TW201708257A

TW201708257A - Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體

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Publication number: TW201708257A
Application number: TW105124268A
Authority: TW
Inventors: 托拜耳斯瑞烏; 喬恩潘茲亞雷克; 克勞蒂亞布魯梅爾; 法蘭西斯卡波特; 克里斯多夫達霍夫; 派翠克霍夫曼; 伊麗莎貝斯那爾沃德
Original assignee: 安美基研究（慕尼黑）公司
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2017-03-01
Also published as: EP4219562A2; MX2018001159A; AU2016302580A1; PL3328891T3; SG10202000793XA; TWI829617B; IL256821B; JP2018527909A; BR112018001042A2; CO2018000882A2; JP2022062061A; SI3328891T1; CN109476735B; FI3328891T3; IL289894B; HUE061579T2; EP3328891A1; PH12018500157A1; MY193235A; EA201890337A8

Abstract

本發明係關於一種雙特異性抗體構築體，其包含結合於目標細胞表面上之人類FLT3的第一結合域及結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域。此外，本發明提供一種編碼該抗體構築體之聚核苷酸、包含該聚核苷酸之載體，及用該聚核苷酸或載體轉型或轉染之宿主細胞。此外，本發明提供一種用於產生本發明之抗體構築體的方法、該抗體構築體之醫療用途，及包含該抗體構築體之套組。

Description

FLT3及CD3抗體構築體

本發明係關於一種雙特異性抗體構築體，其包含結合於目標細胞表面上之人類FLT3的第一結合域及結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域。此外，本發明提供一種編碼該抗體構築體之聚核苷酸、包含該聚核苷酸之載體及用該聚核苷酸或載體轉型或轉染之宿主細胞。此外，本發明提供一種用於產生本發明之抗體構築體的方法、該抗體構築體之醫療用途及包含該抗體構築體之套組。

急性骨髓性白血病(AML)為非均質血液惡性病，其為成人中所診斷之急性白血病之最常見類型。AML佔所有白血病之大致三分之一，僅美國2013報導有估計14,500例新病例且總存活率不佳。在過去的30年，AML患者之照護標準極少改良。然而，分子及細胞生物學之近來發展已徹底改變吾人對正常及患病狀態下人類血細胞生成之理解。已鑑別涉及疾病發病機制之若干關鍵參與者且可作為可操作目標進行分析。一種在大致30%之AML中發生最常間突變之此類活化「驅動子」基因為FLT3 。

在20世紀90年代，亦稱為胎兒肝臟激酶2(FLK-2)、人類幹細胞激酶1(SCK-1)或分化簇抗原(CD135)之Fms樣酪胺酸激酶3(FLT3)為藉由兩個獨立基團選殖之造血受體酪胺酸激酶。位於人類中染色體13q12上之FLT3 基因編碼III類受體酪胺酸激酶蛋白，其與其他III類家族成員具有同源性，該等其他III類家族成員包括幹細胞因子受體(c- KIT)、巨噬細胞群落刺激因子受體(FMS)及血小板衍生生長因子受體(PDGFR)。

在與FLT3配位體結合時，FLT3受體經歷均二聚，由此使近膜域中之特異性酪胺酸殘基自體磷酸化且經由PI3K/Akt、MAPK及STAT5途徑進行下游活化。FLT3因此在控制增殖、存活期及正常造血細胞分化中起關鍵作用。

人類FLT3表現於CD34+CD38-造血幹細胞(HSC)以及樹枝狀前驅細胞子組中。FLT3表現亦可在多能祖細胞中偵測到，該等多能祖細胞如CD34+CD38+CD45RA-CD123^低常見骨髓祖細胞(CMP)、CD34+CD38+CD45RA+CD123^低顆粒球單核球祖細胞(GMP)及CD34+CD38+CD10+CD19-常見淋巴祖細胞(CLP)。有趣的是，在CD34+CD38-CD45RA-CD123-巨核細胞紅血球祖細胞(MEP)中FLT3表現幾乎不存在。因此FLT3表現主要限於在更成熟之單核細胞性譜系細胞中具有一些表現之早期骨髓及淋巴祖細胞。FLT3之此有限表現模式與FLT3配位體形成顯著對比，其表現於大部分造血組織及前列腺、腎臟、肺、結腸及心臟中。此等不同表現模式使得FLT3表現為確定FLT3信號傳導途徑之組織特異性之限速步驟。

AML中之最常見FLT3 突變為見於20%至38%細胞遺傳學正常AML患者中之FLT3內部串聯重複(FLT3-ITD)。FLT3-ITD在編碼序列之一部分近膜域複製且以頭到尾取向插入時形成。FLT3 突變已在表明對AML具有強疾病特異性的慢性淋巴白血病(CLL)、非霍奇金氏淋巴瘤及多發性骨髓瘤患者中鑑別出。突變型FLT3活化通常在所有FAB亞型上觀察到，然而患有FAB M5(單核細胞性白血病)之AML患者顯著增加，而FAB亞型M2及M6(顆粒球性或紅細胞系白血病)顯著極少與FLT3活化相關，符合FLT3之正常表現模式。

小百分比之AML患者(5-7%)在FLT3酪胺酸激酶域(FLT3 TKD)中最常在D835處或在一些情況下在T842或I836處存在單胺基酸突變，而甚至更少之患者(約1%)在涉及殘基579、590、591及594之FLT3近膜域中具有突變。FLT3-ITD 突變型AML患者患有侵襲形式之疾病，其特徵在於早期復發及低存活率，而總存活率及無事件存活率不顯著受FLT3-TKD 突變之存在影響。此外，具有FLT3-ITD 突變併發TET2 或DNMT3A 突變之AML患者，與具有野生型TET2 或DNMT3A 之FLT3-ITD 突變型AML患者相比具有不利總風險概況，從而強調AML之臨床及生物異質性。

FLT3-ITD與FLT3 TKD突變會誘導FLT3之配位體無關之活化，從而導致Ras/MAPK路徑及PI3K/Akt路徑之下游活化。然而，與任一突變有關之下游信號傳導路徑之不同之處主要在於較佳藉由FLT3-ITD活化STAT5，由此導致增殖潛能增加及DNA修復路徑調節異常。

與FLT3 突變狀態無關，在三分之二之AML患者中FLT3磷酸化明顯，且FLT3表現於>80%之AML胚細胞及約90%之所有AML患者中，從而使其成為大樣品量中與疾病發病機制有關之具有吸引力的治療目標。

若干小分子抑制劑已成為具有FLT3 突變之AML患者之具有吸引力的治療選項。第一代FLT3酪胺酸激酶抑制劑(TKI)之特徵在於缺乏選擇性、效力及不利藥物動力學特性。已開發出更新且更具選擇性之藥劑以對抗此問題；然而其功效受出現二級抗性限制。

若干早期FLT3 TKI尤其包括米哚妥林(midostaurin，PKC412)、來他替尼(lestaurtinib，CEP-701)、舒尼替尼(sunitinib，SUI1248)及索拉菲尼(sorafinib，BAY 43-9006)。復發性或難治性AML患者中在此等多重激酶目標藥劑下I期及II期之反應率受到限制，大概歸因於其不能在無劑量限制毒性下達成有效FLT3抑制。已開發喹雜替尼(Quizartinib，AC220)作為對FLT3野生型及FLT3-ITD具有高選擇性之第二代FLT3 TKI，且表明尤其在圍移植環境中在較年輕之患者組中有益。然而，在接受喹雜替尼之復發患者中鑑別出的FLT3 中之二級突變強調需要為AML患者開發較佳之治療策略，同時突出FLT3作為治療目標之有效性。

若干目標藥劑已在患有重新復發/難治癒或二級疾病之AML患者中進行測試。腫瘤抑制基因之表觀遺傳沉默在AML疾病發病機制中起至關重要之作用，且如阿紮胞苷(azacitadine)及地西他濱(decitabine)之DNA甲基轉移酶(DNMT)抑制劑已取得一些臨床上的成功。此外，AML患者子組中影響組蛋白翻譯後修飾(例如EZH2 及ASXL1 突變)或DNA甲基化(例如DNMT3A 、TET2 、IDH1/2 )之突變的近來鑑別已發展出多種治療選項，包括EZH2、DOT1L、IDH1/2抑制劑以及HDAC及蛋白酶體抑制劑。然而，AML細胞中許多此等化合物之臨床前研究表明此等抑制劑可改變造血分化之表現型及基因表現特徵，而不會導致AML胚細胞之直接細胞毒性。因此，仍然存在一種對鑑別新穎目標/模式之強未滿足之醫療需求以對抗AML且導致AML母細胞目標溶解。AML之其他治療性候選物包括奧洛拉激酶抑制劑(包括AMG 900)，及在細胞週期進程中起重要作用之polo樣激酶之抑制劑。

AML患者之照護標準仍對幹細胞移植(當可行時)具有化學治療作用。然而，大多數治療患者中復發/難治癒病例之出現准許了其他治療模式。若干白血病特異性抗原之鑑別及描述以及免疫介導之移植物抗白血病效應之更清晰理解已經為開發對抗血液惡性疾病之免疫調節策略鋪平了道路，如若干論文中所綜述。

吉妥珠單抗奧唑米星(Gemtuzumab ozogamicin，GO)為針對CD33之抗體-藥物結合物，一種隨處可見之骨髓細胞表面標記。GO在展示GO治療結果無改良之隨機分組試驗之後自市場撤回。然而，存在對重新評估AML中之GO的需要，且已起始若干試驗以徹底方式評估GO之功效及毒性。對抗AML之其他生物藥劑包括林妥珠單抗(lintuzumab，SGN-33)、呈未結合形式或與放射性鉍結合之人類化抗CD33單株抗體及SL-401，該SL-401包含與對抗IL-3受體之白喉毒素有效負載偶合之人類IL-3，該白喉毒素有效負載過度表現於大多數AML胚細胞中。靶向腫瘤相關抗原與效應子溶胞T細胞之下一代單株抗體包括AMG 330(靶向CD33之雙特異性T細胞接合分子或BiTE分子)及MGD006，該MGD006為一種結合於CD123及CD3之雙親和性再靶向分子。

近來在嵌合抗原受體T細胞在難治癒性CLL及急性淋巴母細胞白血病(ALL)中取得之成功為開發骨髓特異性CAR-T細胞，包括CD123 CAR-T及CD33 CAR-T治療鋪平了道路。已投入若干努力來產生樹突狀細胞疫苗以及與核查點阻斷抑制劑組合以便改良結果。

亦產生抗FLT3之治療性抗體。假定抗體治療在低二級抗性機制發生概率下更有效，因為抗體係針對FLT3之細胞外域，其與細胞內激酶域相比較不易於發生突變。Imclone抗體IMC-EB10在復發AML患者中在I期研究中進行評估，然而該研究因缺乏功效而終止(ClinicalTrials.gov識別碼：NCT00887926)。因此，仍迫切需要評估治療AML之包括雙特異性抗體之第二代單株抗體。

因為仍需要具有治療與FLT3表現相關之血液疾病之其他可用選項，故在此提供以具有針對腫瘤目標細胞表面上之FLT3的結合域及針對T細胞表面上之CD3的第二結合域之雙特異性抗體構築體形式解決此問題之方式及方法。

因此，在第一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗體構築體，其包含結合於目標細胞表面上之人類FLT3的第一結合域及結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域，其中該第一結合域結合於包含在如SEQ ID NO：801-804中所示之FLT3之胞外區內之FLT3之抗原決定基。

必須注意，如本文所用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數個提及物。因此，例如提及「一試劑」包括此類不同試劑中之一或多者，且提及「該方法」包括提及一般熟習此項技術者已知的可對本文所述之方法進行修改或取代的等效步驟及方法。

除非另外指示，否則在一系列要素之前的術語「至少」應理解為指系列中之每一要素。熟習此項技術者使用不超過常規實驗之途徑即可識別或能夠確定本文中所述之本發明的特定實施例的許多等效物。此類等效物意欲由本發明涵蓋。

每當在本文中使用時，術語「及/或」包括「及」、「或」及「由該術語連接之要素的所有或任何其他組合」之含義。

如本文中所用，術語「約(about)」或「大致(approximately)」意謂在既定值或範圍之±20%內、較佳±15%內、更佳±10%內且最佳±5%內。

在本說明書通篇及隨後申請專利範圍中，除非上下文另有要求，否則詞語「包含(comprise)」及諸如「包含(comprises)」及「包含(comprising)」之變化形式應理解為暗示包括所述整數或步驟或整數或步驟之群，但不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟之群。當在本文中使用時，術語「包含」可經術語「含有」或「包括」取代，或有時當在本文中使用時，經術語「具有」取代。

當在本文中使用時，「由……組成」排除所主張要素中未規定之任何要素、步驟或成分。當在本文中使用時，「基本上由……組成」不排除並不大體上影響技術方案之基本及新穎特徵之材料或步驟。

在本文各情況下，術語「包含」、「基本上由……組成」及「由……組成」中任一者可經其他兩個術語中之任一者替換。

術語「抗體構築體」係指如下分子，其中結構及/或功能基於抗體(例如全長或完整免疫球蛋白分子)之結構及/或功能。因此，抗體構築體能夠結合於其特異性目標或抗原。此外，本發明之抗體構築體包含抗體之允許目標結合之最小結構需要。此最小需要可例如藉由存在至少三個輕鏈CDR(亦即VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR(亦即VH區之CDR1、CDR2及CDR3)，較佳所有六個CDR定義。本發明之構築體所基於之抗體包括例如單株、重組、嵌合、去免疫、人類化及人類抗體。

包括駱駝抗體及藉由生物技術或蛋白工程改造方法或製程產生之其他免疫球蛋白抗體之全長或完整抗體在本發明之「抗體構築體」之定義內。此等全長抗體可為例如單株、重組、嵌合、去免疫、人類化及人類抗體。全長抗體之片段(諸如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab'、F(ab')2或「r IgG」(「半抗體」))亦在「抗體構築體」之定義內。本發明之抗體構築體亦可為抗體之經修飾片段，亦稱為抗體變異體，諸如scFv；di-scFv或bi(s)-scFv；scFv-Fc；scFv拉鏈；scFab；Fab2；Fab3；雙功能抗體；單鏈雙功能抗體；串聯雙功能抗體(Tandab)；串聯di-scFv；串聯tri-scFv；「微型抗體」，其由如下結構例示：(VH-VL-CH3)₂ 、(scFv-CH3)₂ 、((scFv)₂ -CH3+CH3)、((scFv)₂ -CH3)或(scFv-CH3-scFv)₂ ；多功能抗體，諸如三功能抗體或四功能抗體；及單域抗體，諸如奈米抗體；或僅包含一個可變域(其可為VHH、VH或VL)之獨立於其他V區或域特異性結合抗原或抗原決定基的單可變域抗體。

結合域通常可包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)；然而，其並不必須包含兩者。Fd片段例如具有兩個VH區且常常保留完整抗原結合域之一些抗原結合功能。抗體片段、抗體變異體或結合域之格式之其他實例包括(1)Fab片段，其為具有VL、VH、CL及CH1域之單價片段；(2)F(ab')2片段，其為具有兩個由二硫橋鍵在鉸鏈區連接之Fab片段之二價片段；(3)Fd片段，其具有兩個VH及CH1域；(4)Fv片段，其具有抗體之單個臂之VL及VH域；(5)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341：544-546)，其具有VH域；(6)分離之互補決定區(CDR)及(7)單鏈Fv(scFv)，後者為較佳的(例如源自scFV庫)。本發明之抗體構築體之實施例之實例(例如)描述於WO 00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、WO 2014/144722、WO 2014/151910及WO 2015/048272中。

此外，術語「抗體構築體」之定義包括單價、二價及多價(polyvalent/multivalent)構築體，且因此包括特異性結合於僅一種抗原結構之單特異性構築體以及經由不同結合域特異性結合超過一種抗原結構(例如兩種、三種或三種以上)之雙特異性及多特異性(polyspecific/multispecific)構築體。此外，術語「抗體構築體」之定義包括由僅一個多肽鏈組成之分子以及由超過一個多肽鏈組成之分子，該等鏈可相同(均二聚體、均三聚體或均寡聚物)或不同(雜二聚體、雜三聚體或雜寡聚物)。以上鑑別之抗體及其變異體或衍生物之實例尤其描述於Harlow及Lane,Antibodies a laboratory manual,CSHL Press(1988)；及Using Antibodies：a laboratory manual,CSHL Press(1999)；Kontermann及Dübel,Antibody Engineering,Springer，第2版，2010；及Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Cambridge University Press 2009中。

本發明之抗體構築體較佳為「活體外產生之抗體構築體」。此術語係指根據上述定義之抗體構築體，其中所有或一部分可變區(例如至少一個CDR)在非免疫細胞選擇，例如活體外噬菌體呈現、蛋白晶片或可測試候選序列結合至抗原之能力的任何其他方法中產生。因此，此術語較佳排除僅藉由在動物中在免疫細胞中進行基因組重排產生的序列。「重組抗體」為經由使用重組DNA技術或遺傳工程改造製備之抗體。

如本文所用，術語「單株抗體」(mAb)或單株抗體構築體係指獲自大體上同種抗體之群的抗體，亦即構成該群之個別抗體除可少量存在之可能天然存在之突變及/或轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)以外為相同的。與通常包括針對不同決定子(或抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑相比，單株抗體對抗原上之單一抗原位點或決定子具有高度特異性。除其特異性之外，單株抗體之有利之處在於其藉由融合瘤培養合成，因此未受其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體之特徵為自大體上同種之抗體群體獲得，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。

為製備單株抗體，可使用提供藉由連續細胞株培養物製備之抗體的任何技術。舉例而言，欲使用之單株抗體可藉由首先由Kohler等人，Nature,256：495(1975)描述之融合瘤方法製得或可藉由重組DNA方法(參見例如美國專利第4816567號)製得。製備人類單株抗體之其他技術的實例包括三源雜交瘤技術、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor,Immunology Today 4(1983),72)及EBV融合瘤技術(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96)。

融合瘤可隨後使用標準方法篩選，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)及表面電漿子共振(BIACORE^TM )分析，以鑑別一或多個產生與特定抗原特異性結合之抗體的融合瘤。相關抗原之任何形式可用作免疫原，例如重組抗原、天然存在形式、其任何變異體或片段以及其抗原肽。如BIAcore系統中所採用之表面電漿子共振可用於增加結合於目標抗原之抗原決定基(諸如FLT3或CD3ε)的噬菌體抗體的功效(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。

製備單株抗體之另一例示性方法包括篩選蛋白表現庫，例如噬菌體呈現或核糖體呈現庫。噬菌體呈現例如描述於Ladner等人，美國專利第5,223,409號；Smith(1985)Science 228：1315-1317，Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)中。

除使用呈現庫以外，可使用相關抗原使非人類動物(例如嚙齒動物(諸如小鼠、倉鼠、兔或大鼠))免疫。在一個實施例中，非人類動物包括人類免疫球蛋白基因之至少一部分。舉例而言，可用人類Ig(免疫球蛋白)基因座之大片段工程改造小鼠抗體產生缺陷型小鼠品系。使用融合瘤技術，可製造及選擇來源於具有所需特異性之基因的抗原特異性單株抗體。參見例如XENOMOUSE^TM ,Green等人(1994)Nature Genetics 7：13-21，US 2003-0070185、WO 96/34096及WO 96/33735。

單株抗體亦可獲自非人類動物，且接著使用此項技術中已知之重組DNA技術修飾，例如人類化、去免疫、使其嵌合等。經修飾之抗體構築體的實例包括非人類抗體之人類化變異體、「親和力成熟」抗體(參見例如Hawkins等人，J.Mol.Biol.254,889-896(1992)及Lowman等人，Biochemistry 30,10832-10837(1991))及具有改變之效應功能的抗體突變體(參見例如美國專利5,648,260；Kontermann及D ü bel(2010)，上述引文及Little(2009)，上述引文)。

在免疫學中，親和力成熟為如下方法，藉由該方法在免疫反應過程期間B細胞產生對抗原具有增加之親和力的抗體。在重複暴露於相同抗原下，宿主將產生具有相繼增大之親和力的抗體。如天然原型，活體外親和力成熟基於突變及選擇之原理。活體外親和力成熟已成功地用於最佳化抗體、抗體構築體及抗體片段。CDR內部之無規突變使用射線、化學誘變劑或易錯PCR引入。另外，遺傳多樣性可藉由鏈改組而增加。使用呈現方法(如噬菌體呈現)之兩或三輪突變及選擇通常產生親和力在低奈莫耳範圍內之抗體片段。

抗體構築體之胺基酸取代變異之較佳類型涉及取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選擇用於進一步研究之所得變異體應相對於產生其之親本抗體具有經改良之生物特性。產生此類取代變異體之適宜方式涉及使用噬菌體呈現之親和力成熟。簡言之，使若干高變區位點(例如6-7個位點)突變以在各位點產生所有可能之胺基酸取代。因此產生之抗體變異體以單價方式自絲狀噬菌體粒子以與包裝在各粒子內之M13的基因III產物的融合物形式呈現。隨後如本文所揭示將噬菌體呈現之變異體針對其生物活性(例如結合親和力)進行篩選。為鑑別用於修飾之候選高變區位點，可進行丙胺酸掃描突變誘發以鑑別顯著有助於抗原結合之高變區殘基。或者或另外，分析抗原-抗體複合物的晶體結構以鑑別在結合域與例如人類FLT3之間的接觸點可為有益的。此類接觸殘基及相鄰殘基為根據本文中詳述之技術用於取代的候選物。在產生此等變異體後，如本文所述對變異體組進行篩選，且可在一或多個相關分析中選擇具有優良特性之抗體用於進一步研究。

本發明之單株抗體及抗體構築體尤其包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中的相應序列以及此類抗體之片段(只要其展現所需生物活性即可)一致或同源(美國專利第 4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))。本文中所關注之嵌合抗體包括「靈長類化」抗體，其包含衍生自非人類靈長類動物(例如，舊世界猴、猿等)之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列。已描述多種製備嵌合抗體之方法。參見例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.81：6851,1985；Takeda等人，Nature 314：452,1985；Cabilly等人，美國專利第4,816,567號；Boss等人，美國專利第4,816,397號；Tanaguchi等人，EP 0171496；EP 0173494；及GB 2177096。

抗體、抗體構築體、抗體片段或抗體變異體亦可藉由例如WO 98/52976或WO 00/34317中所揭示方法藉由特定缺失人類T細胞抗原決定基(稱為「去免疫」之方法)來修飾。簡言之，針對結合於MHC II類之肽分析抗體之重鏈及輕鏈可變域；此等肽表示可能之T細胞抗原決定基(如WO 98/52976及WO 00/34317所定義)。為偵測可能之T細胞抗原決定基，可施用稱為「肽穿線」之電腦模型化法，且另外，可搜索人類MHC II類結合肽之資料庫中的VH及VL序列中所存在之基元，如WO 98/52976及WO 00/34317中所述。此等基元結合於18種主要MHC II類DR異型中之任一者，因此構成可能之T細胞抗原決定基。所偵測之潛在T細胞抗原決定基可藉由取代可變域中之少數胺基酸殘基或較佳藉由單一胺基酸取代基來消除。通常，進行保守取代。常常但非排他地，可使用對人類生殖系抗體序列中之位置常見的胺基酸。人類生殖系序列揭示例如於Tomlinson等人，(1992)J.MoI.Biol.227：776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today第16(5)卷：237-242；及Tomlinson等人(1995)EMBO J.14：14：4628-4638。V BASE目錄提供人類免疫球蛋白可變區序列之綜合目錄(由Tomlinson,LA.等人，MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK彙編)。此等序列可用作人類序列之來源，例如用於構架區及CDR。亦可使用共同人類構架區，例如如美國專利第6,300,064號中所述。

「人類化」抗體、抗體構築體、其變異體或片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)為大部分人類序列之抗體或免疫球蛋白，其含有源自非人類免疫球蛋白之極小序列。在極大程度上，人類化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之高變區(亦為CDR)之殘基經來自非人類(例如嚙齒動物)物種(供體抗體)(諸如具有所要特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠、倉鼠或兔)的高變區之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基置換為相應非人類殘基。此外，如本文中所用之「人類化抗體」亦可包含未在受體抗體抑或供體抗體中發現之殘基。進行此等修飾以進一步優化且最大化抗體效能。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分、通常人類免疫球蛋白之恆定區的至少一部分。對於進一步細節，參見Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature,332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596(1992)。

人類化抗體或其片段可藉由用人類Fv可變域之等效序列置換不直接參與抗原結合之Fv可變域之序列產生。產生人類化抗體或其片段之例示性方法由以下文獻提供：Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等人，(1986)BioTechniques 4：214；及US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；及US 6,407,213。彼等方法包括分離、操控及表現編碼來自重鏈或輕鏈中之至少一者的免疫球蛋白Fv可變域之全部或一部分的核酸序列。此類核酸可獲自產生針對上述預定目標之抗體的融合瘤以及來自其他來源。可接著將編碼人類化抗體分子之重組DNA選殖至適當表現載體中。

人類化抗體亦可使用表現人類重鏈及輕鏈基因但不能表現內源小鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因之轉殖基因動物(諸如小鼠)產生。 Winter描述可用於製備本文所述之人類化抗體的例示性CDR移植法(美國專利第5,225,539號)。特定人類抗體之全部CDR可用非人類CDR之至少一部分置換，或僅一些CDR可用非人類CDR置換。僅需要置換人類化抗體結合於預定抗原所需數目的CDR。

人類化抗體可藉由引入保守取代、共同序列取代、生殖系取代及/或回復突變最佳化。此類經改變之免疫球蛋白分子可藉由此項技術中已知之數種技術中之任一者製備(例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80：7308-7312,1983；Kozbor等人，Immunology Today,4：7279,1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.,92：3-16,1982及EP 239 400)。

術語「人類抗體」、「人類抗體構築體」及「人類結合域」包括具有大體上對應於此項技術中已知之人類生殖系免疫球蛋白序列之抗體區(諸如可變及恆定區或域)之抗體、抗體構築體及結合域，包括例如Kabat等人，(1991)(上述引文)所述者。本發明之人類抗體、抗體構築體或結合域可例如在CDR及尤其在CDR3中包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入的突變)。人類抗體、抗體構築體或結合域可有至少一個、兩個、三個、四個、五個或五個以上位置經不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基置換。如本文所用之人類抗體、抗體構築體及結合域之定義亦涵蓋全人類抗體，其僅包括抗體之非人造及/或遺傳改變之人類序列，其可藉由使用諸如Xenomouse之技術或系統獲得。

