TW201619377A

TW201619377A - Ｃａｒ表現載體及ｃａｒ表現ｔ細胞

Info

Publication number: TW201619377A
Application number: TW104133272A
Authority: TW
Inventors: Koji Tamada; Yukimi Sakoda; Keishi Adachi
Original assignee: Noile Immune Biotech Inc
Priority date: 2014-10-09
Filing date: 2015-10-08
Publication date: 2016-06-01
Also published as: PT3597742T; CN107109421B; JP2022048153A; IL251504A0; BR112017006710B1; PL3597742T3; PH12017500596A1; CA2962375A1; JP6161098B2; LT3205720T; KR20170067773A; JP7008350B2; WO2016056228A1; CY1122324T1; PT3205720T; CA2962375C; US10316102B2; JP2017153487A; CN107109421A; DK3205720T3

Abstract

本發明之課題係在於，提供一種在T細胞中與嵌合抗原受體(CAR)一同表現T細胞之免疫功能存進因子，且免疫誘導效果和抗腫瘤活性高的CAR表現T細胞、和用於製造該CAR表現T細胞之CAR表現載體。本發明製造CAR表現載體、和導入了所述CAR表現載體的CAR表現T細胞，該CAR表現載體含有編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸和編碼T細胞之免疫功能促進因子的核酸，其中，所述編碼免疫功能促進因子的核酸為編碼介白素7的核酸和編碼CCL19的核酸、編碼相對於SHP-1的顯性失活突變體的核酸、或者編碼相對於SHP-2的顯性失活突變體的核酸。

Description

CAR表現載體及CAR表現T細胞

本發明係有關於CAR表現載體、導入了CAR表現載體的CAR表現T細胞、以及含有CAR表現T細胞的抗癌劑。

嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor：以下也稱為「CAR」)是使識別癌細胞之細胞表面抗原的單鏈抗體與誘導T細胞激活之訊號傳遞區融合而成之人造嵌合蛋白。如圖1所示，藉由在不具有腫瘤反應性之通常末梢血T細胞(末梢血T淋巴球)中導入編碼CAR的基因，能夠大量製造可表現CAR的CAR表現T細胞(以下也僅稱為「CAR-T細胞」)。該CAR-T細胞具有腫瘤反應性，能夠引導癌細胞的傷害，且不依存於與主要組織相容性基因複合體(MHC)的相互作用。

藉由投餵CAR-T細胞而進行的癌症免疫療法、更為具體而言係從患者採集T細胞，且在該T細胞中導入編碼CAR的基因而使其增幅，再次移入患者之療法(參照非專利文獻1)，目前正在全球進行臨床試驗，得出對於白血病或淋巴瘤等造血器官惡性腫瘤等呈現有效性之結果。

近年來，各種CAR-T細胞之研究不斷發展。例如，提出了：包含被修飾的自身人T細胞的醫藥組合物，該自身人T細胞包含編碼由CD19抗原結合區、細胞膜貫通區、4-1BB共刺激訊號區以及CD3ζ訊號區構成之CAR的核酸(參照專利文獻1)；以及與癌細胞結合之一個或多個帶標籤蛋白之複合物同時或者分開投餵給受驗體，且與上述帶標籤蛋白結合，誘導癌細胞死亡之一個或多個對於治療有效的抗標籤嵌合抗原受體(AT-CAR)表現T細胞群體(參照專利文獻2)；包含編碼嵌合抗原受體之核酸的細胞，該嵌合抗原受體包含人抗體139之抗原結合區、胞外鉸鏈區、細胞膜貫通區以及胞內T細胞訊號傳遞區(參照專利文獻3)；包含編碼嵌合抗原受體之核酸序列的細胞，該嵌合抗原受體包含抗原結合區、細胞膜貫通區、共刺激訊號傳遞區、以及包含SEQ ID NO：24之氨基酸序列的CD3ζ訊號傳遞區(參照專利文獻4)；藉由基因工程製造的CD19特異性T細胞，該細胞之細胞表面膜上表現和保有CD19特異性嵌合受體，該嵌合受體由免疫細胞之效應功能用的胞內訊號傳遞區、至少一個細胞膜貫通區以及至少一個胞外區構成，胞外區包含CD19特異性受體(參照專利文獻5)；以及導入了編碼嵌合抗原受體之核酸的嵌合抗原受體表現細胞，該嵌合抗原受體作為胞內區而包含糖皮質激素誘導腫瘤壞死因子受體(GITR)的胞內區(參照專利文獻6)。

但是，CAR-T細胞在生物體內的生存效率低、或者藉由CAR-T細胞誘導的內源性T細胞之激活或朝向腫瘤局部之集聚不充分這一問題、以及經由癌細胞所具有的腫瘤免疫逃逸機構、即PD-L1/PD-1路徑傳遞之免疫抑制訊號、和癌微環境中分泌之TGF-β或IL-10等免疫抑制因子對於CAR-T細胞之活性的阻礙這一問題，透過當前之技術尚不能解決。因此，存在未發現充分治療效果的癌種和病症，要求製造更加有效的CAR-T細胞和用於製造該CAR-T細胞的表現載體。

[先行技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]美國專利申請公開第2014/0106449號說明書

[專利文獻2]日本專利特表2014-504294號公報

[專利文獻3]日本專利特表2014-516510號公報

[專利文獻4]日本專利特表2014-507118號公報

[專利文獻5]日本專利特開2011-004749號公報

[專利文獻6]國際公開第2013/051718號小冊子

[非專利文獻]

[非專利文獻1]中澤洋三信州醫志61(4)：197~203(2013)

在現有CAR-T細胞中，設法藉由使CAR之訊號傳遞區含有CD28、4-1BB、CD3ζ等，從而提高T細胞之激活能力，但是，基於CAR-T細胞的內源性T細胞之免疫誘導效果和腫瘤微環境中相對於免疫抑制機構之抗性並未充分增強，相對於固體癌，尚未實現CAR-T細胞所帶來之治療效果。因此，本發明之課題係在於提供在T細胞中與CAR一同表現T細胞之免疫功能促進因子，且免疫誘導效果和抗腫瘤活性高的CAR-T細胞、和用於製造該CAR-T細胞的CAR表現載體。

本發明人等以在利用CAR-T細胞的癌症免疫療法中實現更出色的免疫誘導效果和抗腫瘤活性作為目的，嘗試改良了CAR-T細胞。在該過程中，注重於作為促進T細胞之免疫功能的因子的細胞因子、趨化因子、訊號控制蛋白，構建了與CAR一同表現促進上述T細胞之免疫功能的因子的載體。發現將該表現載體導入T細胞之後，能夠製造具有比現有CAR-T細胞更為出色的免疫誘導效果和抗腫瘤活性的CAR-T細胞，從而完成了本發明。

即，本發明之公開內容如下。

(1)一種CAR表現載體，其含有編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸和編碼T細胞之免疫功能促進因子的核酸，其特徵在於，所述編碼免疫功能促進因子的核酸為編碼介白素7的核酸和編碼CCL19的核酸、編碼相對於SHP-1的顯性失活突變體的核酸、或者編碼相對於SHP-2的顯性失活突變體的核酸。

(2)如上述(1)所述之CAR表現載體，其中，編碼免疫功能促進因子的核酸為編碼介白素7的核酸和編碼CCL19的核酸。

(3)如上述(2)所述之CAR表現載體，其中，編碼CAR的核酸與編碼T細胞之免疫功能促進因子的核酸經由編碼自剪切型肽的序列而連接。

(4)如上述(2)或(3)所述之CAR表現載體，其中，編碼介白素7的核酸與編碼CCL19的核酸經由編碼自剪切型肽的序列而連接。

(5)如上述(1)至(4)中任一項所述之CAR表現載體，其中，編碼CAR的核酸含有編碼識別FITC或CD20的單鏈抗體之多肽的核酸。

(6)如上述(1)至(5)中任一項所述之CAR表現載體，其中，編碼CAR的核酸含有編碼CD8的細胞膜貫通區之多肽的核酸。

(7)如上述(1)至(6)中任一項所述之CAR表現載體，其中，編碼CAR的核酸含有編碼CD28的胞內區、4-1BB的胞內區以及CD3ζ的胞內區之多肽的核酸。

(8)一種CAR表現T細胞，其導入了以下的(a)或(b)所示之載體。

(a)上述(1)至(7)中任一項所述之CAR表現載體；(b)含有編碼CAR的核酸和編碼介白素7的核酸的CAR表現載體、和含有編碼CAR的核酸和編碼CCL19的核酸的CAR表現載體。

(9)一種抗癌劑，其含有上述(8)所述之CAR表現T細胞和藥學上允許的添加劑。

使用本發明之CAR表現載體，能夠製造同時具備生存能力、淋巴球集聚能力以及腫瘤細胞毒活性的CAR-T細胞、和對於癌微環境下的免疫抑制具有抗性的CAR-T細胞。若使用該CAR-T細胞對癌症患者進行免疫療法，則可期待強力的癌症治療效果，能夠進行對於難治性、進行性癌症也有效的癌症免疫療法。

