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Ab B6 —^04^1 五、發明說明（1 ) 1，本發明之範囷。本發明有關酵素之分析以及其中所 使用的物質，而且尤其有關於分析之一種方法及物質， 在此分析中，可偵測的信號之增强係藉著指示劑反應之 酵素催化之調節作用來達成。

2本發明之背景。雖然酵素科學幾乎有一百年歷史， 而且酵素在許多生化反應中所扮演的重要角色於40年前 就被I解，但是酵素學應用於臨床㈣却是最近的事。 就在最近20年前，這些應用大約只占了在臨床實驗室中 所進行之測試總數之3…，而且只 經例行性分析。 I 相反地，現今酵素分析占了大型醫院實驗室中全部工 作的Μ ’而且多至20 - 25種酵素可經例行性分析。這 些例行性分析之詳細 何標準麥考書中=有關臨床或”化學之饪 之二St析…液，例如血清，尿液及，脊教液中 在某些分析中，^〜 ^或疋超^常範固。 結果而 ㈣料濃度是細菌或病毒戚梁的 Π有Γ特殊酵素之分析對於特球病原而言，在珍斷 存在於^ *測知—酵素不正常地 存在於菝液，例如血清 表示Μ可做為組織或器官损傷之 如，酒精去氫酵素其是肝職專— 鱗酸魅K的以及駿性 辨锻啤其疋前列腺專一性的 表示在這些蕊官中之组計 號中發現，則各別 •織知傷。鹼性磷騣酶活性之測量 甲 4(210X297«爱） 78. 8. 3,000 ...................................................琴 f請先閑讀背面之注意事项再填窝本頁} .訂. •線…： 在殄靳行膽系異常及骨骼異常方两有其重要性。 測分析係根據基質.變成產物之酵素催化，其可經 所有或二量。假如在酵素反應中，基質濃度逐漸增加， 加而因子保持不變，則反應速率隨著基^濃廣的增 度將：加，直至達到最大值。任何進-步地增加基質滾 1左、法激起反應速率再增加。因此，當基質以充分過 在時，反懕速率只依酵素濃度而定。 ，：為酵素是真正的催化劑，而且在反應當中不被改變 .所以在充分的基質存在下，酵素反應的速率是恒定的 如2在分析系統中，反應速率只因酵素濃度而定。假 热•的酵素以低濃度存在’反應速率將是朴常低 ’而且可能需要—段長時間來形成足夠的▲物以備測 訂 g尿液11 —測知的速度是基本要素的例子中，如決定血 、中病原存在的例子中，這是—個嚴重的缺點。 在酵素分析中，另一個限制是在臨床樣品中，經常存 著干擾酵素活性而降低分析敏威性的物質。這些物質 線 :般歸因於干擾，在血清及尿液樣品之酵素分析中是朴 常麻煩的β 在免疫分析中，分析的敏或性已經藉著各種擴增步驟 經濟部中央標準局印製 提高。在階段式擴增作用中，可測知的（ 色的）分子之數目接其土 疋有顏 …使用兩種或更多的酵素或酵素衍 買。專利權屬於哈里斯（Harri s )的美國 利案號4,463,090揭示了 —種階段式擴增作用之免疫分 甲 4(210x297 公沒） 3,0〇〇 4

五、發明說明（3) 析’其中大分子催化劑，例如踌素或是和配體偶合的原 酵素’活化第二酵素，此第二酵素與基質反應以生成可 測知的信號，或者依次活化第三酵素。 專利權屬於謝爾夫（Self )的美國專利案號 4,446,231揭示了 —種循環擴增作用的酵素免疫分折， 其包括第—及第二酵素系統以及第二酵素系统調節劑。 第一酵素系統包括一種和—配體偶合的第—酵素。在謝 街夫之發明的第一個實例中，第一酵素系统作用在調節 劑前趨物以释故出調節劑，此調節剩是第二酵素的—個 輔助因子’其活化第二酵素系统以催化使基質變成可測 知的產物之反應。在此反應期間，調節劑經轉化成不活 化形式，而且循環是由再活化該調節劑之第三酵素來完 成。在第二個實例中，調節劑是第二系統的—個抑制劑 ’而且藉著第-酵素系统移去，由是第二系统經活化以 作用在基質上，而且因此產生可測知的產物。 專利權屬於波古斯拉斯基（Boguslaski )等人的美國 專利案號4,492,751揭示循環系统，其宁酵素基赏或輔 酵素經接合至特殊速結的配錡之某一成員。 許多分子已經顯示出引起標的酵素之特珠的不活化作 用。一小組抑制剩，稱做機制基準的抑制劑，是酵素之 基質，其和酵素反應以形成一共價鍵。機制基準的抑制 劑巳由瓦史（祖Sh ),寫了評論（屈， 871(1982))。另一小組抑制劑包括其作用有如穗定的過 ...................................................^.................................^.................................^ (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 甲 4(210X297 公犮）

經濟部中央標準局印製 渡態（transition state )相似物之分子。焦伯（ elb )等人在生物化學24，1813 (198 5)中巳揭示某 些氟酮（fluor〇加七加郎）有如水解酵素之過渡態抑制 劑。 酵素分析在分析技街的目錄中是赛责的附加項目；然 而他們谷易受上述的限制所支配。本發明則專注在經改 良的酵素分析，其可解決這些問題。 發明概要 本發明的—個特點是—種在液菝中之酵素分析的方法 ，此酵素在下文中被解释成未知酵素。經懷疑含有此未 知酵素的液體和封阻調節劑及第二酵素合倂在—起。未 知酵素移去封阻基以提供調節劑给第二酵素。而後加入 :二酵素的基質。基質經第二酵素轉化成產物，此產物 =供可測知的信號。藉著第二酵素來使基赏變成產物的 :化受調節劑之調節。基質至直物的反應在下文中經解 释成指示劑反應。 本發明的較佳封阻調節劑是封阻抑制劑，其經由未知 酵素轉化成抑㈣’較佳的第二酵素是料（邮吻 )，較佳的基質是色原（chr_gen =—。最佳的是，色原是無Π : «醇轉化成有顏色的產物，色原轉化成為產*的轉 化作用受到抑制劑之抑制。 本發明之另—特點包括—物 質組套，其f行大體描述 .......................if31.................................t................................漆 (請先聞讀背面之注意事續再填窝本瓦) (

