CN109476735A

CN109476735A - Flt3和cd3的抗体构建体

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Publication number: CN109476735A
Application number: CN201680044598.1A
Authority: CN
Inventors: T·劳姆; J·彭泽莱克; C·布鲁麦尔; F·博特; C·达尔霍夫; P·霍夫曼; E·纳赫沃尔德
Original assignee: Amgen Research Munich GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2016-08-01
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2036-08-01
Also published as: EP4219562A2; MX2018001159A; AU2016302580A1; PL3328891T3; SG10202000793XA; TWI829617B; IL256821B; JP2018527909A; BR112018001042A2; CO2018000882A2; JP2022062061A; SI3328891T1; CN109476735B; FI3328891T3; IL289894B; HUE061579T2; EP3328891A1; PH12018500157A1; MY193235A; EA201890337A8

Abstract

本公开涉及双特异性抗体构建体，其包含与靶细胞表面上的人FLT3结合的第一结合结构域和与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域。此外，本公开提供编码抗体构建体的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体以及用所述多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。此外，本公开提供了产生本公开的抗体构建体的方法，所述抗体构建体的医学用途以及包含所述抗体构建体的试剂盒。

Description

FLT3和CD3的抗体构建体

本发明涉及双特异性抗体构建体，其包含与靶细胞表面上的人FLT3结合的第一结合结构域和与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域。此外，本发明提供编码抗体构建体的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体以及用所述多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。此外，本发明提供了产生本发明的抗体构建体的方法，所述抗体构建体的医学用途以及包含所述抗体构建体的试剂盒。

引言：

急性骨髓性白血病(AML)是异质性血液恶性肿瘤，其为成人中诊断的最常见类型的急性白血病。AML占所有白血病的约三分之一，仅在美国在2013年就报告了估计并且14,500例新病例，总体存活率差。过去三十年来，AML患者的护理标准几乎没有改善。然而，分子和细胞生物学的最新进展已彻底改变了我们对正常和患病状态下人造血作用的理解。参与疾病发病机制的几个主要参与者已被鉴定，并可作为可行的靶标来接受询问。在约30％的AML中最常发生突变的一个这样的激活“驱动”基因是FLT3。

Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)(也称为胎肝激酶2(FLK-2)、人干细胞激酶1(SCK-1)或分化簇抗原(CD135))是在1990年代由两个独立团体克隆的造血受体酪氨酸激酶。位于人染色体13q12上的FLT3基因编码与其它III类家族成员(包括干细胞因子受体(c-KIT)、巨噬细胞集落刺激因子受体(FMS)和血小板衍生生长因子受体(PDGFR))共享同源性的III类受体酪氨酸激酶蛋白。

在与FLT3配体结合后，FLT3受体发生同源二聚化，由此使得能够使近膜结构域中的特定酪氨酸残基自磷酸化，以及通过PI3K/Akt、MAPK和STAT5途径进行下游激活。因此，FLT3在控制正常造血细胞的增殖、存活和分化中起着至关重要的作用。

人FLT3在CD34+CD38-造血干细胞(HSC)以及树突前体细胞的亚组中表达。FLT3表达也可以在多能祖细胞如CD34+CD38+CD45RA-CD123 ^低常见的骨髓性祖细胞(CMP)、CD34+CD38+CD45RA+CD123 ^低粒细胞单核祖细胞(GMP)和CD34+CD38+CD10+CD19-常见的淋巴祖细胞(CLP)中被检测到。有趣的是，CD34+CD38-CD45RA-CD123-巨核细胞红细胞祖细胞(MEP)中几乎不存在FLT3表达。因此，FLT3表达主要限于早期骨髓性和淋巴样祖细胞，在更成熟的单核细胞谱系细胞中有一些表达。FLT3的这种有限的表达模式与在大多数造血组织以及前列腺、肾、肺、结肠和心脏中表达的FLT3配体的表达模式明显不同。这些不同的表达模式使得FLT3表达是确定FLT3信号传导途径的组织特异性的限速步骤。

AML中最常见的FLT3突变是FLT3内部串联重复(FLT3-ITD)，在20％至38％的细胞遗传学正常的AML患者中发现该内部串联重复。当近膜结构域编码序列的一部分被复制并以头部至尾部取向插入时，形成FLT3-ITD。在慢性淋巴样白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤患者中未鉴定出FLT3突变，暗示着具有对AML的强疾病特异性。通常在所有FAB亚型中观察到突变型FLT3激活，然而，其在具有者FAB M5(单核细胞白血病)的AML患者中显著增加，而FAB亚型M2和M6(粒细胞或红系白血病)显著不太频繁地与FLT3激活有关，与FLT3的正常表达模式一致。

小百分比的AML患者(5-7％)在FLT3酪氨酸激酶结构域(FLT3 TKD)中存在单个氨基酸突变(最常见地在D835处或在一些情况下在T842或I836处)，而更少的患者(～1％)在FLT3近膜结构域中具有涉及残基579、590、591和594的突变。具有FLT3-ITD突变型AML的患者具有以早期复发和差的存活率为特征的侵袭性疾病形式，而总体存活和无事件存活不受FLT3-TKD突变的存在显著影响。此外，具有同时发生的TET2或DNMT3A突变的FLT3-ITD突变的AML患者与具有野生型TET2或DNMT3A的FLT3-ITD突变型AML患者相比，具有不利的总体风险特征，这突出了AML的临床和生物学异质性。

FLT3-ITD和FLT3 TKD突变均诱导FLT3的配体非依赖性激活，导致Ras/MAPK途径和PI3K/Akt途径的下游激活。然而，与任一突变相关的下游信号传导途径主要不同在于FLT3-ITD优先激活STAT5，从而导致增强的增殖潜能和DNA修复途径的异常调节。

与FLT3突变状态不相关，FLT3磷酸化在三分之二以上的AML患者中是明显的，并且FLT3在＞80％的AML母细胞中表达，在所有AML患者中有约90％表达FLT3，使其成为在大样本量中与疾病发病机制相关的有吸引力的治疗靶标。

几种小分子抑制剂已成为具有FLT3突变的AML患者的有吸引力的治疗选择。第一代FLT3酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的特征在于选择性、效力的缺乏以及不利的药代动力学特性。为了解决这个问题，已开发了更新和更具选择性的药剂；然而，它们的功效受限于二次抗性的出现。

几种早期的FLT3 TKI包括米哚妥林(PKC412)、来妥替尼(CEP-701)、舒尼替尼(SUI1248)和索拉非尼(BAY 43-9006)等等。在复发性或难治性AML患者中，这些多激酶靶向剂在I期和II期的响应率受到限制，这大概是由于它们无法达到有效的FLT3抑制而无剂量限制性毒性。奎扎替尼(Quizartinib)(AC220)已被开发为对FLT3野生型和FLT3-ITD具有高选择性的第二代FLT3 TKI，并且已在年轻的患者组群中尤其在移植围环境中显示出益处。然而，在接受奎扎替尼的复发患者中鉴定的FLT3中的继发性突变强调了对为AML患者开发更好的治疗策略的需要，同时强调FLT3作为治疗靶标的有效性。

已在具有新生、复发/难治或继发性疾病的AML患者中测试了几种靶向剂。肿瘤抑制基因的表观遗传沉默在AML疾病发病机制中起着重要作用，DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂如阿扎胞苷和地西他滨已取得了一定的临床成功。此外，最近在AML患者的亚组中对影响组蛋白翻译后修饰(例如EZH2和ASXL1突变)或DNA甲基化(例如DNMT3A、TET2、IDH1/2)的突变的鉴定已导致多种治疗选项(包括EZH2、DOT1L、IDH1/2抑制剂以及HDAC和蛋白酶体抑制剂)的开发。然而，许多这些化合物在AML细胞中的临床前研究表明，这些抑制剂可改变造血分化的表型和基因表达特征，而非引起AML母细胞的直接细胞毒性。因此，仍然存在对鉴定对抗AML以及引发AML母细胞的靶向溶解的新型靶标/模式的很强的未满足的医学需求。AML的其它治疗候选药物包括Aurora激酶抑制剂(包括AMG 900)和在细胞周期进程中起重要作用的polo样激酶的抑制剂。

在可行的情况下，AML患者的护理标准仍然是采用干细胞移植的化学疗法。然而，在绝大多数治疗的患者中复发/难治性病例的出现需要额外的治疗方式。几种白血病特异性抗原的鉴定和描述，以及对免疫介导的移植物抗白血病作用的更清楚的理解，已为开发用于抗血液恶性肿瘤的免疫调节策略铺平了道路，并于几篇论文中进行了综述。

吉妥单抗奥佐米星(GO)是针对CD33的抗体-药物缀合物，CD33是一种普遍存在的骨髓细胞表面标志物。在对于GO疗法未显示结果的改善的随机试验后，从市场撤出GO。然而，需要在AML中重新评价GO，并已开始了几个试验来彻底评估GO的功效和毒性。针对AML的其它生物药剂包括林妥珠单抗(SGN-33)(一种以未缀合的形式或与放射性铋缀合的形式存在的人源化抗CD33单克隆抗体)和SL-401(由针对在大多数AML母细胞中过表达的IL-3受体的偶联有白喉毒素有效负荷的人IL-3组成)。靶向肿瘤相关抗原和效应子溶细胞性T细胞两者的新一代单克隆抗体包括AMG 330(一种靶向CD33的双特异性T细胞衔接器或BiTE分子)和MGD006(一种与CD123和CD3结合的双重亲和性重新靶向分子)。

嵌合抗原受体T细胞在难治性CLL和急性淋巴母细胞性白血病(ALL)中的最近成功已为开发骨髓性特异性CAR-T细胞(包括CD123CAR-T和CD33CAR-T)疗法铺平了道路。为了改善结果，也已在产生树突细胞疫苗以及与检查点阻断抑制剂的组合中投入了若干努力。

也已产生了针对FLT3的治疗性抗体。由于抗体针对FLT3的细胞外结构域(所述结构域比细胞内激酶结构域更不易发生突变)，因此推测抗体疗法更有效且发生次级抗性机制的可能性较小。在I期研究中在复发性AML患者中评价Imclone抗体IMC-EB10，然而，由于缺乏功效(ClinicalTrials.gov标识符：NCT00887926)，终止研究。因此存在对评估用于治疗AML的第二代单克隆抗体(包括双特异性抗体)的迫切需要。

由于仍然存在对拥有用于治疗与FLT3表达相关的血液疾病的其它可用选项的需要，因此提供了用于以双特异性抗体构建体的形式解决此问题的手段和方法，所述双特异性抗体构建体具有针对肿瘤靶细胞表面上的FLT3的结合结构域以及针对T细胞表面上的CD3的第二结合结构域。

因此，在第一方面，本发明提供了双特异性抗体构建体，其包含与靶细胞表面上的人FLT3结合的第一结合结构域和与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域，其中所述第一结合结构域与FLT3的表位结合，所述表位包含在如SEQ ID NO：801-804中所示的FLT3的细胞外区域内。

必须注意的是，如本文中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数所指物。因此，例如，提及“一种试剂”包括此类不同试剂的一种或多种，提及“该方法”包括提到本领域普通技术人员已知的能够修改或取代本文所述的方法的等效步骤和方法。

除非另有说明，否则一系列要素前的术语“至少”应理解为是指这一系列的每个要素。本领域技术人员仅采用常规实验即能认识到或确定许多与本文描述的本发明具体实施方案等效的情况。本发明旨在涵盖此类等效情况。

本文中任何地方使用的术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的全部或任何其它组合”的含义。

如本文中所用，术语“约”或“大致”意指在给定值或范围的±20％以内，优选在±15％以内，更优选在±10％以内，最优选在±5％内。

在整个本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”以及诸如“包括”和“含有”的变化将被理解为意指包含所述的整体或步骤或者整体或步骤的组或，但不排除任何其它整体或步骤或者整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“含有”可用术语“包含”或“包括”代替，或者当在本文中使用时有时用术语“具有”代替。

当在本文中使用时，“由......组成”排除权利要求元素中未指定的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由......组成”不排除不实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。

在本文的每种情况下，术语“含有”、“基本上由...组成”和“由......组成”中的任何一个可以用另外两个术语中的任一个来代替。

术语“抗体构建体”是指其中结构和/或功能基于抗体，例如全长或完整免疫球蛋白分子的结构和/或功能的分子。因此抗体构建体能够结合其特定靶标或抗原。此外，根据本发明的抗体构建体包含允许靶标结合的抗体的最低结构要求。该最低要求可以例如通过存在至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)，优选全部六个CDR来定义。根据本发明构建体所基于的抗体包括例如单克隆、重组、嵌合、去免疫化、人源化和人抗体。

在根据本发明的“抗体构建体”的定义内，全长或完整抗体还包括通过生物技术或蛋白质工程方法或加工产生的骆驼科动物抗体和其它免疫球蛋白抗体。这些全长抗体可以是例如单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体和人抗体。同样在“抗体构建体”的定义内的是全长抗体的片段，诸如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab’、F(ab′)2或“r IgG”(“半抗体”)。根据本发明的抗体构建体也可以是抗体的经修饰的片段(也称为抗体变体)，诸如scFv、双-scFv或双-scFv、scFv-Fc、scFv-接链、scFab、Fab2、Fab3、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(Tandab′s)、串联双-scFv、串联三-scFv、由如下结构示例的“微型抗体”：(VH-VL-CH3)₂、(scFv-CH3)₂、((scFv)₂-CH3+CH3)、((scFv)₂-CH3)或(scFv-CH3-scFv)₂、多抗体(multibody)诸如三抗体或四抗体，以及单结构域抗体诸如纳米抗体或只包含一个可变结构域(其可以是VHH、VH或VL，不依赖于其它V区或结构域而特异性结合抗原或表位)的单可变结构域抗体。

结合结构域通常可包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，其不必包含两者。例如，Fd片段具有两个VH区，并且通常保留了完整抗原结合区的一些抗原结合功能。抗体片段、抗体变体或结合结构域的形式的另外的实例包括(1)Fab片段，其具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab′)2片段，其具有在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(3)Fd片段，其具有两个VH和CH1结构域；(4)Fv片段，其具有抗体单臂的VL和VH结构域，(5)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，其具有VH结构域；(6)分离的互补决定区(CDR)，和(7)单链Fv(scFv)，后者是优选的(例如，源自scFV文库)。根据本发明的抗体构建体的实施方案的实例描述于例如WO 00/006605、WO 2005/040220、WO2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US2014/0302037、WO2014/144722、WO 2014/151910和WO 2015/048272中。

此外，术语“抗体构建体”的定义包括单价、二价和多价和多价构建体，并因此包括特异性结合至仅一个抗原结构的单特异性构建体，以及通过不同的结合结构域特异性结合多于一个(例如，2个、3个或更多个)抗原性结构的双特异性和多重特异性/多特异性构建体。此外，术语“抗体构建体”的定义还包括仅由一条多肽链组成的分子以及由多于一条多肽链组成的分子，所述链可以是相同的(同二聚体、同三聚体或同寡聚体)或不同的(异二聚体、异三聚体或异寡聚体)。上述鉴定的抗体及其变体或衍生物的实例尤其描述于Harlow和Lane，Antibodies a laboratory manual，CSHL Press(1988)以及Using Antibodies：alaboratory manual，CSHL Press(1999)，Kontermann和Antibody Engineering，Springer，第2版，以及Little，Recombinant Antibodies for Immunotherapy，CambridgeUniversity Press 2009中。

本发明的抗体构建体优选为“体外产生的抗体构建体”。该术语是指根据上述定义的抗体构建体，其中全部或部分可变区(例如，至少一个CDR)在非免疫细胞选择(例如体外噬菌体展示、蛋白质芯片或其中可测试候选序列的结合抗原的能力的任何其它方法)中产生。因此该术语优选排除仅通过动物免疫细胞中的基因组重排产生的序列。“重组抗体”是通过使用重组DNA技术或遗传工程制造的抗体。

如本文中所用，术语“单克隆抗体”(mAb)或单克隆抗体构建体是指从基本上同源的抗体群体获得的抗体，即除了可能少量存在的可能天然存在的突变和/翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)外，群体中包含的单个抗体是相同的。与通常包含针对不同决定簇(或表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，单克隆抗体是高度特异性的，针对抗原上的单个抗原位点或决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优点还在于它们由杂交瘤培养物合成，因此不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆的”表示从基本上同源的抗体群获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。

为了制备单克隆抗体，可使用提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术。例如，待使用的单克隆抗体可以通过由Koehler等，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法(参见，例如美国专利第4,816,567号)制备。用于产生人单克隆抗体的其它技术的实例包括三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor，Immunology Today 4(1983)，72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)，77-96)。

然后可使用标准方法(诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振(BIACORE^TM)分析)筛选杂交瘤，以鉴定产生与特定抗原特异性结合的抗体的一种或多种杂交瘤。可将任何形式的相关抗原用作免疫原，例如重组抗原、天然存在的形式、其任何变体或片段，以及其抗原肽。如BIAcore系统中使用的表面等离振子共振可用于增加结合靶抗原的表位(例如FLT3或CD3 ε)的噬菌体抗体的效率(Schier，Human Antibodies Hybridomas7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。

制备单克隆抗体的另一种示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体展示文库或核糖体展示文库。噬菌体展示描述于例如Ladner等，美国专利第5,223,409号；Smith(1985)Science228：1315-1317，Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中。

除了使用展示文库以外，还可使用相关抗原来免疫非人动物，例如啮齿类动物(诸如小鼠、仓鼠、兔或大鼠)。在一个实施方案中，非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可能使用人Ig(免疫球蛋白)基因座的大片段来对在小鼠抗体产生中具有缺陷的小鼠品系进行工程化。使用杂交瘤技术，可以产生并选择来源于具有所需特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见，例如，XENOMOUSE^TM，Green等(1994)Nature Genetics 7：13-21，US 2003-0070185，WO 96/34096和WO 96/33735。

单克隆抗体也可以从非人动物获得，然后使用本领域已知的重组DNA技术进行修饰，例如人源化、去免疫化、赋予嵌合等。经修饰的抗体构建体的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟的”抗体(参见，例如Hawkins等，J.Mol.Biol.254，889-896(1992)和Lowman等，Biochemistry 30，10832-10837(1991))以及具有改变的效应子功能的抗体突变体(参见，例如，美国专利第5,648,260号，Kontermann和(2010)，在上述引文中，以及Little(2009)，在上述引文中)。

在免疫学中，亲和力成熟是B细胞籍以在免疫反应过程中产生具有针对抗原的增加的亲和力的抗体的过程。由于反复暴露于相同的抗原，宿主会产生具有依次更大的亲和力的抗体。与天然原型一样，体外亲和力成熟基于突变和选择的原理。体外亲和力成熟已被成功地用于优化抗体、抗体构建体和抗体片段。使用辐照、化学诱变剂或易错PCR在CDR内引入随机突变。另外，可通过链改组来增加遗传多样性。使用展示方法如噬菌体展示的两轮或三轮突变和选择通常产生具有在低纳摩尔范围内的亲和力的抗体片段。

抗体构建体的氨基酸取代变异的优选类型涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，被选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体具有改善的生物学性质。用于产生此类取代变体的便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，将几个高变区位点(例如6-7个位点)突变以在每个位点处产生所有可能的氨基酸取代。如此产生的抗体变体以单价方式作为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合物从丝状噬菌体颗粒展示。然后筛选噬菌体展示的变体的如本文所公开的生物活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。可选择地或者另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定结合结构域与例如人FLT3之间的接触点可以是有益的。此类接触残基和相邻残基是用于根据本文阐述的技术进行取代的候选者。一旦产生此类变体，就如本文所述对变体的小组进行筛选，并且可在一个或多个相关测定中选择具有优异性质的抗体用于进一步开发。

本发明的单克隆抗体和抗体构建体具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)(其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一种抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源)以及此类抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性即可(美国专利第4,816,567号；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文中的目标嵌合抗体包括包含源自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体。已经描述了多种制备嵌合抗体的方法。参见，例如Morrison等，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.81：6851，1985；Takeda等，Nature 314：452，1985，Cabilly等，美国专利第4,816,567号；Boss等，美国专利第4,816,397号；Tanaguchi等，EP 0171496；EP 0173494和GB 2177096。

还可通过例如WO 98/52976或WO 00/34317中公开的方法通过对人T细胞表位的特异性删除(称为“去免疫化”的方法)来修饰抗体、抗体构建体、抗体片段或抗体变体。简言之，可以分析抗体的重链和轻链可变结构域的结合MHC II类的肽；这些肽代表潜在的T细胞表位(如在WO 98/52976和WO 00/34317中所定义的)。为了检测潜在的T细胞表位，可应用称为“肽穿线”的计算机建模方法，并且另外可搜索人MHC II类结合肽的数据库的存在于VH和VL序列中的基序，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序与18种主要的MHC II类DR同种异型中的任一种结合，从而构成潜在的T细胞表位。检测到的潜在T细胞表位可通过取代可变结构域中的少量氨基酸残基来消除，或者优选通过单个氨基酸取代来消除。通常地，进行保守取代。通常，但非唯一地，可使用对于人种系抗体序列中的位置是共同的氨基酸。人种系序列公开于例如Tomlinson等(1992)J.MoI.Biol.227：776-798；Cook，G.P.等(1995)Immunol.Today第16卷(5)：237-242；和Tomlinson等(1995)EMBO J.14：14：4628-4638中。VBASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的全面目录(由Tomlinson，LA.等汇编，MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK)。这些序列可用作人序列的来源，例如用于框架区和CDR。也可以使用共有人框架区，例如如美国专利第6,300,064号中所述。

“人源化”抗体、抗体构建体、其变体或片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)是主要具有人序列的抗体或免疫球蛋白，其包含源自非人免疫球蛋白的一个或多个最小序列。就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自接受体高变区(也称为CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人(例如啮齿类动物)物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、仓鼠或兔)的高变区的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，如本文中所用，“人源化抗体”还可包含既不存在于受体抗体中也不存在于供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。关于进一步的细节，参见Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。

人源化抗体或其片段可通过用不同于人Fv可变结构域的等效序列替换不直接参与抗原结合的Fv可变结构域的序列来产生。用于产生人源化抗体或其片段的示例性方法由Morrison(1985)Science229：1202-1207；由Oi等.(1986)BioTechniques 4：214以及由US5,585,089、US 5,693,761、US 5,693,762、US 5,859,205和US 6,407,213提供。那些方法包括分离、操作和表达编码来自重链或轻链中的至少一个的全部或部分免疫球蛋白Fv可变结构域的核酸序列。此类核酸可从产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤获得(如上所述)，以及从其它来源获得。然后可将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆至合适的表达载体中。

人源化抗体还可使用转基因动物诸如表达人重链和轻链基因但不能表达内源小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的小鼠产生。Winter描述了可用于制备本文所述的人源化抗体的示例性CDR移植方法(美国专利第5,225,539号)。特定人抗体的所有CDR可以被至少一部分非人CDR替代，或者仅仅某些CDR可被非人CDR替代。只需要替换人源化抗体与预定抗原结合所需的CDR数目即可。

可通过引入保守取代、共有序列取代、种系取代和/或回复突变来优化人源化抗体。此类改变的免疫球蛋白分子可通过本领域已知的几种技术中的任一种来制备(例如，Teng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：7308-7312，1983；Kozbor等，Immunology Today，4：7279，1983；Olsson等，Meth.Enzymol.，92：3-16，1982和EP 239 400)。

术语“人抗体”、“人抗体构建体”和“人结合结构域”包括抗体、抗体构建体和具有抗体区诸如可变和恒定区的结合结构域，或基本上对应于本领域已知的人种系免疫球蛋白序列的结构域，包括例如由Kabat等(1991)(在上述引文中)描述的那些。本发明的人抗体、抗体构建体或结合结构域可以例如在CDR中，特别地在CDR3中包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体、抗体构建体或结合结构域可使至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个位置被不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替代。如本文所用的人抗体、抗体构建体和结合结构域的定义还设想了完全人抗体，其仅包括非人工和/或遗传改变的人抗体序列，如可通过使用技术或系统诸如Xenomouse衍生的抗体序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体构建体是“分离的”或“基本上纯的”抗体构建体。当用于描述本文公开的抗体构建体时，“分离的”或“基本上纯的”意指已从其生产环境的组分中鉴定、分离和/或回收的抗体构建体。优选地，抗体构建体不与或基本上不与来自其产生环境的所有其它组分缔合。其生产环境中的污染物组分，诸如由重组转染细胞产生的组分，是通常会干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。抗体构建体可以例如构成给定样品中的总蛋白质的至少约5％或至少约50％(按重量计)。可以理解的是，根据情况，分离的蛋白质可构成总蛋白质含量的5％至99.9％(按重量计)。通过使用诱导型启动子或高表达启动子，可以以显著更高的浓度制备多肽，使得以升高的浓度水平制备它。该定义包括在本领域已知的多种生物体和/或宿主细胞中产生抗体构建体。在优选实施方案中，抗体构建体将纯化(1)至足以通过使用旋杯式测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(2)在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选银染，通过SDS-PAGE纯化至均质。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体构建体。

