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CN112961244B - 抗TrkA抗体或其抗原结合片段、其制备方法和应用 - Google Patents

抗TrkA抗体或其抗原结合片段、其制备方法和应用 Download PDF

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CN112961244B CN202110222357.4A CN202110222357A CN112961244B CN 112961244 B CN112961244 B CN 112961244B CN 202110222357 A CN202110222357 A CN 202110222357A CN 112961244 B CN112961244 B CN 112961244B
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Abstract

本发明提供了一种抗TrkA抗体或其抗原结合片段、制备方法和应用。本发明还提供了编码所述抗TrkA抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸，以及包含所述分离的多核苷酸的载体。本发明还提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗疼痛的药物中的用途。

Description

抗TrkA抗体或其抗原结合片段、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物免疫技术领域，具体涉及能特异性结合人原肌球蛋白受体激酶A的抗TrkA抗体或其抗原结合片段，本发明还涉及所述抗体或其抗原结合片段的制备方法和用途。
背景技术
原肌球蛋白受体激酶A(Tropomyosin Receptor Kinase,TrkA,也称为highaffinity nerve growth factor receptor,neurotrophic tyrosine kinase receptortype 1，或TRK1-transforming tyrosine kinase protein)属于原肌球蛋白受体激酶(Trk)家族一员，由NTRK1(neurotrophic receptor tyrosine kinase 1)基因编码。Trk家族包含三种受体，分别是TrkA、TrkB和TrkC，各自通过结合特定的神经营养素配体发挥不同的生物学作用。Trk受体是跨膜受体，由含配体结合区的胞外区、跨膜区(TM)、含酪氨酸激酶区的胞内区组成。TrkA主要在神经嵴神经元、交感神经神经元以及基底前脑和纹状体的胆碱能神经元中表达(Holtzman DM et al.(1992)Neuron 9(3):465-78；Verge VM et al.(1992)J.Neurosci.12(10):4011-22)，在包括B淋巴细胞在内的一些非神经元组织和细胞中也有表达(Torcia M et al.(1996)Cell 85(3):345-56)。TrkA选择性结合神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)，是NGF高亲和性受体。NGF与TrkA结合可激活TrkA激酶活性，从而引起多种信号通路的激活，包括Ras/MAPK、PI3K/Akt和PLCγ通路。除结合TrkA以外，NGF还与p75共同神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR，也称为“低亲和性”NGF受体)结合。
NGF/TrkA信号通路与细胞分化、增殖、生存和疼痛等有关。其中NGF/TrkA与疼痛的发生与外周痛觉末梢敏化有关，NGF/TrkA通路的激活可增加瞬时受体电位香草酸受体1(Transient receptor potential vanilloid subtype 1,TRPV1)磷酸化，从而使其敏感化，并且NGF/TrkA可增加多种蛋白质的表达，包括TRPV1、Na/Ca/K离子通道、CGRP、P物质和脑源性神经营养因子(BDNF)等，这些蛋白质进一步使伤害感受性神经元敏感化，痛觉信号增加，并由背根神经节传至中枢，促进中枢神经系统中次级神经元的激活(Denk F et al.(2017)Annu.Rev.Neurosci.40:307-325)。在受伤和炎症组织中，NGF高表达，并且TrkA对伤害性感受神经元的激活通过多种机制引发，并产生疼痛信号。NGF/TrkA信号通路与疼痛之间的关系在动物模型已得到证实：大鼠注射NGF后，热刺激引起的缩足潜伏期明显缩短(Lewin et al.(1994)Eur J Neurosci,6:1903-1912)；而通过给予大鼠抗NGF抗体、TrkA-IgG、小分子TrkA抑制剂等方式阻断NGF/TrkA信号，可抑制疼痛(Woolf CJ et al.(1994)Neuroscience 62:327-331；McMahon SB et al.(1995)Net.Med.1:774-780；KoltzenburgM et al.(1999)Eur.J.Neurosci.11:1698-1704；Bagal SK et al.(2019)J Med Chem.62(1):247-265)。在人体中，NGF含量在类风湿性关节炎、间质性膀胱炎、胰腺炎、前列腺炎、糖尿病性神经病和癌性疼痛等疼痛患者中都有所升高(Aloe et al.(1992)Arthritis andRheumatism35:351-355；Mantyh PW et al.(2011)Anesthesiology 115(1):189-204)。健康人注射NGF后，可产生痛觉敏感及局部性疼痛(Petty et al.(1994)Ann Neurol.36:244-246)，提示NGF水平的增加是产生痛觉过敏反应所必需的。NGFβ基因发生纯合子错义突变会使人体出现HSAN5症状，这类患者对疼痛、冷、热不敏感(Larsson et al.(2009)NeurobiolDis,33:221-228)。而对先天性无痛无汗症(CIPA)患者的遗传学研究显示TrkA基因(NTRK1)在胞外区或胞内区突变可引起CIPA，此类患者中TrkA无法被NGF激活，从而导致患者失去痛觉感受能力(Mardy S et al.(2001)Human mutation 18:462-471)。
在全球范围内，有数以千万计的患者在遭受着慢性疼痛带来的痛苦，而这个数字随着人口增加还在不断增加。当前临床上使用的用于慢性疼痛治疗的药物包括非甾体类抗炎药、抗惊厥药、阿片类药物等，然而这些药物有很多的不足，其中，非甾体抗炎药的疗效有限，并且具有包括消化道出血和肾脏毒性等副作用；而阿片类药物具有成瘾等副作用。只有不到30％的慢性痛患者可以从现有治疗中获益(Kalso E et al.(2004)Pain 112(3):372-80)。该领域亟需能缓解疼痛、无毒性、防滥用的非阿片类止痛药，NGF/TrkA作为一种全新镇痛机制，为该难题的解决提供了一种可能。到目前为止，有多个抗人NGF抗体处于研发或临床开发阶段，临床实验显示NGF抗体对退行性关节病相伴的关节痛、慢性腰痛、与间质性膀胱炎相伴的膀胱痛等疼痛显示出了强大且范围广的镇痛效果(Lane NE et al.(2010)NEngl J Med 363:1521-1531)，另一方面，多个NGF抗体的临床实验也表明NGF抗体会升高患者的骨关节炎加速进展的风险(Thomas JS et al.(2019)JAMA 322:37-48)，可能面临被限制用于重病人群、不能长期使用和剂量限制等问题，使得NGF抗体的临床应用需要进一步的安全验证。
靶向TrkA的抗体与NGF抑制剂相比，理论上是一种更好的治疗选择。因为TrkA抗体不影响NGF与p75受体的结合，而p75受体功能与神经元发育，成骨细胞分化、增殖，成肌细胞分化、肌肉修复等有关(Akiyama Y et al.(2014)Differentiation,87:111-118；Depontiet al.(2009)Molecular Biology of the Cell,20:3620-3627；Mikami et al.(2012)Differentiation,84:392-399)。预期TrkA抗体在安全性方面表现更优。
基于此，当前对亲和力更高，特异性更强的抗TrkA抗体存在需求。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种亲和力更高，特异性更强的抗TrkA抗体。本发明还提供了所述抗体的制备方法和用途，本发明的抗TrkA抗体可以用于治疗疼痛，包括炎症性疼痛、术后痛、神经病理痛、癌症疼痛、骨关节炎等。与现有技术相比，本发明研发的抗TrkA抗体或其抗原结合片段具备更高的亲和力高、更好的特异性和更强的活性。
一方面，本发明提供了能够特异性结合TRKA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:1，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:2，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:3，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:25，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:26，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:27，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:1所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:2所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:3所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:25所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:26所示的VL CDR2、如SEQ IDNO:27所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了能够特异性结合TRKA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:4，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:5，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:6，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:28，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:29，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:30，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:4所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:5所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:6所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:28所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:29所示的VL CDR2、如SEQ IDNO:30所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了能够特异性结合TRKA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:7，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:8，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:9，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:31，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:32，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:33，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:7所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:8所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:9所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:31所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:32所示的VL CDR2、如SEQ IDNO:33所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了能够特异性结合TRKA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:10，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:11，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:12，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:34，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:35，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:36，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:10所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:11所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:12所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:34所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:35所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:36所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了能够特异性结合TRKA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:13，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:14，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:15，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:37，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:38，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:39，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:13所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:14所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:15所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:37所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:38所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:39所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了能够特异性结合TRKA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:16，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:17，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:18，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:40，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:41，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:42，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:16所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:17所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:18所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:40所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:42所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了能够特异性结合TRKA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:19，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:20，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:21，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:43，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:44，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:45，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:19所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:20所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:21所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:43所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:44所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:45所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了能够特异性结合TRKA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:22，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:23，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:24，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:46，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:47，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:48，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:22所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:23所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:24所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:46所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:47所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:48所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了能够特异性结合TRKA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区包含SEQ ID NO:49-56中任一项所示的重链可变区中含有的3个CDR；并且，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:57-64中任一项所示的轻链可变区中含有的3个CDR；