在一些實施例中，本發明之抗體構築體為「經分離」或「大體上純」的抗體構築體。「經分離」或「大體上純」在用於描述本文所揭示之抗體構築體時意謂抗體構築體已自其製備環境之組分鑑別、分離及/或回收。抗體構築體較佳不或大體上不與來自其製備環境的所有其他組分締合。其製備環境之污染物組分(諸如由經重組轉染細胞產生的污染物組分)為通常干擾多肽之診斷性或治療性用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。抗體構築體可例如構成既定樣品中總蛋白質之至少約5重量%或至少約50重量%。應瞭解，經分離蛋白可視情況而定佔總蛋白含量之5重量%至99.9重量%。多肽可經由使用誘導性啟動子或高表現啟動子以顯著較高濃度製備，以使得其以增加之濃度水準製備。定義包括在此項技術中已知之多種生物體及/或宿主細胞中製備抗體構築體。在較佳實施例中，抗體構築體(1)藉由使用轉杯式測序儀純化至一定程度以足以獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基，或(2)藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色純化至均質。通常，然而，經分離抗體構築體藉由至少一個純化步驟製備。

根據本發明，術語「結合域」特徵在於(特異性)結合於目標分子(抗原)上之既定標目標原決定基或既定目標位點(此處：分別FLT3及CD3)/與其相互作用/識別其的域。第一結合域(識別FLT3)之結構及功能及亦較佳第二結合域(識別CD3)之結構及/或功能基於抗體，例如全長或完整免疫球蛋白分子之結構及/或功能。根據本發明，第一結合域之特徵在於存在三個輕鏈CDR(亦即VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR(亦即VH區之CDR1、CDR2及CDR3)。第二結合域較佳亦包含抗體之允許目標結合之最小結構需要。更佳地，第二結合域包含至少三個輕鏈CDR(亦即VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR(亦即VH區之CDR1、CDR2及CDR3)。據設想，第一及/或第二結合域藉由噬菌體呈現或文庫篩選方法產生或獲得而非藉由將來自預先存在之(單株)抗體之CDR序列移植於骨架中產生或獲得。

根據本發明，結合域呈一或多種多肽形式。此類多肽可包括蛋白質部分及非蛋白質部分(例如化學連接子或化學交聯劑，諸如戊二醛)。蛋白(包括其片段，較佳生物活性片段及肽，通常具有少於30個胺基酸)包含兩個或兩個以上經由共價肽鍵彼此偶合之胺基酸(得到胺基酸之鏈)。如本文所用之術語「多肽」描述分子之群，其通常由超過30個胺基酸組成。多肽可進一步形成多聚體，諸如二聚體、三聚體以及更高級寡聚物，亦即由超過一個多肽分子組成。形成此類二聚體、三聚體等之多肽分子可相同或不相同。此類多聚體之相應高級結構因此稱為均二聚體或雜二聚體、均三聚體或雜三聚體等。雜多聚體之一實例為抗體分子，其在其天然存在之形式下由兩個相同多肽輕鏈及兩個相同多肽重鏈組成。術語「肽」、「多肽」及「蛋白」亦指經天然修飾之肽/多肽/蛋白，其中修飾例如藉由轉譯後修飾(如糖基化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾)進行。「肽」、「多肽」或「蛋白」在本文提及時亦可經化學修飾，諸如聚乙二醇化。此類修飾在此項技術中為吾人所熟知且描述於下文中。

結合於FLT3之結合域及/或結合於CD3之結合域較佳為人類結合域。包含至少一個人類結合域之抗體及抗體構築體避免一些與具有非人類(諸如嚙齒動物，例如鼠類、大鼠、倉鼠或兔)可變及/或恆定區之抗體或抗體構築體有關的問題。此類源自嚙齒動物之蛋白的存在可引起抗體或抗體構築體之快速清除或可引起患者針對抗體或抗體構築體產生免疫反應。為避免使用源自嚙齒動物之抗體或抗體構築體，人類或全人類抗體/抗體構築體可經由向嚙齒動物中引入人類抗體功能以使得嚙齒動物產生全人類抗體來產生。

在YAC中選殖及重建構兆鹼基大小之人類基因座且將其引入小鼠生殖系中的能力提供一種闡明極大或粗略定位之基因座之功能組分以及產生人類疾病之適用模型的有力方法。此外，使用此類技術用人類等效物取代小鼠基因座可對開發期間人類基因產物之表現及調節、其與其他系統之聯繫及其參與疾病誘發及進展提供獨特洞察力。

此類策略之重要實際應用為小鼠體液免疫系統之「人類化」。將人類免疫球蛋白(Ig)基因座引入內源Ig基因已失活之小鼠提供研究抗體之程式化表現及組裝以及其在B細胞發育中之作用的潛在機制的機會。此外，此類策略可提供產生全人類單株抗體(mAb)的理想來源，其為朝向實現人類疾病之抗體療法之前景的重要里程碑。全人類抗體或抗體構築體預期使小鼠mAb或衍生自小鼠之mAb固有的免疫原性及過敏反應達最小，因此提高所投與抗體/抗體構築體之功效及安全性。使用全人類抗體或抗體構築體可預期在治療需要重複化合物投藥之慢性及復發性人類疾病(諸如發炎、自體免疫及癌症)中提供實質性優點。

朝向此目標之一種方法為用人類Ig基因座之大片段工程改造小鼠抗體產生缺陷型小鼠品系以預測此類小鼠將在小鼠抗體不存在下產生大譜系之人類抗體。大人類Ig片段將保持大可變基因多樣性以及適當調節抗體產生及表現。藉由採用小鼠機構進行抗體多樣化及選擇及對人類蛋白之缺乏免疫耐受性，此等小鼠品系中再產生之人類抗體譜系應針對任何相關抗原(包括人類抗原)產生高親和力抗體。使用融合瘤技術，具有所需特異性之抗原特異性人類mAb可容易地產生且選擇。此通用策略結合第一XenoMouse小鼠品系的產生加以展現(參見Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994))。用分別含有人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座之245kb及190kb大小之生殖系構形片段的酵母人造染色體(YAC)工程改造XenoMouse品系，該等染色體含有核心可變及恆定區序列。含人類Ig之YAC據證明與小鼠系統相容以用於抗體重排與表現且能夠取代不活化之小鼠Ig基因。此藉由其誘導B細胞發育、產生全人類抗體之成人樣人類譜系及產生抗原特異性人類mAb之能力展現。此等結果亦表明引入含有較大量V基因之人類Ig基因座之較大部分、其他調節元件及人類Ig恆定區可大體上再現特徵為對感染及免疫之人類體液反應的完整譜系。Green等人之研究近年來延伸至經由分別引入人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座之兆鹼基大小之生殖系構型YAC片段來引入大於約80%人類抗體譜系。參見Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)及美國專利申請案第08/759,620號。

產生XenoMouse小鼠進一步論述且描繪於美國專利申請案第07/466,008號、第07/610,515號、第07/919,297號、第07/922,649號、第08/031,801號、第08/112,848號、第08/234,145號、第08/376,279號、第08/430,938號、第08/464,584號、第08/464,582號、第08/463,191號、第08/462,837號、第08/486,853號、第08/486,857號、第08/486,859號、第08/462,513號、第08/724,752號及第08/759,620號；及美國專利第6,162,963號；第6,150,584號；第6,114,598號；第6,075,181號及第5,939,598號及日本專利第3 068 180 B2號、第3 068 506 B2號及第3 068 507 B2號中。亦參見Mendez等人Nature Genetics 15：146-156(1997)及Green及Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)；EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310及WO 03/47336。

在替代方法中，包括GenPharm International,Inc.之其他人已採用「微型基因座」方法。在微型基因座方法中，經由包括來自Ig基因座之碎片(個別基因)來模擬外源Ig基因座。因此，一或多個VH基因、一或多個DH基因、一或多個JH基因、μ恆定區及第二恆定區(較佳為γ恆定區)形成用於插入動物中之構築體。此方法描述於Surani等人之美國專利第5,545,807號及各為Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號；第5,625,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,661,016號；第5,770,429號；第5,789,650號；第5,814,318號；第5,877,397號；第5,874,299號及第6,255,458號，Krimpenfort及Berns之美國專利第5,591,669號及第6,023.010號；Berns等人之美國專利第5,612,205號；第5,721,367號及第5,789,215號；及Choi及Dunn之美國專利第5,643,763號；及GenPharm國際美國專利申請案第07/574,748號、第07/575,962號、第07/810,279號、第07/853,408號、第07/904,068號、第07/990,860號、第08/053,131號、第08/096,762號、第08/155,301號、第08/161,739號、第08/165,699號、第08/209,741號。亦參見EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852及WO 98/24884及美國專利第5,981,175號。進一步參見Taylor等人(1992)；Chen等人(1993)；Tuaillon等人(1993)；Choi等人(1993)；Lonberg等人(1994)；Taylor等人(1994)及Tuaillon等人(1995)；Fishwild等人(1996)。

Kirin亦已證明由小鼠產生人類抗體，其中經由微細胞融合將染色體之大碎片或完整染色體引入。參見歐洲專利申請案第773 288號及第843 961號。Xenerex Biosciences正在研發可能產生人類抗體的技術。在此技術中，SCID小鼠用人類淋巴細胞(例如B細胞及/或T細胞)復原。隨後用抗原使小鼠免疫且該等小鼠可產生針對該抗原之免疫反應。參見美國專利第5,476,996號；第5,698,767號及第5,958,765號。

人類抗小鼠抗體(HAMA)反應已引導行業製備嵌合或其他人類化抗體。然而，預期將觀察到某些人類抗嵌合抗體(HACA)反應，尤其在抗體之長期或多劑量利用中。因此，需要提供包含針對FLT3之人類結合域及針對CD3之人類結合域的抗體構築體，以消除HAMA或HACA反應的問題及/或效應。

術語「(特異性)結合於」、「(特異性)識別」、「(特異性)針對」及「(特異性)反應」根據本發明意謂與目標分子(抗原)(此處：分別FLT3及CD3)上之既定抗原決定基或既定目標部位結合域相互作用或特異性相互作用。

術語「抗原決定基」係指結合域(諸如抗體或免疫球蛋白)或抗體或免疫球蛋白之衍生物、片段或變異體所特異性結合之抗原上之位點。「抗原決定基」為抗原，因此術語抗原決定基有時在本文中亦稱為「抗原結構」或「抗原決定子」。因此，結合域為「抗原相互作用位點」。該結合/相互作用亦理解為定義「特異性識別」。

「抗原決定基」可由藉由蛋白之三級摺疊並列之鄰接胺基酸或非鄰接胺基酸形成。「線性抗原決定基」為胺基酸一級序列包含識別之抗原決定基的抗原決定基。線性抗原決定基在獨特序列中通常包括至少3個或至少4個、且更通常至少5個或至少6個或至少7個、例如約8至約10個或10個以上胺基酸。

與線性抗原決定基相比，「構形抗原決定基」為如下抗原決定基，其中構成抗原決定基之胺基酸的一級序列並非所識別抗原決定基之唯一指定組分(例如抗原決定基，其中胺基酸之一級序列並非必須由結合域識別)。通常，構形抗原決定基相對於線性抗原決定基包含增加數目之胺基酸。關於識別構形抗原決定基，結合域識別抗原、較佳肽或蛋白或其片段之三維結構(在本發明之上下文中，針對結合域中之一者的抗原結構包含在FLT3蛋白內)。舉例而言，當蛋白分子摺疊以形成三維結構時，形成構形抗原決定基之某些胺基酸及/或多肽主鏈變得毗鄰，使抗體能夠識別抗原決定基。確定抗原決定基之構形的方法包括(但不限於)x射線結晶學、二維核磁共振(2D-NMR)光譜法及定點旋轉標記及電子順磁共振(EPR)光譜法。

下文描述一種抗原決定基定位方法：當人類FLT3蛋白中之區(鄰接胺基酸鏈段)用非人類及非靈長類動物FLT3抗原(例如小鼠FLT3，但亦可設想如雞、大鼠、倉鼠、兔等之其他動物)之其相對應區交換/替換時，預期會出現結合域之結合降低，除非結合域對於所用非人類非靈長類動物FLT3具有交叉反應。與結合於人類FLT3蛋白中之相應區相比，該減小較佳為至少10%、20%、30%、40%或50%；更佳為至少60%、70%或80%，且最佳90%、95%或甚至100%，由此結合於人類FLT3蛋白中之相應區設定為100%。據設想，上述人類FLT3/非人類FLT3嵌合體表現於CHO細胞中。亦設想，人類FLT3/非人類FLT3嵌合體與不同膜結合蛋白(諸如EpCAM)之跨膜域及/或細胞質域融合，參見實例1及2。

在抗原決定基定位之替代或其他方法中，可產生若干截短形式之人類FLT3細胞外域以確定藉由結合域識別之特異性區。在此等截短形式中，以N端起始，逐步刪除不同細胞外FLT3域/子域或區。本發明之上下文中產生且使用之截短FLT3形式已被描述，並設想截短FLT3形式可表現於CHO細胞中。亦設想，截短FLT3形式可與不同膜結合蛋白質(諸如EpCAM)之跨膜域及/或細胞質域融合。亦設想，截短FLT3形式可涵蓋其N端之信號肽域，例如源自小鼠IgG重鏈信號肽之信號肽。此外設想，截短FLT3形式可涵蓋其N端之v5域(在信號肽之後)，其使得檢驗細胞表面上之其恰當表現。預期在彼等截短FLT3形式下會出現結合之減小或缺失，該等形式不再涵蓋藉由結合域識別之FLT3區。結合減小較佳為至少10%、20%、30%、40%、50%；更佳為至少60%、70%、80%，且最佳90%、95%或甚至100%，由此結合於整個人類FLT3蛋白(或其胞外區或域)設定為為100%，參見實例3。

測定目標抗原之特定殘基對藉由抗體構築體或結合域識別之貢獻的另一方法為丙胺酸掃描(參見例如Morrison KL及Weiss GA.Cur Opin Chem Biol.2001年6月；5(3)：302-7)，其中每一待分析之殘基例如經由定點突變誘發經丙胺酸置換。丙胺酸由於其非龐大的化學上惰性甲基官能基而使用，儘管如此，仍模擬許多其他胺基酸具有的二級結構參考物。有時，諸如纈胺酸或白胺酸之龐大胺基酸可用於需要保留突變殘基大小的情況。丙胺酸掃描為已使用一段較長時間的成熟技術。

結合域與抗原決定基或包含抗原決定基之區之間的相互作用暗示結合域對特定蛋白或抗原(此處：分別為FLT3及CD3)上之抗原決定基/包含抗原決定基之區展現可觀親和力，且通常不與除FLT3或CD3外之蛋白或抗原展現顯著反應性。「可觀親和力」包括以約10^-6 M(KD)或更強之親和力結合。較佳地，當結合親和力為約10^-12 M至10^-8 M、10^-12 M至10^-9 M、10^-12 M至10^-10 M、10^-11 M至10^-8 M、較佳約10^-11 M至10^-9 M時，結合被視為特異的。結合域是否與目標特異性反應或特異性結合於目標可尤其易於藉由比較該結合域與目標蛋白或抗原的反應與該結合域與除FLT3或CD3外之蛋白或抗原的反應來測試。較佳地，本發明之結合域基本上或大體上不結合於除FLT3或CD3外之蛋白或抗原(亦即第一結合域不能夠結合於除FLT3外之蛋白且第二結合域不能夠結合於除CD3外之蛋白)。

術語「基本上/大體上不結合」或「不能夠結合」意謂本發明之結合域不結合除FLT3或CD3外之蛋白或抗原，亦即展示與除FLT3或CD3外之蛋白或抗原不超過30%、較佳不超過20%、更佳不超過10%、尤其較佳不超過9%、8%、7%、6%或5%的反應性，從而分別結合於FLT3或CD3設定為100%。

特異性結合被認為由結合域之胺基酸序列中的特異性基元及抗原實現。因此，結合藉由其一級、二級及/或三級結構以及該等結構之二級修飾達成。抗原-相互作用-位點與其特異性抗原之特異性相互作用可使該位點與抗原簡單結合。此外，抗原相互作用位點與其特異性抗原之特異性相互作用可替代地或另外地例如由於誘導抗原之構形變化、抗原之寡聚等引發信號。

在另一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗體構築體，其包含結合於目標細胞表面上之人類FLT3的第一結合域及結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域，其中該第一結合域結合於包含在如SEQ ID NO：814(團簇1)或SEQ ID NO：816(團簇3)中所示之人類FLT3區內之FLT3之抗原決定基。

本發明之雙特異性抗體構築體之第一結合域較佳包含有包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH區及包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL區，其選自由以下組成之群：SEQ ID NO：151-156、SEQ ID NO：161-166、SEQ ID NO：171-176、SEQ ID NO：181-186、SEQ ID NO：191-196、SEQ ID NO：201-206、SEQ ID NO：211-216、SEQ ID NO：221-226、SEQ ID NO：231-236、SEQ ID NO：241-246、SEQ ID NO：251-256、SEQ ID NO：261-266、SEQ ID NO：271-276、SEQ ID NO：281-286、SEQ ID NO：291-296、SEQ ID NO：301-306、SEQ ID NO：311-316、SEQ ID NO：321-326、SEQ ID NO：331-336、SEQ ID NO：341-346、SEQ ID NO：351-356、SEQ ID NO：361-366、SEQ ID NO：371-376、SEQ ID NO：381-386、SEQ ID NO：391-396、SEQ ID NO：401-406、SEQ ID NO：411-416、SEQ ID NO：421-426、SEQ ID NO：431-436、SEQ ID NO：441-446、SEQ ID NO：451-456、SEQ ID NO：461-466、SEQ ID NO：471-476、SEQ ID NO：481-486、SEQ ID NO：491-496、SEQ ID NO：501-506、SEQ ID NO：511-516、SEQ ID NO：521-526、SEQ ID NO：531-536、SEQ ID NO：541-546、SEQ ID NO：551-556、SEQ ID NO：561-566、SEQ ID NO：571-576、SEQ ID NO：581-586、SEQ ID NO：591-596、SEQ ID NO：601-606、SEQ ID NO：611-616、SEQ ID NO：621-626、SEQ ID NO：631-636、SEQ ID NO：641-646、SEQ ID NO：651-656、SEQ ID NO：661-666、SEQ ID NO：671-676、SEQ ID NO：681-686、SEQ ID NO：691-696、SEQ ID NO：701-706、SEQ ID NO：711- 716、SEQ ID NO：721-726、SEQ ID NO：731-736、SEQ ID NO：741-746、SEQ ID NO：751-756、SEQ ID NO：761-766、SEQ ID NO：771-776、SEQ ID NO：781-786、SEQ ID NO：791-796。

術語「可變」係指抗體或免疫球蛋白域之部分，其序列展現變化性且其參與確定特定抗體之特異性及結合親和力(亦即「可變域」)。可變重鏈(VH)與可變輕鏈(VL)一起配對形成單一抗原結合位點。

可變性並不均勻分佈於抗體之整個可變域中；其集中於各重鏈及輕鏈可變區之子域中。此等子域稱為「高變區」或「互補決定區」(CDR)。可變域之更保存(亦即非高變)部分稱為「構架」區(FRM或FR)且在三維空間中為六個CDR提供骨架以形成抗原結合表面。天然存在之重鏈及輕鏈的可變域各包含四個FRM區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其主要採用β片構型，藉由三個高變區連接，從而形成連接β片結構且在一些情形下形成β片結構之一部分的環。各鏈中之高變區藉由FRM與另一鏈之高變區緊密結合在一起，促成抗原結合位點之形成(參見Kabat等人，上述引文)。

術語「CDR」及其複數「CDRs」係指互補決定區，其中三者構成輕鏈可變區之結合特徵(CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)，且三者構成重鏈可變區之結合特徵(CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)。CDR含有負責抗體與抗原之特異性相互作用之殘基中的大多數，因此促成抗體分子之功能活性：其為抗原特異性之主要決定因素。

使精確界定的CDR界限及長度經歷不同分類及編號系統。CDR可因此藉由Kabat、Chothia、觸點或任何其他邊界定義(包括本文所述之編號系統)提及。儘管邊界不同，但各此等系統在什麼構成可變序列內之所謂「高變區」方面具有一些程度之重疊。因此，根據此等系統之CDR定義的長度及相對於相鄰構架區之界限區域可不同。參見例如 Kabat(基於跨物種序列可變性之方法)、Chothia(基於抗原-抗體複合物之結晶學研究的方法)及/或MacCallum(Kabat等人，上述引文；Chothia等人，J.Mol.Biol,1987,196：901-917；及MacCallum等人，J.Mol.Biol,1996,262：732)。表徵抗原結合位點之另一標準為由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用之AbM定義。參見例如Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.In：Antibody Engineering Lab Manual(Duebel,S.及Kontermann,R.編，Springer-Verlag,Heidelberg)。在兩種殘基鑑別技術界定重疊區但非相同區之程度上，其可組合以界定雜交CDR。然而，根據所謂Kabat系統編號為較佳。

通常，CDR形成可歸類為標準結構的環形結構。術語「典型結構」係指由抗原結合(CDR)環採用之主鏈構形。由比較結構研究發現六個抗原結合環中有五個僅具有有限譜系之可用構形。各標準結構之特徵可為多肽主鏈之扭轉角。因此，抗體之間的相應環可具有極類似三維結構，但環之大多數部分中具有高胺基酸序列可變性(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.,1987,196：901；Chothia等人，Nature,1989,342：877；Martin及Thornton,J.Mol.Biol,1996,263：800)。此外，在所採用之環形結構與其周圍之胺基酸序列之間存在關係。特定典型類別之構形由環之長度及位於環內以及保守構架(亦即環外)內關鍵位置處之胺基酸殘基決定。可因此基於此等關鍵胺基酸殘基之存在進行分配至特定典型類別。

術語「典型結構」亦可包括關於例如Kabat(Kabat等人，上述引文)所編錄之抗體之線性序列的考慮因素。Kabat編號方案(系統)為廣泛採用之以一致方式對抗體可變域之胺基酸殘基編號的標準且亦如本文別處所提及為本發明中所用之較佳方案。其他結構考慮因素亦可用於確定抗體之標準結構。舉例而言，Kabat編號不能完全反映之彼等差異可由Chothia等人之編號系統描述及/或由其他技術(例如結晶學及二維或三維電腦模型化)揭示。因此，既定抗體序列可歸於典型類別，其尤其允許鑑別適當框架序列(例如基於在文庫中包括多種典型結構的需要)。由Chothia等人，上述引文所述的抗體胺基酸序列之Kabat編號及結構考慮因素及其對於抗體結構之構築典型態樣的推論描述於該文獻中。不同類別之免疫球蛋白的次單位結構及三維構型在此項技術中為吾人所熟知。對於抗體結構之綜述，參見Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Harlow等人編，1988。

輕鏈之CDR3及尤其重鏈之CDR3可構成輕鏈及重鏈可變區內抗原結合的最重要決定子。在一些抗體構築體中，重鏈CDR3似乎構成抗原與抗體之間的主要接觸區域。可使用僅CDR3變化之活體外選擇方案來改變抗體之結合特性或確定促成抗原結合之殘基。因此，CDR3通常為抗體結合位點內分子多樣性之最大來源。舉例而言，H3可短至兩個胺基酸殘基或大於26個胺基酸。

在經典全長抗體或免疫球蛋白中，各輕(L)鏈藉由一個共價二硫鍵連接至重(H)鏈，而兩個H鏈視H鏈同型而定藉由一或多個二硫鍵彼此連接。最接近於VH的CH域稱為CH1。恆定域(「C」)不直接參與抗原結合，但展現各種效應功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性及補體活化。抗體之Fc區包含在重鏈恆定域內且例如能夠與細胞表面位Fc受體相互作用。

組裝及體細胞突變後之抗體基因之序列高度變化，且此等變化之基因估計編碼10¹⁰ 個不同抗體分子(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等人編，Academic Press,San Diego,CA,1995)。因此，免疫系統提供免疫球蛋白之譜系。術語「譜系」係指至少一個完全或部分來源於至少一個編碼至少一種免疫球蛋白之序列的核苷酸序列。該(該等) 序列可藉由重鏈之V、D及J區段及輕鏈之V及J區段之活體內重組產生。或者，該(該等)序列可響應於發生何種重排(例如活體外刺激)自細胞產生。或者，部分或所有序列可藉由DNA拼接、核苷酸合成、突變誘發及其他方法獲得，參見例如美國專利5,565,332。譜系可僅包括一個序列或可包括複數個序列，包括遺傳性多樣之集合中的序列。

本發明之較佳抗體構築體亦可定義為雙特異性抗體構築體，其包含結合於目標細胞表面上之人類FLT3的第一(較佳人類)結合域及結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域，其中該第一結合域結合於與選自由FL-1至FL-65組成之群的抗體相同之FLT3之抗原決定基，亦即包含有選自由以下組成之群的包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH區及包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL區的抗體：SEQ ID NO：151-156、SEQ ID NO：161-166、SEQ ID NO：171-176、SEQ ID NO：181-186、SEQ ID NO：191-196、SEQ ID NO：201-206、SEQ ID NO：211-216、SEQ ID NO：221-226、SEQ ID NO：231-236、SEQ ID NO：241-246、SEQ ID NO：251-256、SEQ ID NO：261-266、SEQ ID NO：271-276、SEQ ID NO：281-286、SEQ ID NO：291-296、SEQ ID NO：301-306、SEQ ID NO：311-316、SEQ ID NO：321-326、SEQ ID NO：331-336、SEQ ID NO：341-346、SEQ ID NO：351-356、SEQ ID NO：361-366、SEQ ID NO：371-376、SEQ ID NO：381-386、SEQ ID NO：391-396、SEQ ID NO：401-406、SEQ ID NO：411-416、SEQ ID NO：421-426、SEQ ID NO：431-436、SEQ ID NO：441-446、SEQ ID NO：451-456、SEQ ID NO：461-466、SEQ ID NO：471-476、SEQ ID NO：481-486、SEQ ID NO：491-496、SEQ ID NO：501-506、SEQ ID NO：511-516、SEQ ID NO：521-526、SEQ ID NO：531-536、SEQ ID NO：541-546、SEQ ID NO：551-556、SEQ ID NO：561-566、SEQ ID NO：571-576、SEQ ID NO：581-586、SEQ ID NO：591- 596、SEQ ID NO：601-606、SEQ ID NO：611-616、SEQ ID NO：621-626、SEQ ID NO：631-636、SEQ ID NO：641-646、SEQ ID NO：651-656、SEQ ID NO：661-666、SEQ ID NO：671-676、SEQ ID NO：681-686、SEQ ID NO：691-696、SEQ ID NO：701-706、SEQ ID NO：711-716、SEQ ID NO：721-726、SEQ ID NO：731-736、SEQ ID NO：741-746、SEQ ID NO：751-756、SEQ ID NO：761-766、SEQ ID NO：771-776、SEQ ID NO：781-786、SEQ ID NO：791-796。

不論抗體構築體是否結合於與另一既定抗體構築體相同之FLT3之抗原決定基可例如藉由在有嵌合或截短目標分子下抗原決定基定位量測，例如如上文及隨附實例中所描述。

本發明之較佳抗體構築體亦可定義為雙特異性抗體構築體，其包含結合於目標細胞表面上之人類FLT3的第一(較佳人類)結合域及結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域，其中該第一結合域與選自由FL-1至FL-65組成之群的抗體，亦即包含有選自由上文所述組成之群的包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH區及包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL區的抗體競爭結合。

