TW202328167A

TW202328167A - 結核病疫苗

Info

Publication number: TW202328167A
Application number: TW111132746A
Authority: TW
Inventors: 安Ｍ亞文; 茱莉亞迪尤利奧; 珍妮特Ｌ道格拉斯; 艾蜜莉馬歇爾; 利亞Ｂ索里亞加; 赫伯特Ｗ维珍
Original assignee: 美商維爾生物科技股份有限公司
Priority date: 2021-08-31
Filing date: 2022-08-30
Publication date: 2023-07-16
Also published as: CL2024000600A1; US20240350607A1; KR20240049802A; EP4396208A1; CO2024001517A2; AU2022339918A1; MX2024001964A; IL310667A; WO2023034783A1; JP2024534178A; CA3226978A1

Abstract

本揭露內容係關於結核病抗原及用於遞送該等抗原之載體。本揭露內容亦係關於包含該等抗原及載體之免疫原性組成物及其用途。

Description

結核病疫苗

關於序列表之陳述

與本申請案相關之序列表以文本格式代替紙印本提供，且特此以引用之方式併入本說明書中。含有序列表之正文檔案之名稱為930485_439TW_SequenceListing.xml。正文檔案為558,741個位元組，創建於2022年8月22日且經由EFS-Web以電子方式提交。

本發明係有關於結核病疫苗。

發明背景

結核病仍為全球疾病及死亡之主要原因(Schito, M等人，Perspectives on Advances in Tuberculosis Diagnostics, Drugs, and Vaccines. Clin Infect Dis.61增刊3, S102-118 (2015))。因此，對於結核分枝桿菌( Mycobacterium tuberculosis)感染，仍需要有效的預防性或治療性疫苗。

已發現，以巨細胞病毒(CMV)為主之疫苗載體對所遞送之抗原產生較強免疫反應，甚至對傳統上能夠逃避自然免疫且引起重複或慢性感染之病原體亦如此。舉例而言，經修飾以編碼猿猴免疫缺陷病毒(SIV)抗原之恆河猴巨細胞病毒(RhCMV)之68-1株已與針對SIV攻擊之持久保護相關聯(Hansen, SG等人, Immune clearance of highly pathogenic SIV infection. Nature 502,100-104 (2013)；Hansen, SG等人, Profound early control of highly pathogenic SIV by an effector memory T-cell vaccine. Nature 473, 523–527 (2011)；Hansen, SG等人, Effector memory T cell responses are associated with protection of rhesus monkeys from mucosal simian immunodeficiency virus challenge. Nat Med. 15, 293–299 (2009))。CMV載體之後續研究揭露，不同免疫反應可取決於CMV主鏈之特定基因體分而引發(Früh, K等人, CD8+ T cell programming by cytomegalovirus vectors: applications in prophylactic and therapeutic vaccination. Curr Opin Immunol. 47, 52–56 (2017)；Hansen, SG等人Cytomegalovirus vectors violate CD8+ T cell epitope recognition paradigms. Science 340, 1237874 (2013))。

恆河猴巨細胞病毒(RhCMV)之68-1已經展示以引發識別由MHC-II及MHC-E而非習知MHC-I呈遞之肽的CD8+ T細胞。此效果亦已在食蟹獼猴CMV (CyCMV)中觀察到，從而表明HCMV UL128、UL130、UL146及UL147之RhCMV及CyCMV同源物的缺失能夠誘導MHC-E-限制性CD8+ T細胞(國際申請公開案第WO2016/130693A1號，第WO2018/075591A1號)。另外，此等載體引發MHC-II限制性CD8+ T細胞。MHC-II限制性CD8+ T細胞之誘導可藉由將內皮細胞特異性微小RNA (miR) 126之目標位點插入至此等載體之基本病毒基因中來消除，從而產生專門引發MHC-E限制性CD8+ T細胞之「僅MHC-E」載體(國際申請公開案第WO2018/075591A1號)。相比之下，將骨髓細胞特異性miR142-3p插入至68-1 RhCMV中已展示防止MHC-E限制性CD8+ T細胞之誘導，從而產生引發專門受MHC-II限制之CD8+ T細胞的載體(國際申請公開案第WO2017/087921A1號)。UL40同源物Rh67之缺失亦已展示防止MHC-E限制性CD8+ T細胞之誘導，從而產生「僅MHC-II-載體」(國際申請公開案第WO2016/130693A1號)。因此，藉由將CMV載體設計成具有特定基因缺失，CMV可用於遞送抗原及「程式化」對彼等抗原之免疫反應。

發明概要

本文中揭露包含結核分枝桿菌(Mtb)抗原之融合蛋白及編碼該等融合蛋白之核酸。在一些實施例中，本揭露內容提供一種融合蛋白，其包含Mtb Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfA、RpfD、Ra12、TbH9及Ra35，或其部分或片段中之一或多者。在一些實施例中，本揭露內容提供編碼如上文所描述之融合蛋白的載體。

較佳實施例之詳細說明 I. 詞彙表

以下章節提供結核病抗原及相關醫藥組成物以及誘導免疫反應(諸如抗結核分枝桿菌反應)之方法，及治療或預防結核病之方法的詳細描述。在更詳細地闡述本揭露內容之前，提供將在本文中使用之某些術語的定義可能有助於對本揭露內容之理解。額外定義闡述於整個本揭露內容中。

除非上下文另外要求，否則在整個本說明書及申請專利範圍中，字語「包含(comprise)」及其變化形式(諸如「包含(comprises/comprising)」)應以開放的包括性意義解釋，亦即「包括但不限於」。「由……組成」應意謂排除其他成分之超過微量元素及本文中所揭露之實質性方法步驟，且在胺基酸或核酸序列之情況下，分別排除額外胺基酸或核苷酸。術語「基本上由……組成」將申請專利範圍之範疇限制於特定材料或步驟，或不顯著影響所主張發明之基本特徵之材料或步驟。舉例而言，基本上由如本文所定義之元素組成的組成物將不排除來自分離及純化方法之微量污染物及醫藥學上可接受之載劑，諸如磷酸鹽緩衝鹽水、防腐劑及其類似者。類似地，當蛋白質包括的額外胺基酸佔蛋白質之長度的至多20%且並不實質上影響蛋白質之活性(例如，使蛋白質之活性變化不超過50%)時，蛋白質基本上由特定胺基酸序列組成。由過渡術語中之各者定義的實施例在本發明之範疇內。

在本說明書中，除非另外指示，否則術語「約」意謂所指示範圍、值或結構之± 20%。

應理解，除非另外陳述，否則如本文中所使用之術語「一(a/an)」包括所列舉組分中之「一或多者」。替代方案(例如，「或」)之使用應理解為意謂替代方案中之一者、二者或其任何組合，且可與「及/或」同義地使用。如本文中所使用，術語「包括」及「具有」同義地使用，該等術語及其變化形式意欲解釋為非限制性的。

字語「實質上」不排除「完全」；例如「實質上不含」Y之組成物可完全不含Y。必要時，字語「實質上」可自本文中所提供之定義省略。

如本文中所使用，術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」及此等術語之變化形式係指分子，特定言之分別包括融合蛋白之肽、寡肽、多肽或蛋白質，包含藉由普通肽鍵或經修飾肽鍵彼此接合之至少二個胺基酸，諸如例如在等排肽之情況下。舉例而言，肽、多肽或蛋白質可由選自由遺傳密碼定義之20個胺基酸的胺基酸構成，該等胺基酸藉由普通肽鍵彼此連接(「經典」多肽)。肽、多肽或蛋白質可由L-胺基酸及/或D-胺基酸構成。特定言之，術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」亦包括定義為含有非肽結構元素之肽類似物之「肽模擬物」，該等肽能夠模擬或拮抗天然親本肽之多個生物作用。肽模擬物不具有經典肽特徵，諸如酶切肽鍵。特定言之，除此等胺基酸以外，肽、多肽或蛋白質可包含除由遺傳密碼定義之20個胺基酸以外的胺基酸，或其可由除由遺傳密碼定義之20個胺基酸以外的胺基酸構成。特定言之，在本揭露內容之上下文中之肽、多肽或蛋白質可同樣由藉由自然過程(諸如轉譯後成熟過程)或化學過程(其為熟習此項技術者所熟知)修飾之胺基酸構成。此等修飾在文獻中充分詳述。此等修飾可出現在多肽中之任何位置：在肽骨架中、在胺基酸鏈中，或甚至在羧基末端或胺基末端處。特定言之，肽或多肽可在泛素化之後呈分枝狀或呈具有或不具有分枝之環狀。此類型之修飾可為熟習此項技術者熟知之天然或合成轉譯後過程之結果。在本揭露內容之上下文中之術語「肽」、「多肽」或「蛋白質」尤其亦包括經修飾之肽、多肽及蛋白質。舉例而言，肽、多肽或蛋白質修飾可包括乙醯化、醯化、ADP核糖基化、醯胺化、核苷酸或核苷酸衍生物之共價固定、脂質或脂質衍生物之共價固定、磷脂醯肌醇之共價固定、共價或非共價交聯、環化、二硫鍵形成、去甲基化、醣基化(包括聚乙二醇化)、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、蛋白水解過程、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒醯化(seneloylation)、硫酸酯化、胺基酸添加(諸如精胺醯化)或泛素化。此等修飾在文獻中充分詳述(Proteins Structure and Molecular Properties,第2版, T. E. Creighton, New York (1993)；Post-translational Covalent Modifications of Proteins, B. C. Johnson編, Academic Press, New York (1983)；Seifter等人, Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182:626-46 (1990)；及Rattan等人, Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci 663:48-62(1992))。因此，術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」包括例如脂肽、脂蛋白、醣肽、醣蛋白及其類似者。

蛋白質之「異種同源物」之特徵通常在於具有大於75%序列一致性，其係經由使用比對演算法(例如，設定為預設參數之ALIGN程式(2.0版))對特定蛋白質之胺基酸序列進行全長比對來計算。當藉由此方法評定時，與參考序列甚至更相似之蛋白質將展示逐漸增加之一致性百分比，諸如至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%或至少98%序列一致性。另外，可在所揭露肽之特定域之全長上比較序列一致性。

如本文中所使用，「(多)肽」包含藉由如上文所解釋之肽鍵連接之胺基酸單體的單鏈。如本文中所使用，「蛋白質」包含一或多個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(多)肽，即藉由如上文所解釋之肽鍵連接的胺基酸單體之一或多條鏈。在特定實施例中，根據本揭露內容之蛋白質包含1、2、3或4個多肽。

如本文中所使用，術語「核酸」、「核酸分子」、「核酸序列」及「聚核苷酸」可互換地使用且意欲包括DNA分子及RNA分子，包括(但不限於)信使RNA (mRNA)、DNA/RNA混合物或合成核酸。核酸可為單股，或部分或完全雙股(雙螺旋)。雙螺旋核酸可為同雙螺旋或異雙螺旋。核酸分子可為單股或雙股。

如本文中所使用，術語「編碼序列」意欲指編碼蛋白質產物之胺基酸序列的聚核苷酸分子。編碼序列之邊界一般藉由通常以ATG起始密碼子開始之開放閱讀框架測定。

如本文中所使用，術語「表現」係指產生多肽時所涉及之任何步驟，包括轉錄、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後修飾、分泌或類似者。

如本文中所使用，術語「序列變體」係指與參考序列相比具有一或多個變化之任何序列，其中參考序列為序列表中所列出的序列中之任一者，即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:40。因此，術語「序列變體」包括核苷酸序列變體及胺基酸序列變體。對於在核苷酸序列之上下文中的序列變體，參考序列亦為核苷酸序列，而對於在胺基酸序列之上下文中的序列變體，參考序列亦為胺基酸序列。如本文中所使用之「序列變體」與參考序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致。除非另外規定，否則通常關於參考序列(即，本申請案中所列舉之序列)之全長來計算序列一致性。如本文中所提及之一致性百分比可例如使用此項技術中已知之各種比對方法來測定，諸如使用由國家生物資訊中心(the National Center for Biotechnology Information；NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; gap open penalty=1 1 and gap extension penalty=1]指定之預設參數的BLAST。在核酸(核苷酸)序列之上下文中之「序列變體」具有經改變序列，其中參考序列中之核苷酸中之一或多者缺失或經取代，或將一或多個核苷酸插入至參考核苷酸序列之序列中。核苷酸在本文中藉由標準單字母名稱(A、C、G或T)提及。歸因於遺傳密碼之簡併，核苷酸序列之「序列變體」可引起或不引起各別參考胺基酸序列之變化，即胺基酸「序列變體」。在某些實施例中，核苷酸序列變體為不產生胺基酸序列變體(即，沉默突變)之變體。然而，產生「非沉默」突變之核苷酸序列變體亦在範疇內，尤其係產生與參考胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列的此等核苷酸序列變體。在胺基酸序列之上下文中之「序列變體」具有經改變序列，其中與參考胺基酸序列相比，該等胺基酸中之一或多者缺失、經取代或經插入。作為變化之結果，此序列變體具有與參考胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列。舉例而言，根據參考序列之100個胺基酸，具有不超過10個變化(即缺失、插入或取代之任何組合)之變異序列與參考序列「至少90%一致」。

儘管有可能具有非守恆胺基酸取代，但在某些實施例中，取代為守恆胺基酸取代，其中經取代胺基酸具有與參考序列中之對應胺基酸類似的結構或化學特性。藉助於實例，守恆胺基酸取代涉及用另一胺基酸取代一個脂族或疏水性胺基酸，例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；用另一胺基酸取代一個含羥基胺基酸，例如絲胺酸及蘇胺酸；用另一殘基取代一個酸性殘基，例如麩胺酸或天冬胺酸；用另一殘基置換一個含醯胺殘基，例如天冬醯胺及麩醯胺酸；用另一殘基置換一個芳族殘基，例如苯丙胺酸及酪胺酸；用另一殘基取代一個鹼性殘基，例如離胺酸、精胺酸及組胺酸；及用另一胺基酸取代一個小胺基酸，例如丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、甲硫胺酸及甘胺酸。

胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。端插入之實例包括胺基酸序列之N端或C端與報導子分子或酶之融合。

除非另外陳述，否則序列變體之變化並未消除各別參考序列之功能性，例如在本發明之情況下，消除本文中所揭露之抗原或載體之功能性。測定哪些核苷酸及胺基酸殘基在不消除此功能性之情況下分別可經取代、插入或缺失之指導可藉由使用此項技術中已知之電腦程式發現。

本揭露內容之核苷酸序列可經密碼子最佳化，例如密碼子可經最佳化以供人類細胞使用。舉例而言，可因此改變任何病毒或細菌序列。許多病毒，包括HIV及其他慢病毒，使用大量稀有密碼子，且藉由改變此等密碼子以對應於常用於所需個體之密碼子，可如André, S等人(Increased Immune Response Elicited by DNA Vaccination with a Synthetic gp120 Sequence with Optimized Codon Usage. J Virol. 72, 1497-1503 (1998))中所描述達成抗原之增強表現。

如本文中所使用，「衍生自」指定核酸、肽、多肽或蛋白質之核酸序列或胺基酸序列係指核酸、肽、多肽或蛋白質之起始序列。在一些實施例中，衍生自特定序列之核酸序列或胺基酸序列具有與彼序列或其部分基本上一致之胺基酸序列(其衍生自彼序列或其部分)，藉此「基本上一致」包括如上文所定義之序列變體。在某些實施例中，衍生自特定肽或蛋白質之核酸序列或胺基酸序列衍生自特定肽或蛋白質中之對應域。藉此，「對應」尤其係指相同功能性。舉例而言，「細胞外域」對應於(另一蛋白質之)另一「細胞外域」，或「跨膜域」對應於(另一蛋白質之)另一「跨膜域」。因此，肽、蛋白質及核酸之「對應」部分可由一般熟習此項技術者鑑別。同樣地，「衍生自」其他序列之序列通常由一般熟習此項技術者鑑別為序列中具有其起始序列。

在一些實施例中，衍生自另一核酸、肽、多肽或蛋白質之核酸序列或胺基酸序列可與起始核酸、肽、多肽或蛋白質(其衍生該核酸序列或胺基酸序列)一致。然而，衍生自另一核酸、肽、多肽或蛋白質之核酸序列或胺基酸序列亦可相對於起始核酸、肽、多肽或蛋白質(其衍生該核酸序列或胺基酸序列)具有一或多種突變，特定言之，衍生自另一核酸、肽、多肽或蛋白質之核酸序列或胺基酸序列可為起始核酸、肽、多肽或蛋白質(其衍生該核酸序列或胺基酸序列)的如上文所描述之功能序列變體。舉例而言，在肽/蛋白質中，一或多個胺基酸殘基可經其他胺基酸殘基取代，或可發生一或多個胺基酸殘基插入或缺失。

