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TW202330521A - 吡唑并喹啉kras抑制劑 - Google Patents

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TW202330521A
TW202330521A TW111137456A TW111137456A TW202330521A TW 202330521 A TW202330521 A TW 202330521A TW 111137456 A TW111137456 A TW 111137456A TW 111137456 A TW111137456 A TW 111137456A TW 202330521 A TW202330521 A TW 202330521A
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TW
Taiwan
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pharmaceutically acceptable
cancer
compound
fluoro
acceptable salt
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Application number
TW111137456A
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English (en)
Inventor
文育 朱
王曉釗
文清 姚
Original Assignee
美商英塞特公司
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Publication date
Application filed by 美商英塞特公司 filed Critical 美商英塞特公司
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    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract

本發明揭示式I化合物、使用該等化合物抑制KRAS活性之方法，及包含此類化合物之醫藥組合物。該等化合物可用於治療、預防或改善與KRAS活性相關之疾病或病症，諸如癌症。

Description

吡唑并喹啉KRAS抑制劑
本發明提供化合物以及其組合物及使用方法。該等化合物調節KRAS活性且可用於治療各種疾病，包括癌症。
Ras蛋白係由生長因子及各種細胞外刺激活化之小GTP酶家族之一部分。Ras家族調節負責細胞生長、遷移、存活及分化之細胞內信號傳導路徑。RAS蛋白在細胞膜處之活化引起關鍵效應子之結合及細胞內一連串細胞內信號傳導路徑之啟動，包括RAF及PI3K激酶路徑。RAS的體細胞突變可導致不受控制的細胞生長及惡性轉化，而RAS蛋白之活化在正常細胞中受到嚴格調節(Simanshu, D.等人 Cell 170.1 (2017):17-33)。
Ras家族由三個成員構成：KRAS、NRAS及HRAS。RAS突變型癌症占人類癌症之約25%。KRAS為最常突變的同功異型物，占所有RAS突變之85%，而NRAS及HRAS被發現分別在所有Ras突變型癌症之12%及3%中突變(Simanshu, D.等人 Cell 170.1 (2017):17-33)。KRAS突變在前三種最致命的癌症類型中普遍存在：胰臟癌(97%)、大腸直腸癌(44%)及肺癌(30%) (Cox, A.D.等人 Nat Rev Drug Discov (2014) 13:828-51)。大部分RAS突變出現在胺基酸殘基12、13及61處。特定突變之頻率在RAS基因同功異型物之間變化，且雖然G12及Q61突變分別在KRAS及NRAS中占主導，但G12、G13及Q61突變在HRAS中最常見。此外，RAS同功異型物中的突變譜在癌症類型之間有所不同。舉例而言，KRAS G12D突變在胰臟癌(51%)中占主導，其次是大腸直腸腺癌(45%)及肺癌(17%)，而KRAS G12V突變與胰臟癌(30%)相關，其次是大腸直腸腺癌(27%)及肺腺癌(23%) (Cox, A.D.等人 Nat Rev Drug Discov (2014) 13:828-51)。相比之下，KRAS G12C突變在非小細胞肺癌(NSCLC)中，包含11%至16%的肺腺癌，以及2%至5%的胰臟癌及大腸直腸腺癌占主導(Cox, A.D.等人 Nat. Rev. Drug Discov. (2014) 13:828-51)。跨數百個癌細胞株之基因體研究已證明，具有KRAS突變之癌細胞高度依賴於KRAS功能來實現細胞生長及存活(McDonald, R等人 Cell 170 (2017): 577-592)。突變KRAS作為致癌驅動因子之作用得到廣泛活體內實驗證據的進一步支持，表明突變KRAS為動物模型中早期腫瘤發生及維持所必需的(Cox, A.D.等人 Nat Rev Drug Discov (2014) 13:828-51)。
綜合而言，此等研究結果表明，KRAS突變在人類癌症中起關鍵作用；因此，開發靶向突變KRAS之抑制劑可用於臨床治療以KRAS突變為特徵之疾病。
本發明尤其提供式I化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中組成變數在本文中進行定義。
本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含本發明之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，及至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
本發明進一步提供抑制KRAS活性之方法，其包含向個體投與本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。本發明亦提供本文所描述之化合物之用途，其用於製造用於療法之藥劑。本發明亦提供用於療法之本文所描述之化合物。
本發明進一步提供治療患者之疾病或病症之方法，其包含向該患者投與治療有效量之本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
相關申請案本申請案主張2021年10月1日申請之美國臨時申請案第63/261,982號之優先權，該臨時申請案之全部內容以全文引用之方式併入本文中。
化合物 在一態樣中，本文提供一種具有式I之化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： R 1係選自Cl、CH 3、CH 2F、CHF 2及CF 3； Cy 1係選自 R 2係選自F及Cl； R 3係選自 及， Cy 2係選自 其限制條件為式I化合物不為
8-(1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈；
8-(1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-((E)-4-甲氧基丁-2-烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈；
2-((2S,4S)-4-(7-(5,6-二甲基-1H-吲唑-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-2-基)乙腈；
2-((2S,4S)-1-(丁-2-炔醯基)-4-(7-(5,6-二甲基-1H-吲唑-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)哌啶-2-基)乙腈；及
2-((2S,4S)-4-(7-(5,6-二甲基-1H-吲唑-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-1-((E)-4-甲氧基丁-2-烯醯基)哌啶-2-基)乙腈。
在一實施例或式I，或其醫藥學上可接受之鹽中， R 1係選自Cl、CH 2F、CHF 2及CF 3； Cy 1係選自 R 2係選自F及Cl； R 3係選自 及， Cy 2係選自
在另一實施例或式I，或其醫藥學上可接受之鹽中， R 1為Cl； Cy 1係選自 R 2為F； R 3為 及， Cy 2係選自
在式I或其醫藥學上可接受之鹽之一實施例中，R 1係選自Cl、CH 2F、CHF 2及CF 3。在又一實施例中，R 1係選自CH 3、CH 2F、CHF 2及CF 3。在再一實施例中，R 1係選自Cl、CH 3及CF 3。
在式I或其醫藥學上可接受之鹽之一實施例中，R 1係選自CH 2F、CHF 2及CF 3。在另一實施例中，R 1係選自Cl及CH 3。在又一實施例中，R 1係選自Cl及CF 3。在再一實施例中，R 1係選自CH 3及CF 3。
在式I或其醫藥學上可接受之鹽之一實施例中，R 1為Cl。在另一實施例中，R 1為CH 3。在又一實施例中，R 1為CH 2F。在再一實施例中，R 1為CHF 2。在一實施例中，R 1為CF 3。
在式I或其醫藥學上可接受之鹽之一實施例中，Cy 1係選自Cy 1-a及Cy 1-b。在另一實施例中，Cy 1係選自Cy 1-a及Cy 1-c。在又一實施例中，R 1係選自Cy 1-b及Cy 1-c。
在式I或其醫藥學上可接受之鹽之一實施例中，Cy 1為Cy1-a。在另一實施例中，Cy 1為Cy 1-b。在另一實施例中，Cy 1為Cy 1-c。
在式I或其醫藥學上可接受之鹽之一實施例中，R 2為F。在另一實施例中，R 2為Cl。
在式I或其醫藥學上可接受之鹽之一實施例中，R 3為R 3-a。在另一實施例中，R 3為R 3-b。
在式I或其醫藥學上可接受之鹽之一實施例中，Cy 2係選自Cy 2-a及Cy 2-b。在另一實施例中，Cy 2係選自Cy 2-a及Cy 2-c。在另一實施例中，Cy 2係選自Cy 2-b及Cy 2-c。在另一實施例中，Cy 2為Cy 2-a。在又一實施例中，Cy 2為Cy 2-b。在再一實施例中，Cy 2為Cy 2-c。
在式I或其醫藥學上可接受之鹽之一實施例中，Cy 1為Cy 1-a且Cy 2為Cy 2-a。
在式I或其醫藥學上可接受之鹽之一實施例中，式I化合物不為
8-(1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈；
8-(1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-((E)-4-甲氧基丁-2-烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈；
2-((2S,4S)-4-(7-(5,6-二甲基-1H-吲唑-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-2-基)乙腈；
2-((2S,4S)-1-(丁-2-炔醯基)-4-(7-(5,6-二甲基-1H-吲唑-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)哌啶-2-基)乙腈；及
2-((2S,4S)-4-(7-(5,6-二甲基-1H-吲唑-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-1-((E)-4-甲氧基丁-2-烯醯基)哌啶-2-基)乙腈。
在一實施例中，式I化合物係選自 1-(1-((2S,4S)-1-(丁-2-炔醯基)-2-(氰基甲基)哌啶-4-基)-8-氯-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)異喹啉-8-甲腈； 1-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-((E)-4-甲氧基丁-2-烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)異喹啉-8-甲腈； 1-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)異喹啉-8-甲腈； 2-((2S,4S)-4-(8-氯-7-(5,6-二甲基-1H-吲唑-4-基)-4-(3-(乙基(甲基)胺基)氮雜環丁烷-1-基)-6-氟-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-2-基)乙腈； 8-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈； 8-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-((E)-4-甲氧基丁-2-烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈；及 8-(1-((2S,4S)-1-(丁-2-炔醯基)-2-(氰基甲基)哌啶-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈； 或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，式I化合物係選自 1-(1-((2S,4S)-1-(丁-2-炔醯基)-2-(氰基甲基)哌啶-4-基)-8-氯-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)異喹啉-8-甲腈； 1-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-((E)-4-甲氧基丁-2-烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)異喹啉-8-甲腈； 1-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)異喹啉-8-甲腈； 2-((2S,4S)-4-(8-氯-7-(5,6-二甲基-1H-吲唑-4-基)-4-(3-(乙基(甲基)胺基)氮雜環丁烷-1-基)-6-氟-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-2-基)乙腈； 8-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈；及 8-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-((E)-4-甲氧基丁-2-烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈； 或其醫藥學上可接受之鹽。
在又一實施例中，式I化合物為8-(1-((2S,4S)-1-(丁-2-炔醯基)-2-(氰基甲基)哌啶-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈，或其醫藥學上可接受之鹽。
在再一實施例中，式I化合物為1-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)異喹啉-8-甲腈，或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本文中各式之化合物為該等式之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
應進一步瞭解，為了清楚起見而在各別實施例之上下文中描述的本發明之某些特徵亦可以組合形式提供於單一實施例中(同時實施例意欲如同以多重相關形式書寫一般組合)。相反，為了簡潔起見而在單一實施例之上下文中描述的本發明之各種特徵亦可分別或以任何適合的子組合形式提供。因此，考慮到作為式I化合物之實施例所描述的特徵可以任何適合的組合形式組合。
在某些地方，定義或實施例係指特定環(例如，氮雜環丁烷環、吡啶環等)。除非另外指示，否則此等環可連接至任何環成員，其限制條件為不超出原子之價數。舉例而言，氮雜環丁烷環可在環之任何位置處連接，而氮雜環丁烷-3-基環在3-位置處連接。
本文所描述之化合物可為不對稱的(例如具有一或多個立構中心)。除非另外指明，否則意指所有立體異構體，諸如對映異構體及非對映異構體。含有經不對稱取代之碳原子的本發明之化合物可以光學活性或外消旋形式分離。關於如何自光學非活性起始物質製備光學活性形式之方法為此項技術中已知的，諸如藉由解析外消旋混合物或藉由立體選擇性合成。烯烴、C=N雙鍵及其類似者之許多幾何異構體亦可存在於本文所描述之化合物中，且本發明中考慮了所有此類穩定的異構體。本發明化合物之順式及反式幾何異構體已描述且可以異構體混合物形式或以經分離之異構體形式分離。
化合物之外消旋混合物之解析可藉由此項技術中已知之許多方法中的任一者來進行。一種方法包括使用對掌性解析酸進行分步再結晶，該對掌性解析酸為光學活性成鹽有機酸。適用於分步再結晶方法之解析劑為例如光學活性酸，諸如酒石酸之D及L形式、二乙醯基酒石酸、二苯甲醯基酒石酸、杏仁酸、蘋果酸、乳酸或各種光學活性樟腦磺酸，諸如β-樟腦磺酸。適用於分步結晶方法之其他解析劑包括α-甲基苯甲胺(例如 S及 R形式或非對映異構純形式)、2-苯基甘胺醇、降麻黃鹼(norephedrine)、麻黃鹼(ephedrine)、 N-甲基麻黃鹼、環己基乙胺、1,2-二胺基環己烷及其類似物之立體異構純形式。
外消旋混合物之解析亦可藉由在裝填有光學活性解析劑(例如二硝基苯甲醯基苯基甘胺酸)之管柱上溶離來進行。適合的溶離溶劑組合物可藉由熟習此項技術者來確定。
在一些實施例中，本發明化合物具有( R)-組態。在其他實施例中，該等化合物具有( S)-組態。在具有超過一個對掌性中心之化合物中，除非另外指示，否則化合物中之各對掌性中心可獨立地為( R)或( S)。
本發明之化合物亦包括互變異構形式。互變異構形式由單鍵與相鄰雙鍵之交換以及伴隨之質子遷移而產生。互變異構形式包括質子轉移互變異構體，其為具有相同經驗式及總電荷之異構質子化狀態。例示性質子轉移互變異構體包括酮-烯醇對、醯胺-亞胺酸對、內醯胺-內醯亞胺對、烯胺-亞胺對及其中質子可佔據雜環系統之兩個或更多個位置的環形形式，例如1 H-咪唑及3 H-咪唑、1 H-1,2,4-三唑、2 H-1,2,4-三唑及4 H-1,2,4-三唑、1 H-異吲哚及2 H-異吲哚以及1 H-吡唑及2 H-吡唑。互變異構形式可處於平衡狀態或藉由適當取代而在空間上鎖定為一種形式。
本發明之化合物亦可包括中間物或最終化合物中出現之原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子數但質量數不同之彼等原子。舉例而言，氫之同位素包括氚及氘。本發明之化合物之一或多個組成原子可經天然或非天然豐度的原子同位素置換或取代。在一些實施例中，化合物包括至少一個氘原子。舉例而言，本發明之化合物中之一或多個氫原子可經氘置換或取代。在一些實施例中，化合物包括兩個或更多個氘原子。在一些實施例中，化合物包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個氘原子。將同位素包括於有機化合物中之合成方法係此項技術中已知的(Alan F. Thomas之Deuterium Labeling in Organic Chemistry, New York, N.Y., Appleton-Century-Crofts, 1971；Jens Atzrodt, Volker Derdau, Thorsten Fey及Jochen Zimmermann之The Renaissance of H/D Exchange, Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 7744-7765；James R. Hanson之The Organic Chemistry of Isotopic Labelling, Royal Society of Chemistry, 2011)。經同位素標記之化合物可用於各種研究中，諸如NMR光譜法、代謝實驗及/或分析。
用較重同位素，諸如氘進行之取代可得到由更大的代謝穩定性產生之某些治療優勢，例如延長之活體內半衰期或降低之劑量需求，且因此在某些情況下可為較佳的。(A. Kerekes等人 J. Med. Chem. 2011, 54, 201-210; R. Xu等人 J. Label Compd. Radiopharm. 2015, 58, 308-312)。
如本文所使用，術語「化合物」意欲包括所描繪結構之所有立體異構體、幾何異構體、互變異構體及同位素。術語亦意指以任何方式製備，例如以合成方式、經由生物過程(例如，代謝或酶轉化)或其組合製備之本發明之化合物。
所有化合物及其醫藥學上可接受之鹽可與諸如水及溶劑之其他物質一起存在(例如水合物及溶劑合物)或可經分離。當處於固態時，本文所描述之化合物及其鹽可以各種形式存在，且可例如採取包括水合物在內之溶劑合物的形式。化合物可呈任何固態形式，諸如多晶型物或溶劑合物，因此除非另外明確指示，否則本說明書中對化合物及其鹽之提及應理解為涵蓋化合物之任何固態形式。
在一些實施例中，實質上分離本發明之化合物或其鹽。「實質上經分離」意指該化合物至少部分或實質上與其形成或偵測所在之環境分離。部分分離可包括例如富含本發明之化合物的組合物。實質分離可包括含有至少約50重量%、至少約60重量%、至少約70重量%、至少約80重量%、至少約90重量%、至少約95重量%、至少約97重量%或至少約99重量%之本發明之化合物或其鹽的組合物。
片語「醫藥學上可接受」在本文中用於指彼等化合物、物質、組合物及/或劑型在合理醫學判斷範疇內，適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症、與合理益處/風險比相稱。
如本文所使用，表述「環境溫度」及「室溫」為此項技術中所理解的，且通常指溫度，例如反應溫度，其約為進行反應之房間的溫度，例如約20℃至約30℃之溫度。
本發明亦包括本文中所描述之化合物的醫藥學上可接受之鹽。術語「醫藥學上可接受之鹽」係指所揭示化合物之衍生物，其中母體化合物藉由將現有酸或鹼部分轉化為其鹽形式而經修飾。醫藥學上可接受之鹽之實例包括但不限於諸如胺之鹼性殘基之無機酸鹽或有機酸鹽；諸如羧酸之酸性殘基之鹼金屬鹽或有機鹽；及其類似鹽。本發明之醫藥學上可接受之鹽包括例如由無毒性無機酸或有機酸形成之母體化合物的無毒性鹽。本發明之醫藥學上可接受之鹽可藉由習知化學方法自含有鹼性或酸性部分之母體化合物合成。一般而言，此類鹽可藉由使游離酸或鹼形式之此等化合物與化學計算量之適當鹼或酸於水中或於有機溶劑中或於兩者之混合物中反應來製備；一般而言，非水性介質，如醚、乙酸乙酯、醇(例如，甲醇、乙醇、異丙醇或丁醇)或乙腈(MeCN)為較佳的。適合的鹽之清單見於 Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, (Mack Publishing Company, Easton, 1985), 第1418頁；Berge 等人, J. Pharm. Sci., 1977, 66(1), 1-19；及Stahl 等人, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, (Wiley, 2002)中。在一些實施例中，本文中所描述之化合物包括N-氧化物形式。
合成 本發明之化合物，包括其鹽可使用已知有機合成技術製備，且可根據諸多可能合成途徑中之任一者合成，諸如下文流程中之彼等途徑。
用於製備本發明化合物之反應可在熟習有機合成技術者易於選擇的適合溶劑中進行。在進行反應之溫度下，例如可在溶劑結冰溫度至溶劑沸騰溫度範圍內之溫度，適合溶劑可與起始材料(反應物)、中間物或產物實質上不反應。指定反應可在一種溶劑或超過一種溶劑之混合物中進行。視特定反應步驟而定，適用於特定反應步驟之溶劑可藉由熟習此項技術者選擇。
本發明之化合物的製備可涉及各種化學基團之保護及脫除保護。對保護及脫除保護之需求及對適當保護基之選擇可易於由熟習此項技術者確定。保護基之化學描述於例如Kocienski, Protecting Groups, (Thieme, 2007)；Robertson, Protecting Group Chemistry, (Oxford University Press, 2000)；Smith 等人, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 第6版(Wiley, 2007)；Peturssion 等人, 「Protecting Groups in Carbohydrate Chemistry」, J. Chem. Educ., 1997, 74(11), 1297；及Wuts 等人, Protective Groups in Organic Synthesis, 第4版, (Wiley, 2006)中。
反應可根據此項技術中已知的任何適合方法來進行監測。舉例而言，產物形成可藉由光譜手段，諸如核磁共振光譜法(例如 1H或 13C)、紅外光譜法、分光光度法(例如UV-可見)、質譜或藉由層析法，諸如高效液相層析(HPLC)或薄層層析(TLC)進行監測。
以下流程提供關於製備本發明之化合物的一般指導。熟習此項技術者將理解，可使用有機化學之常識修改或最佳化流程中所展示之製備，以製備各種本發明之化合物。 流程 1
式 1-17之化合物可經由流程1中所概述之合成途徑製備。在乙醇中用H 2SO 4酯化市售起始物質 1-1。用諸如 N-氯丁二醯亞胺(NCS)之適當試劑使化合物 1-2鹵化，得到中間物 1-3(Hal為鹵化物，諸如F、Cl、Br或I)。可藉由用諸如乙基丙二醯氯( 1-4)之試劑處理 1-3來製備化合物 1-5。中間物 1-5可進行環化反應(諸如乙醇中之乙醇鈉)以提供化合物 1-6，其可用適當試劑(例如POCl 3)處理，得到化合物 1-7。可進行中間物 1-7與胺 1-8(PG為適當保護基，諸如Boc)之縮合以產生化合物 1-9。用還原劑(諸如DIBAL)還原酯，隨後用氧化劑(諸如戴斯-馬丁高碘烷(Dess-Martin periodinane))氧化中間物，得到醛 1-10。用鹽酸羥胺及吡啶處理中間物 1-10，得到化合物 1-11。中間物 1-11可進行環化反應(諸如甲磺醯氯、胺基吡啶於DCM中)，以提供化合物 1-12。 1-13中之R 3基團可隨後經由適合轉化(諸如S NAr反應或偶合反應)安裝。中間物 1-13可首先進行保護基PG之脫除保護，隨後對所得胺進行官能化(諸如與酸氯化物，例如丙烯醯氯偶合)，隨後得到化合物 1-14。 1-14之鹵素(Hal)可視情況經由過渡金屬介導之偶合或其他適合方法轉化成R 2以獲得 1-15。接著，可藉由在標準鈴木(Suzuki)交叉偶合條件下(例如，在鈀催化劑及適合的鹼之存在下)，或在標準施蒂勒(Stille)交叉偶合條件下(例如，在鈀催化劑之存在下)，或在標準根岸(Negishi)交叉偶合條件下(例如，在鈀催化劑之存在下)，使 1-15與式 1-16之加合物之間發生交叉偶合反應來製備所需產物 1-17，其中M為酸(boronic acid)、酸酯或經適當取代之金屬(例如，M為B(OR) 2、Sn(烷基) 3或Zn-Hal)。上文所描述之化學反應之次序可按需要重新配置以適合不同類似物之製備。
KRAS 蛋白Ras家族由三個成員構成：KRAS、NRAS及HRAS。RAS突變型癌症占人類癌症之約25%。KRAS為人類癌症中最常突變之同功異型物：所有RAS突變中之85%在KRAS中，12%在NRAS中，且3%在HRAS中(Simanshu, D等人 Cell 170.1 (2017):17-33)。KRAS突變在前三種最致命的癌症類型中普遍存在：胰臟癌(97%)、大腸直腸癌(44%)及肺癌(30%) (Cox, A.D.等人 Nat Rev Drug Discov (2014) 13:828-51)。大部分RAS突變出現在胺基酸殘基/密碼子12、13及61處；密碼子12突變在KRAS中最常見。特定突變之頻率在RAS基因之間變化，且G12D突變在KRAS中最占主導，而Q61R及G12R突變在NRAS及HRAS中最常見。此外，RAS同功異型物中的突變譜在癌症類型之間有所不同。舉例而言，KRAS G12D突變在胰臟癌(51%)中占主導，其次是大腸直腸腺癌(45%)及肺癌(17%) (Cox, A.D.等人Nat Rev Drug Discov (2014) 13:828-51)。相比之下，KRAS G12C突變分別在非小細胞肺癌(NSCLC)，包含11-16%之肺腺癌(近一半突變KRAS為G12C)，以及2-5%之胰臟及大腸直腸腺癌中占主導(Cox, A.D.等人 Nat. Rev. Drug Discov. (2014) 13:828-51)。使用shRNA阻斷跨數百個癌細胞株之數千個基因，基因體研究已證明，展現KRAS突變之癌細胞高度依賴於KRAS功能來實現細胞生長(McDonald, R.等人 Cell 170 (2017): 577-592)。綜合而言，此等研究結果表明，KRAS突變在人類癌症中起關鍵作用；因此，開發靶向突變KRAS之抑制劑可用於臨床治療以KRAS突變為特徵之疾病。
使用方法涉及具有G12C、G12V及G12D突變之KRAS的癌症類型包括但不限於：癌瘤(例如胰臟癌、大腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、乳癌、頭頸癌、子宮頸皮膚癌、甲狀腺癌)；造血性惡性病(例如骨髓增生性贅瘤(MPN)、骨髓發育不良症候群(MDS)、慢性及幼年型骨髓單核球性白血病(CMML及JMML)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴球性白血病(ALL)及多發性骨髓瘤(MM))；及其他贅瘤(例如神經膠質母細胞瘤及肉瘤)。另外，在抗EGFR療法之獲得性耐藥中發現KRAS突變(Knickelbein, K.等人 Genes & Cancer, (2015): 4-12)。KRAS突變係在免疫及發炎性病症中發現(Fernandez-Medarde, A.等人 Genes & Cancer, (2011): 344-358)，諸如由KRAS或NRAS之體細胞突變引起的Ras相關淋巴增生性病症(RALD)或幼年型骨髓單核球性白血病(JMML)。
本發明之化合物可抑制KRAS蛋白之活性。舉例而言，本發明之化合物可用於藉由向細胞、個體或患者投與抑制量之一或多種本發明之化合物來抑制細胞或需要抑制酶之個體或患者中KRAS之活性。
作為KRAS抑制劑，本發明之化合物可用於治療與KRAS之異常表現或活性相關之各種疾病。抑制KRAS之化合物將可用於提供一種在腫瘤中預防生長或誘導細胞凋亡或藉由抑制血管生成之手段。因此，預期本發明之化合物將證明可用於治療或預防增生性病症，諸如癌症。特定言之，具有受體酪胺酸激酶之活化突變體或受體酪胺酸激酶上調之腫瘤可對抑制劑特別敏感。
在一態樣中，本文提供一種抑制KRAS活性之方法，該方法包含使本發明之化合物與KRAS接觸。在一實施例中，接觸包含向患者投與化合物。
在一態樣中，本文提供一種抑制具有G12C突變之KRAS蛋白之方法，該方法包含使本發明之化合物與KRAS接觸。
在一態樣中，本文提供一種抑制具有G12D突變之KRAS蛋白的方法，該方法包含使本發明之化合物與KRAS接觸。
在一態樣中，本文提供一種抑制具有G12V突變之KRAS蛋白的方法，該方法包含使本發明之化合物與KRAS接觸。