圖1係示出CAR之結構和利用CAR-T細胞的癌症免疫療法之基本系統之圖。

圖2係表示表現CAR、介白素7(IL-7)以及CCL19的載體之圖。

圖3係示出利用流動式細胞測量術確認抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中的CAR之表現量的結果-1之圖。左側為CAR無染色，右側為CAR染色。

圖4係示出利用流動式細胞測量術確認抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中的CAR之表現量的結果-2之圖。

圖5係利用流動式細胞測量術確認抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中的CAR之表現量的結果之圖。

圖6係示出利用ELISA測量抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞的細胞上清液中的IL-7和CCL19之濃度的結果-1之圖。

圖7係示出利用ELISA測量抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞的細胞上清液中的IL-7和CCL19之濃度的結果-2之圖。

圖8係示出利用ELISA測量抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞的細胞上清液中的IL-7和CCL19之濃度的結果之圖。

圖9係示出對抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞進行刺激，且培養3天、5天、7天後的細胞數之圖。

圖10係示出對抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞進行刺激，且培養3天、5天、7天後的生存率之圖。

圖11係示出對抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞進行刺激，且培養5天後的細胞數之圖。

圖12係示出利用抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞進行T細胞遷移試驗的結果-1之圖。

圖13係示出利用抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞進行T細胞遷移試驗的結果-2之圖。

圖14係示出利用抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞進行樹狀細胞遷移試驗的結果之圖。

圖15係示出利用抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞進行T細胞遷移試驗的結果之圖。

圖16係示出抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中的T細胞之增殖能力的調查結果(刺激後第5天)之圖。

圖17係示出抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中的T細胞之增殖能力的調查結果(刺激後第3天、第7天)之圖。

圖18係示出抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中的CD127之表現的調查結果之圖。

圖19係示出抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中的CCR7之表現的調查結果之圖。

圖20係示出將抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞投餵給荷瘤小鼠時的腫瘤體積之變化的調查結果之圖。

圖21係示出將抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞投餵給荷瘤小鼠時的小鼠生存率的調查結果之圖。

圖22係示出對皮下接種了P815-hCD20，然後投餵了環磷醯胺的小鼠投餵抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞時小鼠的生存率的調查結果之圖。

圖23係示出對皮下接種了P815-hCD20，然後投餵了環磷醯胺的小鼠投餵抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞時小鼠的腫瘤體積的調查結果之圖。

圖24係將圖23中的CPA+7×19的圖表的縱軸數值設為1/10之圖。

圖25係示出將對皮下接種了P815-hCD20的小鼠投餵抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞時的腫瘤組織H&E染色且觀察到的結果之圖。

圖26(a)(b)係示出對皮下接種了P815-hCD20的小鼠投餵抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞時的腫瘤組織的免疫組織化學分析結果之圖。

圖27(a)(b)係示出藉由圖26中的螢光染色標記的陽性區域的定量結果之圖。

圖28係示出對皮下接種了P815-hCD20的小鼠投餵了抗人CD20 CAR-IL-7表現T細胞、抗人CD20 CAR-CCL19表現T細胞、或者抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞時的腫瘤體積的調查結果之圖。

圖29(a)係表示表現CAR和SHP1(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1)的顯性失活突變體(dominant negative mutant)的載體之圖。(b)係表示表現CAR和SHP2(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-2)的顯性失活突變體的載體之圖。

圖30(a)係示出利用抗人CD20 CAR-SHP1DN表現T細胞進行的細胞毒活性試驗的結果之圖。(b)係示出利用抗人CD20 CAR-SHP2DN表現T細胞進行的細胞毒活性試驗的結果之圖。

圖31係示出將P815-hCD20在抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞和FITC結合利妥昔單抗存在下進行混合且調查腫瘤細胞毒活性的結果之圖。

圖32係示出將P815-hCD20與抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞混合且調查腫瘤細胞毒活性的結果之圖。

圖33係示出對皮下接種了P815-hCD20的小鼠投餵抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞，且利用流動式細胞測量術針對白血球表面的表現型對CD4、CD8、CD44、CD62L進行分析的結果之圖。

圖34係示出將脾臟的白血球與利用絲裂黴素C處理後之P815-hCD20一同培養4天且進行刺激，且利用流動式細胞測量術調查T 細胞的增殖的結果之圖。

本發明之CAR表現載體是含有編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸和編碼T細胞之免疫功能促進因子的核酸的CAR表現載體，只要是上述編碼免疫功能促進因子的核酸為編碼介白素7的核酸和編碼CCL19的核酸、編碼相對於SHP-1的顯性失活突變體的核酸、或者編碼相對於SHP-2的顯性失活突變體的核酸的CAR表現載體，便無特別限制，所謂嵌合抗原受體係經由細胞膜貫通區而使識別癌細胞之細胞表面抗原的單鏈抗體與誘導T細胞之激活的訊號傳遞區融合而成之人造嵌合蛋白。

在本發明中，作為編碼CAR的核酸，只要是編碼構成CAR之多肽的核酸，便無特別限制，包括編碼識別癌細胞之細胞表面抗原的單鏈抗體、細胞膜貫通區、以及誘導T細胞之激活的訊號傳遞區的多肽的核酸。

作為CAR中的單鏈抗體，可以舉出由源自單株抗體之抗原結合部位的輕鏈可變區和重鏈可變區(scFv)構成，且連接肽位於輕鏈可變區與重鏈可變區之間的寡肽或者多肽。

作為上述單鏈抗體所識別之癌細胞的細胞表面抗原，只要是癌細胞及其前驅細胞中特異性表現的生物分子、透過細胞的癌化而新發現表現之生物分子、或者在癌細胞中與正常細胞相比表現量增加的生物分子即可，可以舉出CD20、EGFR、FITC、CD19、CD22、CD33、PSMA、GD2、EGFRvariant、ROR1、c-Met、HER2、CEA、Mesothelin、GM2、CD7、CD10、CD30、CD34、CD38、CD41、CD44、CD74、CD123 CD133、CD171、MUC16、MUC1、CS1(CD319)、IL-13Ra2、BCMA、LewisY、IgGkappa chain、Folate receptor-alpha、PSCA、EpCAM。

T細胞激活訊號傳遞區係在上述單鏈抗體識別出癌細胞之細胞表面抗原時能夠在細胞內傳遞訊號之區域，較佳包含從CD28、4-1BB(CD137)、GITR、CD27、OX40、HVEM、CD3ζ、Fc Receptor-associated γchain的胞內區的多肽中選擇的至少一種或兩種以上，更為較佳包含CD28、4-1BB以及CD3ζ這三種胞內區的多肽。

各個胞內區的多肽可以經由包含2至10個氨基酸的寡肽連接子或者多肽連接子而連接，作為該連接子序列，可以舉出甘氨酸-絲氨酸連接序列。

作為本發明中的細胞膜貫通區，可以舉出源自CD8、T細胞受體的α、β鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR的細胞膜貫通區的多肽，可以較佳地舉出人CD8細胞膜貫通區的多肽。藉由該細胞膜貫通區，而使CAR被固定在T細胞之細胞膜上。

上述細胞膜貫通區中也可以包含由任意的寡肽或多肽構成，且長度為1至100個氨基酸、較佳為10至70個氨基酸的鉸鏈區。作為鉸鏈區，可以舉出人CD8的鉸鏈區。

另外，也可以在識別癌細胞之細胞表面抗原的單鏈抗體與細胞膜貫通區之間、細胞膜貫通區與T細胞激活訊號傳遞區之間設置由任意的寡肽或多肽構成的間隔區。作為間隔區之長度，可以舉出1至100個氨基酸、較佳為10至50個氨基酸，作為該間隔區，可以舉出甘氨酸-絲氨酸連接序列。

在本發明中，作為編碼T細胞之功能促進因子的核酸，只要是編碼IL-7的核酸和編碼CCL19的核酸(以下也稱為「本件核酸1」)、編碼相對於SHP-1的顯性失活突變體的核酸(以下也稱為「本件核酸2」)、或者編碼相對於SHP-2的顯性失活突變體的核酸(以下也稱為「本件核酸3」)，便無特別限制，也可以包含多個上述本件核酸1至3的各個核酸，具體而言，也可以是包含本件核酸1和本件核酸2的核酸、包含本件核酸1和本件核酸3的核酸、包含本件核酸2和本件核酸3的核酸、包含本件核酸1、本件核酸2以及本件核酸3的核酸。

此外，作為本件核酸1中的編碼IL-7的核酸和編碼CCL19的核酸，只要包含編碼IL-7的核酸和編碼CCL19的核酸即可，編碼CCL19的核酸相對於編碼IL-7的核酸而配置在上游或配置在下游均可。