优选地，所述重链可变区中含有的3个CDR，和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR，由Kabat或IMGT编号系统定义。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:49所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:49所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:49所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:57所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:57所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:57所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:49所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:57所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:50所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:50所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:50所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:58所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:58所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:58所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:50所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:58所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:51所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:51所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:51所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:59所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:59所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:59所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:51所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:59所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:52所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:52所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:52所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:60所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:60所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:60所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:52所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:60所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:53所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:53所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:53所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:61所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:61所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:61所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:53所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:61所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:54所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:54所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:54所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:62所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:62所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:62所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:54所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:62所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:55所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:55所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:55所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:63所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:63所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:63所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:55所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:63所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:56所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:56所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:56所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:64所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:64所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:64所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:56所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:64所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)；
优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区；
优选地，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
根据本发明的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb)；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
根据本发明的抗体或其抗原结合片段，其中，所述人源化抗体包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:81、85、89、97、99和101中任一项所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:81、85、89、97、99和101中任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:81、85、89、97、99和101中任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:83、87、91、93、和95中任一项所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:83、87、91、93、和95中任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:83、87、91、93、和95中任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:81、85、89、97、99和101中任一项所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:83、87、91、93、和95中任一项所示的序列的VL。
更优选地，所述人源化抗体选自42F5-01、42F5-03、42F5-04、42F5-05、42F5-08、42F5-11、42F5-13、42F5-14或42F5-15。
根据本发明的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段带有标记；优选地，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，其编码所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区；
优选地，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:65-80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100和102中任一项所示的核苷酸编码序列。
本发明还提供了载体，其包含所述的分离的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
本发明还提供了宿主细胞，其包含所述的分离的核酸分子或所述的载体。
本发明还提供了制备所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，更优选为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞，进一步优选为中国仓鼠卵巢细胞。
本发明还提供了双特异性或多特异性分子，其包含所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述双特异性或多特异性分子特异性结合TrkA，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标；
优选地，所述双特异性或多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的分子(例如第二抗体)。
本发明还提供了药物组合物，其含有所述的抗体或其抗原结合片段、所述的双特异性或多特异性分子，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。本发明还提供了一种所述的抗体或其抗原结合片段，或所述的双特异性或多特异性分子或药物组合物或所述的宿主细胞在制备用于治疗多种病症或疾病的药物中的用途。
本发明还提供了多种病症或疾病的治疗方法，其包括向有需要的受试者(其适当地为哺乳动物受试者特别是人类受试者)给予治疗上有效量的抗体或其抗原结合片段，或所述的双特异性或多特异性分子或药物组合物或所述的宿主细胞在制备用于治疗多种病症或疾病的药物中的用途。所述病症或疾病为疼痛，优选地为慢性痛或急性痛，更优选地为慢性痛；进一步地疼痛可与以下任意一种相关：炎症性疼痛、术后痛、神经病理痛、癌症疼痛等；更进一步优选地，疼痛可与以下任意一种相关：胰腺炎性疼痛、肾结石性疼痛、子宫内膜异位症性疼痛、IBD性疼痛、术后粘连性疼痛、胆囊结石性疼痛、头痛、痛经、肌肉骨骼痛、扭伤性疼痛、内脏痛、卵巢囊肿性疼痛、前列腺炎性疼痛、膀胱炎性疼痛、间质性膀胱炎性疼痛、手术后疼痛、偏头痛、三叉神经痛、烧伤和/或创口痛、与创伤相关的疼痛、神经性疼痛、与肌骨骼疾病相关的疼痛、类风湿性关节炎性疼痛、骨关节炎性疼痛、强直性脊柱炎性疼痛、关节周围病变性疼痛、肿瘤痛、来自骨转移的疼痛、HIV感染性疼痛。所述病症或疾病为神经瘤、神经元病症。本发明提供的抗体作为药物与现有抗体比较，具有更强的结合能力和特异性。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1表示本发明的抗TrkA抗体与人TrkA蛋白结合的ELISA实验结果。
图2表示本发明的抗TrkA抗体与TrkA蛋白胞外区(192-402)结合的ELISA实验结果。
图3表示本发明的抗TrkA抗体与猴子TrkA蛋白结合的ELISA实验结果。
图4表示本发明的抗TrkA抗体与小鼠TrkA蛋白结合的ELISA实验结果。
图5表示本发明的抗TrkA抗体与大鼠TrkA蛋白结合的ELISA实验结果。
图6表示本发明的抗TrkA抗体与表达人TrkA蛋白的CHO细胞结合的FACS结果。
图7表示本发明的抗TrkA抗体与现有技术的抗TrkA抗体阻断人TrkA与配体NGF的结合效率的示意图。
图8表示本发明的抗TrkA抗体与现有技术的抗TrkA抗体抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖的效率的示意图。
图9表示本发明的抗TrkA抗体与现有技术的抗TrkA抗体抑制NGF诱导TrkA/Ba/F3细胞增殖的效率的示意图。
图10表示本发明的抗TrkA抗体与人TrkA结合的ELISA实验结果。
图11表示本发明的抗TrkA抗体与人TrkB结合的ELISA实验结果。
图12表示本发明的抗TrkA抗体与人TrkC结合的ELISA实验结果。
图13表示CFA致小鼠炎症性模型在足底注射造模剂CFA之前，采用VonFrey测定痛阈，得到的基础痛阈。
图14表示CFA致小鼠炎症性模型在足底注射造模剂CFA 24小时左右的痛阈，此为给药前的痛阈值。
图15表示使用本发明的抗TrkA抗体33H5与42F5处理CFA致小鼠炎症性模型24小时后的痛阈值，其中*P<0.05vs生理盐水；***P<0.001vs生理盐水。
图16表示使用本发明的抗TrkA抗体33H5与42F5处理CFA致小鼠炎症性模型48小时后的痛阈值，其中*P<0.05vs生理盐水；***P<0.001vs生理盐水。
图17表示本发明的人源化抗TrkA抗体与人TrkA结合的ELISA实验结果。
图18表示本发明的人源化抗TrkA抗体与表达人TrkA、TrkB或TrkC蛋白的CHO细胞结合的FACS结果。
图19表示本发明的人源化抗TrkA抗体与表达人TrkA蛋白的CHO细胞结合的结果
图20表示本发明的人源化抗TrkA抗体抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖的效率。
图21表示本发明的人源化抗TrkA抗体抑制NGF诱导的TrkA/Ba/F3细胞增殖效率。
实施例1.鼠源抗TrkA抗体的制备
