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KR20120089475A - 결핵균 감염을 예방 또는 치료하기 위한 신규한 방법 - Google Patents

결핵균 감염을 예방 또는 치료하기 위한 신규한 방법 Download PDF

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KR20120089475A
KR20120089475A KR1020127008426A KR20127008426A KR20120089475A KR 20120089475 A KR20120089475 A KR 20120089475A KR 1020127008426 A KR1020127008426 A KR 1020127008426A KR 20127008426 A KR20127008426 A KR 20127008426A KR 20120089475 A KR20120089475 A KR 20120089475A
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South Korea
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ala
gly
mtb72f
polypeptide
val
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KR1020127008426A
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레아 콜러
이베스 로베트
스티븐 리드
Original Assignee
인펙셔스 디지즈 리서치 인스티튜트 (아이디알아이)
글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 예를 들어 애주번트와 함께, Mtb72f 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산, 또는 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 약제 조성물을 투여함으로써 활동성 및 잠복성 결핵균(M. tuberculosis)의 재활성화를 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 Mtb72f 핵산 또는 융합 단백질은 결핵균 감염에 대하여 효과적인 하나 이상의 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 상기 방법은 또한 결핵균 감염에 대한 화학요법 섭생의 경과 시간 단축도 제공한다.

Description

결핵균 감염을 예방 또는 치료하기 위한 신규한 방법 {NOVEL METHOD FOR PREVENTING OR TREATING M TUBERCULOSIS INFECTION}
본 발명은 포유동물에서의 결핵균(M. Tuberculosis) 감염의 재활성화를 예방 또는 치료하는 방법 및 결핵균 감염에 대한 화학요법의 치료 시간(time course)를 단축하는 방법에 관한 것이다.
결핵은 결핵균 및 다른 마이코박테리움(Mycobacterium) 종의 감염에 의해 유발되는 만성 감염성 질병이다. 결핵은 매년 약 8백만명의 신규 감염자가 발생되며 3백만명의 목숨을 앗아가는, 개발도산국의 주요 질병이며, 또한 선진국에서도 문제점으로 부각되고 있다. 상당한 기간 동안 감염은 무증상일 수 있으나, 결핵은 가장 공통적인 증상으로서 폐의 급성 염증을 나타내며, 그 결과 발열 및 마른 기침(nonproductive cough)을 유발시킨다. 치료하지 않으면, 일반적으로 심각한 합병증 및 사망을 초래한다.
결핵은 장기간에 걸친 항생제 요법을 이용하여 치료될 수 있으나, 이러한 치료법이 결핵의 확산을 막기에는 역부족이다. 감염된 개체들은 증상을 나타내지는 아니하나, 일정 기간 보균상태(contagious)일 수 있다. 게다가, 치료 섭생을 엄격하게 따르더라도, 환자의 행동을 통제하는 것은 어렵다. 일부 환자들은 치료 과정을 끝마치지 못하는데, 이는 효험없는 치료와 약제 내성의 발달을 초래할 수 있다. 치료의 전 과정을 끝마친다 하더라도, 결핵균 감염은 감염된 개체로부터 근절되지 아니하며 여전히 재활성화될 수 있는 잠복성 감염으로 잔존하게 된다.
결핵의 확산을 통제하기 위해서는, 상기 질병에 대한 효과적인 예방접종(vaccination) 및 정확한 초기 진단이 가장 중요하다. 현재까지는 생균(live bacteria)을 이용한 예방접종이 보호 면역을 유도하기 위한 가장 효율적인 방법이다. 상기 목적을 위해 이용되는 가장 일반적인 마이코박테리움은 바실러스 칼메트-게링(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)인데, M. bovis의 비병원성 종이다. 그러나, BCG의 안정성 및 효능은 논쟁의 대상이 되고 있으며, 미국과 같은 일부 국가에서는 상기 제제를 사용한 일반 대중의 예방접종을 실시하지 않고 있다.
결핵의 진단은 일반적으로 피부 검정법을 이용하여 수행되는데, 상기 검정법은 투베르쿨린 PPD(protein-purified derivative)에 대한 피내 노출을 포함한다. 항원-특이 T 세포 반응은 주입후 48-72시간 까지 주입 부위에서의 측정가능한 정도의 경화(induration)를 초래하는데, 이는 마이코박테리움 항원에 대한 노출을 의미한다. 그러나 상기 검정법은 민감도 및 특이성에서 문제가 있으며, BCG로 예방접종된 개체들은 감염된 개체들과 구별될 수 없다.
대식세포가 마이코박테리움 면역의 주요 작동자로서 역할하는 것으로 밝혀져 왔으며, 또한 T 세포는 이러한 면역의 유력한 유발자이다. 마이코박테리움 감염에 대한 보호에서의 T 세포의 본질적인 역할은 인체면역결핍바이러스(HIV) 감염과 관련된 CD4+ T 세포의 고갈로 인한 AIDS 환자에서의 마이코박테리움 감염의 빈번한 발생에 의해 설명된다. 마이코박테리움-감작성 CD4+ T 세포는 γ-인터페론(IFN-γ)의 잠재적인 생산자인 것으로 밝혀져 왔으며, 이는 차례로 생쥐에서 대식세포에 의한 항-마이코박테리아 영향을 촉발시키는 것으로 입증된 바 있다. 인간에 있어서 IFN-γ의 역할은 덜 명확하지만, 연구는 단독으로 또는 IFN-γ 또는 종양괴사인자-알파와 혼합된, 1,25-디히드록시-비타민 D3가 인간 대식세포를 활성화시켜 결핵균 감염을 억제한다는 것을 밝혀내었다. 더욱이, IFN-γ는 인간 대식세포를 자극하여 1,25-디히드록시-비타민 D3를 만들어 내는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 인터루킨-12(IL-12)는 결핵균 감염에 대한 저항력을 자극하는데 역할을 하는 것으로 밝혀진 바 있다. 결핵균 감염의 면역학에 대한 고찰을 위해, 다음 문헌을 참조하라(Chan & Kaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control(Bloom ed., 1994), Tuberculosis(2nd ed., Rom and Garay, eds., 2003), 및 Harrison 's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966(16th ed., Braunwald, et al, eds., 2005)).
활동성 및 잠복성 감염 둘 모두에서의, 마이코박테리움 튜버큘로시스 감염의 재활성화를 예방하기 위한 효과적인 치료 전략에 대한 요구가 여전히 존재한다. 본 발명은 상기 요구 및 다른 요구들을 충족시킨다.
서열목록에 대한 설명
서열번호:1: N-말단에 6개 히스티딘 태그(His tag)를 지닌 Mtb72f(DNA)
서열번호:2: N-말단에 6개 히스티딘 태그를 지닌 Mtb72f(단백질)
서열번호:3: N-말단에 2개 히스티딘이 삽입된 M72(Mtb72f의 변종)(DNA)
서열번호:4: N-말단에 2개 히스티딘이 삽입된 M72(Mtb72f의 변종)(단백질)
서열번호:5: N-말단에 히스티딘이 삽입되지 않은 Mtb72f(DNA)
서열번호:6: N-말단에 히스티딘이 삽입되지 않은 Mtb72f(단백질)
발명의 요약
본 발명은 예를 들어 AS01B 및 AS02A를 포함하는 하나 이상의 애주번트와 함께, 결핵 군(complex)의 마이코박테리움 종으로부터의 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
본 발명은, 부분적으로, 예컨대 하나 이상의 애주번트와 함께 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편 또는 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 엔코딩하는 핵산을 투여하는 것이 활성 또는 불활성 결핵균 감염의 재활성화를 예방 또는 치료할 수 있다는 본 발명자들의 발견에 기초하고 있다. 바람직한 구체예에서, Mtb72f 융합 단백질 또는 핵산은 결핵균 감염에 대하여 효과적인 하나 이상의 화학요법제와 함께 투여된다.
일 양상에서, 상기 조성물은 개체에서의 결핵 재활성화를 예방 또는 치료하기 위한 방법에 사용되는데, 상기 방법은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 이미 감염된 포유동물에게 결핵균 군 중의 마이코박테리움 종으로부터의 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편 및 애주번트를 포함하는 약제 조성물을 면역학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 Mtb72f 융합 단백질이 결핵균에 대한 면역 반응을 유도하며, 그로 인하여 결핵 재활성화가 예방되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양상에서, 상기 조성물은 개체에서의 결핵 재활성화를 예방하기 위한 방법에 사용되는데, 상기 방법은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 이미 감염된 포유동물에게 결핵균 군 중의 마이코박테리움 종으로부터의 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 엔코딩하는 핵산을 포함하는 약제 조성물을 면역학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 발현된 Mtb72f 융합 단백질이 결핵균에 대한 면역 반응을 유도하며, 그로 인하여 결핵 재활성화가 예방되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양상에서, 상기 조성물은 결핵균(M. tuberculosis) 감염에 대비한 화학요법의 경과 시간을 단축하는 방법에 사용되는데, 상기 방법은 결핵균에 이미 감염된 포유동물에게 결핵균 감염에 효과적인 하나 이상의 화학요법제 및 결핵균 군 중의 마이코박테리움(Mycobacterium) 종으로부터 나온 면역학적으로 유효한 양의 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편 및 애주번트를 포함하는 약제 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 Mtb72f 융합 단백질이 결핵균에 대한 면역 반응을 유도하며, 그로 인하여 결핵균 감염에 대비한 화학요법의 경과 시간이 단축되는 것을 특징으로 한다. 결핵균 감염에 대비한 화학요법의 경과 시간을 단축함으로써, 본 발명의 방법은 또한 결핵균 감염 치료를 받고 있는 개체의 순응을 향상시켜 치료의 전과정을 끝마치게 하는데 효과적이다.
도 1은 스위스 웹스터 생쥐(SWR/J)에서의 결핵균 재활성화 모델을 그림으로 도시한 것이다. 상기 도면은 감염, 화학요법 치료(음료수 리터 당 50㎎ 리팜핀/85㎎ 이소니아지드), 면역처치(immunizations) 및 박테리아 로드/콜로니 형성 단위(colony forming units, CFU)의 계수(enumeration)에 관한 시점을 도시하고 있다.
도 2는 화학요법으로 치료하고 그 다음에 Mtb72f로 면역화시킨, 결핵균 감염된 SWR/J 생쥐에서의 IgG1 및 IgG2a 항체 반응 면역 반응을 보여준다. 생쥐들은 치료를 받지 않거나, 화학요법 치료를 받거나(음료수 리터 당 50㎎ 리팜핀/85㎎ 이소니아지드), 화학요법 치료를 받고 애주번트 없이 제형화된 1회분 당 8㎍의 Mtb72f로 3회 근내 면역화된다. 마지막 면역처치 후 10일째에 생쥐들로부터 채혈하고, IgG1(적색) 및 IgG2a(흑색) 동족체 둘 모두에 대한 항-Mtb72f 항체 반응을 분석하기 위해 ELISA로 혈청을 검정하였다.
도 3은 화학요법으로 치료하고 그 다음에 Mtb72f로 면역화시킨, 결핵균 감염된 SWR/J 생쥐에서의 IgG1 및 IgG2a 항체 반응 면역 반응을 보여준다. 생쥐들은 치료를 받지 않거나, 화학요법 치료를 받거나(음료수 리터 당 50㎎ 리팜핀/85㎎ 이소니아지드), 화학요법 치료를 받고 애주번트 AS01B와 함께 제형화된 1회분 당 8㎍의 Mtb72f로 3회 근내 면역화된다. 마지막 면역처치 후 10일째에 생쥐들로부터 채혈하고, IgG1(적색) 및 IgG2a(흑색) 동족체 둘 모두에 대한 항-Mtb72f 항체 반응을 분석하기 위해 ELISA로 혈청을 검정하였다.
도 4는 화학요법으로 치료하고 그 다음에 Mtb72f로 면역화시킨, 결핵균 감염된 SWR/J 생쥐에서의 인터페론-감마(IFN-γ) 반응을 도시한 도면이다. 다양한 시점에 생쥐로부터 비장 세포를 획득하고 기재된 바와 같이 rMtb72f 또는 구성성분들(Mtb32c 및 Mtb39) 중 어느 하나를 1O㎍/㎖ 사용하여 3일간 시험관내에서 자극하였다. 대조군으로써, PPD(3㎍/㎖), BCG 용해물(10㎍/㎖), conA(3㎍/㎖) 또는 단독의 배지를 사용하여 비장림프구(splenocyte) 배양물을 또한 자극시켰다. 그 후 ELISA로 IFN-γ 생성을 측정하였다.
도 5는 화학요법으로 치료하고 그 다음에 Mtb72f로 면역화시킨, 결핵균 감염된 SWR/J 생쥐에서의 IFN-γ 반응을 도시하고 있다. 다양한 시점에 생쥐로부터 비장 세포를 획득하고 기재된 바와 같이 rMtb72f 또는 구성성분들(Mtb32c 및 Mtb39) 중 어느 하나를 10㎍/㎖ 사용하여 3일간 시험관내에서 자극하였다. 대조군으로써, PPD(3㎍/㎖), BCG 용해물(10㎍/㎖), conA(3㎍/㎖) 또는 단독의 배지를 사용하여 비장림프구(splenocyte) 배양물을 자극시켰다. 그 후 ELISA로 IFN-γ 생성을 측정하였다.
도 6은 화학요법으로 치료하고 그 다음에 Mtb72f로 면역화시킨, 결핵균 감염된 SWR/J 생쥐에서의 CD4+ T 세포 및 IFN-γ 사이토카인 반응을 도시하고 있다. 다양한 시점에 생쥐로부터 비장 세포를 획득하고 밤새 시험관내에서 10㎍/㎖ rMtb72f로 자극시켰다. 그런 다음 상기 세포를 CD4 및 IFN-γ에 관한 염색을 실행하였다. 대조군으로써, 비장림프구 배양물을 배지만으로 자극시켰다. 세포내 사이토카인 염색(intracellular cytokine staining, ICS)으로 CD4+ T 세포 특이적 IFN-γ+ 생성을 측정하였다.
도 7은 Mtb 감염 후 120일째에 CD4+ 및 CD8+ T 세포 특이적 IFN-γ+ 생성 수치에 대해 정리한 표를 도시하고 있다. 치료하지 않았거나, 복합 화학요법으로 30일, 60일 또는 90일 치료하였거나, Mtb72f 백신을 위한 애주번트로서 복합 화학요법(combination chemotherapy)으로 치료한 생쥐 군으로부터 비장 세포를 획득하였다. 시험관내에서 밤새 비장림프구를 10㎍/㎖ rMtb72f로 자극시켰다. 그런 다음 상기 세포를 CD4, CD8 또는 IFN-γ에 관한 염색을 실행하였다. 대조군으로써, 또한 비장림프구 배양물을 배지만으로 자극시켰다. 세포내 사이토카인 염색으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포 특이적 IFN-γ+ 생성을 측정하였다.
도 8은 화학요법으로 치료하고 그 다음에 Mtb72f로 면역화시킨, 결핵균 감염된 SWR/J 생쥐의 생존율을 도시하고 있다. 50-100CFU의 MtbH37Rv를 에어로졸을 통해 감염시키고 30일 후 하위그룹의 생쥐를 대상으로 화학요법(음료수 리터 당 50㎎ 리팜핀/85㎎ 이소니아지드)을 개시하였다. 화학요법을 60일간 지속하였다. 화학요법을 처치받은 상기 생쥐들 중 절반을 애주번트 AS01B와 함께 제형화된 1회분 당 8㎍의 Mtb72f로 3회 근육내 면역화시켰다.
도 9는 화학요법제를 처치하고 그 다음에 Mtb72f로 면역화시킨, 결핵균 감염된 SWR/J 생쥐의 생존율을 도시하고 있다. 50-100CFU의 MtbH37Rv를 에어로졸을 통해 감염시키고 30일 후 하위그룹의 생쥐를 대상으로 화학요법(음료수 리터 당 50㎎ 리팜핀/85㎎ 이소니아지드)을 개시하였다. 화학요법을 별개의 생쥐 하위그룹을 대상으로 30일, 60일 또는 90일간 지속하였다. 화학요법을 처치받은 상기 생쥐들 중 절반을 애주번트 AS01B와 함께 제형화된 1회분 당 8㎍의 Mtb72f로 3회 근육내 면역화시켰다.
특정 구체예에 대한 상세한 설명
본 발명은 활동성 또는 비활동성(즉, 잠복성) 마이코박테리움 감염의 재활성화를 치료, 예방, 또는 지연하는데 유용한 Mtb72f 핵산 또는 융합 단백질 및 애주번트를 포함하는 조성물과 상기 조성물의 용도에 관한 방법과 관련되어 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 상기 조성물은 Mtb72f 융합 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편 또는 Mtb72f 융합 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편을 엔코딩 하는 핵산을 포함하는데, 상기 융합 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편은 결핵 군 중의 마이코박테리움 종(예를 들어, 마이코박테리움 튜버큘로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 또는 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum)과 같은 종), 또는 환경적이거나 기회적(opportunistic)이며 면역력이 약화된 숙주(예: AIDS 환자)에서의 폐 감염과 같은 기회 감염(opportunistic infections)을 일으키는 마이코박테리움 종(예를 들어, BCG, 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 인트라셀룰라(M. intracellulare), 마이코박테리움 세라툼(M. celatum), 마이코박테리움 게나벤스(M. genavense), 마이코박테리움 해모필럼(M. haemophilum), 마이코박테리움 칸사시(M. kansasii), 마이코박테리움 시미애(M. simiae), 마이코박테리움 박캐(M. vaccae), 마이코박테리움 포르투이텀(M. fortuitum), 및 마이코박테리움 스크로푸라셈(M. scrofulaceum))으로부터의 구성성분을 지닌다(참조예: Harrison 's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966 (16th ed., Braunwald, et al., eds., 2005)). 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 Mtb72f 융합 폴리펩티드 또는 Mtb72f 융합 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산, 또는 이들의 면역원성 단편을 포함하는 조성물이 결핵균 감염의 재활성화를 치료, 예방, 또는 지연하는데 유용하다는 것을 발견하였다. 바람직한 구체예에서, Mtb72f 융합 폴리펩티드 또는 핵산은 하나 이상의 화학요법제와 함께 투여된다. 이들 조성물, 폴리펩티드, 및 이들을 엔코딩하는 핵산은 그러므로 질병 증상의 재활성화에 대비하여 예방적인 면역반응이 포유동물 내에서 개시되도록 하는데 유용하다.
본 발명의 Mtb72f 핵산 및 융합 폴리펩티드는 이들의 항원성을 증가시키거나 다른 양상에서 이들 항원을 개선하기 위하여 디자인된 다른 구성성분들을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 항원의 한쪽 말단 쪽에 일정 길이의 히스티딘 잔기들을 부가함으로써 융합 폴리펩티드 항원의 동정이 개선될 수 있다. 본 발명의 상기 조성물, 폴리펩티드, 및 핵산은 항원 복제물, 또는 마이코박테리움 종(Mycobacterium sp.)(예컨대, MTB8.4 항원, MTB9.8 항원, MTB9.9 항원, MTB40 항원, MTB41 항원, ESAT-6 항원, MTB85 복합체 항원, α-결정(crystalline) 항원, 또는 NSl 항원)으로부터의 이종유래 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다.
대안으로 또는 부가적으로 본 발명의 상기 조성물, 폴리펩티드, 및 핵산은 Ag85B 또는 MTCC#2와 같은 마이코박테리움 종(Mycobacterium sp.)으로부터의 다른 항원의 복제물을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 조성물, 폴리펩티드, 및 핵산은 또한 다른 기원으로부터의 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 상기 조성물 및 융합 단백질은 항원의 발현을 증가시키는, 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리펩티드 또는 핵산을 포함할 수 있는데, 그러한 예로서, 인플루엔자 바이러스 단백질인, NSl이 있다(참조예: PCT 국제공개공보 WO 제99/40188호 및 WO 제93/04175호). 본 발명의 핵산은 선택된 종(예컨대, 인간)에서의 코돈 선호도에 기초하여 조작될 수 있다.
Mtb72f 융합 단백질 조성물은 대개 하나 이상의 애주번트를 포함하는데, 상기 애주번트의 예로는, AS01B(리포좀 제형 중의 모노포스포릴 리피드 A(MPL) 및 QS21)(참조: 미국 특허 공개공보 제 2003/0143240호); AS02A(3D-MPL 및 QS21 및 수중유 에멀젼)(참조: Bojang, et al, Lancet(2001) 358:1927)); ENHANZYN(Detox); 3D-MPL; 퀼(Quil) A 및 이의 구성성분(예컨대 QS21)을 포함하는 사포닌 및 사포닌 모방체(mimetics); CWS; TDM; AGP; 면역자극 올리고사카라이드(예컨대, CPG); Leif; 및 이들의 유도체가 있다. 바람직한 구체예에서, Mtb72f 융합 폴리펩티드는 리포좀 제형내의 3D-MPL와 QS21(예컨대, AS01B) 및 수중유 에멀젼 중의 MPL와 QS21(예컨대, AS02A)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 애주번트와 함께 투여된다. 애주번트 AS01B 및 AS02A에 대해서는 피크양쿨 등의 논문에 상세히 기술되어 있다(Pichyangkul, et al., Vaccine(2004) 22:3831-40).
Mtb72f 항원을 핵산으로 전달할 때, 상기 핵산은 바이러스 벡터(즉, 아데노바이러스 벡터) 또는 돌연변이 박테리아 숙주 세포(즉, 돌연변이, 비병원성 마이코박테리움, 락토바실러스 또는 바실러스 칼메트-게링(BCG)을 포함하는 바실러스 숙주 세포 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)) 내로 도입되어 전달될 수 있다.
일 양상에서, 상기 조성물은 개체에서의 결핵 재활성화를 예방 또는 치료하기 위한 방법에 사용되는데, 상기 방법은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 이미 감염된 포유동물에게 결핵균 군 중의 마이코박테리움 종으로부터의 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편 및 애주번트를 포함하는 약제 조성물을 면역학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 Mtb72f 융합 단백질이 결핵균에 대한 면역 반응을 유도하며, 그로 인하여 결핵 재활성화가 예방되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 방법을 실시함으로써, 결핵균 감염의 재활성화는 지연될 수 있다(예를 들면, 수개월, 수년 또는 무기한).
일 양상에서, 상기 조성물은 개체에서의 결핵 재활성화를 예방 또는 치료하기 위한 방법에 사용되는데, 상기 방법은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 이미 감염된 포유동물에게 결핵균 군 중의 마이코박테리움 종으로부터의 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 엔코딩하는 핵산을 포함하는 약제 조성물을 면역학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 발현된 Mtb72f 융합 단백질이 결핵균에 대한 면역 반응을 유도하며, 그로 인하여 결핵 재활성화가 예방되는 것을 특징으로 한다.
일 구체예에서, 상기 Mtb72f 핵산 또는 융합 단백질은 활동성 결핵균 감염을 지닌 개체에 투여된다. 일 구체예에서, 상기 Mtb72f 핵산 또는 융합 단백질 비활동성 또는 잠복성 결핵균 감염을 지닌 개체에 투여된다. 일 구체예에서, 상기 Mtb72f 핵산 또는 융합 단백질은 결핵균 중 다-약제 내성 종에 감염된 개체에 투여된다. 일 구체예에서, 상기 Mtb72f 핵산 또는 융합 단백질은 사전에 바실러스 칼메트-게링(BCG)로 면역화된 개체에 투여된다.
몇몇 구체예에서, Mtb72f 핵산 또는 융합 단백질은 결핵균 감염에 대하여 효과적인 하나 이상의 화학요법제와 함께 투여된다. 이러한 화학요법제의 예로는 아미카신, 아미노살리실산, 카프레오마이신, 시클로세린, 에탐부톨, 에티오나미드, 이소니아지드, 카나마이신, 피라지나미드, 리파마이신(즉, 리팜핀, 리파펜틴 및 리파부틴), 스트렙토마이신, 오플로사신(ofloxacin), 시프로플로사신(ciprofloxacin), 클라리스로마이신(clarithromycin), 아지스로마이신(azithromycin) 및 플루오로퀴놀론이 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 이러한 화학요법제는 선호되는 약물 조합을 사용하는 치료담당 내과의사의 판단에 의해 결정된다. 약제 내성이 없는 결핵균 감염을 치료하기 위해 사용되는 "1선(First-line)" 화학요법제는 이소니아지드, 리팜핀, 에탐부톨, 스트렙토마이신 및 피라지나미드를 포함한다. 하나 이상의 "1선" 약제에 대한 약제 내성이 입증된 결핵균 감염을 치료하기 위해 사용되는 "2선(Second-line)" 화학요법제는 옥플로사신, 시프로플로사신, 에티오나미드, 아미노살리실산, 시클로세린, 카나마이신 및 카프레오마이신을 포함한다.
Mtb72f 핵산 또는 융합 단백질은 결핵균 감염에 대하여 효과적인 하나 이상의 화학요법제의 투여 전, 동시 또는 후에 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 Mtb72f 핵산 또는 융합 단백질은 하나 이상의 화학요법제의 투여 개시 후 약 2주가 되는 시점에 투여된다. 상기 하나 이상의 화학요법제는 일반적으로 소정 기간에 걸쳐 투여된다(예를 들면, 약 1, 2, 3, 또는 4주, 2, 3, 4, 5, 6 또는 8개월, 1 년 또는 그 이상).
특정 구체예에서, Mtb72f 핵산 또는 융합 단백질의 효과는 바실러스 칼메트-게링(BCG)과 함께 투여됨으로써 향상된다.
몇몇 구체예에서, Mtb72f 핵산 또는 융합 폴리펩티드의 프라이밍 또는 첫번째 투여 후 Mtb72f 핵산 또는 융합 폴리펩티드의 1회 이상의 "부스팅" 또는 연속 투여가 뒤따른다("프라이밍 및 부스팅" 방법). 예를 들어, Mtb72f 핵산 또는 융합 폴리펩티드를 첫번째로 투여하고 난 다음 후속하여 Mtb72f 핵산 또는 융합 단백질을 1회 이상 연속 투여한다. 일 구체예에서, Mtb72f 핵산 또는 융합 폴리펩티드를 첫번째로 투여하고 난 다음 후속하여 Mtb72f 융합 폴리펩티드를 1회 이상 연속 투여한다. 일 구체예에서, Mtb72f 핵산 또는 융합 폴리펩티드를 첫번째로 투여하고 난 다음 후속하여 Mtb72f 핵산를 1회 이상 연속 투여한다. 대개 상기 첫번째 또는 "프라이밍" 투여 및 두번째 또는 "부스팅" 투여는 약 2-12주 간격으로, 또는 4-6월까지의 간격으로 이루어 진다. 연속 "부스터" 투여는 약 6월 간격으로, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5년 정도의 긴 간격으로 이루어 진다. 통상적인 부스터 처치(예컨대, 단백질 프라미밍 투여후 단백질 부스팅 투여)가 또한 결핵균 재활성화에 대비한 예방 또는 치료에 유용하다.
또 다른 양상에서, 상기 조성물은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 감염에 대비한 화학요법의 경과 시간을 단축시키는 방법에 사용되는데, 상기 방법은 결핵균에 이미 감염된 포유동물에게 결핵균 감염에 효과적인 하나 이상의 화학요법제 및 결핵균 군 중의 마이코박테리움(Mycobacterium) 종으로부터 나온 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편 및 애주번트를 포함하는 면역학적으로 유효한 양의 약제 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 Mtb72f 융합 단백질이 결핵균에 대한 면역 반응을 유도하며, 그로 인하여 결핵균 감염에 대비한 화학요법의 경과 시간이 단축되는 것을 특징으로 한다. 대개, 6월, 5개월, 4개월, 3개월, 또는 이보다 적은 기간 내에 Mtb72f 핵산 또는 융합 폴리펩티드의 투여로 결핵균 감염에 대한 효과적인 화학요법적 치료 효과를 거둘 수 있을 것이다.
Mtb72f 조성물은 일반적으로 인간에게 투여되나, 길든 포유동물(즉, 개, 고양이, 토끼, 래트, 생쥐, 기니피그, 햄스터, 친칠라) 및 농업용 포유동물(즉, 소, 돼지, 양, 염소 말)을 포함한 다른 포유동물에도 효과적이다.
가장 일반적인 측면에서, 본 발명에 따른 Mtb72f 융합 단백질은 적어도 3개의 항원 Ral2-TbH9-Ra35 각각에 대한 면역원성 단편을 포함하는 단백질이다.