甲 4(210X297 么、没 78· 8· 3,〇〇〇

043*V

五、發明說明（5) 如上之本發明之方法。 在包括酵素抑制劑未封阻的任何分析系統中，嚴重的 拘束戚會降臨到抑制劑及經封阻的抑制劑兩者上，假如 此分析要達到最大敏或度。根據本發明，經封阻的抑制 劑是未知酵素之—種良好的基質，但它在本質上是不與 第-酵素反應的。同樣地，未封阻的抑制劑是第二酵素 之—種有力的抑制劑，但是本質上對未知酵素沒有影響 。因為經封阻的抑制劑及抑制劑和未知及第二酵素之 應，各別地是高度選揮性的，所以源於交叉反應而出 在先前的循環性酵素免疫.分析（EIA )之·,短路，，性 大體上被消除了。 因此’本發明提供了 —變通的方法，俾分析以低濃 存在於液禮中的雜音_。+、 、 本不法心间分析敏威度至胱倍- :以提供了許多優於傳統酵素分析之好處。以更低濃度 在的酵素可經決定。進行分析所需的時間大大地縮短 ，此允許-臨床實驗室在—给定的時間内進行更多的分 析0往往信號可由肉眼朴土& ”咖 ^ ^ ^ 』眼計讀，去除了對昂贵及麻烦的儀 =之需求。因此可賴著地節相銷及空間，使得根據 療宣中進行。 心床實驗至内，甚至發生的 囷式之簡單説明 附圖描述了根、 。 發月之方法及物質之典型分析結 反 現 質 度 診 果 ...................................................餐· (請先閃請背面之注意事項再填窝本页) •訂· .緣· 甲 4(21〇x 297 公沒） 78. 8. 3,000 ,043'Vi A6 B6 五、發明說明（6 ) 較佳f例之詳述 雖然本發明藉著許多不同形式的赏例來充货 祥細敍述本發明較佳實例，吾人要了解，本揭示將被命 為是本發明原理之模苑 、《^ 解及描述的實例。本發明之範圍將藉著附加的中圖 範團及其相當語句來界限。 口根據本發明之方法，經懷疑存在於液體宁之未知酵素 可藉著至少包括兩個擴增階段之分析方法來決定。在本 揭示中’街語《經冰金” - 段决尤表不酵素之測知，例如酵素之 存在與否，或表示液體中酵素濃度的計量❶ 第—個擴增階段是利用未知酵素對第二酵素調節劑之 去封阻作用。第二個擴增階段是利用第二酵素對指示劑 反應之催化作用。這些擴増步驟繼續地發生以提供丨⑻倍 或更高的信號擴增作用，因此存在於樣品中之酵索經； 可以用肉眼來測知。假如需要額外的放大作用，則要提 供額外的酵素以麥與—暗段式的連續反應，其中任—或 所有的反應可提供進—步的信號擴增作用。 本發明較佳之分析方法首先將麥考以下之分析流程表 來以#田述，以提供對分析組成及它們的相互作用之一 般性了解，而後各組成將予詳細討論。 B - Μ

EU/L Μ + Β

Sub Έ 2

04b'V 五、發明說明（7 ) (請先W請背面之注意事項存填寫本頁) 在:迷之流程表中，⑨用以下之定義，其中短線表示 一于鍵實心箭號表示_化學轉化，虚線箭號表示第 —酵素之調節，亦卽指示劑反應之調節。 L •經分析之液體 EU •未知酵素 E2 •第二酵素 Β·Μ -經封阻之調節劑 Μ 第二酵素之游離調節劑 Β -調節劑之封阻基

Sub -基質 p - i 物。 程表可看出’被懷疑含有未知酵素之液體，與經 封阻的調節劑及第二酵素入 、 任何未知酵素移去二起。存在於液孩中之 第二酵素之一基基，而且釋放出游離調節劑。 藉著第二酵素轉化削反應中，基質 輝京锝化成可測知的產物 性藉著游離調節劑來調節—酵素之催化活 之水平成正 物之水平是與游離調節劑 或反比，亦#卩與夫知 反比，各別依據調節削是、' 波度成正比或 量之真正信號可以是與抑制劑而定。經計 ，▲物顏色或是其形成之速：色，例如 失之速率。 或者疋基質顏色或其消 現在轉到分心成切 木知酵素可得自饪何 _ 甲4(21 Ox 297公邛 3. 〇0〇 -04^*

五、發明說明（8) 來源。例如，它可能存在於禮 體液》而且隨後轉至不同，的液 它例子中，未知酵素可能得自 一微生物培養物，或是其中之 ，未知酵素可能不是來自—活 成的酵素。 任何能夠從第二_素<經封 之酵素，可以藉著本發明之方 要通行的説法以範園最庚的可 酵素種類，假如可能的話，包 液中，或者它可能分離自 禮，例如缓衡液中。在其 植液以外之來源，例如， —細胞羊取物。另一方面 植，例如，它可能是—合 阻的調節劑移走一封阻基 法來決定。（我們在此需 能街語來描述可被分析的 括各種類之一或二個例子 請先閲請背面之注意事项再填I本頁) 裝· 較佳的未知酵素一相z .訂· 肢肽酶，晦梅，糖物是水解酵素’例如鱗酸酶， 決定之逋當：知=以及其它。可經由本發明之方法 i乳類特殊例子疋胰蛋白醉，凝血酶， -葡萄糖苷賤 膽驗知酶…半乳糖.酶’力 胺基胜肽酶。 ’磷酸酶，酸性磷酸酶以及白胺酸 •線· 經封阻的調節劑可 第二酵素調節剛之铷：、何能夠藉著未知酵素轉化成 經濟部中央標準局印製 ，卽調節劑以π 較佳的封阻調節劑有兩個成分 J Λ及封阻1 β 的抑制劑，立 跃佳的封阻調節劑是一經封阻 對第 TSjf- ^ ^ 由未知酵素移 —素是不反應的，.直到其封阻基經

，經封阻的且彳p制劑經释故至分析嫖體中。因此 q抑制劑之_ A 、成之選擇乃根據未知酵素及使用 甲4(210X 297公沒

78. 8. 3,000 .後齐苹 λ- 4ί1'.·ί:?τ~.-·ρ义 甲 4 (210X297 公犮） ^043'V ---- 五、發明說明（9 ) 的第—酵素。封阻基必須是能夠以一化学徤共償連接於 抑制劑者，此鍵可以藉著未知酵素充分選擇性地切除， 而且抑制劑組成必射p制第二酵素之活性，但是本質上 對未知酵素不具影響。封阻基從經封阻的抑制劑切除後 ，本質上必須對所有其它的分析成分不加干擾。因此， 第一酵素及其基質之性質將於進一步描述經封阻的抑制 劑及抑制剞之前加以討論。 在本發明之分析中，第二酵素一般而言是—水解酵素 ，其把基質轉化成產物。合適的水解酵素是，例如，磷 醆酶，胜肽酶如胰職酶，凝乳胰臟酶及胃蛋白酶，或者 較佳的疋睹酶如匕賊膽驗赌酶（AChE )及丁基膽驗暗 酶最佳的第—酵素是—幾基赌酶，例如免叶職驗酶（ RLE ) 〇 基質可以是饪何含有—基囷的物質，此基困在指示劑 反應中經由第二酵素切除以提供一產物，此產物藉著— 與顏色相關連的信號而成為可測知肖。因此，在本發明 之貢例中’經測知的信號是一顏色之出現或消失，或 者是從一種顏色改變成另—種顏色。在本發明之另〜實 例中，信號可以是基質轉化成產物之速半變化，例如， —基質之顏色經觀察可在一特定長度的時間係持不變。 因此，信號之計量可在動力穗態或熱力學狀況下進行， 動力計量決定變化的速率，此變化在一段期間發生，而 且—般而言是合倂分析試劑後，在不同時間藉著進行= 78· 8· 3,〇〇〇 ...................................................裝.................................訂.................................線 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁)