不論抗體構築體是否與另一既定抗體構築體競爭結合可在競爭分析，諸如競爭性ELISA或基於細胞之競爭分析中量測。亦可使用抗生素蛋白偶合微米粒子(珠粒)。與塗覆抗生素蛋白之ELISA盤類似，當與經生物素標記之蛋白反應時，各此等珠粒可用作可進行分析之受質。抗原塗覆於珠粒上且接著用第一抗體預塗。添加第二抗體且確定任何額外結合。用於讀出之可能方式包括流式細胞測量術。

在一個實施例中，本發明之抗體構築體的第一結合域包含選自由以下所示之VH區組成之群的VH區：SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：757、SEQ ID NO：767、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：787及SEQ ID NO：797。

在另一實施例中，本發明之抗體構築體的第一結合域包含選自由以下所示之VL區組成之群的VL區：SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：788及SEQ ID NO：798。

在另一實施例中，本發明之抗體構築體的第一結合域包含選自由如以下所示之VH區及VL區對組成之群的VH區及VL區：SEQ ID NO：157+158、SEQ ID NO：167+168、SEQ ID NO：177+178、SEQ ID NO：187+188、SEQ ID NO：197+198、SEQ ID NO：207+208、SEQ ID NO：217+218、SEQ ID NO：227+228、SEQ ID NO：237+238、SEQ ID NO：247+248、SEQ ID NO：257+258、SEQ ID NO：267+268、SEQ ID NO：277+278、SEQ ID NO：287+288、SEQ ID NO：297+298、SEQ ID NO：307+308、SEQ ID NO：317+318、SEQ ID NO：327+328、SEQ ID NO：337+338、SEQ ID NO：347+348、SEQ ID NO：357+358、SEQ ID NO：367+368、SEQ ID NO：377+378、SEQ ID NO：387+388、SEQ ID NO：397+398、SEQ ID NO：407+408、SEQ ID NO：417+418、SEQ ID NO：427+428、SEQ ID NO：437+438、SEQ ID NO：447+448、SEQ ID NO：457+458、SEQ ID NO：467+468、SEQ ID NO：477+478、SEQ ID NO：487+488、SEQ ID NO：497+498、SEQ ID NO：507+508、SEQ ID NO：517+518、SEQ ID NO：527+528、SEQ ID NO：537+538、SEQ ID NO：547+548、SEQ ID NO：557+558、SEQ ID NO：567+568、SEQ ID NO：577+578、SEQ ID NO：587+588、SEQ ID NO：597+598、SEQ ID NO：607+608、SEQ ID NO：617+618、SEQ ID NO：627+628、SEQ ID NO：637+638、SEQ ID NO：647+648、SEQ ID NO：657+658、SEQ ID NO：667+668、SEQ ID NO：677+678、SEQ ID NO：687+688、SEQ ID NO：697+698、SEQ ID NO：707+708、SEQ ID NO：717+718、SEQ ID NO：727+728、SEQ ID NO：737+738、SEQ ID NO：747+748、SEQ ID NO：757+758、SEQ ID NO：767+768、SEQ ID NO：777+778、SEQ ID NO：787+788及SEQ ID NO：797+798。

在又一實施例中，本發明之抗體構築體的第一結合域包含選自由以下所示之彼等多肽組成之群的多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799。

以上第一結合域(藉由其CDR、VH區及VL區以及其組合說明)描述為結合於包含在如SEQ ID NO：819中所示之區內之FLT3之抗原決定基的結合域。

如本文所用之術語「雙特異性」係指「至少雙特異性」之抗體構築體，亦即其包含至少一個第一結合域及第二結合域，其中該第一結合域結合於一種抗原或目標(此處：FLT3)，且該第二結合域結合於另一種抗原或目標(此處：CD3)。因此，本發明之抗體構築體包含針對至少兩種不同抗原或目標之特異性。本發明之術語「雙特異性抗體構築體」亦涵蓋多特異性抗體構築體，諸如三特異性抗體構築體，後者包括三個結合域，或具有超過三個(例如四個、五個……)特異性之構築體。

倘若本發明之抗體構築體為(至少)雙特異性的，則其不會天然存在且其顯著不同於天然存在之產物。因此，「雙特異性」抗體構築體或免疫球蛋白為具有至少兩個具有不同特異性之不同結合位點的人造混合抗體或免疫球蛋白。雙特異性抗體構築體可藉由包括融合瘤融合或Fab'片段連接的多種方法產生。參見例如Songsivilai & Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)。

本發明之抗體構築體的至少兩個結合域及可變域可包含或可不包含肽連接子(間隔肽)。術語「肽連接子」根據本發明包含使本發明之抗體構築體之一個(可變及/或結合)域及另一(可變及/或結合)域之胺基酸序列彼此連結之胺基酸序列。此類肽連接子之基本技術特徵在於其不包括任何聚合反應活性。適合肽連接子中有描述於美國專利第4,751,180號及第4,935,233號或WO 88/09344中之彼等肽連接子。亦可使用肽連接子以使其他域或模組或區(諸如半衰期延伸域)連接至本發明之抗體構築體。

在使用連接子之情況下，此連接子較佳具有一定長度及序列以足以確保第一及第二域各自可彼此獨立地保留其不同結合特異性。對於連接本發明之抗體構築體中之至少兩個結合域(或兩個可變域)之肽連接子，彼等肽連接子為較佳的，其包含僅幾個胺基酸殘基，例如12個或更少胺基酸殘基。因此，12、11、10、9、8、7、6或5個胺基酸殘基之肽連接子為較佳的。設想之具有少於5個胺基酸之肽連接子包含4、3、2或1個胺基酸，其中富集Gly之連接子為較佳的。該「肽連接子」之情形下的尤其較佳「單一」胺基酸為Gly。因此，該肽連接子可由單一胺基酸Gly組成。肽連接子之另一較佳實施例之特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，亦即Gly₄ Ser(SEQ ID NO：1)，或其聚合物，亦即(Gly₄ Ser)x，其中x為1或大於1之整數(例如2或3)。較佳連接子以SEQ ID NO：1-9描繪。該肽連接子之特徵(其包含不存在促二級結構)在此項技術中已知且例如描述於Dall'Acqua等人(Biochem.(1998)37,9266-9273)；Cheadle等人(Mol Immunol(1992)29,21-30)及Raag及Whitlow(FASEB(1995)9(1),73-80)中。此外不促進任何二級結構之肽連接子為較佳的。該等域彼此之連接可由例如遺傳工程改造提供，如實例中所述。製備融合及可操作連接之雙特異性單鏈構築體及在哺乳動物細胞或細菌中表現其之方法在此項技術中熟知(例如WO 99/54440或Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2001)。

如上文所描述，本發明提供一種較佳實施例，其中該抗體構築體呈選自由以下組成之群的格式：(scFv)₂ 、scFv-單域mAb、雙功能抗體及彼等格式中之任一者的寡聚物。

根據一個尤其較佳實施例且如隨附實例中所記錄，本發明之抗體構築體為「雙特異性單鏈抗體構築體」，更佳為雙特異性「單鏈Fv」(scFv)。儘管Fv片段兩個域VL及VH藉由各別基因編碼，其可使用重組方法藉由合成連接子(如上文所描述)接合，該合成連接子使其形成單個蛋白鏈，其中VL及VH區配對以形成單價分子；參見例如Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。此等抗體片段使用熟習此項技術者已知的習知技術獲得，且以與完整或全長抗體相同之方式評估片段之功能。單鏈可變片段(scFv)因此為通常用約10至約25個胺基酸、較佳約15至20個胺基酸之短連接子肽連接的免疫球蛋白之重鏈(VH)及輕鏈(VL)可變區的融合蛋白。連接子通常富集甘胺酸以具有可撓性，以及絲胺酸或蘇胺酸以具有可溶性，且可連接VH之N端與VL之C端，或反之亦然。此蛋白保留原始免疫球蛋白之特異性，但去除恆定區且引入連接子。

雙特異性單鏈分子在此項技術中已知且描述於如下文獻中：WO 99/54440；Mack,J.Immunol.(1997),158,3965-3970；Mack,PNAS,(1995),92,7021-7025；Kufer,Cancer Immunol.Immunother.,(1997),45,193-197；Löffler,Blood,(2000),95,6,2098-2103；Br ü hl,Immunol.,(2001),166,2420-2426；Kipriyanov,J.Mol.Biol.,(1999),293,41-56。關於單鏈抗體產生所述之技術(參見尤其美國專利4,946,778；Kontermann及Dübel(2010)，上述引文及Little(2009)，上述引文)可適合於產生特異性識別所選目標之單鏈抗體構築體。

具有格式(scFv)₂ 之二價(亦稱為二價(divalent))或雙特異性單鏈可變片段(bi-scFvs或di-scFvs)可藉由連接兩個scFv分子(例如由如上文所描之連接子)工程改造。若此等兩個scFv分子具有相同結合特異性，則所得(scFv)₂ 分子較佳稱為二價(亦即對於相同目標抗原決定基其具有兩個價數)。若兩個scFv分子具有不同結合特異性，則所得(scFv)₂ 分子較佳稱為雙特異性的。連接可藉由產生具有兩個VH區及兩個VL區之單一肽鏈進行，得到串聯scFv(參見例如Kufer P.等人，(2004)Trends in Biotechnology 22(5)：238-244)。另一可能性為產生具有連接肽之scFv分子，該等連接肽對於兩個可變區摺疊在一起過短(例如約五個胺基酸)，從而迫使scFv二聚。此類型為稱為雙功能抗體(參見例如Hollinger,Philipp等人，(7月1993)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90(14)：6444-8.)。

根據本發明之抗體構築體的亦較佳實施例，結合於目標抗原FLT3或CD3之結合域的重鏈(VH)及輕鏈(VL)不經由上述肽連接子直接連接，但結合域因形成如對於雙功能抗體所述之雙特異性分子而形成。因此，CD3結合域之VH鏈可經由此類肽連接子融合於FLT3結合域之VL，而FLT3結合域之VH鏈經由此類肽連接子融合於CD3結合域之VL。

單域抗體僅包含一個(單體)抗體可變域，其能夠獨立於其他V區或域選擇性結合於特異性抗原。第一單域抗體自駱駝中發現之重鏈抗體工程改造，且其稱為V_H H片段。軟骨魚亦具有重鏈抗體(IgNAR)，可自該等重鏈抗體獲得稱為V_NAR 片段之單域抗體。替代性方法為將來自例如人類或嚙齒動物之常見免疫球蛋白之二聚可變域分裂為單體，從而獲得單域Ab形式之VH或VL。儘管目前對獲得單域抗體之大多數研究基於重鏈可變域，但衍生自輕鏈之奈米抗體亦展示特異性結合於目標抗原決定基。單域抗體之實例稱為sdAb、奈米抗體或單一可變域抗體。

因此，(單域mAb)₂ 為由(至少)兩個單域單株抗體構成之單株抗體構築體，該等單域單株抗體個別地選自包含VH、VL、V_H H及V_NAR 之群。連接子較佳為肽連接子形式。類似地，「scFv單域mAb」為由至少一個上述單域抗體及一個上述scFv分子構成之單株抗體構築體。同樣，連接子較佳為肽連接子形式。

此外設想，本發明提供一種雙特異性抗體構築體，其包含結合於目標細胞表面之人類FLT3的第一結合域及結合於T細胞表面之人類 CD3的第二結合域，其中第一結合域結合於包含在如SEQ ID NO：819(團簇1)中所示區內之FLT3之抗原決定基。

因此，在本發明之另一態樣中，雙特異性抗體構築體之第一結合域包含有選自由以下組成之群的包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH區及包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL區：SEQ ID NO：151-156、SEQ ID NO：161-166、SEQ ID NO：171-176、SEQ ID NO：181-186、SEQ ID NO：191-196、SEQ ID NO：201-206、SEQ ID NO：211-216、SEQ ID NO：221-226、SEQ ID NO：231-236、SEQ ID NO：241-246、SEQ ID NO：251-256、SEQ ID NO：261-266、SEQ ID NO：271-276、SEQ ID NO：281-286、SEQ ID NO：291-296、SEQ ID NO：301-306、SEQ ID NO：311-316、SEQ ID NO：321-326、SEQ ID NO：331-336、SEQ ID NO：341-346、SEQ ID NO：351-356、SEQ ID NO：361-366、SEQ ID NO：371-376、SEQ ID NO：381-386、SEQ ID NO：391-396、SEQ ID NO：401-406、SEQ ID NO：411-416、SEQ ID NO：421-426、SEQ ID NO：431-436、SEQ ID NO：441-446、SEQ ID NO：451-456、SEQ ID NO：461-466、SEQ ID NO：471-476、SEQ ID NO：481-486、SEQ ID NO：491-496、SEQ ID NO：501-506、SEQ ID NO：511-516、SEQ ID NO：521-526、SEQ ID NO：531-536、SEQ ID NO：541-546、SEQ ID NO：551-556、SEQ ID NO：561-566、SEQ ID NO：571-576、SEQ ID NO：581-586、SEQ ID NO：591-596、SEQ ID NO：601-606、SEQ ID NO：611-616、SEQ ID NO：621-626、SEQ ID NO：631-636、SEQ ID NO：641-646、SEQ ID NO：651-656、SEQ ID NO：661-666、SEQ ID NO：671-676、SEQ ID NO：681-686、SEQ ID NO：691-696、SEQ ID NO：701-706、SEQ ID NO：711-716、SEQ ID NO：721-726、SEQ ID NO：731-736、SEQ ID NO：741-746、SEQ ID NO：791-796。

在一個實施例中，本發明之抗體構築體的第一結合域包含選自由以下所示之VH區組成之群的VH區：SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：747及SEQ ID NO：797。

在另一實施例中，本發明之抗體構築體的第一結合域包含選自由以下所示之VL區組成之群的VL區：SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：748及SEQ ID NO：798。

在另一實施例中，本發明之抗體構築體的第一結合域包含選自由如以下所示之VH區及VL區對組成之群的VH區及VL區：SEQ ID NO：157+158、SEQ ID NO：167+168、SEQ ID NO：177+178、SEQ ID NO：187+188、SEQ ID NO：197+198、SEQ ID NO：207+208、SEQ ID NO：217+218、SEQ ID NO：227+228、SEQ ID NO：237+238、SEQ ID NO：247+248、SEQ ID NO：257+258、SEQ ID NO：267+268、SEQ ID NO：277+278、SEQ ID NO：287+288、SEQ ID NO：297+298、SEQ ID NO：307+308、SEQ ID NO：317+318、SEQ ID NO：327+328、SEQ ID NO：337+338、SEQ ID NO：347+348、SEQ ID NO：357+358、SEQ ID NO：367+368、SEQ ID NO：377+378、SEQ ID NO：387+388、SEQ ID NO：397+398.、SEQ ID NO：407+408、SEQ ID NO：417+418、SEQ ID NO：427+428、SEQ ID NO：437+438、SEQ ID NO：447+448、SEQ ID NO：457+458、SEQ ID NO：467+468、SEQ ID NO：477+478、SEQ ID NO：487+488、SEQ ID NO：497+498、SEQ ID NO：507+508、SEQ ID NO：517+518、SEQ ID NO：527+528、SEQ ID NO：537+538、SEQ ID NO：547+548、SEQ ID NO：557+558、SEQ ID NO：567+568、SEQ ID NO：577+578、SEQ ID NO：587+588、SEQ ID NO：597+598、SEQ ID NO：607+608、SEQ ID NO：617+618、SEQ ID NO：627+628、SEQ ID NO：637+638、SEQ ID NO：647+648、SEQ ID NO：657+658、SEQ ID NO：667+668、SEQ ID NO：697+698、SEQ ID NO：707+708、SEQ ID NO：717+718、SEQ ID NO：727+728、SEQ ID NO：737+738、SEQ ID NO：747+748及SEQ ID NO：797+798。

在另一實施例中，本發明之抗體構築體的第一結合域包含選自由以下所示之彼等多肽組成之群的多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449、SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：799。

亦設想，本發明提供一種雙特異性抗體構築體，其包含結合於目標細胞表面上之人類FLT3的第一結合域及結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域，其中第一結合域結合於包含在如SEQ ID NO：821(團簇3)中所示之區內的FLT3之抗原決定基。

因此，在本發明之另一態樣中，雙特異性抗體構築體之第一結合域包含有如下包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH區及包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL區：SEQ ID NO：671-676、SEQ ID NO：681-686、SEQ ID NO：751-756、SEQ ID NO：761-766、SEQ ID NO：771-776及SEQ ID NO：781-786。

在一個實施例中，本發明之抗體構築體的第一結合域包含SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：757、SEQ ID NO：767、SEQ ID NO：777及SEQ ID NO：787中所示之VH區。

在另一實施例中，本發明之抗體構築體的第一結合域包含SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：778及SEQ ID NO：788中所示之VL區。

在另一實施例中，本發明之抗體構築體的第一結合域包含選自由如SEQ ID NO：677+678、SEQ ID NO：687+688、SEQ ID NO：757+758、SEQ ID NO：767+768、SEQ ID NO：777+778及SEQ ID NO：787+788中所示的VH區及VL區對組成之群的VH區及VL區。

在另一實施例中，本發明之抗體構築體的第一結合域包含選自由SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789中所示之彼等多肽組成之群的多肽。

本發明之另一較佳抗體構築體亦可定義為雙特異性抗體構築體，其包含結合於目標細胞表面上之人類FLT3的第一(較佳人類)結合域及結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域，其中該第一結合域與選自由FL-1至FL-53、FL-55至FL-60及FL-65組成之群的抗體，亦即包含有選自由上文所述組成之群的包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH區及包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL區的抗體競爭結合。

T細胞或T淋巴細胞為一種淋巴細胞(本身為一種白血球)，其在細胞介導之免疫性中起主要作用。存在數種T細胞亞群，各具有不同功能。T細胞可藉由細胞表面上T細胞受體(TCR)之存在而區別於其他淋巴球，諸如B細胞及NK細胞。TCR負責識別結合於主要組織相容複合體(MHC)分子之抗原且由兩個不同蛋白鏈組成。在95%之T細胞中，TCR由α及β鏈組成。在TCR與抗原肽及MHC(肽/MHC複合物)接合時，T淋巴細胞經由相關酶、共受體、特定接附分子及活化或釋放之轉錄因子介導之一系列生物化學事件活化。

CD3受體複合物為一種蛋白複合物且由四個鏈構成。在哺乳動物中，複合物含有CD3γ鏈、CD3δ鏈及兩個CD3ε鏈。此等鏈與T細胞受體(TCR)及所謂ζ鏈結合以形成T細胞受體CD3複合物且在T淋巴球中產生活化信號。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈為含有單一胞外免疫球蛋白域之免疫球蛋白超家族之高度相關細胞表面蛋白。CD3分子之胞內尾部含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或簡稱為ITAM的單一保守基元，其對TCR之信號傳導能力為至關重要的。CD3ε分子為在人類中由位於染色體11上之CD3E 基因編碼的多肽。CD3ε之最佳抗原決定基包含在人類CD3ε細胞外域之胺基酸殘基1-27內。

經由多特異性、至少雙特異性抗體構築體募集T細胞再引導目標細胞之溶解參與細胞溶解突觸形成及傳遞穿孔素及顆粒酶。嚙合之T細胞能夠進行連續目標細胞溶解，且不受干擾肽抗原加工及呈現或純系T細胞分化的免疫逃逸機制影響；參見例如WO 2007/042261。

藉由FLT3xCD3雙特異性抗體構築體介導之細胞毒性可以多種方式量測。參見實例10。效應細胞可為例如刺激性增濃之(人類)CD8陽性T細胞或非刺激性(人類)周邊血液單核細胞(PBMC)。若目標細胞為獼猴來源或表現的或用獼猴FLT3轉染，則效應細胞亦應具有獼猴來源，諸如獼猴T細胞株，例如4119LnPx。目標細胞應表現FLT3(至少細胞外域)，例如人類或獼猴FLT3。目標細胞可為細胞株(諸如CHO)，用FLT3，例如人類或獼猴FLT3穩定或暫時轉染。或者，目標細胞可為FLT3陽性天然表現細胞株，諸如FLT3陽性人類AML細胞株EOL-1、MOLM-13及MV4-11。通常，預期細胞表面上表現較高水準之FLT3的目標細胞株的EC50值較低。效應細胞與目標細胞(E：T)之比率通常為約10：1，但亦可變化。FLT3xCD3雙特異性抗體構築體之細胞毒活性可在51-鉻釋放分析(培育時間約18小時)或基於FACS之細胞毒性分析(培育時間約48小時)中量測。修改分析培育時間(細胞毒性反應)亦為可能的。量測細胞毒性之其他方法為熟習此項技術者熟知且包含MTT或MTS分析、基於ATP之分析，包括生物發光分析、磺醯若丹明B(SRB)分析、WST分析、細胞群落分析及ECIS技術。

本發明之FLT3xCD3雙特異性抗體構築體介導之細胞毒活性較佳在基於細胞之細胞毒性分析中進行量測。亦可在51鉻釋放分析中進行量測。其由EC₅₀ 值表示，該值對應於一半最大有效濃度(誘導為基線與最大值之間的一半的細胞毒性反應的抗體構築體之濃度)。較佳地，FLT3xCD3雙特異性抗體構築體之EC₅₀ 值為5000pM或4000pM，更佳為3000pM或2000pM，甚至更佳1000pM或500pM，甚至更佳400pM或300pM，甚至更佳200pM，甚至更佳100pM，甚至更佳50pM，甚至更佳20pM或10pM，且最佳5pM。

以上既定EC₅₀ 值可以不同分析量測。熟習此項技術者察覺到預期與非刺激性PBMC相比在刺激性/增濃CD8+ T細胞用作效應細胞時EC₅₀ 值可較低。此外，可預期與低目標表現大鼠相比，當目標細胞表現大量目標抗原時EC₅₀ 值較低。舉例而言，當刺激性/增濃人類CD8+ T細胞用作效應細胞(且經FLT3轉染之細胞(諸如CHO細胞)或FLT3陽性人類AML細胞株EOL-1、MOLM-13及MV4-11用作目標細胞)時，FLT3 xCD3雙特異性抗體構築體之EC₅₀ 值較佳為1000pM，更佳為500PM，甚至更佳250pM，甚至更佳100pM，甚至更佳50pM，甚至更佳10pM，且最佳5pM。當人類PBMC用作效應細胞時，FLT3xCD3雙特異性抗體構築體之EC₅₀ 值較佳為5000pM或4000pM(詳言之當目標細胞為FLT3陽性人類AML細胞株EOL-1、MOLM-13及MV4-11時)，更佳為2000pM(詳言之當目標細胞為FLT3轉染的細胞，諸如CHO細胞時)，更佳為1000pM或500pM，甚至更佳200pM，甚至更佳150pM，甚至更佳100pM，且最佳50pM或更低。當諸如LnPx4119之獼猴T細胞株用作效應細胞且諸如CHO細胞之獼猴FLT3經轉染細胞株用作目標細胞株時，FLT3 xCD3雙特異性抗體構築體之EC₅₀ 值較佳為2000pM或1500pM，更佳為1000pM或500pM，甚至更佳300pM或250pM，甚至更佳100pM，且最佳50pM。

較佳地，本發明之FLT3xCD3雙特異性抗體構築體並不誘導/介導FLT3陰性細胞(諸如CHO細胞)之溶解或基本上並不誘導/介導溶解。術語「並不誘導溶解」、「基本上並不誘導溶解」、「並不介導溶解」或「基本上並不介導溶解」意謂本發明之抗體構築體並不誘導或介導FLT3陰性細胞之超過30%，較佳不超過20%，更佳不超過10%，尤其較佳不超過9%、8%、7%、6%或5%溶解，由此FLT3陽性人類肺癌瘤細胞株SHP-77(參見上文)之溶解設定為100%。此通常適用於高達500nM之抗體構築體濃度。熟習此項技術者知曉如何在無需再費周折的情況下量測細胞溶解。此外，本發明教示如何量測細胞溶解之特別說明。

個別FLT3 xCD3雙特異性抗體構築體之單體與二聚同功異型物之間的細胞毒活性差異稱為「效能差」。此效力差可例如計算為分子之單體與二聚形式之EC₅₀ 值之間的比率，參見實例17。本發明之FLT3xCD3雙特異性抗體構築體之效能差較佳為5，更佳4，甚至更佳3，甚至更佳2且最佳1。

本發明之抗體構築體之第一及/或第二(或任何其他)結合域較佳為對於靈長類動物之哺乳動物綱之成員具有特異性的種間交叉結合域。種間交叉特異性CD3結合域例如描述於WO 2008/119567中。根據一個實施例，第一及/或第二結合域除分別結合於人類FLT3及人類CD3之外，應亦結合於靈長類動物之FLT3/CD3，靈長類動物包括(但不限於)新世界靈長類動物(諸如白鬢狨(Callithrix jacchus )、棉冠狨(Saguinus Oedipus )或松鼠猴(Saimiri sciureus ))、舊世界靈長類動物(諸如狒狒及獼猴)、長臂猿、猩猩及非人類人亞科(homininae )。據設想，結合於目標細胞表面上之人類FLT3 的本發明之抗體構築體的第一結合域亦至少結合於獼猴FLT3 ，及/或結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域亦至少結合於獼猴CD3。較佳獼猴為食蟹猴。亦設想為恆河猴(Macaca mulatta, Rhesus)。

在本發明之一個態樣中，第一結合域結合於人類FLT3且進一步結合於獼猴FLT3，諸如食蟹猴之FLT3，且更佳結合於表現獼猴細胞表面上之獼猴FLT3。較佳食蟹猴FLT3以SEQ ID NO：802描繪。獼猴FLT3之第一結合域的親和力較佳為15nM，更佳10nM，甚至更佳5nM，甚至更佳1nM，甚至更佳0.5nM，甚至更佳0.1nM，且最佳0.05nM或甚至0.01nM。

本發明之抗體構築體關於結合獼猴FLT3與人類FLT3[ma FLT3：hu FLT3]之親和力差(如例如藉由BiaCore或藉由Scatchard分析所確定)較佳<100，較佳<20，更佳<15，更佳<10，甚至更佳<8，更佳<6且最佳<2。較佳地，本發明之抗體構築體關於結合於獼猴FLT3與人類FLT3 之親和力差較佳的範圍較佳在0.1與20之間，更佳0.2與10之間，甚至更佳0.3與6之間，甚至更佳0.5與3之間或0.5與2.5之間，且最佳0.5與2之間或0.6與2之間。參見實例5。