본원의 명명법에서, Ra35는 Mtb32A(Ra35FL)의 N-말단을 의미하는데, 결핵균으로부터 유래한 Mtb32A의 처음 약 205개 이상의 아미노산, 미국 특허출원 제 09/597,796호의 도 4에 개시된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열, 또는 또 다른 마이코박테리움 종으로부터의 대응되는 지역을 포함한다. 가장 일반적으로, Ra35는 잔기 535-729에 대응되는 본원에 개시된 서열번호:2의 일부분을 의미한다. 대안으로, 서열번호:2의 잔기 710에 대응되는 아미노산 세린(Ser)이 알라닌(Ala)로 대체된 Ra35의 변이체를 의미한다.
Ral2는 Mtb32A(Ra35FL)의 C-말단을 의미하는데, 결핵균으로부터 유래한 Mtb32A의 마지막 약 132개 이상의 아미노산, 미국 특허출원 제 09/072,967호에 서열번호:4(DNA) 및 서열번호:66(예상되는 아미노산 서열)으로 개시된 서열, 또는 또 다른 마이코박테리움 종으로부터의 대응되는 지역을 포함한다. 가장 일반적으로, Ra35는 잔기 8-139에 대응되는 본원에 개시된 서열번호:2의 일부분을 의미한다.
Mtb39(TbH9)는 본질적으로 미국 특허출원 제 08/658,800호, 제 08/659,683호, 제 08/818,112호, 및 제 08/818,111호와 PCT 국제공개공보 WO 제97/09428호 및 WO 제97/09429호에서 서열번호:106(전장길이 cDNA) 및 서열번호:107(전장길이 단백질)로 개시된 서열을 의미한다. 상기 서열은 또한 미국 특허출원 제 09/056,559호에서 서열번호:33(DNA) 및 서열번호:91(아미노산)로 개시되어 있다. 가장 일반적으로, TbH9은 잔기 143-532에 대응되는 본원에 개시된 서열번호:2의 일부분을 의미한다.
본 발명의 조성물 및 융합 단백질에 사용된 몇몇 개별 항원들의 서열은 하기와 같이 제공된다:
Mtb32A(TbRa35FL 또는 Ra35FL), 미국 특허출원 제 08/523,436호, 08/523,435호, 제 08/658,800호, 제 08/659,683호, 제 08/818,112호, 제 09/056,556호, 및 제 08/818,111호 그리고 PCT 국제공개공보 WO 제97/09428호 및 WO 제97/09429호에서 서열번호:17(cDNA) 및 서열번호:79(단백질)로 개시된 서열(추가 참조: Skeiky et al, Infection and Immunity 67:3998-4007(1999)).
본 발명의 몇몇 융합 단백질의 서열은 하기와 같이 제공된다:
TbH9-Ra35(Mtb59F), 미국 특허출원 제 09/287,849호 및 PCT 국제출원 PCT/US99/07717호에서 서열번호:23(cDNA) 및 서열번호:24(단백질)로 개시된 서열;
Ral2-TbH9-Ra35(Mtb72f), 미국 특허출원 제 09/223,040호 및 PCT 국제출원 PCT/US99/07717호에서 뿐만 아니라, 본원에서 서열번호:1 또는 서열번호:5(DNA) 및 서열번호:2 또는 서열번호:6(단백질)로 개시된 서열. 상기 서열번호:1 및 서열번호:2의 서열은 6개의 히스티딘 잔기로 구성된 히스티딘 태그를 포함한다.
M72, 상기 M72는 서열번호:2의 위치 710에 대응되는 아미노산인 세린 잔기가 알라닌(Ala)으로 변환된(뿐만 아니라 4개의 히스티딘 잔기가 N-말단의 히스티딘-태그로부터 제거됨) Mtb72f의 돌연변이체이며, 본원에서 서열번호:3(DNA) 및 서열번호:4(단백질)로 개시되어 있다. 6개의 히스티딘 잔기로 구성된 히스티딘 태그를 지니는 단백질에서 이러한 서열 변이체는 미국 특허출원 제 09/597,796호 및 PCT 국제출원 PCT/USOl/19959호에 개시되어 있다. Ser710의 Ala로의 대체로 인하여, M72는 Mtb72f보다 자기분해(autolysis)에 대한 저항력이 있는 것으로 여겨진다.
본 발명의 조성물 및 융합 단백질에 사용된 몇몇 추가 항원들의 서열은 하기와 같이 제공된다:
Mtb8.4(DPV), 미국 특허출원 제 08/658,800호, 제 08/659,683호, 제 08/818,112호 및 제 08/818,111호 그리고 PCT 국제공개공보 WO 제97/09428호 및 WO 제97/09429호에 서열번호:101(cDNA) 및 서열번호:102(단백질)로 개시된 서열;
Mtb9.8(MSL), 미국 특허출원 제 08/859,381호, 제 08/858,998호, 제 09/073,009호 및 제 09/073,010호 그리고 국제출원 PCT/US98/10407호 및 PCT/US98/10514호에서 서열번호:12(DNA), 서열번호:109(예상된 아미노산 서열) 및 서열번호:110 내지 124(펩티드)로 개시된 서열;
Mtb9.9A(MTI, MTI-A로도 공지되어 있음), 미국 특허출원 제 08/859,381호, 제 08/858,998호, 제 09/073,009호 및 제 09/073,010호 그리고 국제출원 PCT/US98/10407호 및 PCT/US98/10514호에서 서열번호:3 및 서열번호:4(DNA) 그리고 서열번호:29 및 서열번호:51 내지 66(MTI의 ORF 펩티드)으로 개시된 서열. 2개의 다른 MTI 변이체들이 또한 존재하며, MTI-B와 MTI-C로 불리워진다;
Mtb40(HTCC#1), 미국 특허출원 제 09/073,009호 및 제 09/073,010호 그리고 PCT 국제출원 PCT/US98/10407호 및 PCT/US98/10514호에서 서열번호:137(cDNA) 및 138(예상된 아미노산 서열)로 개시된 서열;
Mtb41(MTCC#2), 미국 특허출원 제 09/073,009호 및 제 09/073,010호 그리고 PCT 국제출원 PCT/US98/10407호 및 PCT/US98/10514호에서 서열번호:140(cDNA) 및 서열번호:142(예상된 아미노산 서열)로 개시된 서열;
ESAT-6, 미국 특허출원 제 09/072,967호에서 서열번호:103(DNA) 및 서열번호:104(예상된 아미노산 서열)로 개시된 서열(상기 ESAT-6호의 서열은 또한 미국 특허 제 5,955,077호에 개시된 서열이다);
α-결정 항원, 버본 등의 문헌에 개시된 서열(Verbon et al ., J. Bad. 174:1352-1359 (1992));
항원 85 복합체(complex), 콘텐트 등의 문헌에 개시된 서열(Content et al ., Infect. & Immunol. 59:3205-3212(1991)).
상기 서열 각각은 또한 콜 등의 문헌 및 인터넷 웹사이트에서도 찾아볼 수 있다(Cole et al., Nature 393:537(1998) 그리고 http://www.sanger.ac.uk 및 http:/www.pasteur.fr/mycdb/).
상기 서열은 미국 특허출원 제 08/523,435호, 08/523,436호, 08/658,800호, 08/659,683호, 08/818,111호, 08/818,112호, 08/942,341호, 08/942,578호, 08/858,998호, 08/859,381호, 09/056,556호, 09/072,596호, 09/072,967호, 09/073,009호, 09/073,010호, 09/223,040호, 09/287,849호 그리고 국제출원 PCT/US98/10407호, PCT/US98/10514호, PCT/US99/03265호, PCT/US99/03268호, PCT/US99/07717호, PCT 국제공개공보 WO 제 97/09428호, WO 제97/09429호, WO 제98/16645호, 및 WO 제98/16646호에 개시되어 있으며, 상기 각각의 문헌들은 본원의 참조로서 여기에 통합된다.
본원에 개시된 항원은 다형적 변이체(polymorphic variants) 및 보존적으로 변형된 변이를 포함하며, 또한 이종간(inter-strain) 및 마이코박테리움 종간 상동체(homologs)를 포함한다. 또한, 본원에 개시된 항원은 부분서열(subsequences) 또는 절단된 서열(truncated sequences)을 포함한다. 상기 융합 단백질은 또한 추가의 폴리펩티드를 포함하며, 마이코박테리움 또는 다른 기원으로부터의 이종유래 펩티드를 포함하거나 포함하지 않는다. 이들 항원은 변형될 수 있는데, 예를 들면, 하기한 바와 같이 링커 펩티드 서열을 부가함으로써 변형될 수 있다. 상기 링커 펩티드는 융합 단백질 각각을 구성하는 하나 이상의 구성성분들 사이에 삽입될 수 있다.
정의
용어 "결핵 재활성화"는 투베르쿨린 시험에서 양성인 것으로 판명되나 명확한 질병 증상을 지니지 않는 개체에서의 질병 증상의 뒤늦은 발현(manifestation)을 의미한다. 상기 개체는 결핵균에 감염되어 있고, 결핵이 비활동성 또는 잠복 상태가 될 정도로 충분히 치료되어 질병 증상이 이전에 활발히 발현되었거나 되지 않았을 수 있다. 결핵 재활성화를 예방 또는 치료하기 위한 방법은 그러나 질병 증상이 활발히 발현된 개체에서 개시될 수 있다.
"1차 결핵"은 결핵균 감염에 직접적으로 뒤따르는 임상적 질병(질병 증상의 발현)을 의미한다. 다음 문헌을 참조하라(Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966(16th ed., Braunwald, et al ., eds., 2005)).
"2차 결핵" 또는 "1차이후(postprimary) 결핵"은 휴지기, 비활동성 또는 잠복성 결핵균 감염의 재활성화를 의미한다. 다음 문헌을 참조하라(Harrison 's Principles of Internal Medicine, 전게서).
"결핵균의 활동성 감염"은 질병 증상이 발현된 결핵균 감염을 의미한다.
"결핵균의 비활동성, 휴지기 또는 잠복성 감염"은 질병 증상의 발현이 없는 결핵균 감염을 의미한다.
"약제 내성" 결핵균 감염은 감염 중인 종이 결핵균 감염을 치료하는데 유효한 하나 이상의 소위 "1선" 화학요법제(예컨대, 이소니아지드, 리팜핀, 에탐부톨, 스트렙토마이신 및 피라지나미드)으로 불활성화되지 않거나 사멸되지 않는(상기 화학요법제에 저항력을 나타냄) 결핵균이 감염된 것을 의미한다.
"다-약제 내성" 결핵균 감염은 감염 중인 종이 결핵균 감염을 치료하는데 유효한 둘 이상의 "1선" 화학요법제에 저항력을 나타내는 결핵균이 감염된 것을 의미한다.
"결핵균 감염 치료에 유효한 화학요법제"는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있고 사용되는 결핵균 감염을 치료하기 위한 약제(pharmacological agents)를 의미한다. 결핵균 감염 치료에 사용되는 예시적인 약제로는 아미카신, 아미노살리실산, 카프레오마이신, 시클로세린, 에탐부톨, 에티오나미드, 이소니아지드, 카나마이신, 피라지나미드, 리파마이신(즉, 리팜핀, 리파펜틴 및 리파부틴), 스트렙토마이신, 오플로사신, 시프로플로사신, 클라리스로마이신, 아지스로마이신 및 플루오로퀴놀론이 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 약제 내성이 없는 결핵균 감염을 치료하기 위해 사용되는 "1선(First-line)" 화학요법제는 이소니아지드, 리팜핀, 에탐부톨, 스트렙토마이신 및 피라지나미드를 포함한다. 하나 이상의 "1선" 약제에 대한 약제 내성이 입증된 결핵균 감염을 치료하기 위해 사용되는 "2선" 화학요법제는 옥플로사신, 시프로플로사신, 에티오나미드, 아미노살리실산, 시클로세린, 카나마이신 및 카프레오마이신을 포함한다. 이러한 약제들에 대해서는 하기 문헌에 고찰되어 있다(Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Chapter 48, Hardman and Limbird eds., 2001).
"FL"은 전장 길이, 즉 폴리펩티드가 야생형 폴리펩티드와 동일한 길이를 갖는다는 것을 의미한다.
"히스티딘 태그"는 N-말단에, 일반적으로 개시 잔기인 메티오닌(Met) 바로 다음에 그렇지 않으면 C-말단에 삽입되는 히스티딘 잔기 가닥(일반적으로 6)을 의미한다. 이들은 일반적으로 천연 서열과 그 기원이 다르나 고정 금속 친화성 크로마토그래피 레진(IMAC)에 대한 단백질 결합을 개선시킴으로써 동정을 용이하게 하기 때문에 (천연 서열에) 통합된다. 일반적으로 말해서 상기 히스티딘 태그의 존재 또는 부재는 개시되어야 하는 항원 단백질에 대한 유용한 면역 반응을 유발시키는지에 관한 관점에서는 그다지 중요하지 않다. 히스티딘 태그 자체에 대한 역 면역반응이 개시되는 경우, 히스티딘 태그의 길이를 최소화하는 것이 최상의 방법인 것으로 여겨진다(예컨대, 4개 또는 그 이하, 바람지직하게는 2개의 잔기).
용어 "이의 면역원성 단편"은 세포독성 T 림프구, 헬퍼 T 림프구 또는 B 세포에 의해 인지되는 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 일반적으로 Mtb72f의 면역원성 단편은 500개 또는 그 이상의 아미노산(예컨대, 600개 또는 그 이상의 아마노산, 예컨대 700개 또는 그 이상의 아미노산)을 포함하는 폴리펩티드일 것이다. 본 발명은 또한 복수의 단편, 예컨대 Mtb72F 융합 단백질 서열의 모든 서열 또는 실질적으로 모든 서열(예컨대, 500개 또는 그 이상의 아미노산, 예컨대, 600개 또는 그 이상의 아미노산, 예컨대, 700개 또는 그 이상의 아미노산)을 함께 커버하는 중첩 단편을 포함한다.
용어 "결핵 군 중의 마이코박테리움 종"은 결핵을 일으키는 것으로 전통적으로 여겨져온 그러한 종과 더불어 또한 마이코박테리움 AIDS 환자와 같은 면역력이 약화된 숙주에서의 결핵 및 폐 질환을 유발시키는 환경성 및 기회성 마이코박테리움 종을 의미하는데, 이러한 종의 예로는 마이코박테리움 튜버큘로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 또는 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum), BCG, 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 인트라셀룰라(M. intracellulare), 마이코박테리움 세라툼(M. celatum), 마이코박테리움 게나벤스(M. genavense), 마이코박테리움 해모필럼(M. haemophilum), 마이코박테리움 칸사시(M. kansasii), 마이코박테리움 시미애(M. simiae), 마이코박테리움 박캐(M. vaccae), 마이코박테리움 포르투이텀(M. fortuitum), 및 마이코박테리움 스크로푸라셈(M. scrofulaceum)이 있다(참조예: Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966(16th ed., Braunwald, et ah, eds., 2005)).
애주번트는 항원에 대한 특이적인 면역 반응을 증가시키는 백신 또는 치료 조성물 내의 구성성분을 의미한다(참조예: Edelman, AIDS Res. Hum Retroviruses 8:1409-1411(1992)). 애주번트는 ThI-유형 및 Th-2 유형 면역반을 유도한다. Thl-유형 사이토카인(예컨대, IFN-γ, IL-2, 및 IL-12)은 투여된 항원에 대한 세포-매개성 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있고, 한편 Th-2 유형 사이토카인(예컨대, IL-4, IL-5, IL-6, IL-1O 및 TNF-β)은 체액성 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있다. Th-I 세포-매개성 면역 반응을 우선 자극할 수 있는 애주번트는 PCT 국제공개공보 WO 제94/00153호 및 WO 제95/17209호에 소개되어 있다.
"핵산"은 단일 또는 이중-가닥 중 어느 한 형태인 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 폴리머를 의미한다. 상기 용어는 합성되거나, 천연적으로 생성되거나, 비-천연적으로 생성되는, 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포괄하는데, 상기 핵산은 대조 핵산과 유사한 결합 특성을 지니며, 대조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사된다. 이러한 유사체의 예로는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNAs)가 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
달리 기재하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명확하게 기재된 서열 뿐만 아니라, 이의 보존적으로 변형된 변이체(예컨대, 축퇴된 코돈 치환) 및 상보 서열을 내재적으로 포함한다. 특히, 축퇴된 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 3번째 위치가 혼재된(mixed) 염기 및/또는 디옥시이노신(deoxyinosine) 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081(1991); Ohtsuka et al., J. Biol . Chem. 260:2605-2608(1985); Rossolini et al., Mol . Cell . Probes 8:91-98(1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드와 호환적으로 사용된다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 의미하며 본원에서 호환적으로 사용된다. 상기 용어는 천연적으로 생성되는 아미노산 폴리머 및 비-천연적으로 생성되는 아미노산 폴리머 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연적으로 생성되는 아미노산에 상응하는 인공 화학 모방체인 아미노산 폴리머에도 적용된다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 아미노산 및 합성 아미노산 이외에 천연적으로 생성되는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 천연적으로 생성되는 아미노산은 유전자 코드에 의해 엔코딩되는 아미노산 이외에 예컨대, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린과 같이 추후에 변형되는 그러한 아미노산이다. 아미노산 유사체는 천연적으로 생성되는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 가지는 화합물, 즉 수소, 카르복시기, 아미노기, 및 R기에 결합된 α 탄소를 가지는 화합물을 의미하는데, 그러한 예로서 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭사이드, 메티오닌 메틸 술포늄이 있다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가지지만, 천연적으로 생성된 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학구조와는 다른 구조를 지니나, 천연적으로 생성되는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화합물을 의미한다.
아미노산은 본원에서 그들의 일반적으로 알려진 3문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회에 의해 권장되는 단일 문자 기호로 기재될 것이다. 이와 유사하게, 뉴클레오티드는 그들의 일반적으로 승인되는 단일 문자 코드로 기재될 것이다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 그러한 핵산 서열을 의미하거나, 상기 핵산이 아미노산 서열을 엔코딩하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여, 무수히 많은 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 대상 단백질을 엔코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두는 아미노산 알라닌을 엔코딩한다. 그래서, 알라닌이 한 코돈에 의해 특정된 모든 위치에서, 상기 코돈은 엔코딩된 폴리펩티드를 변형시키지 아니한 체 상기 기재된 대응 코돈들 중 임의의 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이를 "침묵 변이"라고 하며, 보존적으로 변형된 변이의 일종에 해당한다. 본원에서 폴리펩티드를 엔코딩하는 모든 핵산 서열은 또한 상기 핵산의 가능한 모든 침묵 변이를 기술한다. 통상의 기술자는 핵산에서의 각각의 코돈(통상 메티오닌의 유일한 코돈인, AUG, 및 통상 트립토판의 유일한 코돈인 TGG를 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생산하기 위해 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 각각의 침묵변이는 기재된 각각의 서열에 내재되어 있다.
아미노산 서열과 관련하여, 통상의 기술자는 상기 엔코딩된 서열 내의 임의의 단일 아미노산 또는 아미노산 중 적은 비율을 변형, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가가, 이러한 변형의 결과 임의의 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 대체되는, "보존적으로 변형된 변이체"가 되게 한다는 것을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표가 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체에는 본 발명의 다형적 변이체, 종간 상동체, 및 대립유전자가 배제되지 않으며, 오히려 부가된다.
하기 8개 그룹 각각은 서로에 대하여 보존적으로 치환된 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌 (F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)
(참조예: Creighton, Proteins (1984)).
핵산의 일부분과 관련하여 사용될 때의 용어 "이종유래(heterologous)"는 상기 핵산이 자연에서 서로에 대하여 동일한 유연관계로 발견되지 않는 둘 이상의 부분서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 상기 핵산은 일반적으로 재조합에 의해 생산되는데, 새로운 기능을 갖는 핵산을 만들기 위하여 배열된 서로 관련이 없는 유전자들로부터 유래한 2이상의 서열을 지니며, 그러한 예로서 프로모터는 임의의 기원에서 유래되고 코딩 지역은 또 다른 기원으로부터 유래된 핵산을 들 수 있다. 유사하게, 이종유래 단백질은 상기 단백질이 자연에서 서로에 대하여 동일한 유연관계로 발견되지 않는 둘 이상의 부분서열을 포함한다는 것을 나타낸다(예컨대, 융합 단백질).
"융합 폴리펩티드" 또는 "융합 단백질"은 직접적으로 또는 아미노산 링커를 통해 공유결합적으로 연결된 2이상의 이종유래 마이코박테리움 종 폴리펩티드를 갖는 단백질을 의미한다. 융합 단백질을 이루는 폴리펩티드들은 C-말단에서 C-말단으로, N-말단에서 N-말단으로, 또는 N- 말단에서 C-말단으로 연결될 수 있지만, 일반적으로 C-말단에서 N-말단으로 연결된다. 융합 단백질의 폴리펩티드들은 임의의 순서로 존재할 수 있다. 상기 용어는 또한 융합 단백질을 구성하는 항원의 보존적으로 변형된 변이체, 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이, 부분서열, 및 종간 상동체를 의미한다. 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원은 콜 등의 논문(Cole et al., Nature 393:537(1998))에 소개되어 있는데, 상기 논문은 마이코박테리움 튜버큘로시스의 전체 게놈을 개시하고 있다. 마이코박테리움 튜버큘로시스의 완전한 서열은 또한 인터넷 웹사이트(http://www.sanger.ac.uk 및 http://www.pasteur.fr/mycdb/(MycDB)에서 찾아볼 수 있다. 본원에 소개된, 서열 비교 알고리즘, 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 다른 방법(예컨대, 혼성화 분석 및 항체 결합 분석)을 사용하여, 결핵균 항원에 대응하는 다른 마이코박테리움 종으로부터의 항원을 찾아낼 수 있다.
본 발명의 용도로 사용되는 예시적인 Mtb72f 융합 단백질로서 하기 단백질들이 포함된다:
서열번호:2의 서열 중 잔기 8-729를 포함하는 단백질;
서열번호:2(=Mtb72f)의 서열 중 잔기 2-7이 되는 히스티딘 태그 또는 다른 길이의 히스티딘 태그를 가지거나 가지지 않는 서열번호:2의 서열로 구성되거나 이를 포함하는 단백질;
하나 이상의 결핵균(M. tuberculosis) 항원(예를 들면, 상기 단락 [0045] 내지 [0052]에 나열된 단백질들 중 하나 이상, 또는 상기 단백질들 중 임의의 단백질의 면역원성 단편)과 함께 서열번호:2의 서열 중 잔기 2-7이 되는 히스티딘 태그 또는 다른 길이의 히스티딘 태그를 가지거나 가지지 않는 서열번호:2의 서열을 포함하는 융합 단백질(예컨대, 서열번호:2의 서열 중 잔기 8-729를 포함하는 단백질);
서열번호:4(=M72)의 서열 중 잔기 4-725를 포함하는 단백질;
서열번호:4(=M72)의 서열 중 잔기 2-3이 되는 히스티딘 태그 또는 다른 길이의 히스티딘 태그를 가지거나 가지지 않는 서열번호:4의 서열로 구성되거나 이를 포함하는 단백질; 및
하나 이상의 결핵균(M. tuberculosis) 항원(예를 들면, 상기 단락 [0045] 내지 [0052]에 나열된 단백질들 중 하나 이상, 또는 상기 단백질들 중 임의의 단백질의 면역원성 단편)과 함께 서열번호:4의 서열 중 잔기 2-3이 되는 히스티딘 태그 또는 다른 길이의 히스티딘 태그를 가지거나 가지지 않는 서열번호:4의 서열을 포함하는 융합 단백질(예컨대, 서열번호:4의 서열 중 잔기 4-725를 포함하는 단백질).
본 발명의 용도로 사용되는 Mtb72f 융합 단백질의 예시적인 면역원성 단편으로서 하기 단백질들이 포함된다:
TbH9-Ra35(Mtb59F); 또는 TbH9; 또는 Ra35; 또는 Ral2의 서열로 구성되거나 이를 포함하는 단백질; 및
하나 이상의 결핵균(M. tuberculosis) 항원(예를 들면, 상기 단락 [0045] 내지 [0052]에 나열된 단백질들 중 하나 이상, 또는 상기 단백질들 중 임의의 단백질의 면역원성 단편)과 함께 상기 서열을 포함하는 융합 단백질.
본 발명의 용도로 사용되는 Mtb72f 융합 단백질의 예시적인 면역원성 단편으로서 하기 단백질들이 추가로 포함된다:
서열번호:2의 Ser710에 대응하는 위치가 알라닌(Ala)으로 변경된, TbH9-Ra35(Mtb59F) 또는 Ra35의 서열로 구성되거나 이를 포함하는 단백질; 및
하나 이상의 결핵균(M. tuberculosis) 항원(예를 들면, 상기 단락 [0045] 내지 [0052]에 나열된 단백질들 중 하나 이상, 또는 상기 단백질들 중 임의의 단백질의 면역원성 단편)과 함께 상기 서열을 포함하는 융합 단백질.
보다 구체적으로 Mtb72f는 다음과 같다:
서열번호:2의 잔기 8-729를 포함하는 폴리펩티드; 또는
개시 잔기 메티오닌(Met) 바로 다음에 삽입되는 히스티딘 태그를 가지거나 가지지 않으면서 서열번호:2의 잔기 1 및 8-729로 구성된 폴리펩티드; 또는
서열번호:2의 폴리펩티드; 또는
서열번호:4의 잔기 4-725를 포함하는 폴리펩티드; 또는
개시 잔기 메티오닌(Met) 바로 다음에 삽입되는 히스티딘 태그를 가지거나 가지지 않으면서 서열번호:4의 잔기 1 및 4-725로 구성된 폴립펩티드; 또는
서열번호:4의 폴리펩티드; 또는
서열번호:6의 폴리펩티드.
Mtb72f 융합 단백질 및 이의 면역원성 단편의 추가적인 예시는 상기 언급된 단백질의 N- 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기가, 예를 들어 5개 또는 4개 또는 3개 또는 2개 또는 1개 짧아진 단백질을 포함한다.
Mtb72f 융합 단백질 및 이의 면역원성 단편의 추가적인 예시는 상기 언급된 단백질의 아미노산이 10%까지, 예를 들어, 5%까지(예컨대 아미노산 10개까지, 예컨대 아미노산 5개까지) 본원에 정의된 보존적 치환으로 교체된 단백질을 포함한다.
본 발명의 용도로 사용되는 Mtb72f 핵산의 예시는 상기 언급된 예시적인 Mtb72f 융합 단백질 및 이의 면역원성 단편을 엔코딩하는 핵산(예컨대, DNA 분자)를 포함한다. 언급될 수 있는 특정 DNA 분자 세트는 서열번호:1의 뉴클레오티드 63-2228을 포함한다. 언급될 수 있는 또 다른 특정 DNA 분자 세트는 서열번호:3의 뉴클레오티드 10-2175을 포함한다. 언급될 수 있는 특정 DNA 분자는 서열번호:1 또는 서열번호:3 또는 서열번호:5으로 구성되거나 이를 포함한다.
용어 "융합된"은 융합 단백질내의 두 폴리펩티들 간의 공유결합적 연결을 의미한다. 상기 폴리펩티드는 일반적으로 펩티드 결합을 통해 연결되는데, 서로 직접적으로 연결되거나 아미노산 링커를 통해 연결된다. 대안으로, 상기 펩티드는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 비공유결합성 연결을 통해 결합될 수 있다.
어구 "~에 선택적으로 (또는 특이적으로) 혼성화하다"는 상기 서열이 혼재된 혼합물(예컨대, 세포성 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA 전체) 내에 존재할 때, 스트린전시한 혼성화 조건하에서 임의의 분자가 특정 뉴클레오티드 서열에 대해서만 결합, 이중나선화(duplexing), 또는 혼성화된다는 것을 의미한다.
어구 "스트린전시한 혼성화 조건"은 프로브가 일반적으로 혼재된 핵산 혼합물내에 존재하는 그 밖의 다른 서열과는 혼성화되지 아니하나, 그의 표적 부분서열에 혼성화될 조건을 의미한다. 스트린전시한 조건은 서열-의존적이며 상황에 따라 달라질 것이다. 길이가 긴 서열은 특이적으로 보다 높은 온도에서 혼성화된다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 다음 문헌에 소개되어 있다(Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology?Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of 핵산 assays" (1993)). 일반적으로, 스트린전시한 조건은 규정된 이온 강도 pH에서 특정 서열의 해리온도(thermal melting point, Tm) 보다 약 5-1O℃ 더 낮은 온도가 되도록 설정된다. 상기 Tm은 (규정된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도하) 평형상태에서 표적에 상보적인 프로브의 50%가 표적 서열에 혼성화하는 온도이다(상기 표적 서열이 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서, 상기 프로브의 50%는 평형상태를 점하게 된다). 스트린전시한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 나트륨 이온 1.0M 이하, 일반적으로 나트륨 이온(또는 다른 염) 약 0.01 내지 1.0M이고 온도가 길이가 짧은 프로브(예컨대, 뉴클레오티드 10 내지 50개)의 경우 3O℃이상이며 길이가 긴 프로브(예컨대, 50개 이상의 뉴클레오티드)의 경우 6O℃ 이상이다. 스트린전시한 조건은 또한 포름아미드와 같은 불안정화제(destabilizing agents)의 첨가로 마련될 수 있다.