,043'V 、發明說明（丨〇 ) 系列的計量來完成決定速率變化。動力学計量決h ..................................................... (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 的程度，當指示劑反應的基贅及產物之間達成平衡S化 變化的程度犹決定了。計量可以利用儀器或是，較佳 ，利用肉眼來進行。 者 在利用第二酵素切斷基質以生成—有色產物之前，基 :較好是無色。合適的基質是吲嘌氧基賭以及，較佳的 是’硝基酚赌類，例如鄭位及對位硝基酚醋酸鹽或丁酸 鹽。這些基質是無色的，直至利用羧基赌酶切去 或丁败基β生成有色的对基酚。因此，當調節剩是一抑 ::以及基質是—确基_，被計量之信號 成之抑制。 •訂. 明顯的是，縈光測定法可利用在本發明之方法中。在 本發明之此實例中，第二酵爹可以h 質轉化成…生成光生成性基 之^“性產#丨中破計量之信號是聲光 之凋節。對本發明之此實例而言， 是抑制#1 Λί » g ^ 較好的疋，調節劑 π p削劑以及第二酵索是賭酶。 ，線. 如同以上所述，未知酵素從經私βΒ 基以提供第m 的抑制剩切去封阻 阻的料Γ ㈣。合心酵㈣_及經封 =酵素抑制劑以圖示如下之化學U來表示，其 是經封：：：質（描述於後）決定此化合物是抑制劑或 π經封租的抑制劑： 平4 (210x297公犮 78· 8· 3,〇〇〇 -12 -〇43lVi A6 B6 五、發明說明（11)

(CH2I -(ch2) ACFj (CM21 i acf2 - c - (CH2I 丨

(CH2I n - 在化學式I 17中，R, •可以是氩原子， 的低級烷基，分支的或未分支的，或者 6碳原子 /R2 -Ηζ—〇2 \r2 其中R2可以是1至6碳原子的低級烷基；Rs可以是氫 原子，硝基，烷氧基，齒素及其它；艮4可以是1至丨〇 碳原子之烷基，或是2至10碳原子之烯基或炔基，其利 用一芳香基隨意取代，或者是用一硝基，經基，競基， 烷氧基，鹵烷基，羥烷基，兢烷基取代之芳杳基；γ及 Z各別在可以是Η或F，其中Y及Z至少有一個是F ; X可以是〇，S或NR5 ，其宁Re可以是Η或R2 ; η可 以是1至6 ; m可以是2至6 ; Α可以是F或CF3 ;以 及B可以是Η，磷醆或其鹽類，糖基，胺基醆殘基，例 ...................................................裝.................................訂.................................線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 〒 4(210 >< 297公餞） 78. 8. 3,000 五、發明說明（12) 如離胺醆或魚精胺醆殘基，其經由胺基酸羧基共價結合 至X，2至4碳原子之醯基，，例如乙醒基或丁驢基，或 者是肢肽，其化學式：

NH 其中 R6 是(CH2I4NH2. |CH2I3NH - cf或是笨基 R,可以是11或1至6破原子之低級烷基，分支或未分 支；Re可以是H , i至4硖原子之低級烷基或低級羥 烷基，分支或个分支，或是CH2C〇〇H或（Cl ; h可以是1至*破原子之低級烷基或丧?：^£=^低級烷 氧基，分支或未分支，篆基或笨氡基；…是… 當B是Η時，化学式I至 Η以外之任何基團時，化学 抑制劑。當Β是磷酸或其鹽 汉代表酵素抑制劑。當Β是 夫1至汉代表經封阻的酵索 類時’意味著Β具有化學式 L〇4b'Vi A6 B6 五、發明說明（13) 其中Ρ祓鍵結至X，而旦η可以是如上所述者。 依據化学式I至汉之抑制劑及經封陴的抑制劑，可以 藉著熟練傳統化学反應的人所能恝像出之任何方式來合 成。合適的以及方便的方法描述於以下例子中。下列有 效的酵素抑制劑之目銶只當做模式。 名 稱 核磁共振数據 Ki值(ΜΤ 1 (醏酶） 1. 1, 1， 1，-三 氟 - 3 - ( (C0C13) - 3.9l(».2H). 5.21(ba.lHi. e.90(d.2HK 7.10(4.2K) 2.0 κ l〇~G. RLE 4 - 羥笨基 ) 丙 西同 2. 1， 1， 1 -三 氟 - 3 - ( (COC13)- 4.00(·*2Η). 4.80(b*.lH), > 10-4, PL£ 3 - 羥笨基 ) _ 2 - 丙西同 β.βΟ(»,3κ), 7.30(-,ΙΗ) 3. 1， 1， 1 -三 氟 _ 4 - ( (COC13)- 2.95(-.4Η), 4.90(bs.lH), 2.0 κ 10-8, RLE 4 羥笨基 ) - 2 - 丁酮 6.92(d<i.4H)J=4.60H^ 4. 1， 1， 1 -三 氟 4 - ( (COC13)- 2.94(t,2H>, 3.05(t,2H), 1.0 κ 10-7, RLF. 3 羥笨基 ) - 2 - 丁酮 5.70(6··ΙΗ). 6.βΟ(·.3Η), 7.15<«tH) 氟} 三基 -篆 1羥 1’ · 1，4 ui 5 2 戍西同 (COC13)-2.68(t.2H). 7.IO(d(2H) 1.9l(t.2H). 2.59(t.2H). 5.23(b.,!H)% 6.95(d.2H). 10-8. RLt TX 3 6· 1， 1 -三氟 羥笨基） 5 -2 - 戍西同 <C〇C13) - 1.95(p.2H), »70(t.2H). 2.95(t.2H), 5.^0(b«.lH>. 6.7〇(·.3Ι〇. 7.30<·.1Η> 10-7, 7. 1，1，1 -三 氟 -6 - ( (COCI3)- 2.70<q.2M). 4 -羥笨基 ) -2 - 己酮 7.02(d.2H> 8. 1 -笨基- 3, 3 -二 氟- (COCI3)-2.25(··2Κ)· 10 -羥基- 4 -癸酮 3.l5(b..|«), 5.55(ϋ·,|Ηί. 677(4.210 !.35(·,^Η)4 4UI. •/«

