 간엽 줄기 세포 를 분리하기 위해, 예를 들면, Erices A.외, British J. Haematol., 109:235-242, 2000 또는 Pittenger M. 외, Science, 284:143-147, 1999 등의 문헌에 기재된 Ficol-paque(d=1.077 g/ml, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재 Amersham Biosciences사) 밀도 경사법을 이용하여 단핵 세포를 사람의 골수 또는 제대혈로부터 제조하였다.

분리된 단핵 세포는 20% ES 세포 분류 FBS(미국 유타주 로간 소재 Hyclone사), 4 ng/ml b-FGF, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(미국 캘리포니아 칼스바드 소재 Invitrogen사)과 함께 통상의 배지인 알파 변형 최소 필수 배지(MEM)가 포함된 조직 배양 접시에서 1×10⁶ 세포/㎠의 농도로 접종(seeding)하였다. 배양하여 2주 후, 배양 접시에 많은 세포가 부착하였다. 이들 형태학적으로 균질한 세포는 32-36시간의 배증 주기로 자가재생하였다.

앞에서 기재한 바와 같이 면역세포화학 염색을 이용하여 상기 부착성 세포를 더욱 특성화하였다. CD34 또는 CD45(조혈 세포계의 세포면 항원)에 대한 항체는 Bacton Dickinson사(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)로부터 구입하였다. 염색 결과는 상기 세포가 CD34 및 CD45에 대해 네거티브임을 나타냈으며, 이는 상기 세포가 조혈 세포계에 속하지 않음을 의미한다. 또한, 상기 세포는 예를 들면, Pittenger M. 외, Science, 284:13-147, 1999와 같은 문헌에 기재된 방법에 따라 적절한 배지를 이용하여 골세포, 연골세포, 및 지방세포로 분화하도록 유도할 수 있었다. 분화된 골세포는 von Kossa 염색법을 이용하여 분석하였다. 분화된 연골 세포는 Safranin O에 의해 염색하였다. 지방세포는 Oil Red O에 의해 염색하였다. 상기 방법들은 예를 들면 Colter D. 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:7841-7845,2001에서 찾을 수 있다. 이들 결과는 분리된 세포가 간엽 줄기 세포임을 나타낸다(Prockop D. 외, Nature, 276:71-74, 1997). 그러나, 이들 세포는 SCID 마우스에 도입되었을 때 기형종으로 발생할 수 없거나 유도되었을 때 배아체로 발생할 수 없었기 때문에, 이들 세포의 발생 잠재성은 제한되어 있다. 하기 실시예 5 및 6을 참조할 것이다.

실시예 3

전술한 분리된 간엽 줄기 세포를 기아 조건 하에서 배양하여 다능 세포를 생성시켰다.

상기 간엽 줄기 세포는 실시예 2에 기재된 통상의 배지 중에서 3 내지 5회 패스로 배양되었다. 이어서 세포를 b-FGF(기아 배지)가 없는 0.5% FBS 함유 알파 변형 MEM 내에 5-7일간 유지하였다. 대안으로서, 세포를 통상의 배지 중에 배지를 변경하지 않고 2주일간 유지하였다. 상기 기아 공정 동안 매일 현미경으로 모니터하였으나 세포 융합은 발견되지 않았다. 기아 공정의 말기에 둥글고 납작한 콜로니들이 배지에 나타났다. 마이크로피펫을 이용하여 각각의 콜로니를 채집하고, 20% ES 스크린된 FBS, 4 mg/ml bFGF 및 0.1 mM 2-머캅토에탄올과 함께 이스코브 변성 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco's medium; IMDM) 중에, 예를 들면 미토마이신 처리 마우스 STO 세포(ATCC CRL-1503) 또는 마우스 배아 섬유아세포와 같은 마우스 공급 세포 상에 미분화 상태로 유지했다. 각 콜로니로부터의 세포는 미 분화 상태로 유지되고 4개월 이상(또는 15 계대 이상) 동안 증식을 계속할 수 있었다.

실시예 4

콜로니로부터의 세포에 대한 형태학, 세포 표지 발현, 효소 활성, 및 핵형을 검사했다.