术语“结合结构域”结合本发明表征，为与靶分子(抗原)(此处：分别为FLT3和CD3)上的给定靶表位或给定靶位点(特异性)结合/相互作用/识别所述靶表位或靶位点的结构域。第一结合结构域(识别FLT3)的结构和功能，以及优选还有第二结合结构域(识别CD3)的结构和/或功能基于抗体例如全长或完整免疫球蛋白分子的结构和/或功能。根据本发明，第一结合结构域的特征在于存在三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。第二结合结构域优选还包含允许靶标结合的抗体的最低结构要求。更优选地，第二结合结构域包含至少三个轻链CDR(，即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。可以设想，第一和/或第二结合结构域由噬菌体展示或文库筛选方法产生或可通过噬菌体展示或文库筛选方法获得，而不是通过将来自预先存在的(单克隆)抗体的CDR序列移植至支架中来产生或获得。

根据本发明，结合结构域呈一个或多个多肽的形式。此类多肽可包括蛋白质性质部分和非蛋白质性质部分(例如化学接头或化学交联剂诸如戊二醛)。蛋白质(包括其片段，优选生物活性片段和通常具有少于30个氨基酸的肽)包含通过共价肽键彼此偶联(产生氨基酸链)的两个或更多个氨基酸。如本文中所用，术语“多肽”描述了通常由多于30个氨基酸组成的一组分子。多肽可进一步形成多聚体诸如二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即由多于一个多肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同的或不相同的。因此，此类多聚体的相应较高级结构被称为同二聚体或异二聚体、同三聚体或异三聚体等。异多聚体的实例是抗体分子，其天然存在形式由两条相同的轻多肽链和两条相同的重多肽链组成。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”也指天然修饰的肽/多肽/蛋白质，其中修饰是例如通过翻译后修饰如糖基化、乙酰化、磷酸化等来实现。当在本文中提及时，“肽”、“多肽”或“蛋白质”也可被化学修饰，例如聚乙二醇化。此类修饰在本领域是公知的，并在下面描述。

优选地，结合FLT3的结合结构域和/或结合CD3的结合结构域是人结合结构域。包含至少一个人结合结构域的抗体和抗体构建体避免了一些与具有非人诸如啮齿类动物(例如，鼠、大鼠、仓鼠或兔)的可变区和/或恒定区的抗体或抗体构建体相关的问题。此类啮齿类动物衍生的蛋白质的存在可导致抗体或抗体构建体的快速清除，或者可导致患者产生针对所述抗体或抗体构建体的免疫反应。为了避免使用啮齿类动物来源的抗体或抗体构建体，可通过将人抗体功能引入啮齿类动物，使得啮齿类动物产生完全人抗体来产生人或完全人抗体/抗体构建体。

在YAC中克隆和重建兆碱基大小的人基因座并将其引入小鼠种系中的能力提供了阐明非常大或粗略定位的基因座的功能组分以及产生有用的人疾病模型的有力方法。此外，此类技术用于用小鼠的人等效物取代小鼠基因座的用途可以提供对在发育过程中人基因产物的表达和调控，它们与其它系统的通信以及它们参与疾病诱导和进展的独特见解。

此类策略的重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入其中内源性Ig基因已被失活的小鼠中，为研究抗体的程序化表达和组装的基础机制以及它们在B细胞发育中的作用提供了机会。此外，此类策略可提供用于完全人单克隆抗体(mAb)生产的理想来源-这是实现人疾病的抗体疗法前景的重要里程碑。预期完全人抗体或抗体构建体将小鼠或小鼠来源的mAb固有的免疫原性和变应性反应最小化，从而增加施用的抗体/抗体构建体的功效和安全性。预期完全人抗体或抗体构建体的使用在治疗需要重复化合物施用的慢性和复发性人疾病(诸如炎症、自身免疫和癌症)中提供显著的有利方面。

实现这一目标的一种方法是利用人Ig基因座的大片段对在小鼠抗体产生中具有缺陷的小鼠品系进行工程化，预期此类小鼠在小鼠抗体不存在的情况下将产生大的人抗体组库。大的人Ig片段将保持大的可变基因多样性以及抗体产生和表达的适当调控。通过利用抗体多样化和选择以及对人蛋白质的免疫耐受性的缺乏的小鼠机制，这些小鼠品系中的复制的人抗体组库应当产生针对包括人抗原在内的任何目标抗原的高亲和力抗体。使用杂交瘤技术，可以容易地生产和选择具有所需特异性的抗原特异性人mAb。结合产生第一XenoMouse小鼠品系(参见Green等，Nature Genetics 7：13-21(1994))，证明了该一般性策略。用分别包含人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系构型片段的酵母人工染色体(YAC)对XenoMouse菌株进行工程化，所述片段含有核心可变区和恒定区序列。含有人Ig的YAC经证明与用于抗体的重排和表达的小鼠系统相容，并且能够取代失活的小鼠Ig基因。这通过它们诱导B细胞发育，产生完全人抗体的成人样人组库和产生抗原特异性人mAb的能力来证明。这些结果还表明，引入含有更多数目的V基因、额外的调控元件和人Ig恒定区的更大部分的人Ig基因座可能基本上概括了作为针对感染和免疫的人体液反应的特征的完全组库。Green等的工作最近扩展至通过分别引入兆碱基大小的人重链基因座和κ轻链基因座的种系构型YAC片段来引入大于约80％的人抗体组库。参见Mendez等NatureGenetics 15：146-156(1997)和美国专利申请序列第08/759,620号

在以下专利申请序列和专利中进一步论述和描绘了XenoMouse小鼠的产生：美国专利申请序列第07/466,008号、序列第07/610,515号、序列第07/919,297号、序列第07/922,649号、序列第08/031,801号、序列第08/112,848号、序列第08/234,145号、序列第08/376,279号、序列第08/430,938号、序列第08/464,584号、序列第08/464,582号、序列第08/463,191号、序列第08/462,837号、序列第08/486,853号、序列第08/486,857号、序列第08/486,859号、序列第08/462,513号、序列第08/724,752号和序列第08/759,620号；以及美国专利第6,162,963号、第6,150,584号、第6,114,598号、第6,075,181号和第5,939,598号以及日本专利第 3 068 180 B2号、第3 068 506 B2号和第3 068 507 B2号。也参见Mendez等Nature Genetics 15：146-156(1997)以及Green和Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)、EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310和WO03/47336。

在替代方法中，包括GenPharm International，Inc.在内的其它公司已采用了“微基因座”方法。在微基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的片段(单个基因)来模拟外源Ig基因座。因此，将一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和第二恒定区(优选γ恒定区)形成为用于插入动物的构建体。这种方法描述于属于Surani等的美国专利第5,545,807号和每一个都属于Lonberg和Kay的美国专利第5,545,806号、第5,625,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号、第5,770,429号、第5,789,650号、第5,814,318号、第5,877,397号、第5,874,299号和第6,255,458号、属于的Krimpenfort和Berns的美国专利第5,591,669号和第6,023.010号、属于Berns等的美国专利第5,612,205号、第5,721,367号和第5,789,215号；和属于Choi和Dunn的美国专利第5,643,763号，以及GenPharm国际美国专利申请序第07/574,748号、序列第07/575,962号、序列第07/810,279号、序列第07/853,408号、序列第07/904,068号、序列第07/990,860号、序列第08/053,131号、序列第08/096,762号、序列第08/155,301号、序列第08/161,739号、序列第08/165,699号、序列第08/209,741号。也参见EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美国专利第5,981,175号。另参见Taylor等(1992)、Chen等(1993)、Tuaillon等(1993)、Choi等(1993)、Lonberg等(1994)、Taylor等(1994)和Tuaillon等(1995)、Fishwild等(1996)。

Kirin还已证实了从其中已通过微细胞融合引入了大片段染色体或整个染色体的小鼠产生人抗体。参见欧洲专利申请第773 288号和第843 961号。Xenerex Biosciences正在开发用于潜在产生人抗体的技术。在该技术中，用人淋巴细胞例如B和/或T细胞重建SCID小鼠。然后用抗原免疫小鼠，从而小鼠可产生针对该抗原的免疫反应。参见美国专利第5,476,996号、第5,698,767号和第5,958,765号。

人抗小鼠抗体(HAMA)反应已导致该行业制备嵌合或另外地人源化抗体。然而，预期会观察到某些人抗嵌合抗体(HACA)反应，特别是在抗体的长期或多剂量使用中。因此，希望提供包含针对FLT3的人结合结构域和针对CD3的人结合结构域的抗体构建体，以便消除对HAMA或HACA反应的担忧和/或其作用。

根据本发明，术语“(特异性)结合于”、“(特异性)识别”、“(特异性)针对”和“(特异性地)与......反应”意指结合结构域与靶分子(抗原)(此处分别为FLT3和CD3)上的给定表位或给定靶位点相互作用或特异性相互作用。

术语“表位”是指结合结构域诸如抗体或免疫球蛋白，或抗体或免疫球蛋白的衍生物、片段或变体所特异性结合的抗原上的部位。“表位”是抗原性的，因此术语表位在本文中有时也称为“抗原性结构”或“抗原决定簇”。因此，结合结构域是“抗原相互作用部位”。所述结合/相互作用也被理解为定义“特异性识别”。

“表位”可由连续的氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。“线性表位”是其中氨基酸一级序列包含被识别的表位的表位。线性表位通常在独特序列中包含至少3个或至少4个，更通常地至少5个或至少6个或至少7个，例如约8个至约10个氨基酸。

与线性表位相反，“构象表位”是这样的表位，其中包含表位的氨基酸的一级序列不是所识别的表位的唯一界定成分(例如，其中氨基酸的一级序列不一定被结合结构域识别的表位)。通常地，构象表位相对于线性表位包含增加数量的氨基酸。关于构象表位的识别，结合结构域识别抗原，优选肽或蛋白质或其片段(在发明的上下文中，结合结构域之一的抗原性结构包含在FLT3蛋白内)的三维结构。例如，当蛋白质分子折叠以形成三维结构时，形成构象表位的某些氨基酸和/或多肽主链变得并置，从而使抗体能够识别该表位。确定表位构象的方法包括但不限于x射线晶体学、二维核磁共振(2D-NMR)光谱学以及定点自旋标记和电子顺磁共振(EPR)光谱学。

下面描述了用于表位作图的方法：当人FLT3蛋白中的区域(连续氨基酸区段)与其非人和非灵长类FLT3抗原(例如，小鼠FLT3，但是其它动物如鸡、大鼠、仓鼠、兔等也可以是可能的)的相应区域交换/被其替换时，预期发生结合结构域的结合减少，除非结合结构域对所使用的非人、非灵长类FLT3是交叉反应性的。相较于对人FLT3蛋白中的相应区域的结合，所述减少优选为至少10％、20％、30％、40％或50％；更优选至少60％、70％或80％，最优选90％、95％或甚至100％，从而将对人FLT3蛋白中的相应区域的结合设定为100％。设想了前述人FLT3/非人FLT3嵌合体在CHO细胞中表达。还设想了人FLT3/非人FLT3嵌合体与不同膜结合蛋白诸如EpCAM的跨膜结构域和/或胞质结构域融合，参见实施例1和2。

在用于表位作图的替代或另外的方法中，可产生几种截短形式的人FLT3细胞外结构域以确定被结合结构域识别的特定区域。在这些截短的形式中，不同的细胞外FLT3结构域/亚结构域或区域被从N端开始逐步删除。描绘了在本发明的上下文中产生和使用的截短的FLT3形式，设想了截短的FLT3形式可在CHO细胞中表达。还设想了可将截短的FLT3形式与不同膜结合蛋白诸如EpCAM的跨膜结构域和/或胞质结构域融合。还设想了截短的FLT3形式可在其N末端包含信号肽结构域例如源自小鼠IgG重链信号肽的信号肽。进一步设想了截短的FLT3形式可在其N末端(信号肽之后)包含v5结构域，这允许验证它们在细胞表面上的正确表达。对于不再包含被结合结构域识别的FLT3区域的那些截短的FLT3形式，预期发生结合的减少或丧失。结合的减少优选为至少10％、20％、30％、40％、50％；更优选至少60％、70％、80％，最优选90％、95％或甚至100％，从而将与完整人FLT3蛋白(或其细胞外区或结构域)的结合设定为100％，参见实施例3。

确定靶抗原的特定残基对由抗体构建体或结合结构域产生的识别的贡献的另一种方法是丙氨酸扫描(参见例如Morrison KL & Weiss GA.Cur Opin Chem Biol.2001Jun；5(3)：302-7)，其中待分析的每个残基被丙氨酸替代，例如通过定点诱变。使用丙氨酸是因为其具有非庞大的具有化学惰性的甲基官能团，但所述官能团可模拟许多另外的氨基酸所具有的二级结构参考。在其中需要保持突变残基的尺寸的情况下，有时使用庞大的氨基酸诸如缬氨酸或亮氨酸。丙氨酸扫描是已经使用了很长一段时间的成熟技术。

结合结构域与表位或包含表位的区域之间的相互作用表明结合结构域对特定蛋白质或抗原(此处分别为FLT3和CD3)的表位/包含表位的区域表现出可估计的亲和力，并且通常不表现出与除FLT3或CD3外的蛋白质或抗原的显著反应性。“可估计的亲和力”包括以约10^-6M(KD)或更强的亲和力的结合。优选地，当结合亲和力为约10^-12至10^-8M、10^-12至10^-9M、10^-12至10^-10M、10^-11至10^-8M，优选约10^-11至10^-9M时，结合被认为是特异性的。结合结构域是否与靶标特异性反应或与靶标特异性结合可通过尤其，将所述结合结构域与靶蛋白或抗原的反应与所述结合结构域与除FLT3或CD3外的蛋白质或抗原的反应相比较来容易地测试。优选地，本发明的结合结构域基本上或大体上不与除FLT3或CD3外的蛋白质或抗原结合(即，第一结合结构域不能结合除FLT3外的蛋白质，并且第二结合结构域不能结合除CD3外的蛋白质)。

术语“基本上/大体上不结合”或“不能结合”意指本发明的结合结构域不结合除FLT3或CD3外的蛋白质或抗原，即不显示超过30％，优选不显示超过20％，更优选不显示超过10％，特别优选不显示超过9％、8％、7％、6％或5％的与除FLT3或CD3外的蛋白质或抗原的反应性，从而将与FLT3或CD3的结合分别设定为100％。

据信特异性结合是通过结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特定基序实现的。因此，结合作为其一级、二级和/或三级结构的结果以及作为所述结构的二级修饰的结果而实现。抗原相互作用部位与其特异性抗原的特异性相互作用可导致所述部位与抗原的简单结合。此外，抗原相互作用部位与其特异性抗原的特异性相互作用可以可选地或另外地导致信号的启动，例如，由于抗原构象的改变、抗原的寡聚化等的诱导。

在另一方面，本发明提供了双特异性抗体构建体，其包含与靶细胞表面上的人FLT3结合的第一结合结构域和与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域，其中第一结合结构域与包含在人FLT3的区域内的FLT3的表位结合，所述区域具有如SEQ ID NO：814(簇1)或SEQ ID NO：816(簇3)中所示的序列。

优选地，本发明的双特异性抗体构建体的第一结合结构域包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，所述CDR选自由以下各项组成的组：

SEQ ID NO：151-156、SEQ ID NO：161-166、SEQ ID NO：171-176、SEQ ID NO：181-186、SEQ ID NO：191-196、SEQ ID NO：201-206、SEQ ID NO：211-216、SEQ ID NO：221-226、SEQ ID NO：231-236、SEQ ID NO：241-246、SEQ ID NO：251-256、SEQ ID NO：261-266、SEQID NO：271-276、SEQ ID NO：281-286、SEQ ID NO：291-296、SEQ ID NO：301-306、SEQ IDNO：311-316、SEQ ID NO：321-326、SEQ ID NO：331-336、SEQ ID NO：341-346、SEQ ID NO：351-356、SEQ ID NO：361-366、SEQ ID NO：371-376、SEQ ID NO：381-386、SEQ ID NO：391-396、SEQ ID NO：401-406、SEQ ID NO：411-416、SEQ ID NO：421-426、SEQ ID NO：431-436、SEQ ID NO：441-446、SEQ ID NO：451-456、SEQ ID NO：461-466、SEQ ID NO：471-476、SEQID NO：481-486、SEQ ID NO：491-496、SEQ ID NO：501-506、SEQ ID NO：511-516、SEQ IDNO：521-526、SEQ ID NO：531-536、SEQ ID NO：541-546、SEQ ID NO：551-556、SEQ ID NO：561-566、SEQ ID NO：571-576、SEQ ID NO：581-586、SEQ ID NO：591-596、SEQ ID NO：601-606、SEQ ID NO：611-616、SEQ ID NO：621-626、SEQ ID NO：631-636、SEQ ID NO：641-646、SEQ ID NO：651-656、SEQ ID NO：661-666、SEQ ID NO：671-676、SEQ ID NO：681-686、SEQID NO：691-696、SEQ ID NO：701-706、SEQ ID NO：711-716、SEQ ID NO：721-726、SEQ IDNO：731-736、SEQ ID NO：741-746、SEQ ID NO：751-756、SEQ ID NO：761-766、SEQ ID NO：771-776、SEQ ID NO：781-786、SEQ ID NO：791-796。

术语“可变的”是指抗体或免疫球蛋白结构域的部分(即“可变结构域”)，所述部分在其序列中表现出可变性并涉及确定特定抗体的特异性和结合亲和力。可变重链(VH)和可变轻链(VL)的配对一起形成单个抗原结合部位。

变异性不是均匀地分布在整个抗体的可变结构域中；其集中在每个重链和轻链可变区的子域中。这些子结构域称为“高变区”或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的更保守的(即，非高变的)部分称为“框架”区(FRM或FR)，并为三维空间中的六个CDR提供支架以形成抗原结合表面。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其主要利用通过三个高变区连接的β-折叠构型，其形成环连接，并且在一些情况下形成β折叠结构的部分。每条链中的高变区通过FRM紧密地保持在一起，并与来自另一条链的高变区一起促成抗原结合部位的形成(参见Kabat等，在上述引文中)。

术语“CDR”及其复数“CDRs”是指互补决定区，其中三个互补决定区构成轻链可变区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)的结合特征以及三个互补决定区构成重链可变区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的结合特征。CDR含有大部分负责抗体与抗原的特异性相互作用的残基，因此促成了抗体分子的功能活性：它们是抗原特异性的主要决定簇。

确切定义的CDR边界及长度受到不同分类和编号系统的影响。因此，所述CDR可参考Kabat、Chothia、接触或任何其它边界的定义，包括本文所述的编号系统。尽管有不同的边界，但这些系统中的每一个构成可变序列内的所谓“高变区”时具有一定程度的重叠。因此根据这些系统的CDR定义就相近的框架区在长度和边界区方面有所不同。参见例如Kabat(基于跨物种序列可变性的方法)、Chothia(基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法)和/或MacCallum(Kabat等，在上述引文中；Chothia等，J.MoI.Biol，1987，196：901-917；和MacCallum等，J.MoI.Biol，1996，262：732)。用于表征抗原结合部位的另一个标准是由Oxford Molecular′s AbM抗体建模软件使用的AbM定义的。参见，例如，Protein Sequenceand Structure Analysis of Antibody Variable Domains.于Antibody EngineeringLab Manual(编辑：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)中。从某种程度上说，两个残基鉴定技术定义重叠的区域而不是相同区域，可将它们组合来定义杂合CDR。然而，按照所谓的Kabat系统的编号是优选的。

通常地，CDR形成可被分类为规范结构的环结构。术语“规范结构”是指抗原结合(CDR)环所采用的主链构象。通过比较结构研究发现，六个抗原结合环中的五个仅具有有限的可用构象组库。每个规范结构可由多肽骨架的扭角来表征。因此，抗体之间的对应环可具有非常相似的三维结构，尽管环的大多数部分中存在高氨基酸序列可变性(Chothia和Lesk，J.MoI.Biol.，1987，196：901；Chothia等，Nature，1989，342：877；Martin和Thornton，J.MoI.Biol，1996，263：800)。此外，所采用的环结构与其周围的氨基酸序列之间有关系。特定规范类别的构象由环的长度和位于环内以及保守框架内(即，环外)的关键位置处的氨基酸残基确定。因此可基于这些关键氨基酸残基的存在来进行至特定规范类别的分配。

术语“规范结构”还可包括关于抗体的线性序列(例如，如由Kabat编目的(Kabat等，在上述引文中))的考虑。Kabat编号方案(系统)是以一致的方式对抗体可变结构域的氨基酸残基进行编号的广泛采用的标准，并且也是本发明中应用的优选方案，如也在本文其它地方所提及的。还可使用额外的结构考虑来确定抗体的规范结构。例如，Kabat编号没有充分反映的那些差异可以通过Chothia等的编号系统来描述和/或通过其它技术例如晶体学以及二维或三维计算建模来揭示。因此，可将给定的抗体序列置于规范类别中，该类别允许尤其，鉴定适当的底盘序列(例如，基于在文库中包括各种规范结构的期望)。抗体氨基酸序列的Kabat编号和结构考虑(如由Chothia等(在上述引文中)描述的)及其用于解释抗体结构的规范方面的含义，在文献中进行了描述。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型在本领域中是公知的。关于抗体结构的综述，参见Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，编辑Harlow等，1988。

轻链的CDR3，特别是重链的CDR3可构成轻链和重链可变区内抗原结合中最重要的决定簇。在一些抗体构建体中，重链CDR3似乎构成抗原与抗体之间的主要接触区域。其中单独改变CDR3的体外选择方案可用于改变抗体的结合特性或确定哪些残基促成抗原的结合。因此，CDR3通常是抗体结合部位内分子多样性的最大来源。例如，H3可以短至两个氨基酸残基或多于26个氨基酸。

在规范的全长抗体或免疫球蛋白中，每条轻(L)链通过一个共价二硫键与重(H)链连接，而两条H链通过一个或多个二硫键彼此连接，这取决于H链同种型。最靠近VH的CH结构域通常被称为CHl。恒定(“C”)结构域不直接参与抗原结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体激活。抗体的Fc区包含在重链恒定结构域内并且例如能够与位于细胞表面的Fc受体相互作用。

装配和体细胞突变之后的抗体基因的序列高度变化，估计这些不同的基因编码10¹⁰种不同的抗体分子(Immunoglobulin Genes，第2版，编辑.Jonio等，Academic Press，San Diego，CA，1995)。因此，免疫系统提供了免疫球蛋白的组库。术语“组库”是指至少一个完全或部分来源于至少一个编码至少一个免疫球蛋白的序列的核苷酸序列。所述序列可通过重链的V、D和J区段以及轻链的V和J区段的体内重排来产生。或者，可从响应于例如体外刺激而发生重排的细胞产生所述序列。或者，部分或全部序列可通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变和其它方法获得，参见例如，美国专利第5,565,332号。组库可以只包括一个序列或可以包括多个序列，包括遗传多样性集合中的序列。

根据本发明的优选抗体构建体也可被定义为双特异性抗体构建体，其包含与靶细胞表面上的人FLT3结合的第一(优选人)结合结构域和与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域，其中所述第一结合结构域与选自由FL-1至FL-65组成的组的抗体(即包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区的抗体)结合相同的FLT3的表位，所述CDR选自由以下各项组成的组：

可以例如通过利用嵌合或截短的靶分子(例如如上文中和所附实施例中所述的)进行表位作图，来测量抗体构建体是否与另一给定抗体构建体结合相同的FLT3的表位。

根据本发明的优选抗体构建体也可以定义为双特异性抗体构建体，其包含与靶细胞表面上的人FLT3结合的第一(优选人)结合结构域和与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域，其中所述第一结合结构域与选自由FL-1至FL-65组成的组的抗体(即，包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区的抗体，所述CDR选自由上述CDR组成的组)竞争结合。

可在竞争测定诸如竞争性ELISA或基于细胞的竞争测定中测量抗体构建体是否与另一种给定的抗体构建体竞争结合。还可使用偶联有抗生物素蛋白的微粒(珠粒)。与涂覆有抗生物素蛋白的ELISA板类似，当与生物素化蛋白质反应时，这些珠粒中的每一个可用作可在其上进行测定的基底。将抗原涂覆在珠粒上，然后用第一抗体预涂覆。添加第二抗体并确定任何额外的结合。可能的读出装置包括流式细胞术。

在一个实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自由以下各项中所示的VH区组成的组的VH区：SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ IDNO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ IDNO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ IDNO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ IDNO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ IDNO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ IDNO：737、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：757、SEQ ID NO：767、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：787和SEQ ID NO：797。