2.0 κ Ι0*Η. HU ...................................................裝.................................訂.................................線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 氟三酮-戍 II 1，2 II 9· 羥基 (COC13)-^.20(.,28) 2.1S(«,4K), 4.03<b*,lH). 10-4. 基經 I 6 I氟三嗣 "己 II 1，2 (C0C13)-2.2Q(m.AH) 10-7. 11. 1, 1, 2 辛 三氟 酮 8 -經基 <C0C13) · 1·: 2.75(1 0 · 1.80(··8Η)· 2 .2Η). 3.β5(·.2Η) 甲 4(210X 297 公羚） 78. 8. 3, 000 五、發明說明（14 )

l2.U經全甲I 4 氣- 壬酮 n 1 1, 1, 2, 2 -五氟-5 - 3· (’ 4 ·經笨基）_ 3 戍 -3 基04续基丁 4键 氟- 甲}-物甲>-物 三}酮二基氟化二基氟化 -基--經三氧 •經三氧 1篆2 N ( i N( -L0 - -15， I - 5 , l·* 丁N2 & 錢N4 & 欽 14.15.16. 4 、式 3 C5,戍 :代 N JA. -基· C5,戍 -*代 N 3氧 •基· A6 B6 λ 9d)« I·45( 1#2H)a 3:n〇»·.⑻· <.IS卜.2H> (C〇Ct3) ~ S.90(b*«lM)* β.90(4«ΐΗ) jsl6Ki. 7.25(·.4Η). 7.95(d.lH) ¢020) * 3.13(*,6H)% 3,3〇(..2Η)β 3.4β(«·2Η). 4.0l<b*.2H). {020)- Ι.95(·.4Η). 2.54(·,4Η) 3.10(s.6H)v 3.3S(«.2H). 3.SS(«,2H)4 5.25(b*.tH) 1.2 κ 10-6. Pt£ 8.0 it 10-7. RL£ 1.6 tc 10>7. RL£ S.O κ 10-9. ACh€ 6.5 x 10-8. 拄：PLE ·锗肝臟醏酶（E · C · 3，1. 1. 1 ) RLE.兎旰臟醏酶（Ε· C· 3. 1· 1. 1 ) AChE.已醯膽鹼醏酶（E. C · 3. 1. 1. 7 ) 在本發明之一特殊應用中，未知酵素是鹼性磷酸gg酶 ，第二酵素是免肝臟醏酶或I醚膽鹼赌酶，經封阻的抑 制劑是化學式V之氟化鋼。假如檢性碟酸g》酵存在於未 知液體中，其引起磷醆暗鍵之切開以生成化學式诃之抑 制劑。藉著添加鄰位确笨基丁酸鹽或都位确笨基暗酸抽 ，1，分析就完戍了。 ^ ..............................................i$t.................................t................•…〆........線 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 經濟部中央標準局印製 甲 4(210 X 297 公发） 78. 8. 3,000 204讲 A6 B6 五、發明說明（15) CH·, CH, CF- 1ch2i . 令CF: CH, (CH2I3 - Η - (CH2)3〇h CHi a CH- N〇2 免肝職時酶或 匕酸膽驗暗酶 ............*.....................................政 ί請先¾讀背由<注意事项再填窝本頁〕

VII

VIII 假如抑制剞y[是由於鹼性磷醆賭酶存 而形成，則醏酶的活性技抑制，而且無色的基賀硼不η 轉化成有色的產物砸。假如沒有鹼性磷醆醋酶存在於未 知液體中，則無抑·形成，冑色的產物规也因此形 成了，因為S|*酶未祓抑制。 到目前為止’酵素擴增作用之兩個階段已經被描述。 又如需要附加的信號擴增作用，則 段式擴增分析，I中,“、Μ 夕陌段之階 反應，最後導捋p Μ 八夕钗珠劑繼續 瓦後等敌信號增强。在描 把上试必土 z A▲ 贫a k個實例時 會 地 訂 線 把上述4未知酵素，傲堂 京看做矛—酵素是很w风π，m ^ 把分析媒體中才诘η 队〜’弟一酵 枝Τ < Α剞以酶促轉化 述的第二酵素之嗔〜 、，後者把 呼京之過即剞去封阻。再者 何其後的酵素，可以* κ+ 矛—酵素，或 和附加的試割反應以提供另外的 酵素 上 饪 酵 甲 4(210X297 公沒） 78. 8. 3,000 17 A6 B6 素此酵素則繼續進行除段式酵素反應，渡至調節劑被 去封阻。另外，第：酵素{直接催化指示劑反應，而是 把分㈣試㈣化成第三酵素，此酵素是指示劑 反應之催化劑。 藉著適^的試劑選緙而把試劑加至分析嫖體中，則可 以達成任何欲求之擴增階段數目。 擴〜作用發生於任何先前描述過的發明實例中，因為 未知酵素，第二酵素或饪何其他酵素，如真正的催化劑 在作用’其中單獨酵素分子可以各别地作用在本赏上是 無數個的封阻調節劑或基質分子而不祓消耗。因此，理 論上’藉著本發明之方法，分子的第二酵素足以侦測未 知酵素。實際上，第二酵素，基質及經封阻的抑制劑之 訂 洛加量’以及所使用之擴增陵段次數之決定，乃是根據 想要達到的擴增作用水平，而且這方面之決定不會超出 —般技衡水平。 明顯的是，有無數種適合於決定未知酵素之分析结構 可破想像出來〇在本質上相同的狀況下，籍著未知酵素 線 所產生之信號大小，和分析某範心已定出含量之未知 酵素所產生之信號大小相Μ較，可決定㈣Μ度。 經濟部中央標準局印製 當本發明之方法用來決定酵素濃度時，利用遥當的儀器 ，例如分光光度計，如，貝克曼歸分光光度計（加洲 愛爾文，貝克曼儀器公司）來記讀信號强度是比較方便 的。 甲 4(210X297 公犮） 18 78. 8. 3,000

