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TW202235443A - 抗TrkA抗體或其抗原結合片段、其製備方法和應用 - Google Patents

抗TrkA抗體或其抗原結合片段、其製備方法和應用 Download PDF

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TW202235443A
TW202235443A TW111107207A TW111107207A TW202235443A TW 202235443 A TW202235443 A TW 202235443A TW 111107207 A TW111107207 A TW 111107207A TW 111107207 A TW111107207 A TW 111107207A TW 202235443 A TW202235443 A TW 202235443A
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大陸商熙源安健醫藥（上海）有限公司
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Abstract

本發明提供了一種抗TrkA抗體或其抗原結合片段、製備方法和應用。本發明還提供了編碼所述抗TrkA抗體或其抗原結合片段的分離的多核苷酸，以及包含所述分離的多核苷酸的載體。本發明還提供了所述抗體或其抗原結合片段在製備用於治療疼痛的藥物中的用途。

Description

抗TrkA抗體或其抗原結合片段、其製備方法和應用
本發明屬於生物免疫技術領域，具體涉及能特異性結合人原肌球蛋白受體激酶A的抗TrkA抗體或其抗原結合片段，本發明還涉及所述抗體或其抗原結合片段的製備方法和用途。
原肌球蛋白受體激酶A（Tropomyosin Receptor Kinase, TrkA, 也稱為high affinity nerve growth factor receptor, neurotrophic tyrosine kinase receptor type 1，或TRK1-transforming tyrosine kinase protein）屬於原肌球蛋白受體激酶（Trk）家族一員，由NTRK1（neurotrophic receptor tyrosine kinase 1）基因編碼。Trk家族包含三種受體，分別是TrkA、TrkB和TrkC，各自通過結合特定的神經營養素配體發揮不同的生物學作用。Trk受體是跨膜受體，由含配體結合區的胞外區、跨膜區（TM）、含酪氨酸激酶區的胞內區組成。TrkA主要在神經脊神經元、交感神經神經元以及基底前腦和紋狀體的膽鹼能神經元中表達(Holtzman DM et al. (1992) Neuron 9(3): 465-78; Verge VM et al. (1992) J. Neurosci. 12 (10): 4011-22)，在包括B淋巴細胞在內的一些非神經元組織和細胞中也有表達(Torcia M et al. (1996) Cell 85(3): 345-56)。TrkA選擇性結合神經生長因數（Nerve Growth Factor, NGF），是NGF高親和性受體。NGF與TrkA結合可啟動TrkA激酶活性，從而引起多種信號通路的啟動，包括Ras/MAPK、PI3K/Akt和PLCγ通路。除結合TrkA以外，NGF還與p75共同神經營養因數受體（p75 neurotrophin receptor, p75NTR，也稱為“低親和性”NGF受體）結合。
NGF/TrkA信號通路與細胞分化、增殖、生存和疼痛等有關。其中NGF/TrkA與疼痛的發生與外周痛覺末梢敏化有關，NGF/TrkA通路的啟動可增加暫態受體電位香草酸受體1（Transient receptor potential vanilloid subtype 1, TRPV1）磷酸化，從而使其敏感化，並且NGF/TrkA可增加多種蛋白質的表達，包括TRPV1、Na/Ca/K離子通道、CGRP、P物質和腦源性神經營養因數（BDNF）等，這些蛋白質進一步使傷害感受性神經元敏感化，痛覺信號增加，並由背根神經節傳至中樞，促進中樞神經系統中次級神經元的啟動（Denk F et al. (2017) Annu. Rev. Neurosci. 40: 307-325）。在受傷和炎症組織中，NGF高表達，並且TrkA對傷害性感受神經元的啟動通過多種機制引發，並產生疼痛信號。NGF/TrkA信號通路與疼痛之間的關係在動物模型已得到證實：大鼠注射NGF後，熱刺激引起的縮足潛伏期明顯縮短（Lewin et al. (1994) Eur J Neurosci, 6: 1903-1912）；而通過給予大鼠抗NGF抗體、TrkA-IgG、小分子TrkA抑制劑等方式阻斷NGF/TrkA信號，可抑制疼痛（Woolf CJ et al. (1994) Neuroscience 62: 327-331; McMahon SB et al. (1995) Net. Med. 1: 774-780; Koltzenburg M et al. (1999) Eur. J. Neurosci. 11: 1698 -1704; Bagal SK et al. (2019) J Med Chem. 62(1): 247-265）。在人體中，NGF含量在類風濕性關節炎、間質性膀胱炎、胰腺炎、前列腺炎、糖尿病性神經病和癌性疼痛等疼痛患者中都有所升高（Aloe et al. (1992) Arthritis and Rheumatism 35: 351-355; Mantyh PW et al. (2011) Anesthesiology 115(1): 189-204）。健康人注射NGF後，可產生痛覺敏感及局部性疼痛（Petty et al. (1994) Ann Neurol. 36: 244-246），提示NGF水準的增加是產生痛覺過敏反應所必需的。NGF β基因發生純合子錯義突變會使人體出現HSAN5症狀，這類患者對疼痛、冷、熱不敏感（Larsson et al. (2009) Neurobiol Dis, 33: 221-228）。而對先天性無痛無汗症（CIPA）患者的遺傳學研究顯示TrkA基因（NTRK1）在胞外區或胞內區突變可引起CIPA，此類患者中TrkA無法被NGF啟動，從而導致患者失去痛覺感受能力（Mardy S et al. (2001) Human mutation 18: 462-471）。
在全球範圍內，有數以千萬計的患者在遭受著慢性疼痛帶來的痛苦，而這個數字隨著人口增加還在不斷增加。當前臨床上使用的用於慢性疼痛治療的藥物包括非甾體類抗炎藥、抗驚厥藥、阿片類藥物等，然而這些藥物有很多的不足，其中，非甾體抗炎藥的療效有限，並且具有包括消化道出血和腎臟毒性等副作用；而阿片類藥物具有成癮等副作用。只有不到30%的慢性痛患者可以從現有治療中獲益（Kalso E et al. (2004) Pain 112(3): 372-80）。該領域亟需能緩解疼痛、無毒性、防濫用的非阿片類止痛藥，NGF/TrkA作為一種全新鎮痛機制，為該難題的解決提供了一種可能。到目前為止，有多個抗人NGF抗體處於研發或臨床開發階段，臨床實驗顯示NGF抗體對退行性關節病相伴的關節痛、慢性腰痛、與間質性膀胱炎相伴的膀胱痛等疼痛顯示出了強大且範圍廣的鎮痛效果（Lane NE et al. (2010) N Engl J Med 363: 1521-1531），另一方面，多個NGF抗體的臨床實驗也表明NGF抗體會升高患者的骨關節炎加速進展的風險（Thomas JS et al. (2019) JAMA 322: 37-48），可能面臨被限制用於重病人群、不能長期使用和劑量限制等問題，使得NGF抗體的臨床應用需要進一步的安全驗證。
靶向TrkA的抗體與NGF抑制劑相比，理論上是一種更好的治療選擇。因為TrkA抗體不影響NGF與p75受體的結合，而p75受體功能與神經元發育，成骨細胞分化、增殖，成肌細胞分化、肌肉修復等有關（Akiyama Y et al. (2014) Differentiation, 87: 111-118; Deponti et al. (2009) Molecular Biology of the Cell, 20: 3620-3627; Mikami et al. (2012) Differentiation, 84: 392-399）。預期TrkA抗體在安全性方面表現更優。
基於此，當前對親和力更高，特異性更強的抗TrkA抗體存在需求。
基於現有技術的不足，本發明的主要目的在於提供一種親和力更高，特異性更強的抗TrkA抗體。本發明還提供了所述抗體的製備方法和用途，本發明的抗TrkA抗體可以用於治療疼痛，包括炎症性疼痛、術後痛、神經病理痛、癌症疼痛、骨關節炎等。與現有技術相比，本發明研發的抗TrkA抗體或其抗原結合片段具備更高的親和力高、更好的特異性和更強的活性。
一方面，本發明提供了能夠特異性結合TrkA的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）包含下述3個互補決定區（CDR）的重鏈可變區（VH）：
（i）VH CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 1，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（ii）VH CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 2，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（iii）VH CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 3，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
和/或
（b）包含下述3個互補決定區（CDR）的輕鏈可變區（VL）：
（iv）VL CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 25，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（v）VL CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 26，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（vi）VL CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 27，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
優選地，（i）-（vi）任一項中所述的置換為保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 1所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 2所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 3所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 25所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 26所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 27所示的VL CDR3。
一方面，本發明提供了能夠特異性結合TrkA的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）包含下述3個互補決定區（CDR）的重鏈可變區（VH）：
（i）VH CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 4，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（ii）VH CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 5，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（iii）VH CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 6，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
和/或
（b）包含下述3個互補決定區（CDR）的輕鏈可變區（VL）：
（iv）VL CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 28，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（v）VL CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 29，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（vi）VL CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 30，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
優選地，（i）-（vi）任一項中所述的置換為保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 4所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 5所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 6所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 28所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 29所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 30所示的VL CDR3。
一方面，本發明提供了能夠特異性結合TrkA的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）包含下述3個互補決定區（CDR）的重鏈可變區（VH）：
（i）VH CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 7，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（ii）VH CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 8，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（iii）VH CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 9，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
和/或
（b）包含下述3個互補決定區（CDR）的輕鏈可變區（VL）：
（iv）VL CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 31，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（v）VL CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 32，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（vi）VL CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 33，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
優選地，（i）-（vi）任一項中所述的置換為保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 7所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 8所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 9所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 31所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VL CDR3。