作為編碼相對於SHP1的顯性失活突變體的核酸，只要是編碼相對於SHP1優先發揮作用且能夠阻礙SHP1之作用的SHP1之突變體的核酸，便無特別限制，可以舉出編碼由將SHP1之氨基酸序列中的至少一個氨基酸置換為其他氨基酸的氨基酸序列構成，且能夠阻礙SHP1之作用的突變體的核酸。另外，作為編碼相對於SHP2的顯性失活突變體的核酸，只要是編碼相對於SHP2優先發揮作用且能夠阻礙SHP2之作用的SHP2之突變體的核酸，便無特別限制，可以舉出編碼由將SHP2之氨基酸序列中的至少一個氨基酸置換為其他氨基酸的氨基酸序列構成，且能夠阻礙SHP2之作用的突變體的核酸。

在本發明之CAR表現載體中，在編碼嵌合抗原受體的核酸與編碼T細胞之免疫功能促進因子的核酸之間、包含多個本件核酸1、本件核酸2、本件核酸3時的各核酸之間、以及本件核酸1中的編碼IL-7的核酸與編碼CCL19的核酸之間，只要能夠表現各個核酸，也可以包含任意的核酸，但是，較佳經由編碼自剪切型肽(2A肽)、或者IRES(internal ribozyme entry site)的序列、較佳為編碼2A肽的序列進行連接。藉由使用該序列進行連接，能夠有效地表現各個核酸。

所謂的2A肽係源自病毒的自剪切型肽，具有序列編號1所示之氨基酸序列中的G-P間(距離C末端1個殘基的位置)被內質網切斷的特徵(Szymczak et al.,Expert Opin.Biol.Ther.5(5)：627-638(2005))。因此，經由2A肽而組合在其前後的核酸，在細胞內相互獨立地進行表現。

作為上述2A肽，較佳為源自小核糖核酸病毒、輪狀病毒、昆蟲病毒、口蹄疫病毒或者錐蟲病毒的2A肽，更佳為源自序列編號2所示之小核糖核酸病毒的2A肽(F2A)。

編碼嵌合抗原受體的核酸，可以根據編碼相對於癌細胞之細胞表面抗原的單鏈抗體、細胞膜貫通區、以及T細胞激活訊號傳遞區的多肽的鹼基序列，且藉由化學合成方法、或者利用PCR增幅的方法等公知技術進行製造。此外，為編碼氨基酸而選擇之密碼子也可以進行改變，以將目標寄主細胞中的核酸之表現最佳化。

編碼相對於癌細胞之細胞表面抗原的單鏈抗體、細胞膜貫通區、以及T細胞激活訊號傳遞區的多肽的鹼基序列之資料，可以檢索公知文獻或NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等資料庫而適當地獲得。

例如，編碼T細胞激活訊號傳遞區中的CD28、4-1BB、以及CD3ζ之細胞膜貫通區的多肽的鹼基序列之資料，可以檢索NCBI等資料庫而適當地獲得，關於人CD28，可以例示出以Genbank編號：NM_006139.2(更新日期：2014年5月10日)登記之資料，關於人4-1BB，可以例示出以Genbank編號：NM_001561.5(更新日期：2014年3月16日)登記之資料，關於人CD3ζ，可以例示出以Genbank編號：NM_000734.3(更新日期：2014年8月12日)登記之資料。

另外，編碼人CD8之細胞膜貫通區的多肽的鹼基序列之資料，可以檢索NCBI等資料庫而適當地獲得，可以例示出以Genbank編號：NM_001768.6(更新日期：2014年5月10日)登記之資料。

進而，關於編碼單鏈抗體的多肽的鹼基序列之資料，也可以製造識別作為標的之細胞表面抗原的單株抗體，利用埃德曼法等公知方法確定該單株抗體之氨基酸序列，且根據該氨基酸序列而獲得。作為單株抗體之製造方法，可以舉出使用融合瘤進行製造的方法、藉由基因工程技術且利用含有抗體基因的表現載體對寄主進行轉形而製造的方法、透過利用所希望之抗原對轉殖動物進行免疫而製造的方法。

作為編碼T細胞之免疫功能促進因子的核酸的、編碼IL-7的核酸和編碼CCL19的核酸、編碼相對於SHP-1的顯性失活突變體的核酸、或者編碼相對於SHP-2的顯性失活突變體的核酸，可以根據各自的鹼基序列，利用化學合成方法、或者利用PCR增幅的方法等公知技術進行製造。此外，為編碼氨基酸而選擇之密碼子也可以進行改變，以將目標寄主細胞中的核酸之表現最佳化。

編碼IL-7的核酸和編碼CCL19的核酸、編碼相對於SHP-1的顯性失活突變體的核酸、或者編碼相對於SHP-2的顯性失活突變體的核酸之資料，可以檢索公知文獻或NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等資料庫而適當地獲得。

作為編碼IL-7的核酸，可以根據導入本發明之CAR表現載體的細胞種類適當地進行選擇，例如，可以舉出編碼人IL-7的氨基酸序列(序列編號3)的核酸，只要具有IL-7中的細胞增殖率的促進作用，也可以使用與序列編號3所示之鹼基序列具有80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、進而較佳為95%以上、最佳為98%以上的相同性的鹼基序列。

作為編碼CCL19的核酸，可以根據導入本發明之CAR表現載體的細胞種類適當地進行選擇，例如，可以舉出編碼人CCL19的氨基酸序列(序列編號4)的核酸，只要具有CCL19中的T細胞遷移作用，也可以使用與序列編號4所示之鹼基序列具有80%以上、較佳為85%以上、更較佳為90%以上、進而較佳為95%以上、最佳為98%以上的相同性的鹼基序列。

作為編碼相對於SHP-1的顯性失活突變體的核酸，可以根據導入本發明之CAR表現載體的細胞種類適當地進行選擇，例如，可以舉出編碼相對於人SHP-1的顯性失活突變體的氨基酸序列(序列編號5)的核酸，只要能夠阻礙相對於SHP-1的顯性失活突變體中的SHP-1的作用，也可以使用與序列編號5所示之鹼基序列具有80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、進而較佳為95%以上、最佳為98%以上的相同性的鹼基序列。此外，序列編號5中第453號的絲氨酸為突變部位。

作為編碼相對於SHP-2的顯性失活突變體的核酸，可以根據導入本發明之CAR表現載體的細胞種類適當地進行選擇，例如，可以舉出編碼相對於人SHP-2的顯性失活突變體的氨基酸序列(序列編號6)的核酸，只要能夠阻礙相對於SHP-2的顯性失活突變體中的SHP-2的作用，也可以使用與序列編號6所示之鹼基序列具有80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、進而較佳為95%以上、最佳為98%以上的相同性的鹼基序列。此外，序列編號6中第459號的絲氨酸為突變部位。

本發明之CAR表現載體既可以為直鏈狀，也可以為環狀，還可以是質體等的非病毒載體、病毒載體、或者利用轉位子的載體。另外，該載體也可以含有啟動子或終止子等的控制序列、或者抗藥基因、報導基因等篩選標記序列。透過以能夠在啟動子序列的下游工作的方式配置編碼CAR的核酸或編碼T細胞之免疫功能促進因子的核酸，能夠有效地轉錄各個核酸。另外，藉由含有標記基因，能夠容易地確認編碼嵌合抗原受體的核酸的表現。

另外，本發明之CAR表現載體也可以含有編碼自殺基因的核酸，該自殺基因的位置並無特別限制，可以在用於表現編碼IL-7的核酸、編碼CCL19的核酸、編碼相對於SHP-1的顯性失活突變體的核酸、或者編碼相對於SHP-2的顯性失活突變體的核酸的啟動子的下游，經由編碼2A肽或者IRES的序列而配置在上述各個核酸的上游或下游，也可以配置在其他啟動子的下游。藉由使本發明之CAR表現載體含有編碼自殺基因的核酸，能夠根據癌症的治療經過，而在例如腫瘤消失時投餵激活自殺基因之功能的藥物，從而控制生物體內的CAR表現T細胞數量。

作為自殺基因，可以舉出以下文獻中所載之單純疱疹病毒的胸腺激酶(HSV-TK)或誘導性凋亡蛋白酶9(inducible caspase 9)等，作為激活該基因之功能的藥物，相對於前者可以舉出更昔洛韋、相對於後者可以舉出作為二聚物誘導化合物(chemical induction of dimerization：CID)的AP1903(Cooper LJ.,et.al.Cytotherapy.2006；8(2)：105-17.,Jensen M.C.et.al.Biol Blood Marrow Transplant.2010 Sep；16(9)：1245-56.,Jones BS.Front Pharmacol.2014 Nov 27；5：254.,Minagawa K.,Pharmaceuticals(Basel).2015 May 8；8(2)：230-49.,Bole-Richard E.,Front Pharmacol.2015 Aug 25；6：174)。

作為上述病毒載體，可以舉出反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體，可以較佳地舉出反轉錄病毒載體，可以更佳地舉出pMSGV載體(Tamada k et al.,Clin Cancer Res 18：6436-6445(2002))或pMSCV載體(TAKARA BIO公司生產)。在使用反轉錄病毒載體的情況下，導入基因被組入寄主細胞的染色體組中，因而能夠長時間且穩定地表現。