将含有鼠Fc标签的重组人TrkA蛋白(北京百普赛斯生物科技股份有限公司，TRA-H5254)作为免疫原与等量弗氏完全佐剂(Sigma-Alderich，F5881)混合乳化，用于初始免疫。准备6周龄BALB/c和C57小鼠(江苏华阜康)各10只，每只动物皮下注射50μg免疫原(不包括佐剂质量，下同)。将免疫原与弗氏不完全佐剂(Sigma-Alderich，F5506)混合乳化，用于后续加强免疫。初始免疫2周后每只动物腹腔注射25μg免疫原进行第一次加强免疫；2周后每只动物皮下注射25μg免疫原进行第二次加强免疫。4-5周后最后一次免疫冲击，腹腔注射25μg免疫原。
最后一次免疫后分离小鼠B细胞，与SP2/0细胞(中国科学院细胞库，TCM18)混合，参照BTX公司电转仪操作手册进行融合。融合细胞经过培养后采用酶联免疫法(ELISA)筛选出与TrkA结合并能抑制人TrkA和配体NGF结合的杂交瘤细胞。再通过有限稀释法进行亚克隆，以同样ELISA方式筛选获得8个阳性杂交瘤单克隆细胞株，分别命名为5A3、11G8、26E9、33H5、40D6、42F5、42H6和42A11。
将杂交瘤单克隆细胞株进行扩增并用无血清培养基培养，收集培养基并用蛋白G柱从中纯化，以获得鼠源抗人TrkA单克隆抗体5A3、11G8、26E9、33H5、40D6、42F5、42H6和42A11。
实施例2：鼠源抗TrkA抗体与TrkA结合的ELISA检测
使用含有人Fc的TrkA胞外区(33-417)(北京百普赛斯生物科技股份有限公司，TRA-H5259)蛋白检测抗TrkA抗体的结合能力。96孔酶标板每孔包被50ng人TrkA，洗涤及封闭后加入梯度稀释的抗体，室温孵育1小时。洗涤三次后加入辣根过氧化物酶偶联山羊抗小鼠Fc抗体(Biolegend,405306)，室温孵育1小时，三次洗涤后加入四甲基联苯胺(TMB，Biolegend，421101)显色，1M HCl终止显色，酶标仪读取450nm吸光值。
8个杂交瘤分泌的抗TrkA抗体均以剂量依赖的方式结合至人TrkA胞外区(图1)，8个抗体与人TrkA结合的EC50如表1。
进一步使用只含人TrkA胞外区与配体NGF结合的区域(TrkA 192-402)的融合蛋白(融合人Fc)(北京百普赛斯生物科技股份有限公司，TRA-H5258)检测抗TrkA抗体的结合能力，ELISA结果显示抗TrkA抗体与TrkA胞外区192-402氨基酸区域结合如图2所示，EC50如表2所示。
另外，使用猴子TrkA(杭州皓阳生物技术有限公司，HSP037-05)，大鼠TrkA(北京义翘神州科技股份有限公司，80243-R03H)，小鼠TrkA(北京义翘神州科技股份有限公司，51103-M02H)胞外区融合蛋白(融合人Fc)检测抗TrkA抗体的种属交叉反应，ELISA结果显示8个抗TrkA抗体均可以与三个其他种属的TrkA蛋白有较强的结合，结果如图3-5所示。
表1 8个抗TrkA抗体与人TrkA(33-417)结合的EC50
表2 8个抗TrkA抗体与人TrkA(192-402)结合的EC50
实施例3：鼠源抗TrkA抗体与人TrkA结合亲和力检测
应用生物分子相互作用检测平台ForteBio Octet Red96(PALL)测定抗体亲和力。
利用抗人Fc捕获传感器(Fortebio，18-5088)将含有人Fc标签的人TrkA胞外区(33-417)蛋白固定至芯片，然后结合梯度浓度的抗TrkA抗体。加缓冲液(1X KineticsBuffer:PBS+0.1％BSA+0.05％Tween 20)进行解离，最后通过仪器算法计算出抗原抗体结合的亲和动力学常数，结果如表3所示。
表3抗TrkA抗体与人TrkA结合亲和力
实施例4:流式细胞术检测鼠源抗TrkA抗体与TrkA/CHO细胞的结合
利用流式细胞术(FACS)检测抗TrkA抗体与表达全长TrkA的CHO-K1细胞(TrkA/CHO)的结合情况。将TrkA/CHO细胞培养在含10％FBS,5μg/mL嘌呤霉素的F12K培养基(Hyclone，SH30026)中，阴性对照细胞CHO-K1培养在含10％FBS的F12K培养基中，在对数生长期收集细胞，使用含2％FBS的PBS重悬细胞，在96孔板中每孔加入105细胞(50μl)，并加入50μl的20μg/mL的抗TrkA抗体，或小鼠IgG对照，室温反应1小时，加入1μg/mL Alexa Flour647标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson，115-605-062)，室温孵育30分钟。使用流式细胞分析仪(BioRad,ZE5)检测抗体的结合情况，如图6所示，8个抗TrkA抗体均可结合在TrkA/CHO细胞，但不结合至CHO-K1细胞；对照抗体小鼠IgG既不与CHO-K1结合，也不与TrkA/CHO结合。
实施例5:鼠源抗TrkA抗体阻断人TrkA和配体NGF的结合
申请人根据中国专利申请CN101939337A提供的序列信息，参照其中的最优抗体BXhVH5VL1的重链可变区(SEQ ID NO:5)和轻链可变区(SEQ ID NO:7)，合成了对照抗体BXhVH5VL1。
96孔酶标板每孔包被50ng融合人Fc的TrkA胞外区(33-417)蛋白，洗涤三次后3％BSA封闭1小时。10,000ng/mL(66.67nM)抗TrkA抗体依次3倍稀释10个浓度至0.17ng/mL(0.0011nM)，每孔加入100μL，孵育30分钟后每孔加入100μL的1μg/mL的生物素标记人NGF，室温孵育1小时，洗涤三次。加入链霉亲和素标记辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP，Biolegend，405210)孵育0.5小时，洗涤三次后酶标板中加TMB，显色终止后酶标仪读取450nm吸光值。
结果如图7所示，本发明的抗TrkA抗体可以阻断人TrkA与配体NGF的结合，阻断效果随抗体浓度的升高而明显增强，当抗体浓度为20nM时，这八个抗TrkA抗体可几乎完全阻断TrkA与NGF的结合。而对照抗体BXhVH5VL1对TrkA与NGF的结合，在所测浓度(0.001-100nM)内没有显著阻断作用。本发明8个抗TrkA抗体及BXhVH5VL1阻断人TrkA与配体NGF结合的IC50如表4所示。
表4抗TrkA抗体阻断TrkA-NGF结合的IC50
实施例6：鼠源抗TrkA抗体的体外中和活性检测
A.NGF诱导的TF-1细胞增殖实验
TF-1细胞(人血液白血病细胞，ATCC,CRL-2003)的生长高度依赖GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)，NGF与TF-1细胞表面的TrkA结合后激活其下游信号通路也能诱导TF-1的生长，从而不需要依赖GM-CSF。将TF-1细胞培养于含10％FBS(Gibco,10091148)，2μg/mL GM-CSF(R&D，215-GM-010)的RPMI1640培养基(HyClone，SH30027)，在对数生长期收集细胞，彻底洗涤清除原生长培养基中的GM-CSF,用不含GM-CSF的培养基重悬，每孔5000细胞稀释在80μl培养基中铺到白色透底96孔细胞培养板(corning，3610)。抗TrkA抗体由400μg/mL(2666.67nM)进行4倍梯度稀释制备10个浓度，每孔细胞中加入10μL，室温孵育0.5小时后，每孔细胞加入10μL的50ng/mL的人NGF，在37℃，5％CO2培养箱中培养细胞72小时后加入100μL细胞活力检测试剂(Promega，G7573)，使用多功能酶标仪(SpectraMax)读取光学luminescence信号。如图8所示，本发明的抗TrkA抗体能够抑制人NGF诱导的TF-1细胞的增殖，IC50如表5所示。抗体BXhVH5VL1对TF-1细胞增殖的抑制作用远弱于本发明抗体。当抗体浓度为40μg/mL(266.67nM)时，本发明抗TrkA抗体可完全抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖，而该浓度下抗体BXhVH5VL1对NGF诱导的TF-1细胞增殖的抑制率低于40％。
表5抗TrkA抗体抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖IC50
抗体 5A3 11G8 26E9 33H5 40D6 42F5 42H6 42A11 BXhVH5VL1
IC50(nM) 6.487 1.092 1.393 2.136 8.532 1.302 3.576 1.462 >200
B.NGF诱导的TrkA/Ba/F3细胞增殖实验
Ba/F3细胞的生长有依赖IL-3及不依赖IL-3两种途径，不依赖IL-3的生长需要Ba/F3细胞稳定表达活性激酶。构建表达全长人TrkA的Ba/F3(TrkA/Ba/F3)细胞，该细胞增殖需要添加NGF诱导。
将TrkA/Ba/F3细胞培养于含10％FBS和100ng/mL NGF的RPMI1640培养基，收集细胞并彻底洗涤清除原生长培养基中的NGF，按照每孔3000细胞重悬于80μL不含NGF的培养基中，铺到白色透底96孔细胞培养板(corning，3610)。每孔细胞加入10μL梯度稀释的抗TrkA抗体，室温孵育0.5小时后，每孔细胞加入10μL 50ng/mL的人NGF，使NGF终浓度为5ng/mL，梯度稀释的抗NGF抗体终浓度最高为40μg/mL(266.67nM)。在37℃，5％CO2培养箱中培养细胞48小时后加入100μL细胞活力检测试剂(Promega，G7573)，使用多功能酶标仪(SpectraMax)读取光学luminescence信号。
在观测TrkA/Ba/F3细胞生长的过程中，添加了人NGF的细胞可以正常增殖；本发明的8个抗TrkA抗体能够抑制NGF诱导的TrkA/Ba/F3细胞增殖，抑制作用随浓度的升高而增强，当抗体浓度升高至2.5μg/mL(16.67nM)及更高浓度时，抗TrkA抗体对TrkA/Ba/F3细胞增殖的抑制作用可达100％；而抗体BXhVH5VL1在最高浓度40μg/mL(266.67nM)时对TrkA/Ba/F3细胞增殖的抑制率低于50％(图9)，IC50如表6所示。
表6抗TrkA抗体抑制NGF诱导的TrkA/Ba/F3细胞增殖IC50
抗体 5A3 11G8 26E9 33H5 40D6 42F5 42H6 42A11 BXhVH5VL1
IC50(nM) 0.422 1.646 1.539 0.413 1.805 1.252 0.782 0.738 >200
实施例7：鼠源抗TrkA抗体与TrkA同家族蛋白结合的检测
96孔酶标板每孔包被50ng人TrkA胞外区蛋白，人TrkB胞外区蛋白(北京义翘神州科技有限公司，10047-H03H),人TrkC胞外区蛋白(北京义翘神州科技有限公司，10048-H03H)按照实施例2中方法检测抗TrkA抗体与人TrkA及两个同家族蛋白TrkB、TrkC的结合情况。
8个鼠源抗TrkA抗体与TrkA(图10)有高亲和力，与TrkB(图11)及TrkC(图12)基本无结合。
实施例8：抗TrkA抗体对CFA致小鼠炎症性疼痛的作用
C57BL/6小鼠(浙江维通利华实验动物技术有限公司)，雄性，SPF级，6-8周龄，适应性饲养5天。适应期结束后将动物分成3组，分别为生理盐水组、抗TrkA抗体33H5组、抗TrkA抗体42F5组，每组10只动物。小鼠足底注射造模剂CFA之前，采用VonFrey测定痛阈，此为基础痛阈(图13)。
次日于小鼠足底注射25μl CFA致炎，待足趾肿胀明显后(造模后24小时左右)，同样方法检测小鼠足底痛阈，此为给药前的痛阈值(图14)。
随后每组分别皮下注射生理盐水、抗TrkA抗体33H5、抗TrkA抗体42F5,剂量10mg/kg，并测定给药后24小时及48小时的痛阈(图15，16)，评价受试物对痛阈的影响。
结果如图13-16所示，给药后24小时和48小时，抗TrkA抗体33H5和42F5均能明显改善CFA引起的痛阈下降，与生理盐水组相比，具有统计学差异。
实施例9：鼠源抗TrkA抗体可变区测序及序列分析
使用TRIzol试剂盒(Ambion,15596-026)提取杂交瘤细胞总RNA，以之为模板合成第一链cDNA(Takara)。快速扩增cDNA末端(RACE)得到抗体轻链和重链片段，将扩增片段分别克隆至标准载体。测序得到抗TrkA抗体5A3、11G8、26E9、33H5、40D6、42F5、42H6和42A11的重链和轻链可变区序列为：
抗TrkA抗体5A3:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAIGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGRGVTNYNENFKGKATFTVDISSTTTYIQFSSLTSEDSAVYYCARSNYGDYDFWGQGTSLTVSS(SEQ ID NO:49)
重链可变区核酸序列：
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTATTGGGTACACATTCAGTAGGTACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGAGGTGTTACTAACTACAATGAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGTAGATATATCCTCCACCACAACCTACATTCAATTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATCGAATTATGGTGACTACGACTTCTGGGGCCAAGGCACCTCTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:65)
轻链可变区氨基酸序列：
QTVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSSGAVTTSNHANWVQEKPDHLFTSLMGGTNNRAPGVPARFSGSLIG DKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:57)
轻链可变区核酸序列：
CAGACTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTTCTGGGGCTGTTACAACTAGTAACCATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCTGATCATTTATTCACTAGTCTAATGGGTGGTACCAATAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGCGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCGCAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTCTGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACTAAACTGACTGTCCTA(SEQ ID NO:66)
抗TrkA抗体11G8:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGLTNYDEKFKTKATLTIDKSSRTAYIQLSSLTSEDSAVYYCAKYGNYVAFAFWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:50)
重链可变区核酸序列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAACGGTCTTACTAACTACGATGAGAAATTCAAGACCAAGGCCACACTGACCATAGACAAATCCTCCAGAACAGCCTACATACAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAAATATGGTAACTACGTCGCGTTTGCTTTCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:67)
轻链可变区氨基酸序列：
DIQMTQSPASLSATVGETVTITCRASENIYSYVAWYQQKQGKSPQLLVHNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQF SLKINGLHPEDFGSYYCQHHYGIPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:58)
轻链可变区核酸序列：
GACATTCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCAACTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAAAATATTTACAGTTATGTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAACTCCTGGTCCATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTACCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACGGCCTGCACCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTATGGTATTCCGCTCACGTTCGGCGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO:68)
抗TrkA抗体26E9:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKSSGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIYPSNGRTNYNEKFKNRATLTVDISSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSRYDPMEDWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:51)
重链可变区核酸序列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCTGTGAAGCTGTCCTGCAAGTCTTCTGGCTATACCTTCACCAACTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGCGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTAGCAACGGTCGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAAAACAGGGCCACACTGACTGTAGACATTTCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGAGTAGGTACGACCCTATGGAAGACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCT(SEQ ID NO:69)
轻链可变区氨基酸序列：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVGYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPTRFSGSGSGTSY SLTISSMEAEDAATYYCQQWSSIPLTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:59)
轻链可变区核酸序列：
