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JP6281727B2 - アルブミンの偽エステラーゼ加水分解反応に基づく特異的蛍光プローブおよび定量方法 - Google Patents

アルブミンの偽エステラーゼ加水分解反応に基づく特異的蛍光プローブおよび定量方法 Download PDF

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Description

本発明は医薬技術分野に属し、具体的にアルブミンの偽エステラーゼ加水分解反応に基づく特異的蛍光プローブおよび応用に関する。
ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＨＳＡ）は、血漿中で含量が最も豊富なタンパク質であり、血漿中のタンパク総量の約５０〜６０％を占める（非特許文献１）。体液中のヒト血清アルブミンは脂肪酸、ビリルビン、アミノ酸、ステロイドホルモン、金属イオンおよび多くの治療分子などを輸送することができ、さらに血液の正常な浸透圧を維持することができる。ヒト血清中のアルブミンの正常値範囲は３４〜５４ｇ／Ｌである（非特許文献２）。しかし多くの疾病、例えば肝臓病（特に肝硬変）、ネフローゼ症候群、腫瘍、タンパク喪失性腸症、熱傷および栄養失調などは、血清アルブミンレベルが低下し、高タンパク食および慢性脱水はアルブミンレベルが上昇する。したがって、ヒト血中アルブミン含量の定量、測定は、すでに疾病に関する診断で臨床的に使用されており、人体のアルブミン含量が正常範囲値よりかなり低い場合、患者にヒト血清アルブミンを注射する必要がある。多くの臨床的実践により、血清アルブミンレベルの測定は、肝臓病または腎臓病患者の早期診断および予後に対して、非常に重要な診断の基準値となることがすでに実証されている。さらに重要なこととして、尿中への微量のアルブミンの検出は、一般的に腎臓疾病（例えば糖尿病、高血圧、連鎖球菌感染後の糸球体腎炎）、血管内皮機能障害、心臓疾患および静脈血栓塞栓症のマーカおよび診断の指標とすることができる。下表１に、人体の微量蛋白尿に対する診断値の正常範囲を示す。
（表１）表１ 微量蛋白尿の診断値
現在、アルブミンの測定および定量方法は、電気泳動法、免疫法および色素結合法などの方法を含む。このうち、電気泳動法は時間および労力がかかり、特異性が比較的劣り、アルブミン濃度が過大評価されやすい（非特許文献３）。免疫法は、その特異性は比較的良好であるが、コストが比較的高いため、現在、臨床的応用は比較的少ない。色素結合呈色法は、相対的にやや幅広く応用されているが、該方法は色素の小分子およびアルブミンの部分的領域の結合作用、または個別のアミノ酸の修飾作用に基づいており、有機体の部分的組織タンパクも色素の小分子と類似の作用を生じることができるため、その特異性は保障することができない。ブロモクレゾールグリーンおよびブロモクレゾールパープルは簡単、便利で特異性が相対的に良好な２種の色素分子とされ、臨床的にアルブミンの定量に比較的多く用いられている。しかし、その感度は比較的低く（非特許文献３）、定量の正確性を保証することができないため、過大評価（非特許文献４）または過小評価（非特許文献５）となり、さらに生物サンプル中の非特異的干渉を避けることができない（非特許文献６）。したがって、簡単で操作しやすく、特異性が高く、正確で信頼できるアルブミン定量方法の開発が必要である。
近年、国内外の学者はアルブミンが触媒機能も有することを見出しており、エステル結合構造を有する化合物の加水分解様反応を触媒することができ（非特許文献７）及び（非特許文献８）、反応後、それ自体の一部の遊離アミノ酸がエステル類分子構造中のカルボキシ基と共有結合し、さらに、遊離フェノール性水酸基を含有する１分子の加水分解生成物を放出する。葛広波らは、一部の小分子がアルブミンに特異的に触媒され、エステラーゼ加水分解様反応を生じることができることも見出しており、例えばＧＬＰ−１受容体アゴニストＢｏｃ５は、人体内でアルブミンにのみ触媒されることができ、人体のその他のエステラーゼは該化合物の加水分解に関与しない（非特許文献９）。以上国内外の最近の研究は、我々がアルブミンのエステラーゼ様活性に対し、その特異的な蛍光プローブの基質分子を設計、開発して、アルブミンの活性評価および定量分析に用いることができることを示している。
本発明は、Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基を置換したジベンゾイルエステル類誘導体を、ヒト血清アルブミン蛍光プローブの基質とする応用を提供している。これは、アルブミンの偽エステラーゼ活性により加水分解されると、原型の加水分解生成物と異なる蛍光放射スペクトルを生成することができる。該加水分解反応は選択性が高く、代謝生成物を測定しやすいなどの特徴を有する。