一方面，本發明提供了能夠特異性結合TrkA的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）包含下述3個互補決定區（CDR）的重鏈可變區（VH）：
（i）VH CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 10，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（ii）VH CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 11，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（iii）VH CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 12，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
和/或
（b）包含下述3個互補決定區（CDR）的輕鏈可變區（VL）：
（iv）VL CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 34，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（v）VL CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 35，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（vi）VL CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 36，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
優選地，（i）-（vi）任一項中所述的置換為保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 11所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 12所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 34所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 35所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 36所示的VL CDR3。
一方面，本發明提供了能夠特異性結合TrkA的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）包含下述3個互補決定區（CDR）的重鏈可變區（VH）：
（i）VH CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 13，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（ii）VH CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 14，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（iii）VH CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 15，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
和/或
（b）包含下述3個互補決定區（CDR）的輕鏈可變區（VL）：
（iv）VL CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO:37，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（v）VL CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 38，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（vi）VL CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 39，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
優選地，（i）-（vi）任一項中所述的置換為保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 13所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 14所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 15所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 37所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 38所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 39所示的VL CDR3。
一方面，本發明提供了能夠特異性結合TrkA的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）包含下述3個互補決定區（CDR）的重鏈可變區（VH）：
（i）VH CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 16，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（ii）VH CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 17，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（iii）VH CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 18，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
和/或
（b）包含下述3個互補決定區（CDR）的輕鏈可變區（VL）：
（iv）VL CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 40，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（v）VL CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 41，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（vi）VL CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 42，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
優選地，（i）-（vi）任一項中所述的置換為保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 16所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 17所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 18所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 40所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 42所示的VL CDR3。
一方面，本發明提供了能夠特異性結合TrkA的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）包含下述3個互補決定區（CDR）的重鏈可變區（VH）：
（i）VH CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 19，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（ii）VH CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 20，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（iii）VH CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 21，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
和/或
（b）包含下述3個互補決定區（CDR）的輕鏈可變區（VL）：
（iv）VL CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 43，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（v）VL CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 44，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（vi）VL CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 45，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
優選地，（i）-（vi）任一項中所述的置換為保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 19所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 20所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 21所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 43所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 44所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 45所示的VL CDR3。
一方面，本發明提供了能夠特異性結合TrkA的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）包含下述3個互補決定區（CDR）的重鏈可變區（VH）：
（i）VH CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 22，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（ii）VH CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 23，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（iii）VH CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 24，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
和/或
（b）包含下述3個互補決定區（CDR）的輕鏈可變區（VL）：
（iv）VL CDR1，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 46，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，
（v）VL CDR2，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 47，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列，和
（vi）VL CDR3，其由下述序列組成：SEQ ID NO: 48，或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；
優選地，（i）-（vi）任一項中所述的置換為保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 22所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 23所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 24所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 46所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 47所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 48所示的VL CDR3。
一方面，本發明提供了能夠特異性結合TrkA的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，
所述重鏈可變區包含SEQ ID NO: 49-56中任一項所示的重鏈可變區中含有的3個CDR；並且，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 57-64中任一項所示的輕鏈可變區中含有的3個CDR；
優選地，所述重鏈可變區中含有的3個CDR，和/或所述輕鏈可變區中含有的3個CDR，由Kabat或IMGT編號系統定義。
根據本發明所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）重鏈可變區（VH），其包含選自下列的胺基酸序列：
（i）SEQ ID NO: 49所示的序列；
（ii）與SEQ ID NO: 49所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（iii）與SEQ ID NO: 49所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
和/或，
（b）輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的胺基酸序列：
（iv）SEQ ID NO: 57所示的序列；
（v）與SEQ ID NO: 57所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（vi）與SEQ ID NO: 57所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
優選地，（ii）或（v）中所述的置換是保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 49所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:57所示的序列的VL。
根據本發明所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）重鏈可變區（VH），其包含選自下列的胺基酸序列：
（i）SEQ ID NO: 50所示的序列；
（ii）與SEQ ID NO: 50所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（iii） 與SEQ ID NO: 50所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
和/或，
（b）輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的胺基酸序列：
（iv）SEQ ID NO: 58所示的序列；
（v）與SEQ ID NO: 58所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（vi）與SEQ ID NO: 58所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