선택적 또는 특이적 혼성화의 경우, 양(positive)의 신호는 백그라운드의 2배 이상, 경우에 따라서 10배의 백그라운드 혼성화이다. 스트린전시한 혼성화 조건의 예시는 다음과 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5x SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 배양, 또는, 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 배양, 65℃에서 0.2x SSC, 및 0.1% SDS로 세척.
핵산이 엔코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다면, 스트린전시한 조건하에서 서로 혼성화되지 않는 핵산은 그럼에도 불구하고 여전히 실질적으로 동일하다. 예를 들면, 핵산의 임의의 복제물이 유전자 코드상 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 활용하여 제작될 때, 이러한 경우가 발생한다. 이 경우, 상기 핵산은 일반적으로 적당히 스트린전시한 혼성화 조건하에서 혼성화된다. 예시적인 "적당히 스트린전시한 혼성화 조건"은 37℃에서 40% 포름아미드, 1M NaCl, 1% SDS 버퍼 중에서 혼성화, 및 40℃에서 1X SSC 세척을 포함한다. 양성 혼성화는 2배 이상의 백그라운드가 된다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 유사한 스트린전시 조건을 제공하기 위하여 대안적인 혼성화 및 세척 조건을 이용할 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다.
"항체"는 항원을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편으로부터의 골격부(framework region)를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 공인된 면역글로불린 유전자는 무수한 면역글로불린 가변 지역 유전자 뿐만 아니라, 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 뮤 불변 지역 유전자를 포함한다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되는데, 차례로 면역글로불린 클래스, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 각각 정의된다.
예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 4량체를 포함한다. 각각의 4량체는 2쌍의 동일한 폴리펩티드 사슬로 구성되는데, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄(약 25 kDa)" 및 하나의 "중쇄(약 50-70 kDa)"를 지닌다. 상기 각 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식에 관여하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 지역으로 정의된다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 각각 상기 경쇄 및 중쇄를 의미한다.
항체는 예를 들어, 온전한 면역글로불린 또는 다양한 펩티다아제에 의한 분해로 생산되는 잘-특성결정된 수많은 단편으로서 존재한다. 그래서, 예를 들면, 펩신은 힌지 지역의 디술파이드 연결을 분해하여 F(ab)'2를 생산하며, 상기 항체는 그 자체가 디술파이드 결합에 의해 경쇄가 VH-CH1에 연결된 Fab의 이합체이다. 상기 F(ab)'2는 인지 지역내의 디술파이드 연결을 깨뜨리기 위해 온순한 조건하에서 환원될 수 있으며, 그로 인하여 F(ab)'2 이합체가 Fab' 단량체로 전환된다. 상기 Fab' 단량체는 힌지 지역의 일부를 필수적으로 지니는 Fab이다(참고: Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993)). 온전한 항체 분해에 관한 측면에서 다양한 항체 단편이 정의될지라도, 통상의 기술자는 이러한 단편들이 화학적으로 또는 재조합방법론으로 새로이(de novo) 합성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본원에 사용된 것과 같은, 용어 항체는 또한 전체 항체의 변형에 의해 생산된 항체 단편, 재조합 DNA 방법론을 사용하여 새로이 합성된 항체 단편(예컨대, 단일 사슬 Fv), 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 동정된 항체 단편(참조예: McCafferty et al., Nature 348:552-554(1990))을 포함한다.
단일클론 항체 또는 폴리클론항체의 제조와 관련하여, 본 발명이 속하는 기술분야의 임의의 공지된 기술을 사용할 수 있다(참조예: Kohler & Milstein, Nature 256:495-497(1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72(1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(1985)). 단일 사슬 항체를 생산하기 위한 기술(미국 특허 제 4,946,778호)이 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 생산하기 위해 채용될 수 있다. 또한, 인간화된 항체를 생산하기 위해 형질전환 생쥐(transgenic mice), 또는 그 외의 포유동물과 같은 다른 개체를 사용할 수 있다. 대안으로, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이형(heteromeric) Fab 단편을 동정하기 위해 파지 디스플레이 기술을 사용할 수 있다(참조예: McCafferty et al., Nature 348:552-554(1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783(1992)).
단백질 또는 펩티드를 설명할 때, 어구 항체에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합한다" 또는 "~와 특이적으로 (또는 선택적으로) 면역반응한다"는 이종유래 단백질 및 다른 생물제제(biologics) 집단 내의 단백질의 존재를 확인시키는 결합 반응을 의미한다. 따라서, 지정된 면역검정 조건하에서, 특화된 항체는 특정 단백질에 2배 이상의 백그라운드로 결합하며 샘플내에 존재하는 상당량의 다른 단백질에는 실질적으로 결합하지 않는다. 이러한 조건하에서 항체에 대한 특이적인 결합은 특정 단백질에 대한 항체의 특이성으로 인하여 선별된 항체를 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질과 관련하여 제조된(raised) 폴리클론 항체는 융합 단백질과 특이적으로 면역반응하지만 융합 단백질의 개별 구성요소들과는 면역반응하지 않는 그러한 폴리클론 항체만들 획득하기 위해 선별될 수 있다. 이러한 선별은 개별 항원에 교차 반응하는 항체들을 감별하여 제거함으로써 달성될 수 있다. 특정 단백질에 특이적으로 면역반응하는 항체를 선별하기 위해 다양한 면역검정 포맷을 사용할 수 있다. 예를 들면, 임의의 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선별하기 위해 고체-상 ELISA 면역검정이 일반적으로 사용된다(참조예: Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual(1988) and Using Antibodies: A Laboratory Manual(1998), for a description of immunoassay formats and conditions that can be used to determine specific immunoreactivity). 일반적으로 특이적 또는 선택적 반응은 2배 이상의 백그라운드(신호 대 잡음비)가 될 것이고 보다 일반적으로는 10 내지 100배 이상의 백그라운드가 될 것이다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열(즉, 개별 항원 또는 이의 일부분을 엔코딩하는 내생성 서열) 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드와 대비하여, 엔코딩된 융합 폴리펩티드의 생물학적 활성이 감소되지 않는 그러한 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 변이체는 천연 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 약 80% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 약 90%이상의 동일성을 나타낸다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서, 용어 "동일한" 또는 "동일성" 비율(percent)은 동일하거나 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 특정 비율(즉, 특정된 지역에 걸쳐 70% 동일성, 경우에 따라서 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성)로 지니는 2이상의 서열 또는 부분서열을 의미하는데, 상기 비율은 비교창 상에서 최대 일치도로 교 및 정렬될 때, 또는 지정된 지역이 하기 서열 비교 알고리즘 중 어느 하나를 사용하거나 수동 정렬 및 시각적 감시에 의하여 측정될 경우에 나타나는 비율이다. 그래서 이러한 서열은 "실질적으로 동일한" 서열인 것으로 일컬어 진다. 이러한 정의는 또한 시험 서열의 컴플리먼트를 의미한다. 경우에 따라, 상기 동일성은 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이가 약 25 내지 약 50개 이상, 또는, 경우에 따라, 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이가 75-100인, 지역 전반에 걸쳐 존재한다.
서열 비교의 경우, 일반적으로 임의의 한 서열이 대조서열(reference sequence)로 역할을 하는데, 상기 서열과 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 경우, 시험 및 대조서열이 컴퓨터에 입력되고, 부분서열 변수가(필요한 경우) 지정되며, 서열 알고리즘 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용하거나 대안적인 파라미터를 지정할 수 있다. 그런 다음 상기 서열 비교 알고리즘이 프로그램 파라미터에 근거하여, 대조 서열과 대비하여 시험 서열의 서열 동일성 비율을 계산한다.
본원에서 사용된, "비교창"은 25 내지 500개, 일반적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150개로 구성된 군에서 선택된 연속된 위치의 상기 수치들 중 임의의 수의 세그먼트에 대한 대조를 포함하는데, 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 임의의 서열이 연속된 위치의 동일한 수의 대조서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 최적 서열 정렬은, 예를 들어, 스미스와 워터만의 로컬 호모로지 알고리즘(Smith & Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482(1981)), 니들만과 분쉬의 호모로지 정렬 알고리즘(Needleman & Wunsch, J. MoI . Biol. 48:443(1970)), 피어슨과 림프만의 유사성 조사 방법(Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)), 이러한 알고리즘들의 전산화된 실행(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 수동 정렬 및 시각 감시(참조예: Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., eds. 1995 supplement))에 의해 수행될 수 있다.
유용한 알고리즘의 일예로 PILEUP이 있다. PILEUP은 유연관계(relationship) 및 서열 동일성 비율을 제시하기 위하여 연속(progressive), 짝짖기방식(pairwise) 정렬을 사용하여 관련 서열 그룹으로부터 다수의 서열 정렬을 생성시킨다. 상기 알고리즘은 또한 상기 정렬을 생성시키기 위해 사용된 클러스터링 유연관계를 제시하는 트리 또는 덴도그램을 도시한다. PILEUP은 펭과 두리틀의 단순화한 연속 정렬 방법을 사용한다(Feng & Doolittle, J. MoI . Evol. 35:351-360(1987)). 사용된 방법은 히긴스와 샤프에 의해 개시된 방법과 유사하다(Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153(1989)). 상기 프로그램은 서열을 300개까지 정렬할 수 있는데, 상기 서열 각각은 최대 길이가 뉴클레오티드 또는 아미노산 5,000개이다. 다중 정렬 절차는 두개의 가장 유사한 서열들을 짝짖기방식으로 정렬시킴으로써 개시되는데, 이는 두개의 정렬된 서열 클러스터를 생산한다. 그 다음에 상기 클러스터는 그 다음으로 가장 관련있는 서열 또는 정렬된 서열의 클러스터과 정렬된다. 2개의 서열 클러스터들은 2개의 개별 서열에 대한 짝짖기방식 정렬의 단순 확대에 의해 정렬된다. 최종 정렬은 일련의 연속된, 짝짖기방식 정렬에 의해 달성된다. 상기 프로그램은 특정 서열과 서열 비교 지역을 위한 상기 특정 서열의 아미노산 또는 뉴클레오티드 좌표를 지정함으로써 그리고 프로그램 파라미터들을 지정함으로써 구동된다. PILEUP을 사용할 때, 서열 상동성 유연관계 비율을 계산하기 위하여 대조서열을 다른 시험서열과 비교하는데, 다음 파라미터들을 사용한다: 디폴트 갭 하중(3.00), 디폴트 갭 길이 하중(0.10), 및 가중된 엔드 갭. PILEUP은 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 예컨대, 버전 7.0(Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395(1984))로부터 입수할 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 비율을 측정하는데 적당한 또 다른 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘인데, 상기 알고리즘들은 앨트슐 등의 논문에 각각 소개되어 있다(Altschul et al., Nuc . Acids Res. 25:3389-3402(1977) 및 Altschul et al., J. MoI . Biol. 215:403-410(1990)). BLAST 분석을 실행하기 위한 소프트웨는 생물공학 정보를 위한 국제센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 이용할 수 있다. 상기 알고리즘은 제일 먼저 분석요청(query) 서열 중 길이 W의 짧은 워드들(words)을 확인하여 높은 수치를 기록하는 서열쌍(high scoring sequence pairs, HSPs)을 식별하는 단계를 포함하는데, 상기 분석요청 서열은 데이터베이스 서열 중 동일 길이의 워드와 정렬시킬 때, 소정의 양의 값으로 매겨지는(positive-valued) 상한값(threshold) 스코어 T와 일치하거나 이를 충족시킨다. T는 근접(neighborhood) 워드 스코어 상한값을 의미한다(Altschul et al., 전게서). 상기 최초의 근접 워드 히트(hits)는 이들을 포함하는 더 긴 HSP들을 발견하기 위하여 검색을 개시하는 동안 기초자료(seeds)로 활용된다. 상기 워드 히트는 가능한 멀리 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있도록 하기 위해 각 서열을 따라 양 방향으로 신장된다. 누적 스코어는, 뉴클레오티드 서열의 경우, 파라미터 M(매칭되는 잔기 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 > 0) 및 N(매칭되지 않는 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 상기 누적 스코어를 계산하기 위해 스코어링 매트릭스가 사용된다. 각 방향으로 진행되는 상기 워드 히트의 신장은 다음 경우에 정지된다: 상기 누적 정렬 스코어가 그의 최대 도달값으로부터 X 양(quantity)까지 떨어질 때; 하나 이상의 네거티브-스코어링 잔기 정렬의 축적으로 인해, 상기 누적 스코어가 0 또는 그 이하가 될 때; 또는 어느 한쪽 서열의 말단에 도달할 때. 상기 BLAST 알고리즘의 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열에 관한 프로그램)은 워드길이(W) 11, 기대값(E) 10, M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 디폴트로 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 워드길이 3, 및 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(참조: Henikoff & Henikoff, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 89:10915(1989)) 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M=5, N=-4, 및 양 가닥의 비교를 디폴트로 사용한다.
상기 BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석도 실행한다(참조예: Karlin & Altschul, Proc . Natl Acad . Sci. USA 90:5873-5787(1993)). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성에 대한 한 가지 척도는 최소 확률 합계(smallest sum possibility, P(N))인데, 이는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 발생할 확률에 대한 지표를 제공한다. 예를 들어, 대조핵산과 시험핵산을 비교하여 상기 최소 확률 총계가 약 0.2, 바람직하게는 약 0.01, 가장 바람직하게는 약 0.001 이하이면, 임의의 핵산이 대조서열과 유사한 것으로 간주된다.
폴리뉴클레오티드 조성물
본원에 사용된, 용어 "DNA 세그먼트" 및 "폴리뉴클레오티드"는 특정 종의 전체 게놈 DNA에서 유리되어 동정된 DNA 분자를 의미한다. 그러므로, 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 세그먼트는 하나 이상의 코딩 서열을 포함하지만, 상기 DNA 세그먼트가 수득되는 종의 전체 게놈 DNA로부터 떨어져 나와 실질적으로 동정되거나 유리되어 정제된 DNA 세그먼트를 의미한다. 용어 "DNA 세그먼트" 및 "폴리뉴클레오티드"에는 DNA 세그먼트들 및 이러한 세그먼트들의 더 작은 단편들, 및 또한, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 파지, 바이러스 등을 포함하는 재조합 벡터가 포함된다.
본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이지만, 본 발명의 상기 DNA 세그먼트들은 단백질, 폴리뉴클레오티드들, 펩티드 등을 발현하거나 발현하기 위해 채택될 수 있는 게놈 서열, 잉여-게놈(extra-genomic) 및 플라스미드-엔코딩 서열 및 더 작은 조작된 유전자 세그먼트를 포함할 수 있다. 상기 세그먼트들은 천연적으로 동정되거나, 인간의 손에 의해 합성적으로 변형될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "동정된"은 폴리뉴클레오티드가 다른 코딩 서열과 실질적으로 분리되어 있고, DNA 세그먼트가 거대 염색체 단편 또는 다른 기능 유전자 또는 폴리펩티드 코딩 지역과 같은, 관련이 없는 코딩 DNA의 거대한 일부분을 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 물론, 상기 용어는 최초로 동정된 것과 동일한 DNA 세그먼트를 의미하며, 인간의 손에 의해 세그먼트에 추후 부가된 유전자 또는 코딩 지역을 배제하지 않는다.
통상의 기술자가 인지하고 있을 것이지만, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있으며, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 내포하며 일-대-일로 DNA 분자에 상보적으로 결합하는 HnRNA 분자 및 인트론을 내포하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가적인 코딩 또는 논-코딩 서열이, 그럴 필요는 없으나, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있으며, 폴리뉴클레오티드는, 그럴 필요는 없으나, 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열(즉, 마이코박테리움 항원 또는 이의 일부분을 엔코딩하는 내생 서열) 또는 상기 서열의 변이체, 또는 생물학적 또는 항원적 기능 동등체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 하나 또는 그 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있는데, 이는 하기에 더 자세히 기술되어 있으며, 바람직하게는 천연 종양 단백질과 비교하여, 엔코딩된 폴리펩티드의 면역원성이 감소되지 아니하는 그러한 변이체이다. 엔코딩된 폴리펩티드의 면역원성에 대한 영향은 일반적으로 본원에 기술된 것과 같은 방법으로 평가될 수 있다. 용어 "변이체"는 또한 이종유래 상동 유전자를 포함한다.
추가 구체예에서, 본 발명은 여기서 개시한 하나 이상의 서열과 동일하거나 이에 상보적인 다양한 길이의 연속된 서열을 포함하는 동정된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어, 본 발명에 의하면, 여기에 개시된 하나 이상의 서열 중 약 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 1000개 이상의 연속된 뉴클레오티드 뿐만 아니라 상기 제시된 수치 사이의 모든 중간 길이(intermediate lengths)의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 본원의 문맥에서, "중간 길이"는 상기 제시된 수치 사이의 임의의 길이를 의미하는데, 예컨대 16, 17, 18, 19 등; 21, 22, 23, 등; 30, 31, 32 등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등; 200-500 사이의 모든 정수; 500-1,000 등이다.
코딩 서열 그 자체의 길이에 관계없이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 단편은, 예컨대 프로모터, 폴리아데닐화 시그널, 부가된 제한효소부위, 다중클로닝부위, 다른 코딩 세그먼트 등과 같은, 다른 DNA 서열과 결합될 수 있는데, 상기 폴리뉴클레오티드들은 그 길이가 상당히 다를 수 있다. 그러므로 거의 모든 길이의 핵산 단편을 채택할 수 있다는 것이 예견되며, 전체 길이는 제조의 편리 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 용도에 의해 제한되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 전체 길이가 약 10,000, 약 5000, 약 3000, 약 2,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50 염기쌍 등의 길이인 예시적인 DNA 세그먼트(모든 중간 길이를 포함)가 본 발명의 많은 실시에 있어서 유용할 것으로 예상된다.
더욱이, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는, 유전자 코드 축퇴성의 결과로서, 여기에 기술된 것과 같은 폴리펩티드를 엔코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드들 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 최소의 상동성을 지닌다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용빈도의 차이로 인하여 달라지는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에서 구체적으로 예상되는데, 예를 들어, 인간 및/또는 영장류 코돈 선택을 위해 최적화된 폴리뉴클레오티드가 예상된다. 더 나아가, 본 발명의 영역내에는 여기서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자가 포함된다. 대립유전자는 예컨대, 뉴클레오티드의 결실, 부가 및/또는 치환과 같은 하나 이상의 돌연변이의 결과로서 변형되는 내생성 유전자이다. 그 결과 생성되는 mRNA 및 단백질은, 그럴 필요는 없으나, 변형된 구조 또는 기능을 갖게 된다. 대립유전자는 표준 기술(예컨대, 혼성화, 증폭 및/또는 데이타베이스 서열 비교)을 사용하여 확인될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 동정 및 특성결정
폴리뉴클레오티드는 잘-확립되어 있는 다양한 기술들 중 어느 하나를 사용하여 동정, 제조 및/또는 조작될 수 있다. 예를 들어, 하기에 보다 상세히 기술된 바와 같이, 종양-연관 발현(즉, 본원에서 제공된 대표적인 검정법을 사용하여 측정할 때, 정상 조직에서 보다 종양에서 2배 이상 더 많이 발현)에 대한 cDNA 마이크로어레이 스크리닝에 의해, 폴리뉴클레오티드를 동정할 수 있다. 상기 스크리닝은 예를 들어, 제조업자의 사용지침(및 본질적으로는 쉐나 등의 논문(Schena et al ., Proc. Natl . Acad . Sci. USA 93:10614-10619(1996)) 및 헬러 등의 논문(Heller et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 94:2150-2155(1997))에 소개된 지침)에 따라 신테니(Synteni) 마이크로어레이(Palo Alto, CA)를 사용하여 수행될 수 있다. 대안으로, 예컨대, 결핵균(M. tuberculosis) 세포와 같이, 본원에 기술된 단백질을 발현하는 세포로부터 제조된 cDNA로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 증폭할 수 있다. 이러한 접근방법과 관련하여, 서열-특이적 프라이머를 본원에서 제공된 서열에 근거하여 디자인할 수 있으며, 구매하거나 합성할 수 있다.
잘 알려져 있는 기술을 사용하여 적당한 라이브러리(예를 들어, 결핵균 cDNA 라이브러리)로부터 전장길이 유전자를 동정하기 위해 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 증폭된 부분을 사용할 수 있다. 이러한 기술 내에서, 증폭을 위하여 적당한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머를 사용하여 라이브러리(cDNA 또는 게놈)를 스크리닝한다. 바람직하게는, 라이브러리가 거대 분자를 포함하도록 하기 위해 크기별로 선별된다. 유전자의 5' 및 상류 지역을 확인하기 위해 무작위 프라이밍된 라이브러리가 또한 선호될 수 있다. 게놈 라이브러리가 인트론 획득 및 5' 서열 신장을 위해 선호된다.
혼성화 기술에 관해서는, 공지된 기술(예컨대, 닉(nick)-번역 또는 32P를 이용한 말단-표지에 의해)을 사용하여 서열을 부분적으로 표지할 수 있다. 그런 다음 일반적으로 변성(denaturation)된 박테리아 콜로니(또는 파지 플라크를 포함하는 론(lawns))를 포함하는 필터를 표지된 프로브와 혼성화시켜 박테리아 또는 박테리오파지 라이브러리를 스크리닝한다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1989)). 혼성화된 콜로니 또는 플라크가 선별되고 증식되고, 추후 분석을 위해 DNA가 동정된다. 예를 들어, 서열의 일부분으로부터 획득한 프라이머 및 벡터로부터 획득한 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 cDNA 클론을 분석하여 부가적인 서열의 양을 측정할 수 있다. 하나 이상의 중첩되는 클론을 동정하기 위하여 제한효소 지도와 부분 서열을 제작할 수 있다. 그런 다음 표준 기술을 사용하여 완전한 서열을 결정할 수 있는데, 상기 기술은 일련의 결실 클론을 생성시키는 것을 포함할 수 있다. 그 결과 획득되는 중첩 서열은 이후 연속된 단일 서열로 조립될 수 있다. 공지의 기술을 사용하여, 적당한 단편들을 라이게이션시킴으로써 전장-길이 cDNA 분자를 제작할 수 있다.
대안으로, 일부분의 cDNA 서열로부터 전장길이 코딩 서열을 획득하기 위한 수많은 증폭 기술들이 존재한다. 상기 기술들에서, 증폭은 일반적으로 PCR을 통해 수행된다. 상기 증폭 단계를 수행하기 위해 상업적으로 가용한 다양한 키트들 중 임의의 어느 하나를 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 소프트웨어를 사용하여 프라이머를 디자인할 수 있다. 22-30 뉴클레오티드 길이이고, 50% 이상의 GC 함량을 지니며, 68℃ 내지 72℃의 온도에서 표적 서열과 어닐링하는 프라이머가 바람직하다. 증폭된 지역은 상기에 기술한 것과 같이 시퀀싱될 수 있고, 중첩 서열들은 연속된 서열로 조립될 수 있다.
이러한 증폭 기술 중 하나가 인버스(inverse) PCR(참조: Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186(1988))인데, 상기 PCR은 유전자의 공지된 지역내의 단편을 생성시키기 위해 제한 효소를 사용한다. 이후 상기 단편은 분자내 라이게이션에 의해 환상화(circularization)되며, 상기 공지된 지역으로부터 유래한 다양한(divergent) 프라이머와 함께 PCR용 주형으로 사용된다. 대안적인 접근방법의 범위 내에서, 일부분의 서열에 인접한 서열을 링커 서열에 대한 프라이머 및 공지된 지역에 특이적인 프라이머를 이용한 증폭에 의해 회수할 수 있다. 공지된 서열로부터 반대 방향으로 신장이 개시되는 두개의 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는, 상기 절차를 변형시킨 방법이 PCT 국제공개공보 WO 제96/38591호에 개시되어 있다. 또 다른 기술이 알려져 있는데, "cDNA 말단의 급속 증폭법" 또는 RACE이다. 이 기술은, 공지된 서열의 5' 및 3'에 존재하는 서열을 확인하기 위해, 내재성(internal) 프라이머 및 외래성(external) 프라이머를 사용하는 것을 포함하며, 상기 프라이머는 폴리(poly)A 지역 또는 벡터 서열에 혼성화된다. 추가적인 기술로서 캡쳐(capture) PCR(Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19(1991)) 및 워킹(walking) PCR(Parker et al., Nucl . Acids . Res. 19:3055-60(1991))이 포함된다. 또한 전장 길이 cDNA 서열을 획득하기 위해 증폭을 이용하는 다른 방법을 사용할 수 있다.
특별한 경우, 발현 서열 태그(expressed sequence tag, EST) 데이터베이스에서 제공되는 서열 분석에 의해 전장길이 cDNA 서열을 획득하는 것이 가능한데, 예컨대 GenBank를 이용할 수 있다. 일반적으로 공지의 프로그램(예컨대, NCBI BLAST 검색)을 사용하여 중첩되는 EST에 관한 검색을 수행할 수 있으며, 연속된 전장길이 서열을 생성하기 위해 이러한 EST를 사용할 수 있다. 또한 전장길이 DNA 서열을 게놈 단편의 분석에 의해 획득할 수 있다.
숙주 세포에서의 폴리뉴클레오티드 발현
본 발명의 다른 구체예에서, 적당한 숙주 세포에서의 폴리펩티드 발현을 유도하기 위하여 본 발명의 폴리펩티드, 또는 융합 단백질 또는 이의 기능적 동등체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 재조합 DNA 분자로 사용할 수 있다. 유전자 코드 고유의 축퇴성으로 인해, 실질적으로 동일하거나 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 엔코딩하는 다른 DNA 서열이 생산될 수 있으며, 해당 폴리펩티드를 클로닝 및 발현하는데 상기 서열을 사용할 수 있다.
본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 이해하고 있을 것이지만, 일부 경우, 천연적으로 생성되지 않는 코돈을 소유하는 폴리펩티드-엔코딩 뉴클레오티드 서열을 생산하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 단백질 발현률을 향상시키거나 요망되는 특성을 지닌 재조합 RNA 전사체(예컨대, 천연적으로 생성되는 서열로부터 생산되는 전사체의 반감기보다 더 긴 반감기를 갖는 전사체)를 생산하기 위해 특정 원핵생물 또는 진핵생물 숙주에 의해 선호되는 코돈을 선택할 수 있다.
더욱이, 유전자 생성물의 클로닝, 가공 및/또는 발현을 변화시키는 변형을 포함하나, 이에만 한정되지 않는, 다양한 이유로 인해 서열을 엔코딩하는 폴리펩티드를 변형시키기 위해 본 발명이 속하는 기술분야에 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 조작할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열을 조작하기 위해 유전자 단편 및 합성 올리고뉴클레오티드에 대한 무작위적 단편화 및 PCR 재조립에 의한 DNA 셔플링을 사용할 수 있다. 또한, 새로운 제한효소 부위의 삽입, 당화 패턴의 변형, 코돈 선호도의 변경, 스플라이싱된 변이체 생성, 또는 돌연변이 도입 등을 위해 위치-지정 돌연변이유발을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 융합 단백질을 엔코딩하도록 하기 위해 천연, 변형, 또는 재조합 핵산 서열을 이종유래 서열과 라이게이션시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 활성 억제자에 관한 펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 시판되는 항체에 의해 인식될 수 있는 키메라 단백질을 엔코딩하도록 하는 것이 유용할 수 있다. 융합 단백질은 또한 폴리펩티드-엔코딩 서열 및 이종 단백질 서열 사이에 위치한 절단 부위를 포함하도록 조작될 수 있는데, 이렇게 함으로써 상기 폴리펩티드가 절단되고 이종유래 모에티로부터 떨어져 나와 정제될 수 있게 된다.