在本發明之抗體構築體之一個實施例中，第二結合域結合於人類CD3ε及白鬢狨、棉冠獠狨或松鼠猴CD3ε。第二結合域較佳結合於此等CD3ε鏈之細胞外抗原決定基。亦設想，第二結合域結合於人類及恆河猴CD3ε鏈之細胞外抗原決定基。CD3ε之最佳抗原決定基包含在人類CD3ε細胞外域之胺基酸殘基1-27內。甚至更特定言之，抗原決定基至少包含胺基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。白鬢狨及棉冠獠狨均為屬於狨猴科的新世界靈長類動物，而松鼠猴為屬於卷尾猴科之新世界靈長類動物。

對於本發明之抗體構築體，結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域包含具有選自以下之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的VL區尤其較佳：(a)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：27中所示之CDR-L1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：28中所示之CDR-L2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：29中所示之CDR-L3；(b)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：117中所示之CDR-L1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：118中所示之CDR-L2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：119中所示之CDR-L3；及(c)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：153中所示之CDR-L1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：154中所示之CDR-L2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：155中所示之CDR-L3。

在本發明抗體構築體之一個替代性較佳實施例中，結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域包含具有選自以下之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的VH區： (a)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：12中所示之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：13中所示之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：14中所示之CDR-H3；(b)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：30中所示之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：31中所示之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：32中所示之CDR-H3；(c)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：48中所示之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：49中所示之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：50中所示之CDR-H3；(d)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：66中所示之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：67中所示之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：68中所示之CDR-H3；(e)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：84中所示之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：85中所示之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：86中所示之CDR-H3；(f)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：102中所示之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：103中所示之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：104中所示之CDR-H3；(g)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：120中所示之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：121中所示之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：122中所示之CDR-H3；(h)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：138中所示之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：139中所示之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：140中所示之CDR-H3；(i)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：156中所示之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：157中所示之CDR-H2及如WO 2008/ 119567之SEQ ID NO：158中所示之CDR-H3；(j)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：174中所示之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：175中所示之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：176中所示之CDR-H3。

對於本發明之抗體構築體，結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域更佳包含選自由以下組成之群的VL區：如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：102中所示之VL區(參見亦WO 2008/119567之SEQ ID NO：35、39、125、129、161或165)。

或者，結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域較佳包含選自由以下組成之群的VH區：如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98及SEQ ID NO：101中所示之VH區(亦參見WO 2008/119567之SEQ ID NO：15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181)。

更佳地，本發明之抗體構築體之特徵為結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域包含選自由以下組成之群的VL區及VH區：(a)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：17或21中所示之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：15或19中所示之VH區；(b)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：35或39中所示之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：33或37中所示之VH區；(c)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：53或57中所示之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：51或55中所示之VH區；(d)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：71或75中所示之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：69或73中所示之VH區；(e)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：89或93中所示之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：87或91中所示之VH區；(f)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：107或111中所示之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：105或109中所示之VH區；(g)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：125或129中所示之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：123或127中所示之VH區；(h)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：143或147中所示之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：141或145中所示之VH區；(i)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：161或165中所示之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：159或163中所示之VH區；(j)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：179或183中所示之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：177或181中所示之VH區。

與本發明之抗體構築體結合的亦較佳為結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域，其包含如SEQ ID NO：102中所示之VL區及如SEQ ID NO：101中所示之VH區。

本發明之抗體構築體之一較佳實施例，結合域且尤其第二結合域(其結合於T細胞表面上之人類CD3)具有以下格式：VH區及VL區對呈單鏈抗體(scFv)的格式。VH及VL區以VH-VL或VL-VH的順序排列。較佳地，VH區N端定位於連接子序列且VL區C端定位於連接子序列。

上述本發明抗體構築體之較佳實施例的特徵在於結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103(亦參見 WO 2008/119567之SEQ ID NO：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187)。

亦設想本發明之抗體構築體除其結合於目標分子FLT3及CD3之功能外亦具有另一功能。在此格式中，抗體構築體為藉由經由結合於FLT3靶向目標細胞、經由CD3結合調節細胞毒性T細胞活性及經由募集如NK細胞之效應細胞提供諸如調節抗體依賴性細胞毒性之完全功能性Fc恆定域的三功能或多功能抗體構築體；標記(螢光等)；諸如毒素或放射性核種之治療劑及/或增強血清半衰期的方式等。

延長本發明抗體構築體之血清半衰期之方式的實例包括融合或以其他方式附接於抗體構築體之蛋白的肽、蛋白或域。肽、蛋白或蛋白域組包括結合於人體中具有較佳藥物動力學概況之其他蛋白(諸如血清白蛋白)之肽(參見WO 2009/127691)。此類半衰期延長肽之替代使用概念包括結合於新生兒Fc受體(FcRn，參見WO 2007/098420)之肽，其亦可用於本發明之構築體。連接蛋白或完整蛋白之較大域之概念包括例如融合人類血清白蛋白、人類血清白蛋白之變異體或突變體(參見WO 2011/051489、WO 2012/059486、WO 2012/150319、WO 2013/135896、WO 2014/072481、WO 2013/075066)或其結構域以及融合免疫球蛋白(Fc域)及其變異體之恆定區。Fc域之此類變異體可經最佳化/修飾以允許二聚體或多聚體的所需配對，消除Fc受體結合(例如Fcγ受體)或用於其他原因。此項技術中已知的延長小蛋白化合物在人體中之半衰期的另一個概念為諸如本發明之抗體構築體的彼等化合物的聚乙二醇化。

在一較佳實施例中，本發明之抗體構築體描述如下：(a)多肽，其以N端起始按以下次序包含：●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；●具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；及●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103；及●視情況存在之His-標籤，諸如SEQ ID NO10中所示者；(b)多肽，其以N端起始按以下次序包含：●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO： 159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；●具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103；●視情況存在之具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子； ●具有選自由SEQ ID NO：104-134組成之群的胺基酸序列之多肽；及●視情況存在之His-標籤，諸如SEQ ID NO10中所示者；(c)多肽，其以N端起始按以下次序包含：●具有胺基酸序列QRFVTGHFGGLX₁ PANG(SEQ ID NO：135)之多肽，然而X₁ 為Y或H；及●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；●具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103；●具有胺基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO：137)或QRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO：139)之多肽；及●視情況存在之His-標籤，諸如SEQ ID NO10中所示者；(d)多肽，其以N端起始按以下次序包含：●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98及SEQ ID NO：101；●具有SEQ ID NO：8中所示之胺基酸序列之肽連接子；●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、 SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：788及SEQ ID NO：798及C端之絲胺酸殘基；●具有SEQ ID NO：140中所示之胺基酸序列之多肽；及多肽，其以N端起始按以下次序包含：●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO： 757、SEQ ID NO：767、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：787及SEQ ID NO：797；●具有SEQ ID NO：8中所示之胺基酸序列之肽連接子；●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：102及C端之絲胺酸殘基；●具有SEQ ID NO：141中所示之胺基酸序列之多肽；(e)多肽，其以N端起始按以下次序包含：●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98及SEQ ID NO：101；●具有SEQ ID NO：8中所示之胺基酸序列之肽連接子；●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、 SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：788及SEQ ID NO：798；●具有SEQ ID NO：142中所示之胺基酸序列之多肽；及多肽，其以N端起始按以下次序包含：●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：757、SEQ ID NO：767、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：787及SEQ ID NO：797；●具有SEQ ID NO：8中所示之胺基酸序列之肽連接子；●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：102及C端之絲胺酸殘基；[CD3 VL]●具有SEQ ID NO：143中所示之胺基酸序列之多肽；(f)[V5異源-Fc]多肽，其以N端起始按以下次序包含：具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO： 759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；●具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；及●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103；及●具有SEQ ID NO：144中所示之胺基酸序列之多肽；及具有SEQ ID NO：145中所示之胺基酸序列之多肽；(g)多肽，其以N端起始按以下次序包含：●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；及●具有SEQ ID NO：146中所示之胺基酸序列之多肽；及多肽，其以N端起始按以下次序包含：●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103；及●具有SEQ ID NO：147中所示之胺基酸序列之多肽；(h)多肽，其以N端起始按以下次序包含：●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；及●具有SEQ ID NO：148中所示之胺基酸序列之多肽；及多肽，其以N端起始按以下次序包含：●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103；及●具有SEQ ID NO：149中所示之胺基酸序列之多肽；或(i)多肽，其以N端起始按以下次序包含：●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO： 609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；●具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；及●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103；及●具有SEQ ID NO：150中所示之胺基酸序列之多肽。

(j)多肽，其以N端起始按以下次序包含：●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、 SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；●具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；及●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103；●具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；及●具有選自由SEQ ID NO：843-850組成之群的胺基酸序列之第三域。

在本發明之一較佳態樣中，第一結合域結合於人類FLT3 藉由FLT3配位體減小25%，較佳20百分比，更佳15%，更佳<10%，甚至更佳8%，更佳6%且最佳2%。

如實例18中所述，已出人意料地發現，包含均結合於FLT3之抗原決定基團簇3的FL-53、FL-54、FL-61、F-62、FL-63及FL-64之構築體仍展示高於實例18中所述之閾值的結合信號，但彼等結合子在針對與FLT3 FLT3配位體交互作用所述之區中具有抗原決定基。

此外，鑒於FLT3配位體與抗原決定基團簇3之區的交互作用，進一步假定較遠抗原決定基團簇(諸如FLT3之團簇1)之結合子將不受 FLT3配位體競爭衝擊。然而，存在相當大數目之結合子，其不符合75%閾值之要求。結合子FL-1至FL-53、FL-55至FL-60及FL-65處於對於FLT3配位體競爭不具有敏感性之結合子組中。

如上文所述，若干較佳本發明抗體構築體藉由與另一部分(諸如白蛋白或白蛋白變異體)融合修飾。若此等融合構築體針對其特性(詳言之目標親和力或細胞毒活性)進行表徵，則熟習此項技術者將察覺到可預期類似融合構築體或未修飾之雙特異性抗體構築體具有類似(或甚至較佳)特性。舉例而言，若雙特異性抗體構築體與白蛋白融合具有可觀或所需細胞毒活性或目標親和力，則可預期對於無白蛋白之構築體將觀察到相同/類似或甚至較高細胞毒活性/目標親和力。

根據另一較佳實施例，本發明之雙特異性抗體構築體包含(除兩個結合域以外)包含兩個多肽單體之第三域，該等多肽單體各包含鉸鏈、CH2及CH3域，其中該兩個多肽(或多肽單體)經由肽連接子彼此融合。該第三域較佳以N至C端次序包含：鉸鏈-CH2-CH3-連接子-鉸鏈-CH2-CH3。該第三域之較佳胺基酸序列以SEQ ID NO：843-850描繪。該兩個多肽單體中之每一者較佳具有選自由SEQ ID NO：835-842組成之群或與彼等序列至少90%一致之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，本發明之雙特異性抗體構築體之第一和第二結合域經由肽連接子融合於例如選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8及9組成之群的第三域。

根據本發明，「鉸鏈」為IgG鉸鏈區。此區可藉由類似地使用Kabat編號鑑別，參見Kabat位置223-243。根據上文，對「鉸鏈」之最小需要為與根據Kabat編號之D231至P243之IgG₁ 序列鏈段對應之胺基酸殘基。術語CH2及CH3係指免疫球蛋白重鏈恆定區2及3。此等區亦可藉由類似地使用Kabat編號鑑別，參見CH2之Kabat位置244-360及CH3之Kabat位置361-478。應瞭解，在關於其IgG₁ Fc區、IgG₂ Fc區、 IgG₃ Fc區、IgG₄ Fc區、IgM Fc區、IgA Fc區、IgD Fc區及IgE Fc區之免疫球蛋白之間存在一些差異(參見例如Padlan,Molecular Immunology,31(3),169-217(1993))。術語Fc單體係指IgA、IgD及IgG之最後兩個重鏈恆定區，及IgE及IgM之最後三個重鏈恆定區。Fc單體亦可包括此等域之可撓鉸鏈N端。對於IgA及IgM，Fc單體可包括J鏈。對於IgG，Fc部分包含免疫球蛋白域CH2及CH3及前兩個域與CH2之間的鉸鏈。儘管免疫球蛋白之Fc部分之邊界可不同，但用於包含功能性鉸鏈、CH2及CH3域之人類IgG重鏈Fc部分之實例可定義為例如包含分別用於IgG₄ 之殘基(鉸鏈域之)D231至(CH3域C端之)P476或D231至L476，其中編號根據Kabat。

本發明之抗體構築體因此可按N至C端次序包含：(a)第一結合域；(b)具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；(c)第二結合域；(d)具有選自由SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8及9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；(e)第三域(包含鉸鏈、CH2及CH3域)之第一多肽單體；(f)具有選自由SEQ ID NO：852、853、854及855組成之群的胺基酸序列之肽連接子；及(g)第三域(包含鉸鏈、CH2及CH3域)之第二多肽單體。

本發明之抗體構築體亦較佳按N至C端次序包含：●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列的第一結合域：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；●具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；●具有選自由以下組成之群的胺基酸序列的第二結合域：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103(亦參見WO 2008/119567之SEQ ID NO：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187)；●具有選自由SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8及9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；及●具有選自由SEQ ID NO：843-850組成之群的胺基酸序列之第三域。

在一較佳實施例中，本發明之抗體構築體包含或由SEQ ID NO：856至871中所示之多肽組成。

在本發明抗體構築體之一個較佳實施例中，抗體構築體包含或由如SEQ ID NO：856、858、860、862、864、866、868及870中所示之多肽組成。

在本發明抗體構築體之一個替代較佳實施例中，抗體構築體包含或由如SEQ ID NO：857、859、861、863、865、867、869及871中所示之多肽組成。

在本發明抗體構築體之一個較佳實施例中，抗體構築體包含或由如SEQ ID NO：858、859、862、863、864及865中所示之多肽組成。

抗體構築體之共價修飾亦包括在本發明之範疇內，且一般但未必總在轉譯後進行。舉例而言，將抗體構築體之數種類型之共價修飾藉由使抗體構築體之特定胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或N或C端殘基反應的有機衍生劑反應而引入分子中。

半胱胺醯基殘基最常與α-鹵代乙酸酯(及相對應的胺)(諸如氯乙酸或氯乙醯胺)反應以產生羧甲基或羧醯胺基甲基衍生物。半胱胺醯基殘基亦藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯基磷酸酯、N-烷基順丁烯二醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應而衍生。

組胺醯基殘基藉由在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應而衍生化，因為此試劑對組胺醯基側鏈具相對特異性。對溴苯甲醯甲基溴化物亦有用；反應物較佳在pH 6.0下用0.1M二甲胂酸鈉進行。離胺醯基及胺基末端殘基與丁二酸或其他羧酸酐反應。用此等試劑進行衍生化具有逆轉離胺醯基殘基之電荷的作用。其他適用於衍生含有α-胺基之殘基的試劑包括醯亞胺酯，諸如吡啶甲醯亞胺酸甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氫化物；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2,4-戊二酮及轉胺酶催化之與乙醛酸酯之反應。

精胺醯基殘基藉由與一種或數種習知試劑(其中有苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚滿三酮)反應而進行修飾。由於胍官能基具有高pKa，因此精胺酸殘基之衍生化需要反應在鹼性條件下進行。此外，此等試劑可與離胺酸之基團以及精胺酸ε-胺基反應。

可對酪胺醯基殘基進行特定修飾，其中尤其關注藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應而將光譜標記引入酪胺醯基殘基中。最通常分別使用N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷來形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。酪胺醯基殘基使用¹²⁵ I或¹³¹ I碘化以製備用於放射免疫分析之經標記蛋白質，上述氯胺T方法為適合的。

羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)藉由與碳二醯亞胺(R'-N=C=N--R')反應進行選擇性修飾，其中R及R'為視情況存在之不同烷基，諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，天冬胺醯基及麩胺醯基殘基藉由與銨離子反應而轉化成天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基。

用雙官能試劑衍生適用於使本發明之抗體構築體交聯至多種方法所用的不溶於水的支撐基質或表面。常用交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基丁二醯亞胺酯(例如與4-疊氮水楊酸之酯)、同雙官能醯亞胺酯(包括二丁二醯亞胺基酯，諸如3,3^-二硫代雙(丁二醯亞胺基丙酸酯)及雙官能順丁烯二醯亞胺(諸如雙-N-順丁烯二醯亞胺-1,8-辛烷)。諸如3-[(對疊氮苯基)二硫基]丙醯亞胺甲酯之衍生劑產生能夠在光存在下形成交聯之可光活化中間物。或者，美國專利第3,969,287號、第3,691,016號、第4,195,128號、第4,247,642 號、第4,229,537號及第4,330,440號中所述之反應性水不溶性基質(諸如溴化氰活化之碳水化合物)及反應性基質用於蛋白固定。

常使麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基脫去醯胺基以分別形成相應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。或者，此等殘基在適度酸性條件下脫去醯胺基。此等殘基之任一形式均屬於本發明範疇內。

其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基之羥基或羥丁胺醯基殘基之磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(T.E.Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,1983，第79-86頁)、N端胺之乙醯化及任何C端羧基之醯胺化。

本發明範疇內包括的抗體構築體之另一類共價修飾包含改變蛋白質之糖基化模式。如此項技術中所已知，糖基化模式可視蛋白質之序列(例如存在或不存在以下所論述之特定糖基化胺基酸殘基)或產生蛋白之宿主細胞或生物體而定。下文論述特定表現系統。

多肽之糖基化通常為N連接或O連接。N連接型係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為碳水化合物部分酶促結合於天冬醯胺酸側鏈之識別序列。因此，此等三肽序列中之任一者在抗體中的存在產生潛在性糖基化位點。O-連接之糖基化係指糖N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者附接至羥胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸(儘管亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸)。

向抗體構築體添加糖基化位點藉由改變胺基酸序列以使得其含有上述三肽序列中之一或多者而便利地實現(對於N連接之糖基化位點)。亦可藉由向起始序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或由其取代來進行改變(對於O連接之糖基化位點)。出於簡易性，抗體構築體之胺基酸序列較佳經由DNA水準改變，尤其藉由突變預選鹼基處編碼多肽之DNA以使得產生將轉譯為所要胺基酸之密碼子而改變。

增加抗體構築體上碳水化合物部分之數目的另一方式為藉由醣苷與蛋白質之化學或酶促偶合。此等程序為有利的，因為其不需要在具有糖基化能力之宿主細胞中產生蛋白質來進行N-連接型及O-連接糖基化。視所用偶合模式而定，糖可連接至(a)精胺酸及組胺酸，(b)游離羧基，(c)游離硫氫基，諸如半胱胺酸之硫氫基，(d)游離羥基，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之羥基，(e)芳族殘基，諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之芳族殘基，或(f)麩醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於WO 87/05330及Aplin及Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306頁中。

存在於起始抗體構築體上之碳水化合物部分之移除可以化學或酶促方式實現。化學去糖基化作用需要將蛋白質暴露於化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此處理使得除連接糖(N-乙醯葡萄胺糖或N-乙醯基半乳胺糖)外之大多數或所有糖裂解，而留下完整的多肽。化學去糖基化由Hakimuddin等人，1987,Arch.Biochem.Biophys. 259：52及Edge等人，1981,Anal.Biochem. 118：131描述。多肽上碳水化合物部分之酶促裂解可藉由使用如由Thotakura等人，1987,Meth.Enzymol.138：350所述之各種內醣苷酶及外醣苷酶來達成。在潛在性糖基化位點處之糖基化可藉由使用如由Duskin等人，1982,J.Biol.Chem.257：3105所述之化合物衣黴素阻止。衣黴素阻斷蛋白-N-醣苷鍵形成。

抗體構築體之其他修飾亦涵蓋於本文中。舉例而言，抗體構築體之另一類共價修飾包含將抗體構築體以美國專利第4,640,835號；第4,496,689號；第4,301,144號；第4,670,417號；第4,791,192號或第4,179,337號中所闡述之方式連接於各種非蛋白質聚合物，包括(但不限於)各種多元醇，諸如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物。另外，如此項技術中已知，胺基酸取代可在抗體構築體內之多個位置實現，例如以有助於添加諸如PEG之聚合物。

在一些實施例中，本發明抗體構築體之共價修飾包含添加一或多個標記。標記基團可經由各種長度之間隔臂與抗體構築體偶合以降低潛在位阻。標記蛋白之各種方法為此項技術中已知且可用於執行本發明。術語「標記」或「標記基團」係指任何可偵測標記物。一般而言，視偵測標記物之分析而定，其屬於多種類別-以下實例包括(但不限於)：

a)同位素標記，其可為放射性或重同位素，諸如放射性同位素或放射性核素(例如³ H、¹⁴ C、¹⁵ N、³⁵ S、⁸⁹ Zr、⁹⁰ Y、⁹⁹ Tc、¹¹¹ In、¹²⁵ I、¹³¹ I)

b)磁性標記(例如磁性粒子)

c)氧化還原活性部分

d)光學染料(包括(但不限於)發色團、磷光體及螢光團)，諸如螢光基團(例如FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系磷光體)、化學發光基團及可為「小分子」螢光或蛋白螢光之螢光團

e)酶學基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖、螢光素酶、鹼磷酸酶)

f)生物素標記基團

g)由二級報導子識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈配對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤等)

「螢光標記」意謂可經由固有螢光特性偵測之任何分子。合適之螢光標籤包含但(不限於)螢光素、若丹明、四甲基若丹明、伊紅、赤藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、Malacite綠、芪、螢光黃(Lucifer Yellow)、Cascade Blue J、德克薩斯紅(Texas Red)、IAEDANS、 EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、Oregon綠、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、Cascade Blue、Cascade Yellow及R-藻紅素(PE)(Molecular Probes,Eugene,OR)、FITC、若丹明及德克薩斯紅(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA)。適合光學染料(包括螢光團)描述於Richard P.Haugland之Molecular Probes Handbook中。

適合之蛋白螢光標記亦包括(但不限於)綠色螢光蛋白，包括GFP之海腎(Renilla)、海筆(Ptilosarcus)或多管水母(Aequorea)物種(Chalfie等人，1994,Science 263：802-805)、EGFP(Clontech Laboratories,Inc.,Genbank登錄號碼U55762)、藍色螢光蛋白(BFP,Quantum Biotechno-logies,Inc.1801 de Maisonneuve Blvd.West,8th Floor,Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9；Stauber,1998,Biotechniques 24：462-471；Heim等人，1996,Curr.Biol.6：178-182)、增強之黃色螢光蛋白(EYFP,Clontech Laboratories,Inc.)、螢光素酶(Ichiki等人，1993,J.Immunol.150：5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)及海腎(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利第5,292,658號；第5,418,155號；第5,683,888號；第5,741,668號；第5,777,079號；第5,804,387號；第5,874,304號；第5,876,995號；第5,925,558號)。

白胺酸拉鏈域為促進發現彼等之蛋白質之寡聚合的肽。白胺酸拉鏈最初在數種DNA結合蛋白中鑑別出(Landschulz等人，1988,Science 240：1759)，且此後曾在多種不同蛋白質中發現。已知之白胺酸拉鏈為二聚或三聚的天然存在之肽及其衍生物。適用於產生可溶性寡聚蛋白之白胺酸拉鏈域之實例描述於PCT申請案WO 94/10308中，且來源於肺表面活性蛋白D(SPD)之白胺酸拉鏈描述於Hoppe等人，1994,FEBSLetters 344：191中。經修飾之白胺酸拉鏈允許與其融合之異源蛋白穩定三聚合之用途描述於Fanslow等人，1994,Semin.Immunol.6：267-78中。在一種方法中，使包含FLT3抗體片段或衍生物與白胺酸拉鏈肽融合之重組融合蛋白表現於適合之宿主細胞中，且自培養物上清液回收所形成之可溶性寡聚FLT3抗體片段或衍生物。

本發明之抗體構築體亦可包含其他域，其例如有助於該分子之分離或與該分子之調適藥物動力學概況有關。有助於抗體構築體分離之域可選自肽基元(motives)或二次引入之部分，其可捕捉於分離方法(例如分離管柱)中。此類其他域之非限制性實施例包含如下肽基元，其稱為Myc標籤、HAT標籤、HA標籤、TAP標籤、GST標籤、甲殼素結合域(CBD標籤)、麥芽糖結合蛋白(MBP標籤)、Flag標籤、Strep標籤及其變異體(例如StrepII標籤)及His標籤。所有本文中所揭示之特徵在於鑑別之CDRs的抗體構築體較佳包含His-標籤域，其通常稱為在分子之胺基酸序列中之連續His殘基之重複序列，較佳五個，且更佳六個His殘基(六組胺酸)。His-標籤可位於例如抗體構築體之N或C端，較佳位於C端。六組胺酸標籤(HHHHHH)(SEQ ID NO：10)最佳經由肽鍵連接於本發明抗體構築體之C端。

本發明抗體構築體之第一結合域結合於目標細胞表面上之人類FLT3。人類FLT3之較佳胺基酸序列由NO：801、803、804及805表示。應瞭解，在本發明之上下文中，術語「表面上」意謂結合域特異性結合於包含在FLT3細胞外域內之抗原決定基(FLT3 ECD，參見SEQ ID NO：813)。因此，當本發明之第一結合域由天然表現細胞或細胞株及/或用FLT3轉型或(穩定/暫時)轉染之細胞或細胞株表現時，其較佳結合於FLT3。在一較佳實施例中，當FLT3用作諸如BIAcore或Scatchard之活體外結合分析中的「目標」或「配位體」分子時，第一結合域亦結合於FLT3。「目標細胞」可為其表面上表現FLT3之任何原核或真核細胞；目標細胞較佳為作為人體或動物體之一部分的細胞，諸如卵巢癌細胞、胰臟癌細胞、間皮瘤細胞、肺癌細胞、胃癌細胞及三陰性乳癌細胞。

術語「FLT3 ECD」係指基本上不含FLT3之跨膜及細胞質域的FLT3形式。熟習此項技術者應瞭解，針對本發明之FLT3多肽所鑑別之跨膜域依照此項技術中常規用於鑑別疏水性域類型之準則來鑑別。跨膜域之精確界限可變化，但最可能在本文中特定提及之域的任一端處變化不超過約5個胺基酸。較佳人類FLT3 ECD以SEQ ID NO：813展示。

人類FLT3之第一結合域的親和力較佳為20nM，更佳10nM，甚至更佳5nM，甚至更佳2nM，甚至更佳1nM，甚至更佳0.6nM，甚至更佳0.5nM，且最佳0.4nM。親和力可例如在BIAcore分析中或在Scatchard分析中加以量測，如例如實例中所述。測定親和力的其他方法為熟習此項技術者所熟知。

亦涵蓋本文所述之抗體構築體的胺基酸序列修飾。舉例而言，可需要改良抗體構築體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體構築體之胺基酸序列變異體藉由向抗體構築體核酸中引入適當核苷酸變化或藉由肽合成來製備。所有下述胺基酸序列修飾應產生仍保留未經修飾親本分子之所需生物活性(結合於FLT3及結合於CD3)的抗體構築體。