優選地，（ii）或（v）中所述的置換是保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 50所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 58所示的序列的VL。
根據本發明所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）重鏈可變區（VH），其包含選自下列的胺基酸序列：
（i）SEQ ID NO: 51所示的序列；
（ii）與SEQ ID NO: 51所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（iii） 與SEQ ID NO: 51所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
和/或，
（b）輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的胺基酸序列：
（iv）SEQ ID NO: 59所示的序列；
（v）與SEQ ID NO: 59所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（vi）與SEQ ID NO: 59所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
優選地，（ii）或（v）中所述的置換是保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 51所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:59所示的序列的VL。
根據本發明所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）重鏈可變區（VH），其包含選自下列的胺基酸序列：
（i）SEQ ID NO: 52所示的序列；
（ii）與SEQ ID NO: 52所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（iii）與SEQ ID NO: 52所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
和/或，
（b）輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的胺基酸序列：
（iv）SEQ ID NO: 60所示的序列；
（v）與SEQ ID NO: 60所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（vi） 與SEQ ID NO: 60所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
優選地，（ii）或（v）中所述的置換是保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 52所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 60所示的序列的VL。
根據本發明所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）重鏈可變區（VH），其包含選自下列的胺基酸序列：
（i）SEQ ID NO: 53所示的序列；
（ii）與SEQ ID NO: 53所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（iii） 與SEQ ID NO: 53所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
和/或，
（b）輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的胺基酸序列：
（iv）SEQ ID NO: 61所示的序列；
（v）與SEQ ID NO: 61所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（vi）與SEQ ID NO: 61所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
優選地，（ii）或（v）中所述的置換是保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 53所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 61所示的序列的VL。
根據本發明所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）重鏈可變區（VH），其包含選自下列的胺基酸序列：
（i）SEQ ID NO: 54所示的序列；
（ii）與SEQ ID NO: 54所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（iii）與SEQ ID NO: 54所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
和/或，
（b）輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的胺基酸序列：
（iv）SEQ ID NO: 62所示的序列；
（v）與SEQ ID NO: 62所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（vi）與SEQ ID NO: 62所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
優選地，（ii）或（v）中所述的置換是保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 54所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 62所示的序列的VL。
根據本發明所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）重鏈可變區（VH），其包含選自下列的胺基酸序列：
（i）SEQ ID NO: 55所示的序列；
（ii）與SEQ ID NO: 55所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（iii）與SEQ ID NO: 55所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
和/或，
（b）輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的胺基酸序列：
（iv）SEQ ID NO: 63所示的序列；
（v）與SEQ ID NO: 63所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（vi）與SEQ ID NO: 63所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
優選地，（ii）或（v）中所述的置換是保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 55所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 63所示的序列的VL。
根據本發明所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段包含：
（a）重鏈可變區（VH），其包含選自下列的胺基酸序列：
（i）SEQ ID NO: 56所示的序列；
（ii）與SEQ ID NO: 56所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（iii）與SEQ ID NO: 56所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
和/或，
（b）輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的胺基酸序列：
（iv）SEQ ID NO: 64所示的序列；
（v）與SEQ ID NO: 64所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（vi）與SEQ ID NO: 64所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
優選地，（ii）或（v）中所述的置換是保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 56所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 64所示的序列的VL。
根據本發明所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段進一步包含：
（a）人免疫球蛋白的重鏈恒定區（CH）或其變體，所述變體與其所源自的序列相比具有一個或多個胺基酸的置換、缺失或添加（例如，至多20個、至多15個、至多10個、或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加；例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）；和
（b）人免疫球蛋白的輕鏈恒定區（CL）或其變體，所述變體與其所源自的序列相比具有至多20個胺基酸的保守置換（例如至多15個、至多10個、或至多5個胺基酸的保守置換；例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的保守置換）；
優選地，所述重鏈恒定區是IgG重鏈恒定區，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恒定區；
優選地，所述輕鏈恒定區是κ輕鏈恒定區。
根據本發明的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗原結合片段選自Fab、Fab’、(Fab’) 2、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、雙抗體（diabody）和單域抗體（sdAb）；和/或，所述抗體為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。
根據本發明的抗體或其抗原結合片段，其中，所述人源化抗體包含：
（a）重鏈可變區（VH），其包含選自下列的胺基酸序列：
（i）SEQ ID NO: 81、85、89、97、99和101中任一項所示的序列；
（ii）與SEQ ID NO: 81、85、89、97、99和101中任一項所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（iii）與SEQ ID NO: 81、85、89、97、99和101中任一項所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
和/或，
（b）輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的胺基酸序列：
（iv）SEQ ID NO: 83、87、91、93、和95中任一項所示的序列；
（v）與SEQ ID NO: 83、87、91、93、和95中任一項所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加（例如1個，2個，3個，4個或5個胺基酸的置換、缺失或添加）的序列；或
（vi）與SEQ ID NO: 83、87、91、93、和95中任一項所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列；
優選地，（ii）或（v）中所述的置換是保守置換；
優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 81、85、89、97、99和101中任一項所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 83、87、91、93、和95中任一項所示的序列的VL。
更優選地，所述人源化抗體選自42F5-01、42F5-03、42F5-04、42F5-05、42F5-08、42F5-11、42F5-13、42F5-14或42F5-15。
根據本發明的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段帶有標記；優選地，所述抗體或其抗原結合片段帶有可檢測的標記，例如酶（例如辣根過氧化物酶）、放射性核素、螢光染料、發光物質（如化學發光物質）或生物素。
另一方面，本發明提供了分離的核酸分子，其編碼所述的抗體或其抗原結合片段，或其重鏈可變區和/或輕鏈可變區；
優選地，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO: 65-80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100和102中任一項所示的核苷酸編碼序列。
本發明還提供了載體，其包含所述的分離的核酸分子；優選地，所述載體為克隆載體或表達載體。
本發明還提供了宿主細胞，其包含所述的分離的核酸分子或所述的載體。
本發明還提供了製備所述的抗體或其抗原結合片段的方法，其包括，在允許所述抗體或其抗原結合片段表達的條件下，培養所述的宿主細胞，和從培養的宿主細胞培養物中回收所述抗體或其抗原結合片段；
優選地，所述宿主細胞是哺乳動物細胞，更優選為人、鼠、羊、馬、狗或貓的細胞，進一步優選為中國倉鼠卵巢細胞。
本發明還提供了雙特異性或多特異性分子，其包含所述的抗體或其抗原結合片段；
優選地，所述雙特異性或多特異性分子特異性結合TrkA，並且額外地特異性結合一個或多個其他靶標；
優選地，所述雙特異性或多特異性分子還包含至少一種具有針對第二靶標的第二結合特異性的分子（例如第二抗體）。
本發明還提供了藥物組合物，其含有所述的抗體或其抗原結合片段、所述的雙特異性或多特異性分子，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。本發明還提供了一種所述的抗體或其抗原結合片段，或所述的雙特異性或多特異性分子或藥物組合物或所述的宿主細胞在製備用於治療多種病症或疾病的藥物中的用途。
本發明還提供了多種病症或疾病的治療方法，其包括向有需要的受試者（其適當地為哺乳動物受試者特別是人類受試者）給予治療上有效量的抗體或其抗原結合片段，或所述的雙特異性或多特異性分子或藥物組合物或所述的宿主細胞在製備用於治療多種病症或疾病的藥物中的用途。所述病症或疾病為疼痛，優選地為慢性痛或急性痛，更優選地為慢性痛；進一步地疼痛可與以下任意一種相關：炎症性疼痛、術後痛、神經病理痛、癌症疼痛等；更進一步優選地，疼痛可與以下任意一種相關：胰腺炎性疼痛、腎結石性疼痛、子宮內膜異位症性疼痛、IBD性疼痛、術後粘連性疼痛、膽囊結石性疼痛、頭痛、痛經、肌肉骨骼痛、扭傷性疼痛、內臟痛、卵巢囊腫性疼痛、前列腺炎性疼痛、膀胱炎性疼痛、間質性膀胱炎性疼痛、手術後疼痛、偏頭痛、三叉神經痛、燒傷和/或創口痛、與創傷相關的疼痛、神經性疼痛、與肌骨骼疾病相關的疼痛、類風濕性關節炎性疼痛、骨關節炎性疼痛、強直性脊柱炎性疼痛、關節周圍病變性疼痛、腫瘤痛、來自骨轉移的疼痛、HIV感染性疼痛。所述病症或疾病為神經瘤、神經元病症。本發明提供的抗體作為藥物與現有抗體比較，具有更強的結合能力和特異性。
實施例1：鼠源抗TrkA抗體的製備
將含有鼠Fc標籤的重組人TrkA蛋白（北京百普賽斯生物科技股份有限公司，TRA-H5254）作為免疫原與等量弗氏完全佐劑（Sigma-Alderich，F5881）混合乳化，用於初始免疫。準備6周齡BALB/c和C57小鼠（江蘇華阜康）各10只，每只動物皮下注射50μg免疫原（不包括佐劑品質，下同）。將免疫原與弗氏不完全佐劑（Sigma-Alderich，F5506）混合乳化，用於後續加強免疫。初始免疫2周後每只動物腹腔注射25μg免疫原進行第一次加強免疫；2周後每只動物皮下注射25μg免疫原進行第二次加強免疫。4-5周後最後一次免疫衝擊，腹腔注射25μg免疫原。
最後一次免疫後分離小鼠B細胞，與SP2/0細胞（中國科學院細胞庫，TCM18）混合，參照BTX公司電轉儀操作手冊進行融合。融合細胞經過培養後採用酶聯免疫法（ELISA）篩選出與TrkA結合並能抑制人TrkA和配體NGF結合的雜交瘤細胞。再通過有限稀釋法進行亞克隆，以同樣ELISA方式篩選獲得8個陽性雜交瘤單克隆細胞株，分別命名為5A3、11G8、26E9、33H5、40D6、42F5、42H6和42A11。