作為本發明之CAR表現T細胞，只要是(a)導入上述本發明之CAR表現載體而得到的T細胞、或者(b)導入含有編碼CAR的核酸和編碼介白素7的核酸的CAR表現載體(CAR-IL-7表現載體)、和含有編碼CAR的核酸和編碼CCL19的核酸的CAR表現載體(CAR-CCL19表現載體)的至少兩個載體而得到的T細胞，便無特別限制，作為將本發明之CAR表現載體、或者CAR-IL-7表現載體和CAR-CCL19表現載體導入T細胞的方法，並無特別限制，可以舉出藉由病毒感染法、磷酸鈣法、脂質轉染法、顯微注射法、電穿孔法等公知方法導入的方法，可以較佳地舉出病毒感染法。此外，上述CAR-IL-7表現載體只要含有編碼CAR的核酸和編碼介白素7的核酸即可，上述CAR-CCL19表現載體只要含有編碼CAR的核酸和編碼CCL19的核酸即可，與本發明之CAR表現載體同樣地，只要能夠表現各個核酸，也可以含有編碼2A肽、IRES或者自殺基因的核酸等其他的核酸。

作為病毒感染法，可以舉出將本發明之CAR表現載體和包裝質粒轉染到GP2-293細胞(TAKARA BIO公司生產)、Plat-GP細胞(Cosmo Bio公司生產)、PG13細胞(ATCC CRL-10686)、PA317細胞(ATCC CRL-9078)等包裝細胞中而製造重組病毒，且使T細胞感染該重組病毒的方法，也可以使用Retrovirus packagin Kit Eco(TAKARA BIO公司生產)等市售的試劑盒進行。

本發明之CAR表現載體向T細胞的導入確認，可以透過利用流動式細胞測量術、北方印漬術、南方印漬術、RT-PCR等的PCR、ELISA、西方印漬術調查CAR的表現、或者調查插入載體的標記基因的表現來確認。

作為T細胞，可以舉出源自人的T細胞、或者源自狗、貓、豬、小鼠等非人哺乳動物的T細胞。另外，T細胞可以從浸潤在血液、骨髓液等體液、或者脾臟、胸腺、淋巴節等組織、或者原發腫瘤、轉移性腫瘤、癌性腹水等癌組織中的免疫細胞中單離、提純而得到。作為該T細胞，可以舉出αβT細胞、γδT細胞、CD8⁺T細胞、CD4⁺T細胞、腫瘤浸潤T細胞、記憶T細胞、初始T細胞、NKT細胞等。

在本發明之CAR表現T細胞中，所表現之單鏈抗體位於細胞外，透過具備該單鏈抗體，CAR表現T細胞能夠識別在癌細胞表面上表現的腫瘤相關抗原(TAA)。

另外，在本發明之CAR表現T細胞中，也可以與上述本發明之CAR表現載體一同導入含有編碼自殺基因的核酸的載體。

本發明之抗癌劑只要含有本發明之CAR表現T細胞和藥學上允許之添加劑，便無特別限制，作為上述添加劑，可以列舉出生理鹽水、緩衝生理鹽水、細胞培養基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及其等的組合、穩定劑、助溶劑、界面活性劑、緩衝劑、防腐劑、張力調節劑、填充劑以及潤滑劑。

本發明之抗癌劑可以使用所屬領域技術人員已知的方法投餵給需要治療癌症的受驗體，作為投餵方法，可以舉出靜脈內、腫瘤內、皮內、皮下、肌肉內、腹腔內、動脈內、髓內、心臟內、關節內、滑液囊內、頭蓋內、髓腔內以及蛛膜下(腦脊髓液)的注射。

所投餵的抗癌劑中所包含的本發明之CAR表現T細胞的量，可以根據癌症種類、位置、嚴重程度、接受治療的受驗體的年齡、體重以及狀態等適當地調整，可以較佳地舉出一次投餵1×10⁴至1×10¹⁰個、較佳為1×10⁵至1×10⁹個、更佳為5×10⁶至5×10⁸個。

所投餵的抗癌劑可以按照1日4次、3次、2次或1次、隔一天、隔兩天、隔三天、隔四天、隔五天、1週1次、隔七天、隔八天、隔九天、1週2次、1月1次或者1月2次的方式獨立投餵。

作為本發明之抗癌劑、或後述之癌症治療方法中的癌症，可以舉出腺癌、鱗狀細胞癌、腺鱗狀細胞癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、皮膚癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、陰道癌、子宮頸癌、子宮癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、脾癌、肺癌、氣管癌、支氣管癌、結腸癌、小腸癌、胃癌、食道癌、膽囊癌、睪丸癌、卵巢癌等癌症、或者骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織以及造血組織的癌症、以及軟骨肉瘤、尤恩氏肉瘤、惡性血管內皮瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤等的肉瘤、肝母細胞瘤、髓母細胞瘤、腎母細胞瘤、神經母細胞瘤、胰母細胞瘤、胸膜肺母細胞瘤、視網膜母細胞瘤等的母細胞瘤、或者胚細胞腫瘤、淋巴瘤、白血病。

本發明之抗癌劑可以與其他的抗癌劑同時使用。作為其他的抗癌劑，可以舉出環磷醯胺、苯達莫司汀、依弗醯胺、達卡巴嗪等的烷化劑；噴司他丁、氟達拉濱、克拉屈濱、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巰嘌呤、依諾他賓等的抗代謝藥物；利妥昔單抗、西妥昔單抗、曲妥珠單抗等的分子靶向藥物；伊馬替尼、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、達沙替尼、舒尼替尼、曲美替尼等的激酶抑制劑；硼替佐米等的蛋白酶體抑制劑；環孢素、他克莫司等的鈣調神經磷酸酶抑制劑；伊達比星、阿黴素絲裂黴素C等的抗腫瘤抗生素；伊立替康、依托泊苷等的植物鹼；順鉑、奧沙利鉑、卡鉑等的鉑製劑；他莫昔芬、比卡魯胺等的激素治療藥；干擾素、納武單抗(Nivolumab)、派姆單抗(Pembrolizumab)等的免疫控制藥，可以較佳地舉出烷化劑或抗代謝藥物，可以較佳地舉出環磷醯胺。

作為上述「同時使用本發明之抗癌劑與其他抗癌劑」的方法，可以舉出使用其他的抗癌劑進行處理，然後使用本發明之抗癌劑的方法、同時使用本發明之抗癌劑和其他抗癌劑的方法、使用本發明之抗癌劑進行處理，然後使用其他抗癌劑的方法，可以較佳地舉出使用其他抗癌劑進行處理，然後使用本發明之抗癌劑的方法。另外，在同時使用本發明之抗癌劑與其他抗癌劑的情況下，能夠進一步提高癌症的治療效果，並且減少各種抗癌劑的投餵次數或投餵量，由此能夠減少各種抗癌劑所引起的副作用。另外，本發明之抗癌劑也可以含有上述其他抗癌劑。

作為本發明之另一方式1，可以舉出1)以將本發明之CAR表現T細胞投餵給需要治療癌症的患者為特徵的癌症治療方法、2)作為抗癌劑而使用的本發明之CAR表現T細胞、或者3)本發明之CAR表現T細胞在抗癌劑的調製中的使用。

進而，作為本發明之另一方式2，可以舉出具備本發明之CAR表現載體的、用於製造CAR表現T細胞的試劑盒，作為該試劑盒，只要具備本發明之CAR表現載體，便無特別限制，也可以包含用於製造CAR表現T細胞的說明書、和用於將本發明之CAR表現載體導入T細胞中的試劑。

[實施例1]

〔表現IL-7和CCL19之T細胞的製造〕

(T細胞之免疫功能促進因子的選擇)

能夠控制T細胞之功能的分子在生物體內至少存在數百種。作為用於進一步提高CAR-T細胞中的抗腫瘤效果的控制分子，本發明人等根據迄今為止的知識和經驗，首先從龐大的組合中選擇IL-7和CCL19，且選擇兩者的組合、即IL-7與CCL19的組合而不是單獨選擇各個，製造與CAR一同表現該T細胞之免疫功能促進因子的載體。

此外，上述IL-7是T細胞的生存所必需之細胞因子，藉由骨髓、胸腺、淋巴器官或組織的基質細胞等非造血細胞而生成。另一方面，T細胞自身幾乎不具備生成能力。

另外，上述CCL19主要由淋巴節的樹狀細胞或巨噬細胞生成，具有經由作為其受體的CCR7而使T細胞或B細胞、成熟的樹狀細胞遷移的功能。

(表現IL-7和CCL19之抗FITC CAR表現載體的製造)