術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」通常係指具有技術公認定義之胺基酸，諸如選自由以下組成之群的胺基酸：丙胺酸(Ala或A)；精胺酸(Arg或R)；天冬醯胺(Asn或N)；天冬胺酸(Asp或D)；半胱胺酸(Cys或C)；麩醯胺酸(Gln或Q)麩胺酸(Glu或E)；甘胺酸(Gly或G)；組胺酸(His或H)；異白胺酸(He或I)；白胺酸(Leu或L)；離胺酸(Lys或 K)；甲硫胺酸(Met或M)；苯丙胺酸(Phe或F)；脯胺酸(Pro或P)；絲胺酸(Ser或S)；蘇胺酸(Thr或T)；色胺酸(Trp或W)；酪胺酸(Tyr或Y)；及纈胺酸(Val或V)，但可視需要使用經修飾、合成或罕見的胺基酸。一般而言，胺基酸可分組為具有非極性側鏈(例如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；帶負電側鏈(例如Asp、Glu)；帶正電側鏈(例如Arg、His、Lys)；或不帶電極性側鏈(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp及Tyr)。

胺基酸修飾包括例如缺失抗體構築體之胺基酸序列內的殘基及/或插入該等殘基中及/或取代該等殘基。進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為該最終構築體具有所需特徵。胺基酸變化亦可改變抗體構築體之轉譯後過程，諸如改變糖基化位點之數目或位置。

舉例而言，CDR中之每一者可插入或缺失1、2、3、4、5或6個胺基酸(當然，視其長度而定)，而FR中之每一者可插入或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸。較佳地，胺基酸序列插入物包括長度在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽變化的胺基及/或羧基端融合物，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入物。本發明抗體構築體之插入變異體包括與針對酶之抗體構築體之N端或C端之融合物或與延長抗體構築體之血清半衰期的多肽的融合物。

取代突變誘發之最受關注位點包括重鏈及/或輕鏈之CDR，尤其高變區，但亦涵蓋重鏈及/或輕鏈之FR改變。取代較佳為如本文所述之保守取代。較佳地，視CDR或FR之長度而定，可取代CDR中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸，而可取代構架區(FR)中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20或25個胺基酸。舉例而言，若CDR序列涵蓋6個胺基酸，則據設想此等胺基酸中之一者、兩者或三者經取代。類似地，若CDR序列涵蓋15功胺基酸，則可設想取代此等胺基酸中之一者、兩者、三者、四者、五者或六者。

鑑別抗體構築體中作為突變誘發之較佳位置的某些殘基或區之適用方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，其如Cunningham及Wells,Science,244：1081-1085(1989)所述。此處，抗體構築體內之殘基或目標殘基群經鑑別(例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且經中性或帶負電胺基酸(最佳丙胺酸或聚丙胺酸)置換以影響胺基酸與抗原決定基之相互作用。

隨後，藉由在取代位點處或為取代位點引入其他變異體以改進彼等證明對取代具有功能敏感性之胺基酸位置。因此，雖然預先確定引入胺基酸序列變化之位點或區，但突變本身之性質無需預先確定。舉例而言，為分析或最佳化既定位點之突變的效能，可在目標密碼子或區進行丙胺酸掃描或隨機突變誘發，且針對所需活性之最佳組合篩選所表現之抗體構築體變異體。在具有已知序列之DNA的預定位點處進行取代突變之技術為所熟知的，例如M13引子突變誘發及PCR突變誘發。使用抗原結合活性之分析(諸如FLT3或CD3結合)進行突變體之篩選。

一般而言，若取代重鏈及/或輕鏈之一或多個或全部CDR中之胺基酸，則較佳隨後獲得之「經取代」序列與「原始」CDR序列至少60%或65%、更佳70%或75%、甚至更佳80%或85%且尤佳90%或95%一致。此意謂其取決於CDR之達到與「經取代之」序列一致之程度的長度。舉例而言，具有5個胺基酸之CDR與其經取代之序列較佳80%一致以有至少一個胺基酸經取代。因此，抗體構築體之CDR可與其經取代之序列具有不同程度之一致性，例如CDRL1可具有80%，而 CDRL3可具有90%。

較佳取代(或置換)為保守取代。然而，可設想任何取代(包括非保守取代或下表1中所列之「例示性取代」中之一或多者)，只要抗體構築體保留其經由第一結合域結合於FLT3且經由第二結合域結合於CD3或CD3ε之能力及/或其CDR與隨後經取代序列具有一致性(與「原始」CDR序列至少60%或65%、更佳70%或75%、甚至更佳80%或85%、且尤其較佳90%或95%一致)即可。

保守取代以標題「較佳取代」展示於表1中。若此類取代引起生物活性變化，則可引入表1中稱為「例示性取代」或如下文提及胺基酸類別時之進一步描述的更實質變化且針對所要特徵篩選產物。

本發明抗體構築體之生物特性的實質改變藉由選擇取代實現，該等取代在其對維持(a)取代區域中多肽主鏈之結構，例如片或螺旋構形，(b)目標位點處分子之電荷或疏水性或(c)側鏈之體積的作用上顯著不同。天然存在之殘基基於常見側鏈特性分組：(1)疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)鹼性：asn、gin、his、lys、arg；(5)影響鏈取向之殘基：gly、pro；及(6)芳族：trp、tyr、phe。

非保守取代將必然伴有將此等類別中之一者之成員換成另一個類別。不參與維持抗體構築體之恰當構形之任何半胱胺酸殘基一般可經絲胺酸取代，以提高分子之氧化穩定性及防止異常交聯。反之，可在抗體中添加半胱胺酸鍵以改良其穩定性(尤其在抗體為諸如Fv片段之抗體片段的情況下)。

對於胺基酸序列，序列一致性及/或相似性藉由使用此項技術中已知的標準技術測定，包括(但不限於)Smith及Waterman,1981,Adv.Appl.Math. 2：482之局部序列一致性算法；Needleman及Wunsch,1970,J.Mol.Biol. 48：443之序列一致性比對算法；Pearson及Lipman,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A. 85：2444之相似性檢索方法；此等算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics軟體套件，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)；由Devereux等人，1984,Nucl.Acid Res. 12：387-395所述之最佳擬合序列程序，較佳使用預設或藉由檢查。較佳地，百分比一致性藉由FastDB基於以下參數計算：錯配罰分1；空隙罰分1；空隙尺寸罰分0.33；及接合罰分30，「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,」Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications，第127-149頁(1988),Alan R.Liss,Inc。

適用算法之一實例為PILEUP。PILEUP使用漸進式成對比對來產生一組相關序列之多序列比對。其亦可繪製展示用於產生比對之叢集關係的樹形圖。PILEUP使用Feng及Doolittle,1987,J.Mol.Evol. 35：351-360之漸進式比對方法之簡化方法；該方法類似於Higgins及Sharp,1989,CABIOS 5：151-153所述。適用PILEUP參數包括預設空隙權重3.00、預設空隙長度權重0.10及加權末端空隙。

適用演算法之另一實例為BLAST演算法，描述於：Altschul等人，1990,J.Mol.Biol. 215：403-410；Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res. 25：3389-3402；及Karin等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90：5873-5787中。特別適用之BLAST程序為WU-BLAST-2程序，其自Altschul等人，1996,Methods in Enzymology 266：460-480獲得。WU-BLAST-2使用數個檢索參數，其中之大多數設定成預設值。使用以下值設定可調節的參數：重疊間隔=1、重疊分數=0.125、詞閾值(T)=II。HSP S及HSP S2參數為動態值且藉由本身程式視特定序列之組成及相關序列檢索之特定資料庫之組成而確立；然而可調節該等值以提高敏感性。

另一適用算法為由Altschul等人，1993,Nucl.Acids Res. 25：3389-3402報導之空隙BLAST。空隙BLAST使用BLOSUM-62取代計分；臨限值T參數設定為9；雙擊法用於觸發無空隙延伸部分，電荷空隙長度k，代價為10+k；Xu設定為16，且Xg對於資料庫檢索階段設定為40且對於算法之輸出階段設定為67。空隙比對藉由對應於約22比特之分值觸發。

一般而言，個別變異體CDR之間的胺基酸同源性、類似性或一致性為本文所示之序列的至少60%，且更通常具有至少65%或70%之較佳增加之同源性或一致性，更佳至少75%或80%，甚至更佳至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，且幾乎100%。以類似方式，相對於本文所鑑別之結合蛋白的核酸序列的「核酸序列一致性百分比(%)」定義為候選序列中與抗體構築體之編碼序列中之核苷酸殘基一致的核苷酸殘基之百分比。特定方法使用設定為預設參數之WU-BLAST-2的BLASTN模組，其中重疊間隔及重疊分數分別設定為1及0.125。

一般而言，編碼個別變異體CDR之核苷酸序列與本文所示之核苷酸序列之間的核酸序列同源性、相似性或一致性為至少60%，且更通常具有至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的較佳增加之同源性或一致性，且幾乎100%。因此，「變異體CDR」為相對於本發明之親本CDR具有特定同源性、相似性或一致性的CDR，且享有包括(但不限於)親本CDR之特異性及/或活性的至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的生物功能。

一個實施例中，與本發明之抗體構築體之人類生殖系之一致性百分比為70%或75%，更佳80%或85%，甚至更佳90%，且最佳91%、92%、93%、94%、95%或甚至96%。參見實例8。與人類抗體生殖系基因產物之一致性被認為是在治療期間降低治療蛋白引起患者針對藥物之免疫反應之風險的重要特徵。Hwang及Foote(「Immunogenicity of engineered antibodies」；Methods 36(2005)3-10)證明藥物抗體構築體之非人類部分減少導致在治療期間誘導患者之抗藥物抗體的風險降低。藉由比較大量臨床上評估之抗體藥物及相應免疫原性資料，展示人類化抗體之V區使蛋白質之免疫原性(平均5.1%患者)低於帶有未改變之非人類V區之抗體(平均23.59%患者)的趨勢。因此，對於抗體構築體形式的基於V區之蛋白質療法，需要與人類序列具有較高程度的一致性。出於確定生殖系一致性之此目的，可使用Vector NTI軟體將VL之V區與人類生殖系V區段及J區段之胺基酸序列比對(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)，且胺基酸序列藉由將一致胺基酸殘基除以VL之胺基酸殘基之總數計算(%)。同樣可用於VH區段(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)，除了可能由於VH CDR3之高多樣性及缺乏現有人類生殖系VH CDR3比對搭配物而排除。可隨後使用重組技術提高與人類抗體生殖系基因之序列一致性。

在另一實施例中，本發明之雙特異性抗體構築體在標準研究規模條件下(例如在標準兩步純化方法中)展現高單體產量。較佳地，本發明抗體構築體之單體產量0.25mg/L上清液，更佳0.5mg/L，甚至更佳1mg/L，且最佳3mg/L上清液。

同樣，可測定二聚抗體構築體同功異型物之產量及因此抗體構築體之單體百分比(亦即單體：(單體+二聚體))。單體及二聚抗體構築體之生產率及所計算之單體百分比可例如在來自滾瓶中之標準化研究規模製備之培養物上清液的SEC純化步驟中獲得。在一個實施例中，抗體構築體之單體百分比為80%，更佳85%，甚至更佳90%，且最佳95%。

在一個實施例中，抗體構築體較佳血漿穩定性(有血漿下之EC50與無血漿下之EC50的比率)5或4，更佳3.5或3，甚至更佳2.5或2，且最佳1.5或1。抗體構築體之血漿穩定性可藉由將構築體在37℃下在人類血漿中培育24小時，之後在51鉻釋放細胞毒性分析中測定EC50來測試。細胞毒性分析中之效應細胞可為刺激性增濃之人類CD8陽性T細胞。目標細胞可為例如經人類FLT3轉染之CHO細胞。效應子與目標細胞(E：T)比率可選擇為10：1。用於此目的之人類血漿庫獲自藉由塗佈EDTA之注射器收集的健康供體之血液。藉由離心移除細胞組分，收集上部血漿相且隨後彙集。作為對照，稀釋抗體構築體，之後立即在RPMI-1640培養基中進行細胞毒性分析。血漿穩定性以EC50(血漿培育後)與EC50(對照)之比率的形式計算。參見實例13。

本發明抗體構築體之單體至二聚體之轉化率較佳為低的。轉化率可在不同條件下量測且藉由高效尺寸排阻層析分析。參見實例11。舉例而言，培育抗體構築體之單體同功異型物可在37℃下執行7天且在培育箱中達到例如100μg/ml或250μg/ml之濃度。在此等條件下，本發明抗體構築體展示二聚體百分比較佳5%，更佳4%，甚至更佳3%，甚至更佳2.5%，甚至更佳2%，甚至更佳1.5%，且最佳1%或0.5%，或甚至0%。

本發明之雙特異性抗體構築體亦較佳在多個凍/融循環後呈現極低二聚體轉化率。舉例而言，將抗體構築體單體例如在通用調配緩衝液中調節至250μg/ml之濃度且進行三個凍/融循環(在-80℃下冷凍30分鐘之後在室溫下融化30分鐘)，之後高效SEC以確定已轉化成二聚抗體構築體之最初單體抗體構築體之百分比。雙特異性抗體構築體例如在三個凍/融循環後之二聚體百分比為較佳5%，更佳4%，甚至更佳3%，甚至更佳2.5%，甚至更佳2%，甚至更佳1.5%，且最佳1%或0.5%。

本發明之雙特異性抗體構築體較佳展示聚集溫度45℃或50℃，更佳52℃或54℃，甚至更佳56℃或57℃，且最佳58℃或59℃下之有利熱穩定性。熱穩定性參數可如下依據抗體聚集溫度來確定：將濃度為250μg/ml之抗體溶液轉移至單次使用光析槽中且置放於動態光散射(DLS)裝置中。樣品以0.5℃/min之加熱速率由40℃加熱至70℃，不斷獲取量測半徑。使用指示蛋白熔融及聚集之半徑增加計算抗體之聚集溫度。參見實例12。

或者，溫度熔融曲線可藉由差示掃描熱量測定(DSC)確定，確定抗體構築體之固有生物物理學蛋白穩定性。此等實驗使用MicroCal LLC(Northampton,MA,U.S.A)VP-DSC器件執行。與僅含有調配緩衝液之樣品相比，自20℃至90℃記錄到含有抗體構築體之樣品的能量吸收。將抗體構築體例如在SEC操作緩衝液中調節至250μg/ml之最終濃度。為記錄相應熔融曲線，逐步提高整個樣品溫度。在各溫度T下，記錄樣品及調配緩衝液參考物之能量吸收。針對相應溫度標繪樣品減去參考物之能量吸收Cp(kcal/mol/℃)的差值。熔融溫度定義為能量吸收之第一最大值之溫度。

此外設想，本發明之FLT3xCD3雙特異性抗體構築體並不與(亦即基本上不結合於)人類FLT3旁系同源物KIT v1(SEQ ID NO：805)、CSF1R v1(SEQ ID NO：806)、PDGFRA(SEQ ID NO：807)及/或NTM v3(SEQ ID NO：808)交叉反應。此外設想，本發明之FLT3xCD3雙特異性抗體構築體並不與(亦即基本上不結合於)獼猴/食蟹獼猴FLT3旁系同源物KIT v1、CSF1R v1、PDGFRA及/或NTM v3交叉反應。參見實例7。

亦設想，本發明之FLT3 xCD3雙特異性抗體構築體之濁度(如在純化單體抗體構築體濃縮至2.5mg/ml且隔夜培育之後藉由OD340所量測)0.2，較佳0.15，更佳0.12，甚至更佳0.1，且最佳0.08。參見實例14。

在另一個實施例中，本發明之抗體構築體在酸性pH值下穩定。在非生理pH值(諸如pH 5.5，操作例如陽離子交換層析所需之pH值)下，抗體構築體表現得愈具有耐受性，相對於所負載之蛋白質之總量自離子交換管柱溶離之抗體構築體之回收率愈高。在pH 5.5下自離子(例如陽離子)交換管柱之抗體構築體回收率為較佳30%，更佳40%，更佳50%，甚至更佳60%，甚至更佳70%，甚至更佳80%，甚至更佳90%，甚至更佳95%且最佳99%。參見實例15。

此外設想，本發明之雙特異性抗體構築體展現治療功效或抗腫瘤活性。此可例如在以下晚期人類腫瘤異種移植模型之實例中所述的研究中評定：在研究之第1天，將人類FLT3陽性癌細胞株(例如OVCAR-8)之5×10⁶ 個細胞皮下注射於雌性NOD/SCID小鼠之背部右側。當平均腫瘤體積達到約100mm³ 時，將活體外擴增之人類CD3陽性T細胞移植於小鼠中，其藉由將約2×10⁷ 個細胞注射於動物之腹膜腔中達成。媒劑對照組1之小鼠不接受效應細胞且用作未移植對照來與媒劑對照組2(接受效應細胞)比較以監測單獨的T細胞對腫瘤生長之影響。抗體處理在平均腫瘤體積達到約200mm³ 時開始。處理開始之日各處理組之平均腫瘤尺寸不應在統計學上不同於任何其他組(方差分析)。小鼠藉由靜脈內快速注射用每日0.5mg/kg FLT3 xCD3雙特異性抗體構築體處理約15至20天。在研究期間藉由測徑規量測腫瘤且藉由組間比較腫瘤體積(TV)評估進展。藉由以T/C%=100×(分析組之中值TV)/(對照組2之中值TV)形式計算TV確定腫瘤生長抑制T/C[%]。

熟習此項技術者知曉如何修改或調整此研究之某些參數，諸如所注射腫瘤細胞之數目、注射位點、所移植人類T細胞之數目、欲投與之雙特異性抗體構築體之量及時刻表，而仍達成有意義且可再現之結果。較佳地，腫瘤生長抑制T/C[%]為70或60，更佳50或40，甚至更佳30或20且最佳10或5或甚至2.5。

本發明另外提供一種編碼本發明之抗體構築體的聚核苷酸/核酸分子。

聚核苷酸為由共價鍵結成鏈之13個或13個以上核苷酸單體構成的生物聚合物。DNA(如cDNA)及RNA(如mRNA)為具有獨特生物功能之聚核苷酸的實例。核苷酸為充當核酸分子(如DNA或RNA)之單體或次單位的有機分子。核酸分子或聚核苷酸可為雙股及單股、線性及環形的。其較佳包含於載體中，該載體較佳包含於宿主細胞中。該宿主細胞例如在用本發明之載體或聚核苷酸轉型或轉染後能夠表現抗體構築體。出於該目的，聚核苷酸或核酸分子與控制序列可操作地連接。

遺傳密碼為遺傳物質(核酸)內編碼之資訊轉譯成蛋白質所用之規則之組。活細胞中之生物學解碼藉由核糖體實現，核糖體使用tRNA分子運載胺基酸且同時讀取mRNA之三個核苷酸而以由mRNA規定之次序連接胺基酸。該代碼定義此等核苷酸三聯體(稱為密碼子)之序列如何規定在蛋白質合成期間隨後添加哪個胺基酸。核酸序列中三個核苷酸之密碼子規定單一胺基酸，但有一些例外情形。因為絕大部分基因用完全相同之代碼編碼，故此特定代碼通常稱為標準遺傳密碼。遺傳密碼決定既定編碼區之蛋白質序列，而其他基因組區可影響此等蛋白質產生之時間及位置。

此外，本發明提供一種載體，其包含本發明之聚核苷酸/核酸分子。

載體為用作將(外來)遺傳物質轉移至細胞中之運載工具的核酸分子。術語「載體」涵蓋(但不限於)質體、病毒、黏質體及人造染色體。一般而言，工程改造載體包含複製起點、多選殖位點及可選標記物。載體本身通常為核苷酸序列，通常DNA序列，其包含插入序列(轉殖基因)及充當載體之「主鏈」的較大序列。現今載體可包涵除轉殖基因插入序列及主鏈以外之其他特徵：啟動子、遺傳標記物、抗生素抗性序列、報導基因、靶向序列、蛋白質純化標籤。稱為表現載體(表現構築體)之載體特異於在目標細胞中表現轉殖基因，且通常具有控制序列。

術語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需之DNA序列。適於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。

核酸在其置放至與另一核酸序列具有功能關係時「可操作地連接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其與該多肽之DNA可操作地連接；若啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則其與該序列可操作地連接；或若核糖體結合位點經定位以便有助於轉譯，則其與編碼序列可操作地連接。一般而言，「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列相鄰且在分泌性前導序列之情況下，相鄰且在閱讀相(reading phase)中。然而，增強子不必為相鄰的。連接係藉由在適宜限制性位點處接合來實現。若此類位點不存在，則根據慣例使用合成寡核苷酸接附子或連接子。

「轉染」為向目標細胞中故意引入核酸分子或聚核苷酸(包括載體)的過程。該術語主要用於真核細胞中之非病毒方法。轉導通常用於描述病毒介導之核酸分子或聚核苷酸之轉移。動物細胞之轉染通常包括在細胞膜中打開短暫的孔或「洞」以使得可吸收物質。轉染可使用磷酸鈣、藉由電穿孔、藉由細胞擠壓或藉由混合陽離子脂質與物質產生脂質體(其與細胞膜融合且使其內部之負載沈積)來執行。

術語「轉型」用於描述核酸分子或聚核苷酸(包括載體)向細菌以及非動物真核細胞(包括植物細胞)中之非病毒轉移。因此，轉型為細菌或非動物真核細胞之基因改變，其由經由細胞膜自其環境直接吸收且隨後併入外源遺傳物質(核酸分子)引起。轉型可由人造方式實現。為使轉型發生，細胞或細菌必須處於感受態，其可隨著對環境條件(諸如饑餓及細胞密度)之時間限制性反應而發生。

此外，本發明提供一種用聚核苷酸/核酸分子或用本發明之載體轉型或轉染之宿主細胞。

如本文所用，術語「宿主細胞」或「受體細胞」意欲包括可為或具有編碼本發明抗體構築體之載體、外源核酸分子及聚核苷酸之受體；及/或抗體構築體本身之受體的任何個別細胞或細胞培養物。將各別物質引入細胞中借助於轉型、轉染及其類似方法執行。術語「宿主細胞」亦意欲包括單個細胞之後代或可能後代。因為後續代中由於天然、偶然或故意突變或由於環境影響可能發生某些修飾，故實際上此類後代可能不與親本細胞完全相同(形態或基因組或總DNA互補序列)，但仍包括在如本文所用之術語之範疇內。適合宿主細胞包括原核或真核細胞，而且包括(但不限於)細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞及動物細胞，諸如昆蟲細胞及哺乳動物細胞，例如鼠類、大鼠、獼猴或人類。

本發明之抗體構築體可在細菌中產生。表現後，本發明之抗體構築體以可溶性部分自大腸桿菌細胞漿料分離且可經由例如親和層析及/或尺寸排阻純化。可類似於純化例如CHO細胞中表現之抗體之方法來進行最終純化。

除原核生物以外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)為本發明之抗體構築體的適合選殖或表現宿主。在低級真核宿主微生物中最常使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )或普通麵包酵母。然而，多種其他屬、種及菌株通常可用且適用於本文，諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )；克魯維酵母屬(Kluyveromyce)宿主，諸如乳酸克魯維酵母(K.lactis )、脆壁克魯維酵母(K.fragilis )(ATCC 12424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus )(ATCC 16045)、威克克魯維酵母(K.wickeramii )(ATCC 24178)、克魯維雄酵母(K.waltii )(ATCC 56500)、果妮克魯維酵母(K.drosophilarum )(ATCC 36906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans )及馬克斯克魯維酵母(K.marxianus )；耶氏酵母屬(yarrowia)(EP 402 226)；甲醇酵母(Pichia pastoris )(EP 183 070)；假絲酵母屬(Candida)；里氏木黴(Trichoderma reesia )(EP 244 234)；粗厚神經胞子菌(Neurospora crassa )；施氏酵母屬(Schwanniomyce)，諸如西方施氏酵母(Schwanniomyces occidentalis )；及絲狀真菌，諸如紅黴菌屬(Neurospora)、青黴菌屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)及麴菌屬(Aspergillus)宿主，諸如構巢麯黴(A.nidulans )及黑麯黴(A.niger )。

用於表現本發明之糖基化抗體構築體之適合宿主細胞來源於多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別多種桿狀病毒株及變異體以及來自諸如草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti )(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus )(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster )(果蠅)及家蠶(Bombyx mori )之宿主的相應許可昆蟲宿主細胞。用於轉染之多種病毒株公開可得，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica )NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5病毒株，且根據本發明此類病毒可用作本文中之病毒，尤其用於轉染草地黏蟲細胞。

棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、芥菜及菸草之植物細胞培養物亦可用作宿主。適用於在植物細胞培養物中產生蛋白質之選殖及表現載體為熟習此項技術者已知。參見例如Hiatt等人，Nature(1989)342：76-78，Owen等人(1992)Bio/Technology 10：790-794，Artsaenko等人(1995)The Plant J 8：745-750，及Fecker等人(1996)Plant Mol Biol 32：979-986。

然而，脊椎動物細胞最受關注，且脊椎動物細胞於培養物(組織培養物)中之繁殖已成為常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為由SV40轉型之猴腎臟CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎株(次選殖以用於在懸浮培養物中生長之293或293細胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell，TM4，Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎臟細胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝臟細胞(buffalo rat liver cell，BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，1413 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL5 1)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y Acad.Sci.(1982)383：44-68)；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌株(Hep G2)。

在另一個實施例中，本發明提供一種產生本發明抗體構築體之方法，該方法包含在使得本發明之抗體構築體表現之條件下培養本發明之宿主細胞，及自培養物回收產生之抗體構築體。

如本文所用，術語「培養」係指在適合條件下在培養基中活體外維持細胞、使其分化、生長、增殖及/或繁殖。術語「表現」包括參與制備本發明抗體構築體之任何步驟，包括(但不限於)轉錄、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後修飾及分泌。

當使用重組技術時，抗體構築體可於細胞內、周質間隙中產生或直接分泌於培養基中。若抗體構築體於細胞內產生，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾移除宿主細胞或已溶解片段之顆粒碎片。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述分離分泌至大腸桿菌之周質間隙的抗體的程序。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯基氟(PMSF)存在下經約30min融化細胞漿料。可藉由離心移除細胞碎片。在抗體分泌至培養基中之情況下，通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮此類表現系統之上清液。任一個前述步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白分解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。

自宿主細胞製備之本發明之抗體構築體可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析回收或純化。亦可視欲回收抗體而利用其他用於蛋白質純化之技術，諸如離子交換管柱分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析、肝素SEPHAROSE^TM 層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)層析、層析聚焦、SDS-PAGE 及硫酸銨沈澱。若本發明之抗體構築體包含CH3域，則Bakerbond ABX樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)適用於純化。

親和層析為較佳純化技術。附接親和配位體之基質最常為瓊脂糖，但其他基質為可用的。與用瓊脂糖可達成之流動速率及處理時間相比，機械穩定性基質(諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)流動速率更快且處理時間更短。