본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 화학적 방법을 사용하여, 요망되는 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 합성할 수 있다(참조: Caruthers, M. H. et al ., Nucl . Acids Res . Symp . Ser . pp. 215-223(1980), Horn et al ., Nucl . Acids Res . Symp . Ser. pp. 225-232(1980)). 대안으로, 폴리펩티드의 아미노산 서열, 또는 이의 일부분을 합성하기 위하여 화학적 방법을 사용하여 단백질 그 자체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 다양한 고체-상 기술(Roberge et al., Science 269:202-204(1995))을 사용하여 펩티드 합성을 수행할 수 있으며, 자동화 합성을 달성할 수 있는데, 이의 일예로 ABI 431A 펩티드 합성기(Perkin Elmer, Palo Alto, CA)를 사용할 수 있다.
분취용 고성능 액체 크로마토그래피(preparative high performance liquid 크로마토그래피)(예컨대, Creighton, Proteins , Structures and Molecular Principles(1983)) 또는 이에 필적하는 본 발명이 속하는 기술분야에서 가용한 다른 기술을 이용하여 새로이 합성된 펩티드를 실질적으로 정제할 수 있다. 아미노산 분석 또는 시퀀싱(예컨대, 에드만(Edman) 분해 절차)에 의해 합성 펩티드의 조성을 확인할 수 있다. 또한, 폴리펩티드 변이체를 생산하기 위해, 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 이의 임의의 일부분을 직접적으로 합성하는 도중에 변형시키고/거나 화학적 방법을 사용하여 다른 단백질 또는, 이의 임의의 일부분에서 나온 서열과 결합시킬 수 있다.
요망되는 폴리펩티드를 발현시키기 위해, 폴리펩티드, 또는 기능적 동등체를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 적당한 발현 벡터 즉, 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위한 필수 엘리먼트들을 내포하고 있는 벡터에 삽입할 수 있다. 관심있는 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열 및 적당한 전사 및 번역 조절 엘리먼트를 포함하는 발현 벡터를 제작하기 위해 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용할 수 있다. 상기 방법에는 시험관내조건 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내조건 유전자 재조합이 포함된다. 상기 기술은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual(1989))과 아수벨 등의 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1989))에 개시되어 있다.
폴리뉴클레오티드 서열을 도입 및 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터/숙주 시스템을 사용할 수 있다. 상기 시스템에는 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예컨대, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포; 바이러스 발현 벡터(예컨대, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 박테리아 발현 벡터(예컨대, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환시킨 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템이 포함되나, 이에만 한정되는 것은 아니다
발현 벡터내에 존재하는 "조절 엘리먼트(control elements)" 또는 "조절 서열(regulatory sequences)"은 상기 벡터의 비번역 지역--인헨서, 프로모터, 5' 및 3' 비번역 지역--에 존재하는 것인데, 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용한다. 이러한 엘리먼트는 세기 및 특이성 면에서 다양할 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라서, 구성성(constitutive) 및 유도성 프로모터를 포함하는, 전사 및 번역 엘리먼트를 임의의 적당한 수로 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 시스템으로 클로닝시, PBLUESCRIPT 파지미드(Stratagene, La JoIIa, Calif.) 또는 PSPORT1 플라스미드(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)의 하이브리드 lacZ 프로모터 등과 같은 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 포유류 세포 시스템에서는, 포유류 유전자 또는 포유류 바이러스에서 유래한 프로모터가 일반적으로 바람직하다. 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열의 복제물을 다수 포함하는 세포주를 생산할 필요가 있는 경우에는, SV40 또는 EBV에 기반한 벡터를 적당한 선별 마커와 함께 사용하는 것이 유리할 수 있다.
박테리아 시스템에서, 발현된 폴리펩티드와 관련하여 의도된 용도에 따라 수많은 발현 벡터를 선택할 수 있다. 예를 들어, 항체 유도를 위한 경우와 같이, 많은 양이 필요할 때에는, 용이하게 정제되는 융합 단백질의 발현을 높은 수준으로 유도하는 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 벡터에는, 관심이 있는 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 아미노-말단 메티오닌(Met) 및 β-갈락토시다아제의 연이은 7개 잔기들을 프레임 내에 구비하고 있는 벡터내로 라이게이션시킴으로써 하이브리드 단백질이 생산되는, BLUESCRIPT(Stratagene)와 같은 다기능 E. coli 클로닝 및 발현 벡터; pIN 벡터(Van Heeke &Schuster, J. Biol . Chem. 264:5503-5509 (1989)) 등이 포함되나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 글루타치온 S-전이효소(GST)와 함께 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현시키기 위해 pGEX 벡터(Promega, Madison, Wis.)를 또한 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며 글루타치온-아가로즈 비드에 흡착된 이후에 유리된 글루타치온 존재하에 용출시킴으로써 분해(lysis)된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 상기 시스템에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈, 또는 인자 XA 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인될 수 있는데, 그리하여 관심이 있는 클로닝된 폴리펩티드는 의도된 대로 GST 모에티로부터 방출될 수 있다.
사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 효모에서 알파 인자, 알코올 산화효소, 및 PGH와 같은 구성성 또는 유도성 프로모터를 포함하는 수 많은 벡터를 사용할 수 있다. 검토를 위해, 아우수벨 등의 논문과 그랜트 등의 논문을 참조하라(Ausubel et al. (전게서) 및 Grant et al ., Methods Enzymol. 153:516-544(1987)).
식물 발현 벡터가 사용되는 경우, 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열의 발현은 수 많은 프로모터들 중 임의의 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터를 단독으로 또는 TMV에서 유래한 오메가 선도 서열(Takamatsu, EMBO J. 6:307-311(1987))과 조합하여 사용할 수 있다. 대안으로, 루비스코(RUBISCO) 소단위체 또는 열충격 프로모터와 같은 식물 프로모터를 사용할 수 있다(Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680(1984); Broglie et al., Science 224:838-843(1984); 및 Winter et al., Results Probl . Cell Differ. 17:85-105(1991)). 이러한 작제물을 DNA 직접 형질전환 또는 병원체-매개 형질감염에 의해 식물 세포로 도입할 수 있다. 상기 기술은 수 많은 일반적으로 가용한 참고문헌에 기술되어 있다(참고예: Hobbs in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology pp. 191-196(1992)).
관심있는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 곤충 시스템을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 시스템의 하나로, 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵다면체 바이러스(AcNPV)가 스포돕테라 프루기퍼다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아 라바(Trichoplusia larvae) 내에서 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용된다. 다면체(polyhedrin) 유전자와 같은, 바이러스의 필수적이지 않은 지역 내로 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 클로닝할 수 있으며, 다면체 프로모터의 조절하에 놓이도록 할 수 있다. 폴리펩티드-엔코딩 서열의 성공적인 삽입은 다면체 유전자의 불활성화를 초래하여 코트 단백질이 결여된 재조합 바이러스가 생산되도록 할 것이다. 이후 재조합 바이러스는, 관심있는 폴리펩티드가 발현될 수 있는, 예를 들어, S. 프루기퍼다 세포 또는 트리코플루시아 라바 내로의 감염을 위해 사용될 수 있다(Engelhard et al., Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A.91:3224-3227(1994)).
포유류 숙주 세포에서, 일반적으로 수많은 바이러스-기반 발현 시스템을 이용할 수 있다. 예를 들어, 발현벡터로 아데노바이러스를 사용하는 경우, 관심있는 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 후기(late) 프로모터 및 세부분으로 나뉘어진(tripartite) 선도 서열로 이루어진 아데노바이러스 전사/번역 복합체에 라이게이션시킬 수 있다. 감염된 숙주 세포내에서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 생존력있는 바이러스를 획득하기 위해 바이러스 게놈의 비필수적인 E1 또는 E3 지역내로의 삽입을 이용할 수 있다(Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659(1984)). 또한, 포유류 숙주 세포에서의 발현을 증가시키기 위해 예컨대 로우스 육종바이러스(Rous sarcoma virus, RSV) 전사 인헨서와 같은, 전사 인헨서를 사용할 수 있다. 아데노바이러스를 이용한 작업에 관한 실험방법 및 프로토콜은 문헌(Wold, Adenovirus Methods and Protocols, 1998)에 검토되어 있다. 아데노바이러스 벡터의 용도에 관한 추가 참고사항은 아데노바이러스지(Adenovirus)에서 찾아볼 수 있다: A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004.
관심있는 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열이 더 효율적으로 번역되도록 하기 위해 특정 개시 신호를 또한 사용할 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열, 이의 개시 코돈, 및 상류 서열이 적당한 발현 벡터로 삽입되는 경우에, 추가적인 전사 또는 번역 조절 서열은 불필요할 수 있다. 그러나, 단지 코딩 서열 또는 이의 일부분 만이 삽입되는 경우, ATG 개시코돈을 포함하는 외래 번역 조절 신호가 제공되어야 한다. 더욱이, 삽입체 전체의 확실한 번역을 보장하기 위해서는 개시코돈이 올바른 해독틀 내에 위치하여야 한다. 외래 번역 엘리먼트 및 개시코돈은 그 기원이 다양할 수 있는데, 천연 및 합성 둘 모두가 가능하다. 샤르프 등의 논문(Scharf. et al., Results Probl . Cell Differ. 20:125-162(1994))에 기술되어 있는 것과 같은, 특정 세포 시스템에서 사용되기에 적당한 인헨서를 포함시킴으로써 발현 효율이 향상될 수 있다.
또한, 요망되는 방식으로 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 발현된 단백질을 가공하는 능력에 따라 숙주 세포 계열을 선택할 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 변형은 아세틸화, 카르복시화, 당화, 인산화, 지질화, 및 아실화를 포함하나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 올바른 삽입, 폴딩 및/또는 융합이 용이하도록 하기 위해 단백질의 "프리프로(prepro)" 형태로 절단하는 번역후 가공(Post-translational processing)이 또한 이용될 수 있다. 외래 단백질의 올바른 변형 및 가공이 확실히 보장되도록 하기 위해, 이러한 번역후 활동을 위한 특이적인 세포 기구 및 특징적인 메카니즘을 지니는, 예컨대 CHO, HeLa, MDCK, HEK293, 및 WI38와 같은 다른 숙주 세포를 사용할 수 있다.
재조합 단백질을 장기간 고수율로 생산하기 위해, 일반적으로 안정적인 발현이 선호된다. 예를 들어, 동일 또는 별개 벡터 상에 바이러스 복제 기점 및/또는 내재성 발현 엘리먼트 및 선별 마커 유전자를 포함할 수 있는 발현벡터를 사용하여 관심있는 폴리뉴클레오티드를 안정적으로 발현하는 세포주를 형질전환시킬 수 있다. 벡터 도입후, 세포를 선택배지로 옮기기 전에 증균용 배지에서 1-2일간 성장시킬 수 있다. 선별 마커의 용도는 선별에 대한 저항을 부여하기 위한 것이며, 이의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수를 가능하게 한다. 안정적으로 형질전환된 세포 중의 저항성 클론들은 세포 유형에 적합한 조직 배양 기술을 이용하여 증식시킬 수 있다.
형질전환된 세포주를 회수하기 위해 선별 시스템을 임의의 수로 사용할 수 있다. 상기 시스템은 각기 티미딘 키나아제 억제(tk.sup.) 또는 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 억제(aprt.sup.) 세포에서 활용할 수 있는, 단순포진바이러스 티미딘 키나아제(Wigler et al ., Cell 11:223-32(1977)) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al ., Cell 22:817-23(1990)) 유전자를 포함하나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 또한, 대사길항물질, 항생제 또는 제초제 저항성을 선별을 위한 기준으로 사용할 수 있다: 그 예로는, 메토트렉세이트 (methotrexate)에 대한 저항성을 부여하는, dhfr(Wigler et al ., Proc . Natl . Acad . Sci U.S.A. 77:3567-70(1980)); 아미노글리코시드(aminoglycosides), 네오마이신 및 G-418에 대한 저항성을 부여하는, npt(Colbere- Garapin et al., J. MoI . Biol. 150:1-14(1981)); 각각 클로르술푸론 및 로스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제에 대한 저항성을 부여하는, als 또는 pat(Murry, supra)가 있다. 예를 들어, 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용하도록 하는 trpB, 또는 히스티딘 대신에 히스티놀(histinol)을 이용하도록 하는 hisD(Hartman & Mulligan, Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A. 85:8047-51(1988))가 또 다른 선별 마커로 소개된 바 있다. 최근에, 눈으로 구별가능한 마커(visible markers)를 사용하는 것이 인기를 얻어 왔는데, 안토시아닌, β-글루쿠로니다제 및 이의 기질 GUS, 및 루시퍼라제 및 이의 기질 루시페린과 같은 마커가 형질전환체를 동정하기 위해서 뿐만 아니라, 특정 벡터 시스템에 기인한 일시적이거나 안정적인 단백질의 발현양을 정량하기 위해 광범위하게 사용되고 있다(Rhodes et al., Methods Moi . Biol. 55:121-131(1995)).
마커 유전자 발현의 존/부가 관심있는 유전자가 존재한다는 것을 또한 제시하기는 하지만, 상기 유전자의 존재 및 발현은 확증될 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열이 마커 유전자 서열내로 삽입된다면, 서열을 포함하는 재조합 세포는 마커 유전자 기능의 결여로 인해 확인될 수 있다. 대안으로, 마커 유전자가 단일 프로모터의 조절을 받는 폴리펩티드-엔코딩 서열과 앞뒤 일렬로 정렬되어 위치할 수 있다. 유도 또는 선별 반응시 마커 유전자의 발현은 또한 일반적으로 탠덤 유전자의 발현을 드러내 준다.
대안으로, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 절차에 의해 요망되는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유 및 발현하는 숙주 세포를 동정할 수 있다. 상기 절차는 핵산 또는 단백질의 검출 및/또는 정량을 위한 막, 용액 또는 칩 기반 기술을 포함하는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화와 단백질 생검 또는 면역분석 기술을 포함하나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
폴리뉴클레오티드-엔코딩 생성물의 발현을 검출 및 측정하기 위한 다양한 프로토콜이 당업계에 공지되어 있는데, 상기 프로토콜은 생성물에 특이적인 폴리클론 또는 단일클론 항체를 사용한다. 일예로서 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA), 방사면역검정법(RIA), 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)가 포함된다. 당해 폴리펩티드상의 2개의 비-간섭 에피토프에 민감하게 반응하는 단일클론항체를 이용한 2자리, 단일클론-기반 면역분석법이 일부 경우에 적용시 바람직할 수 있으나, 경쟁적 결합 분석법도 또한 이용할 수 있다. 상기 분석법 및 다른 분석법이, 다음 참고문헌 내의, 다른 여러 곳에 기술되어 있다: Hampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual(1990) 및 Maddox et al., J. Exp . Med . 158:1211-1216(1983).
매우 다양한 표지 및 접합 기술이 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드와 관련된 서열을 검출하기 위한 표지된 혼성화 또는 PCR 프로브를 생산하기 위한 수단은 올리고레이블링(oligolabeling), 닉(nick) 번역, 말단-레이블링 또는 표지된 뉴클레오티드를 사용한 PCR 증폭을 포함한다. 대안으로, 서열, 또는 이의 임의의 일부분을 mRNA 프로브의 생산을 위한 벡터내로 클로닝할 수 있다. 이러한 벡터는 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있고, 상업적으로 이용할 수 있으며, T7, T3, 또는 SP6와 같은 적당한 RNA 중합효소 및 표지된 뉴클레오티드의 첨가에 의해 시험관내에서 RNA 프로브를 합성하기 위해 사용할 수 있다. 시판되는 다양한 키트를 사용하여 상기 절차를 수행할 수 있다. 사용할 수 있는 적당한 리포터 분자 또는 레이블은 방사선핵종, 효소, 형광, 화학발광, 또는 발색(chromogenic) 제제 뿐만 아니라 기질, 코팩터, 억제자, 자성 분말 등을 포함한다.
관심있는 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주세포를 세포 배양물로부터 단백질을 발현시키고 회수하는데 적당한 조건하에서 배양할 수 있다. 재조합 세포에 의해 생산된 단백질은 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라서 분비되거나 세포내부에 포함될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 이해하고 있을 것이지만, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 세포 막을 통해 엔코딩된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 신호 서열을 포함하도록 디자인될 수 있다. 가용성 단백질의 정제를 용이하게 할 폴리펩티드 도메인을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 관심있는 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 결합시키기 위하여 다른 재조합 구성을 사용할 수 있다. 정제를 용이하게 하는 도메인은 고정된 금속 상에서의 정제가 가능하도록 하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트 펩티드, 고정된 면역글로불린 상에서의 정제가 가능하도록 하는 단백질 A 도메인, 및 FLAGS 신장/친화도 정제 시스템(Immunex Corp., Seattle, Wash.)에서 사용되는 도메인을 포함하나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 정제를 용이하게 하기 위해 정제 도메인과 엔코딩된 폴리펩티드 사이에 인자 XA 또는 엔테로키나제(Invitrogen. San Diego, Calif.)에 특이적인 서열과 같은 절단가능한 링커 서열의 통합을 활용할 수 있다. 임의의 상기 발현벡터는 관심있는 폴리펩티드와 티오레독신 또는 에테로키나제 절단부위에 앞서 존재하는 6개의 히스티딘 잔기를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 포라쓰 등의 논문(Porath et al., Prot . Exp . Purif. 3:263-281(1992))에 기술된 바와 같이 IMIAC(immobilized metal ion affinity 크로마토그래피) 상에서의 정제를 용이하게 하는 한편, 엔테로키나제 절단부위는 융합 단백질로부터 요망되는 폴리펩티드를 정제하는 수단을 제공한다. 융합 단백질을 포함하는 벡터에 대한 논의가 크롤 등의 논문(Kroll et al ., DNA Cell Biol. 12:441-453(1993))에 기술되어 있다.
재조합 생산 방법 이외에, 고체-상 기술을 사용하여 펩티드를 직접 합성함으로써 본 발명의 폴리펩티드를 생산할 수 있다(Merrifield, J. Am . Chem . Soc. 85:2149-2154(1963)). 수동 기술을 사용하거나 자동화 방법에 의해 단백질 합성을 실행할 수 있다. 자동화 합성은, 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈 431A 펩티드 합성장치(Perkin Elmer)를 사용하여 달성될 수 있다. 대안으로, 전장 길이 분자를 생산하기 위해 다양한 단편을 화학적으로 개별적으로 합성하고 화학적 방법을 사용하여 결합시킬 수 있다.
생체내조건 폴리뉴클레오티드 전달 기술
추가 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 하나 또는 그 이상 포함하는 유전자 컨스트럭트는 생체내조건에서 세포로 도입된다. 상기 도입은 다양한 또는 잘-알려진 접근법 중 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있으며, 이러한 방법들 중 일부는 예시를 목적으로 하기에 개략적으로 기술되어 있다.
1. 아데노바이러스
하나 이상의 핵산 서열의 생체내조건 전달을 위한 바람직한 방법들 중 하나는 아데노바이러스 발현 벡터를 사용하는 것을 포함한다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 컨스트럭트의 패키징을 보조하는데 그리고 (b) 센스 또는 안티센스 방향으로 클로닝된 폴리뉴클레오티드를 발현시키는데 충분한 아데노바이러스 서열을 포함하는 그러한 벡터 컨스트럭트를 의미한다. 물론, 안티센스 컨스트럭트의 맥락에서, 발현은 유전자 생성물이 합성되어야 한다는 것을 요구하지는 않는다.
상기 발현 벡터는 유전자적으로 조작된 형태의 아데노바이러스를 포함한다. 36kb, 선형, 2중-가닥 DNA 바이러스인, 아데노바이러스의 유전자 구조에 대한 지식은 아데노바이러스 DNA의 거대한 부분을 외래 서열로 대체할 수 있게 하는데, 7kb까지 가능하게 한다(Grunhaus & Horwitz, 1992). 레트로바이러스와는 대조적으로, 숙주 세포에 대한 아데노바이러스 감염은 염색체 통합을 초래하지 아니하는데, 이는 아데노바이러스 DNA가 잠재적인 유전자독성(genotoxicity)없이 에피좀적(episomal) 방식으로 복제할 수 있기 때문이다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정하며, 대규모적인 증폭 후에 게놈 재배열이 검출된 바가 없다. 아데노바이러스는 사실상 상피세포의 세포 주기 단계에 관계없이 모든 상피세포에 감염될 수 있다. 지금까지, 아데노바이러스 감염은 인간에서의 급성 호흡기 질병과 같은 유순한 질병에만 연관되어 있는 것으로 여겨지고 있다.
아데노바이러스는 바이러스의 중간-크기 게놈, 조작의 용이, 고역가(high titer), 폭넓은 표적-세포 범위 및 높은 감염력 때문에 유전자 전달 벡터용으로 특히 적당하다. 바이러스 게놈의 양쪽 말단은 100-200 염기쌍 길이의 역반복염기서열(ITRs)을 포함하는데, 상기 서열은 바이러스 DNA 복제 및 패키징을 위해 필요한 시스(cis) 엘리먼트이다. 게놈의 초기(E) 및 후기(L) 지역은 바이러스 DNA 복제의 개시에 의해 분열되는 상이한 전사 단위를 포함한다. E1 지역(E1A 및 E1B)는 바이러스 게놈 및 소수 세포 유전자의 전자 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩한다. E2(E2A 및 E2B) 지역의 발현은 결국 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질 합성을 초래한다. 이들 단백질들은 DNA 복제, 후기 유전자 발현 및 숙주 세포 셧-오프(shut-off)에 관여한다(Renan, 1990). 바이러스 캡시드 단백질의 대부분을 포함하는, 후기 유전자들의 생성물은, 주요 후기 프로모터(major late promoter, MLP)에 의해 비롯되는 단일한 1차 전사체의 상당한 가공 후에나 발현된다. MLP(16.8 m.u.에 위치함)는 감염 후기에 특히 효율적이며, 상기 프로모터에서 비롯되는 모든 mRNA는 이들을 번역을 위한 바람직한 mRNA로 만들어 주는 5'-세부분으로 나뉘어진 선도서열(tripartite leader, TPL)을 보유한다.
현재 통용되고 있는 시스템에서, 재조합 아데노바이러스는 셔틀 벡터와 프로바이러스 벡터 사이의 상동성 재조합(homologous recombination)에 의해 생성된다. 두 프로바이러스 벡터 간의 가능한 재조합으로 인하여, 야생형 아데노바이러스가 이러한 과정에서 생성될 수 있다. 그러므로, 개개의 플라크로부터 바이러스의 단일 클론을 동정하고 이의 게놈 구조를 검사하는 것이 중요하다..
복제 결함을 지닌, 현재 통용되고 있는 아데노바이러스 벡터의 생산 및 증식은 293로 지정된, 특유한 헬퍼 세포주에 의존하는데, 상기 세포주는 Ad5 DNA 단편에 의해 인간 태아 신장 세포로부터 형질변환되며, 구조적으로 E1 단백질을 발현한다(Graham et al., 1977). E3 지역은 아데노바이러스 게놈에서 없어도 되는 지역이기 때문에(Jones & Shenk, 1978), 현재 통용되고 있는 아데노바이러스 벡터는, 293 세포의 도움을 받아, E1, D3 또는 두 지역내에 외래 DNA를 운반한다(Graham & Prevec, 1991). 천연상태에서, 아데노바이러스는 야생형 게놈의 대략 105%를 패키징할 수 있으며(Ghosh-Choudhury et al., 1987), 약 2 kB의 여분의 DNA를 수용할 수 있는 용량을 제공한다. E1 및 E3 지역내에서 대체될 수 있는 대략 5.5kB의 DNA와 함께, 현재 통용되는 있는 아데노바이러스 벡터의 최대 수용 용량은 7.5kB 또는 벡터 전체 길이의 약 15% 이하이다. 아데노바이러스 게놈의 80% 이상은 벡터 백본내에 그대로 남아 있으며, 이는 벡터가 타고난 세포독성의 근원이 된다. 또한 E1-결실 바이러스의 복제 결함은 불완전하다. 예를 들어, 현재 통상적으로 이용할 수 있는 벡터가 지니는 바이러스 유전자 발현의 누출(leakage)이 높은 다중 감염도(multiplicities of infection, MOI)로 관찰된 바 있다(Mulligan, 1993).
헬퍼 세포주는 인간 태아 신장 세포, 근육 세포, 조혈세포 또는 다른 인간 태아 간엽 세포 또는 상피 세포와 같은 인간 세포에서 유래할 수 있다. 대안으로, 상기 헬퍼 세포는 인간 아데노바이러스에 대하여 허용적인 다른 포유류 종의 세포에서 유래할 수 있다. 상기 세포들은, 예컨대, Vero 세포 또는 다른 원숭이 태아 간엽 세포 또는 상피 세포를 포함한다. 상기에 설명한 바와 같이, 현재 통상적으로 선호되는 헬퍼 세포는 293 세포이다.
최근에, 라처(Racher) 등은 그들의 논문(Racher et al. (1995))에서 293 세포 배양 및 아데노바이러스 증식을 위한 개선된 방법을 제시하였다. 한가지 양태로, 배지 100-200㎖를 포함하는 1 리터 짜리 실리콘 스피너 플라스크(Techne, Cambridge, UK)에 개별 새포를 접종시켜 천연 세포 집합체를 성장시킨다. 40rpm으로 스터링하고 난 후, 트리판 블루를 이용하여 세포 생존도를 측정한다. 또 다른 양태에서, 피브라-셀 마이크로캐리어(Bibby Sterlin, Stone, UK)(5g/ℓ)가 다음과 같이 이용된다. 배지 5㎖에 재현탁시킨, 세포 접종원을 250㎖ 엘렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 중의 캐리어(50㎖)에 첨가하고, 산발적으로 교반하면서, 1 내지 4시간 동안 정치시킨다. 그런 다음 배지를 50㎖의 신선한 배지로 교체하고 진탕시키기 시작한다. 바이러스 생산을 위해, 배지를 교체(최종 부피의 25% 까지)하고 아데노바이러스를 MOI 0.05로 첨가한 시점 이후에, 세포가 약 80% 콘플루언스(confluence)로 성장되도록 한다. 배양물을 밤새 정치시키고 난 다음, 부피를 100%까지 증가시키고, 또 다른 72시간 동안 진탕 배양을 개시한다.
아데노바이러스 벡터가 복제 결함이 있거나, 적어도 조건부 결함이 있어야 한다는 구비조건 이외에, 아데노바이러스 벡터의 특성이 본 발명의 성공적인 실시에 결정적인 요인은 되지 아니하는 것으로 여겨진다. 아데노바이러스는 42종의 상이한 공지된 혈청형 또는 하위그룹 A-F 중의 임의의 바이러스일 수 있다. 아데노바이러스 제 5형은 생화학 및 유전 정보의 상당 부분이 대략 공지되어 있는 인간 아데노바이러스이고, 벡터로서 아데노바이러스를 이용하는 대부분의 구성에 있어 역사적으로 사용되어 왔기 때문에, 하위그룹 C에 속하는 아데노바이러스 5형이 본 발명에서의 사용을 위한 조건부 복제-결함 아데노바이러스 벡터를 획득하는데 있어 바람직한 출발 재료가 된다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 일반적인 벡터는 복제 결함이 있고 아데노바이러스 E1 지역을 보유하지 아니할 것이다. 그래서, 상기 벡터는 관심있는 유전자를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 E1-코딩 서열이 제거된 위치에 도입하기가 가장 용이할 것이다. 그러나, 아데노바이러스 서열내 존재하는 컨스트럭트의 삽입 위치는 본 발명에서 중요하지 않다. 관심있는 유전자를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 칼손 등에 의해 개시된 바와 같이(Karlsson et al. (1986)) 결실된 E3 지역 대신에 E3 대체 벡터내로 삽입되거나 헬퍼 세포주 또는 헬퍼 바이러스가 E4 결함을 보상하는 E4 지역내로 삽입될 수 있다.
아데노바이러스는 시험관내조건 및 생체내조건에서 성장시키고 조작하기가 용이하며 숙주의 범위가 광범위하다. 이러한 바이러스 집단을 예컨대, ㎖당 109-1011 플라크-형성 단위의 고역가로 획득할 수 있으며, 상기 바이러스들은 감염성이 매우 높다. 아데노바이러스의 라이프 사이클은 숙주 세포 게놈으로의 통합을 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터에 의해 운반되어온 외래 유전자들은 에피좀성이며, 그러므로, 숙주 세포에 미치는 유전자독성은 낮다. 야생형 아데노바이러스를 이용한 면역화에 대한 연구에서 부작용이 보고된 적이 없으며(Couch et al., 1963; Top et al., 1971 ), 이는 생체내조건 유전자 전달 벡터로서 상기 아데노바이러스의 안정성 및 치료학적 잠재성을 증명하는 것이다.