在另一態樣中，本文提供一種治療與抑制KRAS相互作用相關之疾病或病症的方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量之本文所揭示之任一式之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在又一態樣中，本文提供一種治療與抑制具有G12C突變之KRAS蛋白相關之疾病或病症的方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量之本文所揭示之任一式之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在再一態樣中，本文亦提供一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包含向該患者投與治療有效量之本文所揭示之化合物，其中該癌症之特徵在於與具有G12C突變之KRAS蛋白相互作用。
在又一態樣中，本文提供一種治療與抑制具有G12D突變之KRAS蛋白相關之疾病或病症的方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量之本文所揭示之任一式之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在再一態樣中，本文亦提供一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包含向該患者投與治療有效量之本文所揭示之化合物，其中該癌症之特徵在於與具有G12D突變之KRAS蛋白相互作用。
在又一態樣中，本文提供一種治療與抑制具有G12V突變之KRAS蛋白相關之疾病或病症的方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量之本文所揭示之任一式之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在再一態樣中，本文亦提供一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包含向該患者投與治療有效量之本文所揭示之化合物，其中該癌症之特徵在於與具有G12V突變之KRAS蛋白相互作用。
在又一態樣中，本文提供一種治療患者之癌症的方法，該方法包含向該患者投與治療有效量之本文所揭示之任一化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在一態樣中，本文提供一種治療有需要之患者之與抑制KRAS相互作用或其突變體相關之疾病或病症的方法，該方法包含以下步驟：向該患者投與本文所揭示之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，或包含本文所揭示之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的組合物，與如本文所描述之另一療法或治療劑組合。
在一實施例中，疾病或病症為免疫或發炎性病症。在另一實施例中，免疫或發炎性病症係由KRAS之體細胞突變引起之Ras相關淋巴增生性病症及幼年型骨髓單核球性白血病。
在一個實施例中，癌症係選自血液癌、肉瘤、肺癌、胃腸道癌、泌尿生殖道癌、肝癌、骨癌、神經系統癌症、婦科癌症及皮膚癌。
在另一實施例中，癌症係選自癌瘤、血液癌、肉瘤及神經膠質母細胞瘤。
在又一實施例中，血液癌係選自骨髓增生性贅瘤、骨髓發育不良症候群、慢性及幼年型骨髓單核球性白血病、急性骨髓性白血病、急性淋巴球性白血病及多發性骨髓瘤。
在再一實施例中，癌瘤係選自胰臟癌、大腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、乳癌、頭頸癌、子宮頸癌、皮膚癌及甲狀腺癌。
在另一實施例中，肺癌係選自非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌、支氣管癌瘤、鱗狀細胞支氣管癌瘤、未分化小細胞支氣管癌瘤、未分化大細胞支氣管癌瘤、腺癌瘤、支氣管癌瘤、肺泡癌瘤、細支氣管癌瘤、支氣管腺瘤、軟骨瘤性錯構瘤、間皮瘤、小細胞及非小細胞癌瘤、支氣管腺瘤及胸膜肺母細胞瘤。
在又一實施例中，肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)。在再一實施例中，肺癌為腺癌。
在一實施例中，胃腸道癌係選自食道鱗狀細胞癌、食道腺癌、食道平滑肌肉瘤、食道淋巴瘤、胃癌瘤、胃淋巴瘤、胃平滑肌肉瘤、外分泌胰臟癌、胰管腺癌、胰臟胰島素瘤、胰臟升糖素瘤、胰臟胃泌素瘤、胰臟類癌瘤、胰臟VIP瘤、小腸腺癌、小腸淋巴瘤、小腸類癌瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、小腸平滑肌瘤、小腸血管瘤、小腸脂肪瘤、小腸神經纖維瘤、小腸纖維瘤、大腸腺癌、大腸管狀腺瘤、大腸絨毛狀腺瘤、大腸錯構瘤、大腸平滑肌瘤、大腸直腸癌、膽囊癌及肛門癌。
在一實施例中，胃腸道癌為大腸直腸癌。
在另一實施例中，癌症為癌瘤。在又一實施例中，癌瘤係選自胰臟癌瘤、大腸直腸癌瘤、肺癌瘤、膀胱癌瘤、胃癌瘤、食道癌瘤、乳癌瘤、頭頸癌瘤、子宮頸皮膚癌瘤及甲狀腺癌瘤。
在再一實施例中，癌症為造血系統惡性腫瘤。在一實施例中，造血系統惡性腫瘤係選自多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病及骨髓增生性贅瘤。
在另一實施例中，癌症為贅瘤。在又一實施例中，贅瘤為神經膠質母細胞瘤或肉瘤。
在某些實施例中，本發明提供一種治療有需要之患者之KRAS介導之病症的方法，其包含以下步驟：向該患者投與根據本發明之化合物或其醫藥學上可接受之組合物。
在一些實施例中，可使用本發明化合物治療之疾病及適應症包括但不限於血液癌、肉瘤、肺癌、胃腸道癌、泌尿生殖道癌、肝癌、骨癌、神經系統癌、婦科癌及皮膚癌。
例示性血液癌包括淋巴瘤及白血病，諸如急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性前髓細胞性白血病(APL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、套細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(包括復發性或難治性NHL及復發性濾泡性淋巴瘤)、霍奇金氏淋巴瘤、骨髓增生性疾病(例如原發性骨髓纖維化(PMF)、真性紅血球增多症(PV)、自發性血小板增多症(ET)、8p11骨髓增生性症候群、骨髓發育不良症候群(MDS)、T細胞急性淋巴母細胞淋巴瘤(T-ALL)、多發性骨髓瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、成人T細胞白血病、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglubulinemia)、毛狀細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、慢性骨髓性淋巴瘤及伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)。
例示性肉瘤包括軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤、纖維肉瘤、脂肉瘤、黏液瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、纖維瘤、脂肪瘤、錯構瘤、淋巴肉瘤、平滑肌肉瘤及畸胎瘤。
例示性肺癌包括非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌、支氣管癌瘤(鱗狀細胞癌、未分化小細胞癌、未分化大細胞癌、腺癌瘤)、肺泡癌瘤(細支氣管癌瘤)、支氣管腺瘤、軟骨錯構瘤、間皮瘤、小細胞及非小細胞癌瘤、支氣管腺瘤及胸膜肺母細胞瘤。
例示性胃腸道癌包括食道癌(鱗狀細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃癌(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰臟癌(外分泌胰臟癌、導管腺癌、胰島素瘤、升糖素瘤、胃泌素瘤、類癌瘤、VIP瘤)、小腸癌(腺癌、淋巴瘤、類癌瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神經纖維瘤、纖維瘤)、大腸癌(腺癌、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯構瘤、平滑肌瘤)、大腸直腸癌、膽囊癌及肛門癌。
例示性泌尿生殖道癌包括腎癌(腺癌、威姆氏腫瘤(Wilm's tumor)[腎胚細胞瘤]、腎細胞癌瘤)、膀胱及尿道癌(鱗狀細胞癌瘤、移行細胞癌瘤、腺癌瘤)、前列腺癌(腺癌瘤、肉瘤)、睾丸癌(精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌瘤、畸胎上皮癌瘤、絨膜癌瘤、肉瘤、間質細胞癌瘤、纖維瘤、纖維腺瘤、腺瘤樣瘤、脂肪瘤)及尿道上皮癌瘤。
例示性肝癌包括肝癌(肝細胞癌瘤)、膽管癌瘤、肝母細胞瘤、血管肉瘤、肝細胞腺瘤及血管瘤。
例示性骨癌包括例如骨原性肉瘤(骨肉瘤)、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性淋巴瘤(網狀細胞肉瘤)、多發性骨髓瘤、惡性巨細胞瘤脊索瘤、骨軟骨瘤(骨軟骨外生骨疣)、良性軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨黏液性纖維瘤、骨樣骨瘤及巨細胞腫瘤。
例示性神經系統癌包括顱骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽腫、黃瘤、畸形性骨炎)、腦膜癌(脊膜瘤、脊膜肉瘤、神經膠瘤病)、腦癌(星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤(meduoblastoma)、神經膠質瘤、室管膜瘤、胚細胞瘤(松果體瘤)、神經膠質母細胞瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、少突神經膠質瘤、神經鞘瘤、視網膜母細胞瘤、先天性腫瘤、神經外胚層腫瘤)及脊髓癌(神經纖維瘤、脊膜瘤、神經膠質瘤、肉瘤)、神經母細胞瘤、萊爾米特-杜多斯病(Lhermitte-Duclos disease)及松果體腫瘤。
例示性婦科癌包括乳癌(導管癌瘤、小葉癌瘤、乳房肉瘤、三陰性乳癌、HER2陽性乳癌、發炎性乳癌、乳頭狀癌瘤)、子宮癌(子宮內膜癌瘤)、子宮頸癌(子宮頸癌瘤、腫瘤前子宮頸發育不良)、卵巢癌(卵巢癌瘤(漿液性囊腺癌瘤、黏液性囊腺癌瘤、未分類癌瘤)、顆粒性膜細胞瘤、塞特利氏-萊迪希氏(Sertoli-Leydig)細胞瘤、無性細胞瘤、惡性畸胎瘤)、外陰癌(鱗狀細胞癌瘤、上皮內癌瘤、腺癌瘤、纖維肉瘤、黑色素瘤)、陰道癌(透明細胞癌瘤、鱗狀細胞癌瘤、葡萄樣肉瘤(胚胎性橫紋肌肉瘤)及輸卵管癌(癌瘤)。
例示性皮膚癌包括黑色素瘤、基底細胞癌瘤、鱗狀細胞癌瘤、卡波西氏肉瘤、梅克爾細胞皮膚癌(Merkel cell skin cancer)、發育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤及瘢痕瘤。
例示性頭頸癌包括神經膠質母細胞瘤、黑色素瘤、橫紋肌肉瘤、淋巴肉瘤、骨肉瘤、鱗狀細胞癌瘤、腺癌瘤、口腔癌、喉癌、鼻咽癌、鼻癌及副鼻癌、甲狀腺癌及副甲狀腺癌、眼部腫瘤、嘴口腫瘤以及鱗狀頭頸癌。
本發明之化合物亦可用於抑制腫瘤轉移。
除致癌贅瘤之外，本發明化合物可用於治療骨骼及軟骨細胞病症，其包括但不限於軟骨發育不全(achrondroplasia)、季肋發育不全(hypochondroplasia)、侏儒症、致死性發育不良(TD) (臨床形式TD I及TD II)、阿帕特症候群(Apert syndrome)、克魯宗症候群(Crouzon syndrome)、傑克遜-外斯症候群(Jackson-Weiss syndrome)、比爾-斯蒂文森螺旋皮膚症候群(Beare-Stevenson cutis gyrate syndrome)、普菲弗症候群(Pfeiffer syndrome)及顱縫封閉過早症候群(craniosynostosis syndrome)。在一些實施例中，本發明提供一種治療患有骨骼及軟骨細胞病症之患者的方法。
在一些實施例中，本文所描述之化合物可用於治療阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、HIV或肺結核。
如本文所使用，術語「8p11骨髓增生性症候群」意指與嗜酸性球增多症及FGFR1異常相關之骨髓/淋巴贅瘤。
如本文所使用，術語「細胞」意指活體外、離體或活體內之細胞。在一些實施例中，離體細胞可為自諸如哺乳動物之有機體切除之組織樣本的一部分。在一些實施例中，活體外細胞可為細胞培養物中之細胞。在一些實施例中，活體內細胞為存活於諸如哺乳動物之有機體中之細胞。
如本文所使用，術語「接觸」係指在活體外系統或活體內系統中將指定部分聚集在一起。舉例而言，使KRAS與本文所描述之化合物「接觸」包括向具有KRAS之個體或患者，諸如人類，投與本文所描述之化合物，以及例如將本文所描述之化合物引入含有細胞或經純化之製劑之樣本中，該細胞或經純化之製劑含有KRAS。
如本文所使用，可互換地使用之術語「個體」、「受試者」或「患者」係指任何動物，包括哺乳動物，較佳為小鼠、大鼠、其他嚙齒動物、兔、犬、貓、豬、牛、綿羊、馬或靈長類動物，且最佳為人類。
如本文所使用，片語「治療有效量」係指在組織、系統、動物、個體或人類中引發由研究人員、獸醫、醫生或其他臨床醫師所尋求之生物或醫學反應之活性化合物或藥劑的量，諸如本文所揭示之任何固體形式或其鹽的量。在任何個別情況下之適當「有效」量可使用熟習此項技術者已知的技術測定。
片語「醫藥學上可接受」在本文中用於指在合理醫學判斷範疇內，適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應、免疫原性或其他問題或併發症、與合理益處/風險比相稱的彼等化合物、物質、組合物及/或劑型。
如本文所使用，片語「醫藥學上可接受之載劑或賦形劑」係指醫藥學上可接受之材料、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、溶劑或囊封材料。賦形劑或載劑一般為安全、無毒的且既不為生物學上不合需要的，亦不為在其他方面不合需要的，且包括可接受用於獸醫學用途以及人類醫藥用途之賦形劑或載劑。在一個實施例中，各組分為如本文中所定義之「醫藥學上可接受的」。參見例如 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21 版 ；Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, Pa, 2005； Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第 6 版 ；Rowe等人編；The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009； Handbook of Pharmaceutical Additives, 第 3 版 ；Ash及Ash編；Gower Publishing Company: 2007； Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 第 2 版 ；Gibson編; CRC Press LLC: Boca Raton, Fla., 2009。
如本文所使用，術語「治療(treating/treatment)」係指抑制疾病；例如抑制正在經歷或呈現疾病、病狀或病症之病變或症狀之個體的疾病、病狀或病症(亦即阻止病變及/或症狀之進一步發展)，或改善疾病；例如改善正在經歷或呈現疾病、病狀或病症之病變或症狀之個體的疾病、病狀或病症(亦即逆轉病變及/或症狀)，諸如降低疾病之嚴重程度。
如本文所使用，術語「預防(prevent/preventing/prevention)」包含預防至少一種與所預防之病狀、疾病或病症相關或由其引起的症狀。
應理解，為了清楚起見而在單獨實施例之上下文中描述的本發明之某些特徵亦可在單一實施例中以組合方式提供(在意欲將實施例組合，如同以多重依賴性方式書寫時)。相反，為了簡潔起見而在單一實施例之上下文中描述的本發明之各種特徵亦可分別或以任何適合的子組合形式提供。
組合療法 I. 癌症療法癌細胞生長及存活可受多個信號傳導路徑之功能障礙影響。因此，組合不同的酶/蛋白/受體抑制劑為有用的，該等抑制劑在其調節活性之目標方面表現出不同的偏好，以治療此類病狀。靶向超過一種信號傳導路徑(或超過一種參與指定信號傳導路徑之生物分子)可降低細胞群體中產生耐藥性之可能性，及/或降低治療之毒性。
一或多種其他醫藥劑，諸如化學治療劑、消炎劑、類固醇、免疫抑制劑、免疫腫瘤劑、代謝酶抑制劑、趨化因子受體抑制劑及磷酸酶抑制劑，以及靶向療法，諸如Bcr-Abl、Flt-3、EGFR、HER2、JAK、c-MET、VEGFR、PDGFR、c-Kit、IGF-1R、RAF、FAK及CDK4/6激酶抑制劑，諸如WO 2006/056399中描述之彼等，可與本發明之化合物組合使用以治療CDK2相關之疾病、病症或病狀。諸如治療抗體之其他藥劑可與本發明之化合物組合使用以治療CDK2相關之疾病、病症或病狀。一或多種其他醫藥劑可同時或依次向患者投與。
在一些實施例中，CDK2抑制劑與BCL2抑制劑或CDK4/6抑制劑組合投與或使用。
如本文所揭示之化合物可與一或多種其他酶/蛋白/受體抑制劑療法組合使用以用於治療疾病，諸如癌症及本文所描述之其他疾病或病症。可用組合療法治療之疾病及適應症之實例包括如本文所描述之疾病及適應症。癌症之實例包括實體腫瘤及非實體腫瘤，諸如液體腫瘤、血癌。感染之實例包括病毒感染、細菌感染、真菌感染或寄生蟲感染。舉例而言，本發明之化合物可與一或多種以下激酶之抑制劑組合以用於治療癌症：Akt1、Akt2、Akt3、BCL2、CDK4/6、TGF-βR、PKA、PKG、PKC、CaM激酶、磷酸酶激酶、MEKK、ERK、MAPK、mTOR、EGFR、HER2、HER3、HER4、INS-R、IDH2、IGF-1R、IR-R、PDGF　R、PDGF　R、PI3K (α、β、γ、δ及多重或選擇性的)、CSF1R、KIT、FLK-II、KDR/FLK-1、FLK-4、flt-1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c-Met、PARP、Ron、Sea、TRKA、TRKB、TRKC、TAM激酶(Axl、Mer、Tyro3)、FLT3、VEGFR/Flt2、Flt4、EphA1、EphA2、EphA3、EphB2、EphB4、Tie2、Src、Fyn、Lck、Fgr、Btk、Fak、SYK、FRK、JAK、ABL、ALK及B-Raf。在一些實施例中，本發明之化合物可與一或多種以下抑制劑組合以用於治療癌症或感染。可與本發明之化合物組合用於治療癌症及感染之抑制劑的非限制性實例包括FGFR抑制劑(FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4，例如培米加替尼(pemigatinib) (INCB54828)、INCB62079)、EGFR抑制劑(亦稱為ErB-1或HER-1；例如埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、奧希替尼(osimertinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、耐昔妥珠單抗(necitumumab)或帕尼單抗(panitumumab))、VEGFR抑制劑或路徑阻斷劑(例如貝伐單抗(bevacizumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、阿西替尼(axitinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、普納替尼(ponatinib)、卡博替尼(cabozantinib)、凡德他尼(vandetanib)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、樂伐替尼(lenvatinib)、阿柏西普(ziv-aflibercept))、PARP 抑制劑(例如，奧拉帕尼(olaparib)、盧卡帕尼(rucaparib)、維利帕尼(veliparib)或尼拉帕尼(niraparib))、JAK抑制劑(JAK1及/或JAK2；例如魯索替尼(ruxolitinib)或巴瑞替尼(baricitinib)；或JAK1；例如伊他替尼(itacitinib) (INCB39110)、INCB052793或INCB054707)、IDO抑制劑(例如艾卡哚司他(epacadostat)、NLG919或BMS-986205、MK7162)、LSD1抑制劑(例如GSK2979552、INCB59872及INCB60003)、TDO抑制劑、PI3K-δ抑制劑(例如帕薩利西布(parsaclisib) (INCB50465)或INCB50797)、PI3K-γ抑制劑諸如PI3K-γ選擇性抑制劑、Pim抑制劑(例如INCB53914)、CSF1R抑制劑、TAM受體酪胺酸激酶(Tyro-3、Axl及Mer；例如INCB081776)、腺苷受體拮抗劑(例如A2a/A2b受體拮抗劑)、HPK1抑制劑、趨化因子受體抑制劑(例如CCR2或CCR5抑制劑)、SHP1/2磷酸酶抑制劑、組蛋白脫乙醯基酶抑制劑(HDAC)諸如HDAC8抑制劑、血管生成抑制劑、介白素受體抑制劑、溴及額外末端家族成員抑制劑(例如溴結構域抑制劑或BET抑制劑諸如INCB54329及INCB57643)、c-MET抑制劑(例如卡馬替尼(capmatinib))、抗CD19抗體(例如他法西他單抗(tafasitamab))、ALK2抑制劑(例如INCB00928)；或其組合。
在一些實施例中，本文所描述之化合物或鹽係與PI3Kδ抑制劑一起投與。在一些實施例中，本文所描述之化合物或鹽係與JAK抑制劑一起投與。在一些實施例中，本文所描述之化合物或鹽係與JAK1或JAK2抑制劑(例如巴瑞替尼或魯索替尼)一起投與。在一些實施例中，本文所描述之化合物或鹽係與JAK1抑制劑一起投與。在一些實施例中，本文所描述之化合物或鹽係與JAK1抑制劑一起投與，該抑制劑相對於JAK2具有選擇性。
組合療法中使用之例示性抗體包括但不限於曲妥珠單抗(trastuzumab) (例如抗HER2)、雷尼株單抗(ranibizumab) (例如抗VEGF-A)、貝伐單抗(AVASTIN TM，例如抗VEGF)、帕尼單抗(例如抗EGFR)、西妥昔單抗(例如抗EGFR)、美羅華(rituxan) (例如抗CD20)及針對c-MET之抗體。
一或多種以下藥劑可與本發明之化合物組合使用且作為非限制性清單呈現：細胞生長抑制劑、順鉑(cisplatin)、小紅莓(doxorubicin)、克癌易(taxotere)、紫杉醇(taxol)、依託泊苷(etoposide)、伊立替康(irinotecan)、坎普托沙(camptosar)、拓樸替康(topotecan)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、埃博黴素(epothilones)、他莫昔芬(tamoxifen)、5-氟尿嘧啶、甲胺喋呤、替莫唑胺(temozolomide)、環磷醯胺、SCH 66336、R115777、L778,123、BMS 214662、IRESSA TM(吉非替尼(gefitinib))、TARCEVA TM(埃羅替尼(erlotinib))、EGFR抗體、內含子、ara-C、阿德力黴素(adriamycin)、環磷醯胺、吉西他濱(gemcitabine)、尿嘧啶芥、氮芥、異環磷醯胺、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基硫代磷胺、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、鏈脲菌素(streptozocin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、氟達拉賓磷酸鹽、奧沙利鉑(oxaliplatin)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、ELOXATIN™ (奧沙利鉑)、噴司他丁(pentostatine)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、小紅莓、表柔比星(epirubicin)、艾達黴素(idarubicin)、光神黴素(mithramycin)、去氧助間型黴素(deoxycoformycin)、絲裂黴素-C、L-天冬醯胺酶、替尼泊甙(teniposide) 17.α.-炔雌醇、己烯雌酚、睪固酮、普賴松(Prednisone)、氟羥甲基睪酮(Fluoxymesterone)、屈他雄酮丙酸酯(Dromostanolone propionate)、睾內酯酮(testolactone)、甲地孕酮乙酸酯(megestrolacetate)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)、甲基睪固酮(methyltestosterone)、普賴蘇穠(prednisolone)、曲安西龍(triamcinolone)、氯烯雌醚(chlorotrianisene)、羥孕酮(hydroxyprogesterone)、胺麩精(aminoglutethimide)、雌莫司汀(estramustine)、甲羥孕酮乙酸酯(medroxyprogesteroneacetate)、亮丙瑞林(leuprolide)、氟他胺(flutamide)、托瑞米芬(toremifene)、戈舍瑞林(goserelin)、卡鉑(carboplatin)、羥基尿素(hydroxyurea)、安吖啶(amsacrine)、甲基苄肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、左旋咪唑(levamisole)、諾維本(navelbene)、阿那曲唑(anastrazole)、來曲唑(letrazole)、卡培他濱(capecitabine)、瑞洛薩芬(reloxafine)、著洛薩芬(droloxafine)、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)、阿瓦斯汀(avastin)、HERCEPTIN TM(曲妥珠單抗)、BEXXAR TM(托西莫單抗(tositumomab))、VELCADE TM(硼替佐米(bortezomib))、ZEVALIN TM(替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan))、TRISENOX TM(三氧化二砷)、XELODA TM(卡培他濱)、長春瑞賓、卟吩姆(porfimer)、ERBITUX TM(西妥昔單抗)、噻替派(thiotepa)、六甲蜜胺(altretamine)、美法侖、曲妥珠單抗、來曲唑(lerozole)、氟維司群(fulvestrant)、依西美坦(exemestane)、異環磷醯胺、利妥昔單抗、C225 (西妥昔單抗)、坎帕斯(Campath) (阿侖單抗(alemtuzumab))、氯法拉濱(clofarabine)、克拉屈濱(cladribine)、艾菲地可寧(aphidicolin)、美羅華、舒尼替尼(sunitinib)、達沙替尼(dasatinib)、替紮他濱(tezacitabine)、Sml1、氟達拉賓(fludarabine)、噴司他丁、三安平(triapine)、地多西(didox)、曲美多斯(trimidox)、艾美多(amidox)、3-AP及MDL-101,731。
本發明之化合物可進一步與其他治療癌症之方法組合使用，例如藉由化學療法、輻射療法、腫瘤靶向療法、輔助療法、免疫療法或手術。免疫療法之實例包括細胞介素治療(例如干擾素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)、CRS-207免疫療法、癌症疫苗、單株抗體、雙特異性或多特異性抗體、抗體藥物結合物、過繼T細胞轉移、鐸受體促效劑、RIG-I促效劑、溶瘤病毒療法及免疫調節小分子，包括沙立度胺(thalidomide)或JAK1/2抑制劑、PI3Kδ抑制劑及其類似物。化合物可與一或多種抗癌藥，諸如化學治療劑組合投與。化學治療劑之實例包括以下中之任一者：阿巴瑞克(abarelix)、阿地介白素(aldesleukin)、阿侖單抗、亞利崔托寜(alitretinoin)、異嘌呤醇(allopurinol)、六甲蜜胺、阿那曲唑(anastrozole)、三氧化二砷、天冬醯胺酶、阿紮胞苷(azacitidine)、貝伐單抗(bevacizumab)、貝沙羅汀(bexarotene)、巴瑞替尼、博萊黴素、硼替佐米、白消安靜脈注射、口服白消安、卡魯睾酮(calusterone)、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、西妥昔單抗、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、氯法拉濱、環磷醯胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素、達肝素鈉、達沙替尼、道諾黴素、地西他濱、地尼白介素(denileukin)、地尼白介素(denileukin diftitox)、右雷佐生(dexrazoxane)、多西他賽、小紅莓、屈他雄酮丙酸酯、托西珠單抗(eculizumab)、表柔比星、埃羅替尼、雌莫司汀、磷酸依託泊苷、依託泊苷、依西美坦(exemestane)、檸檬酸芬太尼(fentanyl citrate)、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉賓(fludarabine)、氟尿嘧啶、氟維司群、吉非替尼、吉西他濱、吉妥單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸組胺瑞林(histrelin acetate)、替伊莫單抗、艾達黴素(idarubicin)、異環磷醯胺、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、干擾素α 2a、伊立替康、拉帕替尼(lapatinib)二甲苯磺酸鹽、來那度胺(lenalidomide)、來曲唑、甲醯四氫葉酸、乙酸亮甲瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀(lomustine)、氮芥、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、美法侖、巰基嘌呤、甲胺喋呤、甲氧沙林(methoxsalen)、絲裂黴素C、米托坦、米托蒽醌、苯丙酸諾龍(nandrolone phenpropionate)、奈拉濱(nelarabine)、諾非妥莫單抗(nofetumomab)、奧沙利鉑、太平洋紫杉醇、帕米膦酸鹽、帕尼單抗、培門冬酶(pegaspargase)、派非格司亭(pegfilgrastim)、培美曲塞二鈉(pemetrexed disodium)、噴司他丁、哌泊溴烷、普卡黴素、甲基苄肼、奎納克林(quinacrine)、拉布立酶(rasburicase)、利妥昔單抗、魯索替尼、索拉非尼(sorafenib)、鏈脲菌素(streptozocin)、舒尼替尼、馬來酸舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊甙(teniposide)、睾內酯酮、撒利多胺(thalidomide)、硫鳥嘌呤、噻替派、拓樸替康、托瑞米芬、托西莫單抗、曲妥珠單抗、視網酸(tretinoin)、尿嘧啶芥、伐柔比星(valrubicin)、長春鹼、長春新鹼、長春瑞賓、伏立諾他(vorinostat)及唑來膦酸鹽(zoledronate)。