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５ Ｎｏｖ ２５；７０（１１）：１６７３〜８４ Ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ２０１０−０５−１２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅｏｒｙ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ，Ｍｏｓｂｙ，５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，２００９ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．２００３，５６，７８０． Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．１９８６，１５５，８３． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．，２００９，５５，５８３． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０１０；７９（５）：７８４〜９１ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００８；２８３（３３）：２２５８２〜９０ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２０１３；４８：３６０〜９
本発明の目的は、アルブミンの偽エステラーゼ加水分解反応に基づく特異的蛍光プローブ分子および応用を提供することである。該プローブ分子を利用して、ヒトの血清、血漿または尿中のアルブミン含量を測定し、サンプル中の蛍光強度値を測定することにより、このうちのアルブミン濃度を計算する。その原型および加水分解生成物の蛍光放射波長は明らかな差を有し、生成物はより測定しやすい。
本発明は、アルブミンの偽エステラーゼ加水分解反応に基づく特異的蛍光プローブを提供している。該特異的蛍光プローブのエステル結合は、ヒト血清アルブミンにより特異的に加水分解されて、分子蛍光放射スペクトルが顕著に異なる蛍光生成物を生成することができ、系中の生成物の含量により、アルブミンの含量および機能を確定する。該特異的蛍光プローブは、Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基が置換されたジベンゾイルエステル類誘導体であり、その構造式は式（１）に示す通りである。式中、Ｒ１は−Ｈ、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５のうちいずれか１種であり、Ｒ ２ はＣ４アルキル基又はＣ４ハロゲン化アルキル基のうちいずれか１種である。
式（１）
本発明は、様々なサンプル中のヒト血清アルブミン含量の定量、測定における前記特異的蛍光プローブの応用も提供している。上記式（１）の化合物をアルブミン特異的加水分解の代謝基質として使用し、加水分解反応を行い、単位時間内の基質の除去量および加水分解生成物の生成量を定量、測定することにより、様々なサンプル（組換発現したアルブミン単一酵素、ヒト組織調製液、各種組織細胞など生物系を含む）中のアルブミン含量を測定する。具体的測定方法は以下の通りである。
――系中でＮ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基を置換したジベンゾイルエステル類誘導体を特異的プローブの基質とする。基質濃度は１／１０〜１０Ｋｍを選択し、一点測定時の基質濃度は好ましくはＫｍである（Ｋｍはミカエリス定数である）。
――リン酸緩衝液など常用される緩衝液中で、反応温度２０〜６０℃の間（好ましい反応温度は３７℃である）、培養系のｐＨ値５．５〜１０．５の間（好ましいｐＨ値は７．４）である。
――反応時間は５〜１２０分間であり、上の基質に相応する加水分解生成物が定量限界に達することを確保する。
――単位時間内の基質の減少量または加水分解生成物の生成量を測定し、アルブミン活性の評価指標とする。
本発明で提供する様々なサンプル中のヒト血清アルブミン含量の定量、測定における特異的蛍光プローブの応用において、プローブ基質およびその加水分解生成物はいずれも蛍光特性を有し、蛍光検出器で基質および生成物の迅速、高感度な測定を実現する。蛍光の測定条件は、励起波長３００〜５００ｎｍ、放射波長４１０〜６００ｎｍである。