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTGGGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCAACTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAGGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTATCCCACTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAG(SEQ ID NO:70)
抗TrkA抗体33H5:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQQPGAELVKPGASVQLSCKASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGLTNYIEKFKNKATLTIDKSSNTAYMQLSGLTPEDSAVYYCAKYGNYVAFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:52)
重链可变区核酸序列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGCAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGTTACTGGATACACTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAACGGTCTTACTAACTACATTGAGAAATTCAAGAACAAGGCCACACTGACTATTGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCGGCCTGACACCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAAATATGGTAACTACGTCGCGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:71)
轻链可变区氨基酸序列：
DIQMTQSPASLSASVGDTVTITCRASENIYTYLAWYQQKQGKSPQLLVHNTKTLAEGVPSRFSGSGSGTQ FSLKISSLQPEDFGTYYCQHHYGVPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:60)
轻链可变区核酸序列：
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGACACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAAAATATCTACACTTATTTAGCTTGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAACTCCTGGTCCATAATACAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCCTCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGACTTATTACTGTCAACATCATTATGGTGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO:72)
抗TrkA抗体40D6:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQQSGTELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGRSSTNYNEKFKGKATF TADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRVSQLHIYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:53)
重链可变区核酸序列：
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAACTGAACTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCAGTAGATACTGGATAGAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGGAGTAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCCGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTACAAGAGTTTCCCAACTGCACATTTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACTGTCACAGTCTCCTCC(SEQ ID NO:73)
轻链可变区氨基酸序列：
DIVMTQVVPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFQQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSG SGTAFTLRISRVEAEDVAFYYCMQHLEFPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:61)
轻链可变区核酸序列：
GATATTGTGATGACTCAGGTTGTACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTATATTGGTTCCAGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACATTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGCTTTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGTTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO:74)
抗TrkA抗体42F5:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKSSGYTFTNYWMHWVRQRPGQGLEWIGEIYPNNGRVNYNEKFKNRATLTVDISSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSRYDPMEDWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:54)
重链可变区核酸序列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAACCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGTCTTCTGGCTATACCTTCACCAACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATCTATCCTAACAACGGTCGTGTTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAACAGGGCCACACTGACTGTAGACATATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGAGTAGGTACGACCCTATGGAAGACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCT(SEQ ID NO:75)
轻链可变区氨基酸序列：
QVVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVGYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPTRFSGSGSGTSY SLTISSMEAEDAATYFCQQWSSIPLTFGSGTRLEIK(SEQ ID NO:62)
轻链可变区核酸序列：
CAAGTTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAGGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCAACTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAGGATGCTGCCACTTATTTCTGCCAGCAGTGGAGTAGTATCCCACTCACGTTCGGCTCGGGGACAAGGTTGGAAATAAAG(SEQ ID NO:76)
抗TrkA抗体42H6:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQQPGVELVKPGASVKLSCKTSGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIYSSNGLTNYNEKFKNKATLTVDKSSSTAYMQLTSLTSEDSAIYYCARHWYVFLDHWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:55)
重链可变区核酸序列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGTTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAATGGATTGGAGAGATTTATTCCAGTAACGGTCTTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAATAAGGCCACACTGACTGTAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCACCAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCGATCTATTACTGTGCAAGACATTGGTACGTCTTCCTTGACCACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:77)
轻链可变区氨基酸序列：
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNHANWVQEKPDHLFTGLIGGINNRAPGVPARFSGSLIGD KAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTRLTVL(SEQ ID NO:63)
轻链可变区核酸序列：
CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACCATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTATCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAATCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAGACTGACTGTCCTA(SEQ ID NO:78)
抗TrkA抗体42A11:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIYPSNGRTNYNEKFKTKATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCAGSRYDAMDFWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:56)
重链可变区核酸序列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGCATTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTAGCAACGGTCGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGACCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCATCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAGGATCGAGATACGATGCTATGGACTTCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:79)
轻链可变区氨基酸序列：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSIISYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCHQWTSNPLTFGGGTKLELK(SEQ ID NO:64)
轻链可变区核酸序列：
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAATTATAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACTTCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGTGGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTGGACTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGGTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA(SEQ ID NO:80)
序列分析得到Kabat及IMGT系统界定的CDR，下表(表7)基于Kabat及IMGT系统的定义列出八个抗TrkA抗体的CDR。
表7基于Kabat及IMGT系统界定抗TrkA抗体CDR
实施例10：鼠源抗TrkA抗体人源化改造及表征
抗体的人源化改造
根据上述获得的杂交瘤细胞分泌的抗体的轻链可变区(VL)及重链可变区(VH)序列进行人源化改造。将鼠源抗体的VL、VH的氨基酸序列在人胚胎系抗体氨基酸序列数据库进行对比和检索，找出同源性高的人类IGHV和IGKV序列作为人源化模板。通过计算机模拟技术，分析可变区与框架区氨基酸存在的可能空间位阻及相互影响，确定对维持人源化抗体活性比较关键的框架区氨基酸，在人源化过程中对这些氨基酸予以保留。通过CDR移植技术完成对轻链和重链可变区的人源化改造。之后通过选定的抗体恒定区模板，得到以下多个人源化抗体。
其中对抗TrkA抗体42F5进行人源化改造，获得了示例性抗体42F5-01，42F5-03，42F5-04，42F5-05，43F5-08，42F5-11。以人IGHV1-2为重链可变区模板，以人IGKV1-39为轻链可变区模板，获得人源化抗体42F5-01和42F5-03；以人IGHV1-2为重链可变区模板，以人IGKV1-6为轻链可变区模板，获得人源化抗体42F5-05；以人IGHV1-2为重链可变区，以人IGKV3-11为轻链可变区模板，获得人源化抗体42F5-11；以人IGHV1-69为重链可变区模板，以人IGKV1-39为轻链可变区模板，获得人源化抗体42F5-04；以人IGHV1-69为重链可变区模板，以人IGKV1-6为轻链可变区模板，获得人源化抗体42F5-08。在获得的人源化抗体中，42F5-01和42F5-05重链可变区序列一致，人源化抗体42F5-03和42F5-11重链可变区序列一致，人源化抗体42F5-04和42F5-08重链可变区序列一致；人源化抗体42F5-03和42F5-04轻链可变区序列一致。
IGHV1-2、IGHV1-69、IGKV1-39、IGKV1-6、IGKV3-11为IMGT(The InternationalImMunoGeneTics Information System)及NCBI(The National Center forBiotechnology Information)中的人类免疫球蛋白基因数据库中人类种系IgG基因。此外，由于抗体42F5重链互补决定区序列中含有脱酰胺位点NG，为消除该位点对抗体的潜在影响，对人源化抗体43F5-01的重链可变区进行了进一步改造。以42F5-01为模板，将重链可变区中的NG55-56突变为SG55-56，或者QG55-56，或者NA55-56，分别获得人源化抗体42F5-13，42F5-14，42F5-15。
将获得的人源化抗体重链可变区序列嫁接至人IgG4重链恒定区，轻链可变区序列嫁接至人Kappa轻链恒定区，并进行基因合成，经酶切后连入相应质粒中。将构建好的质粒瞬时转染至CHO细胞中进行表达，经过7-10天表达，细胞培养上清用相应缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水(pH7.4))平衡的MabSelect柱(GE Healthcare)进行纯化，之后用柠檬酸钠或其它缓冲液进行洗脱，经此步骤获得的抗体，可通过SDS-PAGE或SEC-HPLC进行纯度等鉴定，并用于后续其它表征研究。
抗TrkA抗体42F5人源化抗体可变区序列:
抗TrkA抗体42F5人源化抗体42F5-01、42F5-03、42F5-04、42F5-05、42F5-08、42F5-11、42F5-13、42F5-14、42F5-15可变区序列如下：42F5-01:
重链可变区氨基酸序列:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIYPNNGRVNYNEKFKNRVTMTVDISISTA YMELSRLRSDDTAVYYCARSRYDPMEDWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.81)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGTCCAGCGGCTACACCTTCACAAACTATTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCTAACAATGGCAGGGTGAACTACAACGAGAAGTTTAAGAACAGAGTGACCATGACAGTGGACATCAGCATCTCTACCGCTTACATGGAGCTGTCTAGGCTGCGGTCCGACGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTAGATCTCGCTATGACCCCATGGAGGATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCTTCC(SEQ ID NO.82)
轻链可变区氨基酸序列：
DVQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVGYMHWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFA TYFCQQWSSIPLTFGQGTRLEIK(SEQ ID NO.83)
轻链可变区核酸序列：