在另外的实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自由以下各项中所示的VL区组成的组的VL区：SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ IDNO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ IDNO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ IDNO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ IDNO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ IDNO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ IDNO：738、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：788和SEQ ID NO：798。

在另一个实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自由以下各项中所示的成对的VH区和VL区组成的组的VH区和VL区：SEQ ID NO：157+158、SEQ ID NO：167+168、SEQ ID NO：177+178、SEQ ID NO：187+188、SEQ ID NO：197+198、SEQ ID NO：207+208、SEQ ID NO：217+218、SEQ ID NO：227+228、SEQ ID NO：237+238、SEQ ID NO：247+248、SEQ ID NO：257+258、SEQ ID NO：267+268、SEQ ID NO：277+278、SEQ ID NO：287+288、SEQID NO：297+298、SEQ ID NO：307+308、SEQ ID NO：317+318、SEQ ID NO：327+328、SEQ IDNO：337+338、SEQ ID NO：347+348、SEQ ID NO：357+358、SEQ ID NO：367+368、SEQ ID NO：377+378、SEQ ID NO：387+388、SEQ ID NO：397+398、SEQ ID NO：407+408、SEQ ID NO：417+418、SEQ ID NO：427+428、SEQ ID NO：437+438、SEQ ID NO：447+448、SEQ ID NO：457+458、SEQ ID NO：467+468、SEQ ID NO：477+478、SEQ ID NO：487+488、SEQ ID NO：497+498、SEQID NO：507+508、SEQ ID NO：517+518、SEQ ID NO：527+528、SEQ ID NO：537+538、SEQ IDNO：547+548、SEQ ID NO：557+558、SEQ ID NO：567+568、SEQ ID NO：577+578、SEQ ID NO：587+588、SEQ ID NO：597+598、SEQ ID NO：607+608、SEQ ID NO：617+618、SEQ ID NO：627+628、SEQ ID NO：637+638、SEQ ID NO：647+648、SEQ ID NO：657+658、SEQ ID NO：667+668、SEQ ID NO：677+678、SEQ ID NO：687+688、SEQ ID NO：697+698、SEQ ID NO：707+708、SEQID NO：717+718、SEQ ID NO：727+728、SEQ ID NO：737+738、SEQ ID NO：747+748、SEQ IDNO：757+758、SEQ ID NO：767+768、SEQ ID NO：777+778、SEQ ID NO：787+788和SEQ ID NO：797+798。

在另外的实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自由以下各项中所示的多肽组成的组的多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ IDNO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249和SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279和SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319和SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ IDNO：349和SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379和SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419和SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449和SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479和SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ IDNO：509、SEQ ID NO：519和SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549和SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579和SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619和SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649和SEQ ID NO：659、SEQID NO：669、SEQ ID NO：679和SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719和SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749和SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779和SEQ ID NO：789和SEQ ID NO：799。

上述第一结合结构域(其由它们的CDR、VH区和VL区及其组合指定)表征为与包含在如SEQ ID NO：819中所示的区域内的FLT3的表位结合的结合结构域。

如本文中所用，术语“双特异性的”是指为“至少双特异性的”抗体构建体，即其包含至少第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域与一种抗原或靶标(此处为FLT3)结合，并且第二结合结构域与另一抗原或靶标(此处为CD3)结合。因此，根据本发明的抗体构建体包含针对至少两种不同抗原或靶标的特异性。本发明的术语“双特异性抗体构建体”还包括多特异性抗体构建体诸如三特异性抗体构建体，后者包括三个结合结构域，或具有多于三个(例如四个、五个......)特异性的构建体。

鉴于根据本发明的抗体构建体是(至少)双特异性的，因此它们不是天然存在的，并且它们与天然存在的产物明显不同。因此，“双特异性的”抗体构建体或免疫球蛋白是人工杂合抗体或免疫球蛋白，其具有至少两个具有不同特异性的不同结合部位。双特异性抗体构建体可通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见例如，Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)。

本发明的抗体构建体的至少两个结合结构域和可变结构域可以包含或可以不包含肽接头(间隔肽)。根据本发明，术语“肽接头”包含本发明的抗体构建体的一个(可变和/或结合)结构域与另一个(可变和/或结合)结构域的氨基酸序列籍以相互连接的氨基酸序列。此类肽接头的基本技术特征是其不包含任何聚合活性。在合适的肽接头中有在美国专利第4,751,180号和第4,935,233号或WO 88/09344中所述的那些肽接头。肽接头也可用于将其它结构域或模块或区域(诸如半衰期延长结构域)附接至本发明的抗体构建体。

在使用接头的情况下，该接头优选具有足以确保第一和第二结构域中的每一个可以相互独立地保持它们的差异结合特异性的长度和序列。对于连接本发明的抗体构建体中的至少两个结合结构域(或两个可变结构域)的肽接头，仅包含少数氨基酸残基例如12个氨基酸残基或更少氨基酸残基的那些肽接头是优选的。因此，具有12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个或5个氨基酸残基的肽接头是优选的。具有少于5个氨基酸的设想的肽接头包含4个、3个、2个或1个氨基酸，其中富含Gly的接头是优选的。在所述“肽接头”的上下文中，特别优选的“单个”氨基酸是Gly。因此，所述肽接头可由单个氨基酸Gly组成。肽接头的另一个优选实施方案的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly₄Ser(SEQ ID NO：1)或其聚合物，即(Gly₄Ser)x，其中x是为1或更大(例如2或3)的整数。优选接头描绘于SEQ ID NO：1-9。不存在二级结构的促进的所述肽接头的特征是本领域已知的，并且描述于例如Dall'Acqua等(Biochem.(1998)37，9266-9273)，Cheadle等(Mol Immunol(1992)29，21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB(1995)9(1)，73-80)中。此外不促进任何二级结构的肽接头是优选的。可以例如通过遗传工程(如实施例中所述的)提供所述结构域彼此的键联。用于制备融合的和有效连接的双特异性单链构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表达它们的方法是本领域所公知的(例如WO 99/54440或Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。

如上文所述，本发明提供了优选实施方案，其中抗体构建体呈选自由(scFv)₂、scFv-单结构域mAb、双抗体和任何这些形式的寡聚体组成的组的形式。

根据特别优选的实施方案，并且如所附实施例中所述，本发明的抗体构建体是“双特异性单链抗体构建体”，更优选双特异性“单链Fv”(scFv)。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法通过合成接头(如上文所述的)将它们连接起来，使得它们能够被制备为单一蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子；参见例如，Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整或全长抗体相同的方式评估片段的功能。因此，单链可变片段(scFv)是通常用约10至约25个氨基酸，优选约15至20个氨基酸的短接头肽连接的免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。接头通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管除去恒定区和引入接头，但该蛋白保留了原始免疫球蛋白的特异性。

双特异性单链分子是本领域已知的，并描述于WO 99/54440，Mack，J.Immunol.(1997)，158，3965-3970，Mack，PNAS，(1995)，92，7021-7025，Kufer，CancerImmunol.Immunother.，(1997)，45，193-197，Blood，(2000)，95，6，2098-2103，Immunol.，(2001)，166，2420-2426，Kipriyanov，J.Mol.Biol.，(1999)，293，41-56中。针对单链抗体的产生所描述的技术(尤其，参见，美国专利第4,946,778号，Kontermann和(2010)，在上述引文中，和Little(2009)，在上述引文中)可适于产生特异性识别(一种或多种)选定的靶标的单链抗体构建体。

双价(也称为二价)或双特异性单链可变片段(具有(scFv)₂形式的双-scFv或二-scFv)可通过连接两个scFv分子(例如，利用如上文所述的接头)来工程化。如果这两个scFv分子具有相同的结合特异性，则所得的(scFv)₂分子将优选地被称为双价的(即其对相同的靶表位具有两个效价)。如果两个scFv分子具有不同的结合特异性，则所得的(scFv)₂分子将优选地被称为双特异性的。所述连接可通过用两个VH区和两个VL区产生单一肽链，从而产生串联scFv来实现(参见例如Kurfer P.等，(2004)Trends in Biotechnology 22(5)：238-244)。另一种可能性是产生具有接头肽的scFv分子，所述接头肽对于两个可变区折叠在一起而言太短(例如约5个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化。这种类型被称为双抗体(参见例如Hollinger，Philipp等，(1993年7月)Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 90(14)：6444-8.)。

根据本发明的抗体构建体的另一个优选的实施方案，与靶抗原FLT3或CD3结合的结合结构域的重链(VH)和轻链(VL)不经由上述肽接头直接连接，而结合结构域因双特异性分子的形成(如针对双抗体所描述的)而形成。因此，可将CD3结合结构域的VH链通过此类肽接头与FLT3结合结构域的VL融合，而将FLT3结合结构域的VH链通过此类肽接头与CD3结合结构域的VL融合。

单结构域抗体仅包含一个(单体)抗体可变结构域，其能够独立于其它V区或结构域而选择性地与特定抗原结合。第一个单结构域抗体是从骆驼科动物中发现的重链抗体工程化而来的，这些抗体被称为V_HH片段。软骨鱼类也具有重链抗体(IgNAR)，可从其获得称为V_NAR片段的单结构域抗体。替代方法是将来自普通免疫球蛋白(例如来自人或啮齿类动物)的二聚可变结构域分裂成单体，从而获得作为单结构域Ab的VH或VL。虽然目前对单结构域抗体的大多数研究是基于重链可变结构域，但从轻链衍生的纳米抗体也已显示出与靶表位特异性结合。单结构域抗体的实例被称为sdAb、纳米抗体或单可变结构域抗体。

因此(单结构域mAb)₂是由(至少)两个单结构域单克隆抗体组成的单克隆抗体构建体，其单独地选自包含VH、VL、V_HH和V_NAR的组。接头优选呈肽接头的形式。类似地，“scFv-单结构域mAb”是由至少一个如上所述的单结构域抗体和如上所述的一个scFv分子组成的单克隆抗体构建体。此外，接头优选呈肽接头的形式。

此外还设想，本发明提供了双特异性抗体构建体，其包含与靶细胞表面上的人FLT3结合的第一结合结构域和与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域，其中第一结合结构域与包含在如SEQ ID NO：819(簇1)中所示的区域内的FLT3的表位结合。

因此，在本发明的另外方面，双特异性抗体构建体的第一结合结构域包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，所述CDR选自由以下各项组成的组：

SEQ ID NO：151-156、SEQ ID NO：161-166、SEQ ID NO：171-176、SEQ ID NO：181-186、SEQ ID NO：191-196、SEQ ID NO：201-206、SEQ ID NO：211-216、SEQ ID NO：221-226、SEQ ID NO：231-236、SEQ ID NO：241-246、SEQ ID NO：251-256、SEQ ID NO：261-266、SEQID NO：271-276、SEQ ID NO：281-286、SEQ ID NO：291-296、SEQ ID NO：301-306、SEQ IDNO：311-316、SEQ ID NO：321-326、SEQ ID NO：331-336、SEQ ID NO：341-346、SEQ ID NO：351-356、SEQ ID NO：361-366、SEQ ID NO：371-376、SEQ ID NO：381-386、SEQ ID NO：391-396、SEQ ID NO：401-406、SEQ ID NO：411-416、SEQ ID NO：421-426、SEQ ID NO：431-436、SEQ ID NO：441-446、SEQ ID NO：451-456、SEQ ID NO：461-466、SEQ ID NO：471-476、SEQID NO：481-486、SEQ ID NO：491-496、SEQ ID NO：501-506、SEQ ID NO：511-516、SEQ IDNO：521-526、SEQ ID NO：531-536、SEQ ID NO：541-546、SEQ ID NO：551-556、SEQ ID NO：561-566、SEQ ID NO：571-576、SEQ ID NO：581-586、SEQ ID NO：591-596、SEQ ID NO：601-606、SEQ ID NO：611-616、SEQ ID NO：621-626、SEQ ID NO：631-636、SEQ ID NO：641-646、SEQ ID NO：651-656、SEQ ID NO：661-666、SEQ ID NO：671-676、SEQ ID NO：681-686、SEQID NO：691-696、SEQ ID NO：701-706、SEQ ID NO：711-716、SEQ ID NO：721-726、SEQ IDNO：731-736、SEQ ID NO：741-746、SEQ ID NO：791-796。

在一个实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自由以下各项中所示的VH区组成的组的VH区：SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ IDNO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ IDNO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ IDNO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ IDNO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ IDNO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：747和SEQ IDNO：797。

在另外的实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自由以下各项中所示的VL区组成的组的VL区：SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ IDNO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ IDNO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ IDNO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ IDNO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ IDNO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：748和SEQ IDNO：798。

在另一个的实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自由以下各项中所示的成对的VH区和VL区组成的组的VH区和VL区：SEQ ID NO：157+158、SEQ ID NO：167+168、SEQ ID NO：177+178、SEQ ID NO：187+188、SEQ ID NO：197+198、SEQ ID NO：207+208、SEQ ID NO：217+218、SEQ ID NO：227+228、SEQ ID NO：237+238、SEQ ID NO：247+248、SEQ ID NO：257+258、SEQ ID NO：267+268、SEQ ID NO：277+278、SEQ ID NO：287+288、SEQID NO：297+298、SEQ ID NO：307+308、SEQ ID NO：317+318、SEQ ID NO：327+328、SEQ IDNO：337+338、SEQ ID NO：347+348、SEQ ID NO：357+358、SEQ ID NO：367+368、SEQ ID NO：377+378、SEQ ID NO：387+388、SEQ ID NO：397+398.、SEQ ID NO：407+408、SEQ ID NO：417+418、SEQ ID NO：427+428、SEQ ID NO：437+438、SEQ ID NO：447+448、SEQ ID NO：457+458、SEQ ID NO：467+468、SEQ ID NO：477+478、SEQ ID NO：487+488、SEQ ID NO：497+498、SEQID NO：507+508、SEQ ID NO：517+518、SEQ ID NO：527+528、SEQ ID NO：537+538、SEQ IDNO：547+548、SEQ ID NO：557+558、SEQ ID NO：567+568、SEQ ID NO：577+578、SEQ ID NO：587+588、SEQ ID NO：597+598、SEQ ID NO：607+608、SEQ ID NO：617+618、SEQ ID NO：627+628、SEQ ID NO：637+638、SEQ ID NO：647+648、SEQ ID NO：657+658、SEQ ID NO：667+668、SEQ ID NO：697+698、SEQ ID NO：707+708、SEQ ID NO：717+718、SEQ ID NO：727+728、SEQID NO：737+738、SEQ ID NO：747+748和SEQ ID NO：797+798。

在另外的实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自由以下各项中所示的多肽组成的组的多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ IDNO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279和SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ IDNO：349、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379和SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419和SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449、SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479和SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ IDNO：509、SEQ ID NO：519和SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579和SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619和SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：659、SEQ IDNO：669、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719和SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749和SEQ ID NO：799。

还设想了本发明提供了双特异性抗体构建体，其包含与靶细胞表面上的人FLT3结合的第一结合结构域和与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域，其中第一结合结构域与包含在如SEQ ID NO：821(簇3)中所示的区域内的FLT3的表位结合。

因此，在本发明的另外方面，双特异性抗体构建体的第一结合结构域包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，所述CDR如下：

SEQ ID NO：671-676、SEQ ID NO：681-686、SEQ ID NO：751-756、SEQ ID NO：761-766、SEQ ID NO：771-776和SEQ ID NO：781-786。

在一个实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：757、SEQ ID NO：767、SEQ ID NO：777和SEQ ID NO：787中所示的VH区。

在另外的实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：778和SEQ ID NO：788中所示的VL区。

在另一个实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区和VL区选自由SEQ ID NO：677+678、SEQ ID NO：677+678、SEQ ID NO：687+688、SEQID NO：757+758、SEQ ID NO：767+768、SEQ ID NO：777+778和SEQ ID NO：787+788中所示的成对的VH区和VL区组成的组。

在另外的实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自由SEQ IDNO：679和SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779和SEQ ID NO：789中所示的多肽组成的组的多肽。

根据本发明的另一个优选抗体构建体还可被定义为双特异性抗体构建体，其包含与靶细胞表面上的人FLT3结合的第一(优选人)结合结构域和与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域，其中第一结合结构域与选自由FL-1至FL-53、FL-55至FL-60和FL-65组成的组的抗体(即包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区域的抗体，选自由上述组成的组)竞争结合。

T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥核心作用的一种类型的淋巴细胞(其本身是一种类型的白细胞)。存在几个T细胞的亚组，每个亚组有独特的功能。T细胞可通过细胞表面上的T细胞受体(TCR)的存在而与其它淋巴细胞诸如B细胞和NK细胞相区分。TCR负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原，并且由两种不同的蛋白质链组成。在95％的T细胞中，TCR由阿尔法(α)和贝塔(β)链组成。当TCR与抗原肽和MHC(肽/MHC复合物)接合时，T淋巴细胞通过一系列由相关酶、共受体、专门的衔接分子和激活或释放的转录因子介导的生物化学事件来进行激活。

CD3受体复合物是蛋白质复合物，并由四条链组成。在哺乳动物中，复合物含有CD3γ(伽马)链、CD3δ(德尔塔)链和两条CD3ε(艾普西龙)链。这些链与T细胞受体(TCR)和所谓的ζ(泽塔)链缔合，以形成T细胞受体CD3复合物，并在T淋巴细胞中产生激活信号。CD3γ(伽马)、CD3δ(德尔塔)和CD3ε(艾普西龙)链是包含单个细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3分子的细胞内尾部含有单一的保守基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或简称ITAM，其对于TCR的信号传导能力是必需的。CD3ε分子是在人中由位于染色体11上的CD3E基因编码的多肽。CD3ε的最优选表位包含在人CD3ε细胞外结构域的氨基酸残基1-27内。

通过由多特异性，至少双特异性的抗体构建体募集T细胞进行的靶细胞的重新定向溶解包括溶细胞突触形成以及穿孔素和粒酶的递送。接合的T细胞能够连续溶解靶细胞，并且不受干扰肽抗原加工和呈递的免疫逃逸机制或克隆T细胞分化的影响；参见，例如，WO2007/042261。

可以以各种方式测量由FLT3xCD3双特异性抗体构建体介导的细胞毒性。参见实施例10。效应细胞可以是例如刺激富集的(人)CD8阳性T细胞或未经刺激的(人)外周血单核细胞(PBMC)。如果靶细胞是猕猴来源的或表达猕猴FLT3或用猕猴FLT3转染的，那么效应细胞也应该是猕猴起源的，诸如猕猴T细胞系，例如4119LnPx。靶细胞应该表达FLT3(至少是FLT3的细胞外结构域)，例如人或猕猴FLT3。靶细胞可以是用FLT3(例如，人或猕猴FLT3)稳定或瞬时转染的细胞系(诸如CHO)。或者，靶细胞可以是FLT3阳性天然型表达者细胞系，诸如FLT3阳性人AML细胞系EOL-1、MOLM-13和MV4-11。对于在细胞表面上表达更高水平的FLT3的靶细胞系，通常预期EC50值较低。效应子与靶细胞(E∶T)的比率通常约为10∶1，但也可以变化。FLT3xCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性可以在51-铬释放测定(约18小时的孵育时间)中或在基于FACS的细胞毒性测定(约48小时的孵育时间)中测量。测定孵育时间(细胞毒性反应)的修改也是可能的。其它测量细胞毒性的方法对于本领域技术人员来说是公知的，包括MTT或MTS测定、基于ATP的测定，包括生物发光测定、磺酰罗丹明B(SRB)测定、WST测定、克隆形成测定和ECIS技术。

由本发明的FLT3xCD3双特异性抗体构建体介导的细胞毒性活性优选在基于细胞的细胞毒性测定中测量。其也可在51-铬释放测定中测量。其由EC₅₀值表示，所述值对应于半最大有效浓度(诱导处于基线与最大值中间的细胞毒性反应的抗体构建体的浓度)。优选地，FLT3xCD3双特异性抗体构建体的EC₅₀值≤5000pM或≤4000pM，更优选≤3000pM或≤2000pM，甚至更优选≤1000pM或≤500pM，甚至更优选≤400pM或≤300pM，甚至更优选≤200pM，甚至更优选≤100pM，甚至更优选≤50pM，甚至更优选≤20pM或≤10pM，最优选≤5pM。

以上给出的EC₅₀值可在不同的测定中测量。本领域技术人员知道，与未经刺激的PBMC相比，当刺激/富集的CD8+ T细胞用作效应细胞时，可预期EC₅₀值较低。此外可以预期，与低靶标表达大鼠相比，当靶细胞表达高数量的靶抗原时，EC₅₀值较低。例如，当使用刺激/富集的人CD8+ T细胞作为效应细胞(并且使用FLT3转染的细胞诸如CHO细胞或FLT3阳性人AML细胞系EOL-1、MOLM-13和MV4-11作为靶细胞)时，FLT3xCD3双特异性抗体构建体的EC₅₀值优选≤1000pM，更优选≤500pM，甚至更优选≤250pM，甚至更优选≤100pM，甚至更优选≤50pM，甚至更优选≤10pM，最优选≤5pM。当人PBMC用作效应细胞时，FLT3xCD3双特异性抗体构建体的EC₅₀值优选≤5000pM或≤4000pM(特别是当靶细胞是FLT3阳性人AML细胞系EOL-1、MOLM-13和MV4-11时)，更优选≤2000pM(特别是当靶细胞是FLT3转染细胞诸如CHO细胞时)，更优选≤1000pM或≤500pM，甚至更优选≤200pM，甚至更优选≤150pM，甚至更优选≤100pM，且最优选≤50pM，或更低。当使用猕猴T细胞系诸如LnPx4119作为效应细胞，并且使用猕猴FLT3转染的细胞系诸如CHO细胞作为靶细胞系时，FLT3xCD3双特异性抗体构建体的EC₅₀值优选≤2000pM或≤1500pM，更优选≤1000pM或≤500pM，甚至更优选≤300pM或≤250pM，甚至更优选≤100pM，最优选≤50pM。

优选地，本发明的FLT3xCD3双特异性抗体构建体不诱导/介导或基本上不诱导/介导FLT3阴性细胞诸如CHO细胞的溶解。术语“不诱导溶解”、“基本上不诱导溶解”、“不介导溶解”或“基本上不介导溶解”意指本发明的抗体构建体不诱导或介导超过30％，优选不介导超过20％，更优选不介导超过10％，特别优选不介导超过9％、8％、7％、6％或5％的FLT3阴性细胞的溶解，从而将FLT3阳性人肺癌细胞系SHP-77(见上)的溶解设定为100％。这通常适用于浓度高达500nM的抗体构建体。本领域技术人员知道如何测量细胞溶解而需再费周折。此外，本说明书教导了如何测量细胞溶解的具体说明。

单个FLT3 xCD3双特异性抗体构建体的单体与二聚体同种型之间的细胞毒性活性的差异称为“效力差距”。这种效力差距可以例如计算为分子的单体与二聚体形式的EC₅₀值之间的比率，参见实施例17。本发明的FLT3xCD3双特异性抗体构建体的效力差距优选≤5，更优选≤4，甚至更优选≤3，甚至更优选≤2，最优选≤1。

本发明的抗体构建体的第一个和/或第二(或任何另外的)结合结构域优选对于哺乳动物灵长目的成员是跨物种特异性的。例如，在WO 2008/119567中描述了跨物种特异性CD3结合结构域。根据一个实施方案，除了分别与人FLT3和人CD3结合以外，第一和/或第二结合结构域还将与灵长类动物(包括(但不限于)新世界灵长类动物(诸如普通狨猴(Callithrix jacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinus Oedipus)、松鼠猴(Saimiri sciureus))、旧世界灵长类动物(诸如狒狒和猕猴)、长臂猿、猩猩和非人人亚科(non-humanhomininae))的FLT3/CD3结合。设想了与靶细胞表面上的人FLT3结合的本发明的抗体构建体的第一结合结构域还至少与猕猴FLT3结合，和/或与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域还至少与猕猴CD3结合。优选猕猴是食蟹猕猴(Macaca fascicularis)。还设想了猕猴(Macaca mulatta)(恒河猴(Rhesus))。

在本发明的一个方面，第一结合结构域与人FLT3结合，并且还与猕猴FLT3诸如食蟹猕猴的FLT3结合，更优选与猕猴细胞表面上表达的猕猴FLT3结合。优选食蟹猕猴FLT3示于SEQ ID NO：802中。第一结合结构域对猕猴FLT3的亲和力优选≤15nM，更优选≤10nM，甚至更优选≤5nM，甚至更优选≤1nM，甚至更优选≤0.5nM，甚至更优选≤0.1nM，最优选≤0.05nM或甚至≤0.01nM。