將雜交瘤單克隆細胞株進行擴增並用無血清培養基培養，收集培養基並用蛋白G柱從中純化，以獲得鼠源抗人TrkA單克隆抗體5A3、11G8、26E9、33H5、40D6、42F5、42H6和42A11。
實施例2：鼠源抗TrkA抗體與TrkA結合的ELISA檢測
使用含有人Fc的TrkA胞外區（33-417）（北京百普賽斯生物科技股份有限公司，TRA-H5259）蛋白檢測抗TrkA抗體的結合能力。96孔酶標板每孔包被50ng人TrkA，洗滌及封閉後加入梯度稀釋的抗體，室溫孵育1小時。洗滌三次後加入辣根過氧化物酶偶聯山羊抗小鼠Fc抗體（Biolegend, 405306），室溫孵育1小時，三次洗滌後加入四甲基聯苯胺（TMB，Biolegend，421101）顯色，1M HCl終止顯色，酶標儀讀取450nm吸光值。
8個雜交瘤分泌的抗TrkA抗體均以劑量依賴的方式結合至人TrkA胞外區（圖1），8個抗體與人TrkA結合的EC50如表1。
進一步使用只含人TrkA胞外區與配體NGF結合的區域（TrkA 192-402）的融合蛋白（融合人Fc）（北京百普賽斯生物科技股份有限公司，TRA-H5258）檢測抗TrkA抗體的結合能力，ELISA結果顯示抗TrkA抗體與TrkA胞外區192-402胺基酸區域結合如圖2所示，EC50如表2所示。
另外，使用猴子TrkA (杭州皓陽生物技術有限公司，HSP037-05)，大鼠TrkA（北京義翹神州科技股份有限公司，80243-R03H），小鼠TrkA (北京義翹神州科技股份有限公司，51103-M02H)胞外區融合蛋白（融合人Fc）檢測抗TrkA抗體的種屬交叉反應，ELISA結果顯示8個抗TrkA抗體均可以與三個其他種屬的TrkA蛋白有較強的結合，結果如圖3-5所示。
表1： 8個抗TrkA抗體與人TrkA（33-417）結合的EC50
抗體 5A3 11G8 26E9 33H5 40D6 42F5 42H6 42A11
EC50 （nM） 0.242 0.114 0.099 0.204 0.202 0.128 0.135 0.187
表2：8個抗TrkA抗體與人TrkA（192-402）結合的EC50
抗體 5A3 11G8 26E9 33H5 40D6 42F5 42H6 42A11
EC50 （nM） 0.154 0.071 0.068 0.173 0.195 0.134 0.175 0.234
實施例3：鼠源抗TrkA抗體與人TrkA結合親和力檢測
應用生物分子相互作用檢測平臺ForteBio Octet Red96（PALL）測定抗體親和力。
利用抗人Fc捕獲感測器（Fortebio，18-5088）將含有人Fc標籤的人TrkA胞外區（33-417）蛋白固定至晶片，然後結合梯度濃度的抗TrkA抗體。加緩衝液（1X Kinetics Buffer: PBS + 0.1% BSA + 0.05% Tween 20）進行解離，最後通過儀器演算法計算出抗原抗體結合的親和動力學常數，結果如表3所示。
表3：抗TrkA抗體與人TrkA結合親和力
抗體 K D （ M ） k on （ 1/Ms ） k dis （ 1/s ）
5A3 1.55E-11 1.21E+06 1.88E-05
11G8 ＜1.0E-12 9.92E+05 ＜1.0E-07
26E9 2.67E-11 9.23E+05 2.46E-05
33H5 1.62E-11 1.29E+06 2.09E-05
40D6 2.71E-11 9.18E+05 2.49E-05
42F5 2.18E-12 9.47E+05 2.07E-06
42H6 6.77E-12 1.47E+06 9.91E-06
42A11 1.42E-12 8.89E+05 1.26E-06
實施例4: 流式細胞術檢測鼠源抗TrkA抗體與TrkA/CHO細胞的結合
利用流式細胞術（FACS）檢測抗TrkA抗體與表達全長TrkA的CHO-K1細胞（TrkA/CHO）的結合情況。將TrkA/CHO細胞培養在含10% FBS, 5μg/mL嘌呤黴素的F12K培養基（Hyclone，SH30026）中，陰性對照細胞CHO-K1培養在含10% FBS的F12K培養基中，在對數生長期收集細胞，使用含2%FBS的PBS重懸細胞，在96孔板中每孔加入10 5細胞（50μl），並加入50μl的20μg/mL的抗TrkA抗體，或小鼠IgG對照，室溫反應1小時，加入1μg/mL Alexa Flour 647標記的山羊抗小鼠IgG抗體（Jackson，115-605-062），室溫孵育30分鐘。使用流式細胞分析儀（BioRad, ZE5）檢測抗體的結合情況，如圖6所示，8個抗TrkA抗體均可結合在TrkA/CHO細胞，但不結合至CHO-K1細胞；對照抗體小鼠IgG既不與CHO-K1結合，也不與TrkA/CHO結合。
實施例5: 鼠源抗TrkA抗體阻斷人TrkA和配體NGF的結合
申請人根據中國專利申請CN101939337A提供的序列資訊，參照其中的最優抗體BXhVH5VL1的重鏈可變區（SEQ ID NO: 5）和輕鏈可變區（SEQ ID NO: 7），合成了對照抗體BXhVH5VL1。
96孔酶標板每孔包被50ng 融合人Fc的TrkA胞外區（33-417）蛋白，洗滌三次後3%BSA封閉1小時。10,000ng/mL（66.67 nM）抗TrkA抗體依次3倍稀釋10個濃度至0.17ng/mL （0.0011 nM），每孔加入100μL，孵育30分鐘後每孔加入100μL的1μg/mL的生物素標記人NGF，室溫孵育1小時，洗滌三次。加入鏈黴親和素標記辣根過氧化物酶（Streptavidin-HRP，Biolegend，405210）孵育0.5小時，洗滌三次後酶標板中加TMB，顯色終止後酶標儀讀取450nm吸光值。
結果如圖7所示，本發明的抗TrkA抗體可以阻斷人TrkA與配體NGF的結合，阻斷效果隨抗體濃度的升高而明顯增強，當抗體濃度為20nM時，這八個抗TrkA抗體可幾乎完全阻斷TrkA與NGF的結合。而對照抗體BXhVH5VL1對TrkA與NGF的結合，在所測濃度（0.001-100nM）內沒有顯著阻斷作用。本發明8個抗TrkA抗體及BXhVH5VL1阻斷人TrkA與配體NGF結合的IC50如表4所示。
表4：抗TrkA抗體阻斷TrkA- NGF結合的IC50
抗體 5A3 11G8 26E9 33H5 40D6 42F5 42H6 42A11 BXhVH5VL1
IC50 （nM） 1.763 1.900 2.040 1.498 2.284 2.352 2.185 2.054 ＞100
實施例6： 鼠源抗TrkA抗體的體外中和活性檢測
A．NGF誘導的TF-1細胞增殖實驗
TF-1細胞（人血液白血病細胞，ATCC, CRL-2003）的生長高度依賴GM-CSF（粒細胞巨噬細胞集落刺激因數），NGF與TF-1細胞表面的TrkA結合後啟動其下游信號通路也能誘導TF-1的生長，從而不需要依賴GM-CSF。將TF-1細胞培養於含10%FBS （Gibco, 10091148），2μg/mL GM-CSF（R&D，215-GM-010）的RPMI1640培養基（HyClone，SH30027），在對數生長期收集細胞，徹底洗滌清除原生長培養基中的GM-CSF,用不含GM-CSF的培養基重懸，每孔5000細胞稀釋在80μl培養基中鋪到白色透底96孔細胞培養板（corning，3610）。抗TrkA抗體由400μg/mL （2666.67nM）進行4倍梯度稀釋製備10個濃度，每孔細胞中加入10μL，室溫孵育0.5小時後，每孔細胞加入10μL 的50ng/mL的人NGF，在37℃，5%CO 2培養箱中培養細胞72小時後加入100μL CellTiter-Glo®細胞活力檢測試劑（Promega，G7573），使用多功能酶標儀（SpectraMax）讀取光學luminescence信號。如圖8所示，本發明的抗TrkA抗體能夠抑制人NGF誘導的TF-1細胞的增殖，IC50如表5所示。抗體BXhVH5VL1對TF-1細胞增殖的抑制作用遠弱于本發明抗體。當抗體濃度為40μg/mL（266.67nM）時，本發明抗TrkA抗體可完全抑制NGF誘導的TF-1細胞增殖，而該濃度下抗體BXhVH5VL1對NGF誘導的TF-1細胞增殖的抑制率低於40%。
表5：抗TrkA抗體抑制NGF誘導的TF-1細胞增殖IC50
抗體 5A3 11G8 26E9 33H5 40D6 42F5 42H6 42A11 BXhVH5VL1
IC50（nM） 6.487 1.092 1.393 2.136 8.532 1.302 3.576 1.462  ＞200
B．NGF誘導的TrkA/Ba/F3細胞增殖實驗
Ba/F3細胞的生長有依賴IL-3及不依賴IL-3兩種途徑，不依賴IL-3的生長需要Ba/F3細胞穩定表達活性激酶。構建表達全長人TrkA的Ba/F3（TrkA/Ba/F3）細胞，該細胞增殖需要添加NGF誘導。
將TrkA/Ba/F3細胞培養於含10%FBS和100ng/mL NGF的RPMI1640培養基，收集細胞並徹底洗滌清除原生長培養基中的NGF，按照每孔3000細胞重懸於80μL不含NGF的培養基中，鋪到白色透底96孔細胞培養板（corning，3610）。每孔細胞加入10μL梯度稀釋的抗TrkA抗體，室溫孵育0.5小時後，每孔細胞加入10μL 50ng/mL的人NGF，使NGF終濃度為5ng/mL，梯度稀釋的抗NGF抗體終濃度最高為40μg/mL （266.67nM）。在37℃，5%CO 2培養箱中培養細胞48小時後加入100μL CellTiter-Glo®細胞活力檢測試劑（Promega，G7573），使用多功能酶標儀（SpectraMax）讀取光學luminescence信號。
在觀測TrkA/Ba/F3細胞生長的過程中，添加了人NGF的細胞可以正常增殖；本發明的8個抗TrkA抗體能夠抑制NGF誘導的TrkA/Ba/F3細胞增殖，抑制作用隨濃度的升高而增強，當抗體濃度升高至2.5μg/mL (16.67nM)及更高濃度時，抗TrkA抗體對TrkA/Ba/F3細胞增殖的抑制作用可達100%；而抗體BXhVH5VL1在最高濃度40μg/mL（266.67nM）時對TrkA/Ba/F3細胞增殖的抑制率低於50%（圖9），IC50如表6所示。
表6：抗TrkA抗體抑制NGF誘導的TrkA/Ba/F3細胞增殖IC50
抗體 5A3 11G8 26E9 33H5 40D6 42F5 42H6 42A11 BXhVH5VL1
IC50（nM） 0.422 1.646 1.539 0.413 1.805 1.252 0.782 0.738 ＞200
實施例7：鼠源抗TrkA抗體與TrkA同家族蛋白結合的檢測
96孔酶標板每孔包被50ng人TrkA胞外區蛋白，人TrkB胞外區蛋白（北京義翹神州科技有限公司，10047-H03H）,人TrkC胞外區蛋白（北京義翹神州科技有限公司，10048-H03H）按照實施例2中方法檢測抗TrkA抗體與人TrkA及兩個同家族蛋白TrkB、TrkC的結合情況。
8個鼠源抗TrkA抗體與TrkA（圖10）有高親和力，與TrkB（圖11）及TrkC（圖12）基本無結合。
實施例8：抗TrkA抗體對CFA致小鼠炎症性疼痛的作用
C57BL/6小鼠（浙江維通利華實驗動物技術有限公司），雄性，SPF級，6-8周齡，適應性飼養5天。適應期結束後將動物分成3組，分別為生理鹽水組、抗TrkA抗體33H5組、抗TrkA抗體42F5組，每組10只動物。小鼠足底注射造模劑CFA之前，採用VonFrey測定痛閾，此為基礎痛閾（圖13）。
次日於小鼠足底注射25µl CFA致炎，待足趾腫脹明顯後（造模後24小時左右），同樣方法檢測小鼠足底痛閾，此為給藥前的痛閾值（圖14）。
隨後每組分別皮下注射生理鹽水、抗TrkA抗體33H5、抗TrkA抗體42F5，劑量10mg/kg，並測定給藥後24小時及48小時的痛閾（圖15，16），評價受試物對痛閾的影響。
結果如圖13-16所示，給藥後24小時和48小時，抗TrkA抗體33H5和42F5均能明顯改善CFA引起的痛閾下降，與生理鹽水組相比，具有統計學差異。
實施例9：鼠源抗TrkA抗體可變區測序及序列分析
使用TRIzol試劑盒（Ambion, 15596-026）提取雜交瘤細胞總RNA，以之為範本合成第一鏈cDNA（Takara）。快速擴增cDNA末端（RACE）得到抗體輕鏈和重鏈片段，將擴增片段分別克隆至標準載體。測序得到抗TrkA抗體5A3、11G8、26E9、33H5、40D6、42F5、42H6和42A11的重鏈和輕鏈可變區序列為：
抗TrkA抗體5A3:
重鏈可變區胺基酸序列：
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAIGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGRGVTNYNENFKGKATFTVDISSTTTYIQFSSLTSEDSAVYYCARSNYGDYDFWGQGTSLTVSS（SEQ ID NO: 49）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTATTGGGTACACATTCAGTAGGTACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGAGGTGTTACTAACTACAATGAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGTAGATATATCCTCCACCACAACCTACATTCAATTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATCGAATTATGGTGACTACGACTTCTGGGGCCAAGGCACCTCTCTCACAGTCTCCTCA（SEQ ID NO: 65）
輕鏈可變區胺基酸序列：
QTVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSSGAVTTSNHANWVQEKPDHLFTSLMGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 57）
輕鏈可變區核酸序列：
CAGACTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTTCTGGGGCTGTTACAACTAGTAACCATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCTGATCATTTATTCACTAGTCTAATGGGTGGTACCAATAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGCGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCGCAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTCTGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACTAAACTGACTGTCCTA（SEQ ID NO: 66）
抗TrkA抗體11G8:
重鏈可變區胺基酸序列：
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGLTNYDEKFKTKATLTIDKSSRTAYIQLSSLTSEDSAVYYCAKYGNYVAFAFWGQGTLVTVSA（SEQ ID NO: 50）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAACGGTCTTACTAACTACGATGAGAAATTCAAGACCAAGGCCACACTGACCATAGACAAATCCTCCAGAACAGCCTACATACAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAAATATGGTAACTACGTCGCGTTTGCTTTCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA（SEQ ID NO: 67）
輕鏈可變區胺基酸序列：
DIQMTQSPASLSATVGETVTITCRASENIYSYVAWYQQKQGKSPQLLVHNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINGLHPEDFGSYYCQHHYGIPLTFGAGTKLELK（SEQ ID NO: 58）
輕鏈可變區核酸序列：
GACATTCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCAACTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAAAATATTTACAGTTATGTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAACTCCTGGTCCATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTACCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACGGCCTGCACCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTATGGTATTCCGCTCACGTTCGGCGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA（SEQ ID NO: 68）
抗TrkA抗體26E9:
重鏈可變區胺基酸序列：
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKSSGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIYPSNGRTNYNEKFKNRATLTVDISSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSRYDPMEDWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO: 51）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCTGTGAAGCTGTCCTGCAAGTCTTCTGGCTATACCTTCACCAACTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGCGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTAGCAACGGTCGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAAAACAGGGCCACACTGACTGTAGACATTTCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGAGTAGGTACGACCCTATGGAAGACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCT（SEQ ID NO: 69）
輕鏈可變區胺基酸序列：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVGYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSIPLTFGSGTKLEIK（SEQ ID NO: 59）
輕鏈可變區核酸序列：
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTGGGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCAACTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAGGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTATCCCACTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAG（SEQ ID NO: 70）
抗TrkA抗體33H5:
重鏈可變區胺基酸序列：
QVQLQQPGAELVKPGASVQLSCKASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGLTNYIEKFKNKATLTIDKSSNTAYMQLSGLTPEDSAVYYCAKYGNYVAFAYWGQGTLVTVSA（SEQ ID NO: 52）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGCAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGTTACTGGATACACTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAACGGTCTTACTAACTACATTGAGAAATTCAAGAACAAGGCCACACTGACTATTGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCGGCCTGACACCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAAATATGGTAACTACGTCGCGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA（SEQ ID NO: 71）
輕鏈可變區胺基酸序列：
DIQMTQSPASLSASVGDTVTITCRASENIYTYLAWYQQKQGKSPQLLVHNTKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKISSLQPEDFGTYYCQHHYGVPLTFGAGTKLELK（SEQ ID NO: 60）
輕鏈可變區核酸序列：
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGACACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAAAATATCTACACTTATTTAGCTTGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAACTCCTGGTCCATAATACAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCCTCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGACTTATTACTGTCAACATCATTATGGTGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA（SEQ ID NO: 72）
抗TrkA抗體40D6:
重鏈可變區胺基酸序列：
QVQLQQSGTELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGRSSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRVSQLHIYFDYWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 53）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAACTGAACTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCAGTAGATACTGGATAGAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGGAGTAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCCGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTACAAGAGTTTCCCAACTGCACATTTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACTGTCACAGTCTCCTCC（SEQ ID NO: 73）
輕鏈可變區胺基酸序列：
DIVMTQVVPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFQQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVAFYYCMQHLEFPLTFGAGTKLELK（SEQ ID NO: 61）
輕鏈可變區核酸序列：
GATATTGTGATGACTCAGGTTGTACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTATATTGGTTCCAGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACATTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGCTTTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGTTGGAGCTGAAA（SEQ ID NO: 74）
抗TrkA抗體42F5:
重鏈可變區胺基酸序列：
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKSSGYTFTNYWMHWVRQRPGQGLEWIGEIYPNNGRVNYNEKFKNRATLTVDISSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSRYDPMEDWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO: 54）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAACCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGTCTTCTGGCTATACCTTCACCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATCTATCCTAACAACGGTCGTGTTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAACAGGGCCACACTGACTGTAGACATATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGAGTAGGTACGACCCTATGGAAGACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCT（SEQ ID NO: 75）
輕鏈可變區胺基酸序列：
QVVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVGYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYFCQQWSSIPLTFGSGTRLEIK（SEQ ID NO: 62）
輕鏈可變區核酸序列：
CAAGTTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAGGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCAACTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAGGATGCTGCCACTTATTTCTGCCAGCAGTGGAGTAGTATCCCACTCACGTTCGGCTCGGGGACAAGGTTGGAAATAAAG（SEQ ID NO: 76）
抗TrkA抗體42H6:
重鏈可變區胺基酸序列：
QVQLQQPGVELVKPGASVKLSCKTSGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIYSSNGLTNYNEKFKNKATLTVDKSSSTAYMQLTSLTSEDSAIYYCARHWYVFLDHWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO: 55）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGTTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAATGGATTGGAGAGATTTATTCCAGTAACGGTCTTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAATAAGGCCACACTGACTGTAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCACCAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCGATCTATTACTGTGCAAGACATTGGTACGTCTTCCTTGACCACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA（SEQ ID NO: 77）
輕鏈可變區胺基酸序列：
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNHANWVQEKPDHLFTGLIGGINNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTRLTVL（SEQ ID NO: 63）
輕鏈可變區核酸序列：
CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACCATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTATCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAATCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAGACTGACTGTCCTA（SEQ ID NO: 78）
抗TrkA抗體42A11:
重鏈可變區胺基酸序列：
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIYPSNGRTNYNEKFKTKATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCAGSRYDAMDFWGQGTSVTVSS（SEQ ID NO: 56）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGCATTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTAGCAACGGTCGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGACCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCATCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAGGATCGAGATACGATGCTATGGACTTCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA（SEQ ID NO: 79）
輕鏈可變區胺基酸序列：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSIISYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCHQWTSNPLTFGGGTKLELK（SEQ ID NO: 64）
輕鏈可變區核酸序列：
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAATTATAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACTTCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGTGGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTGGACTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGGTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA（SEQ ID NO: 80）
序列分析得到Kabat及IMGT系統界定的CDR，下表（表7）基於Kabat及IMGT系統的定義列出八個抗TrkA抗體的CDR。
表7：基於Kabat及IMGT系統界定抗TrkA抗體CDR
單抗重鏈CDR: 黑色加粗為Kabat系統界定CDR; 底線為IMGT界定CDR.
克隆號 CDR-H1 SEQ ID No. CDR-H2 SEQ ID No. CDR-H3 SEQ ID No.