아데노바이러스 벡터는 진핵생물 유전자 발현(Levrero et al., 1991 ; Gomez-Foix et al., 1992) 및 백신 개발(Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992)에 사용되어 왔다. 최근의 동물 연구는 재조합 아데노바이러스가 유전자 치료에 사용될 수 있다는 것을 시사한다(Stratford-Perricaudet & Perricaudet, 1991 ; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). 재조합 아데노바이러스를 상이한 조직에 투여하는 연구는 기관 점적주사(trachea instillation)(Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), 근육 주사(Ragot et al., 1993), 말초 정맥 주사(Herz & Gerard, 1993) 및 뇌로의 정위 접종(stereotactic inoculation)(Le Gal La Salle et al., 1993)을 포함한다.
아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스로부터 기원할 수 있다. 대안으로 상기 벡터들은 다른 종, 예를 들어 침팬지의 아데노바이러스로부터 기원할 수 있는데, 이러한 벡터들은 다수의 인간 개체들 내에서 순환하는 인간 아데노바이러스에 대한 항체에 의해 중화되지 아니하는 이점을 지닐 수 있다(참조예: Tatsis N et al(2005) Gene Ther. Dec 1;[인쇄에 앞서 인터넷공개(Epub)]).
2. 레트로바이러스
레트로바이러스는 역전사 과정에 의해 감염된 세포에서 이들의 RNA를 이중가닥의 DNA로 전환시키는 능력을 특징으로 하는 단일가닥 RNA 바이러스 그룹이다(Coffin, 1990). 역전사 이후, 그 결과로 생성된 DNA는 프로바이러스로서 세포 염색체에 안정적으로 통합되고, 바이러스 단백질을 합성한다. 상기 통합은 수용체 세포 내에서의 바이러스 유전자 서열의 유지 및 이의 자손 생성을 초래한다. 레트로바이러스 유전체는 캡시드 단백질, 중합효소, 및 외피 성분을 각각 코딩하는 세개의 유전자인 gag, pol, 및 env을 함유한다. gag 유전자로부터 상류에서 발견된 서열은 유전체의 비리온으로의 패키징을 위한 신호를 포함한다. 두개의 긴 말단 반복(LTR) 서열이 바이러스 유전체의 5' 및 3' 말단에 존재한다. 상기 서열은 강한 프로모터 및 인헨서 서열을 함유하고, 또한 이들은 숙주 세포 게놈으로의 통합에도 필요하다(Coffin, 1990).
레트로바이러스 벡터를 제작하기 위해, 하나 이상의 관심있는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 엔코딩하는 핵산을 특정 바이러스 서열을 대신하여 바이러스 유전체로 삽입하는데, 이는 복제 결함이 있는 바이러스를 생성시키게 된다. 비리온이 생성되도록 하기 위해, LTR 없이 gag, pol, 및 env 유전자 및 패키징 구성요소를 포함하는 패키징 세포주를 제작한다(Mann et al., 1983). cDNA와 함께 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열을 함유하는 재조합 플라스미드가 상기 세포주로 도입되는 경우(예를 들어, 칼슘 포스페이트 침전에 의함), 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자로 패키징되고 난 후, 배양 배지로 분비되는 것을 가능케 한다(Nicolas & Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). 이후, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지가 수거되고, 경우에 따라 농축되고, 유전자 전달에 사용된다. 레트로바이러스 벡터는 매우 광범위한 세포 유형에 감염될 수 있다. 그러나, 통합 및 안정적인 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다(Paskind et al., 1975).
레트로바이러스의 특이적 표적화(targenting)가 가능하도록 디자인된 신규한 방법이 최근 개발되었는데, 상기 방법은 락토오스 잔기의 바이러스 외피로의 화학적 부가에 의한 레트로바이러스의 화학적 변형에 기초하고 있다. 이러한 변형은 시알로당단백질(sialoglycoproten) 수용체를 통한 간세포 특이적 감염이 일어나도록 할 수 있다.
재조합 레트로바이러스를 표적으로 하는 다른 방법이 디자인되었는데, 상기 방법은 레트로바이러스 외피 단백질 및 특이적 세포 수용체에 대한 비오티닐화 항체를 사용한다. 항체는 스트렙트아비딘을 이용하여 비오틴 성분을 통해 커플링된다(Roux et al., 1989). 주조직적합성복합체 클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ 항원에 대한 항체를 이용함으로써, 로우스 등은 시험관내에서 에코트로픽(ecotropic) 바이러스와 함께 표면 항원에 구멍을 뚫는 다양한 인간 세포에 대한 감염을 입증하였다(Roux et al., 1989).
3. 아데노 -부속 바이러스
AAV(Ridgeway, 1988; Hermonat & Muzycska, 1984)는 아데노바이러스 스톡(stocks)의 감염에 의해 발견된 파보바이러스(parovirus)이다. 이는 임의의 질병과 관련되지 않은 어디에나 존재하는 바이러스이다(미국 시민의 85%가 이에 대한 항체를 보유함). 이는 또한 디펜도바이러스로 분류되는데, 이의 복제가 아데노바이러스와 같은 보조 바이러스의 존재에 좌우되기 때문이다. 다섯개의 혈청형이 분리되었고, 이들 중에서 AAV-2의 특성이 가장 잘 규명되어 있다. AAV는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3으로 캡슐화되어 20 내지 24 nm 직경의 정20면체의 비리온을 형성시키는 단일사슬의 선형 DNA를 지닌다(Muzyczka & McLaughlin, 1988).
AAV DNA는 약 4700개 염기 길이이다. 이는 두개의 개방해독틀을 포함하며, 두개의 ITR이 측면에 위치하고 있다. AAV 게놈에는 두개의 주요 유전자 rep 및 cap가 존재한다. rep 유전자는 바이러스 복제에 관여하는 단백질을 엔코딩하며, 한편 cap는 캡시드 단백질 VP1-3을 엔코딩한다. 각각의 ITR은 T 형태의 헤어핀 구조를 형성한다. 이들 말단 반복체는 염색체 통합을 위한 AAV의 유일한 필수 시스(cis) 구성요소이다. 따라서, AAV는 전달을 위한 유전자 카세트에 의해 제거되고 대체되는 모든 바이러스 코딩 서열을 지니는 벡터로 다시 사용될 수 있다. 3개의 바이러스 프로모터가 확인되었고, 이들의 맵 위치에 따라 p5, p19, 및 p40로 명명되었다. p5 및 p19로부터의 전사는 rep 단백질을 생성시키고, p40으로부터의 전사는 캡시드 단배질을 생성시킨다(Hermonat & Muzyczka, 1984).
연구자가 발현 벡터로서 rAVV의 이용 가능성을 연구하도록 촉구하는 여러 요인이 있다. 하나는 숙주 염색체로 통합시키기 위해 유전자를 전달하기 위한 구비조건이 놀랍게도 적다는 점이다. 145-bp의 ITR을 가지는 것이 요구되는데, 이는 단지 AAV 게놈의 6%에 해당한다. 이는 벡터 내에 4.5-kb의 DNA 삽입을 어셈블리시키기 위한 공간을 남긴다. 이러한 운반 공간은 거대한 유전자의 전달로부터 AAV를 보호하면서, 본 발명의 안티센스 컨스트럭트를 전달하기에 충분히 적합하다.
AAV는 또한 이의 안정성으로 인해 운반 비히클로서도 양호한 선택이 된다. 비교적 복잡한 회복(rescue) 메커니즘이 존재한다: 야생형 아데노바이러스뿐만 아니라 AAV 유전자도 rAAV를 동원(mobilization)하는데 필요하다. 또한, AAV는 비병원성이고, 임의의 질병과 관련되어 있지 않다. 바이러스 코딩 서열의 제거는 바이러스 유전자 발현에 대한 면역 반응을 최소화시키고, 따라서, rAAV는 염증 반응을 일으키지 않는다.
4. 발현 컨스트럭트로서의 기타 바이러스 벡터
올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 숙주 세포로 전달하기 위한 본 발명의 발현 컨스트럭트로서 기타 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 백시니아 바이러스(Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988), 렌티바이러스, 폴리오바이러스 및 헤르페스 바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터를 사용할 수 있다. 이들은 다양한 포유동물 세포에 대해 매력적인 여러가지 특징을 제공한다 (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
결함있는 B형 간염 바이러스에 대한 최근의 인지와 함께, 다양한 바이러스 서열의 구조-기능 관계에 대한 새로운 통찰이 획득되었다. 시험관내 연구는 바이러스가 이의 게놈의 80%까지 결실되더라도 보조자-의존 패키징 및 역전사를 위한 능력을 유지할 수 있다는 것을 밝혀냈다(Horwich et al., 1990). 이는 게놈의 많은 부분이 외래 유전 물질로 대체될 수 있다는 것을 암시한다. 간 특이적 유전자 전달과 관련하여 간친화성 및 지속성(통합)이 특히 매력적인 특징이었다. 창 등(Chang et al. (1991))은 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT) 유전자를 중합효소, 표면 및 전표면 코딩 서열의 위치에서 오리 B형 간염 바이러스 유전체로 도입하였다. 조류 간염 세포주로 야생형 바이러스를 코트랜스펙션시켰다. 고역가 재조합 바이러스를 함유하는 배지를 일차 새끼오리 간세포를 감염시키기 위해 사용하였다. 안정적인 CAT 유전자 발현이 트랜스펙션후 적어도 24일 동안 검출되었다(Chang et al., 1991).
5. 비-바이러스 벡터
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되도록 하기 위해, 발현 컨스트럭트는 세포로 전달되어야 한다. 이러한 전달은 세포주를 형질전환시키기 위한 실험실 방법과 같이 시험관내, 또는 특정 질병 상태의 치료에서와 같이 생체내 또는 생체외에서 달성될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 전달을 위한 바람직한 한 메커니즘은 발현 컨스트럭트가 감염성 바이러스 입자 내로 캡슐화되는 바이러스 감염을 이용하는 방법이다.
발현 컨스트럭트가 세포로 전달된 후, 요망되는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 엔코딩하는 핵산은 다른 위치에 자리잡게 되고 발현될 수 있다. 특정 구체예에서, 컨스트럭트를 엔코딩하는 핵산이 세포의 게놈내로 안정적으로 통합될 수 있다. 이러한 통합은 상동성 재조합(유전자 교환)을 통한 특이적 위치 및 배향으로 이루어지거나, 무작위적으로, 비특이적 위치(유전자 보강(augmentation))로 통합이 일어날 수 있다. 또 다른 추가 구체예에서, 핵산은 DNA의 별개의 에피좀 세그먼트로 세포 내에서 안정적으로 유지될 수 있다. 이러한 핵산 세그먼트 또는 "에피좀"은 숙주 세포 주기와 독립적으로 또는 동조(synchronization)되어 유지 및 복제되도록 하기에 충분한 서열을 엔코딩한다. 발현 컨스트럭트를 세포 내로 전달하는 방법 및 핵산이 세포 내에서 유지는 장소는 발현 컨스트럭트의 유형에 따라 달라진다.
본 발명의 특정 구체예에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 컨스트럭트는 단순히 네이키드(naked) 재조합 DNA 또는 플라스미드로 구성될 수 있다. 컨스트럭트의 전달은 세포막을 물리적 또는 화학적으로 투과시키는 상기 언급된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 이는 시험관내에서의 전달에 특히 적절하나, 생체내에서도 이용할 수 있다. 두벤스키 등(Dubensky et al. (1984))은 성체 및 신생 생쥐의 간 및 비장으로 칼슘 포스페이트 침전물 형태의 폴리오마바이러스 DNA를 성공적으로 주입하여, 활성 바이러스 복제 및 급성 감염을 입증하였다. 벤베니스티와 레셰프(Benvenisty & Reshef (1986))는 또한 칼슘 포스페이트 침전된 플라스미드의 직접적인 복막내 주사가 트랜스펙션된 유전자의 발현을 발생시키는 것을 입증하였다. 관심있는 유전자를 엔코딩하는 DNA가 생체내에서도 유사한 방식으로 전달될 수 있으며, 이의 유전자 생성물이 발현될 수 있다는 것이 예상된다.
네이키드 DNA 발현 컨스트럭트를 세포로 전달시키기 위한 본 발명의 또 다른 구체예는 미립자 폭격(bombardment)를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 DNA가 세포를 사멸시키지 않고 세포막을 통과하여 세포로 진입되도록 하기 위해 고속으로 DNA 코팅된 미세분사물(microprojectile)을 가속화시키는 능력을 기초로 한다(Klein et al., 1987). 작은 미립자를 가속화시키기 위한 여러 장치가 개발되었다. 이러한 장치들 중 하나는 고 전압 방전에 기초하는데, 이는 전류를 발생시키고, 이어서 구동력을 제공한다(Yang et al., 1990). 사용된 미세분사물은 생물학적 비활성 물질, 예를 들어 텅스텐 또는 금 비드로 구성된다.
래트 및 생쥐의 간, 피부, 및 근조직을 포함하는 선택된 기관이 생체내에서 폭격(bombarding)된다(Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). 이는 총과 표적 기관 사이에 임의의 중간 조직을 제거하기 위해 조직 또는 세포의 외과적 노출, 생체외에서의 치료를 필요로 할 수 있다. 다시 한번 말하자면, 특정 유전자를 엔코딩하는 DNA는 상기 방법을 통해 전달될 수 있고, 이는 본 발명에 포함된다.
폴리펩티드 조성물
본 발명은, 다른 양상에서, 폴리펩티드 조성물을 제공한다. 일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 포유동물 종으로부터 유래한 단리된 폴리펩티드(또는 에피토프, 변이체, 또는 이의 활성 단편)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 적당히 스트린전시한 조건하에서 본원에 소개된 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 서열에 의해 엔코딩된다. 대안으로, 상기 폴리펩티드는 본원에 개시된 아미노산 서열로부터 유래한 임의의 연속적인(contiguous) 아미노산 서열을 포함하거나, 본원에 소개된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드로 정의될 수 있다.
면역원성 부분은 일반적으로 널리 공지된 기술, 예를 들어 폴의 문헌(Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247(1993)) 및 이에 인용된 참고문헌에 기술된 기술을 이용하여 확인될 수 있다. 이러한 기술은 항원 특이적 항체, 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 능력과 관련하여 폴리펩티드를 스크리닝하는 것을 포함한다. 본원에서, 항혈청 및 항체는 이들이 항원에 특이적으로 결합하는 경우 "항원-특이적"이다(즉, 이들은 ELISA 또는 기타 면역검정에서 관련 단백질과 반응하고, 관련되지 않은 단백질과는 검출가능한 정도로 반응하지 않는다). 이러한 항혈청 및 항체는 본원에 기술된 바와 같이 제조될 수 있고, 널리 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 마이코박테리움 종(Mycobacterium sp.) 단백질의 면역원성 부분은(예를 들어, ELISA 및/또는 T 세포 반응성 검정에서) 전장 폴리펩티드의 반응성과 대비하여 실질적으로 적지 않은 수준으로 상기 항혈청 및/또는 T 세포와 반응하는 부분이다. 이러한 면역원성 부분은 전장 폴리펩티드의 반응성과 유사하거나 보다 높은 수준으로 상기 검정에서 반응할 수 있다. 이러한 스크리닝은 일반적으로 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법, 예를 들어 참고문헌(Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual(1988))에 기술된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 고체 지지체에 고정시키고, 환자의 혈청과 접촉시켜 혈청 내의 항체가 상기 고정된 폴리펩티드에 결합되도록 할 수 있다. 이후, 결합되지 않은 혈청을 제거하고, 예를 들어, 125I로 표지된 단백질 A를 이용하여, 결합된 항체를 검출할 수 있다.
폴리펩티드를 널리 공지된 다양한 기술들 중 임의의 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 기술된 것과 같은 DNA 서열에 의해 엔코딩되는 재조합 폴리펩티드는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 발현 벡터를 이용하여 DNA 서열로부터 용이하게 제조될 수 있다. 발현은 재조합 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 분자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 임의의 적절한 숙주 세포에서 이루어질 수 있다. 적절한 숙주 세포는 원핵생물 세포, 효모, 및 보다 고등한 진핵생물 세포, 예를 들어 포유동물 세포 및 식물 세포를 포함한다. 바람직하게는, 사용되는 숙주 세포는 대장균, 효모, 또는 예컨대 COS 또는 CHO와 같은 포유동물 세포주이다. 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 배양 배지로 분비하는 적절한 숙주/벡터 시스템으로부터의 상층액을 시판되는 필터를 이용하여 우선적으로 농축시킬 수 있다. 농축후, 농축물은 적절한 정제 매트릭스, 예를 들어 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지에 적용될 수 있다. 최종적으로, 하나 이상의 역상 HPLC 단계가 재조합 폴리펩티드의 추가 정제를 위해 채택될 수 있다.
약 100개 미만의 아미노산, 또는 일반적으로 약 50개 미만의 아미노산을 갖는 본 발명의 폴리펩티드, 이의 면역원성 단편, 및 다른 변이체는 또한 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술을 이용하는, 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 임의의 시판되는 고체-상 기술, 예를 들어 성장하는 아미노산 사슬에 연속적으로 아미노산이 부가되는 메리필드(Merrifield) 고체-상 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다(참조: Merrifield, J. Am . Chem . Soc. 85:2149-2146(1963)). 폴리펩티드의 자동화된 합성 장치를 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템즈 디비전(Perkin Elmer/Applied BioSystems Division; Foster City, CA)와 같은 공급자로부터 구매할 수 있으며, 제조업체의 사용지침에 따라 사용할 수 있다.
임의의 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 본원에 기술된 다수의 폴리펩티드를 포함하거나, 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 폴리펩티드와 예컨대 공지된 종양 단백질과 같은, 관련되지 않은 서열을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 이러한 융합 파트너는 예를 들어, T 보조 에피토프(면역학적 융합 파트너), 바람직하게는 인간에 의해 인지되는 T 보조 에피토프를 제공하는 것을 보조할 수 있거나, 천연 재조합 단백질 보다 높은 수율로 단백질의 발현을 보조(발현 인핸서)할 수 있다. 임의의 바람직한 융합 파트너는 면역학적이며 발현을 향상시키는 융합 파트너이다. 기타 융합 파트너는 단백질의 가용성을 증가시키거나 단백질이 요망되는 세포내 구획으로 표적화되도록 하기 위해 선택될 수 있다. 또 다른 추가 융합 단백질은 단백질의 정제를 용이하게 하는 친화성 태그를 포함한다.
융합 단백질은 일반적으로 화학적 컨쥬게이션을 포함하는 표준 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, 융합 단백질은 발현 시스템에서 비융합 단백질에 비해 증가된 수준의 생성을 가능케 하는 재조합 단백질로 발현될 수 있다. 간단하게, 폴리펩티드 성분을 엔코딩하는 DNA 서열은 별개로 어셈블링되고, 적절한 발현 벡터로 라이게이션될 수 있다. 하나의 폴리펩티드 성분을 엔코딩하는 DNA 서열의 3' 말단은 펩티드 링커를 이용하거나 이의 이용 없이 제 2의 폴리펩티드 성분을 엔코딩하는 DNA 서열의 5' 말단에 라이게이션되어, 서열의 해독틀이 제자리에(in phase) 위치하게 된다. 이는 폴리펩티드 양 성분이 지니는 생물학적 활성을 보유하는 단일한 융합 단백질로의 전사를 가능케 한다.
펩티드 링커 서열은 첫번째 및 두번째 폴리펩티드 구성성분이 충분한 거리로 이격되도록 하기 위해 사용될 수 있는데, 이는 각각의 폴리펩티드가 이의 이차 및 삼차 구조로 폴딩되는 것이 보장되도록 하기 위함이다. 이러한 펩티드 링커 서열은 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 표준 기술을 이용하여 융합 단백질로 통합된다. 적절한 펩티드 링커 서열은 하기 요건들을 기초로 하여 선택될 수 있다: (1) 유동적인 신장 형태를 채택하는 이들의 능력; (2) 첫번째 및 두번째 폴리펩티드 상의 기능성 에피토프와 상호작용할 수 있는 이차 구조를 채택할 수 없는 이들의 능력; 및 (3) 폴리펩티드 기능성 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 하전된 잔기의 결핍. 바람직한 펩티드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. 기타 중성에 가까운 아미노산, 예를 들어 Thr 및 Ala가 또한 링커 서열로 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열은 참고문헌(Maratea et al., Gene 40:39-46(1985); Murphy et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 83:8258-8262(1986); 미국 특허 제 4,935,233호 및 미국 특허 제 4,751,180호)에 기술된 것을 포함한다. 링커 서열은 일반적으로 1 내지 약 50개 아미노산 길이일 수 있다. 첫번째 및 두번째 폴리펩티드가 기능성 도메인을 분리시키고, 입체 간섭을 방지하는데 사용될 수 있는 비필수 N-말단 아미노산 영역을 지니는 경우, 링커 서열은 불필요하다.
라이게이션된 DNA 서열은 적절한 전사 또는 번역 조절 성분에 작동가능하게 연결될 수 있다. DNA의 발현에 관여하는 조절 엘리먼트는 첫번째 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 서열에 대하여 5'에만 위치하게 된다. 유사하게, 번역 및 전사 종료 신호에 필요한 정지 코돈은 두번째 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 서열에 대하여 3'에만 존재한다.
융합 단백질이 또한 제공된다. 이러한 단백질은 본원에 기술된 폴리펩티드와, 관련되지 않은 면역원성 단백질을 함께 포함한다. 바람직하게는, 상기 면역원성 단백질은 회복(recall) 반응을 유발할 수 있다. 이러한 단백질의 예는 파상풍, 결핵 및 간염 단백질을 포함한다(참조: Stoute et al., New Engl . J. Med. 336:86-91(1997)).
바람직한 구체예에서, 면역학적 융합 파트너는 그람-네거티브 박테리아인 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) B의 표면 단백질인, 단백질 D로부터 유래된다(PCT 국제공개공보 WO 제91/18926호). 단백질 D 유도체는 대략 상기 단백질의 최초 3분의 1(예를 들어, 최초 N-말단의 100 내지 110개의 아미노산)을 포함할 수 있고, 단백질 D 유도체는 지질화될 수 있다. 바람직한 특정 구체예에서, 지질단백질 D 융합 파트너의 최초 109개의 잔기는 추가의 외인성 T 세포 에피토프를 지닌 폴리펩티드를 제공하고 대장균에서의 발현 수준을 증가시키기 위해(이에 따라, 발현 인헨서로 작용함) N-말단에 포함된다. 지질 꼬리는 항원 제시 세포에 대해 최적의 항원 제시를 보장한다. 기타 융합 파트너는 인플루엔자 바이러스로부터의 비구조 단백질인 NS1(헤마글루티닌)을 포함한다. 통상적으로, N-말단의 81개의 아미노산이 사용되나, T 보조 에피토프를 포함하는 다른 단편이 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 면역학적 융합 파트너는 LYTA로 공지된 단백질, 또는 이의 일부(바람직하게는, C-말단 부분)이다. LYTA는 아미다아제 LYTA(LytA 유전자에 의해 엔코딩됨; Gene 43:265-292(1986))로 공지된 N-아세틸-L-알라닌 아미다아제를 합성하는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 유래된다. LYTA는 펩티도글리칸 백본 내의 특정 결합을 특이적으로 분해하는 자가용해효소이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 DEAE와 같은 일부 콜린 유사체에 대한 친화성에 관여한다. 이러한 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 대장균 C-LYTA 발현 플라스미드의 개발에 이용되어 왔다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 공지된 바 있다(참조: Biotechnology 10:795-798(1992)). 한 바람직한 구체예에서, LYTA의 반복 부분이 융합 단백질에 통합될 수 있다. 반복 부분은 잔기 178에서 시작하는 C-말단 영역에서 발견된다. 특히 바람직한 반복 부분은 잔기 188-305에 포함되어 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 폴리펩티드(융합 단백질을 포함함) 및 폴리뉴클레오티드는 동정된다. "동정된" 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 이의 본래의 환경으로부터 분리된 것이다. 예를 들어, 천연 시스템에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 동정되는 경우, 천연적으로 생성된 단백질이 동정된다. 바람직하게는, 이러한 폴리펩티드는 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상 순수하다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 천연 환경의 일부가 아닌 벡터로 클로닝되는 경우 분리된 것으로 간주된다.
T 세포
면역치료 조성물은 또한 또는 대안으로 마이코박테리움 항원에 특이적인 T 세포를 포함할 수 있다. 이러한 세포는 일반적으로 표준 방법을 이용하여 시험관내 또는 생체외에서 제조될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 시판되는 세포 분리 시스템, 예를 들어 넥셀 테라퓨틱스 인크사(Nexell Therapeutics, Inc)가 시판하고 있는 아이솔렉스(Isolex™) 시스템을 이용하여 환자의 골수, 말초혈액, 또는 골수 또는 말초혈액의 분획으로부터 분리될 수 있다(참조: Irvine, CA; 미국 특허 제 5,240,856호; 미국 특허 제 5,215,926호; PCT 국제공개공보 WO 제89/06280호; WO 제91/16116호 및 WO 제92/07243호). 대안으로, T 세포는 관련되거나 관련되지 않은 인간, 인간이 아닌 포유동물, 세포주 또는 배양물로부터 유래될 수 있다.
T 세포는 본 발명의 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 이러한 폴리펩티드를 발현하는 항원 제시 세포(APC)로 자극될 수 있다. 이러한 자극은 상기 폴리펩티드에 특이적인 T 세포의 생성이 발생하기에 충분한 조건과 시간으로 수행된다. 바람직하게는, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 특정 T 세포가 용이하게 생성되도록 하기 위해 마이크로스피어(microsphere)와 같은 전달 비히클 내에 존재하게 된다.
T 세포는 이러한 T 세포가 사이토카인을 특이적으로 증식시키고 분비하거나, 폴리펩티드로 코팅되거나 상기 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 발현하는 표적 세포를 사멸시키는 경우 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 것으로 간주된다. T 세포 특이성은 임의의 다양한 표준 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 크롬 방출 분석 또는 증식 분석에서, 음성 대조군에 비해 용해 및/또는 증식에서 두배 이상 증가한 자극 지수는 T 세포 특이성을 나타낸다. 이러한 분석은, 예를 들어 참고문헌(Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070(1994))에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 대안으로, T 세포의 증식의 검출은 다양한 공지된 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, T 세포 증식은 DNA 합성의 증가된 속도를 측정함으로써 검출될 수 있다(예를 들어, T 세포와 삼중수소 티미딘의 펄스-라벨링(pulse-labeling) 배양 및 DNA로 통합된 삼중수소 티미딘의 양의 측정에 의함). 3-7일 동안 본원발명의 폴리펩티드(100ng/㎖ - 100㎍/㎖, 바람직하게는 200ng/㎖ - 25㎍/㎖)와의 접촉은 T 세포 증식을 두배 이상 증가시키는 결과를 초래할 것임이 틀림이 없다. 사이토 카인의 방출(예를 들어, TNF 또는 IFN-γ) 수준의 2배 증가가 T-세포 활성화의 지표가 되는 표준 사이토카인 검정법을 사용하여 측정하였을 때, 2-3시간 동안의 상기 기술된 바와 같은 접촉은 사이토카인 방출의 수준을 두배이상 증가시키는 결과를 초래할 것임이 틀림이 없다(참조: Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1(1998)). 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 발현 APC에 대한 반응으로 활성화되는 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+일 수 있다. 단백질 특이적 T 세포는 표준 기술을 이용하여 증식시킬 수 있다. 바람직한 구체예에서, T 세포는 환자, 관련 공여자 또는 관련되지 않은 공여자로부터 유래되고, 자극 및 증식 후 환자에게 투여된다.
치료 목적을 위해, 폴리펩티드, 폴리누클레오티드 또는 APC에 대한 반응으로 증식된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 시험관내 또는 생체내에서 수가 늘어날 수 있다. 시험관내에서 상기 T 세포의 증식은 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 인터루킨-2와 같은 T 세포 성장 인자, 및/또는 폴리펩티드를 합성하는 자극 세포의 첨가와 함께 또는 이의 첨가 없이 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드의 면역원성 부분에 해당하는 짧은 펩티드에 다시 노출될 수 있다. 대안으로, ar 단백질의 존재하에서 증식하는 하나 이상의 T 세포는 클로닝에 의해 그 수가 늘어날 수 있다. 세포를 클로닝하는 방법은 본원발명이 속하는 기술분야에 널리 공지되어 있고, 제한 희석을 포함한다.