此外，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之抗體構築體或根據本發明方法產生之抗體構築體。對於本發明之醫藥組合物，抗體構築體之均質性較佳為80%，更佳81%、82%、83%、84%或85%，更佳86%、87%、88%、89%或90%，又更佳91%、92%、93%、94%或95%，且最佳96%、97%、98%或99%。

如本文所用，術語「醫藥組合物」係關於適用於向患者(較佳人類患者)投與之組合物。本發明之尤其較佳的醫藥組合物包含較佳治療有效量之一種或複數種本發明之抗體構築體。較佳地，醫藥組合物另外包含一或多種(醫藥學上有效之)載劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、界面活性劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑的適合調配物。組合物可接受之組分較佳在所採用之劑量及濃度下對受體無毒性。本發明之醫藥組合物包括(但不限於)液體、冷凍及凍乾組合物。

本發明組合物可包含醫藥學上可接受之載劑。一般而言，如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」意謂與醫藥投與(詳言之非經腸投與)相容之任何及全部水性及非水性溶液、無菌溶液、溶劑、緩衝液(例如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溶液)、水、懸浮液、乳液(諸如油/水乳液)、各種類型之濕潤劑、脂質體、分散培養基及包衣。此類介質及試劑在醫藥組合物中之用途為此項技術中所熟知的，且包含此類載劑之組合物可藉由眾所周知的習知方法調配。

某些實施例提供包含本發明之抗體構築體及另外一或多種賦形劑(諸如此部分及本文別處中所說明性描述之賦形劑)的醫藥組合物。在此方面，賦形劑在本發明中可用於廣泛多種目的，諸如調節調配物之物理、化學或生物特性，諸如調節黏度及或本發明之方法以改良有效性及或穩定此類調配物及針對由於例如在製造、運送、儲存、使用前製備、投與及此後期間出現的應力而降解及腐敗的方法。

在某些實施例中，醫藥組合物可含有調配物材料以用於調節、維持或保持例如組合物的pH值、容積滲透濃度、黏度、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透的目的(參見REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，(A.R.Genrmo編),1990,Mack Publishing Company)。在此類實施例中，適合之調配物材料可包括(但不限於)：●胺基酸，諸如甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、蘇胺酸、脯胺酸、2-苯丙胺酸，包含帶電胺基酸，較佳離胺酸、乙酸離胺酸、精胺酸、麩胺酸及/或組胺酸；●抗菌劑，諸如抗細菌劑及抗真菌劑；●抗氧化劑，諸如抗壞血酸、甲硫胺酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉；●緩衝液、緩衝系統及緩衝劑，其用於使組合物維持在生理pH值或略微較低的pH值下，通常在約5至約8或9之pH值範圍內；緩衝劑之實例為硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸、丁二酸鹽、磷酸鹽、組胺酸及乙酸鹽；例如約pH 7.0-8.5之Tris緩衝液或約pH 4.0-5.5之乙酸鹽緩衝液；●非水性溶劑，諸如丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)；●水性載劑，包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質；●可生物降解聚合物，諸如聚酯；●增積劑，諸如甘露醇或甘胺酸；●螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；●等滲及吸收延遲劑；●複合劑，諸如咖啡鹼、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；●填充劑；●單醣；雙醣；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；碳水化合物可為非還原糖，較佳海藻糖、蔗糖、八硫酸鹽、山梨糖醇或木糖醇；●(低分子量)蛋白質、多肽或蛋白質載劑，諸如人類或牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白，較佳來源於人類；●著色劑及調味劑；●含硫還原劑，諸如麩胱甘肽、硫辛酸、硫乙醇酸鈉、硫代甘油、[α]-單硫代甘油及硫代硫酸鈉；●稀釋劑；●乳化劑；●親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮)；●成鹽相對離子，諸如鈉；●防腐劑，諸如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及其類似物；實例為：氯化苯甲烴銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙基醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)；●金屬複合物，諸如Zn-蛋白質複合物；●溶劑及共溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)； ●糖及糖醇，諸如海藻糖、蔗糖、八硫酸鹽、甘露醇、山梨糖醇或木糖醇水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、丙三醇、環醇(例如肌醇)、聚乙二醇；及多元糖醇；●懸浮劑；●界面活性劑或濕潤劑，諸如普朗尼克(pluronic)、PEG、脫水山梨醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、曲拉通(triton)、緩血酸胺、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal)；界面活性劑可為分子量較佳>1.2KD之清潔劑及/或分子量較佳>3KD之聚醚；較佳清潔劑之非限制性實例為Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80及Tween 85；較佳聚醚之非限制性實例為PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000及PEG 5000；●穩定性增強劑，諸如蔗糖或山梨糖醇；●張力增強劑，諸如鹼金屬鹵化物(較佳氯化鈉或氯化鉀)、甘露醇山梨糖醇；●非經腸遞送媒劑，包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏溶液或不揮發性油；●靜脈內遞送媒劑，包括液體及養分補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖之補充劑)。

對於熟習此項技術者顯而易見的是醫藥組合物之不同組分(例如以上列出之組分)可具有不同效應，例如胺基酸可充當緩衝劑、穩定劑及/或抗氧化劑；甘露醇可充當增積劑及/或張力增強劑；氯化鈉可充當遞送媒劑及/或張力增強劑；等。

設想，除本文所定義之本發明多肽之外，本發明之組合物可包含其他生物學活性劑，視組合物之預期用途而定。此類藥劑可為作用於胃腸系統之藥物、充當細胞生長抑制劑之藥物、預防高尿酸血之藥物、抑制免疫反應之藥物(例如皮質類固醇)、調節發炎性反應之藥物、作用於循環系統之藥物及/或諸如此項技術中已知的細胞激素之藥劑。亦設想，本發明之抗體構築體應用於共同療法，亦即與另一抗癌藥劑組合。

在某些實施例中，最佳醫藥組合物將由熟習此項技術者根據例如預定投藥途徑、傳遞形式及所需劑量來確定。參見例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上。在某些實施例中，此類組合物可影響本發明之抗體構築體的物理狀態、穩定性、活體內釋放率及活體內清除率。在某些實施例中，醫藥組合物中之主要媒劑或載劑本質上可為水性或非水性的。舉例而言，適合的媒劑或載劑可為注射用水、生理鹽水溶液或人造腦脊髓液，其中可能補充有供非經腸投與之組合物中所常見之其他物質。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合之鹽水為另外的例示性媒劑。在某些實施例中，本發明之抗體構築體組合物可藉由使所選具有所需純度的組合物與視情況選用之調配劑(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)以凍乾塊或水溶液形式混合而製備以便儲存。另外，在某些實施例中，本發明之抗體構築體可使用適當賦形劑(諸如蔗糖)調配為凍乾物。

當涵蓋非經腸投與時，本發明所用的治療性組合物可以在醫藥學上可接受之媒劑中包含所需本發明之抗體構築體的無熱原質、非經腸可接受之水溶液形式提供。特別適用於非經腸注射之媒劑為無菌蒸餾水，本發明之抗體構築體在其中調配為無菌、等張溶液，恰當保存。在某些實施例中，製備可涉及所需分子與諸如可注射微球、生物易侵蝕粒子、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體之試劑一起調配，該試劑可提供可經由積存注射傳遞之產物的受控或持續釋放。在某些實施例中，亦可使用玻尿酸，其具有促進循環之持久性持續的作用。在某些實施例中，可使用可植入藥物遞送裝置以引入所需抗體構築體。

額外醫藥組合物對熟習此項技術者將為顯而易見的，包括在持續或受控遞送/釋放調配物中包括本發明之抗體構築體的調配物。用於調配多種其他持續或受控遞送方式(諸如脂質體載劑、生物可侵蝕微粒或多孔珠粒及儲槽式注射劑)的技術亦為熟習此項技術者所知。參見例如國際專利申請案第PCT/US93/00829號，其描述用於遞送醫藥組合物之多孔聚合物微粒的受控釋放。持續釋放製劑可包括呈成形製品(例如膜或微囊)形式之半滲透性聚合物基質。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸交酯(如美國專利第3,773,919號及歐洲專利申請公開案第EP 058481號中所揭示)、L-麩胺酸及L麩胺酸γ-乙酯之共聚物(Sidman等人，1983,Biopolymers 2：547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981,J.Biomed.Mater.Res.15：167-277及Langer,1982,Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，1981，同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開案第EP 133,988號)。持續釋放組合物亦可包括可藉由此項技術中已知之若干方法中之任一者製備之脂質體。參見例如Eppstein等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；歐洲專利申請公開案第EP 036,676號；第EP 088,046號及第EP 143,949號。

抗體構築體亦可包覆於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(分別例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Oslo,A.編，(1980)中。

用於活體內投與之醫藥組合物通常以無菌製劑形式提供。可藉由經由無菌過濾膜過濾來實現滅菌。當組合物經凍乾時，使用此方法之滅菌可在凍乾及復原之前或之後進行。用於非經腸投與之組合物可以凍乾形式或溶液形式儲存。一般將非經腸組合物置放於具有無菌取孔(access port)之容器中，例如具有可藉由皮下注射針穿透之塞子之靜脈溶液袋或小瓶。

本發明之另一個態樣包括本發明抗體構築體之自動緩衝調配物，其可用作醫藥組合物，如國際專利申請案WO 06138181A2(PCT/US2006/022599)中所述。可獲得關於蛋白質穩定及調配物材料及適用於此方面之方法的多種闡述，諸如Arakawa等人，「Solvent interactions in pharmaceutical formulations」,Pharm Res.8(3)：285-91(1991)；Kendrick等人，「Physical stabilization of proteins in aqueous solution」,RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS：THEORY AND PRACTICE,Carpenter及Manning編，Pharmaceutical Biotechnology.13：61-84(2002)及Randolph等人，「Surfactant-protein interactions」,Pharm Biotechnol.13：159-75(2002)，特別參見與賦形劑及其用於本發明之自動緩衝蛋白質調配物之方法切合的部分，尤其關於蛋白質醫藥產品及用於獸醫學及/或人類醫學用途之方法。

鹽可根據本發明之某些實施例用於例如調節調配物之離子強度及/或等張性及/或改良本發明組合物之蛋白質或其他成分的溶解性及/或物理穩定性。眾所周知，離子可藉由結合於蛋白表面上之帶電殘基及藉由遮蔽蛋白中之帶電及極性基團且減小其靜電相互作用、吸引及排斥相互作用的強度而使天然狀態之蛋白穩定。離子亦可藉由結合於詳言之蛋白質之變性肽鍵(--CONH)而使變性狀態之蛋白穩定。此外，離子與蛋白中之帶電基團及極性基團的相互作用亦可減小分子間靜電相互作用，由此預防或減少蛋白凝聚及不可溶性。

離子種類在其對蛋白之效應方面有顯著差異。已完善可用於調配本發明之醫藥組合物的許多類別等級的離子及其對蛋白之效應。一個實例為霍夫梅斯特序列(Hofmeister series)，其藉由對蛋白在溶液中之構形穩定性的效應排列離子及極性非離子溶質。使溶質穩定稱為「親液的」。使溶質去穩定化稱為「離液的(chaotropic)」。親液劑通常在高濃度(例如>1莫耳濃度硫酸銨)下使用以使蛋白自溶液沈澱(「鹽析」)。離液劑通常用於使蛋白變性及/或溶解(「鹽溶」)。離子對「鹽溶」及「鹽析」之相對有效性定義其在霍夫梅斯特序列中之位置。

游離胺基酸可在根據本發明之各種實施例之本發明之抗體構築體調配物中用作增積劑、穩定劑及抗氧化劑以及其他標準用途。離胺酸、脯胺酸、絲胺酸及丙胺酸可用於使調配物中之蛋白穩定。甘胺酸適用於凍乾以確保正確凍乾塊結構及特性。精胺酸可適用於在液體及凍乾調配物中抑制蛋白凝聚。甲硫胺酸適用作抗氧化劑。

多元醇包括糖，例如甘露糖醇、蔗糖及山梨糖醇及諸如丙三醇及丙二醇之多元醇及(出於本文論述之目的)聚乙二醇(PEG)及相關之物質。多元醇為親液的。其為在液體及凍乾調配物中適用的穩定劑，保護蛋白質免受物理及化學降解過程。聚醇亦適用於調節調配物之張力。適用於本發明之所選實施例的聚醇為甘露醇，常用於確保凍乾調配物中凍乾塊之結構穩定性。其確保凍乾塊之結構穩定性。其一般與凍乾保護劑(例如蔗糖)一起使用。山梨糖醇及蔗糖為當中用於調節張力之較佳藥劑且充當在運輸期間避免凍融應力或在製造過程期間避免製備塊體的穩定劑。還原糖(其含有游離醛基或酮基)，諸如葡萄糖及乳糖，可使表面離胺酸及精胺酸殘基糖化。因此，其一般不在根據本發明使用之較佳多元醇當中。另外，形成此類反應物質之糖，諸如在酸性條件下水解成果糖及葡萄糖且因此引起糖基化之蔗糖，在此方面亦不在本發明之較佳多元醇當中。PEG適用於使蛋白質穩定其充當低溫保護劑且在此方面可用於本發明。

本發明之抗體構築體調配物的實施例另外包含界面活性劑。蛋白分子可易於吸附於表面上及變性且隨後在氣-液、固-液及液-液界面凝聚。此等效應一般與蛋白濃度成反比。此等有害相互作用一般與蛋白濃度成反比且通常藉由諸如在產品運送及操作期間產生的物理攪動而加劇。界面活性劑常規用於預防、最小化或減少表面吸附。在此方面，本發明中適用之界面活性劑包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脫水山梨醇聚乙氧基化物之其他脂肪酸酯及泊洛沙姆188(poloxamer 188)。界面活性劑亦常用於控制蛋白構形穩定性。在此方面，界面活性劑之用途具有蛋白特異性，因為任何既定界面活性劑通常將使一些蛋白穩定且使其他蛋白去穩定化。

聚山梨醇酯易於氧化降解且常常在供應時含有足夠數量的過氧化物以引起蛋白殘基側鏈(尤其甲硫胺酸)氧化。因此，聚山梨醇酯應謹慎使用且當使用時，應在其最低有效濃度下使用。在此方面，聚山梨醇酯例示賦形劑應以其最低有效濃度使用的通用規則。

本發明之抗體構築體調配物的實施例另外包含一或多種抗氧化劑。在一定程度上，可藉由維持適當含量之環境氧氣及溫度及藉由避免曝光而在醫藥調配物中預防蛋白的有害氧化。抗氧化劑賦形劑亦可用於預防蛋白的氧化降解。在此方面，適用之抗氧化劑為還原劑、氧氣/自由基清除劑及螯合劑。適用於本發明之治療性蛋白質調配物的抗氧化劑較佳為水溶性的且在產品之整個存放期中維持其活性。在此方面，EDTA為本發明之較佳抗氧化劑。抗氧化劑可能損傷蛋白。舉例而言，還原劑(詳言之，諸如麩胱甘肽)可破壞分子內二硫鍵。因此，選擇適用於本發明之抗氧化劑以尤其消除或充分降低其自身損傷調配物中之蛋白的可能性。

本發明之調配物可包括金屬離子，其為蛋白輔助因子且為形成蛋白配位複合物所需，諸如形成某些胰島素懸浮液所需的鋅。金屬離子亦可抑制一些降解蛋白之過程。然而，金屬離子亦催化降解蛋白之物理及化學過程。鎂離子(10-120mM)可用於抑制天冬胺酸異構化成異天冬胺酸。Ca⁺² 離子(至多100mM)可增加人類去氧核糖核酸醇之穩定性。然而，Mg⁺² 、Mn⁺² 及Zn⁺² 可使rhDNase去穩定化。類似地，Ca⁺² 及Sr⁺² 可使因子VIII穩定，因子VIII可藉由Mg⁺² 、Mn⁺² 及Zn⁺² 、Cu⁺² 及Fe⁺² 去穩定化，且其凝聚可藉由Al⁺³ 離子增加。

本發明之抗體構築體調配物的實施例另外包含一或多種防腐劑。當研發多劑量非經腸調配物涉及多於一次自相同容器提取時，需要防腐劑。其主要功能為抑制微生物生長且在整個存放期或藥品使用時期確保產品無菌性。常用防腐劑包括苯甲醇、苯酚及間甲酚。雖然防腐劑具有與小分子注射劑一起使用的較長歷史，但研發包括防腐劑之蛋白調配物可具有挑戰性。防腐劑幾乎始終具有對蛋白之去穩定化效應(凝聚)且此已變成限制其在多劑量蛋白調配物中使用的主要因素。迄今，已調配大多數蛋白藥物僅用於單次使用。然而，當多劑量調配物為可能的時，其具有使得患者能夠方便且增加可銷售性的附加優勢。良好實例為人類生長激素(hGH)，其中防腐調配物的研發已使得更加方便的多次使用注射筆呈現商業化。目前市場上可獲得至少四種含有hGH防腐調配物的此類筆裝置。Norditropin(液體，Novo Nordisk)、Nutropin AQ(液體，Genentech)及Genotropin(凍乾--雙腔藥筒，Pharmacia & Upjohn)含有苯酚，而Somatrope(Eli Lilly)與間甲酚一起調配。在防腐劑型之調配及研發期間需要考慮數個態樣。藥品中之有效防腐劑濃度必須經最佳化。此需要測試劑型中之既定防腐劑，使得濃度範圍賦予抗微生物有效性而不損害蛋白穩定性。

如可預期，研發含有防腐劑之液體調配物比凍乾調配物更具挑戰性。凍乾產品可在無防腐劑的情況下凍乾且在使用時用含有防腐劑之稀釋劑復原。此縮短防腐劑與蛋白接觸的時間，使相關穩定性風險顯著減至最小。在液體調配物之情況下，應經整個產品存放期(約18至24個月)維持防腐劑有效性及穩定性。注意的重點為防腐劑有效性應展現在含有活性藥物及全部賦形劑組分之最終調配物中。

本文中所揭示之抗體構築體亦可調配為免疫脂質體。「脂質體」為由各種類型之脂質、磷脂及/或適用於遞送藥物至哺乳動物之界面活性劑組成之小微脂粒。脂質體之組分通常排列為雙層形式，類似於生物膜之脂質排列。含有抗體構築體之脂質體藉由此項技術中已知之方法製備，諸如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,77：4030(1980)；美國專利第4,485,045號及第4,544,545號；及W0 97/38731中所述之方法。循環時間增加之脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。尤其適用之脂質體可藉由逆相蒸發法用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生化之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物產生。脂質體經具有界定孔徑之過濾器擠出以產生具有所要直徑之脂質體。本發明之抗體構築體的Fab'片段可如Martin等人J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述經由二硫鍵互換反應與脂質體結合。脂質體內視情況含有化學治療劑。參見Gabizon等人J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。

醫藥組合物一經調配，即可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體或脫水或凍乾粉末形式儲存於無菌小瓶中。此類調配物可以即用形式或在投與前復原之形式(例如凍乾形式)儲存。

本文所定義之醫藥組合物的生物活性可例如藉由細胞毒性分析確定，如以下實例、WO 99/54440或由Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.20(2005),1-12)中所述。如本文所用之「功效」或「活體內功效」係指使用例如標準化NCI反應準則對藉由本發明之醫藥組合物之療法的反應。使用本發明之醫藥組合物之療法的功效或活體內功效指代用於其預期目的之組合物之有效性，亦即組合物引起其所需效應(亦即病理性細胞，例如腫瘤細胞之耗盡)的能力。活體內功效可藉由對相應疾病實體建立之標準方法來監測，包括(但不限於)白血球計數、差異、螢光活化細胞分選、骨髓抽吸。另外，可使用各種疾病特異性臨床化學參數及其他已建立之標準方法。此外，可使用電腦輔助斷層攝影術、X射線、核磁共振斷層攝影術(例如用於基於國家癌症學會準則之反應評定[Cheson BD,Horning SJ,Coiffier B,Shipp MA,Fisher RI,Connors JM,Lister TA,Vose J,Grillo-Lopez A,Hagenbeek A,Cabanillas F,Klippensten D,Hiddemann W,Castellino R,Harris NL,Armitage JO,Carter W,Hoppe R,Canellos GP.Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas.NCI Sponsored International Working Group.J Clin Oncol.1999年4月；17(4)：1244])、正電子發射斷層攝影掃描、白血球計數、差異、螢光活化細胞分選、骨髓抽吸、淋巴結活檢/組織學及各種淋巴瘤特異性臨床化學參數(例如乳酸脫氫酶)及其他已建立之標準方法。

藥物(諸如本發明之醫藥組合物)之研發中的另一個主要難題為藥物動力學特性之可預測調節。為此目的，可形成候選藥物之藥物動力學概況，亦即影響特定藥物治療給定病狀之能力之藥代動力學參數之概況。影響藥物治療一定疾病實體之能力的藥物之藥物動力學參數包括(但不限於)：半衰期、分佈體積、肝首過代謝及血清結合程度。給定藥劑之功效可受上文所提及之參數中之每一者影響。

「半衰期」意謂50%投與藥物經由(例如)代謝、排泄等之生物過程消除之時間。由「肝首過代謝」意謂在藥物首次與肝接觸之後，亦即在其首次穿過肝期間傾向代謝。「分佈體積」意謂遍及身體之多個隔室(例如細胞內及細胞外間隙、組織及器官等)中藥物之保留程度及藥物在此等隔室內之分佈。「血清結合程度」意謂藥物與血清蛋白(諸如白蛋白)相互作用且結合導致藥物之生物活性降低或損失之傾向。

藥物動力學參數亦包括給定量的投與藥物之生物可用性、滯後時間(Tlag)、Tmax、吸收速率、更加起效及/或Cmax。「生物可用性」意謂藥物在血液隔室中之量。「滯後時間」意謂藥物投藥與其在血液或血漿中之偵測及可測性之間的時間延遲。「Tmax」為達到藥物最大血液濃度後的時間，且「Cmax」為使用既定藥物最大限度獲得的血液濃度。達到藥物生物效果所需的藥物之血液或組織濃度之時間受所有參數影響。雙特異性抗體構築體展現跨物種特異性之藥物動力學參數可如上文所概述在非黑猩猩靈長類動物之臨床前動物測試中測定，亦闡述於例如Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.20(2005),1-12)之出版物中。

一個實施例提供本發明之抗體構築體或根據本發明方法產生之抗體構築體，用於預防、治療或改善血液癌症疾病或轉移性癌症疾病。

本文所述之調配物適用作治療、改善及/或預防有需要之患者之如本文所述之病理性醫學病狀的醫藥組合物。術語「治療」係指治療性治療及預防性或防治性措施。治療包括將調配物施用或投與來自患有疾病/病症、具有疾病/病症之症狀或易患疾病/病症之患者之身體、分離組織或細胞，目的為治癒、癒合、緩解、減輕、改變、補救、改善、改良或影響疾病、疾病症狀或疾病之傾向。

如本文所用，術語「改善」係指藉由向有需要之個體投與本發明之抗體構築體使患有如下文所說明之腫瘤或癌症或轉移性癌症之患者的疾病病況之任何改良。此改良亦可視為患者之腫瘤或癌症或轉移性癌症的進程減緩或停止。如本文所用，術語「預防」意謂藉由向有需要之個體投與本發明之抗體構築體避免出現或再出現患有如下文所說明之腫瘤或癌症或轉移性癌症之患者。

術語「疾病」係指可受益於用本文所述之抗體構築體或醫藥組合物治療之任何病狀。其包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易患所述疾病之該等病理病狀。

「贅瘤」為組織之異常生長，通常會但未必總會形成腫塊。當亦形成腫塊時，一般稱為「腫瘤」。贅瘤或腫瘤可為良性的、潛在惡性的(癌前)或惡性的。惡性贅瘤一般稱為癌症。其通常侵入且破壞周圍組織且可形成轉移，亦即其擴展至身體之其他部分、組織或器官。因此，術語「轉移性癌症」涵蓋轉移至原始腫瘤以外之其他組織或器官。淋巴瘤及白血病為淋巴贅瘤。出於本發明之目的，彼等亦由術語「腫瘤」或「癌症」涵蓋。

在本發明之一個較佳具體實例中，血液癌症疾病為AML且轉移性癌症疾病可源於前述疾病。

較佳與本發明有關之腫瘤或癌症疾病係選自由以下組成之群：乳癌、類癌瘤、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、胃癌、頭頸癌、間皮瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、腎癌及胃癌。更佳地，腫瘤或癌症疾病(較佳為實體腫瘤疾病)可選自由以下組成之群：卵巢癌、胰臟癌、間皮瘤、肺癌、胃癌及三陰性乳癌。轉移性癌症疾病可源自前述疾病中之任一者。

本發明亦提供一種用於治療或改善血液癌症疾病或轉移性癌症疾病之方法，其包含向有需要之個體投與本發明之抗體構築體或根據本發明方法產生之抗體構築體的步驟。

術語「有需要之個體」或「需要治療之個體」包括已患病症之個體以及預防病症之個體。有需要之個體或「患者」包括接受預防性或治療性治療之人類及其他哺乳動物個體。

本發明之抗體構築體通常經設計而尤其具有一定範圍之生物可用性及持久性以用於特定投藥途徑及方法、特定投藥劑量及頻率、特定疾病之特定治療。組合物之材料較佳以投藥位點可接受之濃度調配。

因此，可根據本發明設計調配物及組合物以藉由任何適合之投藥途徑遞送。在本發明之上下文中，投藥途徑包括(但不限於)●局部途徑(諸如經上表皮、吸入、經鼻、經眼、經耳、經陰道、經黏膜)；●腸內途徑(諸如經口、經胃腸、舌下、唇下、經頰、經直腸)；及●非經腸途徑(諸如靜脈內、動脈內、骨內、肌肉內、腦內、腦室內、硬膜外、鞘內、皮下、腹膜內、羊膜外、關節內、心內、皮內、病灶內、子宮內、膀胱內、玻璃體內、經皮、鼻內、經黏膜、滑膜內、邊緣內)。

本發明之醫藥組合物及抗體構築體尤其適用於非經腸投藥，例如皮下或靜脈內傳遞，例如藉由注射(諸如快速注射)，或藉由輸注(諸如連續輸注)。醫藥組合物可使用醫療器件投與。用於投與醫藥組合物之醫療裝置的實例描述於美國專利第4,475,196號；第4,439,196號；第4,447,224號；第4,447,233號；第4,486,194號；第4,487,603號；第4,596,556號；第4,790,824號；第4,941,880號；第5,064,413號；第5,312,335號；第5,312,335號；第5,383,851號及第5,399,163號中。

詳言之，本發明提供適合組合物之不間斷投與。作為非限制性實例，不間斷或大體上不間斷，亦即連續投與可藉由患者帶有之小泵系統計量治療劑向患者身體中之流入來實現。包含本發明抗體構築體之醫藥組合物可藉由使用該等泵系統投與。此類泵系統通常為此項技術中已知，且通常依賴於定期更換容納欲輸注治療劑之濾筒。在更換此類泵系統中之濾筒時，可繼而暫時中斷治療劑向患者身體之流動，否則該流動為不間斷的。在此情況下，在本發明之醫藥手段及方法之含義內，濾筒更換前之投藥階段及濾筒更換後之投藥階段仍認為一起構成此類治療劑之一次「不間斷投與」。