化學治療劑之額外實例包括蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米)、沙立度胺、雷利米得(revlimid)及DNA損傷劑，諸如美法侖、多柔比星、環磷醯胺、長春新鹼、依託泊苷、卡莫司汀及其類似物。
例示性類固醇包括皮質類固醇，諸如地塞米松(dexamethasone)或普賴松。
例示性Bcr-Abl抑制劑包括甲磺酸伊馬替尼(GLEEVAC™)、尼羅替尼、達沙替尼、伯舒替尼(bosutinib)及普納替尼，及醫藥學上可接受之鹽。適合之Bcr-Abl抑制劑之其他實例包括美國專利第5,521,184號、WO 04/005281及美國序列號60/578,491中所揭示之屬及物種的化合物及其醫藥學上可接受之鹽。
適合之Flt-3抑制劑之實例包括米哚妥林(midostaurin)、來他替尼(lestaurtinib)、立尼法尼(linifanib)、舒尼替尼、舒尼替尼、順丁烯二酸酯、索拉非尼(sorafenib)、奎紮替尼(quizartinib)、克拉尼布(crenolanib)、帕瑞替尼(pacritinib)、坦度替尼(tandutinib)、PLX3397及ASP2215及其醫藥學上可接受之鹽。適合之Flt-3抑制劑之其他實例包括如WO 03/037347、WO 03/099771及WO 04/046120中所揭示之化合物及其醫藥學上可接受之鹽。
適合之RAF抑制劑之實例包括達拉非尼(dabrafenib)、索拉非尼(sorafenib)及維羅非尼(vemurafenib)及其醫藥學上可接受之鹽。適合之RAF抑制劑之其他實例包括如WO 00/09495及WO 05/028444中所揭示之化合物及其醫藥學上可接受之鹽。
適合之FAK抑制劑之實例包括VS-4718、VS-5095、VS-6062、VS-6063、BI853520及GSK2256098及其醫藥學上可接受之鹽。適合之FAK抑制劑之其他實例包括如WO 04/080980、WO 04/056786、WO 03/024967、WO 01/064655、WO 00/053595及WO 01/014402中所揭示之化合物及其醫藥學上可接受之鹽。
適合之CDK4/6抑制劑之實例包括帕柏西利(palbociclib)、利波西利(ribociclib)、曲拉西利(trilaciclib)、樂羅西利(lerociclib)及阿貝西利(abemaciclib)及其醫藥學上可接受之鹽。適合之CDK4/6抑制劑之其他實例包括如WO 09/085185、WO 12/129344、WO 11/101409、WO 03/062236、WO 10/075074及WO 12/061156中所揭示之化合物及其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，本發明之化合物可與一或多種其他激酶抑制劑(包括伊馬替尼(imatinib))組合使用，特別是用於治療對伊馬替尼或其他激酶抑制劑具有抗性之患者。
在一些實施例中，本發明之化合物可在癌症治療中與化學治療劑組合使用，且相較於對單獨化學治療劑之反應可改良治療反應，而不加重其毒性效應。在一些實施例中，本發明之化合物可與本文所提供之化學治療劑組合使用。舉例而言，用於治療多發性骨髓瘤之額外藥劑可包括但不限於美法侖、美法侖加普賴松[MP]、多柔比星、地塞米松及Velcade (硼替佐米)。用於治療多發性骨髓瘤之其他額外藥劑包括Bcr-Abl、Flt-3、RAF及FAK激酶抑制劑。在一些實施例中，藥劑為烷化劑、蛋白酶體抑制劑、皮質類固醇或免疫調節劑。烷化劑之實例包括環磷醯胺(CY)、美法侖(MEL)及苯達莫司汀。在一些實施例中，蛋白酶體抑制劑為卡非佐米(carfilzomib)。在一些實施例中，皮質類固醇為地塞米松(DEX)。在一些實施例中，免疫調節劑係來那度胺(LEN)或泊利度胺(pomalidomide) (POM)。累加或協同效應為將本發明之CDK2抑制劑與額外藥劑組合之所需結果。
該等藥劑可以單一或連續劑型與本發明之化合物組合，或該等藥劑可以單獨劑型同時或依次投與。
本發明之化合物可與一或多種其他抑制劑或一或多種療法組合使用以用於治療感染。感染之實例包括病毒感染、細菌感染、真菌感染或寄生蟲感染。
在一些實施例中，皮質類固醇諸如地塞米松與本發明之化合物組合向患者投與，其中地塞米松係間歇投與而非連續投與。
式(I)或如本文所述之任一式之化合物、申請專利範圍中之任一者中所列舉及本文所描述之化合物或其鹽可與另一種免疫原性劑組合，諸如癌細胞、經純化之腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽及碳水化合物分子)、細胞及經編碼免疫刺激細胞介素之基因轉染的細胞。可使用之腫瘤疫苗之非限制性實例包括黑色素瘤抗原之肽，諸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MARTI及/或酪胺酸酶之肽，或經轉染以表現細胞介素GM-CSF之腫瘤細胞。
式(I)或如本文所描述之任一式之化合物、申請專利範圍中之任一者中所列舉及本文所描述之化合物或其鹽可與疫苗接種方案組合使用以用於治療癌症。在一些實施例中，腫瘤細胞經轉導以表現GM-CSF。在一些實施例中，腫瘤疫苗包括人類癌症中所涉及之病毒的蛋白，該等病毒諸如人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。在一些實施例中，本發明之化合物可與腫瘤特異性抗原，諸如自腫瘤組織本身分離之熱休克蛋白組合使用。在一些實施例中，式(I)或如本文所描述之任一式之化合物、申請專利範圍中之任一者中所列舉及本文所描述之化合物或其鹽可與樹突狀細胞免疫接種組合以活化強效抗腫瘤反應。
本發明之化合物可與將表現Fe α或Fe γ受體之效應細胞靶向至腫瘤細胞的雙特異性巨環肽組合使用。本發明之化合物亦可與活化宿主免疫反應性之巨環肽組合。
在一些其他實施例中，本發明之化合物與其他治療劑之組合可在骨髓移植或幹細胞移植之前、期間及/或之後向患者投與。本發明之化合物可與骨髓移植組合以用於治療多種造血來源腫瘤。
式(I)或如本文所描述之任一式之化合物、申請專利範圍中之任一者中所列舉及本文所描述之化合物或其鹽可與疫苗組合使用，以刺激針對病原體、毒素及自抗原之免疫反應。此治療方法可特別適用之病原體之實例包括當前無有效疫苗之病原體或習知疫苗不完全有效之病原體。此等包括但不限於HIV、肝炎(A、B及C)、流感、疱疹、賈第蟲屬(Giardia)、瘧疾、利什曼原蟲(Leishmania)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)。
引起可藉由本發明之方法治療之感染的病毒包括但不限於人類乳突狀瘤病毒、流感病毒、A型肝炎、B、C或D型流感病毒、腺病毒、痘病毒、單純疱疹病毒、人類巨細胞病毒、嚴重急性呼吸道症候群病毒、埃博拉病毒、麻疹病毒、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV6、HSV-II及CMV、埃-巴二氏病毒)、黃病毒屬(flaviviruses)、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、科沙奇病毒(coxsackie virus)、冠狀病毒(cornovirus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、輪狀病毒(rotavirus)、麻疹病毒(measles virus)、德國麻疹病毒(rubella virus)、小病毒(parvovirus)、痘瘡病毒(vaccinia virus)、HTLV病毒、登革熱病毒(dengue virus)、乳突狀瘤病毒(papillomavirus)、軟疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰白質炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒腦炎病毒(arboviral encephalitis virus)。
引起可藉由本發明之方法治療之感染的病原菌包含但不限於衣原體(chlamydia)、立克次體細菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(conococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、軍團菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙門氏菌(salmonella)、桿菌(bacilli)、霍亂(cholera)、破傷風(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽病(anthrax)、瘟疫(plague)、鉤端螺旋體病(leptospirosis)及萊姆病(Lyme's disease)細菌。
引起可藉由本發明之方法治療之感染的病原性真菌包括但不限於念珠菌屬(Candida) (白色念珠菌(albicans)、克魯斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、曲黴菌屬(Aspergillus) (煙麴黴(fumigatus)、黑麴黴(niger)等)、毛黴菌目(Mucorales)屬(白黴菌屬(mucor)、犁頭黴屬(absidia)、根黴屬(rhizophus))、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可藉由本發明之方法治療之感染的病原性寄生蟲包括但不限於溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴原蟲(Naegleriafowleri)、棘阿米巴蟲屬(Acanthamoeba sp.)、蘭比亞梨形鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱胞子蟲屬(Cryptosporidium sp.)、肺炎肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、微小巴倍蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondi)及巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。
當向患者投與超過一種醫藥劑時，其可同時、單獨、依次或以組合形式投與(例如對於超過兩種藥劑)。
安全且有效投與大部分此等化學治療劑之方法為熟習此項技術者已知的。另外，其投藥描述於標準文獻中。舉例而言，多種化學治療劑之投與描述於「Physicians' Desk Reference」 (PDR，例如1996版, Medical Economics Company, Montvale, NJ)中，其揭示內容如同闡述一般以全文引用之方式併入本文中。
II. 免疫檢查點療法本發明之化合物可與一或多種免疫檢查點抑制劑組合使用以用於治療疾病，諸如癌症，或感染。例示性免疫檢查點抑制劑包括針對以下免疫檢查點分子的抑制劑：諸如CBL-B、CD20、CD28、CD40、CD70、CD122、CD96、CD73、CD47、CDK2、GITR、CSF1R、JAK、PI3K δ、PI3K γ、TAM、精胺酸酶、HPK1、CD137 (亦稱為4-1BB)、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、TLR (TLR7/8)、TIGIT、CD112R、VISTA、PD-1、PD-L1及PD-L2。在一些實施例中，免疫檢查點分子係選自CD27、CD28、CD40、ICOS、OX40、GITR及CD137之刺激性檢查點分子。在一些實施例中，免疫檢查點分子係選自A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM3、TIGIT及VISTA之抑制性檢查點分子。在一些實施例中，本文所提供之化合物可與一或多種選自KIR抑制劑、TIGIT抑制劑、LAIR1抑制劑、CD160抑制劑、2B4抑制劑及TGFR β抑制劑之藥劑組合使用。
在一些實施例中，本文所提供之化合物可與免疫檢查點分子例如OX40、CD27、GITR及CD137 (亦稱為4-1BB)之一或多種促效劑組合使用。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為抗PD1抗體、抗PD-L1抗體或抗CTLA-4抗體。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為PD-1或PD-L1之抑制劑，例如抗PD-1或抗PD-L1單株抗體。在一些實施例中，抗PD-1或抗PD-L1抗體為納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、度伐魯單抗(durvalumab)、阿維魯單抗(avelumab)、西米普利單抗(cemiplimab)、阿特珠單抗、阿維魯單抗、替雷利珠單抗(tislelizumab)、斯巴達珠單抗(spartalizumab) (PDR001)、賽曲利單抗(cetrelimab) (JNJ-63723283)、特瑞普利單抗(toripalimab) (JS001)、卡瑞利珠單抗(camrelizumab) (SHR-1210)、信迪利單抗(sintilimab) (IBI308)、AB122 (GLS-010)、AMP-224、AMP-514/ MEDI-0680、BMS936559、JTX-4014、BGB-108、SHR-1210、MEDI4736、FAZ053、BCD-100、KN035、CS1001、BAT1306、LZM009、AK105、HLX10、SHR-1316、CBT-502 (TQB2450)、A167 (KL-A167)、STI-A101 (ZKAB001)、CK-301、BGB-A333、MSB-2311、HLX20、TSR-042或LY3300054。在一些實施例中，PD-1或PD-L1之抑制劑為美國專利第7,488,802號、第7,943,743號、第8,008,449號、第8,168,757號、第8,217,149號或第10,308,644號；美國公開案第2017/0145025號、第2017/0174671、第2017/0174679號、第2017/0320875號、第2017/0342060號、第2017/0362253號、第2018/0016260號、第2018/0057486號、第2018/0177784號、第2018/0177870號、第2018/0179179號、第2018/ 0179201號、第2018/0179202號、第2018/0273519號、第2019/0040082號、第2019/0062345號、第2019/0071439號、第2019/0127467號、第2019/0144439號、第2019/0202824號、第2019/0225601號、第2019/ 0300524號或第2019/0345170號；或PCT公開案第WO 03042402號、第WO 2008156712號、第WO 2010089411號、第WO 2010036959號、第WO 2011066342號、第WO 2011159877號、第WO 2011082400號或第WO 2011161699號中所揭示之抑制劑，其各自以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，PD-L1抑制劑為INCB086550。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑係選自表A中之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。 表 A
化合物編號 美國公開申請案編號 名稱及結構
1 US 2018-0179197, 實例#24 (R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羥基吡咯啶-1-基)甲基)-1,7-㖠啶-8-基胺基)-2,2'-二甲基聯苯-3-基)苯并[d]㗁唑-5-基)甲基)吡咯啶-3-甲酸
2 US 2018-0179201, 實例#2 N-(2-氯-3'-(8-氯-6-((2-羥基乙基胺基)甲基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-2'-甲基聯苯-3-基)-5-((2-羥基乙基胺基)甲基)吡啶甲醯胺
3 US 2018-0179197, 實例#25 (S)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((S)-3-羥基吡咯啶-1-基)甲基)-1,7-㖠啶-8-基胺基)-2,2'-二甲基聯苯-3-基)苯并[d]㗁唑-5-基)甲基)吡咯啶-3-甲酸
4 US 2018-0179197, 實例#26 (R)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((S)-3-羥基吡咯啶-1-基)甲基)-1,7-㖠啶-8-基胺基)-2,2'-二甲基聯苯-3-基)苯并[d]㗁唑-5-基)甲基)吡咯啶-3-甲酸
5 US 2018-0179197, 實例#28 (S)-1-((7-氰基-2-(3'-(3-(((R)-3-羥基吡咯啶-1-基)甲基)-1,7-㖠啶-8-基胺基)-2,2'-二甲基聯苯-3-基)苯并[d]㗁唑-5-基)甲基)吡咯啶-3-甲酸
6 US 2018-0179197, 實例#236 1-((7-氰基-2-(3'-(5-(2-(二甲胺基)乙醯基)-5,6-二氫-4H-吡咯并[3,4-d]噻唑-2-基)-2,2'-二甲基聯苯-3-基)苯并[d]㗁唑-5-基)甲基)哌啶-4-甲酸
7 US 2018-0179179, 實例#1 N,N'-(2-氯-2'-甲基聯苯-3,3'-二基)雙(5-((2-羥基乙基胺基)甲基)吡啶甲醯胺)
8 US 2018-0179179, 實例#9 (R)-1-((6-(2'-氯-3'-(5-((3-羥基吡咯啶-1-基)甲基)吡啶甲醯胺基)-2-甲基聯苯-3-基胺甲醯基)吡啶-3-基)甲基)哌啶-4-甲酸
9 US 2018-0179179, 實例#12 (S)-1-((6-((2'-氯-2-甲基-3'-(5-(吡咯啶-1-基甲基)吡啶甲醯胺基)-[1,1'-聯苯]-3-基)胺甲醯基)-4-甲基吡啶-3-基)甲基)哌啶-2-甲酸
10 US 2018-0179202, 實例#52 反4-(2-(2-(2-氯-3'-(3-(((R)-3-羥基吡咯啶-1-基)甲基)-1,7-㖠啶-8-基胺基)-2'-甲基聯苯-3-基胺甲醯基)-1-甲基-6,7-二氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5(4H)-基)乙基)環己烷甲酸
11 US 2018-0179202, 實例#56 順-4-((2-(2-氯-3'-(3-(((R)-3-羥基-3-甲基吡咯啶-1-基)甲基)-1,7-㖠啶-8-基胺基)-2'-甲基聯苯-3-基胺甲醯基)-1-甲基-6,7-二氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5(4H)-基)甲基)環己烷甲酸
12 US 2018-0179202, 實例#68 (R)-4-(2-(2-氯-3'-(7-((3-羥基吡咯啶-1-基)甲基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基胺基)-2'-甲基聯苯-3-基胺甲醯基)-1-甲基-6,7-二氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5(4H)-基)-1-甲基環己烷甲酸
13 US 2018-0179202, 實例#90 (R)-1-((8-((2-氯-3'-(5-(N-乙基-N-甲基甘胺醯基)-5,6-二氫-4H-吡咯并[3,4-d]噻唑-2-基)-2'-甲基-[1,1'-聯苯]-3-基)胺基)-1,7-㖠啶-3-基)甲基)吡咯啶-3-甲酸
14 US 2018-0177784, 實例#35 (R)-2-(二甲胺基)-1-(2-(3'-(5-(2-(3-羥基吡咯啶-1-基)乙醯基)-5,6-二氫-4H-吡咯并[3,4-d]噻唑-2-基)-2,2'-二甲基聯苯-3-基)-4H-吡咯并[3,4-d]噻唑-5(6H)-基)乙酮
15 US 2018-0177870, 實例#37 反-4-((2-(2'-氯-3'-(1,5-二甲基-4,5,6,7-四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲醯胺基)-2-甲基聯苯-3-基胺甲醯基)-1-甲基-6,7-二氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5(4H)-基)甲基)環己烷-1-甲酸
16 US 2018-0177870, 實例#100 反-4-(2-(2-((2'-氯-3'-(1,5-二甲基-4,5,6,7-四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲醯胺基)-2-甲基-[1,1'-聯苯]-3-基)胺甲醯基)-1-甲基-1,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)乙基)環己烷-1-甲酸
17 US 2018-0177870, 實例#114 順-4-((2-((2'-氯-3'-(1,5-二甲基-4,5,6,7-四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲醯胺基)-2-甲基-[1,1'-聯苯]-3-基)胺甲醯基)-1-甲基-1,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)甲基)環己烷-1-甲酸
18 US 2018-0177870, 實例#135 順-4-((2-((2-氯-3'-(1,5-二甲基-4,5,6,7-四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲醯胺基)-2'-甲基-[1,1'-聯苯]-3-基)胺甲醯基)-1-甲基-1,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)甲基)環己烷-1-甲酸
19 US 2018-0177870, 實例#148 反-4-(2-(2-((2'-氯-2-氰基-3'-(1,5-二甲基-4,5,6,7-四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲醯胺基)-[1,1'-聯苯]-3-基)胺甲醯基)-1-甲基-1,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)乙基)環己烷-1-甲酸
20 US 2018-0177870, 實例#159 反-4-((2-(2-氯-3'-(5-(2-(乙基(甲基)胺基)乙醯基)-5,6-二氫-4H-吡咯并[3,4-d]噻唑-2-基)-2'-甲基聯苯-3-基胺甲醯基)-1-甲基-6,7-二氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5(4H)-基)甲基)環己烷-1-甲酸
21 US 2018-0177870, 實例#160 順-4-((2-(2-氯-3'-(5-(2-(乙基(甲基)胺基)乙醯基)-5,6-二氫-4H-吡咯并[3,4-d]噻唑-2-基)-2'-甲基聯苯-3-基胺甲醯基)-1-甲基-6,7-二氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5(4H)-基)甲基)環己烷-1-甲酸
22 US 2018-0177870, 實例#161 4-(2-(2-(2-氯-3'-(5-(2-(乙基(甲基)胺基)乙醯基)-5,6-二氫-4H-吡咯并[3,4-d]噻唑-2-基)-2'-甲基聯苯-3-基胺甲醯基)-1-甲基-6,7-二氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5(4H)-基)乙基)環己烷-1-甲酸
23 US 2018-0177870, 實例#162 4-(2-(2-(2-氯-3'-(5-(2-(異丙基(甲基)胺基)乙醯基)-5,6-二氫-4H-吡咯并[3,4-d]噻唑-2-基)-2'-甲基聯苯-3-基胺甲醯基)-1-甲基-6,7-二氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5(4H)-基)乙基)環己烷-1-甲酸
24 US 2019-0300524, 實例#16 (R)-1-((7-氰基-2-(3'-(2-(二氟甲基)-7-((3-羥基吡咯啶-1-基)甲基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基胺基)-2,2'-二甲基聯苯-3-基)苯并[d]㗁唑-5-基)甲基)哌啶-4-甲酸
25 US 2019-0300524, 實例#17 (R)-1-((7-氰基-2-(3'-(2-(二氟甲基)-7-(((R)-3-羥基吡咯啶-1-基)甲基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基胺基)-2,2'-二甲基聯苯-3-基)苯并[d]㗁唑-5-基)甲基)吡咯啶-3-甲酸
26 US 2019-0300524, 實例#18 (R)-1-((7-氰基-2-(3'-(2-(二氟甲基)-7-(((R)-3-羥基吡咯啶-1-基)甲基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基胺基)-2,2'-二甲基聯苯-3-基)苯并[d]㗁唑-5-基)甲基)-3-甲基吡咯啶-3-甲酸
27 US 2019-0300524, 實例#30 (R)-1-((7-氰基-2-(3'-(2-(二氟甲基)-7-((3-羥基-3-甲基吡咯啶-1-基)甲基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基胺基)-2,2'-二甲基聯苯-3-基)苯并[d]㗁唑-5-基)甲基)哌啶-4-甲酸
28 US 2019-0300524, 實例#31 (S)-1-((7-氰基-2-(3'-(2-(二氟甲基)-7-((3-羥基-3-甲基吡咯啶-1-基)甲基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基胺基)-2,2'-二甲基聯苯-3-基)苯并[d]㗁唑-5-基)甲基)哌啶-4-甲酸
29 US 2019-0345170, 實例#13 (R)-4-(2-(2-((2,2'-二氯-3'-(5-(2-羥丙基)-1-甲基-4,5,6,7-四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲醯胺基)-[1,1'-聯苯]-3-基)胺甲醯基)-1-甲基-1,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)乙基)雙環[2.2.1]庚烷-1-甲酸
30 US 2019-0345170, 實例#17 4,4'-(((((2,2'-二氯-[1,1'-聯苯]-3,3'-二基)雙(氮二基))雙(羰基))雙(1-甲基-1,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2,5-二基))雙(乙烷-2,1-二基))雙(雙環[2.2.1]庚烷-1-甲酸)
31 US 2019-0345170, 實例#18 4-((2-((3'-(5-(2-(4-羧基雙環[2.2.1]庚-1-基)乙基)-1-甲基-4,5,6,7-四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-甲醯胺基)-2,2'-二氯-[1,1'-聯苯]-3-基)胺甲醯基)-1-甲基-1,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)甲基)雙環[2.2.1]庚烷-1-甲酸
32 US 2019-0345170, 實例#34 4,4'-(((((2-氯-2'-甲基-[1,1'-聯苯]-3,3'-二基)雙(氮二基))雙(羰基))雙(1-甲基-1,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2,5-二基))雙(乙烷-2,1-二基))雙(雙環[2.2.1]庚烷-1-甲酸)
33 US 2019-0345170, 實例#51 4,4'-(((((2-氯-2'-氰基-[1,1'-聯苯]-3,3'-二基)雙(氮二基))雙(羰基))雙(1-甲基-1,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2,5-二基))雙(乙烷-2,1-二基))雙(雙環[2.2.1]庚烷-1-甲酸)
34 US 2021-0094976, 實例#1 (R)-4-(2-(2-((2-氯-3'-((2-(二氟甲基)-7-((3-羥基吡咯啶-1-基)甲基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基)胺基)-2'-甲基-[1,1'-聯苯]-3-基)胺甲醯基)-1-甲基-1,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5-基)乙基)雙環[2.2.1]庚烷-1-甲酸