优选地，根据本发明的抗体构建体对于结合猕猴FLT3对比人FLT3的亲和力差距[ma FLT3：hu FLT3](如例如通过BiaCore或通过Scatchard分析测定的)＜100，优选＜20，更优选＜15，进一步优选＜10，甚至更优选＜8，更优选＜6，最优选＜2。根据本发明的抗体构建体对于结合猕猴FLT3对比人FLT3的亲和力差距的优选范围是在0.1与20之间，更优选在0.2与10之间，甚至更优选在0.3与6之间，甚至更优选在0.5与3之间或在0.5和2.5之间，最优选在0.5与2之间或在0.6与2之间。参见实施例5。

在本发明的抗体构建体的一个实施方案中，第二结合结构域与人CD3ε结合并且与普通狨猴、绒顶柽柳猴或松鼠猴CD3ε结合。优选地，第二结合结构域与这些CD3ε链的细胞外表位结合。还设想了第二结合结构域与人和猕猴CD3ε链的细胞外表位结合。CD3ε的最优选表位包含在人CD3ε细胞外结构域的氨基酸残基1-27内。甚至更具体地，表位至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。普通狨猴和绒顶柽柳猴都是属于绢猴科(Callitrichidae)的新世界灵长类动物，而松鼠猴是属于悬猴科(Cebidae)的新世界灵长类动物。

对于本发明的抗体构建体，特别优选的是与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域包含含有选自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区：

(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：27中所示的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQID NO：28中所示的CDR-L2以及如WO2008/119567的SEQ ID NO：29中所示的CDR-L3；

(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：117中所示的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：118中所示的CDR-L2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：119中所示的CDR-L3；和

(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：153中所示的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：154中所示的CDR-L2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：155中所示的CDR-L3。

在本发明的抗体构建体的替代优选实施方案中，与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域包含含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区：

(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：12中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：13中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：14中所示的CDR-H3；

(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：30中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：31中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：32中所示的CDR-H3；

(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：48中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：49中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：50中所示的CDR-H3；

(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：66中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：67中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：68中所示的CDR-H3；

(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：84中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：85中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：86中所示的CDR-H3；

(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：102中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：103中所示的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：104中所示的CDR-H3；

(g)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：120中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：121中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：122中所示的CDR-H3；

(h)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：138中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：139中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：140中所示的CDR-H3；

(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：156中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：157中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：158中所示的CDR-H3；和

(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：174中所示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：175中所示的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO：176中所示的CDR-H3。

对于本发明的抗体构建体，进一步优选的是，与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域包含选自由如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45、SEQID NO：54、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：102(也参见WO 2008/119567的SEQ ID NO：35、39、125、129、161或165)中所示的VL区组成的组的VL区。

或者优选的是，与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域包含选自由如SEQID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQID NO：71、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：101(也参见WO 2008/119567的SEQ ID NO：15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181)中所示的VH区组成的组的VH区。

更优选地，本发明的抗体构建体的特征在于与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域，其包含选自由以下各项组成的组的VL区和VH区：

(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：17或21中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：15或19中所示的VH区；

(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：35或39中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：33或37所述的VH区；

(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：53或57中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：51或55中所示的VH区；

(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：71或75中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：69或73中所示的VH区；

(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：89或93中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：87或91中所示的VH区；

(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：107或111中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：105或109中所示的VH区；

(g)如WO2008/119567的SEQ ID NO：125或129中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：123或127中所示的VH区；

(h)WO 2008/119567的SEQ ID NO：143或147中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：141或145中所示的VH区；

(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：161或165中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：159或163中所示的VH区；和

(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：179或183中所示的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：177或181中所示的VH区。

与本发明的抗体构建体相关的还优选的是与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域，其包含如SEQ ID NO：102中所示的VL区和如SEQ ID NO：101中所示的VH区。

根据本发明的抗体构建体的优选实施方案，结合结构域，特别是第二结合结构域(其与T细胞表面上的人CD3结合)具有以下形式：成对的VH区和VL区呈单链抗体(scFv)的形式。将VH和VL区以VH-VL或VL-VH的顺序放置。优选的是，VH区位于接头序列的N末端，VL区位于接头序列的C末端。

本发明的上述抗体构建体的优选实施方案的特征在于第二结合结构域，其与T细胞表面上的人CD3结合，包含选自由SEQ ID NO：19、SEQ SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQID NO：100和SEQ ID NO：103(也参见WO 2008/119567的SEQ ID NO：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187)组成的组的氨基酸序列。

还设想了本发明的抗体构建体除了其结合靶分子FLT3和CD3的功能以外还具有另外的功能。在这种形式中，抗体构建体是三功能或多功能抗体构建体，其通过与FLT3结合来靶向靶细胞，通过CD3结合来介导细胞毒性T细胞活性，以及提供另外的功能(诸如全功能性Fc恒定结构域通过募集效应细胞如NK细胞来介导抗体依赖性细胞毒性)、标记物(荧光等)、治疗剂诸如毒素或放射性核素，和/或延长血清半衰期的手段等。

用于延长本发明的抗体构建体的血清半衰期的手段的实例包括与抗体构建体融合或以其它方式附接的肽、蛋白质或蛋白质的结构域。肽、蛋白质或蛋白质结构域的组包括在人体中以优选的药代动力学特征与其它蛋白质诸如血清白蛋白(参见WO2009/127691)结合的肽。此类半衰期延长肽的替代概念包括与新生儿Fc受体(FcRn，参见WO 2007/098420)结合的肽，其也可用于本发明的构建体中。附接蛋白质的较大结构域或完整蛋白质的概念包括例如人血清白蛋白、人血清白蛋白的变体或突变体(参见WO2011/051489、WO2012/059486、WO2012/150319、WO2013/135896、WO2014/072481、WO2013/075066)或其结构域的融合物，以及免疫球蛋白的恒定区(Fc结构域)及其变体的融合。为了允许期望的二聚体或多聚体配对，消除Fc受体结合(例如Fcγ受体)或出于其它原因，可以优化/修饰Fc结构域的此类变体。本领域已知的延长小蛋白质化合物在人体中的半衰期的另外的概念是那些化合物诸如本发明的抗体构建体的聚乙二醇化。

在优选实施方案中，本发明的抗体构建体描述如下：

(a)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：159、SEQ IDNO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249和SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQID NO：279和SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319和SEQ IDNO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349和SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379和SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419和SEQ ID NO：429、SEQID NO：439、SEQ ID NO：449和SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479和SEQ IDNO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519和SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549和SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579和SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619和SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ IDNO：649和SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679和SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719和SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749和SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779和SEQ ID NO：789以及SEQ ID NO：799；

·具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；和

·具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103；和

·任选地His-标签，诸如SEQ ID NO 10中所示的所述标签；

(b)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；

·具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103；

·任选地具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；

·具有选自由SEQ ID NO：104-134组成的组的氨基酸序列的多肽；和

·任选地His-标签，诸如SEQ ID NO 10中所示的所述标签；

(c)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有氨基酸序列QRFVTGHFGGLX₁PANG(SEQ ID NO：135)的多肽，其中X₁为Y或H；和

·具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；

·具有氨基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO：137)或QRFCTGHFGGLHPCNG(SEQID NO：139)的多肽；和

·任选地His-标签，诸如SEQ ID NO 10中所示的所述标签；

(d)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：71、SEQ IDNO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：101；

·具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的肽接头；

·具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：158、SEQ IDNO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ IDNO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ IDNO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ IDNO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ IDNO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ IDNO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：788和SEQ ID NO：798以及C末端处的丝氨酸残基；

·具有SEQ ID NO：140中所示的氨基酸序列的多肽；和

从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：157、SEQ IDNO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ IDNO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ IDNO：387、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ IDNO：497、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ IDNO：607、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ IDNO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：757、SEQ ID NO：767、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：787和SEQ ID NO：797；

·具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的肽接头；

·具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：72、SEQ IDNO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：102以及C末端处的丝氨酸残基；

·具有SEQ ID NO：141中所示的氨基酸序列的多肽；

(e)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的肽接头；

·具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：158、SEQ IDNO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ IDNO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ IDNO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ IDNO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ IDNO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ IDNO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：788和SEQ ID NO：798；

·具有SEQ ID NO：142中所示的氨基酸序列的多肽；和

从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ SEQ ID NO：157、SEQID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：757、SEQ ID NO：767、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：787和SEQ ID NO：797；

·具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的肽接头；

·具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：72、SEQ IDNO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：102以及C末端处的丝氨酸残基；[CD3VL]

·具有SEQ ID NO：143中所示的氨基酸序列的多肽；

(f)[V5 Hetero-Fc]从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有SEQ ID NO：144中所示的氨基酸序列的多肽；和

具有SEQ ID NO：145中所示的氨基酸序列的多肽；

(g)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：159、SEQ IDNO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249和SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQID NO：279和SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319和SEQ IDNO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349和SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379和SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419和SEQ ID NO：429、SEQID NO：439、SEQ ID NO：449和SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479和SEQ IDNO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519和SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549和SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579和SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619和SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ IDNO：649和SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679和SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719和SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749和SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779和SEQ ID NO：789以及SEQ ID NO：799；和

·具有SEQ ID NO：146中所示的氨基酸序列的多肽；和

从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有SEQ ID NO：147中所示的氨基酸序列的多肽；

(h)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有SEQ ID NO：148中所示的氨基酸序列的多肽；和

从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有SEQ ID NO：149中所示的氨基酸序列的多肽；或

(i)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；知

·具有SEQ ID NO：150中所示的氨基酸序列的多肽。

(j)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

·具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；和；和

·具有选自由SEQ ID NO：843-850组成的组的氨基酸序列的第三结构域。

在本发明的优选方面，第一结合结构域与人FLT3的结合被FLT3-配体减少≤25％，优选≤20％，更优选≤15％，进一步优选≤10％，甚至更优选≤8％，更优选≤6％，最优选≤2％。

如实施例18中所详细描述的，已经令人惊讶地发现包含均结合FLT3的表位簇3的FL-53、FL-54、FL-61、F-62、FL-63和FL-64的构建体仍然显示了高于实施例18所述的阈值的结合信号，尽管那些结合剂在针对FLT3-配体与FLT3的相互作用所述的区域中具有表位。

此外，鉴于FLT3配体与表位簇3的区域的相互作用，进一步假定，对于更远距离的表位簇诸如FLT3的簇1，结合剂将不受FLT3配体竞争影响。然而，存在相当数量的未达到满足75％阈值的资格的结合剂。结合剂FL-1至FL-53、FL-55至FL-60和FL-65在对FLT3配体竞争不敏感的粘合剂的组中。

如上所述，通过与另一部分诸如白蛋白或白蛋白变体融合来修饰本发明的几种优选抗体构建体。如果表征这些融合构建体的特性(特别是靶标亲和性或细胞毒性活性)，技术人员将会意识到，可以预期类似的融合构建体或未修饰的双特异性抗体构建体具有相似(甚至更好)的性质。例如，如果与白蛋白融合的双特异性抗体构建体具有可估计的或期望的细胞毒性活性或靶标亲和力，则可以预期，对于没有白蛋白的构建体将观察到相同/相似或甚至更高的细胞毒性活性/靶标亲和力。

根据另一个优选实施方案，本发明的双特异性抗体构建体包含(除了两个结合结构域以外)第三结构域，其包含两个多肽单体，每个单体包含铰链、CH2和CH3结构域，其中所述两个多肽(或多肽单体)通过肽接头彼此融合。优选地，所述第三结构域以N端至C端的顺序包含：铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。所述第三结构域的优选氨基酸序列示于SEQID NO：843-850。所述两个多肽单体中的每一个优选具有选自由SEQ ID NO：835-842组成的组的氨基酸序列，或者与那些序列具有至少90％同一性。在另一个优选实施方案中，本发明的双特异性抗体构建体的第一和第二结合结构域通过肽接头与第三结构域融合，所述肽接头例如选自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8和9组成的组。

与本发明一致，“铰链”是IgG铰链区。该区域可以通过使用Kabat编号进行类比来鉴定，参见Kabat位置223-243。与上述一致，“铰链”的最低要求是对应于根据Kabat编号的D231至P243的IgG₁序列区段的氨基酸残基。术语CH2和CH3是指免疫球蛋白重链恒定区2和3。这些区域也可通过使用Kabat编号进行类比来鉴定，关于CH2，参见Kabat位置244-360，以及关于CH3，参见Kabat位置361-478。应当理解，免疫球蛋白之间在IgG₁ Fc区、IgG₂ Fc区、IgG₃ Fc区、IgG₄ Fc区、IgM Fc区、IgA Fc区、IgD Fc区和IgE Fc区中存在一些变异(参见例如，Padlan，Molecular Immunology，31(3)，169-217(1993))。术语Fc单体是指IgA、IgD和IgG的最后两个重链恒定区，以及IgE和IgM的最后三个重链恒定区。Fc单体还可在这些结构域的N末端包含柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc单体可以包括J链。对于IgG，Fc部分包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3以及所述前两个结构域与CH2之间的铰链。尽管免疫球蛋白的Fc部分的边界可以变化，但包含功能性铰链、CH2和CH3结构域的人IgG重链Fc部分的实例可被界定，例如以分别包含IgG₄的残基D231(铰链结构域的)至P476(CH3结构域的C末端的)或D231至LA76，其中根据Kabat编号。

因此，本发明的抗体构建体可以以N至C末端顺序包含：

(a)第一结合结构域；

(b)具有选自由SEQ ID NO：SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；

(c)第二结合结构域；

(d)具有选自由SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8和9组成的组的氨基酸序列的肽接头；

(e)第三结构域的第一多肽单体(包含铰链、CH2和CH3结构域)；

(f)具有选自由SEQ ID NO：852、853、854和855组成的组的氨基酸序列的肽接头；和

(g)第三结构域的第二多肽单体(包含铰链、CH2和CH3结构域)。

还优选的是，本发明的抗体构建体按N至C末端的顺序包含：

·具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的第一结合结构域：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQID NO：219和SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249和SEQ ID NO：259、SEQ IDNO：269、SEQ ID NO：279和SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319和SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349和SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQID NO：379和SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419和SEQ IDNO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449和SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479和SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519和SEQ ID NO：529、SEQID NO：539、SEQ ID NO：549和SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579和SEQ IDNO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619和SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649和SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679和SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719和SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ IDNO：749和SEQ ID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779和SEQ ID NO：789以及SEQ IDNO：799；

·具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；

·具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的第二结合结构域：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103(也参见WO 2008/119567的SEQ ID NO：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187)；

·具有选自由SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8和9组成的组的氨基酸序列的肽接头；和

在优选实施方案中，本发明的抗体构建体包含SEQ ID NO：856至871中所示的多肽或由所述多肽组成。

在本发明的抗体构建体的一个优选实施方案中，抗体构建体包含如SEQ ID NO：856、858、860、862、864、866、868和870中所示的多肽或由所述多肽组成。

在本发明的抗体构建体的一个替代优选实施方案中，抗体构建体包含如SEQ IDNO：857、859、861、863、865、867、869和871中所示的多肽或由所述多肽组成。

在本发明的抗体构建体的优选实施方案中，抗体构建体包含如SEQ ID NO：858、859、862、863、864和865中所示的多肽或由所述多肽组成。

抗体构建体的共价修饰也包括在本发明的范围内，并且通常(但并非总是)在翻译后进行。例如，通过使抗体构建体的特定氨基酸残基与能够与选定的侧链或N或C末端残基反应的有机衍生剂反应，将几种类型的抗体构建体的共价修饰引入分子。

最常见地使半胱氨酰残基与α-卤代乙酸酯(和相应的胺)诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应，得到羧甲基或羧酰氨基甲基衍生物。还通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对-氯汞苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应衍生出半胱氨酰残基。

通过与pH 5.5-7.0的焦碳酸二乙酯反应衍生出组氨酰残基，因为该试剂对组氨酰基侧链有相对特异性。对溴苯甲酰甲基溴也是有用的；该反应优选在pH 6.0的0.1M二甲胂酸钠中进行。赖氨酰基和氨基末端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。利用这些试剂的衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的作用。用于衍生含α-氨基残基的其它合适的试剂包括亚氨酸酯诸如甲基吡啶亚氨酸酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；硼氢化氯；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸盐的反应。

通过与一种或多种常规试剂(其中有苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮)反应来修饰精氨酰残基。由于胍官能团的高pKa，精氨酸残基的衍生需要在碱性条件下进行反应。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。

可进行酪氨酰残基的特异性修饰，特别感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记物引入至酪氨酰残基中。最通常地，将N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰基种类和3-硝基衍生物。使用¹²⁵I或¹³¹I碘化酪氨酰残基以制备用于放射免疫测定的经标记的蛋白质，上述氯胺T法是合适的。

羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(R′-N＝C＝N--R′)反应而被选择性修饰，其中R和R′任选地为不同的烷基诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应而被转化为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。

利用双功能试剂的衍生化可用于将本发明的抗体构建体交联至用于各种方法的不溶于水的支持基质或表面。通常使用的交联剂包括例如1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮基水杨酸的酯、同双功能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯诸如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)和双功能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷。衍生剂诸如3-[(对-叠氮基苯基)二硫代]丙亚氨酸甲酯产生能够在光存在下形成交联的可光活化的中间体。或者，如美国专利第3,969,287号、第3,691,016号、第4,195,128号、第4,247,642号、第4,229,537号和第4,330,440号中所述的反应性水不溶性基质诸如溴化氰活化的碳水化合物和反应性基底用于蛋白质固定。

谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基通常分别脱酰胺成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。或者，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺基。这些残基的任一种形式都落在本发明的范围内。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structureand Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，1983，第79-86页)、N末端胺的乙酰化和任何C末端羧基的酰胺化。

包括在本发明范围内的抗体构建体的另一种类型的共价修饰包括改变蛋白质的糖基化模式。如本领域已知的，糖基化模式可取决于蛋白质的序列(例如，下文中论述的特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在)或其中产生蛋白质的宿主细胞或生物体。下面论述特定的表达系统。

多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链的附接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)是用于碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促附接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中的任一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一至羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸)的附接。

向抗体构建体添加糖基化位点通过改变氨基酸序列以使其含有一个或多个上述三肽序列(用于N-连接的糖基化位点)来方便地实现。还可通过向起始序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)或被所述残基取代来进行改变。为方便起见，抗体构建体的氨基酸序列优选通过DNA水平上的变化来改变，特别是通过在预选碱基处突变编码多肽的DNA，使得产生将翻译成所需氨基酸的密码子。

增加抗体构建体上碳水化合物部分的数量的另一种手段是通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。这些方法是有利的，因为它们不需要在具有用于N-和O-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中生产蛋白质。取决于所使用的偶联模式，可将糖附接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基诸如半胱氨酸的游离巯基，(d)游离羟基如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的羟基，(e)芳族残基诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于WO 87/05330中以及Aplin和Wriston，1981，CRCCrit.Rev.Biochem.第259-306页中。

存在于起始抗体构建体上的碳水化合物部分的去除可通过化学方法或酶促方法实现。化学去糖基化需要蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。该处理导致除连接糖(N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺)外的大部分或全部糖裂解，而使多肽保持完整。化学去糖基化由Hakimuddin等，1987，Arch.Biochem.Biophys.259：52和由Edge等，1981，Anal.Biochem.118：131描述。多肽上的碳水化合物部分的酶促裂解可通过使用如Thotakura等，1987，Meth.Enzymol.138：350描述的多种内切和外切糖苷酶来实现。可以通过使用如由Duskin等，1982，J.Biol.Chem.257：3105描述的化合物衣霉素来防止潜在糖基化位点上的糖基化。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键联的形成。

本文中还设想了抗体构建体的其它修饰。例如，抗体构建体的另一种类型的共价修饰包括以美国专利第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号或第4,179,337号中所示的方式将抗体构建体连接至各种非蛋白质性质的聚合物，包括但不限于各种多元醇诸如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。另外，如本领域已知的，可在抗体构建体内的不同位置进行氨基酸取代，例如，以便于添加聚合物诸如PEG。

在一些实施方案中，本发明的抗体构建体的共价修饰包括添加一个或多个标记物。标记基团可通过不同长度的间隔臂与抗体构建体偶联以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法是本领域已知的并且可用于实施本发明。术语“标记物”或“标记基团”是指任何可检测的标记物。一般地，标记物落在多种类别内，取决于其中它们将被检测的测定-下面的实例包括但不限于：

a)同位素标记物，其可以是放射性同位素或重同位素，诸如放射性同位素或放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)

b)磁性标记物(例如磁性颗粒)

c)氧化还原活性部分

d)光学染料(包括，但不限于，发色团、磷光体和荧光团)诸如荧光基团(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、化学发光基团和可以是“小分子”荧光素(fluores)或蛋白质性质的荧光素的荧光团

e)酶促基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)

f)生物素化的基团

g)被第二报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合部位、金属结合结构域、表位标签等)

“荧光标记物”意指可通过其固有的荧光性质检测到的任何分子。合适的荧光标记物包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、芪、萤光黄、Cascade BlueJ、德克萨斯红、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒冈绿、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、AlexaFluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、级联蓝、级联黄和R-藻红蛋白(PE)(Molecular Probes，Eugene，OR)、FITC、罗丹明和德克萨斯红(Pierce，Rockford，IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science，Pittsburgh，PA)。在Richard P.Haugland的Molecular Probes Handbook中描述了合适的光学染料，包括荧光团。

合适的蛋白质性质的荧光标记物还包括但不限于绿色荧光蛋白，包括GFP的海肾、海笔(Ptilosarcus)或水母种类(Chalfie等，1994，Science 263：802-805)、EGFP(ClontechLaboratories，Inc.，Genbank登录号U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP，QuantumBiotechnologies，Inc.1801 de Maisonneuve Blvd.West，8th Floor，Montreal，Quebec，Canada H3H 1J9；Stauber，1998，Biotechniques 24：462-471；Heim等，1996，Curr.Biol.6：178-182)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP，Clontech Laboratories，Inc.)、萤光素酶(Ichiki等，1993，J.Immunol.150：5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)和海肾(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美国专利第5,292,658号、第5,418,155号、第5,683,888号、第5,741,668号、第5,777,079号、第5,804,387号、第5,874,304号、第5,876,995号、第5,925,558号)。

亮氨酸拉链结构域是促进在其中发现它们的蛋白质的寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初是在几种DNA结合蛋白中鉴定的(Landschulz等，1988，Science 240：1759)，并且自那以来已在多种不同的蛋白中被发现。已知的亮氨酸拉链中有天然存在的肽及其二聚化或三聚化的衍生物。在PCT申请WO 94/10308中描述了适用于产生可溶性寡聚蛋白质的亮氨酸拉链结构域的实例，在Hoppe等，1994，FEBS Letters 344：191中描述了来源于肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链。在Fanslow等，1994，Semin.Immunol.6：267-78中描述了允许与其融合的异源蛋白质的稳定三聚化的经修饰的亮氨酸拉链的用途。在一种方法中，在合适的宿主细胞中表达包含与亮氨酸拉链肽融合的FLT3抗体片段或衍生物的重组融合蛋白，以及从培养上清液回收形成的可溶性寡聚FLT3抗体片段或衍生物。

本发明的抗体构建体还可包含额外的结构域，所述结构域例如有助于分子的分离或涉及分子的适应性药代动力学特征。有助于分离抗体构建体的结构域可选自肽基序或次级引入的部分，其可在分离方法例如分离柱中被捕获。此类额外的结构域的非限制性实施方案包括称为Myc-标签、HAT-标签、HA--标签、TAP-标签、GST-标签、壳多糖结合结构域(CBD-标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP-标签)、Flag-标签、Strep-标签及其变体(例如StrepII-标签)和His-标签的肽基序。以鉴定的CDR为特征的所有本文公开的抗体构建体优选包含His-标签结构域，其通常被称为分子的氨基酸序列中的连续His残基的重复，优选5个，更优选6个His残基(六组氨酸)的重复。His标签可位于例如抗体构建体的N末端或C末端，优选地其位于C末端。最优选地，六-组氨酸标签(HHHHHH)(SEQ ID NO：10)通过肽键连接至根据本发明的抗体构建体的C末端。

本发明的抗体构建体的第一结合结构域与靶细胞表面上的人FLT3结合。人FLT3的优选氨基酸序列由NO：801、803、804和805表示。应理解的是，在本发明的上下文中，术语“在表面上”意指结合结构域与包含在FLT3细胞外结构域(FLT3 ECD，参见SEQ ID NO：813)内的表位特异性结合。因此，当本发明的第一结合结构域由天然表达性细胞或细胞系表达，和/或由用FLT3转化或(稳定/瞬时)转染的细胞或细胞系表达时，根据本发明的第一结合结构域优选与FLT3结合。在优选实施方案中，当FLT3在体外结合测定诸如BIAcore或Scatchard中用作“靶标”或“配体”分子时，第一结合结构域也与FLT3结合。“靶细胞”可以是在其表面上表达FLT3的任何原核或真核细胞；优选地靶细胞是作为人或动物体的一部分的细胞，诸如卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、间皮瘤细胞、肺癌细胞、胃癌细胞和三阴性乳腺癌细胞。