連續或不間斷投與本發明之抗體構築體可為靜脈內或皮下投與，其借助於包括用於驅使流體離開儲集器之流體驅動機構及用於致動驅動機構之致動機構的流體傳遞器件或小泵系統。用於皮下投與之泵系統可包括用於穿過患者皮膚且向患者身體傳遞適合組合物之針或導管。該等泵系統可直接獨立於靜脈、動脈或血管固定或連接於患者之皮膚，從而使得泵系統與患者之皮膚之間可直接接觸。泵系統可連接於患者之皮膚24小時至數天。在小體積儲集器之情況下，泵系統可具有小尺寸。作為一非限制性實例，用於投與適合醫藥組合物之儲集器之體積可為0.1ml至50ml。

連續投藥亦可為借助於皮膚上穿戴之貼片經皮投與且以一定時間間隔更換。熟習此項技術者已知適用於此目的之用於藥物傳遞之貼片系統。值得注意地，經皮投藥尤其適於不間斷投藥，因為更換第一耗盡貼片可藉由例如在緊鄰第一耗盡貼片之皮膚之表面上放置新第二貼片且隨後立即移除第一耗盡貼片而同時有利地實現。不會發生流動中斷或電源電池故障之問題。

若醫藥組合物已凍乾，則經凍乾物質首先在適當液體中復原，隨後投與。經凍乾物質可在例如注射用抑菌水(BWFI)、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)或蛋白在凍乾之前所處之相同調配物中復原。

本發明之組合物可以適合劑量投與個體，該適合劑量可例如藉由劑量遞增研究藉由投與非黑猩猩靈長類動物(例如短尾猿)增加劑量之展現種間交叉特異性之本發明抗體構築體來確定。如上所述，展現本文所述之跨物種特異性之本發明抗體構築體可有利地以相同形式用於非黑猩猩靈長類動物之臨床前測試及人類之藥物。給藥方案將由主治醫師及臨床因素確定。如醫學技術中所熟知，對於任何一個患者，劑量視許多因素而定，包括患者之尺寸、體表面積、年齡、待投與之特定化合物、性別、投藥時間及途徑、一般健康狀況及同時投與之其他藥物。

術語「有效劑量(effective dose)」或「有效劑量(effective dosage)」定義為足以達成或至少部分達成所要作用之量。術語「治療有效劑量」定義為足以治癒或至少部分遏止已患有疾病之患者之疾病及其併發症之量。有效用於此用途之量或劑量取決於欲治療之病狀(適應症)、傳遞之抗體構築體、治療情形及目標、疾病之嚴重性、先前療法、患者之臨床病史及對治療劑之反應、投藥路徑、患者之體型(體重、身體表面或器官尺寸)及/或狀況(年齡及一般健康)及患者自身免疫系統之一般狀態。適當劑量可根據主治醫師之判斷調節以使得其可投與患者一次或經一系列投藥投與患者，且以獲得最佳治療作用。

典型劑量可在約0.1μg/kg至高達約30mg/kg或30mg/kg以上之範圍內，視上文所提及之因素而定。在特定實施例中，劑量可在1.0μg/kg至約20mg/kg、視情況10μg/kg至約10mg/kg或100μg/kg至約5mg/kg範圍內。

治療性有效量之本發明抗體構築體較佳使疾病症狀之嚴重性降低，無疾病症狀期之頻率或持續時間提高或預防疾病病痛所致之損傷或失能。關於治療表現FLT3之腫瘤，治療有效量之本發明抗體構築體(例如抗FLT3/抗CD3抗體構築體)相對於未經治療患者較佳抑制細胞生長或腫瘤生長至少約20%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。可在預測在人類腫瘤中之功效的動物模型中評估化合物抑制腫瘤生長的能力。

醫藥組合物可作為唯一治療劑投與或與其他療法(諸如視需要抗癌療法，例如其他蛋白質及非蛋白質藥物)組合投與。此等藥物可以適時定義之時間間隔及劑量與包含如本文所定義之本發明抗體構築體之組合物同時投與，或分別在投與該抗體構築體之前或之後投與。

如本文中所用之術語「有效且無毒劑量」係指本發明抗體構築體之可耐受劑量，其足夠高以引起病理性細胞消除、腫瘤去除、腫瘤縮小或疾病穩定而無或基本上無大的毒性作用。此類有效且無毒劑量可例如藉由此項技術中描述之劑量遞增研究確定且應低於誘導嚴重不良副事件(劑量限制性毒性，DLT)之劑量。

如本文中所用之術語「毒性」係指體現在不良事件或嚴重不良事件中之藥物的毒性作用。此等副事件可指一般缺乏藥物耐受性及/或投藥之後缺乏局部耐受性。毒性亦可包括由藥物引起之致畸或致癌作用。

如本文中所用之術語「安全性」、「活體內安全性」或「耐受性」定義投與藥物而不會在投與後立即誘導嚴重不良事件(局部耐受性)及在藥物之較長期施用期間誘導嚴重不良事件。「安全性」、「活體內安全性」或「耐受性」可在治療及追蹤階段期間例如以規則時間間隔進行評估。量測包括臨床評估，例如器官表現及實驗室異常之篩選。臨床評估可進行且偏向根據NCI-CTC及/或MedDRA標準所記錄/編碼之正常研究結果。器官表現可包括諸如過敏/免疫學、血液/骨髓、心律不整、凝血及其類似者之標準，如闡述於例如通用不良事件術語標準3.0版(Common Terminology Criteria for adverse events v3.0，CTCAE)中。可測試之實驗室參數包括例如血液學、臨床化學、凝血概況及尿液分析及諸如血清、血漿、淋巴或脊髓液、液體及其類似物之其他體液的檢查。因此，安全性可例如藉由身體檢查、成像技術(亦即超音波、x射線、CT掃描、磁共振成像(MRI)、利用技術器件之其他措施(亦即心電圖)、生命徵象藉由量測實驗室參數及記錄不良事件來評定。舉例而言，在本發明之用途及方法中，非黑猩猩靈長類動物中之不良事件可藉由組織病理學及/或組織化學方法檢驗。

以上術語亦例如在Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6；ICH Harmonised Tripartite Guideline；1997年7月16日之ICH指導委員會會議(ICH Steering Committeemeeting)中提及。

在另一實施例中，本發明提供一種套組，其包含本發明之抗體構築體、根據本發明方法產生之抗體構築體、本發明之聚核苷酸、本發明之載體及/或本發明之宿主細胞。

在本發明之上下文中，術語「套組」意謂一起包裝於容器(container/recipient)或其他物件中的兩種或兩種以上組分，其中之一對應於本發明之抗體構築體、醫藥組合物、載體或宿主細胞。因此，套組可描述為足以達成一定目標之一套產品及/或用具，其可作為單個單元出售。

套組可包含一或多個具有任何適當形狀、尺寸及材料(較佳防水，例如塑膠或玻璃)的容器(諸如小瓶、安瓿、容器、盒子、注射器、瓶子、袋)，其含有適用於投藥之劑量(參見上文)的本發明之抗體構築體或醫藥組合物。套組可另外含有使用說明(例如小冊或說明手冊形式)、投與本發明之抗體構築體的構件(諸如注射器、泵、輸注器或其類似物)、復原本發明之抗體構築體的構件及/或稀釋本發明之抗體構築體的構件。

本發明亦提供用於單次劑量投藥單位的套組。本發明之套組亦可含有包含經乾燥/凍乾之抗體構築體的第一容器及包含水性調配物之第二容器。在本發明之某些實施例中，提供含有單室及多室預填充注射器(例如液體注射器及冷凍乾燥物注射器)的套組。

實例：

以下實例說明本發明。此等實例不應理解為限制本發明之範疇。本發明僅受申請專利範圍限制。

實例1 產生表現野生型及嵌合FLT3之CHO細胞

就實例1及2而言，FLT3抗原可再分為六個所定義之不同子域或區。彼等五個子域之aa序列以SEQ ID NO：814-818描繪。

產生以下分子；亦參見圖1：

對於產生表現人類、鼠類及嵌合FLT3 ExtraCellulrDomain(ECD)之CHO/HEK細胞，將人類FLT3、鼠類FLT3及八種嵌合人類/鼠類FLT3形式之相應編碼序列(參見上文)選殖至稱為pEF-DHFR之質體中(pEF-DHFR描述於Raum等人Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。對於人類及鼠類FLT3之細胞表面表現，使用原始信號肽。所有選殖程序根據標準方案進行(Sambrook,Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。對於各構築體，將對應質體轉染至用於真核表現之缺乏DHFR之CHO細胞中，如Kaufman R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述。

用FACS分析驗證人類、嵌合及鼠類FLT3在CHO細胞上之表現。

實例2 抗FLT3抗體構築體之抗原決定基定位

將用人類、鼠類FLT3及用嵌合人類FLT3分子轉染之細胞(參見實例1)用於PBS/1.5% FCS中之含有融合於人類白蛋白(變異體1)之雙特異性FLT3xCD3抗體構築體(其中CD3結合域命名為I2C)之粗未經稀釋周質萃取物染色。結合分子用內部小鼠單株抗CD3結合域抗體(50μl)，之後用抗小鼠IgG Fc-γ-PE(1：100，50μl；Jackson Immunoresearch號115-116-071)偵測。用PBS/1.5% FCS稀釋所有抗體。作為陰性對照，使細胞與PBS/2% FCS而非周質萃取物一起培育。樣品藉由流式細胞測量術量測。

藉由相應FLT3結合域識別之區示於序列表(表2)中。在包含鼠類抗原決定基團簇之相應嵌合FLT3構築體中之FACS信號缺失為用於結合之相應團簇關聯性的讀數。表2中之相應結果與實例3之結果一致。

實例3 產生表現野生型及截短FLT3之CHO細胞

FLT3抗原之細胞外域可再分為不同子域或區，分別為藉由以下胺基酸位置定義之抗原決定基團簇E1至E6：

對於構築用於抗原決定基定位之截短FLT3分子(參見圖3)，相應七個人類區以及兩個鄰近人類區之五個組合之序列(參見上文)用來自鼠類FLT3之對應區替換。此外，V5標籤(GKPIPNPLLGLDST)經由「GGGGS」連接子融合於嵌合分子之C端。最終嵌合分子序列以SEQ ID NO：827-834描繪。另外，構築全長FLT3(SEQ ID NO：801)及全長食蟹獼猴FLT3(SEQ ID NO：802)，兩者均具有經由「GGGGS」連接子融合於其C端之V5標籤(GKPIPNPLLGLDST)。

為產生表現以上構築體之CHO dhfr-細胞，將相應編碼序列選殖至命名為pEF-DHFR之質體中(pEF-DHFR描述於Raum等人Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中)。亦產生用人類FLT3轉染但無V5標籤之CHO細胞。所有選殖程序根據標準方案進行(Sambrook,Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。對於各構築體，將對應質體轉染至用於真核表現之缺乏DHFR之CHO細胞中，如Kaufman R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述。

構築體在CHO細胞上之表現使用單株小鼠IgG2a抗v5標籤抗體(1μg/ml；AbD Serotec，編號MCA 1360)驗證。結合單株抗體用抗小鼠IgG Fc-γ-PE偵測。作為陰性對照，將細胞與同型對照抗體而非第一抗體一起培育。樣品藉由流式細胞測量術量測。

表2中展示所揭示之FLT3結合子之此分析之結果。彼等結果與根據實例2之抗原決定基定位分析一致

實例4 基於Biacore確定與人類及食蟹獼猴FLT3之抗體親和力

Biacore分析實驗使用有白蛋白之重組人類/食蟹獼猴FLT3-ECD融合蛋白進行，以確定本發明抗體構築體之目標結合。

詳言之，CM5感測子晶片(GE Healthcare)用大致600-800RU相應重組抗原使用乙酸鹽緩衝液(pH 4.5)根據製造商之手冊來固定。FLT3xCD3雙特異性抗體構築體樣品以以下濃度之稀釋系列裝載：用HBS-EP操作緩衝液(GE Healthcare)稀釋之50nM、25nM、12.5nM、6.25nM及3.13nM。流動速率為30μl/min維持3min，接著又在30μl/ml之流動速率下應用HBS-EP操作緩衝液8min至20min。晶片之再生使用10mM glycine、10mM NaCl(pH 1.5)溶液進行。使用BiaEval軟體分析數據組。一般而言，進行兩個獨立實驗。

此外，在Biacore分析中確定雙特異性抗體構築體與人類CD3及獼猴CD3之結合。

實例5 基於Scatchard分析FLT3xCD3雙特異性抗體構築體與目標抗原陽性細胞上人類及獼猴FLT3之親和力，且確定種間親和力間隙

FLT3xCD3雙特異性抗體構築體與用人類或獼猴FLT3轉染之CHO細胞之親和力亦藉由作為量測人類與獼猴FLT3之間的潛在親和力間隙的最可靠方法的Scatchard分析確定。對於Scatchard分析，使用單價偵測系統進行飽和結合實驗以準確確定FLT3xCD3雙特異性抗體構築體與相應細胞株之單價結合。

相應細胞株之2×10⁴ 個細胞(以重組方式表現人類FLT3之CHO細胞株，以重組方式表現獼猴FLT3之CHO細胞株)各與50μl以10-20nM起始之三倍稀釋系列(以1：2進行12次稀釋)之相應FLT3xCD3雙特異性抗體構築體(直至達到飽和)一起培育，之後在4℃下在攪拌下培育16h及一個剩餘洗滌步驟。接著，再將細胞與30μl CD3xALEXA488結合物溶液一起培育一小時。在一個洗滌步驟之後，使細胞再懸浮於150μl含有3.5%甲醛之FACS緩衝液中，再培育15min，離心，再懸浮於FACS緩衝液中且使用FACS CantoII機及FACS Diva軟體進行分析。自兩個獨立實驗組，各使用三份，得到資料。計算相應Scatchard分析以推知最大結合(Bmax)。確定半最大結合下FLT3xCD3雙特異性抗體構築體之濃度，反映相應KD。三份量測之值繪製成雙曲線及S形曲線，以表明極小至最佳結合範圍內之適當濃度。

實例6 雙特異性結合及種間交叉反應性

為確認結合於人類FLT3及CD3及食蟹獼猴FLT3及CD3，藉由流式細胞術使用以下各物測試本發明之雙特異性抗體構築體： ●分別用人類FLT3(SEQ ID NO：801)、用人類FLT3同功異型物(人類FLT3(T227M)同功異型物，參見SEQ ID NO：803及人類FLT3-ITD同功異型物，參見SEQ ID NO：804)且用獼猴FLT3(SEQ ID NO：802)轉染之CHO細胞，●FLT3陽性人類AML細胞株EOL-1、MOLM-13及MV4-11(但亦可設想其他FLT3陽性人類細胞株)

●表現CD3之人類T細胞白血病細胞株HPB-all(DSMZ,Braunschweig,ACC483)，及●表現食蟹獼猴CD3之T細胞株LnPx 4119

對於流式細胞測量術，在4℃下使相應細胞株之200,000個細胞與50μl濃度為5μg/ml之純化雙特異性抗體構築體一起培育60min。細胞在4℃下用PBS/2% FCS洗滌兩次且接著與對雙特異性抗體構築體之CD3結合部分具有特異性的內部小鼠抗體(2μg/ml)一起培育30min。在洗滌之後，在4℃下結合之小鼠抗體用山羊抗小鼠Fcγ-PE(1：100)偵測30min。樣品藉由流式細胞測量術量測。使用未轉染之CHO細胞作為陰性對照。

實例7 確認不存在與人類旁系同源物之結合

將人類FLT3旁系同源物KIT v1(SEQ ID NO：805)、CSF1R v1(SEQ ID NO：806)、PDGFRA(SEQ ID NO：807)及NTM v3(SEQ ID NO：808)穩定轉染至CHO細胞中。如本發明實例中所使用之旁系同源物之序列如序列表中所鑑別。

在FACS分析中用特異性抗體確定蛋白表現。如實例6中所述進行流式細胞測量術分析。

實例8： 與人類生殖系之一致性

為分析抗體構築體與人類抗體生殖系基因之序列之一致性/相似性，本發明之FLT3結合域如下對準：將包括所有CDR之完整VL對準；將包括CDR 1及2但不包括CDR3之完整VH針對人類抗體生殖系基因(Vbase)對準。更多細節可現於本申請案之說明書中。

實例9 細胞毒活性

在五個活體外細胞毒性分析中分析本發明之FLT3xCD3雙特異性抗體構築體對將效應子T細胞再引導至表現FLT3之目標細胞之效力：●在18小時51鉻釋放分析中量測FLT3xCD3雙特異性抗體構築體對將刺激性人類CD8+效應子T細胞再引導至人類FLT3轉染之CHO細胞之效力。

●在18小時51鉻釋放分析中量測FLT3xCD3雙特異性抗體構築體對將刺激性人類CD8+效應子T細胞再引導至FLT3陽性人類AML細胞株EOL-1、MOLM-13及MV4-11(但亦可設想其他FLT3陽性人類細胞株)之效力。

●在48小時基於FACS之細胞毒性分析中量測FLT3xCD3雙特異性抗體構築體對將非刺激性人類PBMC中之T細胞再引導至人類FLT3轉染之CHO細胞之效力。

效應細胞：非刺激性人類PBMC(CD14-/CD56-)。目標細胞：EOL-1。效應子與目標細胞(E：T)之比率：10：1。BiTE蛋白如所指示

效應細胞：非刺激性人類PBMC(CD14-/CD56-)。目標細胞：MV4-11。效應子與目標細胞(E：T)之比率：10：1。BiTE蛋白如所指示。

●在48小時基於FACS之細胞毒性分析中量測FLT3xCD3雙特異性抗體構築體對將非刺激性人類PBMC再引導至FLT3陽性人類AML細胞株EOL-1、MOLM-13及MV4-11(但亦可設想其他FLT3陽性人類細胞株)之效力。

●為確認交叉反應性FLT3xCD3雙特異性抗體構築體能夠將獼猴T細胞再引導至獼猴FLT3轉染之CHO細胞，用獼猴T細胞株作為效應子T細胞進行48小時基於FACS之細胞毒性分析。

效應細胞：非刺激性人類PBMC(CD14-/CD56-)。目標細胞：mac FLT3轉染之CHO細胞，效應子與目標細胞(E：T)之比率：10：1。BiTE蛋白如所指示。

●在48小時基於FACS之細胞毒性分析中在不存在及存在FLT3配位體下量測FLT3xCD3雙特異性抗體構築體對將非刺激性人類PBMC再引導至人類FLT3轉染之CHO細胞之效力。效應細胞：非刺激性人類PBMC(CD14-/CD56-)。目標細胞：hu FLT3轉染之CHO細胞。效應子與目標細胞(E：T)之比率：10：1。BiTE蛋白如所指示。

實例10.1 使用刺激性人類T細胞之鉻釋放分析

如下文所述獲得富集CD8⁺ T細胞之刺激性T細胞。在37℃下用最終濃度1μg/ml之市售抗CD3特異性抗體(OKT3，Orthoclone)塗佈皮氏培養皿(直徑145mm，Greiner bio-one GmbH,Kremsmünster)1小時。藉由一個用PBS洗滌之步驟移除未結合蛋白。將3-5×10⁷ 個人類PBMC 添加至預塗佈之皮氏培養皿中於120ml具有穩定麩醯胺酸/10% FCS/IL-2 20U/ml(Proleukin®，Chiron)之RPMI 1640中且刺激2天。在第三天，收集細胞且用RPMI 1640洗滌一次。添加IL-2至最終濃度為20U/ml且在與上文相同之細胞培養基中再培養細胞一天。使用Dynal-Beads根據製造商之方案藉由消耗CD4⁺ T細胞及CD56⁺ NK細胞CD8⁺ 細胞使毒性T淋巴球(CTL)富集。

食蟹獼猴FLT3或人類FLT3轉染之CHO目標細胞用PBS洗滌兩次且在37℃下在最終體積100μl之具有50%FCS之RPMI中用11.1MBq⁵¹ Cr標記60分鐘。隨後，經標記之目標細胞用5ml RPMI洗滌3次，且接著用於細胞毒性分析中。在96孔盤中於總體積200μl之E：T比率10：1之補充型RPMI中進行分析。使用起始濃度0.01至1μg/ml之純化雙特異性抗體構築體及其三倍稀釋液。分析之培育時間為18小時。細胞毒性經確定為上清液中釋放之鉻相對於最大溶解(添加Triton-X)及自發溶解(無效應細胞)之差值之相對值。一式四份進行所有量測。上清液中鉻活性之量測在Wizard 3" γ計數器中進行(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Köln,Germany)。對結果之分析用Windows用之Prism 5進行(5.0版，GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)。使用藉由分析程式由S形劑量反應曲線計算之EC50值比較細胞毒活性。

實例10.2 將刺激性人類效應子T細胞再引導至人類FLT3轉染之CHO細胞之效力

在51鉻(⁵¹ Cr)釋放細胞毒性分析中使用用人類FLT3轉染之CHO細胞作為目標細胞及刺激性人類CD8+ T細胞作為效應細胞來分析本發明之FLT3xCD3雙特異性抗體構築體之細胞毒活性。如實例10.1中所述進行實驗。

實例10.3 將刺激性人類效應子T細胞再引導至FLT3陽性人類細胞株之效力

在51鉻(⁵¹ Cr)釋放細胞毒性分析中使用FLT3陽性人類AML細胞株EOL-1、MOLM-13及MV4-11作為目標細胞來源及刺激性人類CD8+ T細胞作為效應細胞來分析FLT3xCD3雙特異性抗體構築體之細胞毒活性。如實例10.1中所述進行分析。

實例10.4 使用非刺激性人類PBMC之基於FACS之細胞毒性分析 分離效應細胞

藉由Ficoll密度梯度離心，自富集淋巴細胞之製劑(白血球層)(收集輸注用血液之血庫之副產物)製備人類周邊血液單核細胞(PBMC)。白血球層藉由本地血庫提供且在與血液收集同一天製備PBMC。在Ficoll密度離心及用達爾伯克氏PBS(Gibco)大規模洗滌之後，經由與紅血球溶解緩衝液(155mM NH₄ Cl、10mM KHCO₃ 、100μM EDTA)一起培育自PBMC移除剩餘紅血球。在100 x g下離心PBMC時，經由上清液移除血小板。剩餘淋巴球主要涵蓋B及T淋巴球、NK細胞及單核細胞。保持PBMC在37℃/5%CO₂ 下於具有10%FCS(Gibco)之RPMI培養基(Gibco)中培養。

消耗CD14 ⁺ 及CD56 ⁺ 細胞

對於CD14⁺ 細胞之消耗，使用人類CD14 MicroBeads(Milteny Biotec,MACS，編號130-050-201)，對於NK細胞之消耗，使用人類CD56 MicroBeads(MACS，編號130-050-401)。對PBMC進行計數且在室溫下用300 x g離心10min。將上清液丟棄且細胞集結粒再懸浮於MACS分離緩衝液[80μL/10⁷ 個細胞；PBS(Invitrogen，編號20012-043)、0.5%(v/v)FBS(Gibco，編號10270-106)、2mM EDTA(Sigma-Aldrich，編號E-6511)]中。添加CD14 MicroBeads及CD56 MicroBeads(20μL/10⁷ 個細胞)且在4-8℃下培育15min。用MACS分離緩衝液(1-2mL/10⁷ 個細胞)洗滌細胞。在離心(參見上文)之後，將上清液丟棄且細胞再懸浮於MACS分離緩衝液(500μL/10⁸ 個細胞)中。接著使用LS管柱(Miltenyi Biotec，編號130-042-401)分離CD14/CD56陰性細胞。在37℃下於培養箱中將無CD14+/CD56+細胞之PBMC培養於RPMI完全培養基，亦即補充有10% FBS(Biochrom AG，編號S0115)、1倍非必需胺基酸(Biochrom AG，編號K0293)、10mM Hepes緩衝液(Biochrom AG，編號L1613)、1mM丙酮酸鈉(Biochrom AG，編號L0473)及100U/mL青黴素/鏈黴素(Biochrom AG，編號A2213)之RPMI1640(Biochrom AG，編號FG1215)中直至需要。

目標細胞標記

對於用流式細胞測量術分析分析細胞溶解，使用作為目標細胞之螢光膜染料DiOC₁₈ (DiO)(Molecular Probes，編號V22886)標記人類FLT3或獼猴FLT3轉染之CHO細胞且使其與效應細胞不同。簡言之，收集細胞，用PBS洗滌一次且於含有2%(v/v)FBS及膜染料DiO(5微升/10⁶ 個細胞)之PBS中調節至10⁶ 個細胞/毫升。在37℃下培育3min後，用完全RPMI培養基洗滌細胞兩次且將細胞數調節至1.25×10⁵ 個細胞/毫升。使用0.5%(v/v)等張EosinG溶液(Roth,#45380)測定細胞活力。

基於流式細胞術之分析

此分析經設計以定量在FLT3雙特異性抗體構築體之連續稀釋液存在下經食蟹獼猴或人類FLT3轉染之CHO細胞的溶解。混合等體積之DiO標記之目標細胞及效應細胞(亦即無CD14⁺ 細胞之PBMC)，從而產生10：1之E：T細胞比率。將160μl此懸浮液轉移至96孔盤之各孔。添加40μL FLT3xCD3雙特異性抗體構築體之連續稀釋液及陰性對照雙特異性(識別不相關目標抗原之基於CD3之雙特異性抗體構築體)或 RPMI完全培養基作為額外陰性對照。雙特異性抗體介導之細胞毒性反應在7% CO₂ 含濕氣培育箱中進行48小時。接著將細胞轉移至新96孔盤，且藉由添加最終濃度為1μg/mL之碘化丙錠(PI)監測目標細胞膜完整性之損失。PI為膜不可滲透性染料，其通常為活細胞所排斥，而死細胞吸收其且變得可由螢光發射鑑別。

樣品藉由流動式細胞測量術在FACSCanto II儀器上量測且藉由FACSDiva軟體分析(兩者皆來自Becton Dickinson)。目標細胞鑑別為DiO陽性細胞。將PI陰性目標細胞分類為活目標細胞。根據下式計算細胞毒性之百分比：

使用GraphPad Prism 5軟體(Graph Pad Software,San Diego)，相對於相應雙特異性抗體濃度繪製細胞毒性百分比之圖。用四參數邏輯回歸模型分析劑量反應曲線以評估具有固定之希爾斜率(hill slope)之S型劑量反應曲線且計算EC50值。

實例10.5 將刺激性人類PBMC再引導至人類FLT3轉染之CHO細胞之效力

在基於FACS之細胞毒性分析中使用用人類FLT3轉染之CHO細胞作為目標細胞及非刺激性人類PBMC作為效應細胞來分析FLT3xCD3雙特異性抗體構築體之細胞毒活性。如以上實例8.4中所述進行分析。