如本文中所使用，術語「突變」係關於與參考序列，例如對應基因體序列相比，核酸序列及/或胺基酸序列之變化。突變(例如與基因體序列相比)可為例如(天然存在之)體細胞突變、自發突變、誘導突變(例如由酶、化學物質或輻射誘導)或由定點突變誘發獲得之突變(用於在核酸序列中及/或在胺基酸序列中產生特異性及有意變化的分子生物學方法)。因此，應理解術語「突變(mutation/mutating)」亦包括例如在核酸序列中或在胺基酸序列中物理上產生突變。突變包括一或多個核苷酸或胺基酸之取代、缺失及插入以及若干連續核苷酸或胺基酸之倒位。一些類型之編碼序列突變包括點突變(個別核苷酸或胺基酸之差異)；沉默突變(不引起胺基酸變化之核苷酸差異)；缺失(一或多個核苷酸或胺基酸缺失(直至且包括基因之整個編碼序列缺失)之差異)；框移突變(不可除以3的之核苷酸數目缺失引起胺基酸序列改變之差異)。產生胺基酸差異之突變亦可稱作胺基酸取代突變。胺基酸取代突變可藉由胺基酸序列中之特定位置處的相對於野生型之胺基酸變化來描述。為了達成胺基酸序列中之突變，可將突變引入至編碼該胺基酸序列之核苷酸序列中以表現(重組)突變多肽。突變可例如藉由改變(例如藉由定點突變誘發)編碼一個胺基酸之核酸分子之密碼子以產生編碼不同胺基酸之密碼子，或藉由合成序列變體，例如藉由已知編碼多肽之核酸分子之核苷酸序列，且藉由在無需使核酸分子之一或多個核苷酸突變的情況下設計包含編碼多肽之變體之核苷酸序列之核酸分子的合成來達成。

如本文中所使用之術語「重組」(例如，重組蛋白、重組核酸、重組抗體等)係指藉由重組手段製備、表現、產生或分離且非天然存在之任何分子(蛋白質、核酸、抗體等)。參考核酸或多肽，「重組」係指序列不係天然存在的或序列藉由人工組合兩個或更多個以其他方式分離之序列區段而獲得的核酸或多肽，例如包含異源抗原之CMV載體。此人工組合通常藉由化學合成，或更常見地藉由人工操縱核酸之分離區段，例如藉由基因工程改造技術來實現。重組多肽亦可指已使用重組核酸，包括轉移至並非為多肽之天然來源之宿主生物體的重組核酸(例如編碼形成包含異源抗原之CMV載體之多肽的核酸)製備之多肽。

如本文中所使用，術語「載體」係指可併入有特定序列之核酸分子且接著引入至宿主細胞中，藉此製造轉型宿主細胞的載子。載體可包括准許其在宿主細胞中複製之核酸序列，諸如複製起始序列。載體亦可包括一或多種可選標記基因及此項技術中已知之其他遺傳元件，包括引導核酸表現之啟動子元件。載體可為病毒載體，諸如CMV載體。病毒載體可由野生型或減毒病毒構築，包括複製缺陷型病毒。

由於在本文中使用術語「可操作地連接」，因此當第一核酸序列以使得其對第二核酸序列有影響之方式置放時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。可操作地連接之DNA序列可為連續的，或其可以一定距離操作。

如本文中所使用，術語「啟動子」可指引導核酸轉錄之大量核酸控制序列中之任一者。通常，真核啟動子包括靠近轉錄起始位點之必需核酸序列，諸如在聚合酶II型啟動子之情況下，TATA元件或藉由一或多個轉錄因子識別之任何其他特定DNA序列。啟動子之表現可藉由強化子或抑制子元件進一步調節。啟動子之大量實例為可獲得的且為一般熟習此項技術者所熟知。包含可操作地連接至編碼特定多肽之核酸序列之啟動子的核酸可稱為表現載體。啟動子可來自CMV基因，包括但不限於UL82及UL78。

如本文中所使用，術語「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換地使用且所有此等名稱均包括後代。因此，字語「轉型體」及「轉型細胞」包括主要個體細胞及其衍生之培養物，而與轉移數目無關。亦應理解，由於有意或無意突變，所有後代之DNA含量可能不完全一致。包括具有與最初轉型細胞中所篩選的相同功能或生物活性的變體後代。在意指不同名稱之情況下，將自上下文中瞭解。

如本文中所使用，術語「微小RNA」係指參與控制基因表現之生物分子之主要類別。舉例而言，在人類心臟、肝臟或腦中，miRNA在組織規格或細胞譜系決定中起作用。另外，miRNA影響多種過程，包括早期發育、細胞增殖及細胞死亡，以及細胞凋亡及脂肪代謝。大量miRNA基因、不同表現模式及潛在miRNA目標之豐度表明miRNA可為基因多樣性之重要來源。成熟miRNA通常為調節包括與miRNA互補之序列之mRNA之表現的8至25個核苷酸非編碼RNA。已知此等小RNA分子藉由調節mRNA之穩定性及/或轉譯來控制基因表現。舉例而言，miRNA結合於目標mRNA之3' UTR且抑制轉譯。miRNA亦可結合於目標mRNA且經由RNAi路徑介導基因沉默。miRNA亦可藉由引起染色質凝聚來調節基因表現。

miRNA藉由結合於miRNA識別元件(MRE)使一或多個特異性mRNA分子之轉譯沉默，該miRNA識別元件定義為直接與mRNA轉錄物上某處之miRNA鹼基配對且與其相互作用的任何序列。通常，MRE存在於mRNA之3'非轉譯區(UTR)中，但其亦可存在於編碼序列或5'UTR中。MRE不一定與miRNA完美互補，通常僅具有與miRNA互補之幾個鹼基且通常在互補之彼等鹼基內含有一或多個錯配。MRE可為能夠經miRNA充分結合以使得MRE可操作連接之基因(諸如活體內生長所必需或強化之CMV基因)之轉譯由諸如RISC之miRNA沉默機制抑制的任何序列。

如本文所使用之術語「疫苗」通常理解為提供至少一種抗原或免疫原之預防性或治療性物質。抗原或免疫原可衍生自適用於疫苗接種之任何物質。舉例而言，抗原或免疫原可衍生自病原體，諸如衍生自細菌或病毒粒子等，或衍生自腫瘤或癌組織。抗原或免疫原刺激身體之適應性免疫系統以提供適應性免疫反應。特定言之，「抗原」或「免疫原」通常係指可由免疫系統(例如，適應性免疫系統)識別且能夠例如藉由形成抗體及/或抗原特異性T細胞來觸發抗原特異性免疫反應作為適應性免疫反應之一部分的物質。通常，抗原可為或可包含可由MHC呈遞至T細胞之肽或蛋白質。疫苗可用於預防或治療。因此，疫苗可用於降低產生疾病(諸如腫瘤或病理性感染)之可能性，或降低疾病或病況之症狀嚴重程度、限制疾病或病況(諸如腫瘤或病理性感染)之進展或限制疾病或病況(諸如腫瘤)之復發。在特定實施例中，疫苗包含表現異源抗原之複製缺陷型CMV。在特定實施例中，疫苗包含表現包含Mtb抗原之融合蛋白的複製缺陷型CMV。如本文中所使用，術語「抗原」或「免疫原」可互換地使用以指能夠誘導個體之免疫反應之物質，通常為蛋白質。該術語亦指具有免疫活性之蛋白質，其意義在於在向個體投予(直接地或藉由向個體投予編碼該蛋白質之核苷酸序列或載體)後，蛋白質能夠誘發針對彼蛋白質之體液及/或細胞型之免疫反應。

如本文中所使用，「異源」或「外源」核酸分子、構築體或序列係指核酸分子或核酸分子之部分，其取決於上下文對第二核酸分子或宿主細胞並非為天然的，但可能與核酸分子或該第二核酸分子或宿主細胞之部分同源。異源或外源核酸分子、構築體或序列之來源可來自不同屬或物種，或可為合成的。在某些實施例中，藉由例如共軛、轉化、轉染、電穿孔或類似者向宿主細胞或宿主基因體中添加異源或外源核酸分子(即，非內源或天然)，其中所添加分子可整合至宿主基因體中或以染色體外遺傳物質(例如，以質體或其他形式之自我複製載體)形式存在，且可存在於多個複本中。另外，術語「異源」包括由引入至第二核酸分子或宿主細胞中之外源核酸分子編碼的非天然酶、蛋白質或其他活性物質，即使第二核酸分子或宿主細胞編碼同源蛋白質或活性物質。

如本文中所使用，術語「異源抗原」係指不衍生自其已插入之載體的任何蛋白質或其片段。舉例而言，在一些實施例中，「異源抗原」為並非衍生自CMV之任何蛋白質或其片段。異源抗原可為病原體特異性抗原、腫瘤病毒抗原、腫瘤抗原、宿主自體抗原或任何其他抗原。

如本文中所使用，「抗原特異性T細胞」係指識別特定抗原之CD8+或CD4+淋巴球。通常，抗原特異性T細胞特異性結合於由MHC分子呈遞之特定抗原，但不特異性結合於由相同MHC呈遞之其他抗原。

如本文中所使用，「免疫原性肽」係指包含等位基因特異性模體(motif)或其他序列，諸如N端重複序列之肽，使得該肽將結合MHC分子且誘導針對衍生免疫原性肽之抗原的細胞毒性T淋巴球(「CTL」)反應或B細胞反應(例如抗體產生)。在一些實施例中，免疫原性肽使用序列模體或其他方法，諸如此項技術中已知的神經網路或多項式測定來鑑別。通常，使用演算法來判定肽之「結合臨限值」以選擇具有使其在一定親和力下具有高結合機率且將具有免疫原性之評分的彼等肽。演算法係基於對特定位置處之特定胺基酸之MHC結合的影響、對特定位置處之特定胺基酸之抗體結合的影響或對含模體肽中之特定取代之結合的影響。在免疫原性肽之上下文中，「保守殘基」為以顯著高於肽中之特定位置處之隨機分佈所預期的頻率出現的殘基。在一些實施例中，保守殘基為MHC結構可提供與免疫原性肽之接觸點的殘基。

如本文中所使用，術語「投予」意謂藉由任何有效途徑向個體提供或給予藥物，諸如包含有效量之抗原的組成物或包含外源抗原之醫藥組成物。例示性投予途徑包括(但不限於)注射(諸如皮下、肌肉內、皮內、腹膜內及靜脈內)、經口、經舌下、經直腸、經皮、經鼻內、經陰道及吸入途徑。

如本文中所使用，使用之「醫藥學上可接受之載劑」為習知的。E.W. Martin之Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA,第19版, 1995描述適用於醫藥遞送本文中所揭露之組成物的組成物及調配物。一般而言，載劑之性質將視所採用之特定投予模式而定。舉例而言，非經腸調配物通常包含包括醫藥學上及生理學上可接受之流體的可注射流體，諸如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、右旋糖水溶液、甘油或類似者作為媒劑。對於固體組成物(例如散劑、丸劑、錠劑或膠囊形式)，習知無毒固體載劑可包括例如醫藥級之甘露醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。除生物中性載劑以外，待投予之醫藥組成物可含有少量無毒輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑及pH緩衝劑及其類似者，例如乙酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸酯。

劑量通常相對於體重表示。因此，即使未明確提及術語「體重」，但以[g、mg或其他單位]/kg (或g、mg等)表示之劑量通常指[g、mg或其他單位]「/kg (或g、mg等)體重」。

如本文中所使用之術語「疾病」意欲通常與術語「病症」及「病況」(如同醫學病況)同義且可與其互換地使用，此係因為以上全部反映人類或動物身體或其部分中之一者之異常狀況，該異常狀況損害正常運作、通常藉由突出的病徵及症狀體現且使得人類或動物之持續時間縮短或生活品質降低。

如本文中所使用，「結核病」意謂一般由通常感染肺之結核分枝桿菌引起之疾病。然而，諸如堪薩斯分枝桿菌( M .kansasii)之其他「非常型」分枝桿菌可產生疾病的類似臨床及病理表像。結核分枝桿菌之傳播藉由空氣途徑在具有不良通風之受限區域中發生。在超過90%之病例中，在感染結核分枝桿菌後，免疫系統阻止結核分枝桿菌(通常稱作發揚性結核病)之疾病發展。然而，並非所有的結核分枝桿菌均被殺滅且因此形成微小的硬膠囊。將「原發性結核病」視為初始感染之後產生的疾病，通常發生在兒童身上。初始感染病灶為伴有肉芽腫性肺門淋巴結感染之較小胸膜下肉芽腫。此等共同構成Ghon綜合症。在幾乎所有情況下，此等肉芽腫消退且不存在進一步感染擴散。「繼發性結核病」在成年人中主要被視為先前感染之再激活(或再感染)，尤其係在健康狀況下降時。肉芽腫性發炎更加鮮紅且廣泛。通常，上肺葉受最大影響，且可發生空腔化。肺外之結核病擴散可導致出現大量具有特徵性模式之不常見發現，該等特徵性模式包括骨骼結核病、生殖道結核病、泌尿道結核病、中樞神經系統(CNS)結核病、胃腸道結核病、腎上腺結核病、瘰鬁(scrofula)及心臟結核病。「潛伏性」結核病為可藉由診斷性分析，諸如但不限於結核菌素皮膚測試(TST)偵測到之個人中的Mtb感染，其中該感染在彼個人中不產生症狀。「發揚性」結核病為個體之症狀性Mtb感染。顯微鏡下，由TB感染產生之發炎為肉芽腫性的，伴有上皮樣巨噬細胞及朗格漢斯(Langhans)巨細胞以及淋巴球、漿細胞，可能亦有幾個多形核細胞、具有膠原蛋白之纖維母細胞，且中心有特徵性乾酪樣壞死。發炎反應係藉由IV型超敏反應介導，且皮膚測試係基於此反應。在一些實例中，結核病可藉由皮膚測試、抗酸性染色、金胺(auramine)染色或其組合來診斷。所篩檢之最常見樣本係痰，但亦可對組織或其他體液執行組織學染色。「肺部」結核病係指任何細菌學上確認或臨床上診斷之涉及肺之結核病病例，包括肺實質及/或氣管支氣管樹。「肺外」結核病係指任何細菌學上確認或臨床上診斷之涉及除肺以外之器官的結核病病例，包括但不限於胸膜、淋巴結、腹、泌尿生殖道、皮膚、關節、骨頭及/或腦膜。

如本文中所使用，「復發性」結核病係指內源性、原發性結核分枝桿菌感染之再激活或結核分枝桿菌之最近外源性再感染。復發性結核病亦指可在初次感染後多年出現之「原發後(postprimary)肺結核」。

如本文中所使用，「輔助」係指與初步治療一起使用的治療，其中輔助治療之目的係輔助初步治療。 II. 結核病抗原

本文中揭露包含結核分枝桿菌(Mtb)抗原之融合蛋白及編碼其之核酸。

在一些實施例中，本揭露內容提供一種融合蛋白，其包含Mtb Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfA、RpfD、Ra12、TbH9及Ra35，或其部分或片段中之一或多者。

Ag85A為Mtb乙醯基轉移酶，其與Ag85B及Ag85C形成複合物且參與合成分枝桿菌細胞包膜之組分(參見例如, Elamin, AA等人, The Mycobacterium tuberculosisAg85A is a novel diacylglycerol acyltransferase involved in lipid body formation. Molecular Microbiology 81, 1577-1592 (2011))。如本文中所使用，視上下文而定，「Ag85A」可指酶或編碼Ag85A蛋白質或肽之胺基酸序列或其部分。在一些實施例中，Ag85A係指根據UniProtKB-P9WQP3 (A85A_MYCTU) (SEQ ID NO:1)之胺基酸序列。在一些實施例中，Ag85A係指根據SEQ ID NO:1之胺基酸序列之片段。在一些實施例中，Ag85A係指根據SEQ ID NO:11之胺基酸序列。在一些實施例中，Ag85A係指根據SEQ ID NO:12之胺基酸序列。在一些實施例中，Ag85A係指與根據SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列，或其片段。在一些實施例中，Ag85A係指與根據SEQ ID NO:11之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，Ag85A係指與根據SEQ ID NO:12之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。