术语“FLT3 ECD”是指基本上不合FLT3的跨膜和胞质结构域的FLT3形式。本领域技术人员将理解的是，根据在本领域中常规用于鉴定该类型的疏水结构域的标准来鉴定针对本发明的FLT3多肽鉴定的跨膜结构域。跨膜结构域的确切边界可以改变，但最可能的是在本文中具体提及的结构域的任一末端变化不超过约5个氨基酸。优选的人FLT3 ECD示于SEQID NO：813中。

第一结合结构域对人FLT3的亲和力优选≤20nM，更优选≤10nM，甚至更优选≤5nM，甚至更优选≤2nM，甚至更优选≤1nM，甚至更优选≤0.6nM，甚至更优选≤0.5nM，最优选≤0.4nM。亲和力可以例如在BIAcore测定中或在Scatchard测定中测量，例如，如实施例中所述的。确定亲和力的其它方法也是本领域技术人员熟知的。

还设想了本文所述的抗体构建体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改善抗体构建体的结合亲和力和/或其它生物性质。抗体构建体的氨基酸序列变体通过将合适的核苷酸变化引入抗体构建体核酸中或通过肽合成来制备。所有下面描述的氨基酸序列修饰应产生仍然保留未修饰的亲本分子的所需生物活性(与FLT3和CD3结合)的抗体构建体。

术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常是指具有其本领域公认的定义的氨基酸，诸如选自由以下各项组成的组的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(He或I)：亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)，尽管可以根据需要使用经修饰的、合成的或稀有的氨基酸。通常，氨基酸可以分组为具有非极性侧链(例如，Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；带负电荷的侧链(例如，Asp、Glu)；带正电的侧链(例如，Arg、His、Lys)；或不带电的极性侧链(例如，Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。

氨基酸修饰包括，例如，抗体构建体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。只要最终的构建体具有所需的特征，就可进行缺失、插入和取代的任意组合以获得最终的构建体。氨基酸的改变还可改变抗体构建体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。

例如，可在每个CDR中可插入或删除1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸(当然，取决于它们的长度)，而可在每个FR中插入或删除1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或25个氨基酸。优选地，氨基酸序列插入包括长度从1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基变化至含有100个或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。本发明的抗体构建体的插入变体包括与酶的抗体构建体的N末端或C末端融合或与增加抗体构建体的血清半衰期的多肽融合。

用于取代诱变的最吸引人的位点包括重链和/或轻链的CDR，特别是高变区，但也设想了重链和/或轻链的FR改变。取代优选地是如本文所述的保守取代。优选地，可在CDR中取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸，而可在框架区(FR)中取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或25个氨基酸，这取决于CDR或FR的长度。例如，如果CDR序列包含6个氨基酸，则设想这些氨基酸中的1个、2个或3个被取代。类似地，如果CDR序列包含15个氨基酸，则设想这些氨基酸中的1个、2个、3个、4个、5个或6个被取代。

如由Cunningham和Wells在Science，244：1081-1085(1989)中所述，用于鉴定作为诱变的优选位置的抗体构建体的某些残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。此处，抗体构建体内的残基或靶残基的组(例如，带电残基诸如arg、asp、his、lys和glu)被鉴定并且被中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与表位的相互作用。

然后通过在取代位点处引入另外的或其它变体或通过引入另外的或其它变体以进行取代来对展现出对取代的功能敏感性的那些氨基酸位置进行精修。因此，虽然用于引入氨基酸序列变异的位点或区域是预定的，但突变本身的性质不必预先确定。例如，为了分析或优化给定位点处的突变的性能，可在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选表达的抗体构建体变体的所需活性的最佳组合。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点处进行取代突变的技术是公知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。使用抗原结合活性诸如FLT3或CD3结合的测定来筛选突变体。

通常，如果在重链和/或轻链的一个或多个或全部CDR中取代氨基酸，则优选的是所获得的“取代的”序列与“原始”CDR序列具有至少60％或65％，更优选70％或75％，甚至更优选80％或85％，特别优选90％或95％同一性。这意味着其与“取代的”序列的同一性程度取决于CDR的长度。例如，具有5个氨基酸的CDR优选与其取代序列具有80％同一性，以便具有至少一个取代的氨基酸。因此，抗体构建体的CDR可与它们的取代序列具有不同程度的同一性，例如CDRLl可具有80％同一性，而CDRL3可具有90％同一性。

优选取代(或替代)是保守取代。然而，只要抗体构建体保留其通过第一结合结构域与FLT3结合以及通过第二结合结构域与CD3或CD3ε结合的能力，和/或其CDR与所取代的序列具有同一性(与“原始”CDR序列具有至少60％或65％，更优选70％或75％，甚至更优选80％或85％，特别优选90％或95％同一性)，就设想任何取代(包括非保守取代或来自下文表1中列出的“示例性取代”中的一个或多个取代)。

表1中以“优选取代”为标题示出保守取代。如果此类取代导致生物活性改变，则可引入表1中命名为“示例性取代”的，或者如下文关于氨基酸类别所进一步描述的更实质性改变，并筛选产物的所需特征。

表1：氨基酸取代

原始	示例性取代	优选取代
			Ala(A)	val，leu，ile	val
Arg(R)	lys，gln，asn	lys
			Asn(N)	gln，his，asp，lys，arg	gln
Asp(D)	glu，asn	glu
			Cys(C)	ser，ala	ser
Gln(Q)	asn，glu	asn
			Glu(E)	asp，gln	asp
Gly(G)	Ala	ala
			His(H)	asn，gln，lys，arg	arg
Ile(I)	leu，val，met，ala，phe	leu
			Leu(L)	norleucine，ile，val，met，ala	ile
Lys(K)	arg，gln，asn	arg
			Met(M)	leu，phe，ile	leu
Phe(F)	leu，val，ile，ala，tyr	tyr
			Pro(P)	Ala	ala
Ser(S)	Thr	thr
			Thr(T)	Ser	ser
Trp(W)	tyr，phe	tyr
			Tyr(Y)	trp，phe，thr，ser	phe
Val(V)	ile，leu，met，phe，ala	leu

本发明的抗体构建体的生物特性的实质性修饰通过选择取代来实现，所述取代在它们对维持以下方面的作用上显著不同：(a)取代区域中的多肽主链的结构，例如作为折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。将天然存在的残基基于共同的侧链性质分成以下组：(1)疏水性残基：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性残基：cys、ser、thr；(3)酸性残基：asp、glu；(4)碱性残基：asn、gin、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳族残基：trp、tyr、phe。

非保守替代将使得这些类别之一的成员与另一个类别的成员交换。任何不参与维持抗体构建体的适当构象的半胱氨酸残基可以通常用丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可将半胱氨酸键添加至抗体以提高其稳定性(特别是在抗体是抗体片段诸如Fv片段的情况下)。

对于氨基酸序列，通过使用本领域已知的标准技术来测定序列同一性和/或相似性，所述标准技术包括但不限于局部序列同一性算法(Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482)，序列同一性比对算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443)，相似性检索方法(Pearson和Lipman，1988，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85：2444)，这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，由Devereux等，1984，Nucl.Acid Res.12：387-395所描述的最佳拟合序列程序，优选使用缺省设置，或通过目测。优选地，通过基于以下参数的FastDB来计算百分比同一性：为1的错配罚分、为1的缺口罚分、为0.33的缺口大小罚分以及为30的连接罚分，″Current Methods in SequenceComparison and Analysis，″Macromolecule Sequencing and Synthesis，SelectedMethods and Applications，第127-149页(1988)，Alan R.Liss，Inc.。

有用的算法的实例是PILEUP。PILEUP使用渐进式成对的比对从一组相关序列中创建多重序列比对。其还可以绘制显示用于创建比对的聚类关系的树图。PILEUP使用Feng和Doolittle，1987，J.Mol.Evol.35：351-360的渐进比对方法的简化方法；该方法类似于Higgins和Sharp，1989，CABIOS 5：151-153所描述的方法。有用的PILEUP参数包括为3.00的缺省缺口权重、为0.10的缺省缺口长度权重和加权末端缺口。

有用的算法的另一个实例是1990，J.Mol.Biol.215：403-410；Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402和Karin等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787中描述的BLAST算法。特别有用的BLAST程序是从Altschul等，1996，Methods inEnzymology266：460-480获得的WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2使用多个检索参数，其中大部分被设置为缺省值。将可调整的参数设置为以下值：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，单词阈值(T)＝II。HSP S和HSP S2参数是动态值，并且由程序本身根据特定序列的组成和针对其检索目标序列的特定数据库的组成来确定；然而，可调整所述值以提高灵敏度。

另一种有用的算法是如由Altschul等，1993，Nucl.Acids Res.25：3389-3402报道的有缺口的BLAST。有缺口的BLAST使用BLOSUM-62取代评分；设置为9的阈值T参数；触发无缺口延伸(ungapped extension)的两次命中法(two-hit method)，为k的收取缺口长度(charges gap length)，为10+k的费用；设置为16的Xu，以及设为40(用于数据库检索阶段)和设置为67(用于算法的输出阶段)的Xg。有缺口的比对由对应于约22比特的得分触发。

通常，各个变体CDR与本文所述的序列之间的氨基酸同源性、相似性或同一性为至少60％，更常见地具有优选至少65％或70％，更优选至少75％或80％，甚至更优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％的递增同源性或同一性。以类似的方式，将相对于本文鉴定的结合蛋白的核酸序列的“百分比(％)核酸序列同一性”，定义为候选序列中与抗体构建体的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。具体方法是利用设置为缺省参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，重叠跨度和重叠分数分别设置为1和0.125。

通常，编码各个变体CDR的核苷酸序列与本文所述的核苷酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或同一性为至少60％，更常见地具有优选至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％和几乎100％的递增的同源性或同一性。因此，“变体CDR”是与本发明的亲本CDR具有指定的同源性、相似性或同一性的变体，并且共享生物功能，包括但不限于至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的亲本CDR的特异性和/或活性。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体构建体与人种系的同一性百分比≥70％或≥75％，更优选≥80％或≥85％，甚至更优选≥90％，最优选≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％或甚至≥96％。参见实施例8。与人抗体种系基因产物的同一性被认为是在治疗期间降低治疗性蛋白在患者中引发针对该药物的免疫反应的风险的重要特征。Hwang和Foote(“Immunogenicity of engineered antibodies”；Methods 36(2005)3-10)证明了药物抗体构建体的非人部分的减少导致在治疗期间在患者中诱发抗药物抗体的风险降低。通过比较临床评估的抗体药物的详尽数量与相应的免疫原性数据，趋向显示了抗体的V区的人源化使得蛋白质比携带未改变的非人V区的抗体(平均23.59％的患者)具有更低的免疫原性(平均5.1％的患者)。因此，对于抗体构建体形式中的基于V区的蛋白质治疗剂而言，与人序列的更高程度的同一性是所期望的。为了测定种系同一性，可使用Vector NTI软件将VL的V区与人种系V区段和J区段的氨基酸序列(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)进行比对，并通过将相同的氨基酸残基除以VL的氨基酸残基总数以百分数计算氨基酸序列。对于VH片段(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)也是如此，除了VH CDR3由于其高度多样性和缺少现有的人种系VH CDR3比对参数而可被排除外。然后可使用重组技术来增加与人抗体种系基因的序列同一性。

在另外的实施方案中，本发明的双特异性抗体构建体在标准研究规模条件下，例如在标准的两步纯化方法中表现出高单体产率。优选地，根据本发明的抗体构建体的单体产率≥0.25mg/L上清液，更优选≥0.5mg/L，甚至更优选≥1mg/L，最优选≥3mg/L上清液。

同样地，可测定抗体构建体的二聚体抗体构建体同种型的产率，并由此确定单体百分比(即，单体：(单体+二聚体))。单体和二聚抗体构建体的生产率和计算的单体百分比可以例如在来自于滚瓶中进行的标准化研究-规模生产的培养上清液的SEC纯化步骤中获得。在一个实施方案中，抗体构建体的单体百分比≥80％，更优选≥85％，甚至更优选≥90％，最优选≥95％。

在一个实施方案中，抗体构建体具有≤5或≤4，更优选≤3.5或≤3，甚至更优选≤2.5或≤2，最优选≤1.5或≤1的优选血浆稳定性(具有血浆的EC50与没有血浆的EC50的比率)。抗体构建体的血浆稳定性可通过将构建体在37℃下在人血浆中孵育24小时，然后在51-铬释放细胞毒性测定中测定EC50来测试。细胞毒性测定中的效应细胞可以是经刺激富集的人CD8阳性T细胞。靶细胞可以例如是用人FLT3转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞(E∶T)的比率可以选择为10∶1。用于此目的的人血浆库来源于通过涂覆有EDTA的注射器收集的健康供体的血液。通过离心除去细胞组分，收集上层血浆相，然后合并。作为对照，在即将进行细胞毒性测定之前在RPMI-1640培养基中稀释抗体构建体。血浆稳定性计算为EC50(血浆孵育后)与EC50(对照)的比率。参见实施例13。

此外优选的是，本发明的抗体构建体的单体至二聚体的转化率是低的。可在不同条件下测量转化率，并通过高效尺寸排阻色谱进行分析。参见实施例11。例如，可在培养箱中，在37℃下和以例如100μg/ml或250μg/ml的浓度孵育抗体构建体的单体同种型，进行7天。在这些条件下，优选的是，本发明的抗体构建体显示出≤5％，更优选≤4％，甚至更优选≤3％，甚至更优选≤2.5％，甚至更优选≤2％，甚至更优选≤1.5％，最优选≤1％或≤0.5％或甚至0％的二聚体百分比。

还优选的是，本发明的双特异性抗体构建体在多次冻/融循环后以非常低的二聚体转化率存在。例如，将抗体构建体单体例如在通用制剂缓冲液中调整至250μg/ml的浓度，并进行三个冻/融循环(在-80℃下冷冻30分钟，随后在室温下解冻30分钟)，随后进行高效SEC以测定已被转化成二聚抗体构建体的最初为单体抗体构建体的百分比。优选地，例如在三个冻/融循环之后，双特异性抗体构建体的二聚体的百分比优选≤5％，更优选≤4％，甚至更优选≤3％，甚至更优选≤2.5％，甚至更优选≤2％，甚至更优选≤1.5％，最优选≤1％或甚至≤0.5％。

本发明的双特异性抗体构建体优选显示出聚集温度≥45℃或≥50℃，更优选≥52℃或≥54℃，甚至更优选≥56℃或≥57℃，最优选≥58℃或≥59℃的有利的热稳定性。热稳定性参数可以如下以抗体聚集温度的方式来测定：将浓度为250μg/ml的抗体溶液转移到一次性使用比色杯中，并置于动态光散射(DLS)装置中。将样品以0.5℃/分钟的加热速率从40℃加热到70℃，不断地采集测量的半径。将表明蛋白质的熔解和聚集的半径增加用于计算抗体的聚集温度。参见实施例12。

或者，可通过差示扫描量热法(DSC)测定温度熔解曲线以测定抗体构建体的固有生物物理学蛋白质稳定性。这些实验使用MicroCal LLC(Northampton，MA，U.S.A)VP-DSC装置进行。与仅含有制剂缓冲液的样品相比，从20℃至90℃记录含有抗体构建体的样品的能量吸收。将抗体构建体例如在SEC运行缓冲液中调整至终浓度为250μg/ml。为了记录相应的熔解曲线，逐步升高整个样品温度。在每个温度T下记录样品和制剂缓冲液参考的能量吸收。将样品的能量吸收Cp(kcal/mole/℃)减去参考值的差值针对相应的温度作图。熔解温度被定义为第一次最大能量吸收时的温度。

此外还设想，本发明的FLT3xCD3双特异性抗体构建体不与人FLT3旁系同源物KITv1(SEQ ID NO：805)、CSF1R V1(SEQ ID NO：806)、PDGFRA(SEQ ID NO：807)和/或NTM v3(SEQ ID NO：808)交叉反应(即，基本上不结合)。此外，还设想，本发明的FLT3xCD3双特异性抗体构建体不与猕猴/cyno FLT3旁系同源物KIT v1、CSF1R v1、PDGFRA和/或NTM v3交叉反应(即，基本上不结合)。参见实施例7。

还设想本发明的FLT3xCD3双特异性抗体构建体具有≤0.2，优选≤0.15，更优选≤0.12，甚至更优选≤0.1，最优选≤0.08的浊度(如在将纯化的单体抗体构建体浓缩至2.5mg/ml并过夜孵育后，通过OD 340测量的)。参见实施例14。

在另外的实施方案中，根据本发明的抗体构建体在酸性pH下是稳定的。抗体构建体在非生理pH诸如pH 5.5(运行例如阳离子交换色谱所需的pH)下表现出的耐受性越高，从离子交换柱洗脱的抗体构建体相对于负载的蛋白质的总量的回收率就越高。抗体构建体从pH 5.5的离子(例如，阳离子)交换柱的回收率优选≥30％，更优选≥40％，更优选≥50％，甚至更优选≥60％，甚至更优选≥70％，甚至更优选≥80％，甚至更优选≥90％，甚至更优选≥95％，最优选≥99％。参见实施例15。

此外还设想，本发明的双特异性抗体构建体显示治疗功效或抗肿瘤活性。这可以例如在如以下晚期人肿瘤异种移植模型的实例中公开的研究中进行评估：

在研究的第1天，将人FLT3阳性癌细胞系(例如OVCAR-8)的5x 10⁶个细胞皮下注射至雌性NOD/SCID小鼠的右背侧翼。当平均肿瘤体积达到约100mm³时，通过将大约2x10⁷个细胞注射至动物的腹腔内，来将体外扩增的人CD3阳性T细胞移植到小鼠体内。媒介物对照组1的小鼠不接受效应细胞，并用作用于与媒介物对照组2(接受效应细胞)比较的未移植对照，以监测单独的T细胞对肿瘤生长的影响。当平均肿瘤体积达到约200mm³时，开始抗体治疗。治疗开始当天每个治疗组的平均肿瘤大小与任何其它组均不应有统计学差异(方差分析)。用0.5mg/kg/天的FLT3xCD3双特异性抗体构建体，通过静脉推注，进行约15至20天来治疗小鼠。在研究期间通过卡尺测量肿瘤，并通过肿瘤体积(TV)的组间比较来评估进展。通过将TV计算为T/C％＝100x(分析组的中值TV)/(对照组2的中值TV)来测定肿瘤生长抑制T/C[％]。

本领域技术人员知道如何修改或调整本研究的某些参数，诸如注射的肿瘤细胞的数量、注射部位、移植的人T细胞的数量、待施用的双特异性抗体构建体的量以及时间线，同时仍然达到有意义和可重现的结果。优选地，肿瘤生长抑制T/C[％]≤70或≤60，更优选≤50或≤40，甚至更优选≤30或≤20，最优选≤10或≤5或甚至≤2.5。

本发明还提供了编码本发明的抗体构建体的多核苷酸/核酸分子。

多核苷酸是由链中共价键合的13个或更多个核苷酸单体组成的生物聚合物。DNA(诸如cDNA)和RNA(诸如mRNA)是具有不同生物功能的多核苷酸的实例。核苷酸是用作核酸分子如DNA或RNA的单体或亚单位的有机分子。核酸分子或多核苷酸可以是双链的和单链的，线性的和环状的。其优选地包含载体中，所述载体优选地包含在宿主细胞中。所述宿主细胞，例如在用本发明的载体或多核苷酸转化或转染后，能够表达所述抗体构建体。为此目的，将多核苷酸或核酸分子与控制序列可操作地连接。

遗传密码是籍以将遗传物质(核酸)中编码的信息翻译成蛋白质的一组规则。活细胞中的生物解码通过核糖体来实现，所述核糖体使用tRNA分子携带氨基酸并且一次读取mRNA的三个核苷酸，按照由mRNA指定的顺序连接氨基酸。所述密码定义了这些核苷酸三联体(称为密码子)的序列如何指定在蛋白质合成期间接下来将添加哪种氨基酸。除了一些例外，核酸序列中的三核苷酸密码子指定单个氨基酸。由于绝大多数基因都是用完全相同的密码编码的，所以这个特定的密码通常被称为规范或标准遗传密码。虽然遗传密码决定给定编码区的蛋白质序列，但其它基因组区域可以影响这些蛋白质产生的时间和地方。

此外，本发明提供了包含本发明的多核苷酸/核酸分子的载体。

载体是用作将(外来)遗传物质转移至细胞中的媒介物的核酸分子。术语“载体”包括但不限于质粒、病毒、粘粒和人工染色体。通常，工程载体包含复制起始点、多克隆位点和选择标记。载体本身通常是核苷酸序列，通常是DNA序列，其包含插入物(转基因)和用作载体“主链”的更大序列。现代载体除了转基因插入物和主链以外，还包含其它特征：启动子、遗传标记、抗生素抗性、报道基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体专门用于转基因在靶细胞中的表达，并且通常具有控制序列。

术语“控制序列”是指在特定的宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。

当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则其与编码序列可操作地连接。一般地，“可操作地连接的”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下是连续的并处于阅读相中。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在方便的限制性位点进行连接来实现的。如果此类位点不存在，则根据常规实践，使用合成寡核苷酸衔接子或接头。

“转染”是有意将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。转导通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及打开细胞膜中的瞬时孔或“洞”，以允许摄取物质。可使用磷酸钙，通过电穿孔，通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生脂质体(所述脂质体与细胞膜融合并将其货物存放在内部)来进行转染。

术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)至细菌中，以及至非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是通过细胞膜从其周围环境直接摄取外源遗传物质(核酸分子)并随后将其整合而产生的细菌或非动物真核细胞的遗传改变。转化可通过人工手段来实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态，这可作为对环境条件诸如饥饿和细胞密度等的限时反应而发生。

此外，本发明还提供了用本发明的多核苷酸/核酸分子或载体转化或转染的宿主细胞。

如本文中所用，术语“宿主细胞”或“受体细胞”旨在包括可以为或已为载体、外源性核酸分子和编码本发明的抗体构建体的多核苷酸的任何单独细胞或细胞培养物；和/或抗体构建体本身的受体。通过转化、转染等将相应的物质引入细胞中。术语“宿主细胞”也旨在包括单细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于天然的、意外的或有意的突变或者由于环境影响而在后代中发生，所以此类子代实际上可能不是与亲本细胞完全相同的(在形态学或基因组或总DNA互补序列上)但仍包括在本文所使用的术语的范围内。合适的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞，还包括但不限于细菌、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞，诸如昆虫细胞和哺乳动物细胞(例如鼠、大鼠、猕猴或人)。

本发明的抗体构建体可以在细菌中生产。表达后，将本发明的抗体构建体以可溶级分与大肠杆菌(E.coli)细胞糊分离，并可通过例如亲和层析和/或尺寸排阻来将其纯化。可以类似于用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法来进行最终纯化。

除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是本发明的抗体构建体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、种和菌株在本文中通常是可用的并且是有用的，诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主诸如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24178)、瓦尔特鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.Marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402 226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183 070)；念珠菌属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244 234)；粗脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)诸如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；以及丝状真菌诸如链孢属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

用于表达本发明的糖基化抗体构建体的合适宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了来自宿主(诸如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕)的许多杆状病毒株和变体以及相应的许可性昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株是公共可获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5病毒株，并且此类病毒可用作根据本发明的本文中的病毒，特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染。

棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。用于在植物细胞培养物中产生蛋白质的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见例如Hiatt等，Nature(1989)342：76-78，Owen等(1992)Bio/Technology 10：790-794，Artsaenko等(1995)The Plant J 8：745-750和Fecker等(1996)Plant Mol Biol 32：979-986。

然而，一直以来最让人感兴趣是在脊椎动物细胞中，脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1细胞系；人胚胎肾细胞系(被亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CVIATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，1413 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL5 1)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y Acad.Sci.(1982)383：44-68)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。

在另外的实施方案中，本发明提供了用于生产本发明的抗体构建体的方法，所述方法包括在允许表达本发明的抗体构建体表达的条件下培养本发明的宿主细胞，并从培养物回收所产生的抗体构建体。

如本文中所用，术语“培养”是指细胞在适当条件下在培养基中的体外维持、分化、生长、增殖和/或繁殖。术语“表达”包括涉及产生本发明抗体构建体的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

当使用重组技术时，抗体构建体可在细胞内、在周质空间中产生，或者直接分泌到培养基中。如果抗体构建体在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤除去微粒碎片(宿主细胞或溶解片段)。Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了用于分离被分泌至大肠杆菌周质空间的抗体的方法。简言之，在约30分钟内，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的情况下将细胞糊解冻。细胞碎片可通过离心去除。当抗体被分泌至培养基中时，通常首先使用商购可得的蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂诸如PMSF可包括在任何上述步骤中以抑制蛋白水解，并可包含抗生素来防止偶然污染物的生长。