-043lV 五、發明說明（17 ) 本發明之另-觀點是”試劑組套或 本發明之方·行未知酵素之分析。組套可據 酵素Hr經封组切制， 弟- 赏。組套也可包括未知酵素之標準物，例：了酵素，基 ::已經決定之樣品，或者包括有益於完:分析： 。組ίΓΠ質。它可包括溶液，例如食鹽水或緩衝液 組套《成分可置於各別的容器中，例如，小離心管（ 或者兩種或多種成公經組合置於—單獨容器 實驗 例行性分析技衡-瞬時釋色層分析（piashsiiic^ Chr〇.at〇grophy )在 32 - 63 網孔（3 _ 7 〆）之’ 廳歸上進行。分析性薄層色層分析（TLC )在厚度 為〇·25公厘，以銀落為底之矽攀板（5 X 20公分）（ 麟自EH scientlf lc )上進行。製備性溥層色層分析在 厚度為2·0公厘，以玻璃為底之歸板（20 X 20公分） (購自EM Sicentmc )上進行。嫁點在湯娘士胡佛（ Thomas Hoover )毛細熔點測試儀器上進行測量，而且 未經校正。核磁共振光譜以_工测分光光度計 來記錄，而且化学位移（ppm為單位）以相對於三甲基 石夕烷者記錄之。高效性液相色層分析（HPLC )則在— 具UV侦測之瓦特氏（Waters ) 5/0雙幫浦系統中進 行使用下列兩種置於-布朗李（Brownlee ) A >： 3〇〇 (請先S-讀背面之注意事項再填窝本頁) :裝. .訂， •線. ψ 4(21〇x 297 公沒） -19 78· 8. 3,000 五、發明說明（丨8 ) A6 B6 經濟部中央標準局印製 7 X 25 0公厘管柱中之—溶劑系统·•系統a )首先以 30福醋醆餒（NH4〇AC ) ( pH 6.5 )維持5分鐘，接 著以直線梯度至2.0 Μ之醋酸銨沖提30分鐘，隨後以 1.0Μ睹醆銨維持5分鐘。系統β )使用邓咖暗酸銨 (pH 6 · 5 )缓衡系统。流速是χ . 〇公撮/分鐘。氣相. 色層分析是在一 Η·Ρ· 584〇a氣相色層分析儀進行，此儀 器配備有FID以及自動注射器，使用購自J&w Scientific公司之3〇 M D3-l Megabore管柱〇氣相色产分 析條件如下：在10TC維持3分鐘，接著以10 *c /分鐘之 梯度加熱至2 50 ·(：，隨後在250 *C維持3分鐘，流速是 16 ·0公撮/分鐘。 抑制常數在50 nM之三羥甲基胺基甲烷緩衡液（Tris buffer, PH 8.0 )中測量。酵素及抑制劑在室温下網^育2〇 分鐘。酵素基質隨後加入，而且水解速率以分光光度計 測量。豬肝臟醏酶及兎肝臟醏酶之基質是鄭位_稍笨基 丁酸鹽，G醯膽鹼醏酶之基質是醯基硫膽鹼和愛耳是 (Ellman's )試劑。 賁例1 〔4 - (3 -氧代_ 4, 4, 4 -三氟丁基）笨基〕鱗酸二 銨 A 3_(_4 -甲氧笨基）_-2 - (1-氧代 _2, 2，2 -三氟G基）丙酸G醋 —個1升而具有4頸之圓底燒瓶，其經安较了逆流凝

3,0〇〇 請 先 聞 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 1 裝 訂 s. 線 五、發明說明（19 ) (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 縮器，液滴漏斗，惠氣人口，以及磁性攪拌$，此燒瓶 充裝分散在油中之也化納7·17克（〇 i49M )以 及300公振之無水已醚。9公撮絕對酒精缓緩地加至攪 拌中之溶液。在氪氧停止放出後，25免（〇 i36 m ) 〇 基4, 4, 4 -三氟甲基匕醯乙醆鹽和21·3免（〇136M )4 -甲氧笨氣之混合物，於—小時期間加入。然後混 合物以逆流加熟過夜。反應混合物經冷却，以水，i N 鹽酸’無水硫酸鎮羊取，溶剞在減签下除去β 33.5克粗 免·的反應混合物’在60 X 300公厘之辟膠·管柱上，以1 :3之G基暗酸鹽：己院·混合物進行色居分析。相似的 部分經合併在一起，而且得到9克（27% )的油狀產物· 。核磁共振 NHR (CDC!13) 2.12 (m, 3tl), 2·67 (m, 2Η), 3·85 (m, 311), 3.90 (s, 311), 7·24 (q, 4Η). B I Ll-三氟-e - (4-經笨基）-2- 丁綱 —個100公撮的圓底燒瓶，經安裝了逆流凝縮器，磁 性攪拌器·以及氬氣入口，此燒瓶充裝2.05免（6.7 M)G基3 - (4 -甲軋笨基）-2 - (1 -氧代-2, 2，2 -三氟匕基）丙酸鹽，溶於酒精中之31 %溴化 氫20公撮，以及10公撮的水。此混合物以120 *C加熱過 夜，在減壓下滚縮，而且在二氣甲烷及水之間加以分離 。有機層以水成二硫化物，飽和的重硖醆納，無水破酸 鎂萃舣，而且溶劑在減壓下除去。粗製的反應混合物在 50X 3 00公厘之矽疹管柱上，以1 :1之己酸鹽：己烷 甲 4(2l〇x 297公釐） 21 78. 8. 3,〇〇〇 B6 真，發明說明（20 進行色層分析。相似的部分合併在一起，而且溶劑在滅 壓下移去，以生成清澈之油狀產物6〇〇毫免（41 % 。 核磁共振瞭（⑽3)χ· 2·95(〜 4η), 4·9〇(μ，如， 6.93{dd, 411) J=4,60Hz. C二G基C4_(3 -軋化_4, 4, 4_三氟丁基）笨 基〕磷醆鹽 —個10公摄之一頸圓底燒瓶，經安裝了氬氡入口及磁 性挽拌器·，而且置於冰浴中，在5.c充裝4〇〇毫克（ 1.8 mM )之1，；!，卜三氟_ 4 - ( 4 -羥笨基）_ 2 _ 丁酮，400毫克（2.4aM )之二匕基氣化磷酸鹽，· 0.15公撮之無水吡啶，以及5公摄之二氣甲烷。混合 物在室溫下攪拌過夜，過濾以除去吡啶氣化氮，以 0.2 N &化氣萃取，《水萃取，而且乾燥（無水硫駿鎮 )。在減壓下除去溶劑以得到—棕色油狀粗製產物6〇〇 毫克。利用i : i之G酸鹽：[院溶劑系統之製樣㈣ 層色層分析，可製得一清澈之油狀產物600毫免（92% ^其核共振临，㈣，3.0(m, 4H), 〇 4.20(mf 4H), 7.15 (S/ 4H). 〇 〔4 - (3 -氧代-4, 4, 4 -三氟-丁基）笨基〕 經濟部中央標準局印製 填酸二按 -個25公撮之―㈣錢取，經安装了^人口及磁 性攪拌器，充裝5.0公撮之二氣甲烷，14〇毫克（〇 * 蝴）之二己基C 4 - (3 -氧代_ 4,4,4 _三氟丁基 甲 4(21〇x 297¾:衮） 22 - 78. 8. 3,000