세포는 광 현미경 또는 주사 전자현미경으로 검사되었다. 주사 전자현미경 검사를 위해, 2% 오스뮴 테트라옥사이드(w/v), 0.1M 인산염 완충액 pH 7.4 중에 4℃에서 16시간 동안 고정하고 등급화 에탄올 시리즈를 통해 탈수한 Melinex 막(미국 버지니아주 호프웰 소지 DuPont사) 상에 배양하였다. 액화 이산화탄소를 이용하여 임계점 건조하고 크롬으로 스퍼터 코팅을 행한 후, 2kV에서 조작되는 주사 전자현미경(SEM) Leo 982(독일, LEO Elektronenmikroskopie GmbH)의 전계 방출 하에 세포를 검사했다. 참고 자료: Bozzola J. 외, 1992. 주사 전자현미경용 표본 제조: Electron Microscopy: principles and Techniques for Biologists, pp. 40-62. Jones and Bartlett Publishers, Boston. 현미경 사진에 나타난 바와 같이, 상기 세포의 형태는 Thomson J. 외, Science, 282:1145-1147, 1998에 기재된 바와 같이 미분화 ES 세포의 형태와 유사했다.

또한 전술한 면역조직화학 염색(immunocytochemistry staining)을 이용하여 세포를 특징지었다. SSEA-1(MC-480, 1:50), SSEA-3(MC-631, 1:50), 및 SSEA-4(MC-813-70, 1:50)에 대한 항체를 Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa(이국 아이오와주 아이오와시 소재)로부터 입수하였다. 안티-TRA-1-60 및 안티-TRA-1-81 항체를 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(미국 캘리포니아 산타 크루즈 소재)로부터 입수하였다. 그 결과 상기 세포가 SSEA-1에 대해서는 네거티브이고 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81에 대해서는 포지티브인 것으로 나타났다. 전사인자 Oct-4의 발현도 Reubinoff B. 외, Nature Biotechnol., 18:399-404, 2000에 기재된 바와 같이 역전사 PCR(reverse transcription-PCR)에 의해 검출되었다.

Sigma 86-R 키트를 이용하여 제조사(미국 미주리주 세인트루이스 소재, Sigma사)의 지침에 따라 상기 세포의 알칼리성 포스파타아제 활성을 검출하였다. 세포는 높은 수준의 알칼리 포스파타아제 활성을 나타냈다. 또한, Kim N. 외, Science, 266:2011-2015, 1994에 기재된 TRAPeze ELSIA 텔로머라아제 검출법을 이용하여 상기 세포의 텔로머라아제 활성을 검사하였다. 그 결과 세포에서 높은 수준의 텔로머라아제 활성이 나타났다.

예를 들면, ISCN 1995: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature(F. Mitelman, ed.) Karger, Basel(1995)에 기재된 방법을 이용하여 세포의 핵형을 측정하였다. 요약하면, 세포를 수확하기 12시간 전에 1:4로 희석하여 서브 배양하였다. 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 수집하고 콜세미드(colcemid)와 함께 1.5시간 배양하고, 이어서 저장성 KCl로 용균하고 산/알콜 중에 고정하였다. 예를 들면 Freshney, R에 의한 "Culture of animal cells-A manual of basic technique" 3rd ed. A John Wiley & Sons, Inc. New York(1994), pp 205-209에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 중기(metaphase)를 분석하였다. 그 결과 상기 세포는 모두 46개의 인간 염색체를 가지고 있는 것으로 나타났다. 염색체는 정상적 인간 염색체와 비교하여 인지될 수 있는 변화가 없었다.

실시예 5

실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 세포의 다능성을 시험하기 위해 기형종 형성 어세이를 행했다.

SCID 마우스의 뒷다리 근육조직 내에 약 1×10⁵개의 세포를 이식했다. 주입 후 6-8주에 기형종이 관찰되었다. 기형종을 수확하고, Thomson J. 외, Science, 282:1145-1147, 1998에 기재된 방법을 이용하여 조직학적 검사를 행했다. 검사된 모든 종양은 3개의 배아층 모두로부터 유도된 조직을 함유하였다: 즉, 발생하는 위장관(내배엽); 연골, 골 및 횡문 근육(중배엽); 및 각막 렌즈, 갈라진 케라틴, 발생하는 표피(외배엽). 대조로서 실시예 2에 기재된 간엽 줄기 세포는 SCID 마우스에서 기형종으로 발생하지 않았다.