약제 조성물
추가 구체예에서, 본 발명은 세포 또는 동물에 투여하기 위한 약제학적으로 허용되는 용액 중에 단독으로 존재하거나 하나 이상의 기타 치료종(modality)과 조합된 본원에 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, T-세포, 항체 및 화학요법 조성물의 제형에 관한 것이다.
또한, 요망되는 경우, 본원에 기술된 폴리펩티드의 조성물을 발현하는 핵산 세그먼트(예를 들어, RNA 또는 DNA)가, 예를 들어 기타 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다양한 약제학적 활성제(결핵균 감염에 대하여 효과적인 화학요법제를 포함함)와 같은 기타 작용제와 조합되어 투여될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 사실, 추가 제제가 표적 세포 또는 숙주 조직과 접촉시 심각한 부작용을 야기시키지 않는 한, 포함될 수 있는 기타 성분에는 사실상 제한이 없다. 따라서, 조성물은 특정 경우 필요시 다양한 기타 제제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 숙주 세포 또는 기타 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있거나, 대안으로 본원에 기술된 바와 같이 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 치환되거나 유도된 RNA 또는 DNA 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어 경구, 비경구, 정맥내, 비내, 및 근내 투여 및 제형을 포함하는 다양한 치료 요법에서 본원에 기술된 특정 조성물을 이용하기 위한 적당한 투여 및 치료 섭생이 개발되어 있으므로, 약제학적으로 허용되는 부형제 및 담체 용액의 제형은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 기타 투여 경로는 점막 표면, 예를 들어 질내 투여를 포함한다. 일반적으로, 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 제형은 투여당 약 2㎍ 내지 약 50㎍ Mtb72f 폴리펩티드, 보다 일반적으로 투여당 약 5㎍ 내지 약 40㎍ Mtb72f 폴리펩티드를 전달한다.
1. 경구 전달
특정 적용에서, 본원에 기술된 약제 조성물은 경구 투여를 통해 동물에게 전달될 수 있다. 따라서, 이들 조성물은 비활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 제형화되거나, 하드쉘 또는 소프트쉘 젤라틴 캡슐에 장입되거나, 정제로 압착되거나, 식용 음식에 직접적으로 함유될 수 있다.
활성 화합물은 심지어 부형제와 함께 혼합될 수 있고, 이는 섭취가능한 정제, 구강정, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다(Mathiowitz et al ., 1997; Hwang et al ., 1998; 미국 특허 제 5,641,515호; 미국 특허 제 5,580,579호 및 미국 특허 제 5,792,451호, 이들의 전체 내용은 참조로서 본원에 특별히 통합됨). 정제, 트로키, 환약, 캡슐 등은 또한 다음과 같은 성분들을 포함할 수 있다: 결합제, 예를 들어 검 트래거캔쓰(tragacanth), 아카시아, 옥수수 전분, 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어 디칼슘 포스페이트; 붕해제, 예를 들어 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트; 및 수크로오스, 락토오스 또는 사카린과 같은 감미제 또는 페퍼민트, 동록유(wintergreen) 또는 체리 착향제와 같은 착향제. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 물질과 함께 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 기타 물질이 코팅으로 존재할 수 있거나, 달리 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환약, 또는 캡슐은 쉘락(shellac), 당 또는 이들 둘 모두로 코팅될 수 있다. 엘릭시르의 시럽은 활성 화합물, 감미제로서 수크로오스, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지향과 같은 착향제를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위 형태로 제조시에 사용되는 임의의 물질은 사용되는 양에서 약제학적으로 순수하고 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 지효성 방출 제제 및 제형에 포함될 수 있다.
일반적으로, 이들 제형은 대개 2㎍ 내지 50㎍ 사이의 Mtb72f 폴리펩티드를 포함한다. 당연히, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물 내의 활성 화합물(들)의 양은 임의의 제공된 단위 투여 화합물에서 적당한 투여량이 수득되는 방식으로 제조될 수 있다. 용해성, 생체이용율, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물의 저장 수명과 같은 요인 뿐만 아니라 기타 약리학적 고려 사항이 상기 약제 제형의 제조에서 통상의 기술자에 의해 고려될 것이고, 이에 따라 다양한 투여량 및 치료 섭생이 요망될 수 있다.
경구 투여를 위해, 본 발명의 조성물은 대안으로 구강세척제, 치약, 구강정, 구강 스프레이, 또는 구강 설하 투여 제형의 형태로 하나 이상의 부형제와 함께 혼합(incorporation)될 수 있다. 예를 들어, 구강세척제는 요망되는 양의 활성 성분을 나트륨 보레이트 용액(도벨스 용액(Dobell's Solution))과 같은 적절한 용매와 혼합시킴으로써 제조될 수 있다. 대안으로, 활성 성분은 나트륨 보레이트, 글리세린 및 중탄산칼륨을 함유한 용액과 같은 구강용 용액에 혼합되거나, 치약내에 분산되어 있거나, 물, 결합제, 연마제, 착향제, 기포제, 및 습윤제를 포함할 수 있는 조성물에 치료학적 유효량으로 첨가될 수 있다. 대안으로, 조성물은 혀 밑에 위치되거나 달리 입에서 용해될 수 있는 정제 또는 용액 형태로 제조될 수 있다.
2. 주사 전달
특정 상황에서, 본원에 기술된 약제 조성물은 미국 특허 제5,543,158호; 미국 특허 제5,641,515호 및 미국 특허 제5,399,363호(이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 특별히 통합됨)에 기술된 바와 같이 비경구적으로, 정맥내로, 근내로, 또는 복막내로 전달되는 것이 바람직할 수 있다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 활성 화합물의 용액은 히드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물로 제조될 수 있다. 분산제는 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물, 및 오일로 제조될 수 있다. 보관 및 사용에 관한 통상적인 조건 하에서, 이들 제조물은 미생물의 성장을 예방하기 위해 방부제를 함유한다.
주사용으로 적당한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 수용액 또는 분산액의 즉석의 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(미국 특허 제5,466,468호, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 특별히 포함됨). 모든 경우에서, 상기 형태는 멸균 상태여야 하고, 용이한 주사가 가능하게 하는 정도의 유동성이 있어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건하에서 안정적이어야 하고, 박테리아와 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성이 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산제의 경우 요망되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 촉진될 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 조성물의 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 주사용 조성물의 흡수가 연장될 수 있다.
수용액의 비경구 투여를 위해, 예를 들어 용액은 필요시 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 우선 충분한 염수 또는 글루코오스를 이용하여 등장성이 되도록 해야 한다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근내, 피하 및 복막내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 출원의 견지에서 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 1회 투여량은 1㎖의 등장성 NaCl 용액에 용해되고, 1000㎖의 대량 피하주사 용액에 첨가되거나 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035-1038 and 1570-1580). 투여량의 약간의 변화가 치료되는 피검체의 상태에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 임의의 경우에서 개개 환자에 대하여 적절한 용량을 결정할 것이다. 더욱이, 인간에게 투여하기 위해, 제제는 미국 식품의약품국의 생물학제제 표준에 의해 요구되는 바와 같은 불임증, 발열원성, 및 일반적인 안정성 및 순도 표준을 충족해야 한다.
멸균 주사액은 요구되는 분량의 활성 화합물을 상기 열거된 다양한 기타 성분을 함유한 적절한 용매에 혼합하고, 필요에 따라, 멸균 여과시킴으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 다양한 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼합시킴으로써 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 이의 제조를 위한 바람직한 방법은 활성 성분과 더불어 이의 사전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가로 요망되는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
본원에 기술된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가염(단백질의 유리 아미노기를 이용하여 형성됨)을 포함하는데, 상기 염은 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등을 사용하여 만들어진다. 유리 카르복실기를 이용하여 형성된 염은 또한 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화제이철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다. 제형화한 후, 용액은 제형의 투여량과 호환되는 방식으로 투여될 것이고, 이러한 양은 치료적으로 유효한 양일 것이다. 제형은 주사 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여된다.
본원에서 사용되는 "담체"는 임의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 완충용액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 상기 매질 및 작용제의 용도는 본원발명이 속하는 기술분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적 매질 또는 작용제가 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 치료 조성물에서의 이의 용도가 고려된다. 보조 활성 성분이 또한 조성물에 포함될 수 있다.
어구 "약제학적으로 허용되는"은 인간에게 투여되는 경우 알레르기 또는 유사한 성가신 반응을 일으키지 않는 분자 실재물 및 조성물을 의미한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수용성 조성물의 제조는 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지되어 있다. 통상적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 주사가능한 용액으로 제조되고; 주사 전에 액체 형태의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 제조물은 또한 유화될 수 있다.
3. 비강 및 구강 전달
특정 구체예에서, 약제 조성물은 비내 스프레이, 구강 스프레이, 흡입, 및/또는 기타 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 유전자, 핵산 및 펩티드 조성물을 비강 및 구강 에어로졸 스프레이를 통해 폐로 직접 전달하는 방법은, 예를 들어 미국 특허 제 5,756,353호 및 미국 특허 제 5,804,212호(이들의 전체 내용은 참조로서 본원에 특별히 포함됨)에 기술되어 있다. 또한, 비내 미세입자 수지(Takenaga et al ., 1998) 및 라이소포스파티딜-글리세롤 화합물(미국 특허 제 5,725,871호, 이의 내용은 참조로서 본원에 특별히 포함됨)을 이용한 약물의 전달은 또한 약학 분야에 널리 공지되어 있다. 또한, 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroetheylene) 지지 매트릭스 형태의 경점막 약물 전달은 미국 특허 제 5,780,045호(이의 내용은 참조로서 본원에 특별히 포함됨)에 기술되어 있다.
4. 리포좀 -매개, 나노캡슐-매개, 및 미세입자-매개 전달
특정 구체예에서, 본 발명자들은 본원발명의 조성물을 적절한 숙주 세포로 도입시키기 위해 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 마이크로스피어, 지질 입자, 비히클 등의 이용을 고려하고 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 전달을 위해 지질 입자, 리포좀, 비히클, 나노구, 또는 나노입자 등에 캡슐화되어 제형화될 수 있다.
이러한 제형은 본원에 기술된 핵산 또는 컨스트럭트의 약제학적으로 허용되는 제형을 도입하는데 바람직할 수 있다. 리포좀의 형성 및 용도는 일반적으로 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다(참조예: Couvreur et al., 1977; Couvreur, 1988; Lasic, 1998; 세포내 세균 감염 및 질병에 대한 표적화된 항생제 요법에서의 리포좀 및 나노캡슐의 용도를 기술함). 최근, 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 지닌 리포좀이 개발되었다(Gabizon & Papahadjopoulos, 1988; Allen and Choun, 1987; 미국 특허 제 5,741,516호, 이의 내용은 참조로서 본원에 특별히 포함됨). 추가로, 잠재적 약물 담체로서 리포좀 및 리포좀 유사 제조물에 관한 다양한 방법이 검토되었다(Takakura, 1998; Chandran et al ., 1997; Margalit, 1995; 미국 특허 제 5,567,434호; 미국 특허 제 5,552,157호; 미국 특허 제 5,565,213호; 미국 특허 제 5,738,868호 및 미국 특허 제 5,795,587호, 이들의 전체 내용은 참조로서 본원에 특별히 포함됨).
리포좀은 T 세포 현탁, 1차 간세포 배양 및 PC12 세포를 포함하는 기타 방법에 의한 트랜스펙션에 일반적으로 내성을 나타내는 다수의 세포 유형과 함께 성공적으로 사용되어 왔다(Renneisen et al ., 1990; Muller et al ., 1990). 또한, 리포좀은 바이러스-기반 전달 시스템에서의 통상적인 DNA 길이 제한으로부터 자유롭다. 리포좀은 유전자, 약물(Heath & Martin, 1986; Heath et al ., 1986; Balazsovits et al ., 1989; Fresta & Puglisi, 1996), 방사선치료제 (Pikul et al., 1987), 효소(lmaizumi et al ., 1990a; Imaizumi et al ., 1990b), 바이러스(Faller & Baltimore, 1984), 전사 인자 및 다른자리입체성효과인자(Nicolau & Gersonde, 1979)를 배양된 다양한 세포주 및 동물에 도입시키는데 있어서 효과적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀 매개 약물 전달의 유효성을 시험하는 여러 성공적인 임상 실험이 완료되었다(Lopez-Berestein et al ., 1985a; 1985b; Coune, 1988; Sculier et al ., 1988). 더욱이, 여러 연구는 리포좀의 사용이 전신 전달 후에 자가면역 반응, 독성 또는 성선 국소화와 관련되지 않다는 것을 시사한다(Mori & Fukatsu, 1992).
리포좀은 수용성 매질 내에 분산된 인지질로부터 형성되고, 동시에 다층 동심 이중층 소포(다중층 비히클(multilamella vesicles, MLVs)로도 언급됨)를 형성한다. MLV는 일반적으로 25nm 내지 4μm의 직경을 지닌다. MLV에 대한 음파 처리는 결과적으로 코어 내에 수용액을 함유하는, 200 내지 500Å의 범위의 직경을 지니는 작은 단일층 소포(SUV)를 형성시킨다.
리포좀은 세포막과 유사성을 지니고, 펩티드 조성물을 위한 담체로서 본 발명과 연계하여 사용하는 것이 고려된다. 이들은 수용성 공간 및 이중층 자체 내에 제각기 포획될 수 있는 수용성 및 지질 용해성 물질에 매우 적합하다. 리포좀 제형을 선택적으로 변형시킴으로써 심지어 활성제의 위치-특이적 전달에 약물-함유 리포좀을 사용하는 것이 가능할 수 있다.
코우브러 등의 문헌(Couvreur et al . (1977; 1988))의 교시 이외에, 하기의 정보가 리포좀 제형을 생성시키는데 이용될 수 있다. 인지질은 물에 대한 지질의 몰비에 따라, 물에 분산되는 경우 리포좀이 아닌 다양한 구조를 형성할 수 있다. 몰비가 낮을 때 리포좀은 바람직한 구조를 이루게 된다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 이가 양이온의 존재에 좌우된다. 리포좀은 이온 및 극성 물질에 대해 낮은 투과성을 나타낼 수 있으나, 상승된 온도에서 이들의 투과성이 현저하게 변환되는 상 전이를 일으킨다. 상 전이는 젤 상태로 공지된, 빽빽하게 패키징된 정돈된 구조로부터 액체 상태로 공지된, 느슨하게 패키징된 덜 정돈된 구조로의 변화를 포함한다. 이는 특징적인 상-전이 온도에서 발생하고, 결과적으로 이온, 당 및 약물에 대한 투과성을 증가시킨다.
온도 이외에, 단백질에 대한 노출이 리포좀의 투과성을 변화시킬 수 있다. 예컨대 시토크롬 c와 같은, 특정 가용성 단백질은 이중충에 결합하고, 이를 변형시키고, 이중층을 투과하여, 투과성을 변화시킨다. 콜레스테롤은 명백히 인지질을 더욱 단단하게 패킹시킴으로써 이러한 단백질의 투과를 억제한다. 항생제 및 억제제 전달을 위한 가장 유용한 리포좀 제형은 콜레스테롤을 함유할 것으로 예상된다.
용질을 포획하는 능력은 여러 유형의 리포좀 사이에서 다양하다. 예를 들어, MLV는 용질 포획에서 적당히 효율적이나, SUV는 매우 비효율적이다. SUV는 크기 분배에서 동질성 및 재현성의 장점을 제공하나, 크기 및 포획 효율 사이의 절충은 거대 단층 비히클(LUV)에 의해 제공된다. 이들은 에테르 증발로 제조되고, 용질 포획에서 MLV 보다 3 내지 4배 더 효율적이다.
리포좀 특성 이외에, 화합물 포획에서 중요한 결정인자는 화합물 그 자체의 물리화학적 특성이다. 극성 화합물은 수용성 공간에서 포획되고, 비극성 화합물은 소포의 지질 이중층에 결합한다. 극성 화합물은 투과를 통해 방출되거나, 이중층이 파괴되는 경우에 방출되나, 비극성 화합물은 이중층이 온도에 의해 분열되거나 지질단백질에 노출되어 파괘되지 않는 한 이중층과 결합된 상태로 존재한다. 둘 모두의 유형은 상 전이 온도에서 최대 유출 속도를 나타낸다.
리포좀은 다음과 같은 네가지 상이한 메커니즘을 통해 세포와 상호작용한다: 대식세포 및 중성구와 같은 세망내피 시스템의 식세포에 의한 세포내이입; 비특이적인 약한 소수성 또는 정전기적 작용력(forces), 또는 세포 표면 구성요소들과의 특이적 상호작용에 의한 세포 표면으로의 흡착; 세포질로의 리포좀 성분의 동시적 방출과 함께 원형질막으로의 리포좀의 지질 이중층의 삽입에 의한 혈장 세포막과의 융합; 및 리포좀 성분의 임의의 회합 없이, 세포 또는 세포하막으로의 리포좀 지질의 이동, 또는 그 반대. 흔히, 어느 메커니즘이 활동적이고 하나 이상의 메커니즘이 동일한 시간에 작동할 것인지를 결정하는 것은 어렵다.
정맥내 주사된 리포좀의 운명 및 배치는 이들의 물리적 특성, 예를 들어 크기, 유동성, 및 표면 전하에 좌우된다. 이들은 이들의 조성, 및 수분 내지 수시간에 달하는 혈액내 반감기에 따라, 수시간 또는 수일 동안 조직 내에서 존속할 수 있다. MLV 및 LUV와 같은 보다 큰 리포좀은 세망내피 시스템의 식세포에 의해 신속하게 흡수될 수 있으나, 순환계의 생리기능은 상기 거대종이 대부분의 부위에서 방출되는 것을 억제한다. 이들은 예컨대, 간 또는 비장의 동양혈관(sinusoids)과 같은 거대한 모세혈관 내피 내에 구멍 또는 기공이 존재하는 장소에만 존재할 수 있다. 따라서, 이러한 기관은 우세한 흡수 부위이다. 또 다른 한편으로, SUV는 보다 광범위한 조직 분포를 나타내나, 그럼에도 불구하고 간 및 비장에서 고도로 격리된다. 일반적으로, 이러한 생체내 행동은 거대한 크기의 리포좀을 수용하기 쉬운 기관 및 조직에 국한된 표적화로 리포좀의 잠재적 표적화를 제한한다. 상기한 기관 및 조직에는 혈액, 간, 비장, 골수, 및 림프기관이 포함된다.
표적화는 일반적으로 본 발명과 관련하여 제한되지 않는다. 그러나, 특이적 표적화가 요망되어야 하는 경우, 이를 달성하기 위한 방법을 이용할 수 있다. 리포좀 표면에 결합시키고, 항체 및 이의 약물 내용물을 특정 세포 유형 표면 상에 위치한 특정 항원 수용체로 유도시키기 위해 항체를 사용할 수 있다. 탄수화물 결정인자(세포-세포 인지, 상호작용 및 부착에서 역할을 하는 당단백질 또는 당지질 세포 표면 성분)가 또한 인지 부위로 사용될 수 있는데, 이는 상기 결정인자들이 리포좀을 특정 세포 유형으로 유도하는데 있어 잠재능력을 발휘할 수 있기 때문이다. 대부분, 리포좀 제조물의 정맥내 주사를 사용할 것으로 예상되나, 기타 투여 경로가 또한 고려될 수 있다.
대안으로, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물의 약제학적으로 허용되는 나노캡슐 제형을 제공한다. 나노캡슐은 일반적으로 안정적이고 재현가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다(Henry-Michelland et al ., 1987; Quintanar-Guerrero et al., 1998; Douglas et al ., 1987). 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 초미립 입자(약 0.1㎛의 크기)가 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 이용하여 디자인되어야 한다. 본 발명에서의 사용을 위하여 상기 요건을 충족시키는 생분해가능한 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 고려된다. 상기 입자는 문헌(Couvreur et al ., 1980; 1988; zur Muhlen et al ., 1998; Zambaux et al . 1998; Pinto-Alphandry et al ., 1995 및 미국 특허 제 5,145,684호, 이들의 전체내용은 참조로서 본원에 특별히 포함됨)에 기술된 바와 같이 용이하게 제조될 수 있다.
백신
본 발명의 바람직한 특정 구체예에서, 백신이 제공된다. 백신은 일반적으로 면역자극제와 조합된, 상기에서 기술된 것과 같은 하나 이상의 약제 조성물을 포함할 것이다. 면역자극제는 외래 항원에 대한 면역 반응(항체 및/또는 세포 매개를 포함함)을 향상시키거나 효력을 강화하는 임의의 물질일 수 있다. 면역자극제의 예는 애주번트, 생분해성 마이크로스피어(예를 들어, 폴리락틱 갈락티드) 및 리포좀(상기 화합물이 포함되는 리포좀; 참조예: Fullerton, 미국 특허 제 4,235,877호)을 포함한다. 백신 제조물은 일반적으로, 예를 들어 문헌(Powell & Newman, eds., Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach) (1995))에 기술되어 있다. 본 발명의 범위 내의 약제 조성물 및 백신은 또한 생물학적으로 활성 또는 비활성일 수 있는 기타 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 기타 종양 항원의 하나 이상의 면역원성 부분은 조성물 또는 백신 내에서 융합 폴리펩티드로 통합되거나 별개의 화합물로 존재할 수 있다.
예시적 백신은 상기 기술된 것과 같은 하나 이상의 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA를 함유할 수 있고, 상기 폴리펩티드는 제자리에서(in situ) 생성된다. 상기 언급한 바와 같이, DNA는 핵산 발현 시스템, 박테리아 및 바이러스 발현 시스템을 포함하는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 전달 시스템 내에 존재할 수 있다. 다수의 유전자 전달 기술은 문헌(Rolland, Crit . Rev . Therap . Drug Carrier Systems 15:143-198(1998)), 및 이에 인용된 참조문헌과 같이, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지되어 있다. 적절한 핵산 발현 시스템은 환자에서의 발현에 필요한 DNA 서열(예를 들어, 적당한 프로모터 및 종결 신호)을 함유한다. 박테리아 전달 시스템은 세포 표면 상에서 폴리펩티드의 면역원성 부분을 발현하거나 에피토프를 분비하는 박테리아 숙주 세포(예를 들어, 마이코박테리움, 바실러스 또는 락토바실러스 종(바실러스-칼메테-게링(Bacillus - Calmette - Guerrin) 또는 락토코커스 종을 포함함))의 투여를 포함한다(참조예: Ferreira, et al., An Acad Bras Cienc(2005) 77:113-124; 및 Raha, et al., Appl Microbiol Biotechnol(2005) PubMedID15635459)). 바람직한 일 구체예에서, DNA는 바이러스 발현 시스템(예를 들어, 백시니아 또는 기타 폭스 바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노바이러스)을 이용하여 도입될 수 있는데, 상기 시스템은 비병원성(결함있는), 복제 적격 바이러스의 사용을 포함할 수 있다. 적절한 시스템의 일예는 다음 문헌에 기술되어 있다: Fisher-Hoch et al ., Proc . Natl . Acad . Sci USA 86:317-321(1989); Flexner et al ., Ann . N.Y. Acad . Sci 569:86-103(1989); Flexner et al ., Vaccine 8:17-21(1990); 미국 특허 제 4,603,112호, 제 4,769,330호, 및 제 5,017,487호; PCT 국제공개공보 WO 제 89/01973호; 미국 특허 제 4,777,127호; GB 제 2,200,651호; EP 제 0,345,242호; PCT 국제공개공보 WO 제 91/02805호; Berkner, Biotechniques 6:616-627(1988); Rosenfeld et al ., Science 252:431-434(1991); Kolls et al ., Proc. Natl . Acad . Sci USA 91:215-219(1994); Kass-Eisler et al ., Proc . Natl . Acad. Sci USA 90:11498-11502(1993); Guzman et al ., Circulation 88:2838-2848(1993); 및 Guzman et al ., Cir . Res . 73:1202-1207(1993). DNA를 이러한 발현 시스템에 통합시키는 기술은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. DNA는 또한, 예를 들어 울머 등의 논문(Ulmer et al ., Science 259:1745-1749(1993))에서 소개되고, 코헨의 논문(Cohen, Science 259:1691-1692(1993))에서 고찰된 바와 같이, "네이키드(naked)" DNA일 수 있다. 네이키드 DNA의 흡수는 생분해성 비드에 DNA를 코팅시킴으로써 증가될 수 있는데, 상기 비드는 세포내로 효율적으로 운반된다. 백신이 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 성분 둘 모두를 포함할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 이러한 백신은 향상된 면역 반응을 제공할 수 있다.
백신이 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 약제학적으로 허용되는 염을 함유할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 이러한 염은 유기 염기(예를 들어, 1차, 2차 및 3차 아민의 염 및 염기성 아미노산) 및 무기 염기(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘염)를 포함하는 약제학적으로 허용되는 비독성 염기로부터 제조될 수 있다.
본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 담체가 본원발명의 백신 조성물에 사용될 수 있고, 한편 담체의 유형은 투여 방법에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 조성물은, 예를 들어 국소, 경구, 비내, 정맥내, 두개내, 복막내, 피하 또는 근내 투여를 포함하는 임의의 적절한 투여 방식에 적합하게 제형화될 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여를 위해, 담체는 바람직하게는 물, 염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충용액을 포함한다. 경구 투여를 위해, 상기 담체 또는 고형 담체 중 임의의 것, 예를 들어 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 및 탄산 마그네슘이 사용될 수 있다. 생분해성 마이크로스피어(예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)가 또한 본 발명의 약제 조성물을 위한 담체로 사용될 수 있다. 적절한 생분해성 마이크로스피어는, 예를 들어 미국 특허 제 4,897,268호; 제 5,075,109호; 제 5,928,647호; 제 5,811,128호; 제 5,820,883호; 제 5,853,763호; 제 5,814,344호 및 제 5,942,252호에 기술되어 있다. 숙주에서 클래스Ⅰ-제한 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 수 있는, 미국 특허 제 5,928,647호에 기술된 미립자-단백질 복합체를 포함하는 담체가 또한 사용될 수 있다.
이러한 조성물은 또한 완충용액(예를 들어, 중성 완충 염수 또는 인산 완충 염수), 탄수화물(예를 들어, 글루코오스, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산, 항산화제, 정균제, EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제, 애주번트(예를 들어, 수산화알루미늄), 제형이 수혈받는자의 혈액과 등장성, 저장성 또는 약간 고장성이 되도록 하는 용질, 현탁제, 증점제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 조성물은 동결건조물로 제형화될 수 있다. 화합물은 또한 널리 공지된 기술을 이용하여 리포좀 내에 캡슐화될 수 있다.
임의의 다양한 면역자극제가 본원발명의 백신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 애주번트가 포함될 수 있다. 대부분의 애주번트는 신속한 이화작용으로부터 항원을 보호하기 위해 디자인된 물질, 예를 들어 수산화알루미늄 또는 광유, 및 면역 반응의 자극제, 예를 들어 지질 A, 보르타델라 퍼투시스(Bortadella pertussis) 또는 미코박테리움종 또는 미코박테리움 유래 단백질을 함유한다. 예를 들어, 탈지화되고, 탈당지질화된 M. 백캐(M. vaccae)("pVac")가 사용될 수 있다. 적절한 애주번트는 시중에서 구매하여 사용할 수 있는데, 상기 애주번트의 예로는 프로인트 불완전 애주번트(Freund's Incomplete Adjuvant) 및 완전 애주번트 (Difco Laboratories, Detroit, MI); 머크(Merck) 애주번트 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS01B, AS02A, AS15, AS-2 및 이의 유도체(GlaxoSmithKline, Philadelphia, PA); CWS, TDM, Leif, 수산화알루미늄 겔(alum) 또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄 염; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 티로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당; 양이온적 또는 음이온적으로 유도된 다당류; 폴리포스파젠; 생분해성 마이크로스피어; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼(quil) A가 있다. GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7 또는 -12와 같은 사이토카인이 또한 애주번트로 사용될 수 있다.
본원에 제공된 백신에서, 애주번트 조성물은 Th1 타입의 면역 반응을 우세하게 유도하도록 디자인될 수 있다. 고수준의 Th1-타입 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대해 세포 매개 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있다. 대조적으로, 고수준의 Th2-타입 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액성 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있다. 본원에 제공된 백신의 적용후, 환자는 Th1- 및 Th2-타입 반응을 포함하는 면역 반응이 증가될 것이다. 반응이 주로 Th1-타입인 바람직한 구체예에서, Th1-타입 사이토카인의 수준은 Th2-타입 사이토카인의 수준 보다 훨씬 높은 수준으로 증가할 것이다. 이들 사이토카인의 수준은 표준 분석을 이용하여 용이하게 측정될 수 있다. 사이토카인의 구성원에 대하여 고찰하기 위해서는, 다음 문헌을 참조하라: Mosmann & Coffman, Ann . Rev . Immunol. 7:145-173 (1989).