經濟部中央標準局印製 )篆基〕磷酸鹽以及2 · 0公撮之溴化三甲基矽院。此混 合物在室溫攪拌3小時後，加入10公撮甲醇，而且揮發 性物質在減壓下除去。殘留物溶於水中，而且以1〇ν 之氫氡化鈉調pH值至7.3。水溶液以乙醚萃取，而且 經令凍乾燥以得到白色固體物1 90毫免。此物質溶於 公援之30πΜ醋酸銨緩衡液中，而且藉著高故性液相色 層分析使用系统Α來纯化。凍乾後之產物重量是5〇毫免 (37 % )。其熔點是235 240 °C。核磁共振 晴（D2〇)fic-；u9C)(m, 2iI), 2.56(nw 2H), 4.65(s，贿、 6·88(«Μ, 82Ηζ· 賁例2 1 _經基-5，5 -—氣-8,8 -二甲基_ 4 -壬西同 A G基23 2 -二氟-5, 5-二甲基己酸鹽 —個100公檨之三頸圓底燒瓶，經安裝了液滴漏斗，氬 氡入口，水浴，以及磁性攪拌器，充裝8·0公撳之二象 甲烷以及2.21免（20mM)之G基2 _氧代_ 5,5 _二 甲基己酸鹽。溶於5公撮二氯甲烷之二己基胺基硫三氟 化物2.11免（13 mM )以15分鐘時間加至反應混合物， 在室溫下挽拌此現合物過夜。此反應混合物在水和二氯 甲烷之間枝分離，把有機層加以乾燥（無水硫酸鎮）， 而且在減壓下移去溶劑。油狀殘i留物在83_咫.C蒸餾， 得到1.0免（25% )產物。其核磁共振瓜肛（CDC13)义_ 0.95(s, 9Η), 1·40 (m, 411), 2·1〇 (m，叫，4·35 (q, 2Η)· .............................................(·.：裝.................................4?....................(-........線： C請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) 甲 4(210X297 公沒） 23 78. 8. 3,000

A - 五、發明說明（22) (請先間讀背面之注意事項再填窝本頁) B 2 , 3, 4, 5 _ 四氬 _ 2 _ 氧代 _ 3 _ 〔 （ 5, 5 ·二甲 基_ 2_· 2 _二氟_ } _氧代）己基〕呋喃 —個25公撮之三頸圓底繞瓶，經安裝了乾燥試管，液 滴漏斗，加熱罩，以及磁性搅拌器，充裝〇 24免（ .訂· 5 · 0 HJM )分散於50 %油中之氬化鈉。氬化鈉以無水己 院清洗（兩次，每次丨〇公撮），而且把5公摄之g醚加 至二角燒瓶中。5滴絕對乙醉和5公撮匕縫之混合物缓 緩地加至氩化鈉懸浮液中。氬氣停止故出後，1〇克（ 5·0χηΜ之2,2 -二氟-5,5 _二甲基-己酸匕鞋•和溶 於5公掇d之〇·43克（5.0 mM ) 丁酸内醏之混合物 ，以20分鐘時間加入。溶液經逆流3小畤，而且在室溫 攬拌過夜。反應混合物用1 N氣化氬分離，有機層用水 清洗（兩次》每次50公撖），經乾垛（無水破酸鎂）， 而且在減恩下移去溶劑。油狀殘留物〇88克，從己烷 :酸鹽混合物結晶出產物〇·66克（53% )。產物之 核磁共振 nmr (CDCl3)cC_ 〇·95(3, 9H), , •線· 2.00(m, 3Η), 2.50(m, 2Η), 3.00(m, 1Η), 4.25(m, 1Η), 4·5(πι,1Η), C 1-羥基-5，5-二氟-8, 8 -二甲基-4-壬酮 —個10公撮之一類圓底燒瓶，經安裝了氬氣入口， 磁性挽拌器，以及逆流凝缩器，充裝1()公振之食醋， 4滴濃鹽酸以及2〇〇毫免（〇Si刪）之2,3, 4,5 -四 乳-2 -氧代-3 - (5, 5 -二甲基-2,2 -二氟-1 vf_. -氧代己基）吹喃。反應混合物以l1〇»c加熱過夜。反 78. 8. 3,000 甲 4(210X297公S ) 24 A6 B6 五、發明說明（23 ) 應混合物用。醚萃取，而且。醚用水交叉清洗，經乾燥 (無水硫酸鎂），㈤且在減壓下除去溶劑。&留物在ι〇 X60公厘之料管柱上，使用9 :丄之己烷：c醆鹽混 合物進行色層分析，得到清澈油狀物。核磁共板 ㈣（-Vf 5(sm45(t,2H),2.oo(、m,6H), 3.12(bs, III), 4.15(^, in). 實例3 N,N--T^.n.C2. -5, 5, 5 -二氟_ 4 _軋代五按，氬氧化物鹽 氟_1, 1-二羥基）乙基〕呋喃 一個3公升的三頸圓底燒瓶，經安裝了逆流凝縮器， 液滴漏斗，氬氡入口，磁性搅拌器，以及加热罩，充裝 36免（0.75 Μ )溶於50 %油中之氬化鈉。氩化鈉用無 水己烷清洗（兩次，每次200公摄），然後懸浮在8〇〇 公振之Cj鍵以及22公振之純粹酒精中。丁酸鹽内赌 60.2克（0.7 Μ )和溶於75 0公撮c醚之0基三氛匕 酸鹽99.4克（0.7 Μ )之混合物，以係持反應輊微逆 流之速率，加至懸浮液中。混合物再經逆流2小時，而 後在室&挽拌過夜。反應在冰浴中呤却，而且加入i ν 鹽駿250公撮。有機層被分離，以水清洗（兩次，每次 200公撮），經乾燥（無水硫酸鎮），而且在滅壓下移 去溶劑。殘留物從己烷：醆鹽結晶出產物64 ·〇克（ ...................................................«.. (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) .訂· •線 甲 4(21〇x 297公釐） -25 78. 8. 3,000