人工合成編碼抗FITC CAR的抗FITC CAR DNA片段(序列編號7)、編碼序列編號1所示之2A肽(F2A)和與該肽連續之限制酶位點(MCS)的F2A-MCS DNA片段(序列編號8)、編碼小鼠IL-7(無終止密碼子)以及與其連續之F2A和小鼠CCL19的IL-7-F2A-CCL19 DNA片段(序列編號9)，其中，上述抗FITC CAR由抗FITC scFv、小鼠CD8膜貫通區、小鼠CD28-4-1BB-CD3ζ胞內訊號基序構成。在序列編號7中，第1至819號為編碼抗FITC scFv之多肽的序列，第829至1074號為編碼小鼠CD8膜貫通區之多肽的序列、第1075至1197號為編碼小鼠CD28的胞內區之多肽的序列、第1198至1332號為編碼4-1BB的胞內區之多肽的序列，第1333至1674號為編碼CD3ζ的胞內區之多肽的序列。另外，在序列編號9中，第1至462號為編碼IL-7的序列，第463至537號為編碼F2A的序列，第538至864號為編碼CCL19的序列。

為了製造表現CAR、IL-7以及CCL19的CAR載體，將上述抗FITC CAR DNA片段與上述F2A-MCS DNA片段加以連接，從而製造抗FITC CAR-F2A-MCS建構。接著，在pMSGV反轉錄病毒表現載體(Tamada K et al.,Clin Cancer Res 18：6436-6445(2002))中對製造的建構進行選殖，製造包含抗FITC CAR-F2A-MCS的pMSGV載體。透過限制酶(NsiI和SalI)處理和結紮而將上述IL-7-F2A-CCL19 DNA片段插入上述pMSGV載體的MCS中，從而得到包含抗FITC CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19的pMSGV載體(IL-7/CCL19表現-抗FITC CAR載體)。所得載體之配置圖如圖2所示。另外，作為對照組，在pMSGV反轉錄病毒表現載體中對抗FITC CAR DNA片段進行選殖，從而製造包含抗FITC CAR的pMSGV載體(對照組抗FITC CAR載體)。

(導入IL-7/CCL19表現-抗FITC CAR載體之反轉錄病毒的製造)

為了轉導小鼠T細胞而製造了反轉錄病毒。使用Lipofectamine 2000或3000(生命科技(Life Technologies)公司生產)，將上述IL-7/CCL19表現-抗FITC CAR載體或者對照組抗FITC CAR載體、和pCL-Eco質體(Imgenex公司生產)轉染至GP2-293包裝細胞株(TAKARA BIO公司生產)中，從而製造導入了IL-7/CCL19表現-抗FITC CAR載體或者對照組抗FITC CAR載體的反轉錄病毒。從轉染經過48小時後，回收含有上述反轉錄病毒的上清液。

作為上述GP2-293細胞的培養液，使用加入10%FCS、100U/ml盤尼西林、100mg/ml鏈黴素的DMEM。另外，作為後述實施例中所使用之T細胞的培養液，使用加入10%FCS、100U/ml盤尼西林、100mg/ml鏈黴素、50mM 2-巰基乙醇、2mM左旋麩醯胺酸的RPMI-1640。

(小鼠T細胞之轉導)

為了轉導小鼠T細胞，利用固層化之抗CD3單株抗體(3μg/ml)、抗CD28單株抗體(1μg/ml)、IL-2(100IU/ml)，將源自脾臟和淋巴節的3×10⁶個提純後之小鼠T細胞激活48小時。接著，將含有以上製造之導入IL-7/CCL19表現-抗FITC CAR載體或者對照組抗FITC CAR載體的反轉錄病毒的上清液，與利用塗敷有25μg/ml的RetroNectin(註冊商標：TAKARA BIO公司生產)的板激活的上述小鼠T細胞(1×10⁶cells/ml)混合，並以1500rpm離心2小時後，在IL-2(100IU/ml)的存在下培養6小時。為了從培養液中除去反轉錄病毒，而回收小鼠T細胞，並轉移至含有IL-2(100IU/ml)的新的增殖培養液(RPMI)中，進而培養42小時，得到導入了IL-7/CCL19表現-抗FITC CAR載體的小鼠T細胞(抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞)或者導入了對照組抗FITC CAR載體的小鼠T細胞(抗FITC CAR表現T細胞)。

(表現IL-7和CCL19之抗CD20 CAR表現載體的製造)

除了在上述IL-7/CCL19表現-抗FITC CAR載體的製造中，根據利妥昔單抗之序列而將序列編號7所示之序列中所包含之抗FITC scFv區域的序列，置換為生命科技公司合成之抗人CD20 scFv(序列編號10)的序列之外，利用同樣的方法製造包含抗人CD20 CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19的pMSGV載體(IL-7/CCL19表現-抗人CD20 CAR載體)。同樣地，除了在上述對照組抗FITC CAR載體的製造中，將序列編號7所示之序列中所包含之抗FITC scFv區域的序列置換為上述抗人CD20 scFv(序列編號10)的序列之外，利用同樣的方法製造包含抗人CD20 CAR的pMSGV載體(對照組抗人CD20 CAR載體)。利用與上述相同的方法，將上述IL-7/CCL19表現-抗人CD20 CAR載體或者對照組抗人CD20 CAR載體導入小鼠T細胞中，製造抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或者抗人CD20 CAR表現T細胞。

[實施例2]

〔利用流動式細胞測量術測量CAR表現〕

(流動式細胞測量術分析)

識別作為模式抗原(model antigen)的FITC的CAR之表現量藉由雙色流動式細胞測量術分析進行。將製造的抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞在FITC結合聚葡萄糖和別藻藍蛋白(APC)結合抗CD8單株抗體(53-6.7 Affymetrix公司生產)的存在下進行培養。流動式細胞測量術使用EC800(索尼公司生產)，資料分析使用FlowJo software(Tree Star公司生產)。

另外，識別人CD20的CAR之表現量也藉由雙色流動式細胞測量分析進行。使用將製造的抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞生物素標記後之蛋白質L和APC結合鏈黴親和素進行分析。

(結果)

結果如圖3至圖5所示。在圖3中，左側為CAR無染色(未添加FITC結合聚葡萄糖)的抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之結果，右側為CAR染色(添加FITC結合聚葡萄糖)的抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之結果，在圖4中，「transduction(-)」為未轉導的T細胞之結果，「Cont.」為抗FITC CAR表現T細胞之結果，「7×19」為抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之結果，在圖5中，「transduction(-)」為未轉導的T細胞之結果，「Cont.」為抗人CD20 CAR表現T細胞之結果，「7×19」為抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之結果。另外，圖中數值表示各個族群的百分率。如圖3至圖5所示，在抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中，確認到CAR之表現。

[實施例3]

〔IL-7、CCL19的分泌〕

(抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之培養上清液中的IL-7、CCL19濃度的測量-1)

利用1μg/ml固層化之FITC結合曲妥珠單抗，對製造的抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或者抗FITC CAR表現T細胞進行刺激且培養3天，回收上清液，並利用市售ELISA試劑盒(R&D systems公司生產)測量IL-7和CCL19之濃度。結果如圖6所示。

(結果)

如圖6所示，在培養上清液中，檢測出300pg/ml以上的IL-7，檢測出75pg/ml以上的CCL19。因此，確認抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞表現IL-7和CCL19，且所表現之IL-7和CCL19分泌在細胞外。此外，在對照組的抗FITC CAR表現T細胞中，IL-7、CCL19均在檢測極限以下(Not detected)。

(抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之培養上清液中的IL-7、CCL19濃度的測量-2)

使用ELISA試劑盒測量有無利用固層化之FITC接合曲妥珠單抗或者抗CD3單株抗體刺激下培養3天、5天、7天後之IL-7和CCL-19之濃度。結果如圖7所示。在圖7中，白色柱表示未刺激，灰色柱表示利用FITC結合曲妥珠單抗進行刺激，黑色柱表示利用抗CD3單株抗體進行刺激。另外，「Cont.」表示抗FITC CAR表現T細胞，「7×19」表示抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞。

(結果)

由圖7明確可知，不僅是3天，即使培養5天、7天，在抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中，IL-7和CCL-19也分泌在細胞外。

(抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之培養上清液中的IL-7、CCL19濃度的測量)

進而，關於製造的抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或者抗人CD20 CAR表現T細胞，同樣使用ELISA試劑盒測量在有無利用使用絲裂黴素C處理後之P815肥大細胞瘤、進行了基因重組以表現人CD20的P815肥大細胞瘤(P815-hCD20)、或者固層化之抗CD3單株抗體刺激下培養3天或5天後之IL-7和CCL-19之濃度。結果如圖8所示。在圖8中，白色柱表示無刺激，斜線柱表示利用使用絲裂黴素C處理後之P815進行刺激，黑色柱表示利用P815-hCD20進行刺激，灰色柱表示利用固層化之抗CD3單株抗體進行刺激。另外，「Cont.」表示抗人CD20 CAR表現T細胞，「7×19」表示抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞。

(結果)

由圖8明確可知，即使在抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中，IL-7和CCL-19也分泌在細胞外。

[實施例4]

〔CAR表現T細胞之細胞數、生存率〕

(抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之細胞數、生存率)