實例10.6 將非刺激性人類PBMC再引導至FLT3陽性人類卵巢癌細胞株之效力

此外在基於FACS之細胞毒性分析中使用FLT3陽性人類AML細胞株EOL-1、MOLM-13及MV4-11作為目標細胞來源及非刺激性人類 PBMC作為效應細胞來分析FLT3xCD3雙特異性抗體構築體之細胞毒活性。如以上實例8.4中所述進行分析。

實例10.7 獼猴T細胞再引導至表現獼猴FLT3之CHO細胞之效力

最終，在基於FACS之細胞毒性分析中使用用獼猴(食蟹獼猴)FLT3轉染之CHO細胞作為目標細胞及獼猴T細胞株4119LnPx(Knappe等人Blood 95：3256-61(2000))作為效應細胞來源來分析FLT3xCD3雙特異性抗體構築體之細胞毒活性。如上文所述進行獼猴FLT3轉染之CHO細胞之目標細胞標記及細胞毒活性之基於流式細胞測量術之分析。

實例11 在(i)三個凍/融循環及(ii)在250μg/ml下培育7天之後單體轉化為二聚體

使雙特異性FLT3xCD3抗體單體構築體依序經受不同應力條件、高性能SEC，以確定已轉化為二聚抗體構築體之最初單體抗體構築體之百分比。

(i)用通用調配物緩衝液將25μg單體抗體構築體調節至濃度為250μg/ml，且接著在-80℃下冷凍30min，之後在室溫下解凍30min。三個凍/融循環之後，藉由HP-SEC確定二聚體含量。

(ii)用通用調配物緩衝液將25μg單體抗體構築體調節至濃度為250μg/ml，之後在37℃下培育7天。二聚體含量藉由HP-SEC確定。

將高解析度SEC管柱TSK Gel G3000 SWXL(Tosoh,Tokyo-Japan)連接至配備有A905自動取樣器之Äkta Purifier 10 FPLC(GE Lifesciences)。管柱平衡及操作緩衝液由100mM KH₂ PO₄ -200mM Na₂ SO₄ (調節至pH 6.6)組成。將抗體溶液(25μg蛋白)施用於平衡管柱且在7MPa之最大壓力下以0.75ml/min之流動速率進行溶離。在280、 254及210nm光學吸光度下監測整個操作。藉由Äkta Unicorn軟體操作評估表中記錄之210nm信號之峰積分進行分析。二聚體含量藉由二聚體峰之面積除以單體加二聚體峰之總面積來計算。

實例12 熱穩定性

抗體聚集溫度如下確定：40μl抗體構築體溶液以250μg/ml轉移至單次使用光析槽中且置放於Wyatt動態光散射裝置DynaPro Nanostar(Wyatt)中。樣品以0.5℃/min之加熱速率由40℃加熱至70℃，不斷獲取量測半徑。DLS裝置遞送之套裝軟體使用指示蛋白及聚集熔融之半徑之增加以計算抗體構築體之聚集溫度。

實例13 在人類血漿中培育24小時後之穩定性

純化之雙特異性抗體構築體在37℃下在人類血漿池中以1：5之比率在2-20μg/ml之最終濃度下培育96小時。在血漿培育之後，在使用起始濃度為0.01-0.1μg/ml之刺激性增濃之人類CD8+ T細胞及人類FLT3轉染之CHO細胞及10：1之效應子與目標細胞(E：T)之比率之51鉻釋放分析中比較抗體構築體(如實例8.1中所述之分析)。包括非培育性新近解凍之雙特異性抗體構築體作為對照物。

實例14 2500μg/ml抗體濃度下之濁度

藉由旋轉濃縮單元將1ml濃度250μg/ml之純化之抗體構築體溶液濃縮至2500μg/ml。在5℃下存儲16h之後，抗體溶液之濁度藉由針對通用調配物緩衝液之OD340nm光學吸收量測來確定。

實例15 藉由高解析度陽離子交換層析得到之蛋白均質性

藉由高解析度陽離子交換層析CIEX分析本發明抗體構築體之蛋白均質性。

50μg抗體構築體單體用50ml結合緩衝液A(20mM磷酸二氫鈉、30mM NaCl、0.01%辛酸鈉，pH 5.5)稀釋且將40ml此溶液施用於連接至Äkta Micro FPLC裝置(GE Healthcare,Germany)之1ml BioPro SP-F管柱(YMC,Germany)中。在樣品結合之後，再用結合緩衝液實施洗滌步驟。對於蛋白溶離，施用超過10倍管柱體積之使用緩衝液B(20mM磷酸二氫鈉、1000mM NaCl、0.01%辛酸鈉，pH 5.5)高達50%緩衝液B之線性增加之鹽梯度。在280、254及210nm光學吸光度下監測整個操作。藉由Äkta Unicorn軟體操作評估表中記錄之280nm信號之峰積分進行分析。

實例16 如藉由HIC Butyl所量測之表面疏水性

疏水相互作用層析HIC中以流通模式測試本發明之雙特異性抗體構築體之表面疏水性。

將50μg抗體構築體單體用通用調配物緩衝液稀釋至最終體積為500μl(10mM檸檬酸、75mM離胺酸鹽酸鹽、4%海藻糖，pH 7.0)且施加於連接至Äkta Purifier FPLC系統(GE Healthcare,Germany)之1ml Butyl Sepharose FF管柱(GE Healthcare,Germany)。在280、254及210nm光學吸光度下監測整個操作。藉由Äkta Unicorn軟體操作評估表中記錄之280nm信號之峰積分進行分析。溶離行為藉由比較蛋白信號之面積及升高及降低速度來評估，由此指示BiTE白蛋白融合物與基質之交互作用之強度。

實例17 雙特異性抗體構築體之單體與二聚同功異型物之間的效力差

為確定個別FLT3xCD3雙特異性抗體構築體之單體與二聚同功異型物之間的細胞毒活性差(稱為效力差)，如上文所述用純化之雙特異性抗體構築體單體及二聚體進行18小時51鉻釋放細胞毒性分析(實例10.1)。效應細胞為刺激性增濃之人類CD8+ T細胞。目標細胞為hu FLT3轉染之CHO細胞。效應子與目標細胞(E：T)之比率為10：1。效力差計算為EC50值之間的比率。

實例18 FLT3結合子與其目標之結合的FLT3配位體競爭

進行此分析以測試可溶性FLT3配位體是否損害本發明之抗FLT3結合域與FLT3之結合。

為驗證人類FLT3配位體與用人類FLT3轉染之CHO細胞之結合，在4℃下將細胞與人類FLT3配位體一起培育30分鐘。用抗HIS抗體(5μg/ml；AbD Serotec)，之後用抗小鼠IgG Fc-γ-PE(1：100；Jackson Immunoresearch，編號115-116-071)偵測結合FLT3配位體。作為陰性對照，將細胞與PBS/2% FCS而非CD27一起培育。

為藉由FLT3配位體測試FLT3結合子之競爭/置換，在4℃下將用人類FLT3轉染之CHO細胞在有或無FLT3配位體下培育30分鐘(10μg/FLT3配位體)。之後，細胞不洗滌但用FLT3結合子(scFv's)直接染色。用小鼠單株抗FLAG M2抗體(1μg/ml；Sigma F1804)，之後抗小鼠IgG Fc-γ-PE(1：100；Jackson Immunoresearch，編號115-116-071)偵測結合之scFv。作為陰性對照，將為與非特異性scFv而非FLT3 scFv一起培育。用具有2% FCS之PBS稀釋FLT3配位體及所有抗體。

為評估資料，藉由FACS偵測螢光中值。因與FLT3配位體競爭所致之超過25%之信號缺失理解為對結合具有顯著影響。此可為理解為對FLT3之相同域具有顯著空間交互作用。大於75%閾值之所有結合子(中值[有配位體]/中值[無配位體]×10075%)

(對於FL-1至FL-65其為真)鑑別為對FLT3配位體競爭不具敏感性。

FLT3配位體與其受體之交互作用描述於文獻中發生於與抗原決定基團簇3對應之區中。因此，預期藉由與FLT3配位體競爭吾人之篩選中鑑別對抗原決定基團簇3具有特異性之所有結合子以及針對相鄰團簇2及4之彼等結合子將顯著影響螢光中值之信號。此期望一般為正確的。出人意料地，結合於抗原決定基團簇3之FL-53、FL-54、FL-61、F-62、FL-63及FL-64仍展示高於閾值之信號。

此外，鑒於FLT3配位體與抗原決定基團簇3之區的交互作用，進一步假定較遠抗原決定基團簇(諸如FLT3之團簇1)之結合子將不受FLT3配位體競爭衝擊。然而，存在相當大數目之結合子，其不符合75%閾值之要求。結合子FL-1至FL-53、FL-55至FL-60及FL-65處於對於FLT3配位體競爭不具有敏感性之結合子組中。

圖1：

(a)單體FLT3蛋白之示意性結構及(b)與FLT3LG均二聚體相互作用之FLT3均二聚體之晶體結構。

圖2：

用於抗原決定基團簇結合子表徵之嵌合人類/小鼠FLT3分子之示意性結構。

圖3： 用於抗原決定基團簇結合子表徵之截短FLT3構築體之示意性結構。

圖4：

分析本發明之FLT3結合子與FLT3配位體競爭以結合FLT3之分析法。

CHO-人類FLT3細胞與或不與10μg/ml FLT3配位體一起培育30min(無洗滌步驟)。添加scFv周質製備物且培育30分鐘。使用小鼠抗FLAG+結合PE之山羊抗小鼠進行偵測且螢光中值藉由FACS偵測(中值(有配位體)/中值(無配位體)×100%)。

圖5：

指定種間交叉特異性雙特異性單鏈構築體與用人類FLT3轉染之CHO細胞、人類CD3+ T細胞株、用食蟹獼猴FLT3轉染之CHO細胞及獼猴CD3+ T細胞株LnPx 4119之FACS結合分析。紅色線表示與2μg/ml純化單體蛋白一起培育之細胞，其隨後與小鼠抗I2C抗體及PE標記之山羊抗小鼠IgG偵測抗體一起培育。黑色直方圖線反映陰性對照：細胞僅與抗I2C抗體以及PE標記之偵測抗體一起培育(參見實例6)。

圖6：

藉由再引導至作為效應細胞之缺乏CD56之非刺激性人類PBMC 及作為目標細胞之用人類FLT3轉染之CHO細胞中之指定種間交叉特異性單鏈構築體誘導的細胞毒活性。(實例9)

圖7：

交叉反應性結合於CD3、FLT3及其同功異型物。5μg/ml BiTE蛋白：4℃ 60min；2μg/ml抗-I2C-Ab 3E5.A5：4℃ 30min；山羊抗小鼠-PE 1：100：4℃ 30min。

圖8：

非結合於ParAlogs及未經轉染之CHO。5μg/ml BiTE蛋白：4℃ 60min；2μg/ml抗-I2C-Ab 3E5.A5：4℃ 30min；山羊抗小鼠-PE 1：100：4℃ 30min。

圖9：

抗原決定基團簇定位-團簇E1。

圖10：

在不存在及存在FLT3LG(FLT3配位體)下使用非刺激性人類PBMC抗人類FLT3轉染之CHO細胞，FLT3 scFc抗體構築體具有活性。

<110> 德商安美基研究(慕尼黑)公司托拜耳斯瑞烏

<120> FLT3及CD3抗體構築體

<130> please adapt

<150> US 62/199,944

<151> 2015-07-31

<150> 62/290861

<151> 2016-02-03

<160> 871

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 62

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<212> PRT

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<220>

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<210> 64

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<212> PRT

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸

<400> 135

<210> 136

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<220>

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

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<220>

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<220>

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<220>

<223> 合成肽

<400> 791

<210> 792

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 792

<210> 793

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 793

<210> 794

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 794

<210> 795

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 795

<210> 796

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 796

<210> 797

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 797

<210> 798

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 798

<210> 799

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 799

<210> 800

<211> 492

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 800

<210> 801

<211> 993

<212> PRT

<213> 智人

<400> 801

<210> 802

<211> 993

<212> PRT

<213> 食蟹猴

<400> 802

<210> 803

<211> 993

<212> PRT

<213> 智人

<400> 803

<210> 804

<211> 1013

<212> PRT

<213> 智人

<400> 804

<210> 805

<211> 976

<212> PRT

<213> 智人

<400> 805

<210> 806

<211> 972

<212> PRT

<213> 智人

<400> 806

<210> 807

<211> 1089

<212> PRT

<213> 智人

<400> 807

<210> 808

<211> 355

<212> PRT

<213> 智人

<400> 808

<210> 809

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 809

<210> 810

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 810

<210> 811

<211> 287

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 811

<210> 812

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 812

<210> 813

<211> 543

<212> PRT

<213> 智人

<400> 813

<210> 814

<211> 83

<212> PRT

<213> 智人

<400> 814

<210> 815

<211> 78

<212> PRT

<213> 智人

<400> 815

<210> 816

<211> 101

<212> PRT

<213> 智人

<400> 816

<210> 817

<211> 87

<212> PRT

<213> 智人

<400> 817

<210> 818

<211> 99

<212> PRT

<213> 智人

<400> 818

<210> 819

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 819

<210> 820

<211> 89

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 820

<210> 821

<211> 77

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 821

<210> 822

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 822

<210> 823

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 823

<210> 824

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 824

<210> 825

<211> 89

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 825

<210> 826

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 826

<210> 827

<211> 589

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 827

<210> 828

<211> 589

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 828

<210> 829

<211> 608

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> hu lsp V5xFlt3-E3muxEpC-pEFDHFR

<400> 829

<210> 830

<211> 589

<212> PRT

<213> 人工

<220<

<223> hu lsp V5xFlt3-E3AmuxEpC-pEFDHFR

<400> 830

<210> 831

<211> 589

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> hu lsp V5xFlt3-E3BmuxEpC-pEFDHFR

<400> 831

<210> 832

<211> 589

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> hu lsp V5xFlt3-E4muxEpC-pEFDHFR

<400> 832

<210> 833

<211> 589

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> hu lsp V5xFlt3-E5muxEpC-pEFDHFR

<400> 833

<210> 834

<211> 589

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> hu lsp V5xFlt3-E6muxEpC-pEFDHFR

<400> 834

<210> 835

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Fc單體-1

<400> 835

<210> 836

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Fc單體-2

<400> 836

<210> 837

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Fc單體-3

<400> 837

<210> 838

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Fc單體-4

<400> 838

<210> 839

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Fc單體-5

<400> 839

<210> 840

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Fc單體-6

<400> 840

<210> 841

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Fc單體-7

<400> 841

<210> 842

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Fc單體-8

<400> 842

<210> 843

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> scFc-1

<400> 843

<210> 844

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> scFc-2

<400> 844

<210> 845

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> scFc-3

<400> 845

<210> 846

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> scFc-4

<400> 846

<210> 847

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> scFc-5

<400> 847

<210> 848

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> scFc-6

<400> 848

<210> 849

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> scFc-7

<400> 849

<210> 850

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> scFc-8

<400> 850

<210> 851

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> (G4S)4連接子

<400> 851

<210> 852

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> (G4S)5連接子

<400> 852

<210> 853

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> (G4S)6連接子

<400> 853

<210> 854

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> (G4S)7連接子

<400> 854

<210> 855

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> (G4S)8連接子

<400> 855

<210> 856

<211> 989

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_16xCD3-scFc

<400> 856

<210> 857

<211> 987

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_16xCD3-scFc_delGK

<400> 857

<210> 858

<211> 989

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_23xCD3-scFc

<400> 858

<210> 859

<211> 987

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_23xCD3-scFc_delGK

<400> 859

<210> 860

<211> 989

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_36xCD3-scFc

<400> 860

<210> 861

<211> 987

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_36xCD3-scFc_delGK

<400> 861

<210> 862

<211> 989

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_39_xCD3-scFc

<400> 862

<210> 863

<211> 987

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_39-xCD3-scFc_delGK

<400> 863

<210> 864

<211> 989

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_42_xCD3-scFc

<400> 864

<210> 865

<211> 987

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_42_xCD3-scFc_delGK

<400> 865

<210> 866

<211> 989

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_46_CCxCD3-scFc

<400> 866

<210> 867

<211> 987

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_46_CCxCD3-scFc_delGK

<400> 867

<210> 868

<211> 989

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_52_CCxCD3-scFc

<400> 868

<210> 869

<211> 987

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_52_CCxCD3-scFc_delGK

<400> 869

<210> 870

<211> 994

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_61xCD3-scFc

<400> 870

<210> 871

<211> 992

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> FL_61xCD3-scFc_delGK

<400> 871

Claims

一種雙特異性抗體構築體，其包含結合於目標細胞表面上之人類及獼猴(macaque)FLT3的第一結合域及結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結合域，其中該第一結合域結合於FLT3之抗原決定基，其包含在如SEQ ID NO：801-804中所示之FLT3之胞外區內。
如請求項1之抗體構築體，其中該第一結合域結合於FLT3之抗原決定基，其包含在具有如SEQ ID NO：814(團簇(cluster)1)或SEQ ID NO：816(團簇3)中所示之序列之人類FLT3區內。
如前述請求項中任一項之抗體構築體，其中該抗體構築體呈選自由以下組成之群的型式：(scFv)₂ 、scFv-單域mAb、雙功能抗體(diabodies)及該等型式之寡聚物。
如請求項2或3之抗體構築體，其中該第一結合域包含有包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH區及包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL區，選自由以下組成之群：SEQ ID NO：151-156、SEQ ID NO：161-166、SEQ ID NO：171-176、SEQ ID NO：181-186、SEQ ID NO：191-196、SEQ ID NO：201-206、SEQ ID NO：211-216、SEQ ID NO：221-226、SEQ ID NO：231-236、SEQ ID NO：241-246、SEQ ID NO：251-256、SEQ ID NO：261-266、SEQ ID NO：271-276、SEQ ID NO：281-286、SEQ ID NO：291-296、SEQ ID NO：301-306、SEQ ID NO：311-316、SEQ ID NO：321-326、SEQ ID NO：331-336、SEQ ID NO：341-346、SEQ ID NO：351-356、SEQ ID NO：361-366、SEQ ID NO：371-376、SEQ ID NO：381-386、SEQ ID NO：391-396、SEQ ID NO：401-406、SEQ ID NO：411-416、SEQ ID NO：421-426、 SEQ ID NO：431-436、SEQ ID NO：441-446、SEQ ID NO：451-456、SEQ ID NO：461-466、SEQ ID NO：471-476、SEQ ID NO：481-486、SEQ ID NO：491-496、SEQ ID NO：501-506、SEQ ID NO：511-516、SEQ ID NO：521-526、SEQ ID NO：531-536、SEQ ID NO：541-546、SEQ ID NO：551-556、SEQ ID NO：561-566、SEQ ID NO：571-576、SEQ ID NO：581-586、SEQ ID NO：591-596、SEQ ID NO：601-606、SEQ ID NO：611-616、SEQ ID NO：621-626、SEQ ID NO：631-636、SEQ ID NO：641-646、SEQ ID NO：651-656、SEQ ID NO：661-666、SEQ ID NO：671-676、SEQ ID NO：681-686、SEQ ID NO：691-696、SEQ ID NO：701-706、SEQ ID NO：711-716、SEQ ID NO：721-726、SEQ ID NO：731-736、SEQ ID NO：741-746、SEQ ID NO：751-756、SEQ ID NO：761-766、SEQ ID NO：771-776、SEQ ID NO：781-786、SEQ ID NO：791-796。
如請求項4之抗體構築體，其中該第一結合域包含選自由以下所示組成之群的VH區：SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO： 507、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：757、SEQ ID NO：767、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：787及SEQ ID NO：797。
如請求項4或5中任一項之抗體構築體，其中該第一結合域包含選自由以下所示組成之群的VL區：SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：788及SEQ ID NO：798。
如請求項4至6中任一項之抗體構築體，其中該第一結合域包含選自由以下所示之VH區及VL區對組成之群的VH區及VL區：SEQ ID NO：157+158、SEQ ID NO：167+168、SEQ ID NO：177+178、SEQ ID NO：187+188、SEQ ID NO：197+198、SEQ ID NO：207+208、SEQ ID NO：217+218、SEQ ID NO：227+228、SEQ ID NO：237+238、SEQ ID NO：247+248、SEQ ID NO：257+258、SEQ ID NO：267+268、SEQ ID NO：277+278、SEQ ID NO：287+288、SEQ ID NO：297+298、SEQ ID NO：307+308、SEQ ID NO：317+318、SEQ ID NO：327+328、SEQ ID NO：337+338、SEQ ID NO：347+348、SEQ ID NO：357+358、SEQ ID NO：367+368、SEQ ID NO：377+378、SEQ ID NO：387+388、SEQ ID NO：397+398、SEQ ID NO：407+408、SEQ ID NO：417+418、SEQ ID NO：427+428、SEQ ID NO：437+438、SEQ ID NO：447+448、SEQ ID NO：457+458、SEQ ID NO：467+468、SEQ ID NO：477+478、SEQ ID NO：487+488、SEQ ID NO：497+498、SEQ ID NO：507+508、SEQ ID NO：517+518、SEQ ID NO：527+528、SEQ ID NO：537+538、SEQ ID NO：547+548、SEQ ID NO：557+558、SEQ ID NO：567+568、SEQ ID NO：577+578、SEQ ID NO：587+588、SEQ ID NO：597+598、SEQ ID NO：607+608、SEQ ID NO：617+618、SEQ ID NO：627+628、SEQ ID NO：637+638、SEQ ID NO：647+648、SEQ ID NO： 657+658、SEQ ID NO：667+668、SEQ ID NO：677+678、SEQ ID NO：687+688、SEQ ID NO：697+698、SEQ ID NO：707+708、SEQ ID NO：717+718、SEQ ID NO：727+728、SEQ ID NO：737+738、SEQ ID NO：747+748、SEQ ID NO：757+758、SEQ ID NO：767+768、SEQ ID NO：777+778、SEQ ID NO：787+788及SEQ ID NO：797+798。
如請求項4至7中任一項之抗體構築體，其中該第一結合域包含選自由以下所示組成之群的多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799。
如請求項1至8中任一項之抗體構築體，其中該第二結合域結合於人類CD3ε及白鬢狨(Callithrix jacchus )、棉冠獠狨(Saguinus Oedipus )或松鼠猴(Saimiri sciureus )CD3ε。
如請求項1至9中任一項之抗體構築體，其包含：(a)多肽，其自N端開始按以下次序包含：具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；及具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103；及視情況His-標籤，諸如SEQ ID NO 10中所示者；(b)多肽，其自N端開始按以下次序包含：具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及 SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103視情況之具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；具有選自由SEQ ID NO：104-134組成之群的胺基酸序列之多肽；及視情況His-標籤，諸如SEQ ID NO 10中所示者；(c)多肽，其自N端開始按以下次序包含：具有胺基酸序列QRFVTGHFGGLX₁ PANG(SEQ ID NO：135)之多肽，其中X₁ 為Y或H；及具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及 SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103；具有胺基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO：137)或QRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO：139)之多肽；及視情況His-標籤，諸如SEQ ID NO 10中所示者；(d)多肽，其自N端開始按以下次序包含：具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98及SEQ ID NO：101；具有SEQ ID NO：8中所示之胺基酸序列之肽連接子；具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：788及SEQ ID NO：798及絲胺酸殘基在C端；具有SEQ ID NO：140中所示之胺基酸序列之多肽；及多肽，其自N端開始按以下次序包含：具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：757、SEQ ID NO：767、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：787及SEQ ID NO：797；具有SEQ ID NO：8中所示之胺基酸序列之肽連接子；具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45、 SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：102及絲胺酸殘基在C端；具有SEQ ID NO：141中所示之胺基酸序列之多肽；(e)多肽，其自N端開始按以下次序包含：具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98及SEQ ID NO：101；具有SEQ ID NO：8中所示之胺基酸序列之肽連接子；具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：788及SEQ ID NO：798；具有SEQ ID NO：142中所示之胺基酸序列之多肽；及多肽，其自N端開始按以下次序包含：具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：757、SEQ ID NO：767、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：787及SEQ ID NO：797；具有SEQ ID NO：8中所示之胺基酸序列之肽連接子；具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：102及絲胺酸殘基在C端；具有SEQ ID NO：143中所示之胺基酸序列之多肽；(f)多肽，其自N端開始按以下次序包含：具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；具有選自由SEQ ID NO：1-9組成之群的胺基酸序列之肽連接子；及具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103；及具有SEQ ID NO：144中所示之胺基酸序列之多肽；及具有SEQ ID NO：145中所示之胺基酸序列之多肽；(g)多肽，其自N端開始按以下次序包含：具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID 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NO：147中所示之胺基酸序列之多肽；(h)多肽，其自N端開始按以下次序包含：具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679及SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719及SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749及SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779及SEQ ID NO：789及SEQ ID NO：799；及具有SEQ ID NO：148中所示之胺基酸序列之多肽；及多肽，其自N端開始按以下次序包含：具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：103；及具有SEQ ID NO：149中所示之胺基酸序列之多肽；或(i)多肽，其自N端開始按以下次序包含：具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219及 SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249及SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279及SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349及SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419及SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449及SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479及SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519及SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549及SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579及SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619及SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649及SEQ ID NO：659、SEQ ID 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如請求項1至10中任一項之抗體構築體，其包含或由SEQ ID NO：856至871中所示之多肽組成。
如請求項1至11中任一項之抗體構築體，其中該第一結合域與人類FLT3之結合係藉由FLT3配位體降低25%、較佳20%、更佳15%、另更佳<10%、甚至更佳8%、更佳6%且最佳2%。
一種聚核苷酸，其編碼如前述請求項中任一項之抗體構築體。
一種載體，其包含如請求項13之聚核苷酸。
一種宿主細胞，其用如請求項13之聚核苷酸或用如請求項14之載體轉型或轉染。
一種製備如請求項1至12中任一項之抗體構築體的方法，該方法包含使如請求項15之宿主細胞在允許如請求項1至12中任一項之抗體構築體表現之條件下培養及自培養物回收所產生之抗體構築體。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至12中任一項之抗體構築體或如請求項16之方法產生之抗體構築體。
如請求項1至12中任一項之抗體構築體或如請求項16之方法產生之抗體構築體，其用於預防、治療或改善血液癌症疾病或轉移性癌症疾病。
一種用於治療或改善血液癌症疾病或轉移性癌症疾病之方法，其包含向有需要個體投與如請求項1至12中任一項之抗體構築體或如請求項16之方法產生之抗體構築體的步驟。
如請求項19之方法或如請求項18之抗體構築體，其中該血液癌症疾病為AML或源於前述任一者之轉移性癌症疾病。
一種套組，其包含如請求項1至12中任一項之抗體構築體、如請求項16之方法產生之抗體構築體、如請求項13之聚核苷酸、如請求項14之載體及/或如請求項15之宿主細胞。