ESAT-6為與病原性毒性及宿主免疫反應之調節相關聯的分泌型Mtb蛋白質(Sreejit, G等人The ESAT-6 Protein of Mycobacterium tuberculosisInteracts with Beta-2-Microglobulin (β2M) Affecting Antigen Presentation Function of Macrophage. PLoS Pathog 10, e1004446 (2014))。如本文中所使用，視上下文而定，「ESAT-6」可指蛋白質或肽，或編碼ESAT-6蛋白質或肽之胺基酸序列或其部分。在一些實施例中，ESAT-6係指根據UniProtKB - P9WNK7 (ESXA_MYCTU) (SEQ ID NO:2)之胺基酸序列。在一些實施例中，ESAT-6係指根據SEQ ID NO:2之胺基酸序列的片段。在一些實施例中，ESAT-6係指根據SEQ ID NO:13之胺基酸序列。在一些實施例中，ESAT-6係指與根據SEQ ID NO:2之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列，或其片段。在一些實施例中，ESAT-6係指與根據SEQ ID NO:13之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。

Rv3407為Mtb抗原(Mollenkopf, HJ等人Application of Mycobacterial Proteomics to Vaccine Design: Improved Protection by Mycobacterium bovis BCG Prime-Rv3407 DNA Boost Vaccination against Tuberculosis. Infection and Immunity 72, 6471-6479 (2004))。如本文中所使用，視上下文而定，「Rv3407」可指抗原性蛋白質或肽，或編碼Rv3407蛋白質或肽之胺基酸序列或其部分。在一些實施例中，Rv3407係指根據UniProtKB - P9WF23 (VPB47_MYCTU) (SEQ ID NO:3)之胺基酸序列。在一些實施例中，Rv3407係指根據SEQ ID NO:3之胺基酸序列的片段。在一些實施例中，Rv3407係指根據SEQ ID NO:14之胺基酸序列。在一些實施例中，Rv3407係指與根據SEQ ID NO:3之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列，或其片段。在一些實施例中，Rv3407係指與根據SEQ ID NO:14之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。

Rv2626c已鑑別為Mtb潛伏抗原(Amiano, NO等人IFN-γ and IgG responses to Mycobacterium tuberculosislatency antigen Rv2626c differentiate remote from recent tuberculosis infection. Sci Rep 10, 7472 (2020))。如本文中所使用，視上下文而定，「Rv2626c」可指抗原性蛋白質或肽，或編碼Rv2626c蛋白質或肽之胺基酸序列，或其部分。在一些實施例中，Rv2626c係指根據UniProtKB - P9WJA3 (HRP1_MYCTU) (SEQ ID NO:4)之胺基酸序列。在一些實施例中，Rv2626c係指根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列的片段。在一些實施例中，Rv2626c係指根據SEQ ID NO:15之胺基酸序列。在一些實施例中，Rv2626c係指與根據SEQ ID NO:4之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列，或其片段。在一些實施例中，Rv2626c係指與根據SEQ ID NO:15之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。

RpfA及RpfD屬於涉及毒性及休眠復蘇但一般不需要活體外生長之Mtb蛋白質家族(Kana, BD等人The resuscitation-promoting factors of Mycobacterium tuberculosisare required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro. Mol Microbiol. 67, 672-684 (2008))。如本文中所使用，視上下文而定，「RpfA」可指蛋白質或肽，或編碼RpfA蛋白質或肽之胺基酸序列，或其部分。RpfA在Mtb菌株中具有可變表現。Mtb菌株中之RpfA可為全長或包括僅C端、僅N端及/或缺乏蛋白質之中心部分。在一些實施例中，RpfA係指根據UniProtKB - P9WG31 (RPFA_MYCTU) (SEQ ID NO:5)之胺基酸序列。在一些實施例中，RpfA係指根據SEQ ID NO:5之胺基酸序列的片段。在一些實施例中，RpfA係指根據SEQ ID NO:16之胺基酸序列。在一些實施例中，RpfA係指與根據SEQ ID NO:5之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列，或其片段。在一些實施例中，RpfA係指與根據SEQ ID NO:16之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。

如本文中所使用，視上下文而定，「RpfD」可指蛋白質或肽，或編碼RpfD蛋白質或肽之胺基酸序列，或其部分。在一些實施例中，RpfD係指根據UniProtKB - P9WG27 (RPFD_MYCTU) (SEQ ID NO:6)之胺基酸序列。在一些實施例中，RpfD係指根據SEQ ID NO:6之胺基酸序列的片段。在一些實施例中，RpfD係指根據SEQ ID NO:17之胺基酸序列。在一些實施例中，RpfD係指與根據SEQ ID NO:6之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列，或其片段。在一些實施例中，RpfD係指與根據SEQ ID NO:17之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。

Ra12係指Mtb32A之C端部分，通常包含Mtb32A之最後約132個胺基酸(國際申請公開案第WO2006/117240A2號，其針對與Ra12及Ra35抗原及包含其之融合體相關的教示以引用之方式併入本文中)。Mtb32A為Mtb絲胺酸蛋白酶(Skeiky, YAW等人Cloning, Expression, and Immunological Evaluation of Two Putative Secreted Serine Protease Antigens of Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity 67, 3998-4007 (1999))。一實例為對應於UniProtKB - O07175 (O07175_MYCTU) (SEQ ID NO:7)之Mtb32A序列。如本文中所使用，視上下文而定，「Ra12」可指蛋白質或肽，或編碼Ra12蛋白質或肽之胺基酸序列，或其部分。在一些實施例中，Ra12係指根據SEQ ID NO:23之胺基酸序列。在一些實施例中，Ra12係指根據SEQ ID NO:23之胺基酸序列的片段。在一些實施例中，Ra12係指與根據SEQ ID NO:23之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。

Ra35係指Mtb32A之N端部分(國際申請公開案第WO2006/117240A2號)。如本文中所使用，取決於上下文，「Ra35」可指蛋白質或肽，或編碼Ra35蛋白質或肽之胺基酸序列，或其部分。在一些實施例中，Ra35係指根據SEQ ID NO:25之胺基酸序列。在一些實施例中，Ra35係指根據SEQ ID NO:25之胺基酸序列的片段。在一些實施例中，Ra35係指與根據SEQ ID NO:25之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，Ra35係指根據SEQ ID NO:26之胺基酸序列。在一些實施例中，Ra35係指根據SEQ ID NO:26之胺基酸序列的片段。在一些實施例中，Ra35係指與根據SEQ ID NO:26之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。

TbH9 (亦稱為Mtb39a或PPE18)為蛋白質之分枝桿菌脯胺酸-脯胺酸-麩胺酸(PPE)家族之成員且似乎涉及Mtb之細胞內存活(Bhat, KH等人Role of PPE18 Protein in Intracellular Survival and Pathogenicity of Mycobacterium tuberculosisin Mice. PLoS ONE 7, e52601 (2012))。TbH9 (Mtb39a)與Mtb39b及Mtb39c高度同源，其一起構成Mtb39基因家族。如本文中所使用，取決於上下文，「TbH9」可指蛋白質或肽，或編碼TbH9蛋白質或肽之胺基酸序列，或其部分。在一些實施例中，TbH9係指根據UniProtKB - L7N675 (PPE18_MYCTU) (SEQ ID NO:8)之胺基酸序列。在一些實施例中，TbH9係指根據SEQ ID NO:8之胺基酸序列之片段。在一些實施例中，TbH9係指根據SEQ ID NO:24之胺基酸序列。在一些實施例中，TbH9係指與根據SEQ ID NO:8之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列，或其片段。在一些實施例中，TbH9係指與根據SEQ ID NO:24之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。

Mtb72f為包含結核分枝桿菌蛋白質Mtb32a及TbH9之融合蛋白。Mtb72f係藉由將TbH9與Mtb32a之C末端及N末端部分融合來構築，如下：Mtb32 C末端-Mtb39-Mtb32 N末端。將編碼Mtb32a之約14-kDa C端片段之開放閱讀框架(ORF)依序連接至TbH9之全長ORF，接著為Mtb32a之約20-kDa N端部分。如本文中所使用，視上下文而定，「Mtb72f」可指抗原性融合蛋白或肽，或編碼Mtb72f蛋白或肽之胺基酸序列，或其部分。在一些實施例中，Mtb72f係指根據SEQ ID NO:18之胺基酸序列。在一些實施例中，Mtb72f係指根據SEQ ID NO:18之胺基酸序列之片段。在一些實施例中，Mtb72f係指與根據SEQ ID NO:18之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列，或其片段。

Mtb72f亦可指其中已根據SEQ ID NO:19移除胺基酸位置1處之甲硫胺酸的Mtb72f。在一些實施例中，Mtb72f係指根據SEQ ID NO:19之胺基酸序列的片段。在一些實施例中，Mtb72f係指與根據SEQ ID NO:19之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列，或其片段。

M72為在N端處包括二殘基組胺酸標籤且在胺基酸位置710處包括絲胺酸至丙胺酸取代之Mtb72f的變體。Mtb32a之C端部分及TbH9之全長ORF在其他方面為與在Mtb72f (SEQ ID NO:18)中相同之序列。Mtb32a之N端部分含有S710A取代。如本文中所使用，視上下文而定，「M72」可指抗原性融合蛋白或肽，或編碼M72蛋白或肽之胺基酸序列，或其部分。在一些實施例中，M72係指根據SEQ ID NO:21之胺基酸序列。在一些實施例中，M72係指根據SEQ ID NO:21之胺基酸序列的片段。在一些實施例中，M72係指與根據SEQ ID NO:21之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列，或其片段。

「M72-fusion-2」為在N端處具有3個胺基酸缺失之M72之變體，其中已移除胺基酸位置1處之甲硫胺酸及二殘基組胺酸標籤兩者。在一些實施例中，M72-fusion-2係指根據SEQ ID NO:22之胺基酸序列。在一些實施例中，M72-fusion-2係指根據SEQ ID NO:22之胺基酸序列之片段。在一些實施例中，M72-fusion-2係指與根據SEQ ID NO:22之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列，或其片段。

圖1及圖2展示本文中所描述之融合蛋白之非限制性實例。

在一些實施例中，本揭露內容提供一種融合蛋白，其包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、Ra12、TbH9、Ra35及RpfD或其片段。在一些實施例中，本揭露內容提供Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–Ra12–TbH9–Ra35–RpfD融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:42之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:42之胺基酸序列。

在一些實施例中，本揭露內容提供一種融合蛋白，其包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfA及RpfD或其片段。在一些實施例中，本揭露內容提供Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–RpfA–RpfD融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:9至10中之任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:9之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:10之胺基酸序列。

在一些實施例中，本揭露內容提供一種融合蛋白，其包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfA、RpfD、Ra12、TbH9及Ra35或其片段。除非另外規定，否則個別Mtb抗原可以任何次序存在於融合蛋白中。另外，其可利用或不利用如本文中所描述之連接子以C端至N端至C端方式連接。在一些實施例中，本揭露內容提供Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–RpfA–RpfD–Ra12–TbH9–Ra35融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包含(i)與根據SEQ ID NO:9至10中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；及(ii)與根據SEQ ID NO:18至22中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:27之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:28之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:29之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:30之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:27之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:28之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:29之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:30之胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明提供一種融合蛋白，其包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfA、RpfD及TbH9或其片段。在一些實施例中，本揭露內容提供Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–RpfA–RpfD–TbH9融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包含(i)與根據SEQ ID NO:9至10中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；及(ii)與根據SEQ ID NO:24之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:31之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:32之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:31之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:32之胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明提供一種融合蛋白，其包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfD、Ra12、TbH9及Ra35或其片段。在一些實施例中，本揭露內容提供Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–RpfD–Ra12–TbH9–Ra35融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包含(i)與SEQ ID NO:1及11至12中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；(ii)與SEQ ID NO:2或13之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；(iii)與根據SEQ ID NO:3或14之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；(iv)與根據SEQ ID NO:4或15之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；(v)與根據SEQ ID NO:6或17之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；(vi)與根據SEQ ID NO:23之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；(vii)與根據SEQ ID NO:8或24之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；及(viii)與根據SEQ ID NO:25至26中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:33之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:34之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:35之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:36之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:33之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:34之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:35之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:36之胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明提供一種融合蛋白，其包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfD及TbH9或其片段。在一些實施例中，本揭露內容提供Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–RpfD–TbH9融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包含(i)與根據SEQ ID NO:1及11至12中之任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；(ii)與根據SEQ ID NO:2或13之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；(iii)與根據SEQ ID NO:3或14之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；(iv)與根據SEQ ID NO:4或15之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；(v)與根據SEQ ID NO:6或17之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；及(vi)與根據SEQ ID NO:8或24之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:37之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:38之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:37之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:38之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:42及1至38中之任一者之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。

在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:42之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白由根據SEQ ID NO:42之胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由根據SEQ ID NO:42之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO 27之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:27之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白由根據SEQ ID NO:27之胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由根據SEQ ID NO:27之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:28之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:28之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白由根據SEQ ID NO:28之胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由根據SEQ ID NO:28之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:29之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:29之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白由根據SEQ ID NO:29之胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由根據SEQ ID NO:29之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:30之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:30之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白由根據SEQ ID NO:30之胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由根據SEQ ID NO:30之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:31之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:31之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白由根據SEQ ID NO:31之胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由根據SEQ ID NO:31之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:32之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:32之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白由根據SEQ ID NO:32之胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由根據SEQ ID NO:32之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:33之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:33之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白由根據SEQ ID NO:33之胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由根據SEQ ID NO:33之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:34之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:34之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白由根據SEQ ID NO:34之胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由根據SEQ ID NO:34之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:35之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:35之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白由根據SEQ ID NO:35之胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由根據SEQ ID NO:35之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:36之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:36之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白由根據SEQ ID NO:36之胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由根據SEQ ID NO:36之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:37之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:37之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白由根據SEQ ID NO:37之胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由根據SEQ ID NO:37之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，融合蛋白包含與根據SEQ ID NO:38之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含根據SEQ ID NO:38之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白由根據SEQ ID NO:38之胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由根據SEQ ID NO:38之胺基酸序列組成。

在前述實施例中之任一者中，融合蛋白可進一步包含標籤。在一些實施例中，融合蛋白可進一步包含聚-His標籤。在一些實施例中，聚His標籤包含二至六個His殘基或由其組成。在一些實施例中，poly-His標籤位於融合蛋白之N端處或插入在N端處之起始Met殘基之後。在前述實施例中之任一者中，融合蛋白可進一步包含包括胺基酸序列YPYDVPDYA (SEQ ID NO:40)之人類流感血球凝集素(HA)標籤。在一些實施例中，HA標籤位於融合蛋白之C端處。在一些實施例中，融合蛋白可與標籤或其他顯影劑(諸如生物素、螢光部分、放射性部分或其他肽標籤)結合。

個別Mtb抗原可以不具有任何連接子之C端至N端或N端至C端方式連接在一起。或者，連接子可存在於本文所揭露之融合蛋白中任一者內之任何二個Mtb抗原之間。在一些實施例中，融合蛋白可進一步包含一或多個連接Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfA、RpfD、Ra12、TbH9及Ra35中之一或多者的連接子。舉例而言，連接子可包含以下或由以下組成：在二個Mtb抗原之連接點處包括的一或多個胺基酸殘基。在一些實施例中，連接子係由任擇地含有一或多個限制位點之DNA區段編碼，其中該DNA區段插入在編碼本文所揭露之融合蛋白中任一者之二個Mtb抗原之核酸分子之間。在一些實施例中，限制位點包含EcoRI限制位點或EcoRV限制位點。在一些實施例中，融合蛋白包含Ra12與TbH9之間的連接子，從而產生EcoRI限制位點。在一些實施例中，融合蛋白包含TbH9與Ra35之間的連接子，從而產生EcoRV限制位點。

在一些態樣中，本揭露內容提供一種編碼本文所揭露之融合蛋白中之任一者的核酸分子。

在一些實施例中，融合蛋白係由包含與根據SEQ ID NO: 41之核酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之序列的核酸編碼。在一些實施例中，融合蛋白由藉由根據SEQ ID NO: 41之核酸序列編碼的胺基酸序列組成。在一些實施例中，融合蛋白基本上由藉由根據SEQ ID NO: 41之核酸序列編碼的胺基酸序列組成。 III. 載體