對於透過抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞生成之IL-7或CCL19是否發揮生物功能，且呈現免疫誘導效果進行了研究。利用1μg/ml固層化之FITC結合曲妥珠單抗對製造的抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或者抗FITC CAR表現T細胞進行刺激，且培養3天、5天、7天，並回收細胞和上清液。藉由錐蟲藍之染色對細胞數和生存率進行了分析。結果如圖9、圖10所示。在圖9、圖10中，黑色柱表示抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞，白色柱表示抗FITC CAR表現T細胞，橫軸表示培養天數。另外，利用Student’s t-test對於顯著性差異進行了研究(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005,†p<0.001)。

(結果)

由圖9、圖10明確可知，抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之細胞增殖、生存率均得到促進，透過抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞生成之IL-7或CCL19發揮生物功能。

(抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之細胞數)

在大鼠IgG2a陰性對照組、抗CD127單株中和抗體或者抗CCR7單株中和抗體的存在下，利用P815-hCD20與絲裂黴素C一同對含有抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞(4×10⁵個)的樣品進行刺激。培養5天，並藉由錐蟲藍對活細胞之絕對數進行了調查。此外，CD127是IL-7之受體，CCR7是CCL19之受體。結果如圖11所示。在圖11中，「Iso.Cntrl.」係在大鼠IgG2a陰性對照組的存在下利用P815-hCD20進行刺激之情況，「anti-CD127」係在抗CD127單株中和抗體的存在下利用P815-hCD20進行刺激之情況，「anti-CCR7」係在抗CCR7單株中和抗體的存在下利用P815-hCD20進行刺激之情況。在圖11中，黑色柱表示抗人CD20 CAR-IL7/CCL19表現T細胞，白色柱表示抗人CD20 CAR表現T細胞。另外，各資料以3個孔之平均±標準偏差表示，＊：表示P<0.05，†：表示P<0.001。

(結果)

如圖11所示，在抗人CD20 CAR-IL7/CCL19表現T細胞中，細胞數也增加，且細胞增殖率得到促進，並且透過anti-CD127抑制了細胞增殖，由此明確可知，細胞增殖率之促進係經由作為IL-7之受體的CD127發揮作用。

[實施例5]

〔T細胞遷移試驗〕

(利用抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞的細胞遷移試驗)

藉由使用Transwell的細胞遷移試驗，對於CCL19之遷移引起效果進行了研究。應答側T細胞之遷移性藉由下述方式進行了測量，即：使用96孔之Transwell(註冊商標)小室(Cornig Costar公司生產)，且經由孔徑為5μm的聚碳酸酯濾器而使其遷移。具體而言，在小室之下層，利用1μg/ml固層化FITC結合曲妥珠單抗對抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或抗FITC CAR表現T細胞刺激3天。應答側T細胞係藉由MACS(註冊商標)(Miltenyi Biotec公司生產)的陰性選擇而從脾臟或淋巴節調製而成。應答側T細胞利用CytoTell blue(AAT Bioquest公司生產)進行標記，且在上層培養了3小時。利用流動式細胞測量術對於從小室上層朝向下層之遷移進行了調查。結果如圖12所示。在圖12中，黑色柱表示抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞，白色柱表示抗FITC CAR表現T細胞，縱軸表示遷移至小室下層的應答側T細胞之絕對數(以下的圖13、14中也是同樣)。另外，利用Student’s t-test對於顯著性差異進行了研究(*p<0.05)。

(結果)

如圖12所示，與抗FITC CAR表現T細胞相比較，抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中更多的T細胞遷移至下層。在CAR表現T細胞等的淋巴球移入療法中，投餵的T細胞對於癌細胞的傷害當然很重要，但除此之外，將癌症患者中本來存在之內源性T細胞(=寄主側免疫細胞)激活，且調動其作為攻擊癌細胞的細胞也很重要。為此，從提高免疫治療效果方面出發，較佳為，不僅從外部移入具有抗腫瘤活性的淋巴球，而且透過任何方法引起移入的T細胞與內源性T細胞的能動性相互作用，從而使內源性T細胞集聚在癌症部位。由圖12之結果明確可知，抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞具有使內源性T細胞集聚之能力，因而能夠誘導移入的T細胞與內源性T細胞之能動性相互作用。

(利用抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞進行的T細胞或樹狀細胞之遷移試驗)

在Transwell之下層小室中，利用固層化之FITC結合曲妥珠單抗或抗CD3單株抗體，對含有抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或抗FITC CAR表現T細胞之樣品(5×10⁵個)進行刺激。第三天將利用CytoTell Blue染色後之4×10⁵個T細胞置於上層，且孵化3小時或5小時。同樣地，利用固層化之FITC結合曲妥珠單抗對各個樣品進行刺激，並於第三天將利用CytoTell Blue染色後之4×10⁵個樹狀細胞置於上層，且孵化3小時或5小時。利用流動式細胞測量術對於從上層遷移至下層的各個應答側細胞進行了分析。結果如圖13、圖14所示。在圖13、圖14中，黑色柱表示抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞，白色柱表示抗FITC CAR表現T細胞。此外，在圖13、圖14以及後述圖15中，各資料以3個孔之平均±標準偏差表示，＊：表示P<0.05，＊＊：表示P<0.01，†：表示P<0.001，††：表示P<0.00001，‡：表示P<5×10^-5。

(結果)

由圖13、圖14之結果明確可知，抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞使內源性T細胞和樹狀細胞集聚之能力高。

(利用抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞進行的T細胞遷移試驗)

在Transwell之下層小室中，將含有抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞(1×10⁵個)之樣品，與利用絲裂黴素C處理後之P815-hCD20一同進行培養。第3天將利用CytoTell Blue染色後之4×10⁵個T細胞置於上層，並在大鼠IgG2a陰性對照組、抗CD127單株抗體、或者抗CCR7單株抗體的存在下孵化3小時。利用流動式細胞測量術對於從上層遷移至下層的各個應答側T細胞進行了分析。結果如圖15所示。在圖15中，「Iso.Cntrl.」係在大鼠IgG2a陰性對照組的存在下利用P815-hCD20進行刺激之情況，「anti-CD127」係在抗CD127單株中和抗體的存在下利用P815-hCD20進行刺激之情況，「anti-CCR7」係在抗CCR7單株中和抗體的存在下利用P815-hCD20進行刺激之情況。在圖15中，黑色柱表示抗人CD20 CAR-IL7/CCL19表現T細胞，白色柱表示抗人CD20 CAR表現T細胞。

(結果)

由圖15之結果明確可知，在抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中，使內源性T細胞集聚之能力也高，並且透過anti-CCR7而抑制了內源性T細胞之集聚，因此，內源性T細胞之集聚係經由作為CCL19之受體的CCR7而發揮作用。

另外，由圖9至圖15之結果明確可知，抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞和抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞，具有藉由IL-7有效地增殖，生存率也高，並且藉由CCL19而使T細胞或樹狀細胞集聚在癌症部位這一免疫誘導不可或缺之重要效果，從而具有出色的免疫誘導效果。即，由此明確可知，在CAR表現T細胞中，藉由表現「IL-7」和「CCL19」這兩個控制分子，能夠提高該T細胞之增殖能力、生存率、免疫誘導效果。

[實施例6]

〔T細胞之增殖能力〕

利用CytoTell Blue(AAT Bioquest公司生產)對含有抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之樣品和作為對照組而含有抗FITC CAR表現T細胞之樣品(5×10⁵個)進行染色，並在透過固定化之FITC結合曲妥珠單抗刺激後，利用流動式細胞測量術進行了分析。刺激開始後第5天之結果如圖16所示，第3天、第7天之結果如圖17所示。在圖16中，柱形圖之數值表示細胞分裂數，在圖16、圖17中，餅狀圖之數值表示白血球族群中的各個閘控(gating)後的部分(0,1,2,3,4>的細胞分裂數)之比例。

(結果)

由圖16、圖17之結果明確可知，與抗FITC CAR表現T細胞相比較，抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之增殖能力增大。

[實施例7]

〔T細胞、樹狀細胞以及CAR表現T細胞中的CD127或CCR7之表現〕

利用流動式細胞測量術，對於非刺激的脾臟T細胞(初始T細胞：naive T cells)、將脾臟T細胞與抗CD3單株抗體、抗CD28單株抗體以及IL-2一同培養2天且刺激後之細胞(activated T cells)、非刺激的脾臟中的樹狀細胞(dendritic cells)、以及利用與實施例1之「小鼠T細胞之轉導」相同的方法激活而製造的抗FITC CAR表現T細胞(Cont.)和抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞(7×19)進行了分析，且對於CD127或CDR7之表現進行了調查。此外，T細胞為CD3⁺CD19^-之族群，抗FITC CAR表現T細胞、抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞為相對於FITC結合葡聚糖珠呈陽性之族群，樹狀細胞為CD11c⁺之族群。CD127表現之調查結果如圖18所示，CCR7表現之調查結果如圖19所示。在圖中，數值表示陽性之百分比，「Cont.」表示抗FITC CAR表現T細胞，「7×19」表示抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞。

(結果)