在一些實施例中，抗體為抗PD-1抗體，例如抗PD-1單株抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體為納武單抗(nivolumab)、派姆單抗、西米普利單抗、斯巴達珠單抗、卡瑞利珠單抗、賽曲利單抗、特瑞普利單抗、信迪利單抗、AB122、AMP-224、JTX-4014、BGB-108、BCD-100、BAT1306、LZM009、AK105、HLX10或TSR-042。在一些實施例中，抗PD-1抗體為納武單抗、派姆單抗、西米普利單抗、斯巴達珠單抗、卡瑞利珠單抗、賽曲利單抗、特瑞普利單抗或信迪利單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體為派姆單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體為納武單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體為西米普利單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體為斯巴達珠單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體為卡瑞利珠單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體為賽曲利單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體為特瑞普利單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體為信迪利單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體為AB122。在一些實施例中，抗PD-1抗體為AMP-224。在一些實施例中，抗PD-1抗體為JTX-4014。在一些實施例中，抗PD-1抗體為BGB-108。在一些實施例中，抗PD-1抗體為BCD-100。在一些實施例中，抗PD-1抗體為BAT1306。在一些實施例中，抗PD-1抗體為LZM009。在一些實施例中，抗PD-1抗體為AK105。在一些實施例中，抗PD-1抗體為HLX10。在一些實施例中，抗PD-1抗體為TSR-042。在一些實施例中，抗PD-1單株抗體為納武單抗或派姆單抗。在一些實施例中，抗PD-1單株抗體為MGA012 (INCMGA0012；瑞弗利單抗(retifanlimab))。在一些實施例中，抗PD1抗體為SHR-1210。其他抗癌劑包括抗體治療劑，諸如4-1BB (例如烏瑞蘆單抗(urelumab)、烏托米單抗(utomilumab)。在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為PD-L1之抑制劑，例如抗PD-L1單株抗體。在一些實施例中，抗PD-L1單株抗體為阿特珠單抗、阿維魯單抗、度伐魯單抗、替雷利珠單抗、BMS-935559、MEDI4736、阿特珠單抗(MPDL3280A；亦稱為RG7446)、阿維魯單抗(MSB0010718C)、FAZ053、KN035、CS1001、SHR-1316、CBT-502、A167、STI-A101、CK-301、BGB-A333、MSB-2311、HLX20或LY3300054。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為阿特珠單抗、阿維魯單抗、度伐魯單抗或替雷利珠單抗。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為阿特珠單抗。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為阿維魯單抗。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為度伐魯單抗。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為替雷利珠單抗。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為BMS-935559。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為MEDI4736。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為FAZ053。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為KN035。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為CS1001。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為SHR-1316。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為CBT-502。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為A167。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為STI-A101。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為CK-301。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為BGB-A333。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為MSB-2311。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為HLX20。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為LY3300054。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係結合至PD-L1或其醫藥學上可接受之鹽的小分子。在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係結合至且內化PD-L1或其醫藥學上可接受之鹽的小分子。在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑係選自US 2018/0179201、US 2018/0179197、US 2018/0179179、US 2018/0179202、US 2018/0177784、US 2018/0177870、US序列號16/369,654 (申請於2019年3月29日)及美國序列號62/688,164之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其各者以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為KIR、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGF β之抑制劑。
在一些實施例中，抑制劑為MCLA-145。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為CTLA-4之抑制劑，例如抗CTLA-4抗體。在一些實施例中，抗CTLA-4抗體為伊匹單抗(ipilimumab)、曲美木單抗(tremelimumab)、AGEN1884或CP-675,206。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為LAG3之抑制劑，例如抗LAG3抗體。在一些實施例中，抗LAG3抗體為BMS-986016、LAG525、INCAGN2385或艾法莫德(eftilagimod) α (IMP321)。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為CD73之抑制劑。在一些實施例中，CD73之抑制劑為奧來魯單抗(oleclumab)。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為TIGIT之抑制劑。在一些實施例中，TIGIT之抑制劑為OMP-31M32。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為VISTA之抑制劑。在一些實施例中，VISTA之抑制劑為JNJ-61610588或CA-170。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為B7-H3之抑制劑。在一些實施例中，B7-H3之抑制劑為依諾妥珠單抗(enoblituzumab)、MGD009或8H9。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為KIR之抑制劑。在一些實施例中，KIR之抑制劑為利瑞魯單抗(lirilumab)或IPH4102。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為A2aR之抑制劑。在一些實施例中，A2aR之抑制劑為CPI-444。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為TGF-β之抑制劑。在一些實施例中，TGF-β之抑制劑為曲貝德生(trabedersen)、吉布替尼(galusertinib)或M7824。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為PI3K-γ之抑制劑。在一些實施例中，PI3K-γ之抑制劑為IPI-549。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為CD47之抑制劑。在一些實施例中，CD47之抑制劑為Hu5F9-G4或TTI-621。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為CD73之抑制劑。在一些實施例中，CD73之抑制劑為MEDI9447。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為CD70之抑制劑。在一些實施例中，CD70之抑制劑為庫妥珠單抗(cusatuzumab)或BMS-936561。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為TIM3之抑制劑，例如抗TIM3抗體。在一些實施例中，抗TIM3抗體為INCAGN2390、MBG453或TSR-022。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為CD20之抑制劑，例如抗CD20抗體。在一些實施例中，抗CD20抗體為阿托珠單抗(obinutuzumab)或利妥昔單抗。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑為OX40、CD27、CD28、GITR、ICOS、CD40、TLR7/8及CD137(亦稱為4-1BB)之促效劑。
在一些實施例中，CD137之促效劑為烏瑞蘆單抗。在一些實施例中，CD137之促效劑為烏托米單抗。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑為GITR之抑制劑。在一些實施例中，GITR之促效劑為TRX518、MK-4166、INCAGN1876、MK-1248、AMG228、BMS-986156、GWN323、MEDI1873或MEDI6469。在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑為OX40之促效劑，例如OX40促效劑抗體或OX40L融合蛋白。在一些實施例中，抗OX40抗體為INCAGN01949、MEDI0562 (他利昔珠單抗(tavolimab))、MOXR-0916、PF-04518600、GSK3174998、BMS-986178或9B12。在一些實施例中，OX40L融合蛋白為MEDI6383。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑為CD40之促效劑。在一些實施例中，CD40之促效劑為CP-870893、ADC-1013、CDX-1140、SEA-CD40、RO7009789、JNJ-64457107、APX-005M或Chi Lob 7/4。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑為ICOS之促效劑。在一些實施例中，ICOS之促效劑為GSK-3359609、JTX-2011或MEDI-570。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑為CD28之促效劑。在一些實施例中，CD28之促效劑為治療珠單抗(theralizumab)。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑為CD27之促效劑。在一些實施例中，CD27之促效劑為瓦利魯單抗(varlilumab)。
在一些實施例中，免疫檢查點分子之促效劑為TLR7/8之促效劑。在一些實施例中，TLR7/8之促效劑為MEDI9197。
本發明之化合物可與雙特異性抗體組合使用。在一些實施例中，雙特異性抗體中之一個結構域靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、GITR、OX40、TIM3、LAG3、CD137、ICOS、CD3或TGFβ受體。在一些實施例中，雙特異性抗體結合至PD-1及PD-L1。在一些實施例中，結合至PD-1及PD-L1之雙特異性抗體為MCLA-136。在一些實施例中，雙特異性抗體結合至PD-L1及CTLA-4。在一些實施例中，結合至PD-L1及CTLA-4之雙特異性抗體為AK104。
在一些實施例中，本發明之化合物可與一或多種新陳代謝酶抑制劑組合使用。在一些實施例中，新陳代謝酶抑制劑為IDO1、TDO或精胺酸酶之抑制劑。IDO1抑制劑之實例包括艾卡哚司他、NLG919、BMS-986205、PF-06840003、IOM2983、RG-70099及LY338196。精胺酸酶抑制劑之抑制劑包括INCB1158。
如通篇所提供，其他化合物、抑制劑、藥劑等可與本發明化合物以單一或連續劑型組合，或其可作為各別劑型同時或依次投與。
調配物、劑型及投與本發明化合物當用作醫藥時可以醫藥組合物形式投與。因此，本發明提供一種組合物，其包含式I、II或如本文中所描述之各式中之任一者的化合物(如申請專利範圍之任一項中所列舉及本文中所描述之化合物)或其醫藥學上可接受之鹽或其實施例中之任一者；及至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。此等組合物可以醫藥技術中熟知之方式製備，且可藉由各種途徑投與，其視指示局部治療或全身治療及待治療之區域而定。投與可經局部(包括經皮、表皮、經眼及至黏膜，包括鼻內、陰道及直腸遞送)、肺(例如吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括藉由霧化器；氣管內或鼻內)、經口或非經腸。非經腸投與包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內、肌內或注射或輸注；或顱內，例如鞘內或心室內投與。非經腸投與可呈單次推注給藥形式，或可為例如連續灌注泵浦。用於局部投與之醫藥組合物及調配物可包括經皮貼片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體以及散劑。習知醫藥載劑、水溶液、粉末或油性基劑、增稠劑及其類似物可為必需或合乎需要的。
本發明亦包括醫藥組合物，其含有本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽作為活性成分與一或多種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑之組合。在一些實施例中，組合物適合於局部投與。製備本發明之組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，藉由賦形劑稀釋或封閉於呈例如膠囊、藥囊、紙或其他容器形式之此類載體中。當賦形劑充當稀釋劑時，其可為固體、半固體或液體材料，其充當活性成分的媒劑、載劑或介質。因此，組合物可呈以下形式：錠劑、丸劑、散劑、口含劑、藥囊、扁囊劑、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、氣溶膠(呈固體形式或於液體介質中)、含有例如高達10重量%活性化合物之軟膏、軟及硬明膠膠囊、栓劑、無菌可注射溶液及無菌封裝散劑。
在製備調配物時，在與其他成分組合之前，可將活性化合物研磨以提供適當粒度。若活性化合物實質上不可溶，則可將其研磨至小於200目之粒度。若活性化合物實質上水可溶，則粒度可藉由研磨調節，以在調配物中提供實質上均一的分佈，例如約40目。
可使用諸如濕式研磨之已知研磨步驟來研磨本發明之化合物，以獲得適合於錠劑成形及其他調配物類型之粒度。可藉由此項技術中已知之方法製備本發明之化合物之細微粉碎(奈米顆粒)製劑，參見例如WO 2002/000196。
適合之賦形劑的一些實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、黃蓍、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、水、糖漿及甲基纖維素。調配物可另外包括：潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鎂及礦物油；潤濕劑；乳化劑及懸浮劑；防腐劑，諸如羥基苯甲酸甲酯及羥基苯甲酸丙酯；甜味劑；及調味劑。本發明之組合物可經調配以便在藉由採用此項技術中已知之程序投與患者之後提供活性成分之快速、持續或延遲釋放。
在一些實施例中，醫藥組合物包含矽化微晶纖維素(SMCC)及本文中所描述之至少一種化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，矽化微晶纖維素包含以w/w計約98%微晶纖維素及約2%二氧化矽。
在一些實施例中，組合物為持續釋放組合物，其包含至少一種本文中所描述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，組合物包含至少一種本文所描述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及至少一種選自以下之組分：微晶纖維素、單水合乳糖、羥丙基甲基纖維素及聚氧化乙烯。在一些實施例中，組合物包含至少一種本文所描述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及微晶纖維素、單水合乳糖以及羥丙基甲基纖維素。在一些實施例中，組合物包含至少一種本文所描述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及微晶纖維素、單水合乳糖以及聚氧化乙烯。在一些實施例中，組合物進一步包含硬脂酸鎂或二氧化矽。在一些實施例中，微晶纖維素為Avicel PH102™。在一些實施例中，單水合乳糖為Fast-flo 316™。在一些實施例中，羥丙基甲基纖維素為羥丙基甲基纖維素2208 K4M (例如Methocel K4 M Premier™)及/或羥丙基甲基纖維素2208 K100LV (例如Methocel K00LV™)。在一些實施例中，聚氧化乙烯為聚氧化乙烯WSR 1105 (例如Polyox WSR 1105™)。
在一些實施例中，使用濕式造粒製程來生產組合物。在一些實施例中，使用乾式造粒製程來生產組合物。
組合物可以單位劑型調配，各劑量含有約5至約1,000 mg (1 g)，更通常約100 mg至約500 mg活性成分。在一些實施例中，各劑量含有約10 mg活性成分。在一些實施例中，各劑量含有約50 mg活性成分。在一些實施例中，各劑量含有約25 mg活性成分。術語「單位劑型」係指適合以單位劑量形式用於人類個體及其他哺乳動物的物理上不連續之單元，各單元含有經計算以產生所需治療作用的預定量之活性材料，其與適合之醫藥賦形劑結合。
用於調配醫藥組合物之組分為高純度且實質上不含可能有害的污染物(例如，至少為國家食品級，通常至少為分析級，且更通常至少為醫藥級)。尤其對於人類消耗而言，該組合物較佳地根據如美國食品藥物管理局之可適用規定中所定義之良好製造規範標準製造或調配。舉例而言，適合的調配物可為無菌的及/或實質上等張的及/或完全符合美國食品藥物管理局之所有良好製造規範規定。
活性化合物可以在寬劑量範圍內有效，且通常以治療有效量投與。然而，應理解，化合物之實際投與量通常將由醫師根據相關情況確定，包括待治療之病狀、所選投與途徑、所投與之實際化合物、個別患者之年齡、體重及反應、患者症狀之嚴重程度及其類似情況。
本發明之化合物之治療劑量可根據例如治療之特定用途、化合物之投與方式、患者之健康及狀況，以及處方醫師之判斷而變化。醫藥組合物中之本發明之化合物的比例或濃度可視多種因素而變化，包括劑量、化學特徵(例如疏水性)及投與途徑。舉例而言，本發明之化合物可以含有約0.1至約10% w/v之化合物的生理緩衝水溶液形式提供以用於非經腸投與。一些典型劑量範圍為每天每公斤體重約1 µg至約1 g。在一些實施例中，劑量範圍為每天每公斤體重約0.01 mg至約100 mg。劑量很可能視諸如以下各者之變數而定：疾病或病症之類型及發展程度、特定患者之總體健康狀況、所選化合物之相對生物功效、賦形劑之配方及其投與途徑。有效劑量可自來源於活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推得到。
為了製備固體組合物諸如錠劑，將主要活性成分與醫藥賦形劑混合以形成含有本發明之化合物之均勻混合物的固體預調配組合物。當將此等預調配組合物稱為均勻組合物時，活性成分通常均勻分散在整個組合物中，以使得該組合物可易於再分為同等有效之單位劑型，諸如錠劑、丸劑及膠囊。隨後，此固體預調配物再分為含有例如約0.1至約1000 mg本發明之活性成分的上文所描述之類型的單位劑型。
本發明之錠劑或丸劑可經包覆或另外經混配以提供具有延長作用之優勢的劑型。舉例而言，錠劑或丸劑可包含內部劑量及外部劑量組分，後者呈包覆前者之包膜形式。兩種組分可由腸溶層隔開，該腸溶層用以防止在胃中崩解且允許內部組分完整進入十二指腸或釋放延遲。各種材料可用於此類腸溶性層或包衣，此類材料包括多種聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇及乙酸纖維素之此類材料的混合物。
可結合本發明之化合物及組合物以經口或藉由注射投與之液體形式包括水溶液、適當調味的糖漿、水性或油性懸浮液、及具有可食用油(諸如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)之調味乳液、以及酏劑及類似醫藥媒劑。
用於吸入或吹入之組合物包括醫藥學上可接受之水性或有機溶劑或其混合物中之溶液及懸浮液，及散劑。液體或固體組合物可含有如上文所描述之適合的醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，藉由經口或經鼻呼吸道途徑投與組合物以用於局部或全身性作用。組合物可藉由使用惰性氣體而霧化。霧化溶液可直接自霧化裝置吸入或可將霧化裝置附接至面罩、圍罩或間歇性正壓呼吸機。溶液、懸浮液或粉末組合物可自以適當方式遞送調配物之裝置經口或經鼻投與。
局部調配物可含有一或多種習知載劑。在一些實施例中，軟膏可含有水及一或多種選自以下之疏水性載劑：例如液體石蠟、聚氧乙烯烷基醚、丙二醇、白凡士林及其類似者。乳膏之載劑組合物可基於水與甘油及一或多種其他組分，例如單硬脂酸甘油酯、PEG-單硬脂酸甘油酯及鯨蠟硬脂醇之組合。凝膠可使用異丙醇及水，適當地與其他組分(諸如甘油、羥基乙基纖維素及其類似者)組合來調配。在一些實施例中，局部調配物含有至少約0.1 wt%、至少約0.25 wt%、至少約0.5 wt%、至少約1 wt%、至少約2 wt%或至少約5 wt%的本發明之化合物。局部調配物可適當地封裝於例如100 g之管中，其視情況伴隨有治療所選適應症，例如牛皮癬或其他皮膚病狀之說明書。
向患者投與之化合物或組合物的量將視所投與之物質、投與目的(諸如預防或治療)、患者狀態、投與方式及其類似者而變化。在治療性應用中，可向已患有疾病之患者以足以治癒或至少部分地遏制疾病及其併發症之症狀的量投與組合物。治療有效劑量將視所治療之疾病病狀而定，以及由主治臨床醫師根據諸如疾病之嚴重程度、患者之年齡、體重及一般狀況及其類似者之因素進行判斷。
向患者投與之組合物可呈上文所描述之醫藥組合物形式。此等組合物可藉由習知滅菌技術滅菌，或可經無菌過濾。水溶液可封裝以按原樣使用或凍乾，經凍乾之製劑在投與之前與無菌水性載劑組合。化合物製劑之pH通常在3與11之間、更佳5至9且最佳7至8。應理解，使用某些前述賦形劑、載劑或穩定劑將導致醫藥鹽形成。
本發明之化合物之治療劑量可根據例如治療之特定用途、化合物之投與方式、患者之健康及狀況，以及處方醫師之判斷而變化。醫藥組合物中之本發明之化合物的比例或濃度可視多種因素而變化，包括劑量、化學特徵(例如疏水性)及投與途徑。舉例而言，本發明之化合物可以含有約0.1至約10% w/v之化合物的生理緩衝水溶液形式提供以用於非經腸投與。一些典型劑量範圍為每天每公斤體重約1 µg至約1 g。在一些實施例中，劑量範圍為每天每公斤體重約0.01 mg至約100 mg。劑量很可能視諸如以下各者之變數而定：疾病或病症之類型及發展程度、特定患者之總體健康狀況、所選化合物之相對生物功效、賦形劑之配方及其投與途徑。有效劑量可自來源於活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推得到。
經標記之化合物及分析方法本發明之另一態樣係關於本發明之經標記之化合物(經放射性標記、經螢光標記等)，其將不僅可用於成像技術，而且可用於活體外及活體內分析，以便對包括人類之組織樣品中之KRAS蛋白進行定位及定量，及藉由經標記化合物之抑制結合來鑑別KRAS配體。本發明之化合物之原子中之一或多者的取代亦可用於產生經分化之ADME (吸附、分佈、代謝及分泌)。因此，本發明包括含有此類經標記或經取代之化合物的KRAS結合分析。
本發明進一步包括經同位素標記之本發明之化合物。「經同位素」或「經放射性標記」化合物為其中一或多個原子由具有與通常在自然界中發現(亦即，天然存在)之原子質量或質量數不同的原子質量或質量數之原子置換或取代的本發明之化合物。可併入本發明之化合物中的適合的放射性核種包括但不限於 2H (氘亦寫為D)、 3H (氚亦寫為T)、 11C、 13C、 14C、 13N、 15N、 15O、 17O、 18O、 18F、 35S、 36Cl、 82Br、 75Br、 76Br、 77Br、 123I、 124I、 125I及 131I。舉例而言，本發明化合物中之一或多個氫原子可經氘原子置換(例如，本文所提供之式I、II或任何式之C 1-6烷基之一或多個氫原子可視情況經氘原子取代，諸如-CD 3經取代為-CH 3)。在一些實施例中，本文所提供之式I、II或任何式中之烷基可經全氘化。
本文中所呈現之化合物的一或多個組分原子可經天然或非天然豐度之原子同位素置換或取代。在一些實施例中，化合物包括至少一個氘原子。在一些實施例中，化合物包括兩個或更多個氘原子。在一些實施例中，化合物包括1至2個、1至3個、1至4個、1至5個或1至6個氘原子。在一些實施例中，化合物中之所有氫原子可經氘原子置換或取代。
使有機化合物中包括同位素之合成方法係此項技術中已知的(Alan F. Thomas之Deuterium Labeling in Organic Chemistry, New York, N.Y., Appleton-Century-Crofts, 1971；Jens Atzrodt, Volker Derdau, Thorsten Fey及Jochen Zimmermann之The Renaissance of H/D Exchange, Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 7744-7765；James R. Hanson之The Organic Chemistry of Isotopic Labelling, Royal Society of Chemistry, 2011)。經同位素標記之化合物可用於各種研究中，諸如NMR光譜法、代謝實驗及/或分析。
經諸如氘之較重同位素取代可獲得由更大代謝穩定性產生之某些治療優勢，例如延長之活體內半衰期或降低之劑量需求，且因此在某些情況下可為較佳的。(參見例如A. Kerekes等人, J . Med. Chem.2011, 54, 201-210；R. Xu等人, J . Label Compd. Radiopharm.2015, 58, 308-312)。特定言之，一或多個代謝位點處之取代可獲得一或多種治療優勢。
併入本發明之經放射性標記之化合物中之放射性核種將視經放射性標記之化合物之特定應用而定。舉例而言，對於活體外腺苷受體標記及競爭分析，併入 3H、 14C、 82Br、 125I、 131I或 35S之化合物可為適用的。對於放射性成像應用， 11C、 18F、 125I、 123I、 124I、 131I、 75Br、 76Br或 77Br可為適用的。
應瞭解，「經放射性標記」或「經標記之化合物」係併入至少一種放射性核種之化合物。在一些實施例中，放射性核種係選自 3H、 14C、 125I、 35S及 82Br。
本發明可進一步包括將放射性同位素併入至本發明化合物中之合成方法。將放射性同位素併入至有機化合物中之合成方法在此項技術中已熟知，且一般熟習此項技術者將易於認識到可用於本發明化合物之方法。
經標記之本發明之化合物可用於篩選分析以鑑別及/或評估化合物。舉例而言，經由追蹤標記，可藉由監測當與KRAS接觸時其濃度變化來評估經標記之新合成或經鑑別之化合物(亦即測試化合物)結合KRAS蛋白之能力。舉例而言，可評估測試化合物(經標記之化合物)減少已知結合至KRAS蛋白之另一化合物(亦即標準化合物)之結合的能力。因此，測試化合物與標準化合物競爭結合至KRAS蛋白之能力與其結合親和力直接相關。相反，在一些其他篩選分析中，標準化合物經標記而測試化合物未經標記。因此，監測經標記標準化合物之濃度以評估標準化合物與測試化合物之間的競爭，且由此確定測試化合物之相對結合親和力。
套組本發明亦包括可用於例如治療或預防與KRAS活性相關之諸如癌症或感染之疾病或病症的醫藥套組，其包括含有醫藥組合物之一或多個容器，該醫藥組合物包含治療有效量之式I、II之化合物或其實施例中之任一者。此類套組可進一步包括各種習知醫藥套組組分中之一或多者，諸如具有一或多種醫藥學上可接受之載劑之容器、另外的容器等，如對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。套組中亦可包括呈插頁或呈標籤形式之說明書，其指示待投與組分之量、投與指南及/或用於混合組分之指南。
本發明將藉助於特定實例更詳細地加以描述。以下實例係出於說明之目的而提供，且不意欲以任何方式限制本發明。熟習此項技術者將易於識別出可改變或修改以產生基本上相同結果之各種非關鍵參數。已發現該等實例之化合物會根據至少一種本文所描述之分析抑制KRAS之活性。
實例下文提供本發明之化合物的實驗程序。一些所製備化合物之製備型LC-MS純化係在Waters質量定向分餾系統上進行。用於操作此等系統之基礎設備設定、方案及控制軟體已詳細描述於文獻中。參見例如「Two-Pump At Column Dilution Configuration for Preparative LC-MS」, K. Blom, J. Combi. Chem., 4, 295 ( 2002)；「Optimizing Preparative LC-MS Configurations and Methods for Parallel Synthesis Purification」, K. Blom, R. Sparks, J. Doughty, G. Everlof, T. Haque, A. Combs, J. Combi. Chem., 5, 670 ( 2003)；及「Preparative LC-MS Purification: Improved Compound Specific Method Optimization」, K. Blom, B. Glass, R. Sparks, A. Combs, J. Combi. Chem., 6, 874-883 ( 2004)。所分離之化合物通常進行分析型液相層析質譜分析(LCMS)以進行純度檢查。