在一些實施例中，本揭露內容提供編碼如上文所描述之融合蛋白的載體。

載體可為此項技術中已知之任何表現載體。對於待表現之抗原，融合蛋白之蛋白質編碼序列應「可操作地連接」至引導蛋白質之轉錄及轉譯的調節或核酸控制序列。當編碼序列及核酸控制序列或啟動子以使得編碼序列在核酸控制序列之影響或控制下表現或轉錄及/或轉譯的方式共價連接時，其稱為「可操作地連接」。「核酸控制序列」可為任何核酸元件，諸如(但不限於)啟動子、強化子、IRES、內含子及本文所描述之引導與其可操作地連接之核酸序列或編碼序列之表現的其他元件。術語「啟動子」係指一組轉錄控制模組，其在RNA聚合酶II之起始位點周圍叢集且當操作地連接至本揭露內容之蛋白質編碼序列時引起所編碼蛋白質之表現。本揭露內容之異源抗原及融合蛋白之表現可處於組成性啟動子或誘導性啟動子之控制下，其僅在暴露於一些特定外部刺激，諸如(但不限於)抗生素(諸如四環素)、激素(諸如蛻皮激素)或重金屬時起始轉錄。啟動子亦可對特定細胞類型、組織或器官具有特異性。許多適合啟動子及強化子為此項技術中已知的，且任何此類適合啟動子或強化子可用於本揭露內容之轉基因之表現。舉例而言，適合的啟動子及/或強化子可選自真核啟動子資料庫(Eukaryotic Promoter Database；EPDB)。

在一些實施例中，編碼融合蛋白之載體為質體、黏質體、噬菌體、細菌載體或病毒載體。在一些實施例中，載體為病毒載體，諸如痘病毒、腺病毒、風疹、仙台病毒、棒狀病毒、α病毒、疱疹病毒、慢病毒、反轉錄病毒或腺相關病毒。在一些實施例中，編碼融合蛋白之載體為細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome；BAC)。在一些實施例中，編碼融合蛋白之載體為CMV載體，例如RhCMV或HCMV載體。在一些實施例中，編碼融合蛋白之載體為包含TR3主鏈之重組HCMV載體。

在一些實施例中，重組CMV載體為或衍生自HCMV TR3。如本文中所提及，「HCMV TR3」或「TR3」係指衍生自臨床分離株HCMV TR之HCMV-TR3載體主鏈，如Caposio, P等人(Characterization of a live attenuated HCMV-based vaccine platform. Scientific Reports 9, 19236 (2019))中所描述。

如本文所描述，重組CMV載體之特徵可在於存在或不存在一或多個CMV基因。CMV載體之特徵亦可在於存在或不存在由一或多個CMV基因編碼之一或多種蛋白質。由於編碼CMV基因之核酸序列中存在突變，所以由CMV基因編碼之蛋白質可不存在。在一些實施例中，載體可包括CMV基因之異種同源物或同源物。CMV基因之實例包括但不限於UL82、UL128、UL130、UL146、UL147、UL18及UL78。

人類巨細胞病毒UL82基因編碼pp71，其為位於病毒顆粒之被膜域中之蛋白質。舉例而言，CMV TR株之UL82基因為GenBank寄存編號KF021605.1之118811至120490。

pp71可執行一或多個功能，包括抑制病毒基因轉錄之Daxx抑制、負調節STING及避免細胞抗病毒反應(Kalejta RF等人, Expanding the Known Functional Repertoire of the Human Cytomegalovirus pp71 Protein. Front Cell Infect Microbiol. 2020年3月12日;10:95)。UL82之缺失或藉由在UL82基因座處插入外源基因破壞UL82導致不存在pp71蛋白質，且因此減少纖維母細胞、內皮細胞、上皮細胞及星形膠質細胞之複製(Caposio P等人, Characterization of a live-attenuated HCMV-based vaccine platform. Sci Rep. 2019年12月17日;9(1):19236)。UL82缺失或破壞之作用可藉由細胞激酶抑制劑逆轉。恆河猴巨細胞病毒(RhCMV)基因RhCMV 110與人類CMV UL82同源(Hansen SG等人, Complete sequence and genomic analysis of rhesus cytomegalovirus. J Virol. 2003年6月;77(12):6620-36)。

人類巨細胞病毒基因UL128及UL130編碼病毒套膜之結構性組分(Patrone, M等人，Human cytomegalovirus UL130 protein promotes endothelial cell infection through a producer cell modification of the virion. J Virol. 79(13):8361-73 (2005)；Ryckman, BJ等人，Characterization of the human cytomegalovirus gH/gL/UL128-131 complex that mediates entry into epithelial and endothelial cells. J Virol. 82(1):60-70 (2008)；Wang, D等人，Human cytomegalovirus virion protein complex required for epithelial and endothelial cell tropism. Proc Natl Acad Sci U S A. 102(50):18153-8 (2005))。舉例而言，CMV TR株之UL128基因為GenBank寄存編號KF021605.1之176206至176964且CMV TR株之UL130基因為GenBank寄存編號KF021605.1之177004至177648。

人類巨細胞病毒基因UL146及UL147分別編碼CXC趨化介素vCXC-1及vCXC-2 (Penfold, ME等人，Cytomegalovirus encodes a potent alpha chemokine. Proc Natl Acad Sci U S A. 96(17):9839-44 (1999))。舉例而言，CMV TR株之UL146基因為GenBank寄存編號KF021605.1之180954至181307且CMV TR株之UL147基因為GenBank寄存編號KF021605.1之180410至180889。

人類巨細胞病毒UL18基因編碼與β2-微球蛋白締合且可結合內源性肽之I型膜醣蛋白(Park, B等人，Human cytomegalovirus inhibits tapasin-dependent peptide loading and optimization of the MHC class I peptide cargo for immune evasion. Immunity. 20(1):71-85 (2004)；Browne, H等人，A complex between the MHC class I homologue encoded by human cytomegalovirus and beta 2 microglobulin. Nature. 347(6295):770-2 (1990)；Fahnestock, ML等人，The MHC class I homolog encoded by human cytomegalovirus binds endogenous peptides. Immunity. 3(5):583-90 (1995))。舉例而言，CMV TR株之UL18基因為GenBank寄存編號KF021605.1之24005至25111。

人類巨細胞病毒UL78基因編碼假定G蛋白偶聯受體(Chee, MS等人，Analysis of the protein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD169. Curr Top Microbiol Immunol. 1154:125-69 (1990))且亦可在病毒複製中具有作用(Michel, D等人，The human cytomegalovirus UL78 gene is highly conserved among clinical isolates, but is dispensable for replication in fibroblasts and a renal artery organ-culture system. J Gen Virol. 86(Pt 2):297-306 (2005))。舉例而言，CMV TR株之UL78基因為GenBank寄存編號KF021605.1之114247至115542。

在一些實施例中，重組CMV載體表現UL128或UL130，或其異種同源物。在一些實施例中，重組CMV載體表現UL146及UL147，或其異種同源物。在一些實施例中，重組CMV載體表現UL128、UL130、UL146及UL147。

在一些實施例中，由於編碼UL128及UL130或其異種同源物之核酸序列中存在突變，所以重組CMV載體(例如，重組HCMV載體或包含TR3主鏈之重組HCMV載體)不表現UL128或UL130，或其異種同源物。在一些實施例中，由於編碼UL146、UL147、UL18、UL78或UL82或其異種同源物之核酸序列中存在突變，所以CMV載體針對UL146、UL147、UL18、UL78及UL82及其異種同源物中之一或多者具有缺陷。在一些實施例中，由於編碼US11或其異種同源物之核酸序列中存在突變，所以CMV載體針對US11及其異種同源物具有缺陷。在前述實施例中，一或多個突變可為導致缺乏活性蛋白質之表現的任何突變。此類突變包括例如點突變、框移突變、並非編碼蛋白質之全部序列缺失(截短突變)或編碼蛋白質之全部核酸序列缺失。在一些實施例中，重組CMV載體(例如，重組HCMV載體或包含TR3主鏈之重組HCMV載體)表現UL40及US28，或其異種同源物。

在一些實施例中，由於編碼UL78、UL128及UL130或其異種同源物之核酸序列中存在突變，所以重組CMV載體(例如，重組HCMV載體或包含TR3主鏈之重組HCMV載體)不表現UL78、UL128或UL130，或其異種同源物。在一些其他實施例中，如本文所揭露之編碼融合蛋白之核酸分子置換UL78。在一些其他實施例中，融合蛋白可操作地連接至UL78啟動子且由其表現。

在一些實施例中，由於編碼UL78、UL128及UL130或其異種同源物之核酸序列中存在突變，所以重組CMV載體(例如，重組HCMV載體或包含TR3主鏈之重組HCMV載體)不表現UL78、UL128或UL130，或其異種同源物。在一些其他實施例中中，重組CMV載體表現UL18、UL82、UL146及UL147，或其異種同源物。在一些其他實施例中，如本文所揭露之編碼融合蛋白之核酸分子置換UL78。在一些其他實施例中，融合蛋白可操作地連接至UL78啟動子且由其表現。

在一些實施例中，由於編碼UL82、UL128及UL130或其異種同源物之核酸序列中存在突變，所以重組CMV載體(例如，重組HCMV載體或包含TR3主鏈之重組HCMV載體)不表現UL82、UL128或UL130，或其異種同源物。在一些其他實施例中，本文所揭露之編碼融合蛋白之核酸分子置換UL82。在一些其他實施例中，融合蛋白可操作地連接至UL82啟動子且由其表現。

用於製造具有所要疫苗特性之HCMV載體的挑戰為載體通常經設計以具有減少之病毒複製或生長。舉例而言，一些活性減毒HCMV-HIV疫苗載體經工程改造以藉由HCMV基因UL82 (其編碼外被蛋白pp71)之缺失而具有生長缺陷，從而導致病毒產量較低。pp71對於野生型HCMV感染至關重要，因為此被膜蛋白質易位至細胞核，在此情況下其抑制細胞Daxx功能，因此允許觸發複製週期之CMV立即早期(IE)基因表現。一些製造製程依賴於使用靶向Daxx之siRNA短暫轉染MRC-5細胞的功能互補，該siRNA模擬HCMV pp71之功能中之一者。另一方法為使用編碼pp71之mRNA轉染，以使得宿主細胞能夠表現必需病毒基因。用於表現必需病毒基因之mRNA之轉染可能夠提供基因之所有功能，該等功能可能增強感染過程，諸如細胞週期刺激、有效病毒粒子包裝及病毒穩定性。另外，存在感染晚期之蛋白質有可能包裝於後代病毒中，其可藉由更高效的第一輪感染及持續感染之建立而降低疫苗之所需劑量。因此，在一些實施例中，本揭露內容提供一種製造重組CMV病毒載體之方法，其包含：(a)將編碼pp71蛋白質之mRNA引入細胞中；(b)用重組CMV感染該細胞；(c)培育該細胞；及(d)收集該重組CMV病毒載體。在一些實施例中，使用轉染將編碼pp71蛋白質之核酸遞送至細胞。在一些實施例中，細胞為MRC-5細胞。在一些實施例中，重組CMV為如本文所描述之重組HCMV (例如，衍生自TR3主鏈之重組HCMV載體)。在一些實施例中，重組CMV及重組CMV病毒載體包含編碼異源病原體特異性抗原(諸如，如本文所描述之Mtb抗原)之核酸。藉由此方法製成之CMV病毒載體亦在本揭露內容之範疇內。

在一些實施例中，重組CMV載體(例如，重組HCMV載體或包含TR3主鏈之重組HCMV載體)包含編碼微小RNA (miRNA)識別元件(MRE)之核酸序列。在一些實施例中，HCMV載體包含編碼MRE之核酸序列，該MRE含有內皮細胞中表現之微小RNA之目標位點。內皮細胞中表現之miRNA之實例為miR126、miR-126-3p、miR-130a、miR-210、miR-221/222、miR-378、miR-296及miR-328。在一些實施例中，重組CMV載體(例如，重組HCMV載體或包含TR3主鏈之重組HCMV載體)包含編碼MRE之核酸序列，該MRE含有骨髓細胞中表現之微小RNA之目標位點。骨髓細胞中表現之miRNA之實例為miR-142-3p、miR-223、miR-27a、miR-652、miR-155、miR-146a、miR-132、miR-21、miR-124及miR-125。

本文所揭露之載體中可包括之MRE可為識別在存在由內皮細胞表現之miRNA或由骨髓細胞表現之miRNA之情況下使表現沉默的任何元件。此類MRE可為miRNA之精確互補序列。替代地，其他序列可用作給定miRNA之MRE。舉例而言，可使用公開可用之資料庫自序列預測MRE。在一個實例中，可在網站microRNA.org (www.microrna.org)上檢索miRNA。繼而，將列舉miRNA之mRNA目標之清單。對於頁面上之各所列目標，可訪問『比對細節』且訪問假定的MRE。一般熟習此項技術者可自文獻選擇驗證、假定或突變的MRE序列，該文獻將預測在骨髓細胞(諸如巨噬細胞)中表現之miRNA的存在下誘導沉默。一個實例涉及上文提及之網站。一般熟習此項技術者可隨後獲得表現構築體，藉以報導基因(諸如螢光蛋白、酶或其他報導基因)具有由啟動子(諸如組成性活性啟動子或細胞特異性啟動子)驅動之表現。可隨後將MRE序列引入表現構築體中。可將表現構築體轉染至適當細胞中，且細胞用感興趣的miRNA轉染。缺乏報導基因之表現指示MRE在miRNA之存在下使基因表現沉默。

在一些實施例中，CMV載體包含不編碼任何MRE之核酸序列。

在一些實施例中，本文描述之CMV載體含有可防止宿主間擴散之突變，藉此使得病毒不能感染免疫功能不全的個體或由於CMV感染而面對併發症的其他個體。本文所描述之CMV載體亦可含有使得呈遞免疫顯性及非免疫顯性抗原決定基以及非典型MHC限制的突變。然而，在一些實施例中，本文所描述之CMV載體中之突變不影響載體再感染先前已經感染CMV之個體的能力。此類CMV突變描述於例如美國專利申請公開案第US2013/0136768A1號、第US2013/0142823A1號；第US2014/0141038A1號；及國際申請公開案第WO2014/138209A1號中，針對與此等突變相關之教示，該等公開案以引用之方式併入本文中。

本文所揭露之CMV載體可藉由將包含編碼Mtb抗原(例如，如本文所揭露之融合蛋白)之序列的DNA插入CMV基因體之必需或非必需區域中製備。該方法可進一步包含使CMV基因體之一或多個區缺失。該方法可包含活體內重組。因此，該方法可包含在細胞相容的培養基中在存在包含由與CMV基因體之部分同源的DNA序列側接之異源DNA的供體DNA的情況下用CMV DNA轉染細胞，藉此將異源DNA引入CMV之基因體中，且接著任擇地回收藉由活體內重組所修飾之CMV。該本方法亦可包含分裂CMV DNA以獲得經分裂之CMV DNA，將異源DNA接合至經分裂之CMV DNA以獲得雜合的CMV-異源DNA，用該雜合的CMV-異源DNA轉染細胞，及接著任擇地回收藉由異源DNA之呈遞而修飾之CMV。由於包括活體內重組，因此該方法亦提供一種包含並非天然存在於編碼對於CMV為外源之多肽的CMV中之供體DNA的質體，該供體DNA係在將以其他方式與CMV基因體之必需或非必需區域共線的CMV DNA區段內，使得來自CMV之必需或非必需區域之DNA側接供體DNA。異源DNA可插入至CMV中以在任何位向產生重組CMV，必要時產生該DNA及其表現之穩定整合。