GACGTGCAGCTGACCCAGTCTCCTTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGCTCCGCTTCTTCCAGCGTGGGCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGAGGCTGATCTACGACACATCTAAGCTGGCTTCCGGAGTGCCAAGCCGGTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGAACCGACTACACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACATATTTTTGTCAGCAGTGGAGCTCTATCCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACACGCCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO.84)
42F5-03:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGEIYPNNGRVNYNEKFKNRATLTVDISISTAY MELSRLRSDDTAVYYCARSRYDPMEDWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.85)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGTCCAGCGGCTACACCTTCACAAACTATTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGCGAGATCTACCCTAACAATGGCAGGGTGAACTACAACGAGAAGTTTAAGAACAGAGCCACCCTGACAGTGGACATCAGCATCTCTACCGCTTACATGGAGCTGTCTAGGCTGCGGTCCGACGATACAGCCGTGTACTATTGTGCTAGATCTCGCTATGACCCCATGGAGGATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCTTCC(SEQ ID NO.86)
轻链可变区氨基酸序列：
DVQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVGYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFA TYFCQQWSSIPLTFGQGTRLEIK(SEQ ID NO.87)
轻链可变区核酸序列：
GACGTGCAGCTGACCCAGTCTCCTTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGCTCCGCTTCTTCCAGCGTGGGCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGAGGTGGATCTACGACACATCTAAGCTGGCTTCCGGAGTGCCAAGCCGGTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGAACCGACTACACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACATATTTTTGTCAGCAGTGGAGCTCTATCCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACACGCCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO.88)
42F5-04：
重链可变区氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGEIYPNNGRVNYNEKFKNRATLTVDISTSTAY MELSSLRSEDTAVYYCARSRYDPMEDWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.89)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGCTCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGTCTTCCGGCTACACCTTCACAAACTATTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGCGAGATCTACCCTAACAATGGCAGAGTGAACTACAACGAGAAGTTTAAGAACCGCGCCACCCTGACAGTGGACATCTCTACCTCCACAGCTTACATGGAGCTGAGCTCTCTGAGAAGCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTGCTAGGTCTCGGTATGACCCCATGGAGGATTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGTCCAGC(SEQ ID NO.90)
轻链可变区氨基酸序列：
同42F5-03(SEQ ID NO.87)
轻链可变区核酸序列：
同42F5-03(SEQ ID NO.88)
42F5-05:
重链可变区氨基酸序列：
同42F5-01.(SEQ ID NO.81)
重链可变区核酸序列：
同42F5-01.(SEQ ID NO.82)
轻链可变区氨基酸序列：
QVQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVGYMHWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFA TYFCQQWSSIPLTFGQGTRLEIK(SEQ ID NO.91)
轻链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGACCCAGTCTCCTTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCTCCGCTTCTTCCAGCGTGGGCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGAGGCTGATCTACGATACATCTAAGCTGGCTTCCGGAGTGCCAAGCCGGTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGAACCGACTACACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACATATTTTTGTCAGCAGTGGAGCTCTATCCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACACGCCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO.92)
42F5-08
重链可变区氨基酸序列：
同42F5-04(SEQ ID NO.89)
重链可变区核酸序列：
同42F5-04(SEQ ID NO.90)
轻链可变区氨基酸序列：
QVQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVGYMHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFA TYFCQQWSSIPLTFGQGTRLEIK(SEQ ID NO.93)
轻链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGACCCAGTCTCCTTCCAGCCTGTCCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCTCCGCTTCTTCCAGCGTGGGCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGAGGTGGATCTACGATACATCTAAGCTGGCTTCCGGAGTGCCAAGCCGGTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGAACCGACTACACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACATATTTTTGTCAGCAGTGGAGCTCTATCCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACACGCCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO.94)
42F5-11:
重链可变区氨基酸序列：
同42F5-03(SEQ ID NO.85)
重链可变区核酸序列：
同42F5-03(SEQ ID NO.86)
轻链可变区氨基酸序列：
EVVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVGYMHWYQQKPGQAPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDAA VYFCQQWSSIPLTFGQGTRLEIK(SEQ ID NO.95)
轻链可变区核酸序列：
GAGGTGGTGCTGACCCAGTCCCCAGCCACACTGAGCCTGTCTCCAGGAGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCTCCGCCTCCAGCTCTGTGGGCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCTAGGCGGTGGATCTACGACACCTCTAAGCTGGCTTCCGGAGTGCCAGCTCGCTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGCACAGACTACACCCTGACAATCTCCAGCCTGGAGCCTGAGGATGCCGCCGTGTACTTCTGTCAGCAGTGGTCTTCCATCCCACTGACCTTTGGCCAGGGCACAAGGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO.96)
42F5-13:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIYPNSGRVNYNEKFKNRVTMTVDISISTA YMELSRLRSDDTAVYYCARSRYDPMEDWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.97)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCTTCTGTGAAGGTGAGCTGCAAGAGCTCCGGCTACACCTTTACCAATTATTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATATATCCCAATAGCGGCCGGGTGAATTATAATGAGAAGTTTAAGAATCGGGTGACCATGACCGTGGATATCAGCATCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGATGACACCGCTGTGTACTACTGCGCTAGGTCCAGGTATGACCCCATGGAGGATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ ID NO.98)
轻链可变区氨基酸序列：
同42F5-01(SEQ ID NO.83)
轻链可变区核酸序列：
同42F5-01(SEQ ID NO.84)
42F5-14:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIYPNQGRVNYNEKFKNRVTMTVDISISTA YMELSRLRSDDTAVYYCARSRYDPMEDWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.99)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCCTGTAAGTCCAGCGGCTATACCTTCACCAACTATTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATATATCCTAACCAGGGCCGGGTGAATTATAACGAGAAGTTCAAGAATAGGGTGACCATGACCGTGGACATCTCCATCAGCACCGCTTACATGGAGCTGTCCAGGCTGCGGAGCGACGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTCCCGGTATGATCCCATGGAGGACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ ID NO.100)
轻链可变区氨基酸序列：
同42F5-01(SEQ ID NO.83)
轻链可变区核酸序列：
同42F5-01(SEQ ID NO.84)
42F5-15:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIYPNNARVNYNEKFKNRVTMTVDISISTA YMELSRLRSDDTAVYYCARSRYDPMEDWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.101)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGTAAGAGCAGCGGCTACACCTTTACCAATTATTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGATTGGAGTGGATGGGCGAGATATATCCTAACAATGCCAGGGTGAACTATAATGAGAAGTTTAAGAACCGGGTGACCATGACCGTGGACATCAGCATCTCCACCGCCTATATGGAGCTGAGCCGGCTGCGGTCCGACGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCCGGTCCCGGTATGATCCTATGGAGGACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCTCC(SEQ ID NO.102)
轻链可变区氨基酸序列：
同42F5-01(SEQ ID NO.83)
轻链可变区核酸序列：
同42F5-01(SEQ ID NO.84)
表8抗TrkA抗体42F5人源化抗体可变区序列
B.人源化抗TrkA抗体表征
1)人源化抗体与人TrkA结合
使用含有鼠Fc的人TrkA胞外区(33-417)蛋白研究抗TrkA抗体42F5人源化抗体的亲和力，96孔酶标板每孔包被50ng人TrkA，洗涤及封闭后加入梯度稀释的人源化抗体，室温孵育1小时。洗涤三次后加入辣根过氧化物酶偶联山羊抗人IgG抗体(ThermoFisher，A18817)，室温反应1小时，三次洗涤后加入四甲基联苯胺(TMB，Biolegend)显色，1M HCl终止显色，酶标仪读取450nm处吸光值。
结合情况如表9和图17所示，不同序列的抗TrkA抗体42F5人源化抗体均与人TrkA有相似的结合，结合程度与人鼠嵌合抗体42F5-Chi(含鼠源抗TrkA抗体42F5可变区和人抗体恒定区)相当。
表9抗TrkA抗体42F5人源化抗体与TrkA结合EC50
2)人源化抗体与表达TrkA/TrkB/TrkC的细胞的结合
利用分别表达TrkA、TrkB、TrkC的细胞株TrkA/CHO(ThermoFisher,K1516),TrkB/CHO(ThermoFisher,K1491),TrkC/CHO(ThermoFisher,K1515)研究抗TrkA抗体42F5人源化抗体的特异性，并使用CHO-K1作为阴性对照，通过流式细胞术检测人源化抗体与四株细胞的结合情况。
按照产品说明书培养细胞，在对数生长期收集细胞，使用流式缓冲液(PBS+2％FBS,pH 7.4)重悬细胞，在96孔板中每孔加入105细胞(50μl)，并加入50μl的100μg/mL的人源化抗TrkA抗体，室温孵育60min，采用1200rpm转速离心弃去上清并洗涤细胞3次。FITC标记的山羊抗人Fc抗体(Abcam，ab97224)用流式缓冲液稀释至5μg/mL，用以重悬细胞，室温避光孵育30min，离心弃去上清并洗涤3次，用7AAD溶液(Biolegend，420403)重悬细胞，室温孵育10min后使用流式细胞仪(BioRad,ZE5)检测抗体的结合情况。
结果如图18所示，与人鼠嵌合抗体42F5-Chi相似，抗TrkA抗体42F5人源化抗体可以结合到TrkA/CHO细胞，但不能结合到TrkB/CHO，TrkC/CHO以及CHO-K1细胞，说明人源化抗TrkA抗体的特异性良好。
采用相同的流式细胞术检测人源化抗TrkA抗体和TrkA/CHO细胞的结合曲线，抗体由66.67μg/mL的浓度起始3倍梯度稀释至共10个浓度，结果如图19所示，抗TrkA抗体42F5人源化抗体和TrkA/CHO细胞的结合程度与人鼠嵌合抗体42F5-Chi相当，EC50在表10中总结。
表10抗TrkA抗体42F5人源化抗体流式结合EC50(nM)
3)NGF诱导的TF-1细胞增殖实验
如实施例6A中所述，通过TF-1细胞的增殖来检测抗TrkA抗体42F5人源化抗体对NGF/TrkA通路的抑制效果。结果如图20所示，抗TrkA抗体42F5人源化抗体均可抑制NGF诱导的TF-1细胞的增殖，抑制程度与人鼠嵌合抗体42F5-Chi相当，IC50如表11所示。
表11抗TrkA抗体42F5人源化抗体抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖IC50
4)NGF诱导的TrkA/Ba/F3细胞增殖实验
如实施例6B中所述，通过TrkA/Ba/F3的增殖来检测抗TrkA抗体42F5人源化抗体对NGF/TrkA通路的抑制效果。结果如图21所示，人源化抗TrkA抗体均可抑制NGF诱导的TrkA/Ba/F3细胞的增殖，抑制程度与人鼠嵌合抗体42F5-Chi相当，IC50如表12所示。
表12抗TrkA抗体42F5人源化抗体抑制NGF诱导的TrkA/Ba/F3细胞增殖IC50
尽管已经对本发明的具体实施方式进行了详细说明和描述，但应当认识到，本发明不受所述具体实施方式的限制。
序列表
<110> 杭州熙源生物技术有限公司
<120> 抗TrkA抗体或其抗原结合片段、其制备方法和应用
<141> 2021-02-28
<160> 102
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Ile Glu
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Ile Leu Pro Gly Arg Gly Val Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Arg Ser Asn Tyr Gly Asp Tyr Asp Phe
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Lys Tyr Gly Asn Tyr Val Ala Phe Ala Phe
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Arg Ser Arg Tyr Asp Pro Met Glu Asp
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His