所分離之化合物通常在以下條件下進行分析型液相層析質譜分析(LCMS)以進行純度檢查：儀器：Agilent 1100系列，LC/MSD，管柱：Waters Sunfire TMC 185 µm粒度，2.1×5.0 mm，緩衝液：移動相A：0.025% TFA水溶液及移動相B：乙腈；梯度為在3分鐘內2%至80% B，流動速率為2.0毫升/分鐘。
一些所製備化合物亦藉由具有MS偵測器之逆相高效液相層析(RP-HPLC)或急驟層析(矽膠)以製備規模分離，如實例中所指示。典型的製備型逆相高效液相層析(RP-HPLC)管柱條件如下： pH = 2純化：Waters Sunfire TMC 185 µm粒度，19×100 mm管柱，用移動相A：0.1% TFA (三氟乙酸)水溶液及移動相B：乙腈溶離；流動速率為30毫升/分鐘，使用如文獻中所描之化合物特定方法最佳化方案使各化合物之分離梯度最佳化[參見「Preparative LCMS Purification: Improved Compound Specific Method Optimization」, K. Blom, B. Glass, R. Sparks, A. Combs, J. Comb. Chem., 6, 874-883 (2004)]。通常，用於30×100 mm管柱之流動速率為60毫升/分鐘。 pH = 10純化：Waters XBridge C 185 µm粒度，19×100 mm管柱，用移動相A：0.15% NH 4OH水溶液及移動相B：乙腈溶離；流動速率為30毫升/分鐘，使用如文獻中所描述之化合物特定方法最佳化方案使各化合物之分離梯度最佳化[參見「Preparative LCMS Purification: Improved Compound Specific Method Optimization」, K. Blom, B. Glass, R. Sparks, A. Combs, J. Comb. Chem., 6, 874-883 (2004)]。通常，用於30×100 mm管柱之流動速率為60毫升/分鐘。
可在本文中使用以下縮寫：AcOH (乙酸)；Ac 2O (乙酸酐)；aq. (水溶液)；atm. (大氣壓)；Boc (三級丁氧基羰基)；BOP ((苯并三唑-1-基氧基)三(二甲胺基)六氟磷酸鏻)；br (寬峰)；Cbz (羧基苯甲基)；calc. (計算值)；d (二重峰)；dd (雙重二重峰)；DBU (1,8-二氮雜二環[5.4.0]十一-7-烯)；DCM (二氯甲烷)；DIAD (疊氮二甲酸 N, N'-二異丙酯)；DIEA (N,N-二異丙基乙胺)；DIPEA ( N, N-二異丙基乙胺)；DIBAL (二異丁基氫化鋁)；DMF ( N, N-二甲基甲醯胺)；Et (乙基)；EtOAc (乙酸乙酯)；FCC (急驟管柱層析)；g (公克)；h (小時)；HATU ( N, N, N', N'-四甲基-O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)六氟磷酸釒尿)；HCl (鹽酸)；HPLC (高效液相層析)；Hz (赫茲)；J (偶合常數)；LCMS (液相層析-質譜)；LDA (二異丙胺基鋰)；m (多重峰)；M (莫耳)； mCPBA (3-氯過氧苯甲酸)；MS (質譜)；Me (甲基)；MeCN (乙腈)；MeOH (甲醇)；mg (毫克)；min. (分鐘)；mL (毫升)；mmol (毫莫耳)；N (當量)；NCS (N-氯丁二醯亞胺)；NEt 3(三乙胺)；nM (奈莫耳)；NMP (N-甲基吡咯啶酮)；NMR (核磁共振光譜)；OTf (三氟甲烷磺酸鹽)；Ph (苯基)；pM (皮莫耳)；PPT (沈澱)；RP-HPLC (逆相高效液相層析)；r.t. (室溫)；s (單峰)；t (三重峰或三級)；TBS (三級丁基二甲基矽基)；tert (三級)；tt (三重三重峰)；TFA (三氟乙酸)；THF (四氫呋喃)；µg (微克)；µL (微升)；µM (微莫耳)；wt % (重量百分比)。鹽水為飽和氯化鈉水溶液。真空為在真空下。
實例 1a 及實例 1b. 1-(1-((2S,4S)-1-( 丁 -2- 炔醯基 )-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -4- 基 )-8- 氯 -6- 氟 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -7- 基 ) 異喹啉 -8- 甲腈 步驟 1. 2- 胺基 -4- 溴 -3- 氟苯甲酸乙酯 向2-胺基-4-溴-3-氟苯甲酸(22.7 g，92 mmol)於乙醇(184 mL)中之溶液中緩慢添加硫酸(9.82 mL，184 mmol)。將所得混合物加熱至回流持續2天。冷卻至室溫後，反應混合物用水稀釋且用6 M NaOH (22 mL)調節pH至7。真空移除有機溶劑。所得混合物用乙酸乙酯及水稀釋。有機層用0.5 N NaOH溶液、鹽水洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮，得到所需產物(23.2 g，96%)。C 9H 10BrFNO 2(M+H) +m/z之LCMS計算值= 262.0，264.0；實驗值262.0，264.0。
步驟 2. 2- 胺基 -3- 氟 -4-(4,4,5,5- 四甲基 -1,3,2- 二氧雜硼雜環戊烷 -2- 基 ) 苯甲酸乙酯 將2-胺基-4-溴-3-氟苯甲酸乙酯(21.8 g，83 mmol)、雙(頻哪醇根基)二硼(25.3 g，100 mmol)、二氯[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]鈀(II)二氯甲烷加合物(6.79 g，8.32 mmol)及無水乙酸鉀(17.96 g，183 mmol)及二㗁烷(416 ml)之混合物在氮氣氛圍下於100℃攪拌5小時。粗物質經由矽藻土過濾且用乙酸乙酯洗滌。濃縮濾液。殘餘物經急驟層析純化，得到所需產物(24 g，93%)。C 15H 22BFNO 4(M+H) +m/z之LCMS計算值= 310.2；實驗值310.1。
步驟 3 . 8- 氰基異喹啉 2- 氧化物 在0℃下，向異喹啉-8-甲腈(3.70 g，24.00 mmol)於CH 2Cl 2(240 ml)中之溶液中添加m-CPBA (7.10 g，28.8 mmol)。在0℃下攪拌反應混合物2小時。用飽和NaHCO 3溶液稀釋反應混合物。水層用DCM萃取(3×)。合併之有機層經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。藉由急驟層析(用0至100%梯度之乙酸乙酯/己烷溶離)純化粗物質，得到所需產物(3.2 g，78%)。C 10H 7N 2O (M+H) +: m/z之LC-MS計算值=171.1；實驗值171.1。
步驟 4 . 1- 氯異喹啉 -8- 甲腈 向8-氰基異喹啉2-氧化物(5.30 g，31.1 mmol)、2,6-二甲基吡啶(7.26 ml，62.3 mmol)於CH 2Cl 2(62.3 ml)中之溶液中添加POCl 3(5.81 ml，62.3 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物2小時。藉由添加飽和NaHCO 3(80 mL)淬滅反應混合物。有機層經MgSO 4乾燥且濃縮，得到粗產物。用乙酸乙酯/己烷濕磨粗產物，得到呈白色固體狀之所需產物(4.0 g，68%)。C 10H 6ClN 2(M+H) +: m/z之LC-MS計算值=189.0；實驗值189.0。
步驟 5. 2- 胺基 -4-(8- 氰基異喹啉 -1- 基 )-3- 氟苯甲酸乙酯 將1-氯異喹啉-8-甲腈(6.60 g，35.0 mmol)、2-胺基-3-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)苯甲酸乙酯(11.36 g，36.7 mmol)、SPhos Pd G4 (1.390 g，1.750 mmol)及磷酸三鉀水合物(17.73 g，77 mmol)於1,4-二㗁烷(120 mL)及水(24 mL)中之混合物在80℃攪拌2小時。用乙酸乙酯及水稀釋溶液。濃縮有機層。粗物質未經純化即用於下一步驟中。C 19H 15FN 3O 2(M+H) +: m/z之LC-MS計算值=336.1；實驗值336.1。
步驟 6. 2- 胺基 -5- 氯 -4-(8- 氰基異喹啉 -1- 基 )-3- 氟苯甲酸乙酯 在室溫下，向2-胺基-4-(8-氰基異喹啉-1-基)-3-氟苯甲酸乙酯(11.7 g，34.9 mmol)於DMF (116 mL)中之溶液中添加NCS (5.12 g，38.4 mmol)。在80℃下加熱混合物15小時。將反應混合物冷卻至室溫且用水稀釋。藉由過濾收集沈澱物且用水及乙酸乙酯/己烷(1:2)洗滌。用乙酸乙酯萃取濾液。濃縮有機層。藉由過濾收集固體且用乙酸乙酯/己烷(1:2)洗滌，得到所需產物(10.2 g，79%)。C 19H 14ClFN 3O 2(M+H) +: m/z之LC-MS計算值=370.1；實驗值370.1。
步驟 7. 5- 氯 -4-(8- 氰基異喹啉 -1- 基 )-2-(3- 乙氧基 -3- 側氧基丙醯胺基 )-3- 氟苯甲酸乙酯 在0℃下，向2-胺基-5-氯-4-(8-氰基異喹啉-1-基)-3-氟苯甲酸乙酯(10.3 g，27.9 mmol)及TEA (5.05 ml，36.2 mmol)於DCM (280 mL)中之溶液中逐滴添加3-氯-3-側氧基丙酸乙酯(3.92 ml，30.6 mmol)。所得混合物在0℃下攪拌且藉由LC-MS監測。逐滴添加另一當量3-氯-3-側氧基丙酸乙酯(3.92 ml，30.6 mmol)且攪拌1小時。用水及DCM稀釋反應物。分離有機層且經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。殘餘物藉由急驟層析純化，得到所需產物(9.5 g，70%)。C 24H 20ClFN 3O 5(M+H) +: m/z之LC-MS計算值=484.1；實驗值484.1。
步驟 8. 6- 氯 -7-(8- 氰基異喹啉 -1- 基 )-8- 氟 -2,4- 二羥基喹啉 -3- 甲酸 乙酯 將21%乙醇鈉(19.91 ml，53.3 mmol)於EtOH中之溶液逐滴添加至5-氯-4-(8-氰基異喹啉-1-基)-2-(3-乙氧基-3-側氧基丙醯胺)-3-氟苯甲酸乙酯(8.6 g，17.77 mmol)於EtOH(80 ml)中之溶液中。在室溫下攪拌所得混合物2小時。向反應燒瓶中添加1 N HCl以調節pH至3。真空移除溶劑。收集所得沈澱物且用乙酸乙酯洗滌，得到呈白色固體狀之所需產物(7.4 g，95%)。C 22H 14ClFN 3O 4(M+H) +: m/z之LC-MS計算值=438.1；實驗值438.1。
步驟 9. 6- 氯 -7-(8- 氰基異喹啉 -1- 基 )-8- 氟 -2,4- 二羥基喹啉 -3- 甲酸 乙酯 向反應燒瓶中添加6-氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-8-氟-2,4-二羥基喹啉-3-甲酸乙酯(7.4 g，16.90 mmol)及POCl 3(31.5 ml，338 mmol)，將所得混合物在110℃下攪拌2小時。藉由與甲苯共沸(3次)移除POCl 3，且殘餘物用DCM及飽和NaHCO 3溶液稀釋。分離有機層且經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。粗物質用乙酸乙酯/己烷(1:1)濕磨，得到呈白色固體狀之所需產物(7.24 g，90%)。C 22H 12Cl 3FN 3O 2(M+H) +: m/z之LC-MS計算值=474.0，476.0；實驗值474.0，476.0。
步驟 10. 4-(((2S,4S)-1-( 三級丁氧基羰基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -4- 基 ) 胺基 )-2,6- 二氯 -7-(8- 氰基異喹啉 -1- 基 )-8- 氟喹啉 -3- 甲酸 乙酯 向2,4,6-三氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-8-氟喹啉-3-甲酸乙酯(7.24 g，15.25 mmol)於DMF (100 ml)中之溶液中添加(2S,4S)-4-胺基-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(6.56 g，18.30 mmol)及DIEA (5.3 ml，30.5 mmol)。將所得混合物在65℃下攪拌隔夜。將反應混合物用乙酸乙酯及水稀釋。將有機層用水及鹽水洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。粗物質藉由矽膠管柱(用0至30%梯度之乙酸乙酯/己烷溶離)純化，得到呈淺黃色泡沫狀之所需產物(11.5 g，95%)。C 40H 49Cl 2FN 5O 5Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 796.3，798.3；實驗值796.3，798.3。
步驟 11. (2S,4S)-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 )-4-((2,6- 二氯 -7-(8- 氰基異喹啉 -1- 基 )-8- 氟 -3-( 羥基甲基 ) 喹啉 -4- 基 ) 胺基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 在-78℃下，向4-(((2S,4S)-1-(三級丁氧基羰基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-4-基)胺基)-2,6-二氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-8-氟喹啉-3-甲酸乙酯(2.45 g，3.07 mmol)於甲苯(30.7 ml)中之溶液中添加1.0 M含DIBAL-H之DCM (9.84 ml，9.84 mmol)。使所得混合物經2小時時段升溫至-20℃，用甲醇(1.3 mL)淬滅。在≤10℃將羅謝爾(Rochelle)鹽水溶液(由14.7 g (6 wt)羅謝爾鹽及50 mL水製備)添加至溶液中。兩相混合物在15-25℃下劇烈攪拌≥1小時且分離，得到有機層。有機層經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。且按原樣使用。C 38H 47Cl 2FN 5O 4Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 754.3，756.3；實驗值754.3，756.3。
步驟 12. (2S,4S)-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 )-4-((2,6- 二氯 -7-(8- 氰基異喹啉 -1- 基 )-8- 氟 -3- 甲醯基喹啉 -4- 基 ) 胺基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 向(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-((2,6-二氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-8-氟-3-(羥基甲基)喹啉-4-基)胺基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(2.32 g，3.07 mmol)於DCM (23 ml)及乙腈(7.7 ml)中之溶液中添加乙酸(0.53 ml，9.22 mmol)及IBX (2.58 g，9.22 mmol)。在38℃下攪拌所得混合物22小時，過濾反應混合物且用DCM洗滌。濃縮濾液且用矽膠管柱(用含0至20%梯度之乙酸乙酯/己烷溶離)純化，得到呈兩個峰形式之所需產物。
非對映異構體1 (1.05 g，45%). 峰1. C 38H 45Cl 2FN 5O 4Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 752.3，754.3；實驗值752.3，754.3。
非對映異構體2 (1.05 g，45%). 峰2. C 38H 45Cl 2FN 5O 4Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 752.3，754.3；實驗值752.3，754.3。
步驟 13. (2S,4S)-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 )-4-((2,6- 二氯 -7-(8- 氰基異喹啉 -1- 基 )-8- 氟 -3-((E)-( 羥亞胺基 ) 甲基 ) 喹啉 -4- 基 ) 胺基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 向(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-((2,6-二氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-8-氟-3-甲醯基喹啉-4-基)胺基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(0.85 g，1.13 mmol) (來自最後一個步驟之峰1)、DCM (11 ml)及EtOH (11 ml)之混合物中添加鹽酸羥胺(0.259 g，3.73 mmol)及吡啶(0.30 ml，3.73 mmol)。將反應混合物在40℃下攪拌16小時。在真空中蒸發溶劑。殘餘物與DCM及水混合。用DCM萃取水層。經合併之有機層用CuSO 4水溶液、鹽水洗滌，經MgSO 4乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，得到所需產物(0.5 g，57%)。C 38H 46Cl 2FN 6O 4Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 767.3，769.3；實驗值767.3，769.3。
非對映異構體2以與非對映異構體1類似之方式使用來自最後一個步驟之峰2來製備。C 38H 46Cl 2FN 6O 4Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 767.3，769.3；實驗值767.3，769.3。
步驟 14. (2S,4S)-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 )-4-(4,8- 二氯 -7-(8- 氰基異喹啉 -1- 基 )-6- 氟 -1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 在0℃下，向(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-((2,6-二氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-8-氟-3-((E)-(羥亞胺基)甲基)喹啉-4-基)胺基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(486 mg，0.633 mmol) (來自最後一個步驟之非對映異構體1)於CH 2Cl 2(5 mL)中之溶液中添加2-胺基吡啶(113 mg，1.203 mmol)及Ms-Cl (84 µl，1.076 mmol)。在0℃下攪拌所得混合物2小時，隨後升溫至室溫隔夜。用水稀釋反應混合物。用鹽水洗滌有機層，經MgSO 4乾燥，過濾且濃縮。且按原樣使用。C 38H 44Cl 2FN 6O 3Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 749.3，751.3；實驗值749.3，751.3。
非對映異構體2以與非對映異構體1類似之方式使用來自最後一個步驟之峰2來製備。C 38H 44Cl 2FN 6O 3Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 749.3，751.3；實驗值749.3，751.3。
步驟 15. (2S,4S)-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 )-4-(8- 氯 -7-(8- 氰基異喹啉 -1- 基 )-6- 氟 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 將甲硫醇鈉(133 mg ，1.901mmol)添加至(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-(4,8-二氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-6-氟-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(475 mg，0.634 mmol) (來自最後一個步驟之非對映異構體1)於MeOH (6.3 ml)/1,4-二㗁烷(6.3 ml)之混合物中，在90℃下攪拌18小時。該混合物用飽和NH 4Cl稀釋且用EtOAc萃取。經合併之有機層經MgSO 4乾燥，過濾、濃縮且按原樣使用。C 39H 47ClFN 6O 3SSi (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 761.3；實驗值761.3。
非對映異構體2以與非對映異構體1類似之方式使用來自最後一個步驟之峰2來製備。C 39H 47ClFN 6O 3SSi (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 761.3；實驗值761.3。
步驟 16. (2S,4S)-4-(8- 氯 -7-(8- 氰基異喹啉 -1- 基 )-6- 氟 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-(2- 羥基乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 向(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-(8-氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(482mg，0.633 mmol) (來自最後一個步驟之非對映異構體1)於THF (6.33 ml)之溶液中添加含1.0 M含TBAF之THF (633 µl，0.633 mmol)中。在60℃下攪拌所得混合物1小時。在冷卻至室溫後，反應混合物用水及乙酸乙酯稀釋。分離有機層且用鹽水洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。殘餘物經急驟層析純化，得到所需產物(0.39 g，95%)。C 33H 33ClFN 6O 3S (M+H) +: m/z之LC-MS計算值=647.2；實驗值647.2。
非對映異構體2以與非對映異構體1類似之方式使用來自最後一個步驟之峰2來製備。C 33H 33ClFN 6O 3S (M+H) +: m/z之LC-MS計算值=647.2；實驗值647.2。
步驟 17. (2S,4S)-4-(8- 氯 -7-(8- 氯萘 -1- 基 )-6- 氟 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 向(2S,4S)-4-(8-氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(2-羥基乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(392 mg，0.606 mmol)於DCM (6.0 ml)中之溶液中添加戴斯-馬丁高碘烷(283 mg，0.666 mmol)。將所得混合物攪拌1小時，向反應燒瓶中添加飽和NaHCO 3且攪拌10分鐘。分離有機層且經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。將粗物質溶解於THF (20 mL)中，向反應燒瓶中添加氫氧化銨(1.37 ml，9.81 mmol)，隨後添加碘(157 mg，0.618 mmol)。在室溫下攪拌所得混合物2小時，用乙酸乙酯及飽和NaS 2O 3溶液稀釋反應溶液。分離有機層且用鹽水洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。殘餘物經急驟層析純化，得到所需產物(0.32 g，82%)。C 33H 30ClFN 7O 2S (M+H) +: m/z之LC-MS計算值=641.2；實驗值641.2。
非對映異構體2以與非對映異構體1類似之方式使用來自最後一個步驟之峰2來製備。C 33H 30ClFN 7O 2S (M+H) +: m/z之LC-MS計算值=641.2；實驗值641.2。
步驟 18. 1-(8- 氯 -1-((2S,4S)-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -4- 基 )-6- 氟 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -7- 基 ) 異喹啉 -8- 甲腈 在0℃下將m-CPBA (43.9 mg，0.254 mmol)添加至(2S,4S)-4-(8-氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(142 mg，0.221 mmol)於CH 2Cl 2(2.211 ml)中之溶液中，且隨後將反應物在此溫度下攪拌20分鐘。藉由添加飽和Na 2S 2O 3淬滅反應物，將其用乙酸乙酯稀釋且用飽和NaHCO 3溶液、鹽水洗滌，過濾且濃縮，且將粗物質直接用於下一步驟中。
將LiHMDS (318 µl，0.318 mmol)添加至(S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙-1-醇(41.0 mg，0.318 mmol)於THF (1 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌所得混合物30分鐘。將第一溶液添加至(2S,4S)-4-(8-氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-6-氟-4-(甲基亞磺醯基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(95 mg，0.144 mmol)於THF (2.0 ml)中之溶液中，且隨後將反應物在60℃下攪拌2小時。將反應混合物用乙酸乙酯及水稀釋。分離有機層且經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。用1:1 DCM/TFA (2 mL)處理殘餘物1小時。在真空中蒸發溶劑。藉由製備型LCMS (XBridge C18管柱，用一定梯度之乙腈/含有0.1% TFA之水以60毫升/分鐘之流動速率溶離)純化殘餘物，得到呈兩個峰之所需產物(60 mg，58%)。C 34H 33ClFN 8O (M+H) +: m/z之LC-MS計算值=623.2；實驗值623.2。
非對映異構體2以與非對映異構體1類似之方式使用來自最後一個步驟之峰2來製備。C 34H 33ClFN 8O (M+H) +: m/z之LC-MS計算值=623.2；實驗值623.2。
步驟 19. 1-(1-((2S,4S)-1-( 丁 -2- 炔醯基 )-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -4- 基 )-8- 氯 -6- 氟 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -7- 基 ) 異喹啉 -8- 甲腈向丁-2-炔酸(0.711 mg，8.46 µmol )及1-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)異喹啉-8-甲腈雙(2,2,2-三氟乙酸酯) (6.0 mg，7.05 µmol)於DMF (1.0 ml)中之溶液中添加HATU (3.4 mg，8.81 µmol)及DIEA (4.9 µl，0.028 mmol)。在室溫下攪拌所得混合物2小時。將反應物用甲醇及1 N HCl (0.1 mL)稀釋，隨後使用製備型LCMS (XBridge C18管柱，用一定梯度之乙腈/含有0.1% TFA之水，以60毫升/分鐘之流動速率溶離)純化殘餘物，得到所需非對映異構體1。
非對映異構體2以類似方式使用1-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)異喹啉-8-甲腈雙(2,2,2-三氟乙酸酯) (來自最後一步之峰2)合成。
實例 1a. 非對映異構體1. 峰1. C 38H 35ClFN 8O 2(M+H) +m/z之LCMS計算值= 689.3；實驗值689.3。
實例 1b. 非對映異構體2. 峰2. C 38H 35ClFN 8O 2(M+H) +m/z之LCMS計算值= 689.3；實驗值689.3。
實例 2a 及實例 2b. 1-(8- 氯 -1-((2S,4S)-2-( 氰基甲基 )-1-((E)-4- 甲氧基丁 -2- 烯醯基 ) 哌啶 -4- 基 )-6- 氟 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -7- 基 ) 異喹啉 -8- 甲腈 此化合物係根據 實例 1a 及實例 1b 步驟 19中所描述之程序，用(E)-4-甲氧基丁-2-烯酸置換丁-2-炔酸來製備。C 39H 39ClFN 8O 3(M+H) +: m/z之LCMS計算值= 721.3；實驗值：721.3。
實例 3a 及實例 3b. 1-(8- 氯 -1-((2S,4S)-2-( 氰基甲基 )-1-(2- 氟丙烯醯基 ) 哌啶 -4- 基 )-6- 氟 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -7- 基 ) 異喹啉 -8- 甲腈 此化合物係根據 實例 1a 及實例 1b 步驟 19中所描述之程序，用2-氟丙烯酸置換丁-2-炔酸來製備。C 37H 34ClF 2N 8O 2(M+H) +: m/z之LCMS計算值= 695.2；實驗值：695.2。
實例 4a 及實例 4b. 2-((2S,4S)-4-(8- 氯 -7-(5,6- 二甲基 -1H- 吲唑 -4- 基 )-4-(3-( 乙基 ( 甲基 ) 胺基 ) 氮雜環丁烷 -1- 基 )-6- 氟 -1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-1-(2- 氟丙烯醯基 ) 哌啶 -2- 基 ) 乙腈 步驟 1 ： 2- 胺基 -4- 溴 -5- 氯 -3- 氟苯甲酸甲酯 在室溫下將硫酸(7.76 ml，146 mmol)緩慢添加至2-胺-4-溴-5-氯-3-氟苯甲酸(19.5 g，72.8 mmol)於MeOH (146 ml)中之溶液中。將所得混合物加熱至80℃隔夜。隨後將混合物冷卻至室溫且緩慢倒入飽和NaHCO 3中。在室溫下攪拌混合物30分鐘，隨後用EtOAc萃取。有機層經MgSO 4乾燥，過濾，濃縮，且不經進一步純化即用於下一步驟中。C 8H 7BrClFNO 2(M+H) +: m/z之LC-MS計算值=281.9，283.9；實驗值281.9，283.9。