五 A6 B6 、發明說明（24 ) 經濟部中央標準局印製 45·4 % ),其熔點是87〜兕.c。核磁共振 nmr (DMSO-d ) «C _ ? 〇〇fm ^ , • ), 3.09(t,lH)j=7H2, 4.20(m,2H) 7.〇〇(s,1H), 7.52(s, III)· B ’ ’ —氟_5_羥基-2-戍綱之製備 -個5 OG公振之三頸圓底燒瓶，經安裝了逆流凝縮器 ，加熱罩，以及磁性挽拌器，充裝61.5 U 0·31 M ) 之 2, 3, 4, 5 n 2 _ 氧代 _ 3 _ ( 2, 2 2 _ 三象· 1, 1 一羥基基）呋喃，6·4公撮之濃鹽醆，公 撮之水’以及80公撮之匕駿。反應混合物以i2「C加熱 過夜。錢再加人3公振之滚㈣以及5公振之水，而 昱反應混合物再加熱10小時。反應混合物在水和。醚之 閼被分離，而水層用固蹬重硖醆鈉（100皂）中和。匕醚 溶液用水洗務（兩& , β yv λ ΙΛ Ν (兩次，每次20公撮）’經乾燥（無水硫 酸鎂），而且在減壓下移去溶劑，得到6〇免"5%卜炎 黃色油狀產物。核磁共振_ (CDC1 )义 4.03(1^, 1H), 4.20(0,, 1H). ·細，4H), C L L 1 -三氟 5 -漠· - 2 -戍酮 一個50〇公振之三頸圓底燒瓶，經安逛7 即底現肌版安裝了液滴漏斗， 磁性攪拌器，冰-鹽浴，以及氬氣入口 , 无裝125公撮 之無水二甲基甲醒胺，29免（35. 7 mM )之=β \ 一' Λ - 5 羥基_ 2 _戊酮。混合物冷却至_ 5。 而且11.5 g (71·6 dim )的溴在兩小時期間一滴滴吔加入。在室漾 下搅拌過夜後，反應混合物經由_ 3〇 Α 管枉在2.0 甲 4(210><297公衮） -26 78. 8. 3,〇〇〇 請 先 閲 讀 背 © 之 注 意 事 项 再 填 窝 才一 1\ 裝 钉 線 A6 B6 五、發明說明（25) 公厘水銀柱罄力下蒸餾。兩個部分經收集；第—部分來 自27 _ 35 ΐ者，第二部分來自35 __ 7(rc者。第二部分在 水和G醚之間被分離，有機層用水洗滌（三次，每次⑽ 公撮），經乾燥（無水硫駿糕），而且在室溫下減磨蒸 發，得到一無色油狀混合物，其由二甲基甲醮胺，匕韃 ，及欲求之產物組成’未經進一步纯化之產物用於下— 個反應。 D 1^，1^-二甲基-5,5,5-三氟_4_軋代戍， 一個500公撮之三頸圓底燒瓶，經安裝了液滴漏斗 氬氣入口，磁性攪拌器，以及冰-鹽浴，在_ 8.c充较 21.5克（0.45 Μ )之無水一甲胺。然後在-1〇°(3把溶_ 於二甲基甲醒胺之1，1，1 -三氟-5，溴-2 -戊酮 19.4克（88.5 raM )和Li魅一滴滴地加至藏合物。懸浮 液在-KTC攬拌2 · 5小時》溶劑則從沉嚴物上清液移去 。沉澱物以已縫洗條（三次，每次200公撮），有機舞 合併在一起，以水洗條（二次，每次30公撮），經乾綠 (無水硫醆鎂），而且滅壓下蒸發，得到15.9免 % )之淡黃色油狀物。其鹽酸鹽核磁共 振 nmr (CDCl^ ) ^ 1.98(s, 411), 2.90(s, 6H), 3.21(t, 2ίΤ).

E N，N -二甲基- Ν·〔2·甲軋基）匕基〕-5 5，5 -三氟-4 -氧代戊鉄，氬氧化物鹽 —個25公撮之一頸圓底燒瓶，充裝2.95免（21.2 mM )之 2 ‘臭 C* 基甲鍵，0.33 克（1.77 mM )之 N ...................................................裝.................................tr.................................«.. (請先閃讀背面之注意事项再填寫本頁〕 甲 4(210X297 公釐） 27 五、發明説明（26 ) N -二甲基-(夂5，5，-二氟-4 -氡代戍胺）以及 2.5公摄之二甲基甲ST胺，混合物在室溫挽将3天。在 滅I下移去溶劑，而且號拍色油狀物在一氩氧化物型 Dow肛-i管柱（15 X 200公厘）（含2〇〇公撮水）上 進行色層分析。來自管柱之流出物經凍乾產生琥珀色油 狀物0.28克（60%)，此產物是氫氧化物鹽。核磁共 振耐2H), 3.13(s, 6η), Μ%，卸， 3.41(m# 2H), 3.6〇(m, 2H), 3.88(bs, 211).. 此物質用於下一個反應而未經進一步纯化。 F 1^，^-二甲基-1^-〔2-羥基）匕基〕-5，5, 5 ·三氟-4 -氧代戊餘，氟氧化物鹽 —個10公撮之圓底燒瓶，經安裝了氬氣入口以及逆流 經濟部中央標準局印製， 凝粮器，充裝0.275 g ( ΐ·ι應）n，N -二甲基-1^-〔2-(甲氧基）1基〕-5,5,5-三氟-4-氧 代戍缺，氬氧化物鹽，4.0公撮水及8.0公撮溶於C·酸 之30 %溴化氬。此混合物在1 2〇 〇c加熱5小時，冷却， 而且在減譽下移去溶劑。殘留物以水共同蒸發（3次， 每次20公撮），而且產生之油狀物在—氬氧化物型 Dcmex-i (丨5 X 200公厘）管柱上進行色層分析。在減 恩下蒸·發流出物，得到氬氧化物鹽產物0.27克（63% ) 。核磁共振 nmr (D2〇)^- 4H), 3.13(s, 6H), 3.30 (m,2H), 3.48 (m, 2H), 4.〇l(bS/ 2H). 78. 8. 3,000 f請先閑讀背面之注意事項再填寫f 〇 -- 甲 4(210X297 公沒) 28 A6 B6 五、發明説明（27 ) 賁例4 N，N -二甲基-N - C 2 -(磷酸氧基）匕基〕-5, 5，5 -三氟-4 -氧代戊鉄，接鹽 一個10公撮之三頸燒瓶，經安裝了液滴漏斗，氬氣入 口，磁性挽拌器·，以及冰鹽浴，充裝0.093公振（1.0 mM )磷酸氧氣化物以及0.5公振三甲基碟酸鹽。在 -C 把 70.0 毫克（〇.2ώΜ )N , N -二甲基-n _〔 2 -(經基）基〕-5,5,5 -二氟-4 -氧代戊按，數 氧化物鹽一滴滴地加至這個混.合物中。混合物經挽拌3〇 分鐘，然後置於一冷凍器過夜。混合物先後以匕醚及石 油縫研磨（四次，每次50公撮），得到樹脂狀沉澱物。 此沉澱物以冰覆蓋，用i N氩軋化鈉中和至pH6〇， 而且在減壓下蒸發至乾。產生.之固體物1〇7毫皂，溶於 PH 7.0之30 mM醋酸餒緩衡液，而且藉著高效性色層分 析以系統B來純化。在第12分鐘流出之產物，藉著缓衝 液之凍乾而分離出9·°毫克（】D無色樹脂。核磁共 振 nmr (D„〇) rC _ i Qn, . 2 ^ 4H), 3.14(s, 6H), 3.42(n, 2H), 3-6〇(m, 2H), 4.X9(bs/ 2H). 概要s之，本發明招也 、 …未…二=法以伯測及決定存在於液 接觸，因此未知酵索移：：索及經封阻之調節劑 劑。第二酵素h 去封阻基以提供第二酵素之調節 化基質成為'ά質隨後加入。調節劑調節第二酵索轉 丞只咏為一產物， 生成可測知的信號。信號之侦測 甲 4 (210X297 公沒） 78. 8. 3,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· .訂· .線， '29