1 5 10
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 12
Ala Lys Tyr Gly Asn Tyr Val Ala Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Ile Glu
1 5 10
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Ile Leu Pro Gly Arg Ser Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 15
Thr Arg Val Ser Gln Leu His Ile Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 16
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 17
Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Arg Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 18
Ala Arg Ser Arg Tyr Asp Pro Met Glu Asp
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 20
Glu Ile Tyr Ser Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 21
Ala Arg His Trp Tyr Val Phe Leu Asp His
1 5 10
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 22
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 23
Glu Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 24
Ala Gly Ser Arg Tyr Asp Ala Met Asp Phe
1 5 10
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 25
Arg Ser Ser Ser Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn His Ala Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 26
Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 27
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val
1 5
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 28
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 29
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 30
Gln His His Tyr Gly Ile Pro Leu Thr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 31
Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met His
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 32
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 33
Gln Gln Trp Ser Ser Ile Pro Leu Thr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 34
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Thr Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 35
Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 36
Gln His His Tyr Gly Val Pro Leu Thr
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 37
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 38
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 39
Met Gln His Leu Glu Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 40
Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met His
1 5 10
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 41
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 42
Gln Gln Trp Ser Ser Ile Pro Leu Thr
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 43
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn His Ala Asn
1 5 10
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 44
Gly Ile Asn Asn Arg Ala Pro
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 45
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val
1 5
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 46
Ser Ala Ser Ser Ile Ile Ser Tyr Met His
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 47
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 48
His Gln Trp Thr Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
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<211> 117
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ile Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Arg Gly Val Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Ile Ser Ser Thr Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asn Tyr Gly Asp Tyr Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 118
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Gly Asn Tyr Val Ala Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 51
<211> 117
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Tyr Asp Pro Met Glu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 118
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 52
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Gln Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Gly Asn Tyr Val Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 53
<211> 119
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Arg Ser Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Val Ser Gln Leu His Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 54
<211> 117
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 54
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Arg Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Tyr Asp Pro Met Glu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 55
<211> 117
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 55
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Val Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Ser Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Trp Tyr Val Phe Leu Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 117
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 56
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Ser Arg Tyr Asp Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 57
<211> 109
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 57
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Ser Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn His Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Ser
35 40 45
Leu Met Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Thr Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
His Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Gly Leu His Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ile Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 59
<211> 106
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 59
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ile Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
His Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 61
<211> 112
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 61
Asp Ile Val Met Thr Gln Val Val Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Phe Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 62
<211> 106
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 62
Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ile Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 63
<211> 109
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 63
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn His Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Ile Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 64
<211> 106
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 64
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ile Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Thr Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 65
<211> 351
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 65
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcaagg ctattgggta cacattcagt aggtactgga tagagtgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagaggtgt tactaactac 180
aatgagaact tcaagggcaa ggccacattc actgtagata tatcctccac cacaacctac 240
attcaattca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagatcgaat 300
tatggtgact acgacttctg gggccaaggc acctctctca cagtctcctc a 351
<210> 66
<211> 327
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 66
cagactgttg tgactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60
acttgtcgct caagttctgg ggctgttaca actagtaacc atgccaactg ggtccaagaa 120
aaacctgatc atttattcac tagtctaatg ggtggtacca ataaccgagc tccaggtgtt 180
cctgccagat tctcaggctc cctgattggc gacaaggctg ccctcaccat cacaggggcg 240
cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctctggt acagcaacca ttgggtgttc 300
ggtggaggaa ctaaactgac tgtccta 327
<210> 67
<211> 354
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 67
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttccggcta cacctttacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta acaacggtct tactaactac 180
gatgagaaat tcaagaccaa ggccacactg accatagaca aatcctccag aacagcctac 240
atacaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaaatatggt 300
aactacgtcg cgtttgcttt ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354
<210> 68
<211> 321
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 68
gacattcaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcaa ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtga aaatatttac agttatgtag catggtatca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcaactcct ggtccataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtaccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaacgg cctgcaccct 240
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat cattatggta ttccgctcac gttcggcgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 69
<211> 351
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 69
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc tgtgaagctg 60