5A3 GYTFS RYW IE 1 E ILPGRGVTNYNENFKG 2 AR SNYGDYDF 3
11G8 GYTFT SYW MH 4 E INPNNGLTNYDEKFKT 5 AK YGNYVAFAF 6
26E9 GYTFT NYW MH 7 E IYPSNGRTNYNEKFKN 8 AR SRYDPMED 9
33H5 GYTFT SYW IH 10 E INPNNGLTNYIEKFKN 11 AK YGNYVAFAY 12
40D6 GYTFS RYW IE 13 E ILPGRSSTNYNEKFKG 14 TR VSQLHIYFDY 15
42F5 GYTFT NYW MH 16 E IYPNNGRVNYNEKFKN 17 AR SRYDPMED 18
42H6 GYTFT SYW MH 19 E IYSSNGLTNYNEKFKN 20 AR HWYVFLDH 21
42A11 GYTFT NYW MH 22 E IYPSNGRTNYNEKFKT 23 AG SRYDAMDF 24
單抗輕鏈CDR: 黑色加粗為Kabat系統界定CDR; 底線為IMGT界定CDR.
克隆號 CDR-L1 SEQ ID No. CDR-L2 SEQ ID No. CDR-L3 SEQ ID No.
5A3 RSS SGAVTTSNHAN 25 GT NNRAP 26 ALWYSNHWV 27
11G8 RAS ENIYSYVA 28 NA KTLAE 29 QHHYGIPLT 30
26E9 SAS SSVGYMH 31 DT SKLAS 32 QQWSSIPLT 33
33H5 RAS ENIYTYLA 34 NT KTLAE 35 QHHYGVPLT 36
40D6 RSS KSLLHSNGNTYLY 37 RM SNLAS 38 MQHLEFPLT 39
42F5 SAS SSVGYMH 40 DT SKLAS 41 QQWSSIPLT 42
42H6 RSS TGAVTTSNHAN 43 GI NNRAP 44 ALWYSNHWV 45
42A11 SAS SIISYMH 46 DT SKLAS 47 HQWTSNPLT 48
實施例10：鼠源抗TrkA抗體人源化改造及表徵
抗體的人源化改造
根據上述獲得的雜交瘤細胞分泌的抗體的輕鏈可變區（VL）及重鏈可變區（VH）序列進行人源化改造。將鼠源抗體的VL、VH的胺基酸序列在人胚胎系抗體胺基酸序列資料庫進行對比和檢索，找出同源性高的人類IGHV和IGKV序列作為人源化範本。通過電腦類比技術，分析可變區與框架區胺基酸存在的可能空間位阻及相互影響，確定對維持人源化抗體活性比較關鍵的框架區胺基酸，在人源化過程中對這些胺基酸予以保留。通過CDR移植技術完成對輕鏈和重鏈可變區的人源化改造。之後通過選定的抗體恒定區範本，得到以下多個人源化抗體。
其中對抗TrkA抗體42F5進行人源化改造，獲得了示例性抗體42F5-01，42F5-03，42F5-04，42F5-05，43F5-08，42F5-11。以人IGHV1-2為重鏈可變區範本，以人IGKV1-39為輕鏈可變區範本，獲得人源化抗體42F5-01和42F5-03；以人IGHV1-2為重鏈可變區範本，以人IGKV1-6為輕鏈可變區範本，獲得人源化抗體42F5-05；以人IGHV1-2為重鏈可變區，以人IGKV3-11為輕鏈可變區範本，獲得人源化抗體42F5-11；以人IGHV1-69為重鏈可變區範本，以人IGKV1-39為輕鏈可變區範本，獲得人源化抗體42F5-04；以人IGHV1-69為重鏈可變區範本，以人IGKV1-6為輕鏈可變區範本，獲得人源化抗體42F5-08。在獲得的人源化抗體中，42F5-01和42F5-05重鏈可變區序列一致，人源化抗體42F5-03和42F5-11重鏈可變區序列一致，人源化抗體42F5-04和42F5-08重鏈可變區序列一致；人源化抗體42F5-03和42F5-04輕鏈可變區序列一致。
IGHV1-2、IGHV1-69、IGKV1-39、IGKV1-6、IGKV3-11為IMGT（The International ImMunoGeneTics Information System）及NCBI（The National Center for Biotechnology Information）中的人類免疫球蛋白基因資料庫中人類種系IgG基因。此外，由於抗體42F5重鏈互補決定區序列中含有脫醯胺位點NG，為消除該位點對抗體的潛在影響，對人源化抗體43F5-01的重鏈可變區進行了進一步改造。以42F5-01為範本，將重鏈可變區中的NG 55-56突變為SG 55-56，或者QG 55-56，或者NA 55-56，分別獲得人源化抗體42F5-13，42F5-14，42F5-15。
將獲得的人源化抗體重鏈可變區序列嫁接至人IgG4重鏈恒定區，輕鏈可變區序列嫁接至人Kappa輕鏈恒定區，並進行基因合成，經酶切後連入相應質粒中。將構建好的質粒暫態轉染至CHO細胞中進行表達，經過7-10天表達，細胞培養上清用相應緩衝液（如磷酸鹽緩衝鹽水（pH7.4））平衡的MabSelect柱（GE Healthcare）進行純化，之後用檸檬酸鈉或其它緩衝液進行洗脫，經此步驟獲得的抗體，可通過SDS-PAGE或SEC-HPLC進行純度等鑒定，並用於後續其它表徵研究。
抗TrkA抗體42F5人源化抗體可變區序列:
抗TrkA抗體42F5人源化抗體42F5-01、42F5-03、42F5-04、42F5-05、42F5-08、42F5-11、42F5-13、42F5-14、42F5-15可變區序列如下：
42F5-01:
重鏈可變區胺基酸序列:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIYPNNGRVNYNEKFKNRVTMTVDISISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSRYDPMEDWGQGTTVTVSS （SEQ ID NO.81）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGTCCAGCGGCTACACCTTCACAAACTATTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCTAACAATGGCAGGGTGAACTACAACGAGAAGTTTAAGAACAGAGTGACCATGACAGTGGACATCAGCATCTCTACCGCTTACATGGAGCTGTCTAGGCTGCGGTCCGACGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTAGATCTCGCTATGACCCCATGGAGGATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCTTCC（SEQ ID NO.82）
輕鏈可變區胺基酸序列：
DVQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVGYMHWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQWSSIPLTFGQGTRLEIK （SEQ ID NO.83）
輕鏈可變區核酸序列：
GACGTGCAGCTGACCCAGTCTCCTTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGCTCCGCTTCTTCCAGCGTGGGCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGAGGCTGATCTACGACACATCTAAGCTGGCTTCCGGAGTGCCAAGCCGGTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGAACCGACTACACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACATATTTTTGTCAGCAGTGGAGCTCTATCCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACACGCCTGGAGATCAAG （SEQ ID NO.84）
42F5-03:
重鏈可變區胺基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGEIYPNNGRVNYNEKFKNRATLTVDISISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSRYDPMEDWGQGTTVTVSS （SEQ ID NO.85）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGTCCAGCGGCTACACCTTCACAAACTATTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGCGAGATCTACCCTAACAATGGCAGGGTGAACTACAACGAGAAGTTTAAGAACAGAGCCACCCTGACAGTGGACATCAGCATCTCTACCGCTTACATGGAGCTGTCTAGGCTGCGGTCCGACGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTAGATCTCGCTATGACCCCATGGAGGATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCTTCC （SEQ ID NO.86）
輕鏈可變區胺基酸序列：
DVQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVGYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQWSSIPLTFGQGTRLEIK （SEQ ID NO.87）
輕鏈可變區核酸序列：
GACGTGCAGCTGACCCAGTCTCCTTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGCTCCGCTTCTTCCAGCGTGGGCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGAGGTGGATCTACGACACATCTAAGCTGGCTTCCGGAGTGCCAAGCCGGTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGAACCGACTACACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACATATTTTTGTCAGCAGTGGAGCTCTATCCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACACGCCTGGAGATCAAG （SEQ ID NO.88）
42F5-04：
重鏈可變區胺基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGEIYPNNGRVNYNEKFKNRATLTVDISTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRYDPMEDWGQGTTVTVSS （SEQ ID NO.89）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGCTCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGTCTTCCGGCTACACCTTCACAAACTATTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGCGAGATCTACCCTAACAATGGCAGAGTGAACTACAACGAGAAGTTTAAGAACCGCGCCACCCTGACAGTGGACATCTCTACCTCCACAGCTTACATGGAGCTGAGCTCTCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTGCTAGGTCTCGGTATGACCCCATGGAGGATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGTCCAGC （SEQ ID NO.90）
輕鏈可變區胺基酸序列：
同42F5-03 （SEQ ID NO.87）
輕鏈可變區核酸序列：
同42F5-03 （SEQ ID NO.88）
42F5-05:
重鏈可變區胺基酸序列：
同42F5-01. （SEQ ID NO.81）
重鏈可變區核酸序列：
同42F5-01. （SEQ ID NO.82）
輕鏈可變區胺基酸序列：
QVQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVGYMHWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQWSSIPLTFGQGTRLEIK （SEQ ID NO.91）
輕鏈可變區核酸序列：
CAGGTGCAGCTGACCCAGTCTCCTTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCTCCGCTTCTTCCAGCGTGGGCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGAGGCTGATCTACGATACATCTAAGCTGGCTTCCGGAGTGCCAAGCCGGTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGAACCGACTACACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACATATTTTTGTCAGCAGTGGAGCTCTATCCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACACGCCTGGAGATCAAG （SEQ ID NO.92）
42F5-08