从宿主细胞制备的本发明的抗体构建体可使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来回收或纯化。取决于待回收的抗体，也可使用用于蛋白质纯化的其它技术，诸如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析，肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、色谱-聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。当本发明的抗体构建体包含CH3结构域时，Bakerbond ABX树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于纯化。

亲和层析是优选的纯化技术。亲和配体所附接的基质最常见地是琼脂糖，但其它基质也是可用的。机械稳定性基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯允许比可用琼脂糖获得更快的流速和更短的处理时间。

此外，本发明提供了包含本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体的药物组合物。对于本发明的药物组合物，优选的是，抗体构建体的均质性≥80％，更优选≥81％、≥82％、≥83％、≥84％或≥85％，进一步优选≥86％、≥87％、≥88％、≥89％或≥90％，进一步优选≥91％、≥92％、≥93％、≥94％或≥95％，最优选≥96％、≥97％、≥98％或≥99％。

如本文中所用，术语“药物组合物”涉及适合用于向患者，优选人患者施用的组合物。本发明的特别优选的药物组合物优选地以治疗有效量包含一种或多种本发明的抗体构建体。优选地，药物组合物还包含一种或多种(药学上有效的)载体、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的合适制剂。组合物的可接受的成分优选在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。

本发明组合物可包含药学上可接受的载体。一般地，如本文中所用，“药学上可接受的载体”意指任何和所有的含水和非含水溶液、无菌溶液、溶剂、缓冲剂例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液、水、悬浮液、乳剂诸如油/水乳剂，各种类型的润湿剂、脂质体、分散介质和包衣，其与药物施用相容，特别是与肠胃外施用相容。此类介质和药剂在药物组合物中的使用是本领域公知的，包含此类载体的组合物可通过公知的常规方法配制。

某些实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体构建体以及另外的一种或多种赋形剂，诸如在本部分和本文其它地方说明性描述的赋形剂。就这一点而言，赋形剂可在本发明中用于各种目的，诸如调节制剂的物理、化学或生物学性质，诸如调节粘度和/或用于本发明的方法以改善有效性和/或稳定此类配制剂和工艺，防止由于例如在制造、运输、储存、使用前准备、施用期间和之后发生的胁迫而导致的降解和腐败。

在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改变、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透目的的制剂材料(参见，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，(A.R.Genrmo，编辑)，1990，Mack Publishing Company)。在此类实施方案中，合适的制剂材料可包括但不限于：

·氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、脯氨酸、2-苯丙氨酸，包括带电荷的氨基酸，优选赖氨酸、醋酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和/或组氨酸

·抗微生物剂诸如抗菌剂和抗真菌剂

·抗氧化剂诸如抗坏血酸、甲硫氨酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠；

·缓冲液、缓冲体系和缓冲剂，其用于将组合物保持在生理pH或稍低的pH下，通常在约5至约8或9的pH范围内；缓冲剂的实例是硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸、琥珀酸盐、磷酸盐、组氨酸和醋酸盐；例如约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的醋酸盐缓冲液；

·非水溶剂诸如丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和可注射有机酯诸如油酸乙酯；

·含水载体，包括水、酒精/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质；

·可生物降解的聚合物诸如聚酯；

·填充剂诸如甘露醇或甘氨酸；

·螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；

·等渗和吸收延缓剂；

·络合剂诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)

·填料；

·单糖；二糖；和其它碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；碳水化合物可以是非还原糖，优选海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、山梨糖醇或木糖醇；

·(低分子量)蛋白质、多肽或蛋白质性质的载体，诸如人或牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，优选人来源的；

·着色剂和调味剂；

·含硫还原剂，诸如谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、[α]-单硫代甘油和硫代硫酸钠

·稀释剂；

·乳化剂；

·亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮)

·成盐抗衡离子诸如钠；

·防腐剂诸如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等；实例为：苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯基乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)。

·金属复合物诸如锌-蛋白复合物；

·溶剂和助溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；

·糖类和糖醇，诸如海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、甘露糖醇、山梨糖醇或木糖醇水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油、环醇类(例如，肌醇)、聚乙二醇；和多元糖醇；

·助悬剂；

·表面活性剂或润湿剂诸如普朗尼克类、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯类诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、曲拉通、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊；表面活性剂可以是去垢剂，优选具有＞1.2KD的分子量和/或聚醚，优选具有＞3KD的分子量；优选洗涤剂的非限制性实例是吐温20、吐温40、吐温60、吐温80和吐温85；优选聚醚的非限制性实例是PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000和PEG 5000；

·稳定性增强剂诸如蔗糖或山梨糖醇；

·张力增强剂诸如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇；

·肠胃外递送媒介物，包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油；

·静脉内递送媒介物，包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的补充剂)。

对于本领域技术人员来说显而易见的是，药物组合物(例如，上面列出的那些组合物)的不同成分可具有不同的作用，例如，氨基酸可充当缓冲剂、稳定剂和/或抗氧化剂；甘露醇可充当填充剂和/或张力增强剂；氯化钠可充当递送媒介物和/或张力增强剂；等等

设想了本发明的组合物，除了本文定义的本发明的多肽以外，还可包含其它生物活性剂，这取决于组合物的预期用途。此类试剂可能是作用于胃肠系统的药物，充当细胞抑制剂的药物，预防高尿酸血症的药物，抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)，调节炎症反应的药物，作用于循环系统的药物和/或本领域中已知的药剂诸如细胞因子。还设想了，本发明的抗体构建体被用于共同疗法，即与另一种抗癌药物组合。

在某些实施方案中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期的施用途径、递送形式和所需剂量来确定。参见，例如REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上。在某些实施方案中，此类组合物可影响本发明的抗体构建体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载体本质上可以是含水的或非含水的。例如，合适的媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊髓液，可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其它物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是进一步的示例性媒介物。在某些实施方案中，本发明组合物的抗体构建体可通过将具有所需纯度的选定组合物与任选制剂(REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，同上)以冻干饼或水溶液的形式混合来制备用于储存。另外，在某些实施方案中，可以使用合适的赋形剂诸如蔗糖将本发明的抗体构建体配制成冻干物。

当设想虑肠胃外施用时，用于本发明的治疗性组合物可以以无热原的、肠胃外可接受的水溶液的形式提供，所述水溶液包含在药学上可接受的媒介物中的本发明的所需抗体构建体。用于肠胃外注射的特别合适的媒介物是无菌蒸馏水，其中本发明的抗体构建体被配制成适当保存的无菌等渗溶液。在某些实施方案中，制备可涉及将可提供可通过储库注射递送的产品的受控或持续释放的药剂(诸如可注射微球体、生物可侵蚀颗粒、聚合物化合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体)与所需的分子一起配制。在某些实施方案中，也可使用透明质酸，其具有促进循环持续时间的作用。在某些实施方案中，可植入药物递送装置可用于引入所需的抗体构建体。

另外的药物组合物对于本领域技术人员是显而易见的，包括涉及持续或受控递送/释放制剂中的本发明的抗体构建体的制剂。用于配制各种其它持续或受控递送手段(诸如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒和储库注射)的技术也是本领域技术人员已知的。参见，例如，国际专利申请第PCT/US93/00829号，其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的受控释放。持续释放制剂可包括成型制品形式(例如，薄膜或微胶囊)的半透性聚合物基质。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(如美国专利第3,773,919号和欧洲专利申请公开第EP 058481号中公开的)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等，1983，Biopolymers 2：547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，1981，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开第EP 133,988号)。持续释放组合物还可包括可通过本领域已知的几种方法中的任一种制备的脂质体。参见，例如，Eppstein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；欧洲专利申请公开第EP 036,676号、第EP 088,046号和第EP 143,949号。

还可将抗体构建体包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)制备的微胶囊包、胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳剂中。此类技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Oslo，A.编辑，(1980)中。

用于体内施用的药物组合物通常作为无菌制剂提供。灭菌可通过无菌滤膜过滤完成。当将组合物冻干时，可在冻干和重构之前或之后进行使用该方法的灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液储存。通常将肠胃外组合物放入具有无菌入口的容器(例如具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)中。

本发明的另一个方面包括可用作药物组合物的本发明制剂的自我缓冲抗体构建体，如国际专利申请WO 06138181A2(PCT/US2006/022599)中所述的。关于蛋白质稳定化以及用于这方面的制剂材料和方法的各种各样的阐述是可获得的，诸如Arakawa等，“Solventinteractions in pharmaceutical formulations，”Pharm Res.8(3)：285-91(1991)；Kendrick等，RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS：THEORY ANDPRACTICE，Carpenter和Manning，编辑Pharmaceutical Biotechnology.13：61-84(2002)中的“Physical stabilization of proteins in aqueous solution”和Randolph等，“Surfactant-protein interactions”，Pharm Biotechnol.13：159-75(2002)，特别地参见涉及用于根据本发明的自我缓冲蛋白质制剂的赋形剂及其方法，尤其是关于用于兽医和/或人医学用途的蛋白质药物产品和方法的部分。

根据本发明的某些实施方案，可使用盐例如以调节制剂的离子强度和/或等渗性和/或改善根据本发明的组合物的蛋白质或其它成分的溶解度和/或物理稳定性。如所公知的，离子可通过与蛋白质表面上带电荷的残基结合，通过屏蔽蛋白质中的带电荷的极性基团和降低其静电相互作用的强度、吸引力和排斥作用而稳定蛋白质的天然状态。离子还可通过特别地与蛋白质的变性肽键联(--CONH)结合来稳定蛋白质的变性状态。此外，与蛋白质中带电荷的极性基团的离子相互作用也可减小分子间静电相互作用，从而防止或减少蛋白质的聚集和不溶性。

离子种类在其对蛋白质的作用方面有显著的不同。已开发了许多可用于配制根据本发明的药物组合物的离子及其对蛋白质的作用的分类排序。一个实例是霍夫迈斯特系列，其通过对它们对溶液中蛋白质的构象稳定性的影响将离子和极性非离子溶质分级。稳定溶质被称为“亲液”。去稳定溶质被称为“离液”。通常以高浓度(例如，＞1摩尔硫酸铵)使用亲液剂以从溶液中沉淀蛋白质(“盐析”)。离液剂通常用于使蛋白变性和/或使蛋白质增溶(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性限定了它们在霍夫迈斯特系列中的位置。

游离氨基酸可在根据本发明的各种实施方案的本发明的抗体构建体制剂中用作填充剂、稳定剂和抗氧化剂以及其它标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定制剂中的蛋白质。甘氨酸用于冻干以确保正确的滤饼结构和性质。在液体和冻干制剂中，精氨酸可用于抑制蛋白质聚集。甲硫氨酸可用作抗氧化剂。

多元醇包括糖类，例如甘露糖醇、蔗糖和山梨醇和多元醇诸如，例如甘油和丙二醇，以及为了本文论述的目的，聚乙二醇(PEG)和相关物质。多元醇是亲液的。它们是液体和冻干制剂中有用的稳定剂，以保护蛋白质免受物理和化学降解过程的影响。多元醇也用于调节制剂的张力。在本发明的选择的实施方案中有用的多元醇是甘露醇，通常用于确保冻干制剂中滤饼的结构稳定性。其确保滤饼的结构稳定性。其通常与冻干保护剂例如蔗糖一起使用。山梨糖醇和蔗糖是用于调节张力和用作稳定剂以在运输期间或在制造过程中制备团块时防止冻融胁迫的试剂中的优选试剂。还原糖类(其含有游离的醛或酮基团)，诸如葡萄糖和乳糖，可将表面赖氨酸和精氨酸残基糖化。因此，它们通常不在根据本发明使用的优选多元醇当中。另外，在这一点而言，形成此类反应性种类的糖类，诸如蔗糖(其在酸性条件下水解成果糖和葡萄糖，并因此产生糖化作用)也不在本发明的优选多元醇当中。PEG对于稳定蛋白质和作为冷冻保护剂是有用的，并且可在这方面用于本发明。

本发明制剂的抗体构建体的实施方案还包含表面活性剂。蛋白质分子可易于吸附在表面上，并在气-液、固-液和液-液界面上变性和随后聚集。这些效应通常与蛋白质浓度成反比。这些有害的相互作用通常与蛋白质浓度成反比，并且通常通过物理搅拌(诸如在产品的运输和处理过程中产生的物理搅拌)加剧。表面活性剂通常用于防止、最小化或减少表面吸附。在这方面，本发明中有用的表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨糖醇聚乙氧基化物的其它脂肪酸酯和泊洛沙姆188。表面活性剂还通常用于控制蛋白质构象稳定性。表面活性剂在这方面的用途是蛋白质特异性的，因为任何给定的表面活性剂通常会稳定一些蛋白质并使其它蛋白质去稳定。

聚山梨醇酯易于氧化降解，并且通常在供应时含有足够量的过氧化物以引起蛋白质残基侧链尤其是甲硫氨酸的氧化。因此，应谨慎使用聚山梨醇酯，使用时应以其最低有效浓度使用。在这一方面，聚山梨醇酯举例说明了赋形剂应当以其最低有效浓度使用的一般规则。

本发明的抗体构建体的实施方案还包含一种或多种抗氧化剂。在某种程度上，可以通过维持适当水平的环境氧气和温度以及通过避免暴露于光而在药物制剂中防止蛋白质的有害氧化。也可使用抗氧化剂赋形剂来防止蛋白质的氧化降解。在这一方面，有用的抗氧化剂中有还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗性蛋白质制剂中的抗氧化剂优选是水溶性的，并且在整个产品的保存期限内保持其活性。在这一方面，EDTA是根据本发明的优选抗氧化剂。抗氧化剂可以破坏蛋白质。例如，还原剂，特别是诸如谷胱甘肽，可以破坏分子内二硫键联。因此，选择用于本发明的抗氧化剂以，尤其，消除或充分降低其本身破坏制剂中的蛋白质的可能性。

根据本发明的制剂可包括金属离子，所述离子是蛋白质辅因子并且是形成蛋白质配位络合物所必需的，诸如形成某些胰岛素悬浮液所必需的锌。金属离子还可抑制一些降解蛋白质的过程。然而，金属离子也催化降解蛋白质的物理和化学过程。镁离子(10-120mM)可用于抑制天冬氨酸异构化成异天冬氨酸。Ca⁺²离子(高达100mM)可提高人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，Mg⁺²、Mn⁺²和Zn⁺²会使rhDN酶去稳定。类似地，Ca⁺²和Sr⁺²可以稳定因子VIII，其可被Mg⁺²、Mn⁺²和Zn⁺²、Cu⁺²和Fe⁺²去稳定，并且可通过Al⁺³离子增加其聚集。

本发明制剂的抗体构建体的实施方案还包含一种或多种防腐剂。当开发多剂量肠胃外制剂时防腐剂是必需的，所述开发涉及从同一容器进行多于一次提取。它们的主要功能是抑制微生物生长并在整个药物产品的保存期限或使用期限内确保产品无菌性。常用防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间-甲酚。虽然防腐剂在小分子肠胃外使用方面有着悠久的历史，但包含防腐剂的蛋白质制剂的开发可具有挑战性的。防腐剂几乎总是对蛋白质具有不稳定作用(聚集)，并且这已成为限制其在多剂量蛋白质制剂中使用的主要因素。迄今为止，大多数蛋白质药物仅配制为一次性使用。然而，当多剂量制剂是可能的时候，它们具有使患者方便和增加适销性的额外有利方面。一个很好的实例是人生长激素(hGH)的多剂量制剂，其中保存制剂的开发已导致更方便、多用途的注射笔呈现的商业化。目前市场上至少有四种含有hGH的保存制剂的此类笔装置。诺德欣(Norditropin)(液体，Novo Nordisk)、NutropinAQ(液体，Genentech)及Genotropin(冻干--双室药筒，Pharmacia & Upjohn)含有苯酚，而Somatrope(Eli Lilly)与间-甲酚一起配制。保存剂型的配制和开发过程中需要考虑几个方面。必须优化药品中有效的防腐剂浓度。这需要测试剂型中给定的防腐剂的赋予抗微生物效力而不损害蛋白质稳定性的浓度范围。

正如可以预料的那样，含有防腐剂的液体制剂的开发比冻干制剂更具挑战性。冷冻干燥的产品可以在没有防腐剂的情况下冻干，并且在使用时用含有防腐剂的稀释剂重构。这缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间，显著地使相关的稳定性风险降至最低。对于液体制剂，应在整个产品保存期限(约18至24个月)内保持防腐效力和稳定性。重要的一点是，防腐剂的有效性应该在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中得到证明。

本文公开的抗体构建体也可以配制成免疫脂质体。“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，其可用于将药物递送至哺乳动物。脂质体的组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。含有抗体构建体的脂质体通过本领域已知的方法制备，诸如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；美国专利第4,485,045号和和第4,544,545号；以及W0 97/38731中所描述的。具有延长的循环时间的脂质体公开于美国专利第5,013,556号中。特别有用的脂质体可通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。将脂质体挤出通过具有限定孔径的过滤器以产生具有需直径的脂质体。可如Martin等，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)所述，通过二硫键交换反应将本发明的抗体构建体的Fab′片段缀合至脂质体。将化学治疗剂任选地包含在脂质体内。参见Gabizon等J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。

一旦配制了药物组合物，可将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体、晶体或作为脱水或冻干粉储存在无菌小瓶中。此类制剂可以以即用形式或以在施用前重构的形式(例如，冻干的)储存。

本文所定义的药物组合物的生物活性可以例如通过细胞毒性测定来测定，如在WO99/54440中的实施例中或由Schlereth等(Cancer Immunol.Immunother.20(2005)，1-12)所描述的。如本文中所用，“功效”或“体内功效”是指使用例如标准化的NCI反应标准，对通过本发明的药物组合物的治疗的反应。使用本发明的药物组合物的治疗的成功或体内功效是指组合物对其预期目的的有效性，即组合物引起其所需作用的能力，即病理性细胞(例如，肿瘤细胞)的耗竭。体内功效可通过针对相应的疾病实体的已建立的标准方法来监测，包括但不限于白细胞计数、差异、荧光激活细胞分选术、骨髓抽吸。另外，可使用各种疾病特异性临床化学参数和其它建立的标准方法。此外，计算机辅助X线断层摄影术、X射线、核磁共振断层摄影术(例如，用于基于国家癌症研究所标准的反应评估[Cheson BD，HorningSJ，Coiffier B，Shipp MA，Fisher RI，Connors JM，Lister TA，Vose J，Grillo-Lopez A，Hagenbeek A，Cabanillas F，Klippensten D，Hiddemann W，Castellino R，Harris NL，Armitage JO，Carter W，Hoppe R，Canellos GP.Report of an international workshopto standardize response criteria for non-Hodgkin′s lymphomas.NCI SponsoredInternational Working Group.J Clin Oncol.1999年4月；17(4)：1244])、正电子发射断层扫描术、白细胞计数、差异、荧光激活细胞分选术、骨髓抽吸、淋巴结活组织检查/组织学，并且可使用各种淋巴瘤特异性临床化学参数(例如乳酸脱氢酶)和其它已建立的标准方法。

药物诸如本发明的药物组合物的开发中的另一个主要挑战是可预测的药代动力学性质的调节。为此目的，可以建立候选药物的药代动力学特征，即影响特定药物治疗给定病况的能力的药代动力学参数的特征。影响药物治疗某些疾病实体的能力的药物的药代动力学参数包括但不限于：半衰期、分布体积、肝首过代谢和血清结合度。给定药物的功效可以受到上述每个参数的影响。

“半衰期”意指其中通过生物过程如代谢、排泄等消除50％施用的药物所用的时间。“肝首过代谢”是指药物在首次接触肝脏时(即在其首次通过肝脏期间)被代谢的倾向。“分布体积”意指药物在身体内不同隔室的保留程度，如例如细胞内与细胞外间隙、组织和器官等，以及药物在这些隔室内的分布。“血清结合度”意指药物与血清蛋白诸如白蛋白相互作用并与其结合，从而导致该药物生物活性的降低或丧失的倾向。

药代动力学参数还包括给定量的施用的药物的生物利用度、滞后时间(Tlag)、Tmax、吸收率、多发(more onset)和/或Cmax。“生物利用度”意指血液隔室中的药物量。“滞后时间”意指药物施用与其在血液或血浆中检测出及可测得之间的时间延搁。“Tmax”是药物达到最大血药浓度所需要的时间，“Cmax”是对于给定药物获得的最大血药浓度。达到其生物作用所需的药物的血液或组织浓度的时间受所有参数影响。也在例如Schlereth等的出版物(Cancer Immunol.Immunother.20(2005)，1-12)中阐述了表现出跨物种特异性的双特异性抗体构建的药代动力学参数(其可如上所概述的，在临床前动物测试中在非黑猩猩灵长类动物中进行测定)。

一个实施方案提供了本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的用于预防、治疗或改善血液癌症疾病或转移性癌症疾病的抗体构建体。

本文所述的制剂可用作药物组合物，用于在有此需要的患者中治疗、改善和/或预防如本文所述的病理医学病况。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施。治疗包括将所述制剂施加或施用于患有疾病/病症、疾病/病症的症状或具有对疾病/病症的倾向的患者的身体、分离的组织或细胞，目的是治愈、愈合、缓解、减轻、改变、补救、改善、增进或影响疾病、该疾病的症状或罹患该疾病倾向。

如本文中所用，术语“改善”是指通过向有此需要的受试者施用根据本发明的抗体构建体而对患有如下文所述的肿瘤或癌症或转移性癌症的患者的疾病状态的任何改善。此类改善也可以被看作是患者的肿瘤或癌症或转移性癌症的进展的减缓或停止。如本文中所用，术语“预防”意指通过向有此需要的受试者施用根据本发明的抗体构建体而使患者避免发生或再发生患如下文所述的肿瘤或癌症或转移性癌症。

术语“疾病”是指将受益于利用本文所述的抗体构建体或药物组合物的治疗的任何病况。这包括慢性和急性病况或疾病，包括使哺乳动物易患所述疾病的那些病理状况。

“肿瘤”是组织的异常生长，通常但不总是形成肿块。当也形成肿块时，通常将其称为“肿瘤”。赘生物或肿瘤或可以是良性的，可能是恶性的(癌前)或恶性的。恶性赘生物通常被称为癌症。它们通常侵入并破坏周围的组织，并可能形成转移灶，即它们扩散到身体的其它部位、组织或器官。因此，术语“转移性癌症”包括与除原始肿瘤的组织或器官相比至其它组织或器官的转移。淋巴瘤和白血病是淋巴赘生物。为了本发明的目的，它们也被术语“肿瘤”或“癌症”涵盖。

在本发明的一个优选实施方案中，血液癌症疾病是AML，并且转移性癌症疾病可以来源于上述疾病。

结合本发明，优选肿瘤或癌症疾病选自由以下各项组成的组：乳腺癌、类癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、间皮瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肾癌和胃癌。更优选地，优选为实体瘤疾病的肿瘤或癌症疾病可选自由以下各项组成的组：卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤、肺癌、胃癌和三阴性乳腺癌。转移性癌症疾病可以来源于上述任何一种。

本发明还提供用于治疗或改善血液癌症疾病或转移性癌症疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体的步骤。

术语“有需要的受试者”或“需要治疗的”的那些受试者包括已经患有病症的那些受试者以及其中将要预防疾病的那些受试者。有需要的受试者或“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。

通常将针对特定的施用途径和方法，特定的施用剂量和频率，特定疾病的特定治疗，生物利用度和持久性范围等来设计本发明的抗体构建体。组合物的材料优选以对于施用部位是可接受的浓度来进行配制。

因此可根据本发明设计制剂和组合物以通过任何合适的施用途径递送。在本发明的上下文中，施用途径包括但不限于

·局部途径(诸如表皮、吸入、经鼻、经眼、经耳/耳部、经阴道、经粘膜)；

·肠途径(诸如口服、胃肠道、舌下、唇下、口腔、直肠)；和

·肠胃外途径(诸如静脉内、动脉内、骨内、肌内、大脑内、脑室内、硬膜外、鞘内、皮下、腹膜内、羊膜外、关节内、心内、真皮内、病灶内、子宫内、膀胱内、玻璃体内、经皮肤、鼻内、经粘膜、滑膜内、管腔内)。

本发明的药物组合物和抗体构建体特别适用于肠胃外施用，例如皮下或静脉内递送，例如通过注射诸如推注，或通过输注诸如连续输注。药物组合物可使用医疗装置来施用。用于施用药物组合物的医疗装置的实例描述于美国专利第4,475,196号、第4,439,196号、第4,447,224号、第4,447,233号、第4,486,194号、第4,487,603号、第4,596,556号、第4,790,824号、第4,941,880号、第5,064,413号、第5,312,335号、第5,312,335号、第5,383,851号和第5,399,163号。