tcctgcaagt cttctggcta taccttcacc aactactgga tgcactgggt gaagcagcgg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagag atttatccta gcaacggtcg tactaactac 180
aatgagaagt tcaaaaacag ggccacactg actgtagaca tttcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaggagtagg 300
tacgacccta tggaagactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc t 351
<210> 70
<211> 318
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 70
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtgggt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt cccaactcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgag 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtatcc cactcacgtt cggctcgggg 300
acaaagttgg aaataaag 318
<210> 71
<211> 354
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 71
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgcagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agttactgga tacactgggt gaaacagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta acaacggtct tactaactac 180
attgagaaat tcaagaacaa ggccacactg actattgaca aatcctccaa cacagcctac 240
atgcaactca gcggcctgac acctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaaatatggt 300
aactacgtcg cgtttgctta ctggggccag gggactctgg tcactgtctc tgca 354
<210> 72
<211> 321
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 72
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga cactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtga aaatatctac acttatttag cttggtatca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcaactcct ggtccataat acaaaaacct tagcagaagg tgtgccctca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat cattatggtg ttccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 73
<211> 357
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 73
caggttcagc tgcagcagtc tggaactgaa ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt agatactgga tagagtgggt aaaacagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaaggagtag tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgccgata catcctccaa cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aagagtttcc 300
caactgcaca tttactttga ctactggggc caagggacca ctgtcacagt ctcctcc 357
<210> 74
<211> 336
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 74
gatattgtga tgactcaggt tgtaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttatattgg 120
ttccagcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac attgagaatc 240
agtagagtgg aggctgagga tgtggctttt tattactgta tgcaacatct agaatttccg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagttggag ctgaaa 336
<210> 75
<211> 351
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 75
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaaac ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagt cttctggcta taccttcacc aactactgga tgcactgggt gaggcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagag atctatccta acaacggtcg tgttaactac 180
aatgagaagt tcaagaacag ggccacactg actgtagaca tatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaggagtagg 300
tacgacccta tggaagactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc t 351
<210> 76
<211> 318
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 76
caagttgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaggt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt cccaactcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgag 240
gatgctgcca cttatttctg ccagcagtgg agtagtatcc cactcacgtt cggctcgggg 300
acaaggttgg aaataaag 318
<210> 77
<211> 351
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 77
caggtccaac tgcagcagcc tggggttgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaaga cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgaatg gattggagag atttattcca gtaacggtct tactaactac 180
aatgagaagt tcaagaataa ggccacactg actgtagata aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca ccagcctgac atctgaagac tctgcgatct attactgtgc aagacattgg 300
tacgtcttcc ttgaccactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
<210> 78
<211> 327
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 78
caggctgttg tgactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60
acttgtcgct caagtactgg ggctgttaca actagtaacc atgccaactg ggtccaagaa 120
aaaccagatc atttattcac tggtctaata ggtggtatca acaaccgagc tccaggtgtt 180
cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 240
cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acagcaatca ttgggtgttc 300
ggtggaggaa ccagactgac tgtccta 327
<210> 79
<211> 351
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 79
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgtaagg cttctggcta caccttcacc aactactgga tgcattgggt gaaacagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagag atttatccta gcaacggtcg tactaactac 180
aatgagaagt tcaagaccaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcatctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aggatcgaga 300
tacgatgcta tggacttctg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
<210> 80
<211> 318
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 80
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aattataagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacact tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagtggcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccaccagtgg actagtaacc cgctcacgtt cggtggtggg 300
accaagctgg aactgaaa 318
<210> 81
<211> 117
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Arg Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Val Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Tyr Asp Pro Met Glu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 82
<211> 351
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 82
caggtgcagc tggtgcagag cggagctgag gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60
agctgcaagt ccagcggcta caccttcaca aactattgga tgcactgggt gaggcaggct 120
ccaggacagg gactggagtg gatgggcgag atctacccta acaatggcag ggtgaactac 180
aacgagaagt ttaagaacag agtgaccatg acagtggaca tcagcatctc taccgcttac 240
atggagctgt ctaggctgcg gtccgacgat acagccgtgt actattgtgc tagatctcgc 300
tatgacccca tggaggattg gggccagggc accacagtga ccgtgtcttc c 351
<210> 83
<211> 106
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 83
Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ile Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 84
<211> 318
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 84
gacgtgcagc tgacccagtc tccttccagc ctgtccgcca gcgtgggcga tagagtgacc 60
atcacatgct ccgcttcttc cagcgtgggc tacatgcact ggtatcagca gaagcccggc 120
aaggccccta agaggctgat ctacgacaca tctaagctgg cttccggagt gccaagccgg 180
ttctctggct ccggcagcgg aaccgactac accctgacaa tctcttccct gcagccagag 240
gatttcgcca catatttttg tcagcagtgg agctctatcc ccctgacctt tggccagggc 300
acacgcctgg agatcaag 318
<210> 85
<211> 117
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 85
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Arg Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Tyr Asp Pro Met Glu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 86
<211> 351
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 86
caggtgcagc tggtgcagag cggagctgag gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60
agctgcaagt ccagcggcta caccttcaca aactattgga tgcactgggt gaggcaggct 120
ccaggacagg gactggagtg gatcggcgag atctacccta acaatggcag ggtgaactac 180
aacgagaagt ttaagaacag agccaccctg acagtggaca tcagcatctc taccgcttac 240
atggagctgt ctaggctgcg gtccgacgat acagccgtgt actattgtgc tagatctcgc 300
tatgacccca tggaggattg gggccagggc accacagtga ccgtgtcttc c 351
<210> 87
<211> 106
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 87
Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ile Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 88
<211> 318
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 88
gacgtgcagc tgacccagtc tccttccagc ctgtccgcca gcgtgggcga tagagtgacc 60
atcacatgct ccgcttcttc cagcgtgggc tacatgcact ggtatcagca gaagcccggc 120
aaggccccta agaggtggat ctacgacaca tctaagctgg cttccggagt gccaagccgg 180
ttctctggct ccggcagcgg aaccgactac accctgacaa tctcttccct gcagccagag 240
gatttcgcca catatttttg tcagcagtgg agctctatcc ccctgacctt tggccagggc 300
acacgcctgg agatcaag 318
<210> 89
<211> 117
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Arg Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Tyr Asp Pro Met Glu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 90
<211> 351
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 90
caggtgcagc tggtgcagtc cggagctgag gtgaagaagc caggctccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagt cttccggcta caccttcaca aactattgga tgcactgggt gaggcaggct 120
ccaggacagg gactggagtg gatcggcgag atctacccta acaatggcag agtgaactac 180
aacgagaagt ttaagaaccg cgccaccctg acagtggaca tctctacctc cacagcttac 240