本発明で提供する前記特異的プローブ基質の応用において、該特異的プローブ基質はヒトの血清、血漿または尿中のアルブミンの定量、測定に用いられる。
組換発現したヒト血清アルブミンの培養系で考察を行い、特異的阻害実験、組換単一酵素の代謝反応、および酵素反応動力学のいくつかの面の証拠により、Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基を置換したジベンゾイルエステル類誘導体から、特異的なアルブミン加水分解代謝により（図４に示す）、Ｃ−４位のエステル結合が切断された加水分解生成物を生成することができることを証明する。
本発明の前記アルブミンの特異的プローブを用いたアルブミンの測定は、以下の突出した優位性を有する。
（１）高特異性：Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基を置換したジベンゾイルエステル類誘導体は、アルブミンにより高特異的に１つの代謝生成物、すなわちＣ−４位のエステル結合が切断された加水分解生成物に代謝されることができる。
（２）廉価で入手しやすい：Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基を置換したジベンゾイルエステル類誘導体およびその加水分解生成物は、いずれも化学合成により得ることができ、合成工程は簡単で実行しやすい。
（３）高感度：Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格構造を有する化合物は、いずれも良好な蛍光放射スペクトル特性（４１０〜６００ｎｍ）を有し、該基質およびその加水分解代謝生成物は、異なる蛍光放射スペクトル特性を有し、より良好に識別、測定を行うことができる。さらに比率法により、検量線を作成して定量、測定を行うことができる。
図１は、Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミドのＣ−４のヒドロキシ基が置換されたジベンゾイルエステル類誘導体の構造式である。このうち、Ａは蛍光プローブ分子Ａ、Ｂは蛍光プローブ分子Ｂ、Ｃは蛍光プローブ分子Ｃ、Ｄは蛍光プローブ分子Ｄである。 図２は、Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基を置換したジベンゾイルエステルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。 図３は、Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基を置換したジベンゾイルエステルの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 図４は、Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基を置換したジベンゾイルエステル類誘導体のヒト組換単一酵素のスクリーニング試験の結果である。 図５は、Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基を置換したジベンゾイルエステル類誘導体およびその脱ジベンゾイル代謝生成物の蛍光放射スペクトル（それぞれ３４２ｎｍまたは４５２ｎｍで励起する）である。 図６は、脱ジベンゾイル加水分解代謝生成物の生成量がアルブミン濃度に伴って変化する線形フィットである。
以下の実施例は、本発明についてさらに説明したものであるが、これにより本発明を制限することはない。
Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基を置換したジベンゾイルエステル（蛍光プローブ分子Ａ）の化学合成
（１）０．５ｍｍｏｌのＮ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミドおよび０．６２５ｍｍｏｌのトリエチルアミンを含有する１０ｍＬのテトラヒドロフラン溶液に、０．６ｍＭの４−ビフェニルカルボニルクロリド（ジクロロメタン１０ｍＬに溶解）をゆっくりと滴加し、温度を０℃に制御する。
（２）氷浴で１時間撹拌した後、反応系を室温に置いて一晩反応させる。
（３）反応液の溶媒を減圧除去し、残った固体をシリカゲルクロマトグラフィで精製する。酢酸エチル−ｎ−ヘキサン（１：３、ｖ／ｖ）を溶離液とし、１１３ｍｇの白色固体Ａを得る。
（４）得られた白色固体Ａ化合物に対して構造同定を行う。そのプロトン核磁気共鳴スペクトルおよびカーボン１３核磁気共鳴スペクトルは、図２および図３を参照のこと。
Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基を置換した４−パラメチルジベンゾイルエステル（蛍光プローブ分子Ｂ）の化学合成