由圖18明確可知，CD127之表現在活化T細胞中與初始T細胞相比明顯降低，但在抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中比活化T細胞多，進而恢復至初始T細胞以上。另外，由圖19明確可知，CCR7之表現在抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中透過激活而導致表現降低，但與初始T細胞相比維持約67%的表現。現有技術下，已知在T細胞激活後，CD127或CCR7之表現會降低至大致1/2至1/3。因此，認為即使製造表現IL-7或CCL19之CAR表現T細胞，透過將CAR表現T細胞激活，IL-7和CCL19之作用也降低。因此，認為透過使CAR表現T細胞表現IL-7和CCL19，通常很難期待提高CAR表現T細胞之免疫誘導效果或抗腫瘤活性。在本試驗中，也發現在將脾臟T細胞激活後第2天， CD127或CCR7之表現暫時降低。然而，在抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞中，CD127或CCR7之表現在第4天明顯恢復。由此可知，使CAR表現T細胞表現IL-7和CCL19，對於免疫誘導效果或抗腫瘤活性之增強有用。

[實施例8]

〔小鼠腫瘤模型中的治療效果〕

(向小鼠投餵抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞)

向荷瘤小鼠(DBA/2小鼠)皮下接種5×10⁵個P815肥大細胞瘤(P815-hCD20)，該P815肥大細胞瘤(P815-hCD20)進行了基因重組以使其表現人CD20。3天後，向上述小鼠靜脈內投餵3×10⁶個抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或者抗人CD20 CAR表現T細胞。作為對照組，設定了接種上述P815肥大細胞瘤後未處理(未投餵CAR表現T細胞)的非治療群。每週測量2次小鼠的腫瘤體積和生存率。在腫瘤體積分析中，在各個實驗組中計算出標準偏差。關於3個組的顯著性差異，在腫瘤體積分析中係透過Student's t-tests進行了研究，在生存率之調查中係透過log-rank test進行了研究(*P<0.05,**P<0.01)。

小鼠腫瘤體積變化之結果如圖20所示，小鼠生存率之結果如圖21所示。在圖20、圖21中，○表示投餵了抗人CD20 CAR表現T細胞之情況，●表示投餵了抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之情況，◇表示作為非治療群而未投餵CAR表現T細胞之情況。另外，圖20之橫軸表示向小鼠靜脈內投餵細胞後經過的天數，縱軸表示腫瘤體積(mm³)，圖21之橫軸表示向小鼠靜脈內投餵細胞後經過的週數，縱軸表示生存率(%)。

(結果)

如圖20、圖21所示，與投餵抗人CD20 CAR表現T細胞時和未投餵CAR表現T細胞時相比較，在投餵抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞時，發現腫瘤體積減少效果、和生存率提高效果(生存期限延長效果)。因此，明確可知抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞具有出色的抗腫瘤活性。

(向小鼠接種抗癌劑和抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞)

對小鼠皮下接種5×10⁵個P815-hCD20。接種後第10天向腹腔內投餵作為抗癌劑的環磷醯胺(CPA，100mg/kg)，第14天向靜脈內投餵1×10⁶個抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或抗人CD20 CAR表現T細胞。小鼠生存率之結果如圖22所示，腫瘤體積之結果如圖23、圖24所示。在圖22至圖24中，橫軸為皮下接種P815-hCD20後的天數(向小鼠皮下接種P815-hCD20之日為0天)，縱軸為生存率(圖22)、腫瘤體積(腫瘤之長軸×(腫瘤之短軸)²/2(mm³))(圖23、圖24)，「no treatment」為未處理之組，「CPA」為僅投餵了CPA之組，「CPA+Cont.」為投餵CPA後投餵了抗人CD20 CAR表現T細胞之組，「CPA+7×19」為投餵CPA後投餵了抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之組，†表示小鼠死亡。此外，圖24係將圖23中的CPA+7×19的圖表縱軸之數值設為1/10之圖。

(結果)

由圖22明確可知，藉由同時使用本發明之抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞和抗癌劑，生存率變得極高。另外，由圖23、圖24明確可知，透過同時使用本發明之抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞和抗癌劑，腫瘤完全消失。此外，如圖24所示，皮下接種P815-hCD20後第10天腫瘤體積最大，此時的短徑為4.86mm至7.25mm，長徑為5.92mm至8.39mm，以腫瘤體積計為69.91mm³至220.50mm³，平均為140.02mm³。由上述結果也可知，透過利用抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞進行治療，暫時增殖的腫瘤消失。此外，在同時使用其他抗癌劑之情況下，從更加提高本發明之CAR表現T 細胞之抗腫瘤活性方面出發，較佳為如上述方法所示，首先透過其他抗癌劑減少淋巴球細胞數，然後投餵抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞。透過該方法，能夠增強CAR表現T細胞在生物體內的恆定。

[實施例9]

〔向腫瘤組織的滲透效果〕

對小鼠皮下接種5×10⁵個P815-hCD20。接種後第3天，投餵1×10⁶個抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞，接種後第21天切斷腫瘤組織。將各個組織分為2個。1個進行蘇木精-伊紅(H&E)染色，另一個用於免疫組織化學分析。在免疫組織化學分析中，作為一級抗體而利用抗CD4和抗CD8之單株抗體之組合、或者抗CD3和抗DEC205之單株抗體之組合進行。另外，作為二級抗體，使用Alexa Fluor(註冊商標)488結合抗大鼠IgG2a(綠)和Alexa Fluor(註冊商標)647結合抗大鼠IgG2b(紅)。細胞核利用DAPI(藍)進行染色。H&E染色樣品和免疫標記片段之顯微鏡觀察以×100或×200之倍率進行。此外，CD4和CD8為T細胞之標記物，DEC205為樹狀細胞之標記物。H&E染色之結果如圖25所示，免疫組織化學分析之結果如圖26(a)、(b)所示。另外，在圖26(a)、(b)之資料中，使用Hybrid Cell Count program(KEYENCE公司生產)定量各個陽性區域之結果分別如圖27(a)、(b)所示，其中，該各個陽性區域分別透過螢光染色(CD4染色(紅)、CD8染色(綠)、CD3染色(紅)、DEC205染色(綠)、CD3及DEC205的共存(黃))進行了標記。在圖25至圖27中，「no treatment」或「no treat.」為未處理之組，「Cont.」為利用抗人CD20 CAR表現T細胞處理之組，7×19為利用抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞處理之組。

(結果)

由圖25之結果可知，在利用抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞處理時，觀察到壞死(Necrosis)惡化(箭頭所示區域)、細胞核消失之區域。進而，由圖26(a)、圖27(a)之結果明確可知，透過利用抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞進行處理，T細胞滲透入癌組織內，由圖26(b)、圖27(b)之結果明確可知，透過利用抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞進行處理，樹狀細胞與T細胞一同滲透入癌組織內。

[實施例10]

〔IL-7與CCL19之組合的腫瘤治療效果〕

對DBA/2小鼠皮下接種5×10⁵個P815-hCD20。接種後第3天，向靜脈內投餵1×10⁶個抗人CD20 CAR表現T細胞、作為免疫功能促進因子而僅表現IL-7(不表現CCL19)之抗人CD20 CAR-IL-7表現T細胞、作為免疫功能促進因子而僅表現CCL19(不表現IL-7)之抗人CD20 CAR-CCL19表現T細胞、或者表現IL-7和CCL19之抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞。作為對照組，設置了未投餵不表現IL-7和CCL19之CAR表現T細胞的小鼠組。投餵後第10天，測量腫瘤之長軸、短軸，且利用與上述相同的方法計算出腫瘤之體積(mm³)。結果如圖28所示。在圖28中，「No treat」表示未投餵CAR表現T細胞之情況，「Control CAR」表示投餵了抗人CD20 CAR表現T細胞之情況，「IL-7 CAR」表示投餵了抗人CD20 CAR-IL-7表現T細胞之情況，「CCL19 CAR」表示投餵了抗人CD20 CAR-CCL19表現T細胞之情況，「IL-7/CCL19 CAR」表示投餵了抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之情況。

此外，抗人CD20 CAR-IL-7表現T細胞係藉由製造包含抗人CD20 CAR-F2A-IL-7的pMSGV載體(IL-7表現-抗人CD20 CAR載體)，且利用與實施例1之「小鼠T細胞之轉導」相同的方法導入小鼠T細胞中而得到。此外，抗人CD20 CAR-CCL19表現T細胞係藉由製造包含抗人CD20 CAR-F2A-CCL19的pMSGV載體(CCL19表現-抗人CD20 CAR載體)，且利用與實施例1之「小鼠T細胞之轉導」相同的方法導入小鼠T 細胞中而得到。各個載體之製造，按照實施例1之「表現IL-7和CCL19之抗FITC CAR表現載體的製造」或者「表現IL-7和CCL19之抗CD20 CAR表現載體的製造」的方法而進行。編碼IL-7之序列使用序列編號9中第1至462號和與其連續之終止密碼子序列，編碼CCL19之序列使用序列編號9中第538至864號序列。結果如圖28所示。