步驟 2 ： 7- 溴 -6- 氯 -8- 氟 -4- 羥基 -2- 側氧基 -1,2- 二氫喹啉 -3- 甲酸乙酯 在室溫下將3-氯-3-側氧基丙酸乙酯(9.60 ml，75.0 mmol)逐滴添加至2-胺基-4-溴-5-氯-3-氟苯甲酸甲酯(19.25 g，68.1 mmol)及TEA(14.25 ml，102 mmol)於DCM(150 mL)中之溶液中。在攪拌1小時之後，額外添加3-氯-3-側氧基丙酸乙酯(1.745 ml，13.63 mmol)。在再攪拌1小時之後，用水淬滅反應物，隨後用乙酸乙酯萃取。有機層經乾燥，過濾，隨後濃縮。將濃縮殘餘物再溶解於EtOH (150 ml)中且添加含乙醇鈉之乙醇(53.4 ml，143 mmol)。在室溫下攪拌1小時。將反應混合物傾入水(1 L)中且酸化至pH約3，經由過濾收集所得沈澱物，得到所需產物(18.39 g，74.0%)。C 12H 9BrClFNO 4(M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 363.9，365.9；實驗值363.9，365.9。
步驟 3 ： 7- 溴 -2,4,6- 三氯 -8- 氟喹啉 -3- 甲酸乙酯 將7-溴-6-氯-8-氟-2,4-二羥基喹啉-3-甲酸乙酯(2.0 g，5.49 mmol)溶解於POCl 3(10.2 ml，110 mmol)中，且添加DIEA (1.92 ml，10.97 mmol)。在100℃下攪拌所得混合物2小時。在冷卻至室溫後，藉由緩慢傾入快速攪拌之冰水(約250 mL)淬滅反應物，攪拌30分鐘，隨後經由過濾收集固體，得到呈褐色固體之所需產物(1.66 g，75%)。C 12H 7BrCl 3FNO 2(M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 399.9，401.9，403.9；實驗值399.9，401.9，403.9。
步驟 4. (R)-6- 氰基 -5- 羥基 -3- 側氧基己酸三級丁酯 將2.0 M LDA (100 ml，200 mmol)於無水THF (223 ml)中之溶液中冷卻至-78℃持續1小時，且隨後在攪拌下經20分鐘逐滴添加乙酸三級丁酯(26.9 ml，200 mmol)。在-78℃下再維持40分鐘後，逐滴添加(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯(10.5 g，66.8 mmol)之溶液。使混合物在-40℃下攪拌4小時，且隨後將適量HCl (2 M)添加至混合物中，保持pH約6。在此淬滅期間，將混合物之溫度維持在-10℃。完成後，將混合物之溫度冷卻至0℃。用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取混合物。將合併之有機層用NaHCO 3(100 mL)及鹽水(100 mL)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥且蒸發，得到呈黃色油狀物之物質(15.0 g，99%)。
步驟 5. (2S,4R)-2-(2-( 三級丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-4- 羥基哌啶 -1- 甲酸 三級丁酯 用氧化鉑(IV)水合物(0.868 g，3.30 mmol)處理(R)-6-氰基-5-羥基-3-側氧基己酸三級丁酯(15.0 g，66.0 mmol)於乙酸(110 ml)中之溶液。將帕爾瓶抽成真空且用H 2回填三次，並在H 2氛圍(45 psi，再裝入4次)下在22℃下攪拌3小時。經由矽藻土過濾混合物且用EtOH洗滌濾餅。濃縮濾液，得到具有約9:1順:反非對映異構體比率之產物。將殘餘物溶解於甲醇(100 mL)中，隨後添加Boc酸酐(15.3 ml，66.0 mmol)、碳酸鈉(13.99 g，132 mmol)。在室溫攪拌反應混合物隔夜。過濾混合物且濃縮。藉由矽膠管柱純化殘餘物，得到所需產物(11.7 g，56%)。C 16H 29NNaO 5(M+Na) +: m/z之LCMS(產物+Na +)計算值= 338.2；實驗值：338.2。
步驟 6. (2S,4S)-4- 疊氮基 -2-(2-( 三級丁氧基 )-2- 側氧基乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸 三級丁酯 在0℃向(2S,4R)-2-(2-(三級丁氧基)-2-側氧基乙基-4-羥基哌啶-1-甲酸三級丁酯(2.10 g，6.66 mmol)於DCM (33 ml)中之溶液中添加Ms-Cl (0.67 mL，8.66 mmol)。在攪拌1小時後，用水稀釋反應物，分離有機層且經Na 2SO 4乾燥，過濾並濃縮。將所得殘餘物溶解於DMF中且添加疊氮化鈉(1.3 g，20 mmol)，且在70℃下將反應混合物加熱5小時。在冷卻至室溫之後，用EtOAc及水稀釋反應物。分離有機層且經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠管柱純化殘餘物，得到所需產物(1.90 g，84%)。(產物-Boc) C 11H 21N 4O 2(M+H) +: m/z之LCMS計算值= 241.2；實驗值241.2。
步驟 7. (2S,4S)-4- 疊氮基 -2-(2- 羥基乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸 三級丁酯 在-78℃下向(2S,4S)-4-疊氮基-2-(2-三級丁氧基)-2-側氧基乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(21.4 g，62.9 mmol)於DCM(400 ml)中之溶液中添加含1.0 M DIBAL-H之DCM (113 ml，113 mmol)。將所得混合物在-78℃下攪拌2小時。反應物用甲醇(38.1 ml，943 mmol)在-78℃下淬滅。在≤10℃下將羅謝爾鹽水溶液(由126 g (6 wt)羅謝爾鹽及300 mL水製備)添加至溶液中。在15至25℃下劇烈攪拌兩相混合物≥1小時且分離，得到有機層。分離兩相混合物。在15至25℃下用NaCl水溶液(×2)洗滌有機層。經Na 2SO 4乾燥有機層，過濾且濃縮。將殘餘物溶解於甲醇(300 mL)中且在0℃下添加硼氫化鈉(1.43 g，37.7 mmol)。在0℃攪拌反應混合物1小時。用水淬滅反應物且減壓蒸發甲醇。用乙酸乙酯(2×)萃取反應混合物，且用鹽水洗滌有機層，經Na 2SO 4乾燥，過濾並濃縮。藉由急驟層析(用0至50%梯度之乙酸乙酯/己烷溶離)純化粗物質，得到呈無色油狀物之所需產物(14.8 g，87%)。(產物-Boc) C 7H 15N 4O (M+H) +: m/z之LCMS計算值= 171.1；實驗值：171.1。
步驟 8. (2S,4S)-4- 疊氮基 -2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸 三級丁酯 向(2S,4S)-4-疊氮基-2-(2-羥基乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(4.0 g，14.80 mmol)於DMF (74.0 ml)中之溶液中添加咪唑(1.51 g，22.2 mmol)及TBS-Cl (2.90 g，19.24 mmol)。在60℃下攪拌所得混合物1小時15分鐘。反應混合物用EtOAc及水稀釋。將有機層用水(2×)、鹽水洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。藉由急驟層析(0至20%乙酸乙酯/己烷)純化殘餘物，得到呈無色油狀物之所需產物(5.30 g，93%)。(產物-Boc) C 13H 29N 4OSi (M+H) +: m/z之LCMS計算值= 285.2；實驗值：285.2。
步驟 9. (2S,4S)-4- 胺基 -2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸 三級丁酯 向(2S,4S)-4-疊氮基-2-(2-(三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-哌啶-1-甲酸三級丁酯(5.30 g，13.78 mmol)於甲醇(70 ml)中之溶液中添加10%鈀/碳(1.47 g，1.38 mmol)。在真空下抽空反應混合物且用H 2再填充，在室溫下攪拌2小時。經由矽藻土墊過濾反應混合物且用甲醇洗滌。濃縮濾液，得到所需產物(4.5 g，91%)。(產物-Boc) C 13H 31N 2OSi (M+H) +: m/z之LCMS計算值= 259.2；實驗值：259.2。
步驟 10. 7- 溴 -4-(((2S,4S)-1-( 三級丁氧基羰基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -4- 基 ) 胺基 )-2,6- 二氯 -8- 氟喹啉 -3- 甲酸 乙酯 向7-溴-2,4,6-三氯-8-氟喹啉-3-甲酸乙酯(8.7 g，21.7 mmol)於DMF (80 ml)中之溶液中添加(2S,4S)-4-胺基-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(9.33 g，26.0 mmol)及DIEA (7.6 ml，43.3 mmol)。在65℃下攪拌所得混合物5小時。冷卻至室溫後，添加乙酸乙酯及水。將有機層用水(2×)及鹽水洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。藉由急驟層析(用0至25%乙酸乙酯/己烷溶離)純化殘餘物，得到呈泡沫狀之所需產物(14.6 g，93%)。C 30H 44BrCl 2FN 3O 5Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 722.2，724.2；實驗值722.2，724.2。
步驟 11. (2S,4S)-4-((7- 溴 -2,6- 二氯 -8- 氟 -3-( 羥基甲基 ) 喹啉 -4- 基 ) 胺基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸 三級丁酯 在-78℃下向7-溴-4-(((2S,4S)-1-(三級丁氧基羰基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-4-基)胺基)-2,6-二氯-8-氟喹啉-3-甲酸乙酯(14.6 g，20.18 mmol)於甲苯(200 ml)中之溶液中添加含1.0 M DIBAL-H之DCM (60.5 ml，60.5 mmol)。在-78℃下攪拌所得混合物40分鐘且使其升溫至0℃，維持1小時20分鐘，用甲醇(6.8 ml，167mmol)淬滅。在≤10℃下將羅謝爾鹽水溶液(由88 g (6 wt)羅謝爾鹽及200 mL水製備)添加至溶液中。在15至25℃下劇烈攪拌兩相混合物≥1小時且分離，得到有機層。分離兩相混合物。有機層用鹽水洗滌，經Na 2SO 4脫水，過濾且濃縮。按原樣使用粗物質。C 28H 42BrCl 2FN 3O 4Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 680.1，682.1；實驗值680.1，682.1。
步驟 12. (2S,4S)-4-((7- 溴 -2,6- 二氯 -8- 氟 -3- 甲醯基喹啉 -4- 基 ) 胺基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 向(2S,4S)-4-((7-溴-2,6-二氯-8-氟-3-(羥基甲基)喹啉-4-基)胺基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(13.0 g，19.07 mmol)於DCM (150 ml)及乙腈(50 ml)中之溶液中添加IB× (16.02 g，57.2 mmol)及乙酸(3.28 ml，57.2 mmol)。將所得反應混合物在35℃攪拌16小時。過濾反應混合物且濃縮濾液。用EtOAc濕磨所得殘餘物，經由過濾收集所得沈澱物，在真空下乾燥，得到呈淺黃色固體之所需產物(9.4 g，73%，2個步驟)。C 28H 40BrCl 2FN 3O 4Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 678.1，680.1；實驗值678.1，680.1。
步驟 13. (2S,4S)-4-((7- 溴 -2,6- 二氯 -8- 氟 -3-((E)-( 羥亞胺基 ) 甲基 ) 喹啉 -4- 基 ) 胺基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 向(2S,4S)-4-((7-溴-2,6-二氯-8-氟-3-甲醯基喹啉-4-基)胺基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(7.67 g，11.29 mmol)、DCM (56 ml)及EtOH (56 ml)之混合物中添加鹽酸羥胺(2.35 g，33.9 mmol)及吡啶(2.8ml，34.4mmol)。將反應混合物在40℃攪拌16小時。加入另一部分吡啶(2.8 ml，34.4 mmol)及鹽酸羥胺(2.35 g，33.9 mmol)且攪拌4小時。在真空中蒸發溶劑。殘餘物與DCM及水混合。用DCM萃取水層。經合併之有機層用CuSO 4水溶液、鹽水洗，經MgSO 4乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠管柱層析純化殘餘物，得到所需產物(4.5 g，57%)。LC-MS 對於C 28H 41BrCl 2FN 4O 4Si (M+H) +: m/z計算值= 693.1，695.1；實驗值693.1，695.1。
步驟 14. (2S,4S)-4-(7- 溴 -4,8- 二氯 -6- 氟 -1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸 三級丁酯 在0℃向(2S,4S)-4-((7-溴-2,6-二氯-8-氟-3-((E)-(羥亞胺基)甲基)喹啉-4-基)胺基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(4.53 g，6.52 mmol)於CH 2Cl 2(75 mL)中之溶液中添加2-胺基吡啶(0.798 g，8.48mmol)及Ms-Cl (0.610 ml，7.83 mmol)。在0℃攪拌所得混合物2小時。使反應混合物升溫至室溫過夜。用水稀釋反應物。用鹽水洗有機層，經MgSO 4乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠管柱層析(用0至40%乙酸乙酯於己烷中之梯度溶離)純化粗產物，得到所需產物(1.80 g，41%)。LC-MS 對於C 28H 39BrCl 2FN 4O 3Si (M+H) +: m/z計算值= 675.1，677.1；實驗值675.1，677.1。
步驟 15. (2S,4S)-4-(7- 溴 -8- 氯 -6- 氟 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸 三級丁酯 將甲硫醇鈉(0.56 g，8.00 mmol)添加至(2S,4S)-4-(7-溴-4,8-二氯-6-氟-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)-氧基)乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(1.80 g，2.67 mmol)於MeOH (26 ml)/DCM (26 ml)中之混合物中，且隨後在室溫攪拌1小時。該混合物用飽和NH 4Cl稀釋且用EtOAc萃取。經合併之有機層經MgSO 4乾燥，過濾，濃縮。藉由矽膠管柱層析純化粗產物，得到所需產物(1.75 g，95%)。LC-MS 對於C 29H 42BrClFN 4O 3SSi (M+H) +: m/z計算值=687.2，689.2；實驗值687.2，689.2。
步驟 16. (2S,4S)-4-(7- 溴 -8- 氯 -6- 氟 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-(2- 羥基乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸 三級丁酯 向(2S,4S)-4-(7-溴-8-氯-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(1.96 g，2.84 mmol)於THF (28 ml)中之溶液中添加含1.0 M TBAF之THF (4.27 ml，4.27mmol)。在60℃下攪拌所得混合物1小時。在冷卻至室溫後，反應混合物用水及乙酸乙酯稀釋。分離有機層且用鹽水洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。按原樣使用粗物質。C 23H 28BrClFN 4O 3S (M+H) +: m/z之LC-MS計算值=573.1，575.1；實驗值573.1，575.1。
步驟 17. (2S,4S)-4-(7- 溴 -8- 氯 -6- 氟 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -1- 甲酸 三級丁酯 向(2S,4S)-4-(7-溴-8-氯-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(2-羥基乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(0.50 g，0.871 mmol)於DCM (8 ml)中之溶液中添加戴斯-馬丁高碘烷(0.406 g，0.958 mmol)。將所得混合物攪拌1小時，向反應燒瓶中添加飽和NaHCO 3且攪拌10分鐘。分離有機層且經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。將粗物質溶解於THF (10 mL)中，向反應燒瓶中添加氫氧化銨(1.96 ml，14.11 mmol)，隨後添加碘(0.243 g，0.958 mmol)。在室溫下攪拌所得混合物3小時，用乙酸乙酯及飽和NaS 2O 3溶液稀釋反應溶液。分離有機層且用鹽水洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。藉由急驟層析純化殘餘物，得到所需產物(0.40 g，80%)。C 23H 25BrClFN 5O 2S (M+H) +: m/z之LC-MS計算值=568.1，570.1；實驗值568.1，570.1。
步驟 18. (2S,4S)-4-(8- 氯 -7-(6- 氯 -5- 甲基 -1-( 四氫 -2H- 哌喃 -2- 基 )-1H- 吲唑 -4- 基 )-6- 氟 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 在105℃下加熱裝有(2S,4S)-4-(7-溴-8-氯-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(401 mg, 0.705 mmol)、6-氯-5-甲基-1-(四氫-2H-哌喃-2-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)-1H-吲唑(319 mg，0.846mmol)、肆(三苯基膦)鈀(0) (122 mg，0.106 mmol)、碳酸鈉(299 mg，2.82 mmol)及5:1二㗁烷/水(6 ml)之小瓶隔夜。用鹽水及EtOAc稀釋混合物且分離有機層，經MgSO 4乾燥，過濾且蒸發。藉由矽膠管柱層析純化粗產物，得到所需產物(0.39 g，75%)。C 36H 39Cl 2FN 7O 3S (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 738.2；實驗值738.2。
步驟 19. (2S,4S)-4-(8- 氯 -7-(5,6- 二甲基 -1-( 四氫 -2H- 哌喃 -2- 基 )-1H- 吲唑 -4- 基 )-4-(3-( 乙基 ( 甲基 ) 胺基 ) 氮雜環丁烷 -1- 基 )-6- 氟 -1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -1- 甲酸 三級丁酯 在0℃下向(2S,4S)-4-(8-氯-7-(6-氯-5-甲基-1-(四氫-2H-哌喃-2-基)-1H-吲唑-4-基)-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(0.73 g，0.988 mmol)於DCM (10 ml)之溶液中添加 m-CPBA (0.196 g，1.136 mmol)。在此溫度下攪拌反應混合物20分鐘。反應物藉由添加飽和Na 2S 2O 3淬滅，用乙酸乙酯稀釋且用飽和NaHCO 3、鹽水洗滌，過濾，乾燥且濃縮。將粗物質溶解於乙腈(8 ml)中，且將三乙胺(0.607ml，4.36 mmol)及N-乙基-N-甲基氮雜環丁烷-3-胺二鹽酸鹽(0.306 g，1.634 mmol)添加至反應小瓶中，且在80℃下攪拌所得混合物2小時。濃縮粗物質且藉由矽膠管柱(用0至20% DCM於MeOH中之梯度溶離)純化殘餘物，得到所需產物(0.65 g，76%)。LC-MS對於C 42H 52ClFN 9O 3(M+H) +: m/z計算值= 784.4；實驗值784.4。
步驟 20. 2-((2S,4S)-4-(8- 氯 -7-(5,6- 二甲基 -1H- 吲唑 -4- 基 )-4-(3-( 乙基 ( 甲基 ) 胺基 ) 氮雜環丁烷 -1- 基 )-6- 氟 -1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 ) 哌啶 -2- 基 ) 乙腈 向(2S,4S)-4-(8-氯-7-(6-氯-5-甲基-1-(四氫-2H-哌喃-2-基)-1H-吲唑-4-基)-4-(3-(二甲基胺基)氮雜環丁烷-1-基)-6-氟-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(0.65 g，0.771 mmol)於DCM (5 ml)之溶液中添加TFA (4.8 ml，61.7 mmol)。在攪拌0.5小時之後，在真空下移除溶劑，藉由製備型LCMS(XBridge C18管柱，用一定梯度之乙腈/含有0.1% TFA之水之以60毫升/分鐘之流動速率溶離)純化殘餘物，得到呈兩個峰之所需產物(0.40 g，85%)。
非對映異構體1. 峰1. C 32H 36ClFN 9(M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 600.3；實驗值600.3。
非對映異構體2. 峰2. C 32H 36ClFN 9(M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 600.3；實驗值600.3。
步驟 21. 2-((2S,4S)-4-(8- 氯 -7-(5,6- 二甲基 -1H- 吲唑 -4- 基 )-4-(3-( 乙基 ( 甲基 ) 胺基 ) 氮雜環丁烷 -1- 基 )-6- 氟 -1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-1-(2- 氟丙烯醯基 ) 哌啶 -2- 基 ) 乙腈向2-氟丙烯酸(1.1 mg，0.012 mmol)及2-((2S,4S)-4-(8-氯-7-(5,6-二甲基-1H-吲唑-4-基)-4-(3-(乙基(甲基)胺基)氮雜環丁烷-1-基)-6-氟-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)哌啶-2-基)乙腈雙(2,2,2-三氟乙酸酯) (8.5 mg，10.3 µmol) (來自最後一個步驟之峰2)於DMF (1.0 ml)中之溶液中添加HATU (5.1 mg, 0.013 mmol)及DIEA (9.0 µl, 0.051 mmol)。在室溫下攪拌所得混合物2小時。將反應物用甲醇及1 N HCl (0.1 mL)稀釋且使用製備型LCMS (XBridge C18管柱，用一定梯度之乙腈/含有0.1% TFA之水，以60毫升/分鐘之流動速率溶離)純化殘餘物，得到所需非對映異構體1。
非對映異構體2以類似方式使用2-((2S,4S)-4-(8-氯-7-(6-氯-5-甲基-1H-吲唑-4-基)-4-(3-(二甲基胺基)氮雜環丁烷-1-基)-6-氟-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)哌啶-2-基)乙腈雙(2,2,2-三氟乙酸酯) (來自最後一個步驟之峰1)合成。
實例 4a. 非對映異構體1. 峰1. C 35H 37ClF 2N 9O (M+H) +: m/z之LCMS計算值= 672.3；實驗值672.3。 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.34 (m, 2H), 7.48 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 5.70 (m, 1H), 5.35 (m, 2H), 4.98-4.27 (m, 9H), 3.54 (m, 2H), 3.27 (m, 2H), 2.86 (m, 2H), 2.49 (s, 3H), 2.37 - 2.27 (m, 4H), 2.09 (s, 3H), 1.28 (t, J= 7.2 Hz, 3H)。
實例 4b. 非對映異構體2. 峰2. C 35H 37ClF 2N 9O (M+H) +: m/z之LCMS計算值= 672.3；實驗值672.3。
實例 5a 及實例 5b. 8-(8- 氯 -1-((2S,4S)-2-( 氰基甲基 )-1-(2- 氟丙烯醯基 ) 哌啶 -4- 基 )-6- 氟 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -7- 基 )-1- 萘腈 步驟 1. 2- 胺基 -4-(8- 氰基萘 -1- 基 )-3- 氟苯甲酸 乙酯 標題化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟5中所描述之程序，利用8-溴-1-萘腈代替1-氯異喹啉-8-甲腈來合成。C 20H 16FN 2O 2(M+H) +m/z之LCMS計算值= 335.1；實驗值335.1。
步驟 2. 2- 胺基 -5- 氯 -4-(8- 氰基萘 -1- 基 )-3- 氟苯甲酸乙 酯 標題化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟6中所描述之程序，利用2-胺基-4-(8-氰基萘-1-基)-3-氟苯甲酸乙酯代替2-胺基-4-(8-氰基異喹啉-1-基)-3-氟苯甲酸乙酯來合成。C 20H 15ClFN 2O 2(M+H) +m/z之LCMS計算值= 369.1；實驗值369.1。
步驟 3. 5- 氯 -4-(8- 氰基萘 -1- 基 )-2-(3- 乙氧基 -3- 側氧基丙醯胺基 )-3- 氟苯甲酸 乙 酯 此化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟7中所描述之程序，用2-胺基-5-氯-4-(8-氰基萘-1-基)-3-氟苯甲酸乙酯置換2-胺基-5-氯-4-(8-氰基異喹啉-1-基)-3-氟苯甲酸乙酯來合成。C 25H 21ClFN 2O 5(M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 483.1；實驗值483.1。
步驟 4. 6- 氯 -7-(8- 氰基萘 -1- 基 )-8- 氟 -2,4- 二羥基喹啉 -3- 甲酸乙酯 此化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟8中所描述之程序，用5-氯-4-(8-氰基萘-1-基)-2-(3-乙氧基-3-側氧基丙醯胺基)-3-氟苯甲酸乙酯置換5-氯-4-(8-氰基異喹啉-1-基)-2-(3-乙氧基-3-側氧基丙醯胺基)-3-氟苯甲酸乙酯來製備。C 23H 15ClFN 2O 4(M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 437.1；實驗值437.1。
步驟 5. 2,4,6- 三氯 -7-(8- 氰基萘 -1- 基 )-8- 氟喹啉 -3- 甲酸乙酯 此化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟9中所描述之程序，用6-氯-7-(8-氰基萘-1-基)-8-氟-2,4-二羥基喹啉-3-甲酸乙酯置換6-氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-8-氟-2,4-二羥基喹啉-3-甲酸乙酯來製備。C 23H 13Cl 3FN 2O 2(M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 473.0，475.0；實驗值473.1，475.1。
步驟 6. 4-(((2S,4S)-1-( 三級丁氧基羰基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -4- 基 ) 胺基 )-2,6- 二氯 -7-(8- 氰基萘 -1- 基 )-8- 氟喹啉 -3- 甲酸乙酯 此化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟10中所描述之程序，用2,4,6-三氯-7-(8-氰基萘-1-基)-8-氟喹啉-3-甲酸乙酯置換2,4,6-三氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-8-氟喹啉-3-甲酸乙酯來製備。C 41H 50Cl 2FN 4O 5Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 795.3，797.3；實驗值795.5，797.5。
步驟 7. (2S,4S)-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 )-4-((2,6- 二氯 -7-(8- 氰基萘 -1- 基 )-8- 氟 -3-( 羥基甲基 ) 喹啉 -4- 基 ) 胺基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟11中所描述之程序製備，用4-(((2S,4S)-1-(三級丁氧基羰基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-4-基)胺基)-2,6-二氯-7-(8-氰基萘-1-基)-8-氟喹啉-3-甲酸乙酯置換4-(((2S,4S)-1-(三級丁氧基羰基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-4-基)胺基)-2,6-二氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-8-氟喹啉-3-甲酸乙酯。C 39H 48Cl 2FN 4O 4Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 753.3，755.3；實驗值753.4，755.5。