Th1-타입 반응을 우세하게 유도하는데 사용하기 위한 바람직한 애주번트는, 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)의 조합물을 포함하는데, 선택적으로 알루미늄 염이 포함된다(참조예: Ribi, et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, pp. 407-419; GB 2122204B; GB 2220211; 및 US 4,912,094). MPL 애쥬번트는 코리사 코포레이션(Corixa Corporation; Seattle, WA; 미국 특허 제 4,436,727호; 제 4,877,611호; 제 4,866,034호 및 제 4,912,094호 참조)이 판매하는 제품을 사용할 수 있다.
CpG-함유 올리고뉴클레오티드(CpG 디뉴클레오티드는 메틸화되지 않음)가 또한 Th1 반응을 우세하게 유도한다. CpG는 DNA 중에 존재하는 시토신-구아노신 디뉴클레오티드(cytosine-guanosine dinucleotide) 모티프의 축약어이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 널리 공지되어 있고, 예를 들어, PCT 국제공개공보 WO 제 96/02555호, WO 제 99/33488호 및 미국 특허 제 6,008,200호 및 제 5,856,462호에 기술되어 있다. 면역자극 DNA 서열은 또한, 예를 들어, 사토 등의 논문(Sato et al., Science 273:352(1996))에 기술되어 있다. 백신으로 제형화될 경우, CpG는 일반적으로 유리 항원과 함께(PCT 국제공개공보 WO 제 96/02555호; McCluskie and Davis, 전게서) 또는 항원에 공유결합적으로 결합되어(PCT 국제공개공보 WO 제 98/16247호) 자유 용액으로 투여되거나, 수산화 알루미늄과 같은 담체와 함께 제형화된다((Hepatitis surface Antigen) Davis et al. 전게서; Brazolot-Millan et al., Proc . Natl . Acad . Sci, USA, 1998, 95(26), 15553-8). CpG는 또한 전신 및 점막 경로 둘 모두로 투여될 수 있는 애주번트가 되는 것으로 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있다(PCT 국제공개공보 WO 제 96/02555호, EP 468520, Davis et al., J. Immunol, 1998, 160(2):870-876; McCluskie and Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6).
또 다른 바람직한 애쥬번트는 사포닌 또는 사포닌 모방체 또는 유도체, 바람직하게는 QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA)인데, 이는 단독으로 또는 다른 애주번트와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 향상된 시스템은 PCT 국제공개공보 WO 제 94/00153호에 기술된 QS21 및 3D-MPL의 조합물과 같은, 모노포스포릴 리피드 A 및 사포닌 유도체의 조합물, 또는 PCT 국제공개공보 WO 제96/33739호에 기술된, QS21이 콜레스테롤로 켄칭된, 더 적은 면역반응유발(reactogenic) 조성물을 포함한다. 다른 바람직한 제형은 수중유 및 토코페롤을 함유한다. 수중유 중에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 함유하는 특히 유력한 애주번트는 PCT 국제공개공보 WO 제95/17210호에 기술되어 있다. 본 발명에 사용되는 추가 사포닌 애주번트는 QS7(PCT 국제공개공보 WO 제96/33739호 및 WO 제96/11711호에 기술됨) 및 QS17(미국 특허 제 5,057,540호 및 EP 0 362 279 Bl호에 개시됨)를 포함한다.
다른 바람직한 애쥬번트는 몬타니드(Montanide) ISA 720(Seppic, France), SAF(Chiron, California, United States), ISCOMS(CSL), MF-59(Chiron), SBAS 시리즈 애쥬번트(예를 들어, SBAS-2, AS2', AS2'', SBAS-4, 또는 SBAS6, 벨기에, 릭센싸트(Rixensart) 소재, 글락소스미스클라인으로부터 구매가능), Detox(Corixa, Hamilton, MT), RC-529(Corixa, Hamilton, MT) 및 계류 중인 미국 특허출원 번호 제 08/853,826호 및 제 09/074,720호(이들의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨)에 기술된 것과 같은 기타 아미노알킬 글루코오스아미니드 4-포스페이트(AGP)를 포함한다.
애주번트의 추가 예로서 합성된 MPL 및 시가(Shiga) 독소 B 소단위체에 기초한 애주번트가 포함된다(참조: PCT 국제공개공보 WO 제2005/112991호).
본원에 제공된 임의의 백신은 결과적으로 항원, 면역 반응 증강제 및 적절한 담체 또는 부형제의 조합물이 획득되게 하는 널리 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 지효성 방출 제형(즉, 투여 후에 화합물의 느린 방출을 야기시키는 캡슐, 스폰지 또는 젤(예를 들어, 다당류로 구성됨)과 같은 제형)의 일부로 투여될 수 있다. 이러한 제형은 일반적으로 널리 공지된 기술(참조예: Coombes et al ., Vaccine 14:1429-1438(1996))을 이용하여 제조될 수 있고, 예를 들어 경구, 직장 또는 피하 주입에 의해 투여되거나 요망되는 표적 부위에서의 주입에 의해 투여될 수 있다. 지효성 방출 제형은 담체 매트릭스에 분산되고/되거나 속도 조절 막에 의해 둘러싸인 저장소 내에 함유된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체를 포함할 수 있다.
상기 제형 내에서 사용하기 위한 담체는 생체적합성이고, 또한 생분해성일 수 있고; 바람직하게는 상기 제형은 비교적 일정한 수준의 활성 성분 방출을 제공한다. 이러한 담체는 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로오스, 덱스트란 등의 미세입자를 포함한다. 기타 지연 방출 담체는 초분자 생체벡터(supermolecular biovectors)를 포함하는데, 상기 벡터는 비-액체 친수성 코어(예를 들어, 가교된 다당류 또는 올리고당류)와 선택적으로 인지질과 같은 양친매성 화합물을 함유하는 외부층을 포함한다(참조예: 미국 특허 제 5,151,254호 및 PCT 국제공개공보 WO 제94/20078호, WO 제94/23701호 및 WO 제96/06638호). 지효성 방출 제형 내에 함유된 활성 화합물의 양은 주입 부위, 방출의 속도 및 예상 기간, 및 치료되거나 예방되어야 할 질환의 특성에 따라 달라진다.
임의의 다양한 전달 비히클이 종양 세포를 표적으로 하는 항원 특이적 면역 반응의 생성을 촉진시키기 위해 약학적 조성물 및 백신 내에서 사용될 수 있다. 전달 비히클은 수지상세포, 대식세포, B 세포, 단핵구 및 효과적인 APC가 되도록 유전공학적으로 조작될 수 있는 기타 세포와 같은 항원 제시 세포(APC) 를 포함한다. 이러한 세포는 T 세포 반응의 활성화 및/또는 유지를 개선시키고/시키거나, 그 자체로 항종양 효과를 지니고/지니거나, 수용자에 면역학적으로 양립되도록(즉, HLA 일배체형(haplotype)의 매칭) 하기 위해, 항원 제시 능력이 증가되도록 유전적으로 변형될 수 있으나, 반드시 그렇게 해야 하는 것은 아니다. APC는 일반적으로 종양 및 종양주위 조직을 포함하는 임의의 다양한 생물학적 유동체 및 기관으로부터 단리될 수 있고, 이는 자가유래(autologous) 세포, 동종유래(allogenic) 세포, 유전적 동계(syngeneic) 세포 또는 이종유래(xenogenic) 세포일 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서는 항원 제시 세포로서 수지상세포 또는 이의 전구세포를 사용한다. 수지상 세포는 매우 능력있는 APC이고(Banchereau & Steinman, Nature 392:245-251 (1998)), 예방적 또는 치료적 항종양 면역을 유발시키기 위한 생리학적 애주번트로서 효과적인 것으로 밝혀져 있다(참조: Timmerman & Levy, Ann . Rev . Med . 50:507-529 (1999)). 일반적으로, 수지상 세포는 이들의 전형적인 형태(시험관내에서 관찰가능한 현저한 세포질 가공(수상돌기)을 지니는, 제자리(in situ) 성상임), 높은 효율로 항원을 흡수하고, 가공하고, 제시하는 이들의 능력, 및 나이브(naive) T 세포 반응을 활성화시키는 이의 능력에 기초하여 동정될 수 있다. 수지상 세포는 물론 생체내 또는 생체외에서 수지상 세포에서 일반적으로 발견되지 않는 특정 세포 표면 수용체 또는 리간드를 발현시키기 위해 유전공학적으로 조작될 수 있고, 이러한 변형된 수지상 세포가 본 발명에 의해 예상된다. 수지상 세포에 대한 대안으로서, 분비 소포 항원이 로딩된 수지상 세포(소위 엑소솜)이 백신 내에 사용될 수 있다(참조: Zitvogel et al ., Nature Med. 4:594-600 (1998)).
수지상 세포 및 전구세포는 말초 혈액, 골수, 종양 침윤 세포, 종양주위 조직 침윤 세포, 림프절, 비장, 피부, 제대혈 또는 임의의 기타 적절한 조직 또는 액체로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 말초 혈액으로부터 수거된 단핵구의 배양물에, GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFα와 같은 사이토카인의 조합물을 첨가함으로써 생체외에서 분화될 수 있다. 대안으로, 말초 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 수집된 CD34 양성 세포는 배지에 GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 및/또는 수지상 세포의 분화, 성숙 및 증식을 유도하는 기타 화합물(들)을 첨가함으로써 수지상 세포로 분화될 수 있다.
수지상 세포는 편의상 "미성숙" 및 "성숙" 세포로 분류될 수 있고, 상기 분류는 충분히 특성규명된 두 표현형 간의 구별을 위한 간단한 방법을 제공한다. 그러나, 이러한 명명법은 모든 가능한 분화의 중간 단계를 배제시키는 것으로 간주되어선 안된다. 미성숙 수지상 세포는 Fcγ 수용체 및 만노오스 수용체의 높은 발현과 관련된, 항원 흡수 및 가공에 대한 높은 능력을 지니는 APC로 특성규명되어 있다. 성숙 표현형은 전형적으로 상기 마커가 적게 발현되나, 클래스 Ⅰ 및 Ⅱ MHC, 부착 분자(예를 들어, CD54 및 CD11) 및 공동자극 분자(예를 들어, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)와 같은 T 세포 활성화에 관여하는 세포 표면 분자는 높게 발현되는 것을 특징으로 한다.
APC는 일반적으로 단백질(또는 이의 일부분 또는 기타 변이체)을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션될 수 있고, 상기 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 부분은 세포 표면에서 발현된다. 상기 트랜스펙션은 생체외에서 일어날 수 있고, 그런 다음 상기 트랜스펙션된 세포를 포함하는 조성물 또는 백신은 본원에 기술된 바와 같이 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 수지상 세포 또는 기타 항원 제시 세포를 표적으로 삼는 유전자 전달 비히클은 환자에 투여될 수 있는데, 이는 결과적으로 트렌스펙션이 생체내에서 발생되도록 한다. 예를 들어, 수지상 세포의 생체내 및 생체외 트랜스펙션은 일반적으로 PCT 국제공개공보 WO 제97/24447호에 기술된 것과 같은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 임의의 방법, 또는 문헌(Mahvi et al ., Immunology and Cell Biology 75:456-460 (1997))에 기술된 유전자총 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 수지상 세포의 항원 로딩은 수지상 세포 또는 전구세포를 폴리펩티드, DNA(네이키드 또는 플라스미드 벡터 내의 DNA) 또는 RNA; 또는 항원 발현 재조합 세균 또는 바이러스(예를 들어, 백시니아, 조류폭스, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터)와 함께 인큐베이션시킴으로써 달성될 수 있다. 로딩 전에, 폴리펩티드는 T 세포 도움을 제공하는 면역학적 파트너(예를 들어, 담체 분자)에 공유적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 대안으로, 수지상 세포는 단독으로 또는 폴리펩티드의 존재하에서 컨쥬게이션되지 않은 면역학적 파트너와 함께 펄싱(pulsing)될 수 있다.
백신 및 약제 조성물은 밀봉된 앰플 또는 바이얼과 같은, 단위 용량 또는 다용량 용기로 제공될 수 있다. 이러한 용기는 바람직하게는 사용시까지 제형의 무균성을 보존하기 위해 밀봉될 수 있다. 일반적으로, 제형은 유성(oily) 또는 수용성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로 저장될 수 있다. 대안으로, 백신 또는 약제 조성물은 사용 직전에 단지 멸균 액체 담체의 첨가만을 필요로 하는 동결건조된 상태로 저장될 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 공개문헌 및 특허 문헌은, 각각의 개별 공개문헌 또는 특허 문헌이 참조로서 본원에 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 명시되어 있는 경우, 본원의 참고문헌으로써 여기에 통합된다.
앞서 언급한 본 발명은 명료한 이해를 목적으로 예시 및 실예를 제시하는 방식으로 다소 상세하게 기술되어 왔으나, 본 발명의 교시를 고려할 때 첨부된 청구항들의 사상 또는 범위로부터 벗어남이 없이 특정한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
실시예
하기 실시예는 예시를 위한 목적으로 제시된 것일 뿐 본 발명을 이에 국한하려는 의도로 제시된 것은 아니다. 통상의 기술자는 본질적으로 유사한 결과가 양산되도록 하기 위하여 변화 또는 변형될 수 있는 중요하지 않은 다양한 파라미터를 용이하게 인지할 것이다.
실시예 1: Mtb72f (히스티딘 태그 없슴 )(서열번호:6)의 제조
Mtb72f 발현 벡터의 제작
Mtb72f는 2개의 마이코박테리움 튜버큘로시스 단백질, Mtb32와 Mtb39로 만들어진 융합 단백질이다. Mtb72f는 다음과 같이 Mtb39와 Mtb32의 N 말단 및 C 말단을 융합시킴으로써 제작된다: Mtb32 C-말단- Mtb39- Mtb32 N-말단. 구체적으로, Mtb72f 단백질은 Mtb32의 ~14 kDa C-말단 단편(잔기 192-323; 132개 아미노산)을 엔코딩하는 개방해독틀(ORF)을 전장길이의 Mtb39에 앞뒤 나란히 정렬시켜(in tandem) 연속적으로 연결시키고 바로 다음에 연이어서 C-말단에 Mtb32의 ~20-kDa N-말단 부분(잔기 1-195)을 연결시킴으로써 생성된다. 이는 특유한 제한효소부위(EcoRⅠ 및 EcoRＶ)를 포함하는 서열-특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행되며, 결핵균 종 H37Rv으로부터의 게놈 DNA 중 중합효소연쇄반응(PCR)의 종결을 위한 C-말단의 종결 코돈은 제거된다(Mtb32-C 및 Mtb39의 경우).
상기 과정의 상세한 절차는 다음과 같다:
제일 먼저, 다음 올리고뉴클레오티드와 함께 PCR을 이용하여 Mtb32의 C-말단 부분(Mtb32C)을 엔코딩하는 DNA를 H37Rv로부터 클로닝하였다: 5'(5'-CAA-TTA-CAT -ATG-CAT-CAC-CAT-CAC-CAT-CAC-ACG-GCC-GCG-TCC-GAT-AAC-TTC-3') 및 3'(5'-CTA-ATC-GAA-TCC-GGC-CGG-GGG-TCC-CTC-GGC-CAA-3'). 상기 5' 올리고뉴클레오티드는 개시코돈 ATG를 에워싸는 NdeⅠ 제한효소 부위(밑줄)를 포함하였다. 상기 3' 올리고뉴클레오티드는 EcoRⅠ제한효소 부위(밑줄)을 포함하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 Mtb32C(Mtb32의 396개 뉴클레오티드)를 증폭하는데 사용되었으며, 그 결과 얻어진 생성물은 발현 벡터의 NdeⅠ 및 EcoRⅠ제한효소 부위로 서브클로닝되었다. EcoRⅠ 및 EcoRＶ를 연속적으로 절단하여 Mtb32C 플라스미드를 선형화시켰다.
Mtb39의 경우, PCR 증폭 및 클로닝을 위해 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하였다: 5'-(5'-CTA-ATC-GAA - TTC-ATG-GTG-GAT-TTC-GGG-GCG-TTA-3') 및 3'(5'-CTA-ATC-GAT-ATC-GCC-GGC-TGC-CGG-AGA-ATG-CGG-3'). 상기 5' 올리고뉴클레오티드는 EcoRⅠ제한효소 부위(밑줄)를 포함하였고, 한편 상기 3' 올리고뉴클레오티드는 EcoRＶ 제한효소 부위(밑줄)를 포함하였다. Mtb39의 전장길이 코딩 서열을 증폭시키고, 제한효소로 절단하고, 상기 제일 처음 단계로부터의 미리절단된 플라스미드를 사용하여 Mtb32C 골격내의(in-frame) 하류에 서브클로닝하였다.
Mtb32 N-말단 단편의 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드를 다음과 같이 디자인하였다: 5'-(5'-CTA-ATC-GAT - ATC-GCC-CCG-CCG-GCC-TTG-TCG-CAG-GAC-3') 및 3'(5'-CTA-ATC-GAT-ATC-CTA-GGA-CGC-GGC-CGT-GTT-CAT-AC-3'). 양 올리고뉴클레오티드 세트는 EcoRＶ 제한효소 부위(밑줄)를 포함하였고, 한편 상기 3' 올리고뉴클레오티드는 또한 정지 코돈(이탤릭)을 포함하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 이 단백질의 예상된 N-말단 도메인을 엔코딩하는 Mb32의 585개 염기쌍 부분을 증폭시키기 위해 디자인되었다. 그 결과 얻어진 PCR 생성물을 Mtb32c-Mtb39 융합 플라스미드로 서브클로닝하였다. 이후 삽입물의 적당한 배향 및 돌연변이의 부재를 DNA 시퀀싱으로 검증하였다. Master Cell Bank 및 Manufacturer's Working Cell Bank를 구축하기 위해 사용되는, 최종 컨스트럭트의 경우, 6xHis 친화성 태그가 PCR로 제거되었으며 Mtb72f의 개방해독틀(ORF)은 pET 유래 발현 벡터인 pPDM에 서브클로닝되었다. 상기 ORF는 약 72 kDa의 폴리프로테인(Mtb72f)을 코딩하는데, 상기 단백질은 일직선으로 정렬시 다음 순서로구조화되는 도메인을 지닌다: Mtb32C-Mtb39-Mtb32N. 이후 상기 DNA를 E. coli인 HMS174 pLysS 종에 도입하여 상기 종을 형질전환시키고, 시험, 세포 은행 및 제조에 사용하였다.
Mtb72f 벌크 약물 원료의 생산
Mtb72f 생산을 위한 제조 과정은 다음과 같다:
- 발효에 뒤이어 원심분리에 의한 세포 수확, 세포 파쇄(마이크로플루이다이저) 및 원심분리를 실행하여 봉입체 펠렛을 생산;
- 8M 우레아 추출에 의한 상기 봉입체 펠렛의 정제에 뒤이어 Q 세파로즈 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow, QFF) 크로마토그래피, 세라믹 히드록시아파타이트(Ceramic Hydroxyapatite, CHT) 크로마토그래피, 투석여과(diafiltration), 및 멸균여과를 실행하여 정제된 벌크 약물 원료를 생산.
발효
발효를 제조용 부피(working volume) 1OL로 실행하였다. 37℃에서 밤새 배양된 제조용 종균 세포(working seed cells)의 진탕배양 플라스크(shake flask) 배양물 300㎖를 발효조(Fermentor)에 접종한다. 접종 및 발효는 주요 탄소원으로 식물-유래 글리세롤과 함께 유사-단순배지(semi defined medium)를 사용한다. 배지 조성은 하기 표에 기술되어 있다. 모든 배지 구성성분들은 121℃에서 20분간 가열하거나 멸균여과에 의해 멸균된다. 발효가 진행되는 동안, 발효조는 37℃의 온도로 유지된다. 공기는 분당 5 표준 리터(SPLM)의 속도로 살포된다. 배지의 pH는 산(H2SO4) 또는 염기(NaOH)의 자동 첨가로 7.0으로 유지된다. 발효조는 자동으로 교반을 조정하여 용해 산소가 30%로 조절되도록 프로그램되고, 한편 최소 교반 속도가 200rpm으로 유지된다. 1.05% SAG-471 실리콘 소포제(Witco Corp.)를 자동 첨가함으로써 발효조내의 기포 조절이 달성된다. 세포 밀도가 대략 흡광도(600nm) 3.5에 도달될 때, 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 1.0 mM 농도로 상기 발효조에 첨가한다. 상기 IPTG는 Mtb72f 단백질을 엔코딩하는 재조합 유전자의 발현을 유도한다. 발현유도후 3.0시간 경과시, 발효조를 냉각시키고 세포를 원심분리에 의해 IL 원심분리 용기로 수확한다.
발효 배지의 조성
Figure pat00001
봉입체의 동정
세포 펠렛을 2.3L의 용해 버퍼(50 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0) 중에서 재현탁시키고 풀링하고, M-1 1OY Microfluidizer® 를 사용하여 세포를 파쇄한다. 상기 세포가 11,000 ± 1,000 프사이(psi)의 압력에서 상기 Microfluidizer를 5회 거치도록 한다. 현탁액을 500㎖ 용기에 담아 8000 x g로 원심분리한다. 이러한 조건에서, Mtb72f 단백질을 포함하는 봉입체(IB)는 펠렛화되고, 한편 대부분의 세포 파쇄물은 상등액에 존재하게 된다. 상기 IB 펠렛을 세척 버퍼(2M 우레아, 50 mM NaCl, 10mM Tris, pH 8.0) 중에 재현탁시키고, 뒤이어 8,000 g로 원심분리한다. 상등액 분획을 버리고 추가 정제가 요구될 때까지 IB 펠렛을 -70℃ 내지 -80℃로 저장한다.
폴리프로테인의 정제
동결된 IB 제조물을 37℃에서 15분간 녹인 다음 격렬하지 않은 기계적 교반으로 8M 우레아, 50mM NaCl, 20mM 비스-트리스 프로판, pH 7.0(버퍼 A) 중에서 재현탁시킨다. 그런 다음 재현탁된 IB를 실온에서 300rpm으로 2시간 동안 자성 스터링 바를 이용하여 스터링시킨다. 그런 다음 IB 추출물을 고속으로 원심분리시키고 그 결과 얻어진 상등액 분획을 크로마토그래피 분획화에 앞서 0.45uM 필터(Pall, Supor)에 통과시켜 여과한다.
IB 추출물을 1N NaOH로 사전에 살균한 다음 버퍼 A로 평형화시킨 Q 세파로즈 패스트 플로우(QFF) 음이온 교환 수지(10 x 12.5 ㎝ Amersham/Pharmacia BPG; 1L packed bed)를 포함하는 컬럼에 적용시킨다. 상기 컬럼은 버퍼 A를 선형 유속 60 ㎝/hr로 전개시키고 레퍼런스를 위한 현저하게 낮은 중량의 오염물을 함유하는 플로우-스루(flow-through)가 수집된다. Mtb72f의 대부분은 8M 우레아, 90mM NaCl, 20mM 비스-트리스 프로판, pH 7.0을 이용한 단일 단계로 용출되며 흡광도(absorbance)에 기초하여 단일 부피 피크로 수집된다.
QFF 레진은 정제 과정에서 사용된 조건하에서 양전하를 띠게 되는 4차 아민 작용기와 고도로 교차-연결되는 아가로스 레진이다. 전하를 띤 매트릭스는 다양한 음이온과 결합할 수 있게 되며 이후 상기 음이온은 염 구배를 이용하여 선택적으로 용출될 수 있다. 이러한 음이온 크로마토그래피는 레진에 강하게 결합하는 핵산 및 내독소를 단백질과 분리시키는데 사용되는데, 상기 단백질은 레진에 더 약하게 결합되어 상기 오염물보다 앞서서 용출된다. 또한, 이러한 단계는 전하를 띠지 않는 오염물과 단백질 불순물의 많은 부분을 제거시킨다.
90mM NaCl 용출 피크는 QFF 컬럼으로부터 나오고, 1N NaOH로 사전에 살균한 다음 버퍼 C(8M 우레아, 250mM NaCl, 및 20 mM 비스-트리스 프로판, pH 7.0)로 평형화시킨 MacroPrep® 세라믹 히드록시아파타이트(CHT)(I 형, 40uM, BioPad)를 포함하는 컬럼(2.6 x 12㎝ Amersham/Pharmacia XK26/20; 63㎖ 패킹된 베드)에 적용된다. 오염물이 제거된 Mtb72f 대부분을 포함하는 플로우-스루 재료(FT1)가 수집된다. 버퍼 C로 상기 컬럼을 세척하고 그 결과 얻어진 임의의 UV-흡수 물질을 수집한다. 최종적으로, 상기 컬럼은 버퍼 D(8M 우레아, 200mM 인산나트륨, pH 7.4) 중에서 용출된다.
MacroPrep® CHT는 다공성 구형 형태의 히드록시아파타이드(Ca5(PO4)3OH)2이다. CHT 크로마토그래피는 적당한 결합 및 용출 조건이 발견되는 경우 고도로 선택적인 정제 방법이 될 수 있다. 결합의 방식은 전하를 띤 칼슘 및 인산 이온 뿐만 아니라 킬레이션된 분자에 대한 이온 교환 유형 결합을 포함한다. DNA는 상기 레진에 결합할 것이고 개개 단백질에 대한 고도의 선택성이 획득될 것이다. Mtb72f 정제를 위해 사용되는 조건은 검출가능한 숙주 세포 오염물의 사실상 완전한 제거를 가능케하는 고도정제 단계(polishing step)로서 역할한다.
크로마토그래피 분리가 진행되는 동안, 자외선(UV) 흡수, 도전율, 압력, pH, 유속, 및 주위 온도가 모니터링되고 기록된다. 초기 CHT 플로우-스루 원료(FTl)는 추가 하류 부문의 가공에 사용된다.
투석여과 및 멸균여과
우레아를 제거하고 버퍼를 20mM 트리스(pH 7.5)로 교체하기 위해 CHT FTl 풀에 대해 투석여과를 실시한다. 상기 투석여과는 30kDa 분자량 컷오프(MWCO) 초여과 막을 구비한 LV-Centramate™ 접선 유동 여과 장치(tangential flow filtration device)와 함께 Pall Minim™ 시스템을 사용하여 실행된다. 20mM 트리스(pH 7.5) 중의 Mtb72f 용액은 0.2-um 멸균용 필터(Millipak 40)를 사용하여 멸균 여과된다. 용액 50㎖를 멸균된 60㎖ PETG(polyethylene terephthalate copolymer) 배지 용기에 분배하고, 그런 다음 동결시키고 -70℃에 보관한다. 상기 재료는 정제된 Mtb72f 벌크 약물 원료가 된다.
실시예 2: Mtb72f (6의 히스티딘 태그)(서열번호:2)의 제조
히스티딘 태그를 제거하기 위하여 pPDM으로의 서브클로닝하는 단계를 생략하는 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법을 따른다.
실시예 3: M72 (2개의 히스티딘 태그)(서열번호:4)의 제조
M72 발현 벡터의 제작
재조합 플라스미드 6His-Mtb72fmut를 M72 항원 제작을 위한 출발 물질로 사용하였다. 6His-Mtb72fmut는 6his-Mtb72f 재조합 플라스미드(실시예 1 참조)를 주형으로 사용하여 위치-특이적 돌연변이유발방법에 의해 제조되었다. 위치-특이적 돌연변이유발방법은 서열번호:1 중의 위치 710에 해당하는 세린(Ser) 코돈을 알라닌(Ala) 코돈으로 대체하는 것을 포함하였다.
6His-Mtb72fmut 컨스트럭트(Corixa 플라스미드) 상에 존재하는 N-말단 히스티딘의 제거는 "유전자 재단 위치-특이적 돌연변이유발 시스템(Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System, Invitrogen)"을 사용하여 달성되었으며, 이는 예상된 2His-Mtb72Fmut 컨스트럭트를 생성시킨다. 서열 검증 후, 2His- Mtb72fmut 코딩 서열을 상기 플라스미드로부터(제한효소에 의한 절단에 의해) 절단해내고, 겔로 정제하고, pET29a 발현 벡터에 라이게이션시켜 최종적으로 재조합 플라스미드 pET29a/2His-Mtb72fmut를 얻었다. 서열 검증 후, 상기 재조합 플라스미드를 pRIT15497로 공식 명칭을 부여하였으며 HMS174(DE3) 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용하였다. pRIT15497는 M72로 명명된 725개 아미노산으로 이루어진 단백질을 코딩한다.