重組CMV載體中編碼Mtb抗原(例如，如本文所揭露之融合蛋白)的DNA亦可包括啟動子。啟動子可來自任何來源，諸如疱疹病毒，包括內源性巨細胞病毒(CMV)啟動子，諸如人類CMV (HCMV)、恆河猴CMV (RhCMV)、小鼠或其他CMV啟動子。啟動子亦可為非病毒啟動子，諸如EF1α啟動子。啟動子可為截短轉錄活性啟動子，其包含用由病毒提供之反式激活蛋白反式激活的區域及衍生截短轉錄活性啟動子之全長啟動子的最小啟動子區域。啟動子可由對應於最小啟動子之DNA序列與上游調節序列之締合構成。最小啟動子係由CAP位點加ATA盒(用於基礎轉錄位準；不受調控轉錄位準之最小序列)構成；「上游調節序列」係由一或多個上游元件及一或多個強化子序列構成。此外，術語「截短」指示全長啟動子不完全存在，亦即全長啟動子之一些部分已經移除。截短啟動子可衍生自疱疹病毒，諸如MCMV或HCMV，例如，HCMV-IE或MCMV-IE。基於鹼基對，來自全長啟動子之大小可存在高達40%且甚至高達90%的減小。啟動子亦可為經修飾之非病毒啟動子。關於HCMV啟動子，參考美國專利第5,168,062號及第5,385,839號。關於用質體DNA轉染細胞以用於自其表現，參考Felgner, JH等人(Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. J Biol. Chem. 269, 2550-2561 (1994))。關於質體DNA之直接注入作為針對各種感染性疾病之疫苗接種的簡單且有效的方法，參考Ulmer, JB等人(Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science 259, 1745-1749 (1993))。因此在本揭露內容之範疇內，載體可藉由載體DNA之直接注入而使用。亦揭露一種可插入至包含截短轉錄活性啟動子之重組病毒或質體中的表現卡匣。表現卡匣可進一步包括功能性截短之聚腺苷酸化信號；例如截短但具有功能性之SV40聚腺苷酸化信號。截短之聚腺苷酸化信號解決諸如CMV之重組病毒的插入大小限制問題。表現卡匣亦可包括相對於插入其之病毒或系統異源的DNA；且該DNA可為如本文所描述之異源DNA。

應注意，包含編碼融合蛋白之序列的DNA可本身包括用於驅動CMV載體中之表現的啟動子或DNA可限於融合蛋白之編碼DNA。此構築體可以相對於內源性CMV啟動子之此類位向置放，使其可操作地連接至啟動子及藉此進行表現。此外，可完成編碼融合蛋白之DNA的多次複製或使用強或早期啟動子或早期及晚期啟動子或其任何組合以便擴增或增加表現。因此，編碼融合蛋白之DNA可相對於CMV內源啟動子適合地定位，或彼等啟動子可易位以與編碼融合蛋白之DNA一起插入另一位置處。編碼超過一種融合蛋白之核酸，或融合蛋白及另一抗原可封裝於CMV載體中。

在一些實施例中，本揭露內容提供一種重組HCMV載體，其包含與根據SEQ ID NO: 44之核酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，重組HCMV載體包含根據SEQ ID NO: 44之核酸序列。在一些實施例中，重組HCMV載體由根據SEQ ID NO: 44之核酸序列組成。 IV. 醫藥組成物

在一些實施例中，本揭露內容提供一種醫藥組成物(例如，免疫原性或疫苗組成物)，其包含如本文所描述之融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。在一些實施例中，本揭露內容亦提供一種醫藥組成物(例如，免疫原性或疫苗組成物)，其包含編碼如本文所描述之融合蛋白的載體(例如，本文所揭露之重組CMV載體)。含有重組CMV病毒或載體(或其表現產物)之免疫原性或疫苗組成物引發免疫反應(局部或全身性)。該反應可能但不必具有保護性。換言之，免疫原性或疫苗組成物引發局部或全身性保護或治療反應。

此類醫藥組成物可根據熟習醫藥技術之彼等者所熟知的標準技術來製備。此類組成物可以劑量且藉由熟習醫療技術者所熟知的技術考量諸如特定患者之品種或物種、年齡、性別、體重及病狀及投予途徑的因素來投予。組成物可單獨投予，或可與其他蛋白質或肽、與其他載體(例如，其他CMV載體)、或與其他免疫、抗原或或治療性組成物共投予或依序投予。此類其他組成物可包括純化天然抗原或抗原決定基或來自重組CMV或另一載體系統表現之抗原或抗原決定基。

如本文所揭露之醫藥組成物可調配以便用於此項技術中已知之任何投予程序中。此類醫藥組成物可經由非經腸途徑(皮內、腹膜內、肌內、皮下、靜脈內或其他)。投予亦可經由黏膜途徑，例如經口、經鼻、經生殖器等。

組成物之實例包括用於孔口(例如，口腔、鼻、肛門、生殖器(例如陰道)等)投予之液體製劑，諸如懸浮液、糖漿劑或酏劑；及用於非經腸、皮下、腹膜內、皮內、肌內或靜脈內投予(例如，可注射投予)之製劑，諸如無菌懸浮液或乳液。在此類組成物中，重組可與適合之載劑、稀釋劑或賦形劑(諸如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、海藻糖或類似者)混合。

本文所揭露之醫藥組成物典型地可包含或含有佐劑及一定量的抗原(例如，融合蛋白)或編碼抗原之載體以引發所需反應。在人類應用中，明礬(磷酸鋁或氫氧化鋁)為典型的佐劑。用於研究及獸醫學應用中之皂素及其純化組分Quil A、弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)及其他佐劑具有限制其在人類疫苗中之潛在用途的毒性。亦可使用化學成分確定的製劑，諸如胞壁醯二肽、單磷醯基脂質A、磷脂共軛物(諸如由Goodman-Snitkoff, G等人(Role of intrastructural/intermolecular help in immunization with peptide-phospholipid complexes. J Immunol. 147, 410-415 (1991))描述之彼等者)、如Miller, MD等人(Vaccination of rhesus monkeys with synthetic peptide in a fusogenic proteoliposome elicits simian immunodeficiency virus-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes. J Exp. Med. 176, 1739-1744 (1992))所描述之蛋白脂質體內之蛋白質封裝，及諸如Novasome脂質囊泡(Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, N.H.)的脂質囊泡中之蛋白質封裝。

組成物可封裝於單一劑型中以用於藉由非經腸(例如，肌內、皮內或皮下)投予或孔口投予(例如，經舌(例如經口)、胃內)、經黏膜(包括口內、肛門內、陰道內及類似者)投予進行免疫接種。藉由組成物之性質、藉由表現產物之性質、在直接使用載體時藉由表現量及藉由已知因素(諸如個體之品種或物種、年齡、性別、體重、病狀及性質)以及LD50及已知且不需要過度實驗之其他篩選程序測定有效劑量及投予途徑。所表現之產物的劑量可在幾微克至幾百微克範圍內，例如5至500 μg。抗原或編碼抗原之載體可以任何適合之量投予以達成此等劑量位準下之表現。在非限制性實例中：編碼本文所揭露之融合蛋白的CMV載體可以至少10 ₂pfu；或在約10 ₂pfu至約10 ₇pfu範圍內之量投與。其他適合之載劑或稀釋劑可為水或緩衝鹽水，含或不含防腐劑。組成物可凍乾以在投予時再懸浮或可呈溶液形式。 V. 治療方法及其他用途

本文所揭露之融合蛋白及載體(諸如重組CMV載體)可用於誘導個體之免疫學或免疫反應的方法中，該等方法包含向該個體投予包含融合蛋白、載體或重組CMV病毒或載體及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑的組成物。

如本文中所使用，術語「個體」係指活性多細胞脊椎動物生物體，一種包括人類及非人類哺乳動物兩者的類別。個體可為動物，諸如哺乳動物，包括可感染有結核分枝桿菌之任何哺乳動物，例如靈長類(諸如人類，非人類靈長類，例如猴或黑猩猩)或視為肺結核感染之可接受臨床模型的動物。

在一些實施例中，個體為人類。在其他實施例中，個體為18歲或更大年齡之成人。在另外其他實施例中，個體為13至17歲之青少年。

在一些實施例中，個體駐存於肺結核不為地方流行性之地理位置。在一些實施例中，個體駐存於肺結核為地方流行性之地理位置(例如，South Africa)。如本文中所使用，「地方流行性」用於描述一直存在於某些地理區域或某些人群中之疾病。

在一些實施例中，個體經測試針對CMV呈陽性。在一些實施例中，患者經測試針對CMV呈陰性。CMV測試係指測定尿液、唾液、血液、痰或其他體液中存在病毒之分析。CMV測試之非限制性實例包括聚合酶鏈反應(PCR)，例如CMV-唾液PCR測試。

在一些實施例中，個體具有來自干擾素-γ釋放分析(IGRA)之陽性結果。在一些實施例中，個體具有來自干擾素-γ釋放分析之陰性結果。干擾素-γ釋放分析用於診斷肺結核。T淋巴球將在暴露於特異性結核分枝桿菌抗原後釋放干擾素-γ，從而指示先前暴露於所測試之結核分枝桿菌抗原。

在一些實施例中，個體經測試針對CMV呈陽性且具有來自干擾素-γ釋放分析之陽性結果。在一些實施例中，個體經測試針對CMV呈陰性且具有來自干擾素-γ釋放分析之陰性結果。在一些實施例中，個體經測試針對CMV呈陰性且具有來自干擾素-γ釋放分析之陽性結果。在一些實施例中，個體經測試針對CMV呈陽性且具有來自干擾素-γ釋放分析之陰性結果。在其他實施例中，個體先前已投予卡介苗(bacille Calmette-Guérin vaccine；BCG)。在又其他實施例中，個體經測試針對CMV呈陽性，具有來自干擾素-γ釋放分析之陰性結果，且另外先前已投予卡介苗(BCG)。

在一些實施例中，個體為HIV陽性。在其他實施例中，個體為HIV陽性且當前正進行抗逆轉錄病毒療法(ART)。

如本文中所使用，術語「治療」係指改善疾病或病理病狀之病徵或症狀的干預。如本文所使用，關於疾病、病理病狀或症狀之術語「治療(treatment/treat/treating)」亦指任何可觀察的有益治療效果。可例如藉由易感個體之疾病之臨床症狀之發作延遲、疾病之一些或所有臨床症狀之嚴重程度降低、疾病之進展較慢、疾病之復發次數減少、個體之整體健康或幸福改善或藉由特定疾病所特有之此項技術中所熟知之其他參數證明有益效果。防治性治療為出於降低出現病變之風險之目的，向未展示疾病之病徵或僅展示早期病徵之個體投予的治療。治療性治療為在已罹患疾病之病徵及症狀之後向個體投予之治療。

如本文所使用，術語「預防(preventing/prevention)」係指未能罹患疾病、病症或病狀，或與此類疾病、病症或病狀相關之病徵或症狀之發展降低(例如，臨床上相關的量)，或展現延遲病徵或延遲症狀(例如，數天、數週、數月或數年)。預防可需要投予超過一次劑量。

如本文中所使用，術語「有效量」係指足以產生所需反應，諸如減少或消除病狀或疾病之病徵或症狀，或誘導針對抗原之免疫反應的藥劑之量(例如，融合蛋白或編碼融合蛋白之載體)。在一些實例中，「有效量」係治療(包括防治)病症或疾病中之任一者之一或多種症狀及/或潛在病因的量。有效量可為治療有效量，包括預防特定疾病或病狀之一或多種病徵或症狀(諸如與感染性疾病或癌症相關之一或多種病徵或症狀)產生的量。

所揭露之融合蛋白或載體可活體內投予，例如其中之目的係產生免疫原性反應，包括CD4+ T細胞/免疫及/或CD8+ T細胞/免疫。舉例而言，在一些實例中，可能需要在實驗室動物(諸如恆河猴)中使用所揭露之融合蛋白或載體以對使用RhCMV之免疫原性組成物及疫苗進行臨床前測試。在其他實例中，將需要在人類個體中，諸如在臨床試驗及使用HCMV之免疫原性組成物的實際臨床用途中使用融合蛋白或載體。

對於此類活體內應用，所揭露之融合蛋白或載體可作為進一步包含醫藥學上可接受之載劑之免疫原性或醫藥組成物之組分投予。在一些實施例中，本揭露內容之免疫原性組成物適用於刺激針對融合蛋白之免疫反應，且可用作防治性或治療性疫苗之一或多種組分。本揭露內容之核酸及載體特別適用於提供遺傳性疫苗，亦即，用於向個體(諸如人類)遞送本揭露內容之編碼抗原之核酸的疫苗，使得抗原隨後在個體中表現以引發免疫反應。

動物(包括人類)之免疫接種排程(或方案)已熟知且可針對特定個體及免疫性組成物容易地確定。因此，免疫原可向個體投予一或多次。較佳地，在免疫原性組成物之分開投予之間存在設定的時間間隔。雖然此間隔因每個個體而不同，但其通常在10天至數週範圍內，且常常為2週、4週、6週或8週。對於人類，間隔通常為2至6週。在本揭露內容之尤其有利的實施例中，間隔為更長時間，有利地為約10週、12週、14週、16週、18週、20週、22週、24週、26週、28週、30週、32週、34週、36週、38週、40週、42週、44週、46週、48週、50週、52週、54週、56週、58週、60週、62週、64週、66週、68週或70週。免疫接種方案通常具有免疫原性組成物之1至6次投予，但可具有少至一次或二次或四次。誘導免疫反應之方法亦可包括投予佐劑及免疫原。在一些情況下，每年、每兩年或其他長間隔(5至10年)加強免疫接種可補充初始免疫接種方案。本發明方法亦包括多種初免-加強方案。在此等方法中，一或多次初始免疫接種之後為一或多次加強免疫接種。每次免疫接種之實際免疫原性組成物可相同或不同，且免疫原性組成物(例如，含有蛋白質或表現載體)之類型、途徑及免疫原之調配物亦可不同。舉例而言，若表現載體用於初免及加強步驟，則其可具有相同或不同類型(例如，DNA或細菌或病毒表現載體)。一種適用的初免-加強方案提供二次初始免疫接種，四週間隔，接著為在最後一次初始免疫接種之後4及8週的二次加強免疫接種。熟習此項技術者亦應顯而易見，使用本揭露內容之DNA、細菌及病毒表現載體涵蓋若干排列及組合以提供初始及加強方案。CMV載體可重複使用，同時表現衍生自不同病原體之不同抗原。

因此，在一些實施例中，本揭露內容提供一種產生個體之免疫反應的方法，其包含向該個體投予前述融合蛋白、核酸、載體或組成物中之任一者。本文中亦提供前述融合蛋白、核酸、載體或組成物中之任一者的用途，其用於製造用於產生個體之免疫反應的藥劑。

在一些實施例中，本揭露內容提供一種治療或預防個體之肺結核的方法，其包含向該個體投予本文所描述之融合蛋白、核酸、載體或組成物。在一些實施例中，本文所描述之融合蛋白、核酸、載體或組成物用於製造用於治療或預防個體之結核病的藥劑。在一些實施例中，肺結核為潛伏性結核病感染。在一些實施例中，本揭露內容提供一種預防個體之結核疾病的方法。在其他實施例中，個體具有來自干擾素-γ釋放分析之陽性結果。在一些實施例中，本揭露內容提供一種預防結核分枝桿菌感染之方法。在其他實施例中，個體具有來自干擾素-γ釋放分析之陰性結果。

在一些實施例中，本揭露內容提供一種預防個體之結核病及/或結核分枝桿菌感染復發的方法。在其他實施例中，在結核病之先前治療之後進行復發之預防。

在一些實施例中，本文所揭露之融合蛋白及載體(諸如重組CMV載體)在第二結核病治療之前、與其同時或在其之後投予。在一些實施例中，本文所揭露之融合蛋白及載體輔助第二治療。在一些實施例中，接受輔助治療之個體感染有耐藥性結核分枝桿菌。

在一些實施例中，本揭露內容提供一種預防個體之肺結核的方法。

在前述方法、用途或供使用之組成物中的一些中，載體為CMV載體，且CMV載體係以有效引發針對Mtb抗原之CD4+ T細胞反應之量投予。在一些實施例中，至少10%的由重組HCMV載體引發之CD4+ T細胞受MHC-II或其異種同源物限制。在一些其他實施例中，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的由重組HCMV載體引發之CD4+ T細胞受MHC-II或其異種同源物限制。

在前述方法、用途或供使用之組成物中的一些中，載體為CMV載體，且CMV載體係以有效引發針對Mtb抗原之CD8+ T細胞反應之量投予。在一些實施例中，至少10%的由HCMV載體引發之CD8+ T細胞受MHC-Ia或其異種同源物限制。在一些其他實施例中，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的由HCMV載體引發之CD8+ T細胞受MHC-Ia或其異種同源物限制。