步驟 8. (2S,4S)-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 )-4-((2,6- 二氯 -7-(8- 氰基萘 -1- 基 )-8- 氟 -3- 甲醯基喹啉 -4- 基 ) 胺基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟12中所描述之程序製備，用(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-((2,6-二氯-7-(8-氰基萘-1-基)-8-氟-3-(羥基甲基)喹啉-4-基)胺基)哌啶-1-甲酸三級丁酯置換(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-((2,6-二氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-8-氟-3-(羥基甲基)喹啉-4-基)胺基)哌啶-1-甲酸三級丁酯。C 39H 6Cl 2FN 4O 4Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 751.3，753.3；實驗值751.4，753.4。
步驟 9. (2S,4S)-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 )-4-((2,6- 二氯 -7-(8- 氰基萘 -1- 基 )-8- 氟 -3-((E)-( 羥亞胺基 ) 甲基 ) 喹啉 -4- 基 ) 胺基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟13中所描述之程序製備，用(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-((2,6-二氯-7-(8-氰基萘-1-基)-8-氟-3-甲醯基喹啉-4-基)胺基)哌啶-1-甲酸三級丁酯置換(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-((2,6-二氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-8-氟-3-甲醯基喹啉-4-基)胺基)哌啶-1-甲酸三級丁酯。C 39H 47Cl 2FN 5O 4Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 766.3，768.3；實驗值766.4，768.4。
步驟 10. (2S,4S)-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 )-4-(4,8- 二氯 -7-(8- 氰基萘 -1- 基 )-6- 氟 -1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟14中所描述之程序製備，在中用(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-((2,6-二氯-7-(8-氰基萘-1-基)-8-氟-3-((E)-(羥亞胺基)甲基)喹啉-4-基)胺基)哌啶-1-甲酸三級丁酯置換(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-((2,6-二氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-8-氟-3-((E)-(羥亞胺基)甲基)喹啉-4-基)胺基)哌啶-1-甲酸三級丁酯。C 39H 45Cl 2FN 5O 3Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 748.3，750.3；實驗值748.4，750.4。
步驟 11. (2S,4S)-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 )-4-(8- 氯 -7-(8- 氰基萘 -1- 基 )-6- 氟 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟15中所描述之程序製備，用(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-(4,8-二氯-7-(8-氰基萘-1-基)-6-氟-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)哌啶-1-甲酸三級丁酯置換(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-(4,8-二氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-6-氟-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)哌啶-1-甲酸三級丁酯。C 40H 48ClFN 5O 3SSi (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 760.3；實驗值760.3。
步驟 12. (2S,4S)-4-(8- 氯 -7-(8- 氰基萘 -1- 基 )-6- 氟 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-(2- 羥基乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟16中所描述之程序製備，用(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-(8-氯-7-(8-氰基萘-1-基)-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)哌啶-1-甲酸三級丁酯置換(2S,4S)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)-4-(8-氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)哌啶-1-甲酸三級丁酯。C 34H 34ClFN 5O 3S (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 646.2；實驗值646.2。
步驟 13. (2S,4S)-4-(8- 氯 -7-(8- 氰基萘 -1- 基 )-6- 氟 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟17中所描述之程序，用(2S,4S)-4-(8-氯-7-(8-氰基萘-1-基)-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(2-羥基乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯置換(2S,4S)-4-(8-氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(2-羥基乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯來製備。C 34H 31ClFN 6O 2S (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 641.2；實驗值641.2。
步驟 14. 8-(8- 氯 -1-((2S,4S)-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -4- 基 )-6- 氟 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -7- 基 )-1- 萘腈 此化合物根據 實例 1a 及實例 1b步驟18中所描述之程序，用(2S,4S)-4-(8-氯-7-(8-氰基萘-1-基)-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸三級丁酯置換(2S,4S)-4-(8-氯-7-(8-氰基異喹啉-1-基)-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸三級丁酯來製備。C 35H 34ClFN 7O (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 622.2；實驗值622.2。
步驟 15. 8-(1-((2S,4S)-1- 乙醯基 -2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -4- 基 )-8- 氯 -6- 氟 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -7- 基 )-1- 萘腈向2-氟丙烯酸(0.9 mg，9.88 µmol)及8-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈雙(2,2,2-三氟乙酸酯) (7.0 mg，8.23 µmol)於DMF (1.0 ml)中之溶液中添加HATU (3.9 mg，10.3 µmol)及DIEA (1.4 µl，8.23 µmol)。在室溫下攪拌所得混合物2小時。將反應物用甲醇及1 N HCl (0.1 mL)稀釋，隨後使用製備型LCMS (XBridge C18管柱，用一定梯度之乙腈/含有0.1% TFA之水，以60毫升/分鐘之流動速率溶離)純化殘餘物，得到所需非對映異構體1。
非對映異構體2以類似方式使用8-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈雙(2,2,2-三氟乙酸酯) (來自最後一個步驟之峰2)合成。
實例 5a. 非對映異構體1. 峰1. C 37H 36ClFN 7O 2(M+H) +: m/z之LCMS計算值= 664.3實驗值664.3。
實例 5b. 非對映異構體2. 峰2. C 37H 36ClFN 7O 2(M+H) +m/z之LCMS計算值= 664.3實驗值664.3。 1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 9.86 (m, 1H), 8.52 (m, 3H), 8.34 (m, 1H), 8.17 (m, 1H), 7.88 (m, 1H), 7.78 (m, 1H), 7.73 (m, 1H), 5.83 (m, 1H), 5.50 (m, 1H), 5.39 (m, 1H), 5.27 (s, 1H), 3.84 (m, 1H), 3.56 (m, 1H), 3.30 (m, 2H), 3.18 (m, 1H), 3.09 (m, 3H), 2.30 (m, 1H), 2.11 (m, 1H), 1.92 (m, 2H), 1.53 (d, J= 6.0 Hz, 3H)。
實例 6a 及實例 6b. 8-(8- 氯 -1-((2S,4S)-2-( 氰基甲基 )-1-((E)-4- 甲氧基丁 -2- 烯醯基 ) 哌啶 -4- 基 )-6- 氟 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -7- 基 )-1- 萘腈 此化合物係根據 實例 5a 及實例 5b 步驟 15中所描述之程序，用(E)-4-甲氧基丁-2-烯酸置換2-氟丙烯酸來製備。C 40H 40ClFN 7O 3(M+H) +: m/z之LCMS計算值= 720.3；實驗值：720.3。
實例 7 8-(1-((2S,4S)-1-( 丁 -2- 炔醯基 )-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -4- 基 )-6- 氟 -8- 甲基 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -7- 基 )-1- 萘腈 步驟 1 ： 7- 溴 -2,4- 二氯 -8- 氟 -6- 碘喹啉 -3- 甲酸乙酯 標題化合物根據 實例 4a 及 4b步驟1至3所描述之程序，利用2-胺基-4-溴-3-氟-5-碘苯甲酸代替 步驟 1中之2-胺基-4-溴-5-氯-3-氟苯甲酸來合成。C 12H 7BrCl 2FINO 2(M+H) +m/z之LCMS計算值=491.80，493.80；實驗值491.80，493.80。
步驟 2. 7- 溴 -4-(((2S,4S)-1-( 三級丁氧基羰基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -4- 基 ) 胺基 )-2- 氯 -8- 氟 -6- 碘喹啉 -3- 甲酸乙酯 此化合物根據 實例 4a 及實例 4b步驟10中所描述之程序，用 7- 溴 -2,4- 二氯 -8- 氟 -6- 碘喹啉 -3- 甲酸乙酯置換7-溴-2,4,6-三氯-8-氟喹啉-3-甲酸乙酯來製備。C 30H 44BrClFIN 3O 5Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值=814.1，816.1；實驗值814.1，816.2。
步驟 3. (2S,4S)-4-((7- 溴 -2- 氯 -8- 氟 -3-( 羥基甲基 )-6- 碘喹啉 -4- 基 ) 胺基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 4a 及實例 4b步驟11中所描述之程序，用 7- 溴 -4-(((2S,4S)-1-( 三級丁氧基羰基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -4- 基 ) 胺基 )-2- 氯 -8- 氟 -6- 碘喹啉 -3- 甲酸乙酯置換7-溴-4-(((2S,4S)-1-(三級丁氧基羰基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-4-基)胺基)-2,6-二氯-8-氟喹啉-3-甲酸乙酯來製備。C 28H 42BrClFIN 3O 4Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 772.1，774.1；實驗值772.1，774.1。
步驟 4. (2S,4S)-4-((7- 溴 -2- 氯 -8- 氟 -3- 甲醯基 -6- 碘喹啉 -4- 基 ) 胺基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 4a 及實例 4b步驟12中所描述之程序，用 (2S,4S)-4-((7- 溴 -2- 氯 -8- 氟 -3-( 羥基甲基 )-6- 碘喹啉 -4- 基 ) 胺基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯置換(2S,4S)-4-((7-溴-2,6-二氯-8-氟-3-(羥基甲基)喹啉-4-基)胺基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯來製備。C 28H 40BrClFIN 3O 4Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 770.1，772.1；實驗值770.1，772.1。
步驟 5. (2S,4S)-4-((7- 溴 -2- 氯 -8- 氟 -3-((E)-( 羥亞胺基 ) 甲基 )-6- 碘喹啉 -4- 基 ) 胺基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 4a 及實例 4b步驟13中所描述之程序，用 (2S,4S)-4-((7- 溴 -2- 氯 -8- 氟 -3- 甲醯基 -6- 碘喹啉 -4- 基 ) 胺基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯置換(2S,4S)-4-((7-溴-2,6-二氯-8-氟-3-甲醯基喹啉-4-基)胺基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯來製備。C 28H 41BrClFIN 4O 4Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 785.1，787.1；實驗值785.2，787.2。
步驟 6. (2S,4S)-4-(7- 溴 -4- 氯 -6- 氟 -8- 碘 -1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 4a 及實例 4b步驟14中所描述之程序，用 (2S,4S)-4-((7- 溴 -2- 氯 -8- 氟 -3-((E)-( 羥亞胺基 ) 甲基 )-6- 碘喹啉 -4- 基 ) 胺基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯置換(2S,4S)-4-((7-溴-2,6-二氯-8-氟-3-((E)-(羥亞胺基)甲基)喹啉-4-基)胺基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯來製備。C 28H 39BrClFIN 4O 3Si (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 767.1，769.1；實驗值767.1，769.1。
步驟 7. (2S,4S)-4-(7- 溴 -6- 氟 -8- 碘 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 4a 及實例 4b步驟15中所描述之程序，用 (2S,4S)-4-(7- 溴 -4- 氯 -6- 氟 -8- 碘 -1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯置換(2S,4S)-4-(7-溴-4,8-二氯-6-氟-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯來製備。C 29H 42BrFIN 4O 3SSi (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 779.1，781.1；實驗值779.1，781.1。
步驟 8. (2S,4S)-4-(7- 溴 -6- 氟 -8- 碘 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-(2- 羥基乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 4a 及實例 4b步驟16中所描述之程序，用 (2S,4S)-4-(7- 溴 -6- 氟 -8- 碘 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-(2-(( 三級丁基二甲基矽基 ) 氧基 ) 乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯置換(2S,4S)-4-(7-溴-8-氯-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯來製備。C 23H 28BrFIN 4O 3S (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 665.0，667.0；實驗值665.1，667.1。
步驟 9. (2S,4S)-4-(7- 溴 -6- 氟 -8- 碘 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 此化合物根據 實例 4a 及實例 4b步驟17中所描述之程序，用 (2S,4S)-4-(7- 溴 -6- 氟 -8- 碘 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-(2- 羥基乙基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯置換(2S,4S)-4-(7-溴-8-氯-6-氟-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(2-羥基乙基)哌啶-1-甲酸三級丁酯來製備。C 23H 25BrFIN 5O 2S (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 660.0，662.0；實驗值660.0，662.0。
步驟 10. (2S,4S)-4-(7- 溴 -6- 氟 -8- 甲基 -4-( 甲硫基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 在室溫下向(2S,4S)-4-(7-溴-6-氟-8-碘-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(2.75 g，4.16 mmol)於1,4-二㗁烷(36 ml)中之溶液中添加水(6.0 ml)、甲基酸(1.496 g，24.99 mmol)、K 2CO 3(1.151 g，8.33 mmol)及Pd(PPh 3) 2CI 2(0.292 g，0.416 mmol)。在90℃下，在N 2氛圍下，攪拌反應混合物10小時。在反應完成後，反應混合物用水淬滅且用EtOAc萃取。有機相經無水Na 2SO 4乾燥且濃縮，且隨後藉由矽膠管柱層析(溶離劑：己烷:乙酸乙酯=5:1)純化，得到呈白色固體之化合物(1.9 g，83%)。C 24H 28BrFN 5O 2S (M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 548.1，550.1；實驗值548.2，550.2。
步驟 11. (2S,4S)-4-(7- 溴 -6- 氟 -8- 甲基 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 )-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 在0℃下將m-CPBA (57.9 mg，0.335 mmol)添加至(2S,4S)-4-(7-溴-6-氟-8-甲基-4-(甲硫基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(160 mg，0.29 mmol)於CH 2Cl 2(2.9 ml)中之溶液中，且隨後在此溫度下攪拌反應物20分鐘。反應物藉由添加飽和Na 2S 2O 3淬滅，用乙酸乙酯稀釋且用飽和NaHCO 3、鹽水洗滌，過濾，乾燥且濃縮。將含1.0 M LiHMDS之THF (753 µl，0.753 mmol)添加至(S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶基-2-基)乙-1-醇(97 mg，0.753 mmol)於THF (1 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌所得混合物30分鐘。向反應小瓶中添加(2S,4S)-4-(7-溴-6-氟-8-甲基-4-(甲基亞磺醯基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(170 mg，0.301 mmol)於THF (2.0 ml)中之溶液，且隨後在室溫下攪拌反應物2小時。將反應混合物用乙酸乙酯及水稀釋。將有機層經Na 2SO 4乾燥，過濾並濃縮。殘餘物用矽膠管柱(用一定梯度之含0至20%甲醇之DCM溶離)純化，得到呈黃色泡沫狀之所需產物(150 mg，79%)。C 30H 39BrFN 6O 3(M+H) +: m/z之LC-MS計算值= 629.2，631.2；實驗值629.3，631.3。
步驟 12. (2S,4S)-2-( 氰基甲基 )-4-(7-(8- 氰基萘 -1- 基 )-6- 氟 -8- 甲基 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -1- 基 ) 哌啶 -1- 甲酸三級丁酯 在80℃下將(2S,4S)-4-(7-溴-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(150 mg，0.238 mmol)、8-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)-1-萘腈(86 mg，0.31 mmol)、SPhos Pd G4 (19 mg，0.024 mmol)及磷酸三鉀水合物(121 mg，0.524 mmol)於1,4-二㗁烷(2.0 mL)/水(0.400 mL)之混合物在N 2氛圍下攪拌2小時。用乙酸乙酯及水稀釋溶液。濃縮有機層且藉由製備型LCMS (XBridge C18管柱，用一定梯度之乙腈/含有0.1% TFA之水以60毫升/分鐘之流動速率溶離)純化殘餘物，得到呈兩個峰之所需產物(105 mg，63%)。
非對映異構體1. 峰1. C 41H 45FN 7O 3(M+H) +m/z之LC-MS計算值= 702.3；實驗值702.3。
非對映異構體2. 峰2. C 41H 45FN 7O 3(M+H) +m/z之LC-MS計算值= 702.3；實驗值702.3。
步驟 13. 8-(1-((2S,4S)-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -4- 基 )-6- 氟 -8- 甲基 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -7- 基 )-1- 萘腈 來自最後一個步驟之兩個非對映異構體用1:1 DCM/TFA(2 mL)處理40分鐘，真空移除揮發物且殘餘物按原樣用於下一步驟中。
非對映異構體1. 峰1. C 36H 37FN 7O (M+H) +m/z之LC-MS計算值= 602.3；實驗值602.3。
非對映異構體2. 峰2. C 36H 37FN 7O (M+H) +m/z之LC-MS計算值= 602.3；實驗值602.3。
步驟 14. 8-(1-((2S,4S)-1-( 丁 -2- 炔醯基 )-2-( 氰基甲基 ) 哌啶 -4- 基 )-6- 氟 -8- 甲基 -4-((S)-1-((S)-1- 甲基吡咯啶 -2- 基 ) 乙氧基 )-1H- 吡唑并 [4,3-c] 喹啉 -7- 基 )-1- 萘腈向丁-2-炔酸(0.730 mg，8.68 µmol)及8-(1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)哌啶-4-基)-6-氟-8-甲基-4-(((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)甲氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈雙(2,2,2-三氟乙酸酯) (6.0 mg，7.36 µmol) (來自最後一個步驟之非對映異構體2峰2)於DMF (1.0 ml)中之溶液中添加HATU (3.5 mg，9.19 µmol)及DIEA (6.4 µl，0.037 mmol)。在室溫下攪拌所得混合物1小時。將反應物用甲醇及1 N HCl (0.1 mL)稀釋，且使用製備型LCMS (XBridge C18管柱，用一定梯度之乙腈/含有0.1% TFA之水，以60毫升/分鐘之流動速率溶離)純化，得到所需產物(2.5 mg，52%)。C 40H 39FN 7O 2(M+H) +m/z之LCMS計算值= 668.3；實驗值668.3。
實例 A. GDP-GTP 交換分析例示化合物之抑制劑效力係在基於螢光之鳥嘌呤核苷酸交換分析中測定，該分析量測在SOS1 (鳥嘌呤核苷酸交換因子)存在下，bodipy-GDP (經螢光標記之GDP)與GppNHp (不可水解GTP類似物)的交換，以產生KRAS之活性狀態。抑制劑在DMSO中連續稀釋且將0.1 µL之體積轉移至黑色低容量384孔盤之孔中。將5 µL/孔體積的在分析緩衝液(25 mM Hepes pH 7.5，50 mM NaCl，10 mM MgCl2及0.01% Brij-35)中稀釋至5 nM之負載bodipy之KRAS G12C添加至盤中，且在環境溫度下與抑制劑一起預培育2小時。培養盤上包括適當對照(無抑制劑或具有G12C抑制劑(AMG-510)之酶)。藉由在分析緩衝液中添加含有1 mM GppNHp及300 nM SOS1之5 µL/孔體積來起始交換。負載bodipy之KRAS G12C、GppNHp及SOS1之10 µL/孔反應濃度分別為2.5 nM、500 μM及150 nM。反應盤在環境溫度下培育2小時，其為在無抑制劑存在下完成GDP-GTP交換的估計時間。對於KRAS G12D及G12V突變體，使用類似鳥嘌呤核苷酸交換分析，其中負載bodipy之KRAS蛋白之最終濃度為2.5nM，且在添加GppNHp-SOS1混合物之後分別對G12D及G12V進行4小時及3小時培育。所描述之選擇性結合G12D突變體之環肽(Sakamoto等人，BBRC 484.3 (2017), 605-611)或確認結合之內部化合物用作分析盤中之陽性對照。在485 nm激發及520 nm發射下，在PheraStar讀盤儀(BMG Labtech)上量測螢光強度。
使用GraphPad prism或Genedata Screener SmartFit分析資料。IC 50值係藉由將資料擬合至四參數邏輯方程，產生具有可變希爾(Hill)係數之S形劑量-反應曲線來導出。
KRAS_G12C交換分析IC 50資料、KRAS_G12C pERK分析IC 50資料、KRAS_G12C WB pERK分析IC 50資料在下表1中提供。符號「†」指示IC 50≤ 100 nM，「††」指示IC 50＞ 100 nM但≤ 1 μM；且「†††」指示IC 50＞1 μM但≤ 5 μM，「††††」指示IC 50＞5 μM但≤ 10 μM。「NA」指示資料不可用。 表 1
實例編號 G12C_交換 G12C_pERK G12C_WB_pERK
1a † † †
1b † NA NA
2a † † †
2b † † NA
3a † † †
3b †† NA NA
4a † † †
4b ††† NA NA
5a †† NA NA
5b † † †
6a † NA NA
6b † † †
7 † † †