（１）０．５ｍｍｏｌのＮ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミドおよび０．６２５ｍｍｏｌのトリエチルアミンを含有する１０ｍＬのテトラヒドロフラン溶液に、０．６ｍＭの４−パラメチルビフェニルカルボニルクロリド（ジクロロメタン１０ｍＬに溶解）をゆっくりと滴加し、温度を０℃に制御する。
（２）氷浴で１時間撹拌した後、反応系を室温に置いて一晩反応させる。
（３）反応液の溶媒を減圧除去し、残った固体をシリカゲルクロマトグラフィで精製する。酢酸エチル−ｎ−ヘキサン（１：３、ｖ／ｖ）を溶離液とし、２４１ｍｇの白色固体Ｂを得る。
Ｎ−ｎ−酪酸−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基を置換した４−パラメチルジベンゾイルエステル（蛍光プローブ分子Ｃ）の化学合成
（１）０．５ｍｍｏｌのＮ−ｎ−酪酸−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミドおよび０．６２５ｍｍｏｌのトリエチルアミンを含有する１０ｍＬのテトラヒドロフラン溶液に、０．６ｍＭの４−パラメチルビフェニルカルボニルクロリド（ジクロロメタン１０ｍＬに溶解）をゆっくりと滴加し、温度を０℃に制御する。
（２）氷浴で１時間撹拌した後、反応系を室温に置いて一晩反応させる。
（３）反応液の溶媒を減圧除去し、残った固体をシリカゲルクロマトグラフィで精製する。酢酸エチル−ｎ−ヘキサン（１：３、ｖ／ｖ）を溶離液とし、９５ｍｇの白色固体Ｃを得る。
Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基を置換した４−メトキシジベンゾイルエステル（蛍光プローブ分子Ｄ）の化学合成
（１）０．５ｍｍｏｌのＮ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミドおよび０．６２５ｍｍｏｌのトリエチルアミンを含有する１０ｍＬのテトラヒドロフラン溶液に、０．６ｍＭの４−メトキシビフェニルカルボニルクロリド（ジクロロメタン１０ｍＬに溶解）をゆっくりと滴加し、温度を０℃に制御する。
（２）氷浴で１時間撹拌した後、反応系を室温に置いて一晩反応させる。
（３）反応液の溶媒を減圧除去し、残った固体をシリカゲルクロマトグラフィで精製する。酢酸エチル−ｎ−ヘキサン（１：３、ｖ／ｖ）を溶離液とし、１４３ｍｇの白色固体Ｄを得る。
蛍光プローブ分子Ａの加水分解代謝の選択性
（１）ＣＥＳ１ｂ、ＣＥＳ１ｃ、ＣＥＳ２（５μｇ／ｍＬ）、アセチルコリンエステラーゼ（０．１Ｕ／Ｌ）、ブチリルコリンエステラーゼ（２０Ｕ／Ｌ）、血漿（１％）、ヒト血清アルブミン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、子牛血清アルブミン（０．５ｍｇ／ｍＬ）を含有するｐＨ＝６．０のリン酸緩衝液（１０ｍＭ）１９６μＬを、３７℃の条件下で振盪して１０分間プレインキュベートする。
（２）濃度が０．５ｍＭの蛍光プローブ分子Ａを４μＬ加えて反応を開始する。試験サンプル中の蛍光プローブ分子の終濃度を１０μＭにし、３７℃で振盪培養する。
（３）３０分後、２００μＬの冷アセトニトリルを添加して、激しく振盪した後、反応を止める。
（４）プローブ分子Ａ（λｅｘ＝３４２ｎｍ、λｅｍ＝４１６ｎｍ）および加水分解生成物Ａ１（λｅｘ＝４５２ｎｍ、λｅｍ＝５６４ｎｍ）の収集波長部分の蛍光強度値をそれぞれ測定し、Ａ１およびＡの蛍光強度比を計算する（図４および図５を参照）。
アルブミン定量の検量線の作成
（１）５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の標準溶液を使用し、リン酸緩衝液で様々な濃度の検量線標準液（０、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍｇ／ｍＬ）に希釈し（表２を参照のこと）、３７℃で１０分間プレインキュベートする。
（２）それぞれの前記溶液サンプル（９８０μＬ）に濃度が０．５ｍＭの蛍光プローブ分子Ｂを２０μＬ添加し、その終濃度を１０μＭにする。３７℃で３０分間振盪培養し、１ｍＬの冷アセトニトリルを添加して１５秒間激しく振盪し、反応を止める。
（表２）表２ 系列濃度のＨＳＡ標準液の調製
（３）プローブ分子Ｂ（λｅｘ＝３４２ｎｍ、λｅｍ＝４１６ｎｍ）および加水分解生成物Ｂ１（λｅｘ＝４５２ｎｍ、λｅｍ＝５６４ｎｍ）の収集波長部分の蛍光強度値をそれぞれ測定し、Ｂ１およびＢの蛍光強度比をＨＳＡ濃度に対応させ、線形フィットを行って、アルブミン定量の検量線を作成する。曲線の方程式はＹ＝０．００５５７８×Ｘ＋０．０４５３３であり、相関係数の２乗は０．９９９２である（図６を参照のこと）。
ヒト血漿サンプル中のアルブミンの定量分析