重鏈可變區胺基酸序列：
同42F5-04 （SEQ ID NO.89）
重鏈可變區核酸序列：
同42F5-04 （SEQ ID NO.90）
輕鏈可變區胺基酸序列：
QVQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVGYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQWSSIPLTFGQGTRLEIK （SEQ ID NO.93）
輕鏈可變區核酸序列：
CAGGTGCAGCTGACCCAGTCTCCTTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCTCCGCTTCTTCCAGCGTGGGCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGAGGTGGATCTACGATACATCTAAGCTGGCTTCCGGAGTGCCAAGCCGGTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGAACCGACTACACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACATATTTTTGTCAGCAGTGGAGCTCTATCCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACACGCCTGGAGATCAAG （SEQ ID NO.94）
42F5-11:
重鏈可變區胺基酸序列：
同42F5-03 （SEQ ID NO.85）
重鏈可變區核酸序列：
同42F5-03 （SEQ ID NO.86）
輕鏈可變區胺基酸序列：
EVVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVGYMHWYQQKPGQAPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDAAVYFCQQWSSIPLTFGQGTRLEIK （SEQ ID NO.95）
輕鏈可變區核酸序列：
GAGGTGGTGCTGACCCAGTCCCCAGCCACACTGAGCCTGTCTCCAGGAGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCTCCGCCTCCAGCTCTGTGGGCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCTAGGCGGTGGATCTACGACACCTCTAAGCTGGCTTCCGGAGTGCCAGCTCGCTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGCACAGACTACACCCTGACAATCTCCAGCCTGGAGCCTGAGGATGCCGCCGTGTACTTCTGTCAGCAGTGGTCTTCCATCCCACTGACCTTTGGCCAGGGCACAAGGCTGGAGATCAAG （SEQ ID NO.96）
42F5-13:
重鏈可變區胺基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIYPNSGRVNYNEKFKNRVTMTVDISISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSRYDPMEDWGQGTTVTVSS （SEQ ID NO.97）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCTTCTGTGAAGGTGAGCTGCAAGAGCTCCGGCTACACCTTTACCAATTATTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATATATCCCAATAGCGGCCGGGTGAATTATAATGAGAAGTTTAAGAATCGGGTGACCATGACCGTGGATATCAGCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGATGACACCGCTGTGTACTACTGCGCTAGGTCCAGGTATGACCCCATGGAGGATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC （SEQ ID NO.98）
輕鏈可變區胺基酸序列：
同42F5-01 （SEQ ID NO.83）
輕鏈可變區核酸序列：
同42F5-01 （SEQ ID NO.84）
42F5-14:
重鏈可變區胺基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIYPNQGRVNYNEKFKNRVTMTVDISISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSRYDPMEDWGQGTTVTVSS （SEQ ID NO.99）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCCTGTAAGTCCAGCGGCTATACCTTCACCAACTATTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATATATCCTAACCAGGGCCGGGTGAATTATAACGAGAAGTTCAAGAATAGGGTGACCATGACCGTGGACATCTCCATCAGCACCGCTTACATGGAGCTGTCCAGGCTGCGGAGCGACGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTCCCGGTATGATCCCATGGAGGACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC （SEQ ID NO.100）
輕鏈可變區胺基酸序列：
同42F5-01 （SEQ ID NO.83）
輕鏈可變區核酸序列：
同42F5-01 （SEQ ID NO.84）
42F5-15:
重鏈可變區胺基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIYPNNARVNYNEKFKNRVTMTVDISISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSRYDPMEDWGQGTTVTVSS （SEQ ID NO.101）
重鏈可變區核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGTAAGAGCAGCGGCTACACCTTTACCAATTATTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGATTGGAGTGGATGGGCGAGATATATCCTAACAATGCCAGGGTGAACTATAATGAGAAGTTTAAGAACCGGGTGACCATGACCGTGGACATCAGCATCTCCACCGCCTATATGGAGCTGAGCCGGCTGCGGTCCGACGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCCGGTCCCGGTATGATCCTATGGAGGACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCTCC （SEQ ID NO.102）
輕鏈可變區胺基酸序列：
同42F5-01 （SEQ ID NO.83）
輕鏈可變區核酸序列：
同42F5-01 （SEQ ID NO.84）
表8：抗TrkA抗體42F5人源化抗體可變區序列
抗體編號 重鏈 輕鏈
重鏈胺基酸序列 重鏈核酸序列 輕鏈胺基酸序列 輕鏈核酸序列
42F5-01 SEQ ID NO.81 SEQ ID NO.82 SEQ ID NO.83 SEQ ID NO.84
42F5-03 SEQ ID NO.85 SEQ ID NO.86 SEQ ID NO.87 SEQ ID NO.88
42F5-04 SEQ ID NO.89 SEQ ID NO.90 SEQ ID NO.87 SEQ ID NO.88
42F5-05 SEQ ID NO.81 SEQ ID NO.82 SEQ ID NO.91 SEQ ID NO.92
42F5-08 SEQ ID NO.89 SEQ ID NO.90 SEQ ID NO.93 SEQ ID NO.94
42F5-11 SEQ ID NO.85 SEQ ID NO.86 SEQ ID NO.95 SEQ ID NO.96
42F5-13 SEQ ID NO.97 SEQ ID NO.98 SEQ ID NO.83 SEQ ID NO.84
42F5-14 SEQ ID NO.99 SEQ ID NO.100 SEQ ID NO.83 SEQ ID NO.84
42F5-15 SEQ ID NO.101 SEQ ID NO.102 SEQ ID NO.83 SEQ ID NO.84
B．人源化抗TrkA抗體表徵
1）人源化抗體與人TrkA結合
使用含有鼠Fc的人TrkA胞外區（33-417）蛋白研究抗TrkA抗體42F5人源化抗體的親和力，96孔酶標板每孔包被50ng人TrkA，洗滌及封閉後加入梯度稀釋的人源化抗體，室溫孵育1小時。洗滌三次後加入辣根過氧化物酶偶聯山羊抗人IgG抗體（ThermoFisher，A18817），室溫反應1小時，三次洗滌後加入四甲基聯苯胺（TMB，Biolegend）顯色，1M HCl終止顯色，酶標儀讀取450nm處吸光值。
結合情況如表9和圖17所示，不同序列的抗TrkA抗體42F5人源化抗體均與人TrkA有相似的結合，結合程度與人鼠嵌合抗體42F5-Chi（含鼠源抗TrkA抗體42F5可變區和人抗體恒定區）相當。
表9 ：抗TrkA抗體42F5人源化抗體與TrkA結合EC50
抗體 42F5-Chi 42F5-01 42F5-03 42F5-04 42F5-05 42F5-08 42F5-11 42F5-13 42F5-14 42F5-15
EC50 （ nM ） 0.062 0.061 0.056 0.070 0.072 0.055 0.050 0.087 0.071 0.054
2）人源化抗體與表達TrkA/TrkB/TrkC的細胞的結合
利用分別表達TrkA、TrkB、TrkC的細胞株TrkA/CHO (ThermoFisher, K1516）, TrkB/CHO (ThermoFisher, K1491）, TrkC/CHO (ThermoFisher, K1515）研究抗TrkA抗體42F5人源化抗體的特異性，並使用CHO-K1作為陰性對照，通過流式細胞術檢測人源化抗體與四株細胞的結合情況。
按照產品說明書培養細胞，在對數生長期收集細胞，使用流式緩衝液（PBS+2%FBS, pH 7.4）重懸細胞，在96孔板中每孔加入10 5細胞（50μl），並加入50μl 的100μg/mL的人源化抗TrkA抗體，室溫孵育60min，採用1200rpm轉速離心棄去上清並洗滌細胞3次。FITC標記的山羊抗人Fc抗體（Abcam，ab97224）用流式緩衝液稀釋至5μg/mL，用以重懸細胞，室溫避光孵育30min，離心棄去上清並洗滌3次，用7AAD溶液（Biolegend，420403）重懸細胞，室溫孵育10min後使用流式細胞儀（BioRad, ZE5）檢測抗體的結合情況。
結果如圖18所示，與人鼠嵌合抗體42F5-Chi相似，抗TrkA抗體42F5人源化抗體可以結合到TrkA/CHO細胞，但不能結合到TrkB/CHO，TrkC/CHO以及CHO-K1細胞，說明人源化抗TrkA抗體的特異性良好。
採用相同的流式細胞術檢測人源化抗TrkA抗體和TrkA/CHO細胞的結合曲線，抗體由66.67μg/mL的濃度起始3倍梯度稀釋至共10個濃度，結果如圖19所示，抗TrkA抗體42F5人源化抗體和TrkA/CHO細胞的結合程度與人鼠嵌合抗體42F5-Chi相當，EC50在表10中總結。
表10：抗TrkA抗體42F5人源化抗體流式結合EC50
抗體 42F5-chi 42F5-01 42F5-05 42F5-08 42F5-11 42F5-13 42F5-14 42F5-15
EC50 （nM） 0.490 0.605 0.680 0.535 0.513 0.518 0.547 0.609
3）NGF誘導的TF-1細胞增殖實驗
如實施例6A中所述，通過TF-1細胞的增殖來檢測抗TrkA抗體42F5人源化抗體對NGF/TrkA通路的抑制效果。結果如圖20所示，抗TrkA抗體42F5人源化抗體均可抑制NGF誘導的TF-1細胞的增殖，抑制程度與人鼠嵌合抗體42F5-Chi相當，IC50如表11所示。
表11：抗TrkA抗體42F5人源化抗體抑制NGF誘導的TF-1細胞增殖IC50
抗體 42F5-chi 42F5-01 42F5-03 42F5-04 42F5-05 42F5-08 42F5-11 42F5-13 42F5-14 42F5-15
IC50 （nM） 1.547 1.566 1.431 1.691 1.483 1.649 1.404 0.867 1.940 0.850
4）NGF誘導的TrkA/Ba/F3細胞增殖實驗
如實施例6B中所述，通過TrkA/Ba/F3的增殖來檢測抗TrkA抗體42F5人源化抗體對NGF/TrkA通路的抑制效果。結果如圖21所示，人源化抗TrkA抗體均可抑制NGF誘導的TrkA/Ba/F3細胞的增殖，抑制程度與人鼠嵌合抗體42F5-Chi相當，IC50如表12所示。
表12：抗TrkA抗體42F5人源化抗體抑制NGF誘導的TrkA/Ba/F3細胞增殖IC50
抗體 42F5-chi 42F5-01 42F5-03 42F5-04 42F5-05 42F5-08 42F5-11 42F5-13 42F5-14 42F5-15
IC50 （nM） 2.916 2.966 2.91 3.695 4.417 3.541 2.814 3.309 3.273 2.71
儘管已經對本發明的具體實施方式進行了詳細說明和描述，但應當認識到，本發明不受所述具體實施方式的限制。
無