特别地，本发明提供了合适组合物的不间断施用。作为非限制性实例，可通过患者佩戴的用于计量治疗剂至患者体内的流入的小型泵系统来实现不间断或基本不间断的，即连续施用。包含本发明的抗体构建体的药物组合物可通过使用所述泵系统施用。此类泵系统在本领域中通常是已知的，并且通常依靠定期更换含有待输注的治疗剂的药筒。当在此类泵系统中更换药筒时，其它情况下的治疗剂不间断流入患者体内的现象可能会发生暂时中断。在这种情况下，仍将药筒更换前的施用阶段和药筒更换后的施用阶段视为在本发明的药学方式和方法的含义内，并一同构成此类治疗剂的一个“不间断施用”。

本发明的抗体构建体的连续或不间断施用可以是通过流体递送装置或小型泵系统的方式进行在静脉内或皮下进行的，所述流体递送装置或小型泵系统包括用驱动流体从储存器中流出的流体驱动机制和用于致动驱动机制的致动机制。用于皮下施用的泵系统可包括用于穿透患者皮肤并将合适的组合物递送至患者体内的针或套管。所述泵系统可独立于静脉、动脉或血管直接固定或附接至患者的皮肤，从而允许泵系统与患者皮肤之间直接接触。可将泵系统附接于患者的皮肤24小时至数天。所述泵系统可以是小型尺寸，并具有供小容积使用的储存器。作为非限制性实例，用于待施用的合适药物组合物的储存器的容积可在0.1与50ml之间。

连续施用还可通过佩戴在皮肤上并每隔一段时间更换的贴片进行经皮肤施用。本领域技术人员知道适用于该目的的药物递送的贴片系统。值得注意的是，经皮肤施用尤其适用于不间断施用，因为可以有利地同时完成用完第一贴片后的新的第二贴片的更换，例如，将第二贴片放置于紧邻用完的第一贴片的皮肤表面并紧接着移除用完的第一贴片。不会出现流动中断或电池故障的问题。

如果药物组合物已被冻干，则首先在施用之前在合适的液体中重构冻干的材料。可在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或与冻干前蛋白质的相同制剂中重构冻干的材料。

可以以合适的剂量向受试者施用本发明的组合物，所述剂量可以例如通过剂量递增研究(通过向非黑猩猩灵长类动物(例如猕猴)施用递增剂量的表现出本文所述的跨物种特异性的本发明的抗体构建体)来确定。如上所述，表现出本文所述的跨物种特异性的本发明的抗体构建体可有利地以相同的形式用于在非黑猩猩灵长类动物中进行的临床前测试，以及作为人的药物使用。给药方案由主治医师和临床因素决定。如在医学领域中公知的，用于任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康状况以及同时施用的其它药物。

术语“有效剂量”或“有效药剂量”被定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。术语“治疗有效剂量”被定义为足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的该疾病及其并发症的量。对该用途有效的量或剂量将取决于待治疗的病况(适应症)、递送的抗体构建体、治疗背景和目标、疾病的严重程度、先前的治疗、患者的临床病史和对治疗剂的反应、施用途径、患者的体型(体重、体表面或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)以及患者自身免疫系统的一般状态。可根据主治医生的判断，调整适当的剂量，从而使得该剂量可以一次施用于患者或者以一系列施药施用于患者，以获得最佳的治疗效果。

取决于上述因素，常用剂量范围可为约从0.1μg/kg至高达约30mg/kg或更高。在具体的实施方案中，剂量范围可为从1.0μg/kg直至约20mg/kg，任选地从10μg/kg直至约10mg/kg或从100μg/kg直至约5mg/kg。

治疗有效量的本发明的抗体构建体优选导致疾病症状严重度的降低，疾病无症状期的频率或持续时间的增加或由于疾病折磨而损伤或残疾的预防。为了治疗表达FLT3的肿瘤，治疗有效量的本发明的抗体构建体，例如抗FLT3/抗CD3抗体构建体优选抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％(相对于未治疗的患者)。可在预测在人肿瘤中的功效的动物模型中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。

药物组合物可以作为单独的治疗剂或根据需要与其它治疗剂诸如抗癌疗法(例如，其它蛋白质性质和非蛋白质性质的药物)组合施用。这些药物可以与包含如本文定义的本发明的抗体构建体的组合物同时施用，或者在以所限定时间间隔和剂量施用所述抗体构建体之前或之后单独施用。

如本文中所用，术语“有效且无毒的剂量”是指本发明的抗体构建体的可耐受剂量，所述剂量足够高从而引起病理细胞耗竭、肿瘤消除、肿瘤缩小或疾病的稳定，而不具有或基本上不具有较大毒性作用。此类有效且无毒的剂量可以例如通过本领域描述的剂量递增研究来测定，且该剂量应低于诱导严重不良副事件的剂量(剂量限制性毒性，DLT)。

如本文中所用，术语“毒性”是指表现为不良事件或严重不良事件的药物毒性作用。这些副事件可能是指对于药物缺乏整体耐受性和/或在施用后缺乏局部耐受性。毒性还可包括由药物引起的致畸或致癌作用。

如本文中所用，术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义在直接施药后(局部耐受)以及用药后的一个较长时期内药物的施用不会诱导严重不良事件。“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”可以在如治疗和随访期间定期进行评价。测量包括临床评价，例如器官的表现，以及实验室异常情况的筛查。可进行临床评价，并根据NCI-CTC和/或MedDRA标准记录/编码相对于正常结果的偏差。器官的表现可以包括诸如过敏/免疫学、血液/骨髓、心律失常、凝血等的标准，如阐述于例如不良事件术语标准第3.0版(CTCAE)中。可以进行测试的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝血功能概况和尿液分析以及其它体液诸如血清、血浆、淋巴液或脊髓液、脑脊液等的检查。因此可以例如通过体格检查、成像技术(即超声、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI))、其它测量及与技术设备(即心电图)、生命体征，通过测量实验室参数和记录不良事件来评价价安全性。例如，可通过组织病理学和/或组织化学方法来检查根据本发明的用途和方法中的非黑猩猩灵长类动物的不良事件。

上述术语也在例如Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6；ICH Harmonised Tripartite Guideline；ICH SteeringCommittee会议(1997年7月16日召开)中被提及。

在另外的实施方案中，本发明提供了包含本发明的抗体构建体、根据本发明的方法产生的抗体构建体、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或发明的宿主试剂盒。

在本发明的上下文中，术语“试剂盒”意指一起被包装在容器、接受器或其它容器中的两种或更多种组分，其中一种对应于本发明的抗体构建体、药物组合物、载体或宿主细胞。因此，试剂盒可以被描述为足以实现特定目标的一组产品和/或器具，其可以作为单个单元销售。

该试剂盒可以包含任何适当形状、尺寸和材料(优选防水的，例如塑料或玻璃)的一个或多个容器(诸如小瓶、安瓿、容器、注射器、瓶子、袋子)，其以适当的施用剂量包含本发明的抗体构建体或药物组合物(参见上文)。所述试剂盒可另外包含使用指导(例如以小册子或说明书的形式)、施用本发明的抗体构建体的手段(诸如注射器、泵、浸泡器等)、用于重构本发明的抗体构建体的手段和/或用于稀释本发明的抗体构建体的手段。

本发明还提供了用于单剂量施用单元的试剂盒。本发明的试剂盒还可含有包含干燥/冻干抗体构建体的第一接受器和包含含水制剂的第二接受器。在本发明的某些实施方案中，提供了含有单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和lyosyringes)的试剂盒。

附图显示：

图1：(a)单体FLT3蛋白的示意性结构和(b)与FLT3LG同二聚体相互作用的FLT3同二聚体的晶体结构。

图2：用于表位簇结合剂表征的嵌合人/小鼠FLT3分子的示意性结构

图3：用于表位簇结合剂表征的截短的FLT3构建体的示意性结构

图4：分析本发明的FLT3结合剂与FLT3-配体竞争FLT3结合的测定。

将CHO-人FLT3细胞与10μg/ml FLT3配体一起孵育30分钟(无洗涤步骤)。添加scFv周质制剂并孵育30分钟。使用小鼠抗-FLAG+缀合有PE的山羊抗小鼠和通过FACS检测的荧光中值(中值(+配体)/中值(无配体)*100％)进行检测。

图5：指定的跨物种特异性双特异性单链构建体对用人FLT3转染的CHO细胞、人CD3+ T细胞系HPBaLL、用食蟹猴FLT3转染的CHO细胞和猕猴CD3+ T细胞系LnPx 4119的FACS结合分析。红线代表与2μg/ml纯化的单体蛋白一起孵育的细胞，随后用小鼠抗I2C抗体和PE标记的山羊抗小鼠IgG检测抗体孵育所述细胞。黑色直方图线反映阴性对照：仅与抗I2C抗体以及PE标记的检测抗体孵育的细胞(参见实施例6)。

图6：由重新定向于CD56耗竭的未经刺激的人PBMC(作为效应细胞)和用人FLT3转染的CHO细胞(作为靶细胞)的指定的跨物种特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性。(实施例9)

图7：与CD3、FLT3及其同种型的交叉反应性结合)。5μg/ml BiTE蛋白：4℃，60分钟；2pg/ml抗I2C-Ab 3E5.A5：4℃，30分钟；山羊抗小鼠PE 1∶100：4℃，30分钟

图8：不与ParAlogs和未转染的CHO结合。5μg/ml BiTE蛋白：4℃，60分钟；2μg/ml抗I2C-Ab 3E5.A5：4℃，30分钟；山羊抗小鼠PE 1∶100：4℃，30分钟

图9：表位簇作图-簇E1

图10：FLT3 scFc抗体构建体在FLT3LG(FLT3配体)不存在和存在的情况下对于使用未经刺激的人PBMC针对人FLT3转染的CHO细胞是有活性的。

实施例：

以下实施例说明了本发明。这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。本发明仅受权利要求的限制。

实施例1

表达野生型和嵌合FLT3的CHO细胞的产生

为了实施例1和2的目的，可将FLT3抗原细分为已定义的6个不同的亚结构域或区域。这五个亚结构域的氨基酸序列示于SEQ ID NO：814-818中。

产生以下分子；也参见图1：

·hu lsp V5xFlt3-E1muxEpC-pEFDHFR SEQ ID NO：827

·hu lsp V5xFlt3-E2muxEpC-pEFDHFR SEQ ID NO：828

·hu lsp V5xFlt3-E3muxEpC-pEFDHFR SEQ ID NO：829

·hu lsp V5xFlt3-E3AmuxEpC-pEFDHFR SEQ ID NO：830

·hu lsp V5xFlt3-E3BmuxEpC-pEFDHFR SEQ ID NO：831

·hu lsp V5xFlt3-E4muxEpC-pEFDHFR SEQ ID NO：832

·hu lsp V5xFlt3-E5muxEpC-pEFDHFR SEQ ID NO：833

·hu lsp V5xFlt3-E6muxEpC-pEFDHFR SEQ ID NO：834

·hu lsp FLT3-完全鼠EDC

·hu lsp FLT3-完全人EDC

·全长人FLT3 SEQ ID NO：801

·全长cyno FLT3 SEQ ID NO：802

为了产生表达人、鼠和嵌合FLT3细胞外结构域(ECD)的CHO/HEK细胞，将人FLT3、鼠FLT3和8个嵌合的人/鼠FLT3形式(见上文)的相应编码序列克隆至命名为pEF-DHFR(在Raum等，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中描述了pEF-DHFR)的质粒中。对于人和鼠FLT3的细胞表面表达，使用原始信号肽。根据标准方案(Sambrook，MolecularCloning；A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，ColdSpring Harbour，New York(2001))进行所有克隆程序。对于每种构建体，将相应的质粒转染至DHFR缺陷型CHO细胞中以用于真核细胞表达，如由Kaufman R.J.(1990)MethodsEnzymol.185，537-566所描述的。

在FACS测定中证实了人、嵌合和鼠FLT3在CHO细胞上的表达。

实施例2

抗FLT3抗体构建体的表位作图

在PBS/1.5％ FCS中用含有与人白蛋白(变体1)融合的双特异性FLT3xCD3抗体构建体(具有命名为I2C的CD3结合结构域)的粗制未稀释的周质提取物对人、鼠FLT3和嵌合人FLT3分子转染的细胞(参见实施例1)进行染色。用内部小鼠单克隆抗CD3结合结构域抗体(50μl)，随后用抗小鼠IgG Fc-γ-PE(1∶100，50μl；Jackson Immunoresearch # 115-116-071)检测结合的分子。所有抗体用PBS/1.5％FCS稀释。作为阴性对照，用PBS/2％FCS代替周质提取物孵育细胞。通过流式细胞术测量样品。

被相应的FLT3结合结构域识别的区域示于序列表(表2)中。读出包含鼠表位簇的相应的嵌合FLT3构建体中的FACS信号的丢失，以获得相应的簇对于结合的相关性。表2中的相应的结果与根据实施例3的结果一致。

实施例3

表达野生型和截短的FLT3的CHO细胞的产生

可通过以下氨基酸位置将FLT3抗原的胞外结构域分成不同的亚结构域或区域，分别为被定义的表位簇E1至E6：

为了构建用于表位作图的截短的FLT3分子(参见图3)，将相应的七个人区域以及两个相邻人区域的五个组合的序列(参见上文)用来自鼠FLT3的相应区域替换。此外，将V5标签(GKPIPNPLLGLDST)通过“GGGGS”接头与嵌合分子的C末端的融合。最终的嵌合分子序列示于SEQ ID NO：827-834中。此外，构建全长人FLT3(SEQ ID NO：801)和全长cyno FLT3(SEQID NO：802)，两者都具有通过“GGGGS”接头与它们的C末端融合的V5标签(GKPIPNPLLGLDST)。

为了产生表达上述构建体的CHO dhfr-细胞，将相应的编码序列克隆至命名为pEF-DHFR的质粒(在Raum等，Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150中描述了pEF-DHFR)中。还产生了用人FLT3转染但不含V5标签的CHO细胞。根据标准方案(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，Cold Spring Harbour，New York(2001))进行所有克隆程序。对于每种构建体，将相应的质粒转染至DHFR缺陷型CHO细胞中以用于真核细胞表达，如由Kaufman R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566所描述的。

使用单克隆小鼠IgG2a抗v5标签抗体(1μg/ml；AbD Serotec，#MCA 1360)证明了构建体在CHO细胞上的表达。用抗小鼠IgG Fc-γ-PE检测结合的单克隆抗体。作为阴性对照，将细胞与同种型对照抗体而非第一抗体一起孵育。通过流式细胞术测量样品。

对于表2中公开的FLT3结合剂显示了该分析的结果。这些结果与根据实施例2的表位作图分析一致。

表2：表位作图

实施例4

抗体对人和食蟹猴FLT3的亲和力的基于Biacore的测定

使用重组人/猕猴FLT3-ECD与白蛋白的融合蛋白进行Biacore分析实验，以测定本发明的抗体构建体的靶标结合。

详细而言，根据制造商的手册，使用pH 4.5的醋酸盐缓冲液将约600-800RU的相应重组抗原固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。按以下浓度的稀释系列负载FLT3xCD3双特异性抗体构建体样品：在HBS-EP运行缓冲液(GE Healthcare)中稀释的50nM、25nM、12.5nM、6.25nM和3.13nM。流速为30μl/分钟，进行3分钟，然后以30μl/ml的流速再次施加HBS-EP运行缓冲液，进行8分钟至20分钟。使用10m M甘氨酸10mM NaCl pH 1.5溶液进行芯片再生。使用BiaEval软件分析数据集。通常进行两个独立的实验。

此外，在Biacore测定中证实双特异性抗体构建体与人CD3和猕猴CD3的结合。

实施例5

FLT3xCD3双特异性抗体构建体对靶抗原阳性细胞上的人和猕猴FLT3的亲和力的基于Scatchard的分析以及种间亲和力差距的测定

还通过Scatchard分析(作为测量人与猕猴FLT3之间的潜在亲和力差距的最可靠的方法)测定了FLT3xCD3双特异性抗体构建体对用人或猕猴FLT3转染的CHO细胞的亲和力。对于Scatchard分析，使用单价检测系统进行饱和结合实验以精确地测定FLT3xCD3双特异性抗体构建体与相应的细胞系的单价结合。

将各自细胞系(重组表达人FLT3的CHO细胞系，重组表达猕猴FLT3的CHO细胞系)的2x 10⁴个细胞各自与50μl的始于10-20nM的相应FLT3xCD3双特异性抗体构建体(直至达到饱和)的一式三份稀释系列(以1∶2进行12次稀释)一起孵育，随后在4℃下在搅拌孵育16小时并进行一次残留洗涤步骤。然后，将细胞与30μl的CD3xALEXA488缀合物溶液再一起孵育一小时。经过一个洗涤步骤后，将细胞重悬于150μl含有3.5％甲醛的FACS缓冲液中，再孵育15分钟，离心，重悬于FACS缓冲液中并使用FACS CantoII仪和FACS Diva软件进行分析。从两组独立的实验产生数据，每组使用一式三份重复。计算相应的Scatchard分析以从而推断最大结合(Bmax)。测定反映相应KD的FLT3xCD3双特异性抗体构建体在半最大结合时的浓度。将一式三份测量的值绘制成双曲线和S型曲线，以证明从最小至最佳结合的适当浓度范围。

实施例6

双特异性结合和种间交叉反应性

为了证实与人FLT3和CD3以及cyno FLT3和CD3的结合，使用以下细胞通过流式细胞术测试本发明的双特异性抗体构建体：

·分别用人FLT3(SEQ ID NO：801)、人FLT3同种型(人FLT3(T227M)同种型参见SEQID NO：803，以及人FLT3-ITD同种型参见SEQ ID NO：804)和猕猴FLT3(SEQ ID NO：802)转染的CHO细胞，

·FLT3阳性人AML细胞系EOL-1、MOLM-13和MV4-11(但其它FLT3阳性人细胞系也是可行的)

·表达CD3的人T细胞白血病细胞系HPB-all(DSMZ，Braunschweig，ACC483)，和

·表达食蟹猴CD3的T细胞系LnPx 4119

对于流式细胞术，将相应细胞系的200,000个细胞与50μl浓度为5μg/ml的纯化的双特异性抗体构建体在4℃下孵育60分钟。将细胞在PBS/2％FCS中洗涤两次，然后在4℃下用对双特异性抗体构建体的CD3结合部分有特异性的内部小鼠抗体(2μg/ml)孵育30分钟。洗涤后，用山羊抗小鼠Fcγ-PE(1∶100)在4℃下检测结合的小鼠抗体，进行30分钟。通过流式细胞术测量样品。未转染的CHO细胞用作阴性对照。

表3a：FLT3结合结构域的亲和力：

表3b：CD3结合结构域的亲和力：

实施例7

确认不存在对人旁系同源物的结合

将人FLT3旁系同源物KIT v1(SEQ ID NO：805)、CSF1R v1(SEQ ID NO：806)、PDGFRA(SEQ ID NO：807)和NTM v3(SEQ ID NO：808)稳定地转染至CHO细胞中。如序列表中标识的如本实施例中使用的旁系同源物的序列。

表4a：旁系同源物在蛋白质序列的全长范围内与FLT3的同一性

蛋白质	同一性％	查询id(％)
			c-KIT	29	28
CSF1R	29	28
			PDGFRA	27	30

表4b：旁系同源物在蛋白质序列的ECD范围内与FLT3的同一性

蛋白质	同一性％	查询id(％)
			NTM	25	28

用特异性抗体在FACS分析中证实蛋白质表达。如实施例6中所述进行流式细胞术测定。

实施例8：

与人种系的同一性

为了分析抗体构建体序列与人抗体种系基因的同一性/相似性，如下比对本发明的FLT3结合结构域：比对包括所有CDR的完整VL；将包括CDR1和2但除CDR3外的完整VH相对于人抗体种系基因(Vbase)进行比对。更多的细节可在本申请的说明书中找到。

实施例9

细胞毒性活性

在5个体外细胞毒性测定中分析本发明的FLT3xCD3双特异性抗体构建体将效应T细胞针对表达FLT3的靶细胞重新定向的效力：

·在18小时的51-铬释放测定中测量了FLT3xCD3双特异性抗体构建体将经刺激的人CD8+效应T细胞针对人FLT3转染的CHO细胞重新定向的效力。

·在18小时51-铬释放测定中测定了FLT3xCD3双特异性抗体构建体将经刺激的人CD8+效应T细胞针对FLT3阳性人AML细胞系EOL-1、MOLM-13和MV4-11(但其它FLT3阳性人细胞系也是可设想的)重新定向的效力。

·在48小时的基于FACS的细胞毒性测定中，测量了FLT3xCD3双特异性抗体构建体将未经刺激的人PBMC中的T细胞针对人FLT3转染的CHO细胞重新定向的效力。

效应细胞：未经刺激的人PBMC(CD14-/CD56-)。靶细胞：EOL-1。效应子与靶细胞(E∶T)-比率：10∶1。BiTE蛋白如所指示。

效应细胞：未经刺激的人PBMC(CD14-/CD56-)。靶细胞：MV4-11。效应子与靶细胞(E∶T)-比率：10∶1。BiTE蛋白如所指示。

·在48小时的基于FACS的细胞毒性测定中测量了FLT3xCD3双特异性抗体构建体将未经刺激的人PBMC中的T细胞针对FLT3阳性人AML细胞系EOL-1、MOLM-13和MV4-11(但其它FLT3阳性人细胞系也是可设想的)重新定向的效力。

·为了证实交叉反应性FLT3xCD3双特异性抗体构建体能够将猕猴T细胞针对猕猴FLT3转染的CHO细胞重新定向，用猕猴T细胞系作为效应T细胞进行48小时的基于FACS的细胞毒性测定。

效应细胞：未经刺激的人PBMC(CD14-/CD56-)。靶细胞：mac FLT3转染的CHO细胞。效应子与靶细胞(E∶T)-比率：10∶1。BiTE蛋白如所指示。

·在48小时的基于FACS的细胞毒性测定中测量了在FLT3配体不存在和存在的情况下FLT3xCD3双特异性抗体构建体将未经刺激的人PBMC中的T细胞针对人FLT3转染的CHO细胞重新定向的效力。效应细胞：未经刺激的人PBMC(CD14-/CD56-)。靶细胞：hu FLT3转染的CHO细胞。效应子与靶细胞(E∶T)-比率：10∶1。BiTE蛋白如所指示。

实施例10.1

用经刺激的人T细胞进行的铬释放测定

如下所述获得了富集CD8⁺ T细胞的经刺激的T细胞。利用终浓度为1μg/ml的商购可得的抗CD3特异性抗体(OKT3，Orthoclone)在37℃下涂覆皮氏培养皿(直径145 mm，Greiner bio-one GmbH，)，进行1小时。使用PBS通过一个洗涤步骤除去未结合的蛋白质。将3-5 x 10⁷个人PBMC添加至预涂覆的皮氏培养皿中的含有稳定化谷氨酰胺/10％FCS/IL-220 U/ml(Chiron)的120 ml RPMI 1640中，并刺激2天。第三天，收集细胞并用RPMI 1640洗涤一次。添加IL-2至终浓度为20 U/ml，并在与上述培养基相同的细胞培养基中再培养细胞一天。根据制造商的方案，通过使用Dynal-Beads耗竭CD4⁺ T细胞和CD56⁺ NK细胞来富集CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。

将Cyno FLT3-或人FLT3-转染的CHO靶细胞用PBS洗涤两次，并在37℃下用在含有50％FCS的终体积为100μl RPMI中的11.1MBq ⁵¹Cr标记60分钟。随后，用5ml RPMI将标记的靶细胞洗涤3次，然后用于细胞毒性测定。在96孔板中，在总体积为200μl的E∶T比率为10∶1的补充RPMI中进行测定。使用起始浓度为0.01-1μg/ml的纯化的双特异性抗体构建体及其三倍稀释物。测定的孵育时间为18小时。细胞毒性按照上清液中释放的铬相对于最大溶解(添加Triton-X)与自发溶解(无效应细胞)之间差异的相对值进行测定。所有测量均一式四份进行。在Wizard 3”γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH，Germany)中进行上清液中的铬活性测量。使用针对Windows的Prism 5(5.0版，GraphPad Software Inc.，San Diego，California，USA)来进行结果分析。将通过分析程序从S型剂量反应曲线计算的EC50值用于比较细胞毒性活性。

实施例10.2

将经刺激的人效应T细胞针对人FLT3转染的CHO细胞重新定向的效力

在使用用人FLT3转染的CHO细胞作为靶细胞并将经刺激的人CD8⁺ T细胞作为效应细胞的51-铬(⁵¹Cr)释放细胞毒性测定中，分析根据本发明的FLT3xCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如实施例10.1中所述进行该实验。