酵素之濃度可被決定。調節劑與第二酵素提供兩個擴增階 段，因此倍號經擴增100倍或更多倍，使得肉眼觀察出信 號之時間比利用傳統的酵素分析表少了 100倍。 實例5〜8 材料： 卵清蛋白 缓衝液A : 5bM礎酸鉀及ImM氛化pH 7.3 缓衝液B : 50πΜ二乙醇胺及0·5ηΜ氮化鎂 缓衝液 C : 5 0 m M t r i s H C 1， ρ Η 8 . 0 /3 -半乳耱脊鱗，2.3X10< mg/ML於緩衝液A中 飴性磷酸酶，0.4 ng/ML於缓衝液B中 a-C, 7.0X10^ mg/ML 於緩衝液 C 中 4-(4-(/6 -半乳糖灰喃糖基）苯基）-1，1，卜三氣_2_丁酮， 300ϋΜ於缓衝液A中（封阻抑制劑1) 4-(4-(H-乙醯苯基丙胺醛胺基）苯基）-1,1,1-三氣-2-丁酮 ,100 w Μ於緩衝液C中（封阻抑制劑2 ) 經濟部中央梂準局貝工消赀合作杜印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4-(4 -磷苯基）-1,1,1-三氣-2-丁酮，300U Μ於緩衝液Α中 (封阻抑制劑3 ) 二氛靛苯基丁酸酯，200wn於50mM Tris中。 實例5 偵檢/3 -半乳糖替酶之活性 -30- 本紙张尺度边《1中《國家標if(CNS>肀4規格(210X297公龙) 經濟部中央檁準局β工诂费合作社印製 W於_ 五、發明説明（^ / k ^ >9 _ 補充 於緩衝液A中製備含lxi0-3Dg/Ml之RLE及0.2 mg/ML 卵清蛋白之溶液。將0.9 ML整分移入塑膠管（管1), 且0.8 ML整分移入另10支管（管2至11)。緩衝液A ( 100w L)中/3 -半乳耱替酶加入管1，而1 : 5逐次稀釋液 被编成管2至10。整分（50WL)該液被移至撖滴度板之井。 每値井内加入封陴抑制劑1 (50i/L), 20分鐘後再加入 100//L受質溶液。再三分鐘後，加入25w之1 —丙醇。每 値井之吸收度在620ηιη波長被測定。實驗結果如附圖1。 實例6 偵檢鹾α -胰凝乳蛋白酶之活性 以如例5所用方法，經由cx -胰凝乳蛋白酶之作用於 封阻抑制劑，抑制被受質及RLE著色，而《-胰凝乳蛋白 之活性被測定。實驗結果如附圖1。 實例7 偵檢齡性磷酸酶之活性 以如例V所用方法，經由鹼性碟酸酶之作用於封阻抑 制劑，抑制被受質及RLE著色，而鹺性磷酸酶之活性被測定 。實驗結果如附圖1。 實例8 偵檢；3 -半乳耱替酶之活性 於缓衝液A中製備含lX10_3mg/ML之RLE及0.2 mg/ML 卵清蛋白之溶液。該缓衝液A 為12管（每支0.5 ml). -31 - (請先閲讀背面之注意事項#填寫本頁) 本紙張尺度逍《]中國Β家楳iMCNS) 規格（210x29741) 五、發明説明（ η補充 2- a Λ 6 η 6 1 ml之尿和lnl之缓衝掖A混合。0.5 ML造溶液逐次稀 釋（1:2)於12支管。從毎一支管各取0·5 ML整份移至撤滴 定度盤之6列并。在720分鐘（列A及B) , 40分鎗（列D 及E)及60分鐘（列G及HY) , 50//L之300 uM封p且抑制 劑溶液加入并1至Π。管柱12接收50W緩衝液A 。在t = 80 分鐘，100mL之受質溶液加入各并内。3分鐘後，加50 "1 1 _丙醇。每痼并之吸收度在620 πβ波長被測定。結 果如附圖2。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫木頁) 裝- 線- 經濟部中央楳準局β工消费合作社印31 32-

Claims (1)

1. μ Ο AT Β7 C7 D7

   六、中猜專.丨_丨见® 第78106780號「分析酵素中之加強倍號的方法」專利案 (82年2月修正） 1. 一種測定在液髖中之酵素之方法，包括： (a) 將懷疑含有糖苜酶或磔酸酶之液體和羧基酯醏及羧基 酯St之封阻過的抑制劑結合.該耱苔酶或磷酸酶將封 阻過的氣酮抑制劑水解成氣酮抑制劑： (b) 將該羧基醋酶之受質加入該液體中.該氣酮抑制受質 被羧基酯SS水解成有色産物；其中受質偽S自硝基苯 酯及吲η«氣基酯；及 (c) il著偵檢一與該有色産物相關聪之倍號來測定該糖苷 i毎或礎酸酶。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包括測定該液 發中之糖蒈SS或磷酸酶之獯度.乃藉箸測量該倍號之大 小，並且把它和一種與産物相關聯之信號大小相比較/ 此時將含有該糖苷酶或磷酸酶預定S之液鼸樣品重後進 行步驟（a )至（c )。 3. —種測定在液髖中之酵素之方法，包括·· (a) 將懷疑含有糖苷醐或磷酸酶之第一液體與酯酶及酯酶 之封阻過的氣酮抑制劑結合，該糖¥SS或磔酸K將封 阻過的氣酮抑制劑水解成《酮抑制劑； (b) 將色原加至該液體中，該«酮抑制劑抑制色原被酯 水解成有色産物； (功先聞請背面之注意事項再填"本百) 本纸張K度適用中國a家邙孕（CNS)f 4規〖3(210X297公釐） 六，申謓專刊苑園 A 7 B7 C7 D7 有 含 將 當 度 濃 之 is 酸 礎 及或 ; 酶 小¥ 大耱 之之 用中 作體 制液 抑該 董定 計測 大 驟之 步物 行産 進色 複有 重成 品形 樣制 歷抑 液舆 之小 5大 定該 預較 酶比 酸 ， 磷時 或彳 酶(C 苷至 糖 } 該(a 括 包 套 組 ： 質暖 物液 之之 析酶 分酸 酶磷 酸或 雔酶 或 ¥ 酶耱 苷量 。耱定 定行預 而進有 小種含 1 I 4. 酯 ，基 劑氣 制晬 抑吲 酮及 氣酯 及的苯 ; 過基 質阻硝 受封自 ·, 之之選 酶酶酶俱 酯酯酯質 基基基受 羧 羧羧中 i1T3 t I 1 - 其 含 不 上 質 本 1 括 包 尚 其 丨 0 套品 組樣 之髏 項液 4之 第酶 圍酸 範磔 利或 專酶 諳蒈 申耱 如該 5 (功先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -¾.. 經濟部中央標準局員工消費合作社印t •線· 木紙it尺度適;1丨十《«家你平（CNS) 规格（2丨Ο X 2(J7公垃）