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中： 圖1表示本發明的抗TrkA抗體與人TrkA蛋白結合的ELISA實驗結果。 圖2表示本發明的抗TrkA抗體與TrkA蛋白胞外區(192-402)結合的ELISA實驗結果。 圖3表示本發明的抗TrkA抗體與猴子TrkA蛋白結合的ELISA實驗結果。 圖4表示本發明的抗TrkA抗體與小鼠TrkA蛋白結合的ELISA實驗結果。 圖5表示本發明的抗TrkA抗體與大鼠TrkA蛋白結合的ELISA實驗結果。 圖6表示本發明的抗TrkA抗體與表達人TrkA蛋白的CHO細胞結合的FACS結果。 圖7表示本發明的抗TrkA抗體與現有技術的抗TrkA抗體阻斷人TrkA與配體NGF的結合效率的示意圖。 圖8表示本發明的抗TrkA抗體與現有技術的抗TrkA抗體抑制NGF誘導的TF-1細胞增殖的效率的示意圖。 圖9表示本發明的抗TrkA抗體與現有技術的抗TrkA抗體抑制NGF誘導TrkA/Ba/F3細胞增殖的效率的示意圖。 圖10表示本發明的抗TrkA抗體與人TrkA結合的ELISA實驗結果。 圖11表示本發明的抗TrkA抗體與人TrkB結合的ELISA實驗結果。 圖12表示本發明的抗TrkA抗體與人TrkC結合的ELISA實驗結果。 圖13表示 CFA致小鼠炎症性模型在足底注射造模劑CFA之前，採用VonFrey測定痛閾，得到的基礎痛閾。 圖14表示 CFA致小鼠炎症性模型在足底注射造模劑CFA 24小時左右的痛閾，此為給藥前的痛閾值。 圖15表示使用本發明的抗TrkA抗體33H5與42F5處理CFA致小鼠炎症性模型24小時後的痛閾值，其中*P＜0.05 vs 生理鹽水; ***P＜0.001 vs 生理鹽水。 圖16表示使用本發明的抗TrkA抗體33H5與42F5處理CFA致小鼠炎症性模型48小時後的痛閾值，其中*P＜0.05 vs 生理鹽水; ***P＜0.001 vs 生理鹽水。 圖17表示本發明的人源化抗TrkA抗體與人TrkA結合的ELISA實驗結果。 圖18表示本發明的人源化抗TrkA抗體與表達人TrkA、TrkB或TrkC蛋白的CHO細胞結合的FACS結果。 圖19表示本發明的人源化抗TrkA抗體與表達人TrkA蛋白的CHO細胞結合的結果。 圖20表示本發明的人源化抗TrkA抗體抑制NGF誘導的TF-1細胞增殖的效率。 圖21表示本發明的人源化抗TrkA抗體抑制NGF誘導的TrkA/Ba/F3細胞增殖效率。
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Claims (12)

  1. 一種能夠特異性結合TrkA的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL； 所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 1所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 2所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 3所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 25所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 26所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 27所示的VL CDR3；或 所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 4所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 5所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 6所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 28所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 29所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 30所示的VL CDR3；或 所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 7所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 8所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 9所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 31所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VL CDR3；或 所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 11所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 12所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 34所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 35所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 36所示的VL CDR3；或 所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 13所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 14所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 15所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 37所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 38所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 39所示的VL CDR3；或 所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 16所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 17所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 18所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 40所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 42所示的VL CDR3；或 所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 19所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 20所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 21所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 43所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 44所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 45所示的VL CDR3；或 所述抗體或其抗原結合片段的VH包含：如SEQ ID NO: 22所示的VH CDR1、如SEQ ID NO: 23所示的VH CDR2、如SEQ ID NO: 24所示的VH CDR3；並且，所述抗體或其抗原結合片段的VL包含：如SEQ ID NO: 46所示的VL CDR1、如SEQ ID NO: 47所示的VL CDR2、如SEQ ID NO: 48所示的VL CDR3。
  2. 一種能夠特異性結合TrkA的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中： 所述重鏈可變區包含SEQ ID NO: 49-56中任一項所示的重鏈可變區中含有的3個CDR；並且，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 57-64中任一項所示的輕鏈可變區中含有的3個CDR。
  3. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中： 所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 49所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:57所示的序列的VL；或 所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 50所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 58所示的序列的VL；或 所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 51所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:59所示的序列的VL；或 所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 52所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 60所示的序列的VL；或 所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 53所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 61所示的序列的VL；或 所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 54所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 62所示的序列的VL；或 所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 55所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 63所示的序列的VL；或 所述抗體或其抗原結合片段包含：具有如SEQ ID NO: 56所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 64所示的序列的VL。
  4. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段進一步包含： (a)人免疫球蛋白的重鏈恒定區（CH）或其變體；和 (b)人免疫球蛋白的輕鏈恒定區（CL）或其變體。
  5. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗原結合片段選自Fab、Fab’、(Fab’) 2、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、雙抗體（diabody）和單域抗體（sdAb）；和/或，所述抗體為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。
  6. 如請求項5所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述人源化抗體包含： 具有如SEQ ID NO: SEQ ID NO: 81、85、89、97、99和101中任一項所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO: 83、87、91、93、和95中任一項所示的序列的VL。
  7. 如請求項5所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述人源化抗體為42F5-01、42F5-03、42F5-04、42F5-05、42F5-08、42F5-11、42F5-13、42F5-14或42F5-15。
  8. 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，或其重鏈可變區和/或輕鏈可變區。
  9. 一種藥物組合物，其含有如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
  10. 一種用於治療多種病症或疾病的方法，其中，所述病症或疾病為疼痛、神經瘤或神經元病症；所述方法包括給予有需要的受試者治療有效量的權利要求1所述的抗體或其抗原結合片段。
  11. 如請求項10所述的方法，其中，所述疼痛與以下任意一種相關：炎症性疼痛、術後痛、神經病理痛、癌症疼痛。
  12. 如請求項10所述的方法，其中，所述疼痛與以下任意一種相關：胰腺炎性疼痛、腎結石性疼痛、子宮內膜異位症性疼痛、IBD性疼痛、術後粘連性疼痛、膽囊結石性疼痛、頭痛、痛經、肌肉骨骼痛、扭傷性疼痛、內臟痛、卵巢囊腫性疼痛、前列腺炎性疼痛、膀胱炎性疼痛、間質性膀胱炎性疼痛、手術後疼痛、偏頭痛、三叉神經痛、燒傷和/或創口痛、與創傷相關的疼痛、神經性疼痛、與肌骨骼疾病相關的疼痛、類風濕性關節炎性疼痛、骨關節炎性疼痛、強直性脊柱炎性疼痛、關節周圍病變性疼痛、腫瘤痛、來自骨轉移的疼痛、HIV感染性疼痛。
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