（１）ヒト血漿サンプルを１μＬ（約１滴）取り、ｐＨ＝７．４のリン酸緩衝液（１０ｍＭ）で２００倍に希釈し、４５℃の条件下で振盪して１０分間プレインキュベートする。
（２）濃度が０．５ｍＭの蛍光プローブＢを４μＬ添加して反応を開始する。試験サンプル中の蛍光プローブ分子の終濃度を１０μＭにし、４５℃で振盪培養する。
（３）３０分後、２００μＬの冷アセトニトリルを添加し、激しく振盪した後、反応を止める。
（４）プローブ分子Ｂ（λｅｘ＝３４２ｎｍ、λｅｍ＝４１６ｎｍ）および加水分解生成物Ｂ１（λｅｘ＝４５２ｎｍ、λｅｍ＝５６４ｎｍ）の収集波長部分の蛍光強度値をそれぞれ測定し、Ｂ１およびＢの蛍光強度比を計算する。蛍光比を実施例２の検量線に当てはめ、血漿中のアルブミン濃度４６．２ｍｇ／ｍＬが得られる。
ヒト尿サンプル中のアルブミンの定量分析
（１）ヒト尿サンプルを４９０μＬ取り、ｐＨ＝７．４のリン酸緩衝液４９０μＬで希釈し、３７℃下で１０分間プレインキュベートする。
（２）２０μＬの蛍光プローブ分子Ｃ（０．５ｍＭ）を添加し、試験サンプル中の蛍光プローブ分子の終濃度を１０μＭにする。３７℃で３０分間振盪培養し、１ｍＬの冷アセトニトリルを添加して１５秒間激しく振盪し、反応を止める。
（３）プローブ分子Ｃ（λｅｘ＝３４２ｎｍ、λｅｍ＝４１６ｎｍ）および加水分解生成物Ｃ１（λｅｘ＝４５２ｎｍ、λｅｍ＝５６４ｎｍ）の収集波長部分の蛍光強度値をそれぞれ測定し、Ｃ１およびＣの蛍光強度比を計算する。
（４）検量線で対応するアルブミン濃度値を求め、試料サンプル中のアルブミン濃度４８ｍｇ／Ｌが算出される。
組換発現系中のヒトアルブミンの定量分析
（１）組換発現したヒトアルブミンサンプルを１０ｍｇ秤取し、ｐＨ＝７．４のリン酸緩衝液でこれを溶解し、３７℃下で１ｍｇ／ｍＬのアルブミン溶液を調製する。
（２）２０μＬの蛍光プローブ分子Ｄ（０．５ｍＭ）を添加し、試料サンプル中の蛍光プローブ分子の終濃度を１０μＭにする。３７℃で３０分間振盪培養した後、１ｍＬの冷アセトニトリルを添加して１５秒間激しく振盪し、反応を止める。
（３）プローブ分子Ｄ（λｅｘ＝３４２ｎｍ、λｅｍ＝４１６ｎｍ）および加水分解生成物Ｄ１（λｅｘ＝４５２ｎｍ、λｅｍ＝５６４ｎｍ）の収集波長部分の蛍光強度値をそれぞれ測定し、Ｄ１およびＤの蛍光強度比を計算する。
（４）アルブミンの検量線に基づいて該サンプル（１ｍｇ／ｍＬ組換発現アルブミン溶液）中のアルブミン含量１４．９μＭが算出される。

Claims (5)

  1. アルブミンの偽エステラーゼ加水分解反応に基づく特異的蛍光プローブであって、該特異的蛍光プローブのエステル結合が、ヒト血清アルブミンにより特異的に分解されて、分子蛍光放射スペクトルが顕著に異なる蛍光生成物を生成することができ、系中の生成物の含量により、アルブミンの含量および機能を確定し、
    該特異的蛍光プローブは、Ｎ−ｎ−ブチル−４−ヒドロキシ−１，８−ナフタルイミド骨格のＣ−４位のヒドロキシ基が置換されたジベンゾイルエステル類誘導体であり、その構造式は式（１）に示す通りであり、式中、Ｒ１は−Ｈ、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５のうちいずれか１種であり、Ｒ２はＣ４アルキル基又はＣ４ハロゲン化アルキル基のうちいずれか１種であることを特徴とする、特異的蛍光プローブ。
    式（１）
  2. 請求項１に記載の特異的蛍光プローブをアルブミン特異的加水分解の代謝基質として使用し、加水分解反応を行い、単位時間内の基質の除去量および加水分解生成物の生成量を定量、測定することにより、様々なサンプル中のアルブミン含量を測定することを特徴とする、様々なサンプル中のヒト血清アルブミン含量の定量方法。
  3. 前記サンプルが組換発現したアルブミン単一酵素、ヒト組織調製液または各種組織細胞であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  4. 前記加水分解反応の条件として、系がリン酸緩衝液であり、プローブ基質の濃度が１／１０〜１０Ｋｍの間であり、培養系のｐＨ値が５．５〜１０．５の間であり、反応温度が２０〜６０℃の間であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  5. プローブ基質およびその加水分解生成物がいずれも蛍光特性を有し、蛍光検出器で基質および生成物の迅速、高感度な測定を実現し、蛍光測定の条件は、励起波長３００〜５００ｎｍ、放射波長４１０〜６００ｎｍであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
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