실시예 6

실시예 3에서 제조된 세포의 다능성을 시험하기 위해 배아체 형성 어세이를 실행했다.

코팅되지 않은 세균학적 페트리 디쉬에서 4-6일간 세포를 배양했다. 세포를 증식하고 현탁액 중에서 회전 타원체(배아체)를 형성했다. 배아체를 옮기고 0.1% 젤라틴으로 코팅된 쳄버 슬라이드 상에 접종했다. 배지에서 1주일 경과후, 회전 타원체의 성장체로부터 다수의 클러스터가 발생되었다. 클러스터 각각은 사이클당 5-7초의 주기로 12시간 이상 동안 규칙적인 수축 및 이완을 나타냈다. 이 기계적 활성은 Yamada T. 외, Stem Cells, 20:41-49, 2002에 기재된 ES 세포로부터 발생된 장형 기관(원장)의 활성과 유사하였다. 이와 대조적으로, 간엽 줄기 세포는 동일한 조건 하에 유도되었을 때 배아체로 발생되지 못하였다.

기타 실시예

본 명세서에 기재된 모든 특징은 임의의 조합으로 결합될 수 있다. 본 명세서에 기재된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 달성하는 다른 특징으로 대체될 수 있다. 그러므로 달리 언급되지 않는 한, 여기에 기재된 각각의 특징은 일련의 동등하거나 유사한 특징의 예일 뿐이다.

상기 실시예로부터 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 본 발명을 다양한 용도와 조건에 알맞도록 다양한 변화와 변형을 행할 수 있다. 따라서 다른 실시예도 다음의 청구의 범위에 포함된다.

본 발명에 따라 발생 잠재력이 제한되지 않은 다능 체세포를 얻을 수 있다.

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9. 다능 동물 세포(pluripotent animal cell)의 제조 방법으로서,

   동물에서 분리된 제대혈, 골수, 양막액, 지방 조직, 태반 및 말초혈로 구성되는 군으로부터 선택되는 조직으로부터 체세포를 분리하는 단계;

   상기 분리된 체세포를, 0.5% 내지 2%의 혈청을 함유하는 배지 중에 5일 내지 10일간, 또는 10% 내지 20%의 혈청을 함유하는 배지 중에 7일 내지 21일간, 배지를 변경하지 않고 넣어 둠으로써 수행되는 조건 하에서 배양하는 단계; 및

   상기 배양된 세포 중 다능 세포를 동정하고 농후 배양하는 단계

   를 포함하는,

   SCID 마우스에 도입되면 기형종으로 발생하는 다능 동물 세포(pluripotent animal cell)의 제조 방법.
10. 제9항에 있어서,

    상기 다능 동물 세포가 단계 특이적 배아 항원-1 네거티브인 다능 동물 세포의 제조 방법.
11. 제9항에 있어서,

    상기 동물이 포유류인 다능 동물 세포의 제조 방법.
12. 제11항에 있어서,

    상기 포유류가 인간인 다능 동물 세포의 제조 방법.
13. 제12항에 있어서,

    상기 다능 동물 세포가 단계 특이적 배아 항원-1 네거티브인 다능 동물 세포의 제조 방법.
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19. 제9항에 있어서,

    상기 배양 단계가, 상기 분리된 체세포를 0.5%의 혈청을 함유하는 배지 중에 5일 내지 7일간, 또는 20%의 혈청을 함유하는 배지 중에 2주일간, 배지를 변경하지 않고 넣어 둠으로써 수행되는 조건 하에서 배양하는 것인 다능 동물 세포의 제조 방법.
20. 제19항에 있어서,

    상기 다능 동물 세포가 단계 특이적 배아 항원-1 네거티브인 다능 동물 세포의 제조 방법.
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