在一些其他態樣中，本揭露內容提供一種產生識別MHC-II/肽複合物之CD4+ T細胞的方法，其係藉由投予編碼本文所描述之融合蛋白之CMV載體。在一些實施例中，該方法包含： (a)以有效產生一組識別MHC-II/肽複合物之CD4+ T細胞的量向第一個體投予本文所描述之CMV載體； (b)鑑別來自該組CD4+ T細胞之第一CD4+ TCR，其中第一CD4+ TCR識別MHC-II/融合蛋白衍生之肽複合物； (c)自第二個體分離一或多個CD4+ T細胞；及 (d)用表現載體轉染自第二個體分離之一或多個CD4+ T細胞，其中表現載體包含編碼第二CD4+ TCR之核酸序列及可操作地連接至編碼第二CD4+ TCR之核酸序列的啟動子，其中第二CD4+ TCR包含第一CD4+ TCR之CDR3α及CDR3β，藉此產生識別MHC-II/肽複合物之一或多個CD4+ T細胞。

在一些實施例中，該方法包含： (a) 鑑別來自一組CD4+ T細胞之第一CD4+ TCR，其中該組CD4+ T細胞係自已投予本文所描述之CMV載體之個體分離，且其中第一CD4+ TCR識別MHC-II/融合蛋白衍生之肽複合物； (b)自第二個體分離一或多個CD4+ T細胞；及 (c)用表現載體轉染自第二個體分離之一或多個CD4+ T細胞，其中表現載體包含編碼第二CD4+ TCR之核酸序列及可操作地連接至編碼第二CD4+ TCR之核酸序列的啟動子，其中第二CD4+ TCR包含第一CD4+ TCR之CDR3α及CDR3β，藉此產生識別MHC-II/肽複合物之一或多個TCR-轉殖基因CD4+ T細胞。

在一些其他態樣中，本揭露內容提供一種產生識別MHC-Ia/肽複合物之CD8+ T細胞的方法，其係藉由投予編碼本文所描述之融合蛋白的CMV載體。在一些實施例中，該方法包含： (a)以有效產生一組識別MHC-Ia/肽複合物之CD8+ T細胞的量向第一個體投予本文所揭露之CMV載體； (b)鑑別來自該組CD8+ T細胞之第一CD8+ TCR，其中第一CD8+ TCR識別MHC-Ia/融合蛋白衍生之肽複合物； (c)自第二個體分離一或多個CD8+ T細胞；以及 (d)用表現載體轉染自第二個體分離之一或多個CD8+ T細胞，其中表現載體包含編碼第二CD8+ TCR之核酸序列及可操作地連接至編碼第二CD8+ TCR之核酸序列的啟動子，其中第二CD8+ TCR包含第一CD8+ TCR之CDR3α及CDR3β，藉此產生識別MHC-Ia/肽複合物之一或多個CD8+ T細胞。

在一些實施例中，該方法包含： (a) 鑑別來自一組CD8+ T細胞之第一CD8+ TCR，其中該組CD8+ T細胞係自已投予本文所揭露之CMV載體之個體分離，且其中第一CD8+TCR識別MHC-Ia融合蛋白衍生之肽複合物； (b)自第二個體分離一或多個CD8+ T細胞；以及 (c)用表現載體轉染自第二個體分離之一或多個CD8+ T細胞，其中表現載體包含編碼第二CD8+ TCR之核酸序列及可操作地連接至編碼第二CD8+ TCR之核酸序列的啟動子，其中第二CD8+ TCR包含第一CD8+ TCR之CDR3α及CDR3β，藉此產生識別MHC-Ia/肽複合物之一或多個TCR-轉殖基因CD8+ T細胞。

在產生T細胞之方法之一些實施例中，其中第一CD4+ TCR或第一CD8+ TCR係藉由DNA或RNA定序鑑別。在一些實施例中，其中編碼第二CD4+ TCR之核酸序列或編碼第二CD4+ TCR之核酸序列與編碼第一CD4+ TCR或第一CD8+ TCR之核酸序列相同。在一些實施例中，第一及第二個體為人類。

本揭露內容亦提供藉由前述方法產生之CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。在一些其他實施例中，CD4+或CD8+ T細胞用於治療或預防個體之疾病的方法中。CD4+或CD8+ T細胞可在另外其他實施例中用於製造用於治療或預防個體之疾病的藥劑。 VI. 實例實施例

在一些實施例中，本揭露內容提供： 1. 一種融合蛋白，其包含以下或由以下組成： (a) Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、Ra12、TbH9、Ra35及RpfD或其片段； (b) Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–Ra12–TbH9–Ra35–RpfD； (c)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:42之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (d)根據SEQ ID NO:42之胺基酸序列； (e) Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfA、RpfD、Ra12、TbH9及Ra35或其片段； (f) Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–RpfA–RpfD–Ra12–TbH9–Ra35； (g) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:9至10中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:18至22中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (h) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:19之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (i) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:22之該胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (j) (i)根據SEQ ID NO:10之胺基酸序列；及(ii)根據SEQ ID NO:19之胺基酸序列； (k) (i)根據SEQ ID NO:10之胺基酸序列；及(ii)根據SEQ ID NO:22之胺基酸序列； (l)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:27之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (m)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:28之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (n)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:29之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (o)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:30之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (p)根據SEQ ID NO:27之胺基酸序列； (q)根據SEQ ID NO:28之胺基酸序列； (r)根據SEQ ID NO:29之胺基酸序列； (s)根據SEQ ID NO:30之胺基酸序列； (t) Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfA、RpfD及TbH9或其片段； (u) Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–RpfA–RpfD–TbH9； (v) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:9至10中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:24之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (w) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:24之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (x) (i)根據SEQ ID NO:10之胺基酸序列；及(ii)根據SEQ ID NO:24之胺基酸序列； (y)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:31之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (z)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:32之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (aa)根據SEQ ID NO:31之胺基酸序列； (bb)根據SEQ ID NO:32之胺基酸序列； (cc) Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfD、Ra12、TbH9及Ra35或其片段； (dd) Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–RpfD–Ra12–TbH9–Ra35； (ee) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:1及11至12中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:2或13之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(iii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:3或14之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(iv)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:4或15之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(v)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:6或17之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(vi)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:23之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(vii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:8或24之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(viii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:25至26中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (ff)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:33之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (gg)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:34之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (hh)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:35之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:36之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (jj)根據SEQ ID NO:33之胺基酸序列； (kk)根據SEQ ID NO:34之胺基酸序列； (ll)根據SEQ ID NO:35之胺基酸序列； (mm)根據SEQ ID NO:36之胺基酸序列； (nn) Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfD及TbH9或其片段； (oo) Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–RpfD–TbH9； (pp) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:1及11至12中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:2或13之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(iii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:3或14之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(iv)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:4或15之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(v)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:6或17之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(vi)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:8或24之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (qq)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:37之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (rr)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:38之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (ss)根據SEQ ID NO:37之胺基酸序列；或 (tt)根據SEQ ID NO:38之胺基酸序列。 2. 一種融合蛋白，其由一核酸編碼，該核酸包含與根據SEQ ID NO:41之核酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的序列。 3. 一種融合蛋白，其由一核酸編碼，該核酸包含根據SEQ ID NO:41之核酸序列。 4. 如實施例1至3中任一項之融合蛋白，其進一步包含聚-His標籤。 5. 如實施例4之融合蛋白，其中該聚-His標籤包含二至六個His殘基或由其組成。 6. 如實施例1至5中任一項之融合蛋白，其中該聚-His標籤位於該融合蛋白之N端處。 7. 如實施例6之融合蛋白，其中該聚-His標籤在初始Met殘基之後插入。 8. 如實施例1至7中任一項之融合蛋白，其進一步包含HA標籤。 9. 如實施例8之融合蛋白，其中該HA標籤位於該融合蛋白之C端處。 10. 如實施例1至9中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白進一步包含連接Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfA、RpfD、Ra12、TbH9及Ra35中之一或多者的一或多個連接子，其中該一或多個連接子中之各者包含一或多個胺基酸殘基或由其組成。 11. 一種核酸分子，其編碼如實施例1至10中任一項之融合蛋白。 12. 一種載體，其包含如實施例11之核酸分子。 13. 如實施例12之載體，其進一步包含啟動子，其中該啟動子可操作地連接至編碼該融合蛋白之該核酸分子。 14. 如實施例12或實施例13之載體，其中該載體為病毒載體。 15. 如實施例14之載體，其中該病毒載體為巨細胞病毒(CMV)載體。 16. 一種載體，其包含與根據SEQ ID NO:44之核酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的核酸序列。 17. 一種載體，其包含根據SEQ ID NO:44之核酸序列。 18. 一種載體，其基本上由根據SEQ ID NO:44之核酸序列組成。 19. 一種載體，其由根據SEQ ID NO:44之核酸序列組成。 20. 如實施例15至19中任一項之載體，其中該病毒載體為RhCMV載體、HCMV載體或重組HCMV載體。 21. 如實施例15至20中任一項之載體，其中該啟動子可操作地連接至編碼該融合蛋白之該核酸分子，且該啟動子為UL78啟動子或其異種同源物。 22. 如實施例21之載體，其中編碼該融合蛋白之該核酸分子置換UL78之全部或部分。 23. 如實施例22之載體，其中該載體包含與根據SEQ ID NO:44之核酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的核酸序列。 24. 如實施例15或實施例20之載體，其中該啟動子可操作地連接至編碼該融合蛋白之該核酸分子，且該啟動子為UL82啟動子或其異種同源物。 25. 如實施例24之載體，其中編碼該融合蛋白之該核酸分子置換UL82之全部或部分。 26. 如實施例15至25中任一項之載體，其中該RhCMV載體或HCMV載體不表現UL128或UL130，或其異種同源物。 27. 一種重組HCMV載體，其包含TR3主鏈及編碼根據SEQ ID NO:42之異源抗原的核酸序列，其中： (a)該載體不表現UL128或UL130，或其異種同源物； (b)該載體包含編碼UL146、UL147、UL18及UL82，或其異種同源物之核酸序列；且 (c)該異源抗原置換UL78之全部或部分且可操作地連接至該UL78啟動子。 28. 如實施例27之重組HCMV載體，其中該重組HCMV載體包含與根據SEQ ID NO:44之核酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的核酸序列。 29. 如實施例15至28中任一項之載體，其中該RhCMV或HCMV載體(i)包含編碼UL146或其異種同源物之核酸序列及編碼UL147或其異種同源物之核酸序列；且(ii)不表現UL128或UL130，或其異種同源物。 30. 如實施例26至29中任一項之載體，其中該載體不表現UL128蛋白或UL130蛋白，其由在編碼UL128及UL130之該等核酸序列中存在一或多個突變產生。 31. 如實施例30之載體，其中編碼UL128及UL130之該等核酸序列中之該突變為編碼該病毒蛋白之所有該等核酸序列之點突變、框移突變、截短突變或缺失。 32. 如實施例15至31中任一項之載體，其中該載體為包含TR3主鏈之HCMV載體。 33. 如實施例15至32中任一項之載體，其中該載體進一步包含編碼微小RNA (miRNA)識別元件(MRE)之核酸序列，其中該MRE含有在內皮細胞中表現之miRNA的目標位點。 34. 如實施例15至33中任一項之載體，其中該載體進一步包含編碼MRE之核酸序列，其中該MRE含有在骨髓細胞中表現之miRNA之目標位點。 35. 一種醫藥組成物，其包含(i) (a)如實施例1至10中任一項之融合蛋白、(b)如實施例11之核酸或(c)如實施例12至34中任一項之載體；以及(ii)醫藥學上可接受之載劑。 36. 如實施例35之醫藥組成物，其中該醫藥學上可接受之載劑為組胺酸海藻糖(HT)緩衝液。 37. 如實施例35或36之醫藥組成物，其中該醫藥學上可接受之載劑為包含約20 mM L-組胺酸及約10% (w/v)海藻糖之組胺酸海藻糖(HT)緩衝液。 38. 如實施例35至37中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥學上可接受之載劑為包含20 mM L-組胺酸及10% (w/v)海藻糖之組胺酸海藻糖(HT)緩衝液。 39. 如實施例35至38中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥學上可接受之載劑為pH為7.2的包含20 mM L-組胺酸及10% (w/v)海藻糖之組胺酸海藻糖(HT)緩衝液。 40. 一種免疫原性組成物，其包含(i) (a)如實施例1至10中任一項之融合蛋白、(b)如實施例11之核酸或(c)如實施例12至34中任一項之載體；以及(ii)醫藥學上可接受之載劑。 41. 一種在個體中產生免疫反應之方法，其包含向該個體投予如實施例1至40中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物。 42. 一種如實施例1至40中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物之用途，其用於製造用於在個體中產生免疫反應之藥劑。 43. 如實施例1至40中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於在個體中產生免疫反應。 44. 一種治療或預防個體之結核病之方法，其包含向該個體投予如實施例1至40中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物。 45. 一種如實施例1至40中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物之用途，其用於製造用於治療或預防個體之結核病之藥劑。 46. 如實施例1至40中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防個體之結核病。 47. 如實施例1至40中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防個體之結核病，其中該個體呈CMV陽性。 48. 如實施例1至40中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防個體之結核病，其中該個體呈CMV陰性。 49. 如實施例1至40、47或48中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防個體之結核病，其中該個體在干擾素-γ釋放分析中測試出陽性。 50. 如實施例1至40、47或48中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防個體之結核病，其中該個體在干擾素-γ釋放分析中測試出陰性。 51. 如實施例1至40或47至50中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防個體之結核病，其中先前已向該個體投予卡介苗(BCG)。 52. 如實施例1至40或47至51中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防個體之結核病，其中該個體呈HIV陽性。 53. 如實施例1至40或47至52中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防個體之結核病，其中該個體呈HIV陽性且當前正服用抗逆轉錄病毒治療劑。 54. 如實施例1至40或47至53中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防個體之結核病，其中向該個體投予第二療法。 55. 如實施例44至54中任一項之方法、製造用途或用途，其中該結核病為潛伏性結核病感染。 56. 如實施例44至55中任一項之方法、製造用途或用途，其中該結核病為肺結核感染。 57. 如實施例44至56中任一項之方法、製造用途或用途，其中該結核病為一復發性結核病感染。 58. 如實施例41至57中任一項之方法、製造用途或用途，其中該載體為CMV載體，且該CMV載體係以有效引發針對Mtb抗原之CD4+ T細胞反應之量投予。 59. 如實施例41至58中任一項之方法、製造用途或用途，其中該載體為CMV載體，且該CMV載體係以約10 ²pfu至約10 ⁷pfu之量投予。 60. 如實施例58或實施例59之方法、製造用途或用途，其中至少10%的由該重組HCMV載體引發之該等CD4+ T細胞受MHC-II或其異種同源物限制。 61. 如實施例60之方法、製造用途或用途，其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的由該重組HCMV載體引發之該等CD4+ T細胞受MHC-II或其異種同源物限制。 62. 如實施例41至61中任一項之方法、製造用途或用途，其中該載體為CMV載體，且該CMV載體係以有效引發針對Mtb抗原之CD8+ T細胞反應之量投予。 63. 如實施例62之方法、製造用途或供使用之載體或組成物，其中至少10%的由該重組HCMV載體引發之該等CD8+ T細胞受MHC-Ia或其異種同源物限制。 64. 如實施例63之方法、製造用途或供使用之載體或組成物，其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的由該CMV載體引發之該等CD8+ T細胞受MHC-Ia或其異種同源物限制。 65. 一種產生識別MHC-II/肽複合物之CD4+ T細胞的方法，該方法包含： (a)以有效產生一組識別MHC-II/肽複合物之CD4+ T細胞之量向第一個體投予如實施例15至34中任一項之CMV載體； (b)鑑別來自該組CD4+ T細胞之第一CD4+ TCR，其中該第一CD4+ TCR識別一MHC-II/融合蛋白衍生之肽複合物； (c)自第二個體分離一或多個CD4+ T細胞；以及 (d)用表現載體轉染自該第二個體分離之該一或多個CD4+ T細胞，其中該表現載體包含編碼第二CD4+ TCR之核酸序列及可操作地連接至編碼該第二CD4+ TCR之該核酸序列的啟動子，其中該第二CD4+ TCR包含該第一CD4+ TCR之CDR3α及CDR3β，藉此產生識別MHC-II/肽複合物之一或多個CD4+ T細胞。 66. 一種產生識別MHC-II/肽複合物之CD4+ T細胞的方法，該方法包含： (a) 鑑別來自一組CD4+ T細胞之第一CD4+ TCR，其中該組CD4+ T細胞係自已投予如實施例15至34中任一項之CMV載體之個體分離，且其中該第一CD4+ TCR識別MHC-II/融合蛋白衍生之肽複合物； (b)自第二個體分離一或多個CD4+ T細胞；以及 (c)用表現載體轉染自該第二個體分離之該一或多個CD4+ T細胞，其中該表現載體包含編碼第二CD4+ TCR之一核酸序列及可操作地連接至編碼該第二CD4+ TCR之該核酸序列的一啟動子，其中該第二CD4+ TCR包含該第一CD4+ TCR之CDR3α及CDR3β，藉此產生識別MHC-II/肽複合物之一或多個TCR-轉殖基因CD4+ T細胞。 67. 一種產生識別MHC-Ia/肽複合物之CD8+ T細胞的方法，該方法包含： (a)以有效產生一組識別MHC-Ia/肽複合物之CD8+ T細胞之量向第一個體投予如實施例15至34中任一項之CMV載體； (b)鑑別來自該組CD8+ T細胞之第一CD8+ TCR，其中該第一CD8+ TCR識別MHC-Ia/融合蛋白衍生之肽複合物； (c)自第二個體分離一或多個CD8+ T細胞；以及 (d)用表現載體轉染自該第二個體分離之該一或多個CD8+ T細胞，其中該表現載體包含編碼第二CD8+ TCR之核酸序列及可操作地連接至編碼該第二CD8+ TCR之該核酸序列的啟動子，其中該第二CD8+ TCR包含該第一CD8+ TCR之CDR3α及CDR3β，藉此產生識別MHC-Ia/肽複合物之一或多個CD8+ T細胞。 68. 一種產生識別MHC-Ia/肽複合物之CD8+ T細胞的方法，該方法包含： (a) 鑑別來自一組CD8+ T細胞之第一CD8+ TCR，其中該組CD8+ T細胞自已投予如實施例15至34中任一項之CMV載體之個體分離，且其中該第一CD8+ TCR識別MHC-Ia/融合蛋白衍生之肽複合物； (b)自第二個體分離一或多個CD8+ T細胞；以及 (c)用表現載體轉染自該第二個體分離之該一或多個CD8+ T細胞，其中該表現載體包含編碼第二CD8+ TCR之核酸序列及可操作地連接至編碼該第二CD8+ TCR之該核酸序列的啟動子，其中該第二CD8+ TCR包含該第一CD8+ TCR之CDR3α及CDR3β，藉此產生識別MHC-Ia/肽複合物之一或多個TCR-轉殖基因CD8+ T細胞。 69. 如實施例65至68中任一項之方法，其中該第一CD4+ TCR或該第一CD8+ TCR係藉由DNA或RNA定序鑑別。 70. 如實施例65至69中任一項之方法，其中編碼該第二CD4+ TCR之該核酸序列或編碼該第二CD4+ TCR之該核酸序列與編碼該第一CD4+ TCR或該第一CD8+ TCR之該核酸序列一致。 71. 如實施例65至70中任一項之方法，其中該第一個體為人類。 72. 如實施例65至71中任一項之方法，其中該第二個體為人類。 73. 一種CD4+ T細胞，其係藉由如實施例65、66及69至72中任一項之方法產生。 74. 一種治療或預防個體之疾病的方法，該方法包含向該個體投予如實施例73之CD4+ T細胞。 75. 一種如實施例73之CD4+ T細胞之用途，其用於製造用於治療或預防個體之疾病的藥劑。 76. 如實施例73之CD4+ T細胞，其用於治療或預防個體之疾病。 77. 一種CD8+ T細胞，其係藉由如實施例67至72任一項之方法產生。 78. 一種治療或預防個體之疾病的方法，該方法包含向該個體投予如實施例77之CD8+ T細胞。 79. 一種如實施例77之CD8+ T細胞之用途，其用於製造用於治療或預防個體之疾病的藥劑。 80. 如實施例77之CD8+ T細胞，其用於治療或預防個體之疾病。實例實例1：Mtb抗原卡匣之構築