实施例10.3

将经刺激的人效应T细胞针对FLT3阳性人细胞系重新定向的效力

在使用FLT3阳性人AML细胞系EOL-1、MOLM-13和MV4-11作为靶细胞来源并将经刺激的人CD8+ T细胞作为效应细胞的51-铬(⁵¹Cr)释放细胞毒性测定中，分析FLT3xCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如实施例10.1中所述进行该测定。

实施例10.4

利用未经刺激的人PBMC进行的基于FACS的细胞毒性测定

效应细胞的分离

通过Ficoll密度梯度离心从富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)制备人外周血单核细胞(PBMC)，所述制备物为血库采集输注用血的副产物。血沉棕黄层由当地血库提供，且在血液采集当天制备PBMC。在Ficoll密度离心并用Dulbecco′s PBS(Gibco)充分洗涤后，通过用红细胞溶解缓冲液(155mM NH₄Cl，10mM KHCO₃，100μM EDTA)孵育，从PBMC中除去残留的红细胞。通过以100xg离心PBMC从上清液中除去血小板。保留的淋巴细胞主要包括B淋巴细胞和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。将PBMC在37℃/5％CO₂下于含有10％FCS(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中保持培养。

CDl4⁺和CD56⁺细胞的耗竭

对于耗竭CDl4⁺的细胞，使用人CDl4微珠(Milteny Biotec，MACS，#130-050-201)，对于NK细胞的耗竭，使用人CD56微珠(MACS，#130-050-401)。对PBMC进行计数，并在室温下以300xg离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于MACS分离缓冲液[80μL/10⁷个细胞；PBS(Invitrogen，#20012-043)，0.5％(v/v)FBS(Gibco，#10270-106)，2mM EDTA(Sigma-Aldrich，#E-6511)]。添加CD14微珠和CD56微珠(20μL/10⁷个细胞)，并在4-8℃下孵育15分钟。用MACS分离缓冲液(1-2mL/10⁷个细胞)洗涤细胞。离心(参见上文)后，弃去上清，并将细胞重悬于MACS分离缓冲液(500μL/10⁸个细胞)中。然后使用LS柱(Miltenyi Biotec，#130-042-401)分离CD14/CD56阴性细胞。在37℃下于培养箱中，在补充有10％FBS(BiochromAG，#S0115)、1x非必需氨基酸(Biochrom AG，#K0293)、10mM Hepes缓冲液(Biochrom AG，#L1613)、1mM丙酮酸钠(Biochrom AG，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(Biochrom AG，#A2213)的RPMI完全培养基即RPMI1640(Biochrom AG，#FG1215)中培养无CD14+/CD56+的PBMC细胞直至使用。

靶细胞标记

为了在流式细胞术测定中分析细胞溶解，使用荧光膜染料DiOC₁₈(DiO)(MolecularProbes，#V22886)标记作为靶细胞的人FLT3-或猕猴FLT3-转染的CHO细胞，并将其与效应细胞区分开来。简言之，收获细胞，用PBS洗涤一次，并在含有2％(v/v)FBS和膜染料DiO(5μL/10⁶个细胞)的PBS中调整至10⁶个细胞/mL。在37℃孵育3分钟后，将细胞在完全RPMI培养基中洗涤两次，并将细胞数量调整至1.25x 10⁵个细胞/mL。使用0.5％(v/v)等渗EosinG溶液(Roth，#45380)测定细胞的活力。

基于流式细胞术的分析

该测定被设计来在FLT3双特异性抗体构建体的连续稀释物存在的情况下定量cyno FLT3或人FLT3转染的CHO细胞的溶解。将等体积的DiO标记的靶细胞和效应细胞(即，无CD14⁺的PBMC细胞)混合，使E∶T细胞比率为10∶1。将160μl的该悬浮液转移到96孔板的每个孔中。添加40μL FLT3xCD3双特异性抗体构建体的连续稀释物和双特异性阴性对照(识别不相关靶抗原的基于CD3的双特异性抗体构建体)，或作为附加阴性对照的RPMI完全培养基。将双特异性抗体介导的细胞毒性反应在7％CO₂湿润培养箱中进行48小时。然后将细胞转移至新的96孔板中，通过添加终浓度为1μg/mL的碘化丙啶(PI)来监测靶细胞膜完整性的丧失。PI是一种膜不可渗透的染料，其通常被活细胞排除在外，而死细胞将其吸收并通过荧光发射变成可鉴定的。

在FACSCanto II仪上通过流式细胞术测量样品，并用FACSDiva软件(两者均来自Becton Dickinson)进行分析。靶细胞被鉴定为DiO阳性细胞。PI阴性靶细胞被归类为活的靶细胞。根据以下方程式计算细胞毒性的百分比：

n＝事件的数目

使用GraphPad Prism 5软件(Graph Pad Software，San Diego)，将细胞毒性的百分比相对于相应的双特异性抗体构建体浓度作图。采用用于评估具有固定斜率的S型剂量反应曲线的四参数逻辑回归模型分析剂量反应曲线，并计算EC50值。

实施例10.5

将未经刺激的人PBMC针对人FLT3转染的CHO细胞重新定向的效力

使用用人FLT3转染的CHO细胞作为靶细胞，未经刺激的人PBMC作为效应细胞，在基于FACS的细胞毒性测定中分析FLT3xCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如上述实施例8.4所述进行测定。

实施例10.6

将未经刺激的人PBMC针对FLT3阳性人卵巢癌细胞系重新定向的效力

使用FLT3阳性人AML细胞系EOL-1、MOLM-13和MV4-11作为靶细胞来源，未经刺激的人PBMC作为效应细胞，在基于FACS的细胞毒性测定中进一步分析FLT3xCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如上述实施例8.4中所述进行测定。

实施例10.7

将猕猴T细胞针对表达猕猴FLT3的CHO细胞重新定向的效力

最后，使用用猕猴(cyno)FLT3转染的CHO细胞作为靶细胞，并将猕猴T细胞系4119LnPx(Knappe等，Blood 95：3256-61(2000))作为效应细胞来源，在基于FACS的细胞毒性测定中分析FLT3xCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如上所述进行猕猴FLT3转染的CHO细胞的靶细胞标记和细胞毒性活性的基于流式细胞术的分析。

实施例11

在(i)三次冻/融循环和(ii)以250μg/ml孵育7天后单体至二聚体的转化

将双特异性FLT3xCD3抗体单体构建体经受不同的胁迫条件，随后进行高效SEC以确定已被转化成二聚体抗体构建体的初始单体抗体构建体的百分比。

(i)用通用制剂缓冲液将25μg单体抗体构建体调整至250μg/ml的浓度，然后在-80℃下冷冻30分钟，随后在室温下解冻30分钟。在三次冻/融循环之后，通过HP-SEC测定二聚体含量。

(ii)用通用制剂缓冲液将25μg单体抗体构建体调整至250μg/ml的浓度，随后在37℃孵育7天。二聚体含量由HP-SEC测定。

将高分辨率SEC Column TSK Gel G3000 SWXL(Tosoh，Tokyo-Japan)连接至配备有A905自动取样器的 Purifier 10 FPLC(GE Lifesciences)。柱平衡和运行缓冲液由调节至pH 6.6的100mM KH2PO4-200mM Na2SO4组成。将抗体溶液(25μg蛋白质)施加至经平衡的柱上，并在最大压力7MPa下以0.75ml/分钟的流速进行洗脱。在280、254和210nm光吸收下监测整个运行。通过记录在Unicorn软件运行评估表中的210nm信号的峰值积分进行分析。通过二聚体峰面积除以单体加上二聚体峰的总面积计算二聚体的含量。

实施例12

热稳定性

如下测定抗体聚集温度：将40μl的250μg/ml的抗体构建体溶液转移至一次性使用比色杯中，并置于Wyatt动态光散射装置DynaPro Nanostar(Wyatt)中。将样品以0.5℃/分钟的加热速率从40℃加热至70℃，同时不断地采集测量的半径。通过与DLS装置一起交付的软件包使用指示蛋白质熔解和聚集的半径增加来计算抗体构建体的聚集温度。

实施例13

在人血浆中孵育24小时后的稳定性

将纯化的双特异性抗体构建体以1∶5的比率在人血浆库中在37℃下孵育96小时，终浓度为2-20μg/ml。在血浆孵育后，在利用初始浓度为0.01-0.1μg/ml的经刺激的富集的人CD8+ T细胞和人FLT3转染的CHO细胞并且效应细胞与靶细胞(E∶T)比率为10∶1的51-铬释放测定(如实施例8.1中所述的测定)中比较抗体构建体。包括未孵育的新鲜解冻的双特异性抗体构建体作为对照。

实施例14

2500μg/ml抗体浓度下的浊度

将1ml浓度为250μg/ml的纯化的抗体构建溶液通过自旋浓缩单元浓缩至2500μg/ml。在5℃储存16小时后，通过针对通用制剂缓冲液的OD340nm光吸收测量法测定抗体溶液的浊度。

实施例15

通过高分辨率阳离子交换色谱分析蛋白质均质性

通过高分辨率阳离子交换色谱CIEX分析本发明的抗体构建体的蛋白质均质性。

用50ml结合缓冲液A(20mM磷酸二氢钠，30mM NaCl，0.01％辛酸钠，pH5.5)稀释50μg抗体构建体单体，将40ml该溶液施施加至连接至Micro FPLC装置(GE Healthcare，Germany)的1ml BioPro SP-F柱(YMC，Germany)。样品结合后，利用另外的结合缓冲液进行洗涤步骤。对于蛋白质洗脱，施加超过10个柱体积的使用缓冲液B(20mM磷酸二氢钠，1000mMNaCl，0.01％辛酸钠，pH 5.5)直至50％缓冲液B的线性增加的盐梯度。在280、254和210nm光吸收下监测整个运行。通过记录在Unicorn软件运行评估表中的280nm信号的峰值积分进行分析。

实施例16

通过HIC丁基测量的表面疏水性

在疏水相互作用色谱HIC中以流通模式测试本发明的双特异性抗体构建体的表面疏水性。

用通用制剂缓冲液稀释50μg抗体构建体单体至终体积500μl(10mM柠檬酸，75mM赖氨酸HCl，4％海藻糖，pH7.0)，并施加至连接至Purifier FPLC系统(GE Healthcare，Germany)的1ml丁基琼脂糖FF柱(GE Healthcare，Germany)。在280、254和210nm光吸收下监测整个运行。通过记录在人Unicom软件运行评估表中的280nm信号的峰值积分进行分析。通过比较蛋白质信号的上升和下降的面积和速度来评估洗脱行为，从而指示BiTE白蛋白融合物与基质的相互作用的强度。

实施例17

双特异性抗体构建体的单体与二聚体同种型之间的效力差距

为了测定各FLT3xCD3双特异性抗体构建体的单体与二聚体同种型之间的细胞毒性活性的差异(称为效力差距)，如上所述(实施例10.1)利用纯化的双特异性抗体构建体单体和二聚体进行18小时的51-铬释放细胞毒性测定。效应细胞是经刺激的富集的人CD8+ T细胞。靶细胞是hu FLT3转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞(E∶T)的比率为10∶1。效力差距计算为EC50值之间的比率。

实施例18

FLT3结合剂与其靶标的结合的FLT3配体竞争

进行该测定以测试可溶性FLT3配体是否会削弱根据本发明的抗FLT3结合结构域与FLT3的结合。

为了验证人FLT3配体与用人FLT3转染的CHO细胞的结合，将细胞与人FLT3配体在4℃孵育30分钟。用抗HIS抗体(5μg/ml；AbD Serotec)，然后用抗小鼠IgG Fc-γ-PE(1∶100；Jackson Immunoresearch # 115-116-071)检测结合的FLT3配体。作为阴性对照，将细胞与PBS/2％FCS而非CD27一起孵育。

为了测试FLT3配体对FLT3结合剂的竞争/置换，将用人FLT3转染的CHO细胞在4℃(10μg/FLT3配体)下与或不与FLT3配体一起孵育30分钟。之后不洗涤细胞，而是直接用FLT3结合剂(scFv′s)染色。用小鼠单克隆抗FLAG M2抗体(1μg/ml；Sigma F1804)，随后是抗小鼠IgG Fc-γ-PE(1∶100；Jackson Immunoresearch#115-116-071)检测结合的scFv。作为阴性对照，将细胞与非特异性scFv而非FLT3scFv一起孵育。FLT3配体和所有抗体用含有2％FCS的PBS稀释。

为了评估数据，通过FACS检测荧光中值。由于与FLT3配体竞争而导致的超过25％的信号损失被理解为对结合的显著影响。这可以被理解为对于FLT3的相同结构域的显著的空间相互作用。所有高于75％阈值的结合剂

(中值[+配体]/中值[无配体]*100≥75％)

(对于FL-1到FL-65来说是这样的)被鉴定为对于FLT3配体竞争是不敏感的。

文献中描述了FLT3配体与其受体的相互作用发生在对应于表位簇3的区域中。因此，预期在我们的筛选中鉴定的对表位簇3有特异性的所有结合剂以及对相邻的簇2和4有特异性的结合剂，由于与FLT3配体的竞争而在荧光信号中值上受到显著影响。该预期一般是正确的。令人惊讶的是，FL-53、FL-54、FL-61、F-62、FL-63和FL-64(全部与表位簇3结合)仍然显示高于阈值的信号。

此外，鉴于FLT3配体与表位簇3的区域的相互作用，进一步假定针对更远距离的表位簇(诸如FLT3的簇1)的结合剂将不受FLT3配体竞争影响。然而，有相当数量没有资格达到75％的阈值的结合剂。结合剂FL-1至FL-53、FL-55至FL-60和FL-65处于对FLT3配体竞争不敏感的结合剂的组中。

Claims

1.一种双特异性抗体构建体，所述双特异性抗体构建体包含与靶细胞表面上的人和猕猴FLT3结合的第一结合结构域和与T细胞表面上的人CD3结合的第二结合结构域，其中所述第一结合结构域与FLT3的表位结合，所述表位包含在如SEQ ID NO：801-804中所示的FLT3的细胞外区域内。

2.根据权利要求1所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域与包含在人FLT3的区域内的FLT3的表位结合，所述区域具有如SEQ ID NO：814(簇1)或SEQ ID NO：816(簇3)中所示的序列。

3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体呈选自由(scFv)₂、scFv-单结构域mAb、双抗体组成的组的形式和这些形式的寡聚体。

4.根据权利要求2或3所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，所述CDR选自由以下各项组成的组：

SEQ ID NO：151-156、SEQ ID NO：161-166、SEQ ID NO：171-176、SEQ ID NO：181-186、SEQ ID NO：191-196、SEQ ID NO：201-206、SEQ ID NO：211-216、SEQ ID NO：221-226、SEQID NO：231-236、SEQ ID NO：241-246、SEQ ID NO：251-256、SEQ ID NO：261-266、SEQ IDNO：271-276、SEQ ID NO：281-286、SEQ ID NO：291-296、SEQ ID NO：301-306、SEQ ID NO：311-316、SEQ ID NO：321-326、SEQ ID NO：331-336、SEQ ID NO：341-346、SEQ ID NO：351-356、SEQ ID NO：361-366、SEQ ID NO：371-376、SEQ ID NO：381-386、SEQ ID NO：391-396、SEQ ID NO：401-406、SEQ ID NO：411-416、SEQ ID NO：421-426、SEQ ID NO：431-436、SEQID NO：441-446、SEQ ID NO：451-456、SEQ ID NO：461-466、SEQ ID NO：471-476、SEQ IDNO：481-486、SEQ ID NO：491-496、SEQ ID NO：501-506、SEQ ID NO：511-516、SEQ ID NO：521-526、SEQ ID NO：531-536、SEQ ID NO：541-546、SEQ ID NO：551-556、SEQ ID NO：561-566、SEQ ID NO：571-576、SEQ ID NO：581-586、SEQ ID NO：591-596、SEQ ID NO：601-606、SEQ ID NO：611-616、SEQ ID NO：621-626、SEQ ID NO：631-636、SEQ ID NO：641-646、SEQID NO：651-656、SEQ ID NO：661-666、SEQ ID NO：671-676、SEQ ID NO：681-686、SEQ IDNO：691-696、SEQ ID NO：701-706、SEQ ID NO：711-716、SEQ ID NO：721-726、SEQ ID NO：731-736、SEQ ID NO：741-746、SEQ ID NO：751-756、SEQ ID NO：761-766、SEQ ID NO：771-776、SEQ ID NO：781-786、SEQ ID NO：791-796。

5.根据权利要求4所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含选自由以下各项中所示的VH区组成的组的VH区：SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ IDNO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ IDNO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ IDNO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ IDNO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ IDNO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ IDNO：737、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：757、SEQ ID NO：767、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：787和SEQ ID NO：797。

6.根据权利要求4或5中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含选自由以下各项中所示的VL区组成的组的VL区：SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：778、SEQID NO：788和SEQ ID NO：798。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含选自由以下各项中所示的成对的VH区和VL区组成的组的VH区和VL区：SEQ ID NO：157+158、SEQID NO：167+168、SEQ ID NO：177+178、SEQ ID NO：187+188、SEQ ID NO：197+198、SEQ IDNO：207+208、SEQ ID NO：217+218、SEQ ID NO：227+228、SEQ ID NO：237+238、SEQ ID NO：247+248、SEQ ID NO：257+258、SEQ ID NO：267+268、SEQ ID NO：277+278、SEQ ID NO：287+288、SEQ ID NO：297+298、SEQ ID NO：307+308、SEQ ID NO：317+318、SEQ ID NO：327+328、SEQ ID NO：337+338、SEQ ID NO：347+348、SEQ ID NO：357+358、SEQ ID NO：367+368、SEQID NO：377+378、SEQ ID NO：387+388、SEQ ID NO：397+398、SEQ ID NO：407+408、SEQ IDNO：417+418、SEQ ID NO：427+428、SEQ ID NO：437+438、SEQ ID NO：447+448、SEQ ID NO：457+458、SEQ ID NO：467+468、SEQ ID NO：477+478、SEQ ID NO：487+488、SEQ ID NO：497+498、SEQ ID NO：507+508、SEQ ID NO：517+518、SEQ ID NO：527+528、SEQ ID NO：537+538、SEQ ID NO：547+548、SEQ ID NO：557+558、SEQ ID NO：567+568、SEQ ID NO：577+578、SEQID NO：587+588、SEQ ID NO：597+598、SEQ ID NO：607+608、SEQ ID NO：617+618、SEQ IDNO：627+628、SEQ ID NO：637+638、SEQ ID NO：647+648、SEQ ID NO：657+658、SEQ ID NO：667+668、SEQ ID NO：677+678、SEQ ID NO：687+688、SEQ ID NO：697+698、SEQ ID NO：707+708、SEQ ID NO：717+718、SEQ ID NO：727+728、SEQ ID NO：737+738、SEQ ID NO：747+748、SEQ ID NO：757+758、SEQ ID NO：767+768、SEQ ID NO：777+778、SEQ ID NO：787+788和SEQID NO：797+798。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含选自由以下各项中所示的多肽组成的组的多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249和SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279和SEQID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319和SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349和SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379和SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419和SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ IDNO：449和SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479和SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519和SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549和SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579和SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ IDNO：609、SEQ ID NO：619和SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649和SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679和SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719和SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749和SEQ ID NO：759、SEQID NO：769、SEQ ID NO：779和SEQ ID NO：789和SEQ ID NO：799。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体构建体，其中所述第二结合结构域与人CD3ε结合，并且与普通狨猴、绒顶柽柳猴或松鼠猴CD3ε结合。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含：

(a)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249和SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ IDNO：279和SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319和SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349和SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379和SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419和SEQ ID NO：429、SEQ IDNO：439、SEQ ID NO：449和SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479和SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519和SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549和SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579和SEQ ID NO：589、SEQID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619和SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649和SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679和SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719和SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749和SEQID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779和SEQ ID NO：789以及SEQ ID NO：799；

●具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；和

●具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103；和

●任选地His-标签，诸如SEQ ID NO 10中所示的所述标签；

(b)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；

●具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103

●任选地具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；

●具有选自由SEQ ID NO：104-134组成的组的氨基酸序列的多肽；和

●任选地His-标签，诸如SEQ ID NO 10中所示的所述标签；

(c)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有氨基酸序列QRFVTGHFGGLX₁PANG(SEQ ID NO：135)的多肽，其中X₁为Y或H；和

●具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249和SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ IDNO：279和SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319和SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349和SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379和SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419和SEQ ID NO：429、SEQ IDNO：439、SEQ ID NO：449和SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479和SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519和SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549和SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579和SEQ ID NO：589、SEQID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619和SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649和SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679和SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719和SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749和SEQID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779和SEQ ID NO：789和SEQ ID NO：799；

●具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；

●具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：103；

●具有氨基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO：137)或QRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ IDNO：139)的多肽；和

●任选地His-标签，诸如SEQ ID NO 10中所示的所述标签；

(d)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：101；

●具有SEQ ID NO：8中所示的所述氨基酸序列的肽接头；

●具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQID NO：778、SEQ ID NO：788和SEQ ID NO：798以及C末端处的丝氨酸残基；

●具有SEQ ID NO：140中所示的所述氨基酸序列的多肽；和

从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：757、SEQ ID NO：767、SEQID NO：777、SEQ ID NO：787和SEQ ID NO：797；

●具有SEQ ID NO：8中所示的所述氨基酸序列的肽接头；

●具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：102以及C末端处的丝氨酸残基；

●具有SEQ ID NO：141中所示的所述氨基酸序列的多肽；

(e)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有SEQ ID NO：8中所示的所述氨基酸序列的肽接头；

●具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：758、SEQ ID NO：768、SEQID NO：778、SEQ ID NO：788和SEQ ID NO：798；

●具有SEQ ID NO：142中所示的所述氨基酸序列的多肽；和

从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有SEQ ID NO：8中所示的所述氨基酸序列的肽接头；

●具有SEQ ID NO：143中所示的所述氨基酸序列的多肽；

(f)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有SEQ ID NO：144中所示的所述氨基酸序列的多肽；和

具有SEQ ID NO：145中所示的所述氨基酸序列的多肽；

(g)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249和SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ IDNO：279和SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319和SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349和SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379和SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419和SEQ ID NO：429、SEQ IDNO：439、SEQ ID NO：449和SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479和SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519和SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549和SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579和SEQ ID NO：589、SEQID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619和SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649和SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679和SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719和SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：749和SEQID NO：759、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：779和SEQ ID NO：789和SEQ ID NO：799；和

●具有SEQ ID NO：146中所示的所述氨基酸序列的多肽；和

从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有SEQ ID NO：147中所示的所述氨基酸序列的多肽；

(h)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有SEQ ID NO：148中所示的所述氨基酸序列的多肽；和

从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有SEQ ID NO：149中所示的所述氨基酸序列的多肽；或

(i)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有SEQ ID NO：150中所示的所述氨基酸序列的多肽。

(j)从N末端开始按以下顺序包含以下各项的多肽：

●具有选自由SEQ ID NO：1-9组成的组的氨基酸序列的肽接头；和；和

●具有选自由SEQ ID NO：843-850组成的组的氨基酸序列的第三结构域。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体构建体，所述抗体构建体包含如SEQ IDNO：856至871中所示的多肽或由所述多肽组成。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域与人FLT3的结合被FLT3-配体减少≤25％，优选≤20％，更优选≤15％，进一步优选≤10％，甚至更优选≤8％，更优选≤6％，且最优选≤2％。

13.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如前述权利要求中任一项中定义的抗体构建体。

14.一种载体，所述载体包含如权利要求13中定义的多核苷酸。

15.一种宿主细胞，所述宿主细胞用如权利要求13中定义的多核苷酸或用如权利要求14中定义的载体转化或转染。

16.一种用于产生根据权利要求1至12的任一项的抗体构建体的方法，所述方法包括在允许如在权利要求1至12的任一项中定义的抗体构建体表达的条件下培养如权利要求15中定义的宿主细胞，以及从所述培养物中回收所产生的抗体构建体。

17.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至12的任一项所述的抗体构建体或根据权利要求16所述的方法产生的抗体构建体。

18.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体构建体或根据权利要求16所述的方法产生的抗体构建体，所述抗体构建体用于预防、治疗或改善血液癌症疾病或转移性癌症疾病。

19.一种用于治疗或改善血液癌症疾病或转移性癌症疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用根据权利要求1至12的任一项的抗体构建体或根据要求16的方法产生的抗体构建体的步骤。

20.根据权利要求19所述的方法或根据权利要求18所述的抗体构建体，其中所述血液癌症疾病是来源于上述任一种的AML或转移性癌症疾病。

21.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至12的任一项所述的抗体构建体，根据权利要求16所述的方法产生的抗体构建体，如权利要求13中定义的多核苷酸，如权利要求14中定义的载体，和/或如权利要求15中定义的宿主细胞。