實例 B ：發光活力分析MIA PaCa-2 (KRAS G12C；ATCC® CRL-1420)、NCI-H358 (KRAS G12C；ATCC® CRL-5807)、A427 (KRAS G12D；ATCC® HTB53)、HPAFII (KRAS G12D；ATCC® CRL-1997)、YAPC (KRAS G12V；DSMZ ACC382)、SW480 (KRAS G12V；ATCC® CRL-228)及NCI-H838 (KRAS WT；ATCC® CRL-5844)細胞在補充有10% FBS之RPMI 1640培養基(Gibco/Life Technologies)中培養。將補充有2% FBS之RPMI 1640培養基中之每孔八百個細胞接種至含有50 nL測試化合物點(最終濃度係1:500稀釋液，0.2% DMSO中之最終濃度)之白色、透明底384孔Costar組織培養盤中。將盤在37℃、5% CO 2下培育3天。在分析結束時，添加25 μl/孔的CellTiter-Glo試劑(Promega)。在15分鐘後用PHERAstar (BMG)讀取發光。在Genedata Screener中使用SmartFit分析資料以獲得IC 50值。
實例 C ：細胞 pERK HTRF 分析MIA PaCa-2 (KRAS G12C；ATCC® CRL-1420)、NCI-H358 (KRAS G12C；ATCC® CRL-5807)、A427 (KRAS G12D；ATCC® HTB53)、HPAFII (KRAS G12D；ATCC® CRL-1997)、YAPC (KRAS G12V；DSMZ ACC382)、SW480 (KRAS G12V；ATCC® CRL-228)及NCI-H838 (KRAS WT；ATCC® CRL-5844)細胞購自ATCC且在補充有10% FBS之RPMI 1640培養基(Gibco/Life Technologies)中維持。將細胞以每孔5000個細胞(8 μL)塗鋪於Greiner 384孔低容量、平底、經組織培養處理之白色盤中且在37℃、5% CO 2下培育隔夜。第二天早上，將測試化合物儲備溶液在培養基中稀釋成3倍最終濃度，且將4 μL添加至細胞，最終濃度為0.1% DMSO。將細胞與測試化合物一起在37℃、5% CO 2下培育4小時(G12C及G12V)或2小時(G12D)。將4 μL具有阻斷試劑(Cisbio)之4倍裂解緩衝液添加至各孔中且在室溫下使盤平緩(300 rpm)旋轉30分鐘。將每孔4 μL的Cisbio抗磷酸化ERK 1/2 d2與抗磷酸化ERK 1/2穴狀化合物(1:1)混合，且添加至各孔，在室溫下於暗處培育隔夜。在Pherastar讀盤器上在665 nm及620 nm波長下讀取盤。在Genedata Screener中使用SmartFit分析資料以獲得IC 50值。
實例 D ：全血 pERK1/2 HTRF 分析MIA PaCa-2細胞(KRAS G12C；ATCC® CRL-1420)、HPAF-II (KRAS G12D；ATCC® CRL-1997)及YAPC (KRAS G12V；DSMZ ACC382)在具有10% FBS之RPMI 1640 (Gibco/Life Technologies)中維持。對於MIA PaCa-2分析，將細胞以每孔25000個細胞之100 μL培養基接種至96孔組織培養盤(Corning #3596)中，且在分析前在37℃、5% CO 2下培養2天。對於HPAF-II及YAPC分析，將細胞以每孔50000個細胞之100 μL培養基接種至96孔組織培養盤中，且在分析前培養1天。將全血添加至96孔盤中之1 μL化合物點中(於DMSO中製備)，且藉由上下移液平緩混合以使得血液中化合物之濃度為0.5% DMSO中所需濃度之1倍。自細胞中吸出培養基，且每孔添加50 μL含測試化合物之全血，在37℃、5% CO 2下分別培育4小時用於MIA PaCa及YAPC分析；或培育2小時用於HPAF-II分析。在傾倒血液之後，藉由將PBS添加至孔邊且將PBS自盤傾倒至紙巾上，輕敲盤以充分瀝乾來將盤輕緩地洗滌兩次。隨後添加五十微升/孔之具有阻斷試劑(Cisbio)及Benzonase核酸酶(Sigma Cat # E1014-5KU，1:10000最終濃度)之1倍裂解緩衝液#1 (Cisbio)，且在室溫下震盪(250 rpm)培育30分鐘。在裂解之後，使用Assist Plus (Integra Biosciences, NH)將16 μL裂解物轉移至384孔Greiner小容量白色盤中。使用Assist Plus將4 μL的抗磷酸化ERK 1/2 d2與及抗磷酸化ERK 1/2穴狀化合物(Cisbio)之1:1混合物添加至孔中且在室溫下於暗處培育隔夜。在Pherastar讀盤器上在665 nm及620 nm波長下讀取盤。在Genedata Screener中使用SmartFit分析資料以獲得IC 50值。
實例 E ： Ras 活化 Elisa96孔Ras活化ELISA套組(Cell Biolabs Inc；#STA441)使用與96孔盤結合之Raf1 RBD (Rho結合域)自細胞裂解物選擇性地拉下Ras之活性形式。藉由泛Ras抗體及HRP結合二次抗體偵測所捕捉之GTP-Ras。
MIA PaCa-2 (KRAS G12C；ATCC® CRL-1420)、NCI-H358 (KRAS G12C；ATCC® CRL-5807)、A427 (KRAS G12D；ATCC® HTB53)、HPAFII (KRAS G12D；ATCC® CRL-1997)、YAPC (KRAS G12V；DSMZ ACC382)、SW480 (KRAS G12V；ATCC® CRL-228)及NCI-H838 (KRAS WT；ATCC® CRL-5844)細胞在具有10% FBS之RPMI 1640 (Gibco/Life Technologies)中維持。將細胞以每孔25000個細胞的100 μL培養基接種至96孔組織培養盤(Corning #3596)中且在37℃、5% CO 2下培養2天，使得其在分析開始時約80%匯合。在37℃，5% CO 2下用化合物處理細胞4小時或隔夜。在收穫時，用PBS洗滌細胞，充分瀝乾，且隨後在冰上用50 μL 1倍裂解緩衝液(由套組提供)加上所添加的Halt蛋白酶及磷酸酶抑制劑(1:100)裂解1小時。
將Raf-1 RBD在分析稀釋劑中(在套組中提供)以1:500稀釋且將100 µL經稀釋之Raf-1 RBD添加至Raf-1 RBD捕捉盤之各孔中。將盤用盤密封膜覆蓋且在室溫下在定軌震盪器上培育1小時。用每孔250 µL 1倍洗滌緩衝液洗滌盤3次，每次洗滌之間徹底抽吸。一式兩份地添加每孔50 µL Ras裂解物樣品(10-100 µg)。在一對孔中添加「無細胞裂解物」對照用於背景測定。緊跟著各孔將50 µL分析稀釋劑添加至所有孔，且將盤在室溫下在定軌震盪器上培育1小時。用每孔250 µL 1倍洗滌緩衝液洗滌培養盤5次，每次洗滌之間徹底抽吸。將100 µL經稀釋之抗泛Ras抗體添加至各孔中，且將盤在室溫下在定軌震盪器上培育1小時。如前所述洗滌盤5次。將100 µL經稀釋之二級抗體、HRP結合物添加至各孔中，且將盤在室溫下在定軌震盪器上培育1小時。如前所述洗滌培養盤5次且充分瀝乾。將100 μL化學發光試劑(在套組中提供)添加至各孔，包括空白孔。將盤在室溫下在定軌震盪器上培育5分鐘，之後在盤光度計上讀取各微孔之發光。在自所有值減去「無裂解物對照」之背景含量之後，計算相對於DMSO對照孔之抑制%。藉由使用GraphPad Prism 7軟體擬合抑制劑抑制百分比相對於抑制劑濃度對數的曲線來進行IC 50測定。
實例 F ： RAS-RAF 及 PI3K-AKT 路徑之抑制藉由量測KRAS下游效應子細胞外信號調節激酶(ERK)、核糖體S6激酶(RSK)、AKT (亦稱為蛋白激酶B，PKB)及下游受質S6核糖體蛋白之磷酸化來測定化合物之細胞效力。
為了量測磷酸化的細胞外信號調節激酶(ERK)、核糖體S6激酶(RSK)、AKT及S6核糖體蛋白，將細胞(關於細胞株及所產生之資料類型的細節進一步詳述於表2中)以4×10 4個細胞/孔接種在Corning 96孔組織培養處理盤中的具有10% FBS之RPMI培養基中隔夜。次日，將細胞在存在或不存在一定濃度範圍之測試化合物的情況下在37℃、5% CO 2下培育4小時。將細胞用PBS洗滌且用具有蛋白酶及磷酸酶抑制劑(Thermo Fisher，78446)之1倍裂解緩衝液(Cisbio)裂解。使用以下抗體對10或20 µg總蛋白裂解物進行SDS-PAGE及免疫墨點分析：磷酸化ERK1/2-Thr202/Tyr204 (#9101L)、總ERK1/2 (#9102L)、磷酸化AKT-Ser473 (#4060L)、磷酸化p90RSK-Ser380 (#11989S)及磷酸化S6核糖體蛋白-Ser235/Ser236 (#2211S)，來自Cell Signaling Technologies (Danvers, MA)。 表 2
細胞株 組織學 KRAS更改 讀出
H358 肺 G12C pERK, pAKT, p-S6, p-p90RSK
MIA PaCa-2 胰臟 G12C pERK, pAKT, p-S6, p-p90RSK
HPAF II 胰臟 G12D pERK, pAKT, p-S6, p-p90RSK
A427 肺 G12D pERK, pAKT, p-S6, p-p90RSK
AGS 胃 G12D pERK, pAKT, p-S6, p-p90RSK
PaTu 8988s 胰臟 G12V pERK, pAKT, p-S6, p-p90RSK
H441 肺 G12V pERK, pAKT, p-S6, p-p90RSK
YAPC 胰臟 G12V pERK, pAKT, p-S6, p-p90RSK
SW480 大腸直腸 G12V pERK, pAKT, p-S6, p-p90RSK
實例 G ： 活體內功效研究Mia-Paca-2 (KRAS G12C)、H358 (KRAS G12C)、HPAF-II (KRAS G12D)、AGS (KRAS G12D)、SW480 (KRAS G12V)或YAPC (KRAS G12V)人類癌症細胞獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)且在補充有10% FBS之RPMI培養基中維持。對於功效研究實驗，將5×10 6個細胞皮下接種至6至8週齡BALB/c裸小鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA)之右後側腹中。當腫瘤體積為大約150-250 mm 3時，根據腫瘤體積對小鼠進行隨機分組，且經口投與化合物。使用式(L × W 2)/2計算腫瘤體積，其中L及W分別指長度及寬度尺寸。使用式(1 − (VT/VC)) × 100來計算腫瘤生長抑制，其中VT為處理組在處理最後一天之腫瘤體積，且VC為對照組在處理最後一天之腫瘤體積。使用鄧尼特多重比較檢驗(Dunnett's multiple comparisons test)之雙向方差分析來確定處理組之間的統計差異(GraphPad Prism)。小鼠按每籠10至12隻飼養，且提供豐富的食物並使其暴露於12小時亮/暗循環。腫瘤體積超出限制(10%體重)之小鼠藉由CO 2吸入以人道方式安樂死。將動物維持在由國際實驗室動物護理評定及認證協會完全認可的障壁設施中。所有程序均按照關於人類護理及使用實驗室動物之美國公眾服務策略及Incyte動物護理及使用委員會指南進行。
實例 H ： Caco2 分析Caco-2細胞在37℃、5% CO 2氛圍中，在補充有10% (v/v)胎牛血清、1% (v/v)非必需胺基酸、青黴素(100 U/ mL)及鏈黴素(100 µg/mL)之DMEM生長培養基中生長。藉由用含有1 µM EDTA之0.05%胰蛋白酶處理，每7天或4天對Caco-2之匯合細胞單層進行繼代培養。將Caco-2細胞接種於96孔Transwell盤中。Caco-2細胞之接種密度為14,000個細胞/孔。接種後每隔一天更換一次DMEM生長培養基。細胞單層用於Caco-2細胞在22與25天之間的轉運分析。
移除細胞培養基且用HBSS替換。為了量測TEER，將HBSS添加至供體隔室(頂端側)及受體隔室(基底側)。藉由使用REMS自動進樣器量測TEER以確保細胞單層之完整性。將TEER值≥ 300 Ω cm 2之Caco-2細胞單層用於轉運實驗。為了確定吸收方向(A-B)中之P app，將測試化合物(50 μM)於HBSS中之溶液添加至供體隔室(頂端側)，而將具有4% BSA之HBSS溶液添加至受體隔室(基底側)。頂端體積為0.075 mL，且基底側體積為0.25 mL。在37℃、5% CO 2氛圍中培育期為120分鐘。在培育期結束時，自供體及受體側移出樣品且添加等體積的乙腈用於蛋白沈澱。離心(3000 rpm，Allegra X-14R離心機，來自Beckman Coulter, Indianapolis, IN)後收集上清液用於LCMS分析。根據以下公式確定滲透率值： P app(cm/s) = (F * VD)/(SA * MD)， 其中通量率(F，質量/時間)係由受體側相關化合物累積量的斜率計算的，SA為細胞膜的表面積，VD為供體體積，且MD為供體隔室中溶液之初始量。
Caco-2滲透率分析資料在下表3中提供。符號「†」指示Caco2 ≤ 0.5；且「††」指示Caco-2為＞ 0.5但≤ 1；且「†††」指示Caco-2為＞ 1。「NA」指示Caco-2資料不可用。 表 3
實例編號 Caco-2
1a †††
2a †††
3a †††
4a ††
5b ††
6b ††
7 NA
實例 I ： 人類全血穩定性藉由LC-MS/MS測定例示性化合物之全血穩定性。96孔Flexi-Tier™塊(Analytical Sales & Services, Inc, Flanders, NJ)用於培育盤，其含有1.0 mL玻璃小瓶，每小瓶裝有0.5 mL血液(彙集性別，人類全血，來源於BIOIVT, Hicksville, NY或類似)。血液在水浴中預熱至37℃，持續30分鐘。藉由添加100 µL超純水/孔製備96深孔分析盤。將50 µL冷凍超純水/孔添加至96深孔樣品收集盤且用密封墊覆蓋。將1 µL之0.5 mM化合物工作溶液(DMSO:水)添加至培育盤中的血液中，以達到1 µM之最終濃度，藉由移液器徹底混合，且將50 µL轉移至樣品收集盤的T=0孔中。使血液在水中靜置2分鐘，且隨後添加400 µL終止溶液/孔(含有內標之乙腈)。將培育盤置於37℃下以150 rpm震盪之Incu-Shaker CO 2Mini培育箱(Benchmark Scientific, Sayreville, NJ)中。在1、2及4小時，藉由移液器將血液樣品徹底混合，且將50 µL轉移至樣品收集盤的相應孔中。使血液在水中靜置2分鐘，且隨後添加400 µL之終止溶液/孔。將收集盤密封且以1700 rpm渦旋3分鐘(VX-2500 Multi-Tube Vortexer, VWR International, Radnor, PA)，且樣品隨後在收集盤中以3500 rpm離心10分鐘(Allegra X-14R Centrifuge Beckman Coulter, Indianapolis, IN)。將100 µL上清液/孔自樣品收集盤轉移至分析盤之相應孔中。最終盤以1700 rpm渦旋1分鐘，且藉由LC-MS/MS分析樣品。1、2及4小時樣品相對於T=0之峰面積比用於確定剩餘百分比。剩餘百分比與時間之自然對數用於確定斜率，以計算化合物在血液中之半衰期(t 1/2= 0.693/斜率)。
人類全血穩定性資料在下表4中提供。符號「†」指示WBS ≤ 70%；「††」指示WBS ＞ 70%但≤ 90%；且「†††」指示WBS ＞ 90%。「NA」指示WBS資料不可用。 表 4
實例編號 4小時之人類全血穩定性
1a †††
2a †††
3a †††
4a ††
5b NA
6b †††
7 ††
實例 J ： 活體外固有清除率方案對於活體外代謝穩定性實驗，將測試化合物與人類肝微粒體一起在37℃下培育。培育混合物在100 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中含有測試化合物(1 μM)、NADPH (2 mM)及人類肝微粒體(0.5 mg蛋白/mL)。在添加NADPH前，將混合物在37℃下預培育2分鐘。添加NADPH後開始反應，且在0、10、20及30分鐘時用冰冷的甲醇淬滅。使用LC-MS/MS系統分析終止的培育混合物。分析系統由Shimadzu LC-30AD二元泵系統及SIL-30AC自動進樣器(Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD)聯合來自Applied Biosystems (Foster City, CA)之Sciex Triple Quad 6500+質譜儀組成。測試化合物及內標之層析分離係使用來自ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)之Hypersil Gold C18管柱(50 × 2.1 mm，5 µM，175 Å)達成。移動相A由0.1%甲酸/水組成，而移動相B由0.1%甲酸/乙腈組成。總LC-MS/MS運行時間可為2.75分鐘，流動速率為0.75毫升/分鐘。使用來自Applied Biosystems之Analyst軟體(1.6.3版)進行峰面積積分及峰面積比率計算。
活體外固有清除率CL int, 活體外係由測試化合物消失之 t 1/2計算，亦即CL int, 活體外=(0.693/ t 1/2)×(1/ C 蛋白)，其中 C 蛋白為培育期間之蛋白濃度，且 t 1/2係由濃度與時間曲線之對數線性回歸分析的斜率(k)確定；因此， t 1/2=ln2/k。藉由使用基於生理之比例因子、肝微粒體蛋白濃度(45 mg蛋白/g肝)及肝重量(21 g/kg體重)，將CL int, 活體外值縮放為人類的活體內值。使用等式CL int=CL int, 活體外× (mg蛋白/g肝重量)×(g肝重量/kg體重)。隨後藉由使用CL int及肝血流量Q (在人類中20 mL min −1·kg −1)在充分攪拌之肝模型中由CL H=(Q×CL int)/(Q+CL int)計算活體內肝清除率(CL H)，不考慮所有結合。肝提取率計算為CL H除以Q。
實例 K ： 活體內藥物動力學方案對於活體內藥物動力學實驗，經靜脈內或經由經口管飼向雄性史泊格多利大鼠(Sprague Dawley rats)或雄性及雌性食蟹獼猴投與測試化合物。對於靜脈內(IV)給藥，使用10%二甲基乙醯胺(DMAC)於酸化生理鹽水中之調配物以0.5至1 mg/kg給藥測試化合物，對於大鼠經由IV推注，且對於猴經由5分鐘或10分鐘IV輸注。對於經口(PO)給藥，使用含5% DMAC之0.5%甲基纖維素的檸檬酸鹽緩衝液(pH 2.5)以1.0至3.0 mg/kg給藥測試化合物。在給藥前及給藥後至多24小時之多個時間點收集血液樣品。使用EDTA作為抗凝血劑收集所有血液樣品，且離心獲得血漿樣品。測試化合物之血漿濃度係藉由LC-MS法測定。所量測之血漿濃度用於藉由標準非房室法使用Phoenix ®WinNonlin軟體程式(8.0版，Pharsight Corporation)計算PK參數。
在大鼠及猴中，進行測試化合物之盒式給藥以獲得初步PK參數。
雄性米格魯犬(beagle dog)之活體內藥物動力學實驗可在上述條件下進行。
實例 L ： CYP 之時間依賴性抑制 (TDI) 方案此分析經設計以表徵隨著測試化合物隨時間代謝而增加的CYP抑制。其潛在機制包括形成緊密結合的準不可逆抑制性代謝物複合物或藉由代謝物之共價加合物形成使P450酶失活。雖然此實驗採用10倍稀釋以降低代謝物濃度且因此降低可逆抑制之影響，但作為極強效CYP抑制劑之代謝物可能(但不常見)導致陽性結果。
結果來自使用人類肝微粒體(HLM)對CYP2C9、2C19、2D6及3A4 (咪達唑侖(midazolam))之4倍Km濃度的CYP特異性探針受質之混合液。在NADPH再生系統存在(+N)或不存在(-N)之情況下，HLM可與濃度為10 µM之測試化合物一起預培育30分鐘，稀釋10倍，且在受質混合液存在之情況下藉由添加NADPH再生系統之新鮮等分試樣培育8分鐘。代謝物標準品之校準曲線可用於使用LC-MS/MS定量量測酶活性。另外，與已知時間依賴性抑制劑替尼利酸(tienilic aicd) (CYP2C9)、噻氯匹定(ticlopidine) (CYP2C19)、帕羅西汀(paroxetine) (CYP2D6)及醋竹桃黴素(troleandomycin) (CYP3A4)一起培育用作陽性對照，在具有或不具有NADPH再生系統之情況下預培育30分鐘。
分析系統由Shimadzu LC-30AD二元泵系統及SIL-30AC自動進樣器(Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD)聯合來自Applied Biosystems (Foster City, CA)之Sciex Triple Quad 6500+質譜儀組成。測試化合物及內標之層析分離可使用ACQUITY UPLC BEH 130A，2.1 × 50 mm，1.7 μm HPLC管柱(Waters Corp, Milford, MA)達成。移動相A由0.1%甲酸/水組成，而移動相B由0.1%甲酸/乙腈組成。總LC-MS/MS運行時間將為2.50分鐘，流動速率為0.9毫升/分鐘。使用來自Applied Biosystems之Analyst軟體(1.6.3版)進行峰面積積分及峰面積比率計算。
將化合物與NADPH預培育後剩餘之對照CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6及CYP3A4活性百分比針對相應的對照媒劑活性進行校正，且隨後基於0分鐘計算為100%。使用各同功酶之剩餘活性%之自然對數與時間的線性回歸曲線來計算斜率。斜率等於酶損失率，或K obs。
除本文所描述之彼等修改以外，根據前述描述，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將為顯而易見的。此類修改亦意欲屬於隨附申請專利範圍之範疇內。本申請案中所引用之各參考文獻包括但不限於所有專利、專利申請案及公開案，其以全文引用之方式併入本文中。

Claims (31)

  1. 一種具有式(I)之化合物 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： R 1係選自Cl、CH 3、CH 2F、CHF 2及CF 3； Cy 1係選自 R 2係選自F及Cl； R 3係選自 及， Cy 2係選自 限制條件為該式I化合物不為 8-(1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈， 8-(1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-((E)-4-甲氧基丁-2-烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈， 2-((2S,4S)-4-(7-(5,6-二甲基-1H-吲唑-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-2-基)乙腈， 2-((2S,4S)-1-(丁-2-炔醯基)-4-(7-(5,6-二甲基-1H-吲唑-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)哌啶-2-基)乙腈，及 2-((2S,4S)-4-(7-(5,6-二甲基-1H-吲唑-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-1-((E)-4-甲氧基丁-2-烯醯基)哌啶-2-基)乙腈
    。
  2. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中 R 1係選自Cl、CH 2F、CHF 2及CF 3； Cy 1係選自 R 2係選自F及Cl； R 3係選自 及 Cy 2係選自 。
  3. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1係選自CH 3、CH 2F、CHF 2及CF 3。
  4. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1係選自Cl、CH 3及CF 3。
  5. 如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1係選自CH 2F、CHF 2及CF 3。
  6. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1係選自Cl及CH 3。
  7. 如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1係選自Cl及CF 3。
  8. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 1係選自CH 3及CF 3。
  9. 如請求項1至8中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Cy 1係選自Cy 1-a及Cy 1-b。
  10. 如請求項1至8中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Cy 1係選自Cy 1-a及Cy 1-c。
  11. 如請求項1至8中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Cy 1係選自Cy 1-b及Cy 1-c。
  12. 如請求項1至11中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 2為F。
  13. 如請求項1至11中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 2為Cl。
  14. 如請求項1至13中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 3為R 3-a。
  15. 如請求項1至13中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R 3為R 3-b。
  16. 如請求項1至15中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Cy 2係選自Cy 2-a及Cy 2-b。
  17. 如請求項1至15中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Cy 2係選自Cy 2-a及Cy 2-c。
  18. 如請求項1至15中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Cy 2係選自Cy 2-b及Cy 2-c。
  19. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中 Cy 1為Cy 1-a；及 Cy 2為Cy 2-a。
  20. 如請求項1之化合物，其中該化合物係選自 1-(1-((2S,4S)-1-(丁-2-炔醯基)-2-(氰基甲基)哌啶-4-基)-8-氯-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)異喹啉-8-甲腈； 1-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-((E)-4-甲氧基丁-2-烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)異喹啉-8-甲腈； 1-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)異喹啉-8-甲腈； 2-((2S,4S)-4-(8-氯-7-(5,6-二甲基-1H-吲唑-4-基)-4-(3-(乙基(甲基)胺基)氮雜環丁烷-1-基)-6-氟-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-1-基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-2-基)乙腈； 8-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-(2-氟丙烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈； 8-(8-氯-1-((2S,4S)-2-(氰基甲基)-1-((E)-4-甲氧基丁-2-烯醯基)哌啶-4-基)-6-氟-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈；及 8-(1-((2S,4S)-1-(丁-2-炔醯基)-2-(氰基甲基)哌啶-4-基)-6-氟-8-甲基-4-((S)-1-((S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙氧基)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-7-基)-1-萘腈； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  21. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至20中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  22. 一種抑制KRAS活性之方法，該方法包含使如請求項1至20中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，或如請求項21之醫藥組合物與KRAS接觸。
  23. 如請求項22之方法，其中該接觸包含向患者投與該化合物。
  24. 一種治療與抑制KRAS相互作用相關之疾病或病症的方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量之如請求項1至20中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，或如請求項21之醫藥組合物。
  25. 一種治療與抑制具有G12C突變之KRAS蛋白相關之疾病或病症的方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量之如請求項1至20中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，或如請求項21之醫藥組合物。
  26. 一種用於治療患者之癌症的方法，該方法包含向該患者投與治療有效量之如請求項1至20中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，或如請求項21之醫藥組合物。
  27. 如請求項26之方法，其中該癌症係選自癌瘤、血液癌、肉瘤及神經膠質母細胞瘤。
  28. 如請求項27之方法，其中該血液癌係選自骨髓增生性贅瘤、骨髓發育不良症候群、慢性及幼年型骨髓單核球性白血病、急性骨髓性白血病、急性淋巴球性白血病，及多發性骨髓瘤。
  29. 如請求項27之方法，其中該癌瘤係選自胰臟癌、大腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、乳癌、頭頸癌、子宮頸癌、皮膚癌，及甲狀腺癌。
  30. 如請求項25之方法，其中該疾病或病症為免疫或發炎性病症。
  31. 如請求項30之方法，其中該免疫或發炎性病症係由KRAS之體細胞突變引起之Ras相關淋巴增生性病症及幼年型骨髓單核球性白血病。
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