設計編碼包含結核分枝桿菌(Mtb)抗原之融合蛋白的人類CMV載體。評估三個Mtb抗原卡匣，包括融合體6、融合體7 (RpfA缺失及RpfA位點插入融合蛋白M72之變體「M72-融合體-2」的融合體6)及融合體8 (融合體6加C端添加M72-融合體-2) ( 圖2)。融合體7及融合體8中包括之M72之變體「M72-融合體-2」為其中N端二-殘基組胺酸標籤及胺基酸位置1處之甲硫胺酸均已移除(SEQ ID NO:22)的M72。概述Mtb抗原與RpfA變體之守恆的圖表展示於圖3中。融合體 6 之組分

融合體6為包含Ag85A、ESAT6、Rv3407、Rv2626c、RpfA及RpfD之Mtb融合蛋白。融合體 7 之設計

基於融合體6構築融合體7。為產生融合體7，首先使RpfA缺失。RpfA在Mtb菌株中具有可變表現( 圖4)。舉例而言，許多Mtb菌株中之RpfA含有融合體6之同功異構物之僅C端(起始於RpfA中之321 bp處)。另外，Mtb菌株之子集僅具有RpfA N端且其他者不具有N端及中間部分兩者。具有最短RpfA (僅C端；＜100個胺基酸)之Mtb分離株主要來自英國及荷蘭。來自South Africa之Mtb分離株具有可變RpfA且可包括僅C端、僅N端或全長RpfA ( 圖 5)。接著，將M72-融合體-2插入至RpfA位點中。M72-融合體-2衍生自M72，一種充當疫苗抗原的衍生自二種結核分枝桿菌抗原Mtb32a及TbH9之融合蛋白。Mtb32a在毒性無毒性Mtb中守恆之絲胺酸蛋白酶。TbH9 (亦稱為Mtb39a)為由Rv1196/ppe18編碼之PPE/PE家族蛋白質。PPE/PE蛋白質已知為Mtb免疫之顯要目標。TbH9係在藉由對Mtb中之「控制子」與「進展子」進行TCR型態分析所鑑別的抗原中。使RpfA缺失以適應M72抗原之表現，同時維持基因穩定的載體。TbH9為潛伏期中之CD4及CD8T細胞目標。最終融合體7構築體(SEQ ID NO:42)包含Ag85A、ESAT6-Rv3407-Rv2626c、M72-融合體-2 (Mtb32A及TbH9)及RpfD。 融合體8 之設計

基於融合體6構築融合體8，類似於融合體7之構築但在融合體6之C端末端添加M72-融合體-2且不缺失RpfA。實例2：評估MTB抗原卡匣之抗原表現、基因穩定性及免疫原性

Mtb抗原卡匣與UL82或UL78啟動子配對。評估抗原表現、基因穩定性及免疫原性(在恆河猴中)。

表 1.用於評估之Mtb抗原卡匣及啟動子組合。

Mtb 抗原卡匣	啟動子
融合體6	UL78啟動子
融合體7	UL78啟動子
融合體8	UL78啟動子
融合體6	UL82啟動子
融合體7	UL82啟動子
融合體8	UL82啟動子

在細菌人工染色體(BAC)中藉由西方墨點法用ESAT-6抗體測試六個抗原卡匣及啟動子組合(表1)之抗原表現。所有六個BAC具有頻帶在預期大小範圍中之Mtb抗原表現。

使用相同的BAC評估基因穩定性。每個構築體三個純系經傳代以在各代藉由下一代定序(NGS)模擬藥物生產製程(具有三個額外傳代(RSS+3)之研究種儲備液，總共四個傳代)。對於含UL78之構築體在0.003之MOI下，或對於含UL82之構築體在0.01之MOI下，在T-150燒瓶中進行傳代。基因穩定性定義為未觀測到大量修飾隨著傳代而增加(亦即，涉及轉基因或U _L/1 b'區之缺失及/或重排)。發現表現融合體6 +UL78啟動子及融合體6 +UL82啟動子之BAC在RSS+3中為穩定的。表現融合體8 +UL78啟動子之BAC展示插入物及載體主鏈不穩定性。表現融合體7 +UL78啟動子及融合體7 +UL82啟動子之BAC在RSS+2及RSS+3中為穩定的。表現融合體8 +UL82啟動子之BAC在RSS+2及RSS+3中為穩定的。

在恆河猴模型中評估免疫原性。以10 ⁶pfu之劑量向恆河猴投予表現六個抗原卡匣及啟動子組合(表1)之HCMV病毒載體。外周血液單核細胞(PBMC)以兩週遞增進行分離，持續長達十週，接著在胞內細胞介素染色(ICS)之前用含有來自融合體6或融合體6及M72中表現之基因的肽之Mtb肽池刺激。測定CD4+及CD8+ T細胞之頻率、IFNγ+及/或TNFα+細胞之頻率，以及記憶/效應T細胞表型。在投予表現融合體6 +UL78啟動子或融合體6 +UL82啟動子之病毒載體的動物中，在給藥後6週偵測到針對融合體6肽之CD4+及CD8+ T細胞反應( 圖6A 至圖6L)。在投予表現融合體7 +UL78啟動子、融合體7 +UL82啟動子或融合體8 +UL82啟動子之病毒載體的動物中，在6週偵測到針對肽池之T細胞反應( 圖7A 至圖7N)。藉由偵測IFNγ+及/或TNFα+ CD4+及/或CD8+ T細胞指示T細胞反應。

所有三個Mtb抗原設計均具有功能性。融合體7抗原卡匣在恆河猴中引發CD4+及CD8+ T細胞反應。RpfA在Mtb菌株中具有可變表現，證實用M72-融合體-2置換在人類研究中賦予針對CMV之保護。融合體6抗原卡匣併入大範圍之自感染性週期之不同階段(發揚性/潛伏性/再發揚性階段)併入的Mtb抗原且在恆河猴研究中展示具有保護性。融合體8抗原卡匣包括融合體6卡匣以及M72-融合體-2，但可與基因不穩定性相關。實例3：hCMV-TB載體主鏈及TB-抗原啟動子之選擇 載體主鏈選擇

相比於CD8+ T細胞，認為Mtb-特異性CD4+ T細胞對於感染控制更重要。靜脈內卡介苗(Bacillus Calmette–Guérin；BCG)疫苗接種之非人類靈長類研究表明抗原特異性T細胞頻率之重要性。另外，GSK M72-ASO1E疫苗引發抗體及CD4+ T細胞，但極少或無CD8+ T細胞(Penn-Nicholson A等人, Safety and immunogenicity of candidate vaccine M72/AS01E in adolescents in a Mtb endemic setting. Vaccine. 2015年7月31日;33(32):4025-34)。因此，引發Mtb-特異性CD4+ T細胞對於CMV-TB疫苗設計至關重要且較佳在損害CD4+ T細胞反應之情況下引發CD8+ T細胞。此外，引發習知的I類限制性CD8+ T細胞優於引發II類/MHC-E限制性CD8+ T細胞，因為II類/MHC-限制顯示對於Rh-CMV Mtb保護而言並非需要的。

已知本文所描述之CMV載體主鏈引發穩固的CD4+ T細胞反應。另外，主鏈含有完整的UL146-147，預期其誘導I類限制性CD8+ T細胞反應。主鏈包含UL128-130之缺失，已知其促進MRC-5纖維母細胞中之基因穩定性。

構築具有如表2中所示之特徵的CMV-TB載體。表 2 .CMV -TB 載體之特徵

功能	特徵
趨向性及免疫程式化	ΔUL128/UL130
完整UL146/147
完整UL18
ΔUL78或ΔUL82
生長限制	ΔUL82或ΔUL78
抗原遞送	Mtb抗原
UL82或UL78

Mtb 抗原卡匣啟動子選擇

Mtb融合蛋白可插入至CMV載體主鏈中以置換基因(例如，UL82或UL78)使得融合蛋白可操作地連接至缺失基因之啟動子且由其表現。發現UL78啟動子有效驅動融合體7或融合體6之表現且發現UL82啟動子有效驅動融合體8之表現。已知HCMV基因UL82(其編碼外被蛋白質pp71)之缺失產生生長缺乏，從而導致病毒產量較低。另外，亦已知外源性pp71之表現增加UL82缺失CMV載體之轉基因表現(Caposio P.等人, Characterization of a live-attenuated HCMV-based vaccine platform. Sci Rep. 2019年12月17日;9(1):19236)。因此，使用UL82啟動子將需要外源性pp71表現以便達成最高位準之轉基因表現及病毒產量。相比之下，使用UL78啟動子消除在生產期間對pp71 mRNA之外源性表現的需求。實例4：評估載體4之安全性、反應原性、耐受性及免疫原性的1A/1B期研究

1a/1b期研究經設計以評估載體4 (SEQ ID NO:44)之安全性、反應原性、耐受性及免疫原性。將基於CMV狀態(陽性或陰性)、干擾素-γ釋放分析結果(陽性或陰性)及先前卡介苗(bacille Calmette–Guérin；BCG)疫苗接種之接受(陽性或陰性)來評估四組患者。「A部分」將包括CMV+/IGRA-個體，「B部分」將包括CMV-/IGRA-個體，「C部分」將包括CMV+/IGRA-/BCG+個體，且「D部分」將包括CMV+/IGRA+/BCG+個體。將在美國多個地點(A部分及B部分群組)及Mtb為地方流行性的國家(例如，South Africa)的一至二個地點進行該研究。各群組將包含十(10)名患者，其中八(8)名接受藥物，且二(2)名接受安慰劑。實例5：評估用於多種肺結核相關適應症之載體4的研發計劃

圖9展示評估用於預防青少年及成年人之肺結核病之載體4 (SEQ ID NO:44)的研發計劃。圖10展示用於評估用於預防結核分枝桿菌感染及預防青少年及成年人之結核病復發的載體4 (SEQ ID NO:44)的研發計劃。

雖然已說明且描述特定實施例，但應容易瞭解，可組合上文所描述之各種實施例以提供其他實施例，且可組合上文所描述之各種實施例以提供其他實施例。

除非另外明確陳述，否則本說明書中提及及/或本申請案資料表中所列之所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利公開案，包括2021年8月31日申請之美國臨時專利申請案第63/239,278號及2022年7月27日申請之第63/392,778號均以全文引用之方式併入本文中。必要時，可修改實施例之態樣以採用各種專利、申請案及公開案之概念，從而提供又其他實施例。

可依據上文詳細描述，對實施例進行此等及其他改變。一般而言，在以下申請專利範圍中，所用術語不應解釋為將申請專利範圍限於本說明書及申請專利範圍中所揭露之特定實施例，而應解釋為包括所有可能之實施例連同該等申請專利範圍有權要求的等效物之全部範疇。因此，申請專利範圍不受本揭露內容限制。

無

圖1展示包含Mtb抗原之融合蛋白的實例。

圖2展示包含Mtb抗原之融合蛋白融合體6 (Fusion 6)、融合體7 (Fusion 7)及融合體8 (Fusion 8)。圖式中之「M72」係指M72-融合體-2。

圖 3概述Mtb抗原及RpfA變體之蛋白質保留。在對所有Mtb抗原及RpfA變體之分析中包括總共4884個株/分離株。在圖式中指示每一胺基酸位置經比對分離株之數目。RpfA變體之分析中包括標註為「Rv0867c」之分離株。

圖 4展示分佈在Mtb分離株中之可變RpfA蛋白質長度。帶圓圈區域指示具有不同類別之截短及/或缺失的分離株群組。

圖5展示全長RpfA變體之地理分佈。對來自圖4之標記為「具有全長蛋白質之分離株」的分離株群組進行分析。展示最大分率之攜帶全長RpfA基因之分離株的前二十個地理位置。全長RpfA定義為長於400個胺基酸。y軸標記「缺失」係指具有未知位置資訊之分離株。

圖 6A 至圖 6L展示自投予在UL78或UL82啟動子之控制下表現融合體6之病毒載體之恆河猴分離的外周血液單核細胞(PBMC)中之CD4+或CD8+ T細胞(如所指示)「反應」(表現細胞介素)的頻率。給藥後0、2、4、6、8及10週收集PBMC，且在細胞內細胞介素染色(ICS)之前用含有來自融合體6 (Ag58A (圖6A至圖6B)、Rv2626 (圖6C至圖6D)、RpfA (圖6E至圖6F)、ESAT6 (圖6G至圖6H）、Rv3407 (圖6I至圖6J)或RpfD (圖6K至圖6L))中表現之基因之肽的Mtb肽池刺激。實線指示10 ⁶pfu之病毒載體劑量，虛線指示10 ⁵pfu之病毒載體劑量。