atggagctga gctctctgag aagcgaggat accgccgtgt actattgtgc taggtctcgg 300
tatgacccca tggaggattg gggccagggc accacagtga cagtgtccag c 351
<210> 91
<211> 106
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 91
Gln Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ile Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 92
<211> 318
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 92
caggtgcagc tgacccagtc tccttccagc ctgtccgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgct ccgcttcttc cagcgtgggc tacatgcact ggtatcagca gaagcccggc 120
aaggccccta agaggctgat ctacgataca tctaagctgg cttccggagt gccaagccgg 180
ttctctggct ccggcagcgg aaccgactac accctgacaa tctcttccct gcagccagag 240
gatttcgcca catatttttg tcagcagtgg agctctatcc ccctgacctt tggccagggc 300
acacgcctgg agatcaag 318
<210> 93
<211> 106
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 93
Gln Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ile Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 94
<211> 318
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 94
caggtgcagc tgacccagtc tccttccagc ctgtccgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgct ccgcttcttc cagcgtgggc tacatgcact ggtatcagca gaagcccggc 120
aaggccccta agaggtggat ctacgataca tctaagctgg cttccggagt gccaagccgg 180
ttctctggct ccggcagcgg aaccgactac accctgacaa tctcttccct gcagccagag 240
gatttcgcca catatttttg tcagcagtgg agctctatcc ccctgacctt tggccagggc 300
acacgcctgg agatcaag 318
<210> 95
<211> 106
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 95
Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ile Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 96
<211> 318
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 96
gaggtggtgc tgacccagtc cccagccaca ctgagcctgt ctccaggaga gagagccacc 60
ctgtcctgct ccgcctccag ctctgtgggc tacatgcact ggtatcagca gaagccagga 120
caggctccta ggcggtggat ctacgacacc tctaagctgg cttccggagt gccagctcgc 180
ttctctggct ccggcagcgg cacagactac accctgacaa tctccagcct ggagcctgag 240
gatgccgccg tgtacttctg tcagcagtgg tcttccatcc cactgacctt tggccagggc 300
acaaggctgg agatcaag 318
<210> 97
<211> 117
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Arg Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Val Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Tyr Asp Pro Met Glu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 98
<211> 351
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 98
caggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgcttc tgtgaaggtg 60
agctgcaaga gctccggcta cacctttacc aattattgga tgcactgggt gaggcaggct 120
cccggccagg gactggagtg gatgggcgag atatatccca atagcggccg ggtgaattat 180
aatgagaagt ttaagaatcg ggtgaccatg accgtggata tcagcatctc caccgcctac 240
atggagctga gcaggctgag gagcgatgac accgctgtgt actactgcgc taggtccagg 300
tatgacccca tggaggattg gggccagggc accaccgtga ccgtgagcag c 351
<210> 99
<211> 117
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 99
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Gln Gly Arg Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Val Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Tyr Asp Pro Met Glu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 100
<211> 351
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 100
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgcttc cgtgaaggtg 60
tcctgtaagt ccagcggcta taccttcacc aactattgga tgcactgggt gaggcaggcc 120
cctggccagg gactggagtg gatgggcgag atatatccta accagggccg ggtgaattat 180
aacgagaagt tcaagaatag ggtgaccatg accgtggaca tctccatcag caccgcttac 240
atggagctgt ccaggctgcg gagcgacgat accgccgtgt actactgtgc caggtcccgg 300
tatgatccca tggaggactg gggccagggc accaccgtga ccgtgagcag c 351
<210> 101
<211> 117
<212> PRT
<213> (Artificial Sequence)
<400> 101
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Ala Arg Val Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Val Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Tyr Asp Pro Met Glu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 102
<211> 351
<212> DNA
<213> (Artificial Sequence)
<400> 102
caggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgcttc tgtgaaggtg 60
tcctgtaaga gcagcggcta cacctttacc aattattgga tgcactgggt gaggcaggcc 120
cccggccagg gattggagtg gatgggcgag atatatccta acaatgccag ggtgaactat 180
aatgagaagt ttaagaaccg ggtgaccatg accgtggaca tcagcatctc caccgcctat 240
atggagctga gccggctgcg gtccgacgac accgctgtgt actactgcgc ccggtcccgg 300
tatgatccta tggaggactg gggccagggc accaccgtga ccgtgagctc c 351

Claims (30)

1.能够特异性结合TrkA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:16所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:17所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:18所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:40所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:42所示的VL CDR3。
2.能够特异性结合TrkA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区包含SEQ ID NO:54所示的重链可变区中含有的3个CDR，所述3个CDR为Kabat系统界定的CDR，其中，VH CDR1的序列为NYWMH，VH CDR2的序列为EIYPNNGRVNYNEKFKN，VH CDR3的序列为SRYDPMED；并且，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:62所示的轻链可变区中含有的3个CDR，所述3个CDR为Kabat系统界定的CDR，其中VL CDR1的序列为SASSSVGYMH，VL CDR2的序列为DTSKLAS，VL CDR3的序列为QQWSSIPLT；或者
所述重链可变区包含SEQ ID NO:54所示的重链可变区中含有的3个CDR，所述3个CDR为IMGT界定的CDR，其中，VH CDR1的序列为GYTFTNYW，VH CDR2的序列为IYPNNGRV，VH CDR3的序列为ARSRYDPMED；并且，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:62所示的轻链可变区中含有的3个CDR，所述3个CDR为IMGT界定的CDR，其中VL CDR1的序列为SSVGY，VL CDR2的序列为DT，VLCDR3的序列为QQWSSIPLT。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:54所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:62所示的序列的VL。
4.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，
所述抗体或其抗原结合片段进一步包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)；和
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)。
5.权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链恒定区是IgG重链恒定区。
6.权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链恒定区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。
7.权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
8.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，
所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv和双抗体(diabody)；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
9.权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述人源化抗体选自42F5-01、42F5-03、42F5-04、42F5-05、42F5-08、42F5-11、42F5-13、42F5-14或42F5-15；其中
人源化抗体42F5-01包含：如SEQ ID NO:81所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:83所示的轻链可变区；
人源化抗体42F5-03包含：如SEQ ID NO:85所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:87所示的轻链可变区；
人源化抗体42F5-04包含：如SEQ ID NO:89所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:87所示的轻链可变区；
人源化抗体42F5-05包含：如SEQ ID NO:81所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:91所示的轻链可变区；
人源化抗体42F5-08包含：如SEQ ID NO:89所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:93所示的轻链可变区；
人源化抗体42F5-11包含：如SEQ ID NO:85所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:95所示的轻链可变区；
人源化抗体42F5-13包含：如SEQ ID NO:97所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:83所示的轻链可变区；
人源化抗体42F5-14包含：如SEQ ID NO:99所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:83所示的轻链可变区；或
人源化抗体42F5-15包含：如SEQ ID NO:101所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:83所示的轻链可变区。
10.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，
所述抗体或其抗原结合片段带有标记。
11.权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。
12.权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述可检测的标记选自酶、放射性核素、发光物质或生物素。
13.权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述可检测的标记为荧光染料。
14.权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述酶为辣根过氧化物酶或所述发光物质为化学发光物质。
15.分离的核酸分子，其编码权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
16.载体，其包含权利要求15所述的分离的核酸分子。
17.根据权利要求16所述的载体，其中，所述载体为克隆载体或表达载体。
18.宿主细胞，其包含权利要求15所述的分离的核酸分子或权利要求16或17所述的载体。
19.制备权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求18所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
20.根据权利要求19所述的方法，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
21.根据权利要求19所述的方法，所述宿主细胞是人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞。
22.根据权利要求19所述的方法，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
23.双特异性或多特异性分子，其包含权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
24.根据权利要求23所述的双特异性或多特异性分子，其中，所述双特异性或多特异性分子特异性结合TrkA，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。
25.根据权利要求23所述的双特异性或多特异性分子，其中，所述双特异性或多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的分子。
26.根据权利要求25所述的双特异性或多特异性分子，其中，所述针对第二靶标的第二结合特异性的分子为第二抗体。
27.药物组合物，其含有权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求23至26中任一项所述的双特异性或多特异性分子，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
28.权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求23至26中任一项所述的双特异性或多特异性分子或权利要求27所述的药物组合物在制备用于治疗TrkA介导的疼痛的药物中的用途。
29.根据权利要求28所述的用途，其中，所述疼痛为慢性痛。
30.根据权利要求28所述的用途，其中，所述疼痛为炎症性疼痛、术后痛、神经病理痛或癌症疼痛。
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