M72 단백질의 생산
M72 생산을 위하여, 클로람페니콜을 발효 배지에서 배제하는 것을 제외하고는, Mtb72f(실시예 1 참조)에 관하여 기술된 것과 동일한 생산 과정을 따를 수 있다.
생물학적 실시예 1: 비활동성/ 잠복성 상태인 결핵균 감염의 생쥐 모델
잠복성 결핵균 감염에 대한 생쥐 모델을 구축하기 위해, SWR 종을 사용하였다. SWR 생쥐는 면역기능이 저하된 것이 아니라, 보체 성분 C5 분비에 결함이 있는 생쥐이다(참조: Ooi and Colten, Nature (1979) 282:207-8). SWR 생쥐는 만성적인 Mtb 감염 상태를 구현할 수 없으나, 결정상 봉입체(crystalloid inclusions)(식세포작용에 의해 소멸되는 호중구 또는 호산구-유래 과립)를 지니는 상피형(epitheloid)이며 기포형(foamy)인 거대 대식세포, 다소성 괴사(multifocal necrosis), 호중구 축적 및 불충분한 림프구에 의해 특성결정되는 광범위 육아종성 폐렴(diffuse granulomatous pneumonia)을 발달시킨다(참조: Turner, et al., J Submicrosc Cytol Pathol. (2001) 33(l-2):217-9; 및 Turner, et al., Infect Immun. (2003) 71(9):5266-72)). 다음은 AS01B 애주번트와 함께 제형화된 Mtb72f(서열번호:6)의 치료 효능을 평가하기 위한 잠복성 결핵균 감염의 모델로서 스위스 웹스터(SWR/J) 생쥐 종을 사용하기 위한 프로토콜이다. 더블 스트랭스(Double strength) AS01B를 막 안에 콜레스테롤(25㎍)(WO 제 96/33739호) 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)(5㎍)를 함유하는 디오레오일 포스파티딜콜린(100 ㎍)의 소형 단일박막 소포(small unilamellar vesicles, SUV)에 QS21(5㎍)를 첨가하여 제조한다(참조: 미국 특허공개공보 제 2003/0143240호). 주입용 앨리쿼트(50㎕)를 버퍼(PBS, pH 6.8) 중의 단백질 4㎍와 더블 스트랭스 AS01B 50㎕를 혼합하여 제조한다. 각각의 생쥐에 50㎕ 용량 주입을 2회(즉, 단백질 8 ㎍)하였다.
잠복성 결핵균 감염 모델을 구축하기 위한 대표적인 일정이 도 1에 도식적으로 기재되어 있다.
1일: 50-100 콜로니 형성 단위(CFU) 결핵균 개체를 에어로졸을 통해 감염시킨다
30-90일: 음료수 리터 당 50㎎ 리팜핀/85㎎ 이소니아지드로 하부그룹에 속한 생쥐를 처치한다
61일: 후보 백신 5를 투여받은 모든 생쥐가 rMtb72f + AS01B로 면역화되어야 한다
82일: 후보 백신을 투여받은 모든 생쥐가 rMtb72f + AS01B로 면역화되어야 한다
103일: 후보 백신을 투여받은 모든 생쥐가 rMtb72f + AS01B로 면역화되어야 한다
113일: IgG 검정을 위해 채혈한다
다양한 시점: CFU 계수 & 면역원성을 위해 지라 및 폐를 적출한다
변형 1 → 60일간 화학요법으로 치료한다. 30일째에 개시 → 3, 4, 5개월간 치료정지(rest) → 각 시점에 생쥐 2마리의 CFU 계수 및 생존 연구용 생쥐 4-7마리는 남겨둠
변형 2 → 90일간 화학요법으로 치료한다. 30일째에 개시 → 4, 5개월간 치료정지 → 각 시점에 생쥐 2마리의 CFU 계수 및 생존 연구용 생쥐 7마리는 남겨둠
변형 3 → 4, 5, 6월간 치료정지 → 각 시점에 생쥐 2마리의 CFU 계수 및 생존 연구용 생쥐 4마리는 남겨둠
변형 4 → 60일간 화학요법으로 치료한다. 30일째에 개시 → 60일째에 개시하여 r72F+AS01B를 3회 근내(i.m.) 면역처치 → 3, 4, 5개월간 치료정지 → 각 시점에 생쥐 2마리의 CFU 계수 및 생존 연구용 생쥐 4-7마리는 남겨둠
변형 5 → 90일간 화학요법으로 치료한다. 30일째에 개시 → 60일째에 개시하여 r72F+AS01B를 3회 근내(i.m.) 면역처치 → 3, 4, 5개월간 치료정지 → 각 시점에 생쥐 2마리의 CFU 계수 및 생존 연구용 생쥐 4-7마리는 남겨둠
ELISA 플레이트를 코팅하기 위해 rMtb72f를 사용한, 감염후 항체 반응에 대한 분석은 조합된 화학요법 및 Mtb72f+AS01B 면역화 치료를 받은 그룹이 치료되지 않았거나 화학요법 치료만 받은 생쥐(OD가 0.5 이하)보다 더 높은 항체 반응(OD가 2.0에 달함)을 나타낸다는 것을 밝혀내었다(도 2). Mtb72f로 면역화시킨 생쥐들은 화학요법 치료를 60일 받든지 90일 받든지 간에 꽤 많은 Mtb72f-특이적 항체 반응(OD가 1.5와 2.5 사이임)을 나타내었다(도 3).
생쥐에 결핵균을 감염시킨 후 상기 생쥐로부터 다양한 간격으로 비장 세포를 수확하였다. IFN-γ 분비량을 측정하기 위해 재조합 항원으로 시험관에서 비장림프구를 재자극하였다. 상기 세포에 의해 생성된 IFN-γ 수준은 Mtb39를 처리한 경우를 제외하고 60일째의 그룹 1(비치료) 및 2(화학요법으로만 치료)에서 한결같이 무시할만한 정도였다. conA, PPD 및 BCG 용해물(lysate)을 사용한 양성 대조군 자극은 상기 세포가 다른 자극성 분자에 반응하여 IFN-γ를 합성 및 분비할 수 있다는 것을 입증하였다(도 4). 생쥐가 화학요법 치료를 받았든지 그렇지 않았든지 간에, IFN-γ 수준은 Mtb72f+AS01B를 처치받은 그룹에서 높았으나, Mtb72f+AS01B로 면역화시키지 않았었던 그룹에서는 낮거나 무시할만한 정도였다(도 5).
결핵 감염 및 연속된 치료 경과 과정 동안, 특이적인 T 세포가 반응한다. IFN-γ에 대한 세포내 사이토카인 염색을 이용하여 Mtb72F에 대한 특이적 CD4+ 세포 반응 비율을 측정하였다(도 6). 상기 검정에 의해 측정하였을 때 임의의 시점에서 화학요법으로만 치료한 경과에서는 Mtb72F 특이적 CD4+ IFNγ+ T 세포 반응에 있어서 변화가 없는 것처럼 보였다(도 7). Mtb 감염후 120일째에, Mtb72f + AS01B 백신을 투여받은 그룹에서의 Mtb72F에 대한 CD4+ IFNγ+ 반응 경향은 화학요법으로 치료한 시간이 길어짐에 따라 증가하는 것으로 드러났다(도 7).
본 발명자들이 행한 실험의 결과는 생쥐가 결핵균에 감염되기 쉽다는 것을 입증한다. 치료되지 않은 상태로 계속 두면, SWR 생쥐는 Mtb 감염후 115일 무렵에 죽게 된다(도 8 및 9). 복합 화학요법(Combination chemotherapy)으로 60일간 치료받은 생쥐의 평균 생존 기간은 170일이었다(도 8 및 9). 복합 화학요법 및 Mtb72f/AS01B 3회 면역처치로 60일간 치료받은 생쥐의 평균 생존 기간은 215일이었다(도 8 및 9). 화학요법으로 치료받은 생쥐 그룹의 생존은 화학요법 및 Mtb72f/AS01B 백신으로 치료받은 생쥐 그룹과 상당히 다르다(95% 신뢰구간(p=0.0067)).
SEQUENCE LISTING <110> Coler, Rhea N Reed, Steven G Lobet, Yves <120> Novel method for preventing or treating M tuberculosis infection <130> pc26427 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2287 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: tri-fusion protein Mtb72F (Ral2-TbH9-Ra35 or Mtb32-Mtb39) <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> CDS <222> (42)..(2228) <220> <221> misc_feature <222> (2270)..(2270) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 tctagaaata attttgttta ctttaagaan ganatataca t atg cat cac cat cac 56 Met His His His His 1 5 cat cac acg gcc gcg tcc gat aac ttc cag ctg tcc cag ggt ggg cag 104 His His Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln 10 15 20 gga ttc gcc att ccg atc ggg cag gcg atg gcg atc gcg ggc cag atc 152 Gly Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile 25 30 35 cga tcg ggt ggg ggg tca ccc acc gtt cat 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Ser Val Thr Trp Gln Thr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr 115 120 125 Gly Asn Val Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala Glu Phe Met Val Asp 130 135 140 Phe Gly Ala Leu Pro Pro Glu Ile Asn Ser Ala Arg Met Tyr Ala Gly 145 150 155 160 Pro Gly Ser Ala Ser Leu Val Ala Ala Ala Gln Met Trp Asp Ser Val 165 170 175 Ala Ser Asp Leu Phe Ser Ala Ala Ser Ala Phe Gln Ser Val Val Trp 180 185 190 Gly Leu Thr Val Gly Ser Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly Leu Met Val 195 200 205 Ala Ala Ala Ser Pro Tyr Val Ala Trp Met Ser Val Thr Ala Gly Gln 210 215 220 Ala Glu Leu Thr Ala Ala Gln Val Arg Val Ala Ala Ala Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Thr Ala Tyr Gly Leu Thr Val Pro Pro Pro Val Ile Ala Glu Asn Arg 245 250 255 Ala Glu Leu Met Ile Leu Ile Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gln Asn Thr 260 265 270 Pro Ala Ile Ala Val Asn Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met Trp Ala Gln 275 280 285 Asp Ala Ala Ala Met Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr 290 295 300 Ala Thr Leu Leu Pro Phe Glu Glu Ala Pro Glu Met Thr Ser Ala Gly 305 310 315 320 Gly Leu Leu 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Asp Ile Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gln Asp Arg Phe 530 535 540 Ala Asp Phe Pro Ala Leu Pro Leu Asp Pro Ser Ala Met Val Ala Gln 545 550 555 560 Val Gly Pro Gln Val Val Asn Ile Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn 565 570 575 Ala Val Gly Ala Gly Thr Gly Ile Val Ile Asp Pro Asn Gly Val Val 580 585 590 Leu Thr Asn Asn His Val Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Asn Ala Phe 595 600 605 Ser Val Gly Ser Gly Gln Thr Tyr Gly Val Asp Val Val Gly Tyr Asp 610 615 620 Arg Thr Gln Asp Val Ala Val Leu Gln Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu 625 630 635 640 Pro Ser Ala Ala Ile Gly Gly Gly Val Ala Val Gly Glu Pro Val Val 645 650 655 Ala Met Gly Asn Ser Gly Gly Gln Gly Gly Thr Pro Arg Ala Val Pro 660 665 670 Gly Arg Val Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Gln Ala Ser Asp Ser Leu 675 680 685 Thr Gly Ala Glu Glu Thr Leu Asn Gly Leu Ile Gln Phe Asp Ala Ala 690 695 700 Ile Gln Pro Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Asn Gly Leu Gly Gln 705 710 715 720 Val Val Gly Met Asn Thr Ala Ala Ser 725 <210> 3 <211> 2178 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: variant of tri-fusion protein Mtb72F (Ral2-TbH9-Ra35 or Mtb32-Mtb39) <220> <221> misc_feature <222> (4)..(9) <223> 'cat cac' instead of 'cat cac cat cac cat cac' <220> <221> misc_feature <222> (2116)..(2118) <223> 'gcg' instead of 'tcg' <400> 3 atgcatcaca cggccgcgtc cgataacttc cagctgtccc agggtgggca gggattcgcc 60 attccgatcg ggcaggcgat ggcgatcgcg ggccagatcc gatcgggtgg ggggtcaccc 120 accgttcata tcgggcctac cgccttcctc ggcttgggtg ttgtcgacaa caacggcaac 180 ggcgcacgag tccaacgcgt ggtcgggagc gctccggcgg caagtctcgg catctccacc 240 ggcgacgtga tcaccgcggt cgacggcgct ccgatcaact cggccaccgc gatggcggac 300 gcgcttaacg ggcatcatcc cggtgacgtc atctcggtga cctggcaaac caagtcgggc 360 ggcacgcgta cagggaacgt gacattggcc gagggacccc cggccgaatt catggtggat 420 ttcggggcgt taccaccgga gatcaactcc gcgaggatgt acgccggccc gggttcggcc 480 tcgctggtgg ccgcggctca gatgtgggac agcgtggcga gtgacctgtt ttcggccgcg 540 tcggcgtttc agtcggtggt ctggggtctg acggtggggt cgtggatagg ttcgtcggcg 600 ggtctgatgg tggcggcggc ctcgccgtat gtggcgtgga tgagcgtcac cgcggggcag 660 gccgagctga ccgccgccca ggtccgggtt gctgcggcgg cctacgagac ggcgtatggg 720 ctgacggtgc ccccgccggt gatcgccgag aaccgtgctg aactgatgat tctgatagcg 780 accaacctct tggggcaaaa caccccggcg atcgcggtca acgaggccga atacggcgag 840 atgtgggccc aagacgccgc cgcgatgttt ggctacgccg cggcgacggc gacggcgacg 900 gcgacgttgc tgccgttcga ggaggcgccg gagatgacca gcgcgggtgg gctcctcgag 960 caggccgccg cggtcgagga ggcctccgac accgccgcgg cgaaccagtt gatgaacaat 1020 gtgccccagg cgctgcaaca gctggcccag cccacgcagg gcaccacgcc ttcttccaag 1080 ctgggtggcc tgtggaagac ggtctcgccg catcggtcgc cgatcagcaa catggtgtcg 1140 atggccaaca accacatgtc gatgaccaac tcgggtgtgt cgatgaccaa caccttgagc 1200 tcgatgttga agggctttgc tccggcggcg gccgcccagg ccgtgcaaac cgcggcgcaa 1260 aacggggtcc gggcgatgag ctcgctgggc agctcgctgg gttcttcggg tctgggcggt 1320 ggggtggccg ccaacttggg tcgggcggcc tcggtcggtt cgttgtcggt gccgcaggcc 1380 tgggccgcgg ccaaccaggc agtcaccccg gcggcgcggg cgctgccgct gaccagcctg 1440 accagcgccg cggaaagagg gcccgggcag atgctgggcg ggctgccggt ggggcagatg 1500 ggcgccaggg ccggtggtgg gctcagtggt gtgctgcgtg ttccgccgcg accctatgtg 1560 atgccgcatt ctccggcagc cggcgatatc gccccgccgg ccttgtcgca ggaccggttc 1620 gccgacttcc ccgcgctgcc cctcgacccg tccgcgatgg tcgcccaagt ggggccacag 1680 gtggtcaaca tcaacaccaa actgggctac aacaacgccg tgggcgccgg gaccggcatc 1740 gtcatcgatc ccaacggtgt cgtgctgacc aacaaccacg tgatcgcggg cgccaccgac 1800 atcaatgcgt tcagcgtcgg ctccggccaa acctacggcg tcgatgtggt cgggtatgac 1860 cgcacccagg atgtcgcggt gctgcagctg cgcggtgccg gtggcctgcc gtcggcggcg 1920 atcggtggcg gcgtcgcggt tggtgagccc gtcgtcgcga tgggcaacag cggtgggcag 1980 ggcggaacgc cccgtgcggt gcctggcagg gtggtcgcgc tcggccaaac cgtgcaggcg 2040 tcggattcgc tgaccggtgc cgaagagaca ttgaacgggt tgatccagtt cgatgccgcg 2100 atccagcccg gtgatgcggg cgggcccgtc gtcaacggcc taggacaggt ggtcggtatg 2160 aacacggccg cgtcctag 2178 <210> 4 <211> 725 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: variant of tri-fusion protein Mtb72F (Ral2-TbH9-Ra35 or Mtb32-Mtb39) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> 'His His' instead of 'His His His His His His' <220> <221> MISC_FEATURE <222> (706)..(706) <223> 'Ala' instead of 'Ser' <400> 4 Met His His Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly 1 5 10 15 Gln Gly Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln 20 25 30 Ile Arg Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala 35 40 45 Phe Leu Gly Leu Gly Val Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val 50 55 60 Gln Arg Val Val Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr 65 70 75 80 Gly Asp Val Ile Thr Ala Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr 85 90 95 Ala Met Ala Asp Ala Leu Asn Gly His His Pro Gly Asp Val Ile Ser 100 105 110 Val Thr Trp Gln Thr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala Glu Phe Met Val Asp Phe Gly Ala Leu 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asn Ser Ala Arg Met Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala 145 150 155 160 Ser Leu Val Ala Ala Ala Gln Met Trp Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu 165 170 175 Phe Ser Ala Ala Ser Ala Phe Gln Ser Val Val Trp Gly Leu Thr Val 180 185 190 Gly Ser Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly Leu Met Val Ala Ala Ala Ser 195 200 205 Pro Tyr Val Ala Trp Met Ser Val Thr Ala Gly Gln Ala Glu Leu Thr 210 215 220 Ala Ala Gln Val Arg Val Ala Ala Ala Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Gly 225 230 235 240 Leu Thr Val Pro Pro Pro Val Ile Ala Glu Asn Arg Ala Glu Leu Met 245 250 255 Ile Leu Ile Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gln Asn Thr Pro Ala Ile Ala 260 265 270 Val Asn Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met Trp Ala Gln Asp Ala Ala Ala 275 280 285 Met Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Thr Leu Leu 290 295 300 Pro Phe Glu Glu Ala Pro Glu Met Thr Ser Ala Gly Gly Leu Leu Glu 305 310 315 320 Gln Ala Ala Ala Val Glu Glu Ala Ser Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gln 325 330 335 Leu Met Asn Asn Val Pro Gln Ala Leu Gln Gln Leu Ala Gln Pro Thr 340 345 350 Gln Gly Thr Thr Pro Ser Ser Lys Leu Gly Gly Leu Trp Lys Thr Val 355 360 365 Ser Pro His Arg Ser Pro Ile Ser Asn Met Val Ser Met Ala Asn Asn 370 375 380 His Met Ser Met Thr Asn Ser Gly Val Ser Met Thr Asn Thr Leu Ser 385 390 395 400 Ser Met Leu Lys Gly Phe Ala Pro Ala Ala Ala Ala Gln Ala Val Gln 405 410 415 Thr Ala Ala Gln Asn Gly Val Arg Ala Met Ser Ser Leu Gly Ser Ser 420 425 430 Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly Val Ala Ala Asn Leu Gly Arg 435 440 445 Ala Ala Ser Val Gly Ser Leu Ser Val Pro Gln Ala Trp Ala Ala Ala 450 455 460 Asn Gln Ala Val Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu 465 470 475 480 Thr Ser Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly Gln Met Leu Gly Gly Leu Pro 485 490 495 Val Gly Gln Met Gly Ala Arg Ala Gly Gly Gly Leu Ser Gly Val Leu 500 505 510 Arg Val Pro Pro Arg Pro Tyr Val Met Pro His Ser Pro Ala Ala Gly 515 520 525 Asp Ile Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gln Asp Arg Phe Ala Asp Phe Pro 530 535 540 Ala Leu Pro Leu Asp Pro Ser Ala Met Val Ala Gln Val Gly Pro Gln 545 550 555 560 Val Val Asn Ile Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Val Gly Ala 565 570 575 Gly Thr Gly Ile Val Ile Asp Pro Asn Gly Val Val Leu Thr Asn Asn 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catatcgggc ctaccgcctt cctcggcttg ggtgttgtcg acaacaacgg caacggcgca 180 cgagtccaac gcgtggtcgg gagcgctccg gcggcaagtc tcggcatctc caccggcgac 240 gtgatcaccg cggtcgacgg cgctccgatc aactcggcca ccgcgatggc ggacgcgctt 300 aacgggcatc atcccggtga cgtcatctcg gtgacctggc aaaccaagtc gggcggcacg 360 cgtacaggga acgtgacatt ggccgaggga cccccggccg aattcatggt ggatttcggg 420 gcgttaccac cggagatcaa ctccgcgagg atgtacgccg gcccgggttc ggcctcgctg 480 gtggccgcgg ctcagatgtg ggacagcgtg gcgagtgacc tgttttcggc cgcgtcggcg 540 tttcagtcgg tggtctgggg tctgacggtg gggtcgtgga taggttcgtc ggcgggtctg 600 atggtggcgg cggcctcgcc gtatgtggcg tggatgagcg tcaccgcggg gcaggccgag 660 ctgaccgccg cccaggtccg ggttgctgcg gcggcctacg agacggcgta tgggctgacg 720 gtgcccccgc cggtgatcgc cgagaaccgt gctgaactga tgattctgat agcgaccaac 780 ctcttggggc aaaacacccc ggcgatcgcg gtcaacgagg ccgaatacgg cgagatgtgg 840 gcccaagacg ccgccgcgat gtttggctac gccgcggcga cggcgacggc gacggcgacg 900 ttgctgccgt tcgaggaggc gccggagatg accagcgcgg gtgggctcct cgagcaggcc 960 gccgcggtcg aggaggcctc cgacaccgcc gcggcgaacc agttgatgaa caatgtgccc 1020 caggcgctgc aacagctggc ccagcccacg cagggcacca cgccttcttc caagctgggt 1080 ggcctgtgga agacggtctc gccgcatcgg tcgccgatca gcaacatggt gtcgatggcc 1140 aacaaccaca tgtcgatgac caactcgggt gtgtcgatga ccaacacctt gagctcgatg 1200 ttgaagggct ttgctccggc ggcggccgcc caggccgtgc aaaccgcggc gcaaaacggg 1260 gtccgggcga tgagctcgct gggcagctcg ctgggttctt cgggtctggg cggtggggtg 1320 gccgccaact tgggtcgggc ggcctcggtc ggttcgttgt cggtgccgca ggcctgggcc 1380 gcggccaacc aggcagtcac cccggcggcg cgggcgctgc cgctgaccag cctgaccagc 1440 gccgcggaaa gagggcccgg gcagatgctg ggcgggctgc cggtggggca gatgggcgcc 1500 agggccggtg gtgggctcag tggtgtgctg cgtgttccgc cgcgacccta tgtgatgccg 1560 cattctccgg cagccggcga tatcgccccg ccggccttgt cgcaggaccg gttcgccgac 1620 ttccccgcgc tgcccctcga cccgtccgcg atggtcgccc aagtggggcc acaggtggtc 1680 aacatcaaca ccaaactggg ctacaacaac gccgtgggcg ccgggaccgg catcgtcatc 1740 gatcccaacg gtgtcgtgct gaccaacaac cacgtgatcg cgggcgccac cgacatcaat 1800 gcgttcagcg 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Pro Val Val Asn Gly Leu Gly Gln Val Val Gly Met Asn Thr 705 710 715 720 Ala Ala Ser

Claims (41)

  1. 서열번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, 서열번호:4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드.
  3. 서열번호:4의 아미노산 서열을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 3항에 있어서, 서열번호:3의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 1항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 약제 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 추가로 리포좀 제형 중의 3D-MPL 및 QS21을 포함하는 약제 조성물.
  7. 제 4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약제 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 바이러스 벡터 내에 도입된 약제 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 박테리아 숙주 세포 내에 도입된 약제 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 박테리아가 바실러스 칼메트-게링(Bacillus Calmette-Guerin)인 약제 조성물.
  11. 개체에서의 결핵 재활성화(reactivation)를 예방 또는 치료하기 위한 방법으로서, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 이미 감염된 포유동물에게 결핵균 군(complex) 중의 마이코박테리움(Mycobacterium) 종으로부터의 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편 및 애주번트를 포함하는 약제 조성물을 면역학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 Mtb72f 융합 단백질이 결핵균에 대한 면역 반응을 유도하며, 그로 인하여 결핵 재활성화를 예방하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 포유동물이 활동성 결핵균 감염을 지님을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 포유동물이 잠복성 결핵균 감염을 지님을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11항에 있어서, 상기 포유동물이 다-약제 내성 결핵균 종에 감염된 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 11항에 있어서, 상기 포유동물이 바실러스 칼메트-게링(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)으로 사전 면역화되었음을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11항에 있어서, 상기 Mtb72f가 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)로부터 나온 것임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 11항에 있어서, 상기 Mtb72f가 서열번호:2의 잔기 8-729를 포함하는 폴리펩티드임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 Mtb72f가 서열번호:2의 잔기 1 및 최초 메티오닌(Met) 잔기의 바로 다음에 삽입된 히스티딘 태그(His tag)를 수반하거나 수반하지 않는 잔기 8-729로 이루어진 폴리펩티드임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 Mtb72f가 서열번호:2의 폴리펩티드임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17항에 있어서, 상기 Mtb72f가 서열번호:6의 폴리펩티드임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 11항에 있어서, 상기 Mtb72f가 서열번호:4의 잔기 4-725를 포함하는 폴리펩티드임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 Mtb72f가 서열번호:4의 잔기 1 및 최초 메티오닌(Met) 잔기의 바로 다음에 삽입된 히스티딘 태그(His tag)를 수반하거나 수반하지 않는 잔기 4-725로 이루어진 폴리펩티드임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 Mtb72f가 서열번호:4의 폴리펩티드임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 11항에 있어서, 상기 포유동물이 인간임을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 11항에 있어서, 상기 애주번트가 리포좀 제형 중의 3D-MPL 및 QS21, 수중유 에멀젼 중의 3D-MPL 및 QS21으로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 11항에 있어서, 결핵균 감염 치료에 효과적인 하나 이상의 화학요법제의 투여를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 하나 이상의 화학요법제가 이소니아지드(isoniazid) 및 리팜핀(rifampin) 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26항에 있어서, 상기 포유동물이 처음에 소정 시간에 걸쳐 하나 이상의 화학요법제를 투여 받고 그 다음에 제 11항의 약제 조성물을 투여받음을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 26항에 있어서, 상기 포유동물이 처음에 제 11항의 약제 조성물을 투여받고, 그 다음에 소정 시간에 걸쳐 하나 이상의 화학요법제를 투여받음을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 26항에 있어서, 상기 하나 이상의 화학요법제 및 약제 조성물의 투여가 동시에 개시됨을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 11항에 있어서, 제 11항의 약제 조성물을 1회 이상 연속 투여함을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 11항에 있어서, 결핵균 군 중의 마이코박테리움 종으로부터의 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 엔코딩하는 핵산을 연속하여 투여함으로써 프라이밍 및 부스팅하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 개체에서의 결핵 재활성화(reactivation)를 예방 또는 치료하기 위한 방법으로서, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 이미 감염된 포유동물에게 결핵균 군(complex) 중의 마이코박테리움((Mycobacterium) 종으로부터의 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 엔코딩하는 핵산을 포함하는 약제 조성물을 면역학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 발현된 Mtb72f 융합 단백질이 결핵균에 대한 면역 반응을 유도하며, 그로 인하여 결핵 재활성를가 예방하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호:1임을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 33항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호:1의 뉴클레오티드 63-2222를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 33항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호:3임을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 33항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호:3의 뉴클레오티드 10-2175을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 33항에 있어서, 상기 핵산이 아데노바이러스 벡터로 운반되어 짐을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 33항에 있어서, 상기 핵산이 돌연변이 마이코박테리움 또는 바실러스 숙주 세포 벡터임을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 33항에 있어서, 결핵균 군 중의 마이코박테리움 종으로부터의 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 연속하여 투여함으로써 프라이밍 및 부스팅하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 감염에 대한 화학요법의 경과 시간을 단축하는 방법으로서, 결핵균에 이미 감염된 포유동물에게 결핵균 감염에 효과적인 하나 이상의 화학요법제 및 결핵균 군(complex) 중의 마이코박테리움(Mycobacterium) 종으로부터의 Mtb72f 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편 및 애주번트를 포함하는 약제 조성물을 면역학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 Mtb72f 융합 단백질이 결핵균에 대한 면역 반응을 유도하며, 그로 인하여 결핵균 감염에 대한 화학요법의 경과 시간을 단축하는 방법.
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