圖7A 至圖7N展示自投予在UL78或UL82啟動子之控制下表現融合體7或在UL82啟動子之控制下表現融合體8之病毒載體之恆河猴分離的外周血液單核細胞(PBMC)中之CD4+或CD8+ T細胞(如所指示)「反應」(表現細胞介素)的頻率。給藥後0、2、4及6週收集PBMC，且在細胞內細胞介素染色(ICS)之前用含有來自融合體6 (Ag58A (圖7A至圖7B)、Rv2626 (圖7C至圖7D)、RpfA (圖7E至圖7F)、ESAT6 (圖7G至圖7H）、Rv3407 (圖7I至圖7J)或RpfD (圖7K至圖7L))及M72-融合體-2 (在圖7M至圖7N中標記為「M72」)中表現之基因之肽的Mtb肽池刺激。實線指示10 ⁶pfu之病毒載體劑量，虛線指示10 ⁵pfu之病毒載體劑量。

圖8概述載體4 (SEQ ID NO:44)之潛在指示。「TB」係指結核病。「NHP」係指非人類靈長類動物。

圖9展示評估用於預防青少年及成年人之肺結核病之載體4 (SEQ ID NO:44)的研發計劃。

圖10展示評估用於預防Mtb感染及預防青少年及成年人之結核病復發之載體4 (SEQ ID NO:44)的研發計劃。

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Claims

一種融合蛋白，其包含以下或由以下組成： (a) Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、Ra12、TbH9、Ra35及RpfD或其片段； (b) Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–Ra12–TbH9–Ra35–RpfD； (c)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:42之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (d)根據SEQ ID NO:42之胺基酸序列； (e) Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfA、RpfD、Ra12、TbH9及Ra35或其片段； (f) Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–RpfA–RpfD–Ra12–TbH9–Ra35； (g) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:9至10中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:18至22中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (h) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:19之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (i) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:22之該胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (j) (i)根據SEQ ID NO:10之胺基酸序列；及(ii)根據SEQ ID NO:19之胺基酸序列； (k) (i)根據SEQ ID NO:10之胺基酸序列；及(ii)根據SEQ ID NO:22之胺基酸序列； (l)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:27之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (m)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:28之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (n)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:29之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (o)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:30之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (p)根據SEQ ID NO:27之胺基酸序列； (q)根據SEQ ID NO:28之胺基酸序列； (r)根據SEQ ID NO:29之胺基酸序列； (s)根據SEQ ID NO:30之胺基酸序列； (t) Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfA、RpfD及TbH9或其片段； (u) Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–RpfA–RpfD–TbH9； (v) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:9至10中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:24之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (w) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:24之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (x) (i)根據SEQ ID NO:10之胺基酸序列；及(ii)根據SEQ ID NO:24之胺基酸序列； (y)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:31之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (z)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:32之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (aa)根據SEQ ID NO:31之胺基酸序列； (bb)根據SEQ ID NO:32之胺基酸序列； (cc) Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfD、Ra12、TbH9及Ra35或其片段； (dd) Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–RpfD–Ra12–TbH9–Ra35； (ee) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:1及11至12中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:2或13之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(iii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:3或14之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(iv)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:4或15之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(v)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:6或17之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(vi)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:23之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(vii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:8或24之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(viii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:25至26中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (ff)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:33之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (gg)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:34之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (hh)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:35之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:36之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (jj)根據SEQ ID NO:33之胺基酸序列； (kk)根據SEQ ID NO:34之胺基酸序列； (ll)根據SEQ ID NO:35之胺基酸序列； (mm)根據SEQ ID NO:36之胺基酸序列； (nn) Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfD及TbH9或其片段； (oo) Ag85A–ESAT-6–Rv3407–Rv2626c–RpfD–TbH9； (pp) (i)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:1及11至12中任一者之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(ii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:2或13之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(iii)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:3或14之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(iv)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:4或15之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；(v)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:6或17之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性；及(vi)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:8或24之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (qq)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:37之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (rr)一胺基酸序列，其與根據SEQ ID NO:38之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性； (ss)根據SEQ ID NO:37之胺基酸序列；或 (tt)根據SEQ ID NO:38之胺基酸序列。
一種融合蛋白，其由一核酸編碼，該核酸包含與根據SEQ ID NO:41之核酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的一序列。
一種融合蛋白，其由一核酸編碼，該核酸包含根據SEQ ID NO:41之核酸序列。
如請求項1至3中任一項之融合蛋白，其進一步包含一聚-His標籤。
如請求項4之融合蛋白，其中該聚-His標籤包含二至六個His殘基或由二至六個His殘基組成。
如請求項1至5中任一項之融合蛋白，其中該聚-His標籤位於該融合蛋白之N端處。
如請求項6之融合蛋白，其中該聚-His標籤在初始Met殘基之後插入。
如請求項1至7中任一項之融合蛋白，其進一步包含一HA標籤。
如請求項8之融合蛋白，其中該HA標籤位於該融合蛋白之C端處。
如請求項1至9中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白進一步包含連接Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、RpfA、RpfD、Ra12、TbH9及Ra35中之一或多者的一或多個連接子，其中該一或多個連接子中之各者包含一或多個胺基酸殘基或由一或多個胺基酸殘基組成。
一種核酸分子，其編碼如請求項1至10中任一項之融合蛋白。
一種載體，其包含如請求項11之核酸分子。
如請求項12之載體，其進一步包含一啟動子，其中該啟動子可操作地連接至編碼該融合蛋白之該核酸分子。
如請求項12或請求項13之載體，其中該載體為一病毒載體。
如請求項14之載體，其中該病毒載體為一巨細胞病毒(CMV)載體。
一種載體，其包含與根據SEQ ID NO:44之核酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的一核酸序列。
一種載體，其包含根據SEQ ID NO:44之核酸序列。
一種載體，其基本上由根據SEQ ID NO:44之核酸序列組成。
一種載體，其由根據SEQ ID NO:44之核酸序列組成。
如請求項15至19中任一項之載體，其中該病毒載體為一RhCMV載體、一HCMV載體或一重組HCMV載體。
如請求項15至20中任一項之載體，其中該啟動子可操作地連接至編碼該融合蛋白之該核酸分子，且該啟動子為一UL78啟動子或其一異種同源物。
如請求項21之載體，其中編碼該融合蛋白之該核酸分子置換UL78之全部或部分。
如請求項22之載體，其中該載體包含與根據SEQ ID NO:44之核酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的一核酸序列。
如請求項15或請求項20之載體，其中該啟動子可操作地連接至編碼該融合蛋白之該核酸分子，且該啟動子為一UL82啟動子或其一異種同源物。
如請求項24之載體，其中編碼該融合蛋白之該核酸分子置換UL82之全部或部分。
如請求項15至25中任一項之載體，其中該RhCMV載體或HCMV載體不表現UL128或UL130，或其異種同源物。
一種重組HCMV載體，其包含一TR3主鏈及編碼根據SEQ ID NO:42之一異源抗原的一核酸序列，其中： (a)該載體不表現UL128或UL130，或其異種同源物； (b)該載體包含編碼UL146、UL147、UL18及UL82，或其異種同源物之核酸序列；且 (c)該異源抗原置換UL78之全部或部分且可操作地連接至該UL78啟動子。
如請求項27之重組HCMV載體，其中該重組HCMV載體包含與根據SEQ ID NO:44之核酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的一核酸序列。
如請求項15至28中任一項之載體，其中該RhCMV或HCMV載體(i)包含編碼UL146或其異種同源物之一核酸序列及編碼UL147或其異種同源物之一核酸序列；且(ii)不表現UL128或UL130，或其異種同源物。
如請求項26至29中任一項之載體，其中該載體不表現一UL128蛋白或一UL130蛋白，其由在編碼UL128及UL130之該等核酸序列中存在一或多個突變產生。
如請求項30之載體，其中編碼UL128及UL130之該等核酸序列中之該突變為編碼該病毒蛋白之所有該等核酸序列之一點突變、框移突變、截短突變或缺失。
如請求項15至31中任一項之載體，其中該載體為包含一TR3主鏈之一HCMV載體。
如請求項15至32中任一項之載體，其中該載體進一步包含編碼一微小RNA (miRNA)識別元件(MRE)之一核酸序列，其中該MRE含有在內皮細胞中表現之一miRNA的一目標位點。
如請求項15至33中任一項之載體，其中該載體進一步包含編碼一MRE之一核酸序列，其中該MRE含有在骨髓細胞中表現之一miRNA之一目標位點。
一種醫藥組成物，其包含(i) (a)如請求項1至10中任一項之融合蛋白、(b)如請求項11之核酸或(c)如請求項12至34中任一項之載體；以及(ii)一醫藥學上可接受之載劑。
一種免疫原性組成物，其包含(i) (a)如請求項1至10中任一項之融合蛋白、(b)如請求項11之核酸或(c)如請求項12至34中任一項之載體；以及(ii)一醫藥學上可接受之載劑。
一種在一個體中產生一免疫反應之方法，其包含向該個體投予如請求項1至36中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物。
一種如請求項1至36中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物之用途，其用於製造用於在一個體中產生一免疫反應之一藥劑。
如請求項1至36中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於在一個體中產生一免疫反應。
一種治療或預防一個體之結核病之方法，其包含向該個體投予如請求項1至36中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物。
一種如請求項1至36中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物之用途，其用於製造用於治療或預防一個體之結核病之一藥劑。
如請求項1至36中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防一個體之結核病。
如請求項1至36中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防一個體之結核病，其中該個體呈CMV陽性。
如請求項1至36中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防一個體之結核病，其中該個體呈CMV陰性。
如請求項1至36、43或44中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防一個體之結核病，其中該個體在一干擾素-γ釋放分析中測試出陽性。
如請求項1至36、43或44中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防一個體之結核病，其中該個體在一干擾素-γ釋放分析中測試出陰性。
如請求項1至36或43至46中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防一個體之結核病，其中先前已向該個體投予卡介苗(bacille Calmette-Guérin vaccine；BCG)。
如請求項1至36或43至47中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防一個體之結核病，其中該個體呈HIV陽性。
如請求項1至36或43至48中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防一個體之結核病，其中該個體呈HIV陽性且當前正服用抗逆轉錄病毒治療劑。
如請求項1至36或43至49中任一項之融合蛋白、核酸、載體或組成物，其用於治療或預防一個體之結核病，其中向該個體投予一第二療法。
如請求項40至50中任一項之方法、製造用途或用途，其中該結核病為一潛伏性結核病感染。
如請求項40至51中任一項之方法、製造用途或用途，其中該結核病為一肺結核感染。
如請求項40至52中任一項之方法、製造用途或用途，其中該結核病為一復發性結核病感染。
如請求項37至53中任一項之方法、製造用途或用途，其中該載體為一CMV載體，且該CMV載體係以有效引發針對一Mtb抗原之一CD4+ T細胞反應之一量投予。
如請求項54之方法、製造用途或用途，其中至少10%的由該重組HCMV載體引發之該等CD4+ T細胞受MHC-II或其一異種同源物限制。
如請求項55之方法、製造用途或用途，其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的由該重組HCMV載體引發之該等CD4+ T細胞受MHC-II或其一異種同源物限制。
如請求項37至56中任一項之方法、製造用途或用途，其中該載體為一CMV載體，且該CMV載體係以有效引發針對一Mtb抗原之一CD8+ T細胞反應之一量投予。
如請求項57之方法、製造用途或供使用之載體或組成物，其中至少10%的由該重組HCMV載體引發之該等CD8+ T細胞受MHC-Ia或其一異種同源物限制。
如請求項58之方法、製造用途或供使用之載體或組成物，其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的由該CMV載體引發之該等CD8+ T細胞受MHC-Ia或其一異種同源物限制。
一種產生識別MHC-II/肽複合物之CD4+ T細胞的方法，該方法包含： (a)以有效產生一組識別MHC-II/肽複合物之CD4+ T細胞之一量向一第一個體投予如請求項15至34中任一項之CMV載體； (b)鑑別來自該組CD4+ T細胞之一第一CD4+ TCR，其中該第一CD4+ TCR識別一MHC-II/融合蛋白衍生之肽複合物； (c)自一第二個體分離一或多個CD4+ T細胞；以及 (d)用一表現載體轉染自該第二個體分離之該一或多個CD4+ T細胞，其中該表現載體包含編碼一第二CD4+ TCR之一核酸序列及可操作地連接至編碼該第二CD4+ TCR之該核酸序列的一啟動子，其中該第二CD4+ TCR包含該第一CD4+ TCR之CDR3α及CDR3β，藉此產生識別MHC-II/肽複合物之一或多個CD4+ T細胞。
一種產生識別MHC-II/肽複合物之CD4+ T細胞的方法，該方法包含： (a) 鑑別來自一組CD4+ T細胞之一第一CD4+ TCR，其中該組CD4+ T細胞係自已投予如請求項15至34中任一項之CMV載體之一個體分離，且其中該第一CD4+ TCR識別一MHC-II/融合蛋白衍生之肽複合物； (b)自一第二個體分離一或多個CD4+ T細胞；以及 (c)用一表現載體轉染自該第二個體分離之該一或多個CD4+ T細胞，其中該表現載體包含編碼一第二CD4+ TCR之一核酸序列及可操作地連接至編碼該第二CD4+ TCR之該核酸序列的一啟動子，其中該第二CD4+ TCR包含該第一CD4+ TCR之CDR3α及CDR3β，藉此產生識別MHC-II/肽複合物之一或多個TCR-轉殖基因CD4+ T細胞。
一種產生識別MHC-Ia/肽複合物之CD8+ T細胞的方法，該方法包含： (a)以有效產生一組識別MHC-Ia/肽複合物之CD8+ T細胞之一量向一第一個體投予如請求項15至34中任一項之CMV載體； (b)鑑別來自該組CD8+ T細胞之一第一CD8+ TCR，其中該第一CD8+ TCR識別一MHC-Ia/融合蛋白衍生之肽複合物； (c)自一第二個體分離一或多個CD8+ T細胞；以及 (d)用一表現載體轉染自該第二個體分離之該一或多個CD8+ T細胞，其中該表現載體包含編碼一第二CD8+ TCR之一核酸序列及可操作地連接至編碼該第二CD8+ TCR之該核酸序列的一啟動子，其中該第二CD8+ TCR包含該第一CD8+ TCR之CDR3α及CDR3β，藉此產生識別MHC-Ia/肽複合物之一或多個CD8+ T細胞。
一種產生識別MHC-Ia/肽複合物之CD8+ T細胞的方法，該方法包含： (a) 鑑別來自一組CD8+ T細胞之一第一CD8+ TCR，其中該組CD8+ T細胞自已投予如請求項15至34中任一項之CMV載體之一個體分離，且其中該第一CD8+ TCR識別一MHC-Ia/融合蛋白衍生之肽複合物； (b)自一第二個體分離一或多個CD8+ T細胞；以及 (c)用一表現載體轉染自該第二個體分離之該一或多個CD8+ T細胞，其中該表現載體包含編碼一第二CD8+ TCR之一核酸序列及可操作地連接至編碼該第二CD8+ TCR之該核酸序列的一啟動子，其中該第二CD8+ TCR包含該第一CD8+ TCR之CDR3α及CDR3β，藉此產生識別MHC-Ia/肽複合物之一或多個TCR-轉殖基因CD8+ T細胞。
如請求項60至63中任一項之方法，其中該第一CD4+ TCR或該第一CD8+ TCR係藉由DNA或RNA定序鑑別。
如請求項60至64中任一項之方法，其中編碼該第二CD4+ TCR之該核酸序列或編碼該第二CD4+ TCR之該核酸序列與編碼該第一CD4+ TCR或該第一CD8+ TCR之該核酸序列一致。
如請求項60至65中任一項之方法，其中該第一個體為一人類。
如請求項60至66中任一項之方法，其中該第二個體為一人類。
一種CD4+ T細胞，其係藉由如請求項60、61及64至67中任一項之方法產生。
一種治療或預防一個體之一疾病的方法，該方法包含向該個體投予如請求項68之CD4+ T細胞。
一種如請求項68之CD4+ T細胞之用途，其用於製造用於治療或預防一個體之一疾病的一藥劑。
如請求項68之CD4+ T細胞，其用於治療或預防一個體之一疾病。
一種CD8+ T細胞，其係藉由如請求項62至67中任一項之方法產生。
一種治療或預防一個體之一疾病的方法，該方法包含向該個體投予如請求項72之CD8+ T細胞。
一種如請求項72之CD8+ T細胞之用途，其用於製造用於治療或預防一個體之一疾病的一藥劑。
如請求項72之CD8+ T細胞，其用於治療或預防一個體之一疾病。