(結果)

如圖28所示，在投餵抗人CD20 CAR-IL-7表現T細胞或抗人CD20 CAR-CCL19表現T細胞時，腫瘤增殖抑制效果與投餵了Conotrol的抗人CD20 CAR表現T細胞時大致相同或者稍低，但是，在投餵抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞時，腫瘤幾乎消失。因此，儘管IL-7、CCL19各自單獨幾乎無腫瘤增殖抑制效果，但是，藉由將IL-7與CCL19加以組合，能夠得到極高的腫瘤增殖抑制效果。

[實施例11]

〔基於⁵¹Cr釋放檢測之腫瘤細胞毒活性-1〕

(T細胞之免疫功能促進因子的選擇)

在癌組織之微環境中，抑制性訊號向免疫細胞傳遞，抗腫瘤免疫反應被阻礙，由此使免疫療法之效果減弱。抑制訊號透過SHP-1或SHP-2向免疫細胞傳遞。因此，在針對癌症之T細胞療法中，透過使T細胞自身產生阻礙SHP-1或SHP-2之作用的顯性失活突變體，從而能夠增強抗腫瘤效果。因此，製造了同時表現阻礙SHP-1或SHP-2之作用的顯性失活突變體和CAR之載體，並且對腫瘤細胞毒活性進行了調查。

(表現SHP1或SHP2的顯性失活突變體之CAR表現載體的製造)

編碼小鼠SHP1之顯性失活突變體(SHP1DN)的DNA片段透過利用PCR之部位特異性突變導入法而製造，其中，該小鼠SHP1之顯性失活突變體(SHP1DN)含有453位中的觸媒半胱氨酸殘基向絲氨酸之突變(C453S)，編碼小鼠SHP2之顯性失活突變體(SHP2DN)的DNA片段使用生命科技公司合成之DNA片段，其中，該小鼠SHP2之顯性失活突變體(SHP2DN)含有459位中的觸媒半胱氨酸殘基向絲氨酸之突變(C459S)。將編碼小鼠SHP1DN的鹼基序列表示於序列編號11中，編碼小鼠SHP2DN的鹼基序列表示於序列編號12中。在序列編號11中，第1357至1359號的3個鹼基為突變部位，在序列編號12中，第1375至1377號的3個鹼基為突變部位。將編碼SHP1DN或SHP2DN的DNA片段插入pMSGV載體之MCS中，分別得到SHP1DN表現-抗人CD20 CAR載體、SHP2DN表現-抗人CD20 CAR載體，其中，pMSGV載體包含實施例2之IL-7/CCL19表現-抗人CD20 CAR載體製造過程中的抗人CD20 scFv CAR-F2A-MCS。所得載體之配置圖如圖29所示。

(小鼠T細胞之轉導)

利用與實施例1相同的方法，將上述SHP1DN表現-抗人CD20 CAR載體、SHP2DN表現-抗人CD20 CAR載體導入小鼠T細胞，分別得到抗人CD20 CAR-SHP1DN表現T細胞、抗人CD20 CAR-SHP2DN表現T細胞。作為對照組，使用實施例1中製造的抗人CD20 CAR表現T細胞。

(基於⁵¹Cr釋放檢測之腫瘤細胞毒活性)

透過標準型4小時⁵¹Cr釋放檢測測量了CAR表現T細胞對於腫瘤之細胞毒活性。將表現人CD20的P815(P815-hCD20)用作目標腫瘤細胞。採取上述腫瘤細胞，在100μCi Na₂ ⁵¹CrO₄存在下，在37℃下培養1小時後清洗3次。然後，作為效應T細胞，與抗人CD20 CAR表現T細胞、抗人CD20 CAR-SHP1DN表現T細胞、或者抗人CD20 CAR-SHP2DN表現T細胞一同進行培養。效應/目標比設為0.6、1.25、2.5、5、10。透過利用含有10%Triton-X(Sigma-Aldrich公司生產)的培養液或者僅利用培養液對上述細胞進行培養，而測量了目標細胞之最大釋放和自然釋放。利用TopCount閃爍記數器(PerkinElmer公司生產)測量了上清液之⁵¹Cr釋放。藉由公式：特異性傷害(%)=[(試驗釋放-自然釋放)/(最大釋放-自然釋放)]×100而計算出特異性傷害之比例。結果如圖30所示。在圖30(a)中，○為抗人CD20 CAR表現T細胞，●為抗人CD20 CAR-SHP1DN表現T細胞，在圖30(b)中，○為抗人CD20 CAR表現T細胞，●為抗人CD20 CAR-SHP2DN表現T細胞。另外，橫軸以E/T比表示效果(T細胞)與目標(腫瘤細胞)之比，縱軸表示特異性傷害(%)。利用Student’s t-test對於顯著性差異進行了研究(*p<0.05)。

由圖30明確可知，抗人CD20 CAR-SHP1DN表現T細胞或抗人CD20 CAR-SHP2DN表現T細胞具有明顯高於抗人CD20 CAR表現T細胞之腫瘤細胞毒活性。

[實施例12]

〔基於⁵¹Cr釋放檢測之腫瘤細胞毒活性-2〕

將P815-hCD20(1×10⁴個/孔)在未標記(Ab、白底)或者FITC結合(FITC-Ab、塗黑)利妥昔單抗存在下，以效應/目標(E/T)比例為0.15625、0.3125、0.625、2.5、5、10的方式與抗FITC CAR表現T細胞(Cont，圓形)或者抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞(7×19、四角)一同混合，且利用與上述相同的方法測量上清液的⁵¹Cr釋放，計算出毒活性之比例。結果如圖31所示。在圖31中，以「●」表示在FITC結合利妥昔單抗存在下與抗FITC CAR表現T細胞一同混合之情況，以「○」表示在未標記利妥昔單抗存在下與抗FITC CAR表現T細胞一同混合之情況，以「■」表示在FITC結合利妥昔單抗存在下與抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞一同混合之情況，以「□」表示在未標記利妥昔單抗存在下與抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞一同混合之情況。

另外，將815-hCD20(1×10⁴個/孔)以效應/目標(E/T)比例為0.3125、0.625、2.5、5、10、20的方式與抗人CD20 CAR表現T細胞或抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞一同混合，且利用與上述相同的方法測量上清液的⁵¹Cr釋放，計算出毒活性之比例。結果如圖32所示。在圖32中，以「●」表示與抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞一同混合之情況，以「○」表示與抗人CD20 CAR表現T細胞一同混合之情況。

(結果)

由圖31、圖32明確可知，每個抗FITC CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之腫瘤細胞毒活性維持與抗FITC CAR表現T細胞同等水平，同樣地，每個抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞之腫瘤細胞毒活性維持與抗人CD20 CAR表現T細胞同等水平。

[實施例13]

〔CAR表現T細胞在生物體內的生存和向記憶T細胞的分化〕

(流動式細胞測量術分析)

對DBA/2小鼠皮下接種5×10⁵個P815-hCD20。接種後第10天向腹腔內投餵作為抗癌劑的環磷醯胺(CPA、100mg/kg)，第14天向靜脈內投餵1×10⁶個抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞或抗人CD20 CAR表現T細胞。在投餵CAR表現T細胞後第21天，從脾臟或腫瘤所屬淋巴節(腋下、上臂、鼠蹊)單離出白血球。針對白血球表面之表現型而利用流動式細胞測量術對CD4、CD8、CD44、CD62L進行分析之結果如圖33所示。另外，將脾臟的白血球與利用絲裂黴素C處理後之P815-hCD20一同培養4天且進行刺激，并利用流動式細胞測量術調查T細胞之增殖之結果如圖34所示。使用生物素標記之蛋白質L和APC結合鏈黴親和素確認了CAR之表現。圖33中的數字表示CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞各自的閘區(gate region)(CD62L⁺CD44^-為初始T細胞，CD62L⁺CD44⁺為中央記憶T細胞，CD62L^-CD44⁺為效應記憶T細胞)之比例，圖34中的數字表示蛋白質L陽性T細胞之比例。另外，在圖33、圖34中，「Cont.」表示抗人CD20 CAR表現T細胞，「7×19」表示抗人 CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞。

(結果)

由圖33、圖34明確可知，在投餵了抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞的小鼠中，脾臟和淋巴節中的記憶T細胞增加，另外，在與表現人CD20之腫瘤細胞一同培養時，小鼠內生存的抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表現T細胞大幅增殖。結合圖21、圖22的生存率之結果可知，本發明之CAR表現T細胞在投餵的生物體內有效地生存，也具有變為記憶T細胞而消滅癌細胞從而提高生存率之能力，對於癌症之復發預防也有效。

[工業上的可利用性]

使用本發明之CAR表現載體，能夠製造同時具備生存能力和淋巴球集聚能力之CAR-T細胞、和對於癌微環境下的免疫抑制具有抗性之CAR-T細胞，故能夠利用於癌症免疫療法之領域中。

[序列表]

FH26-030WO_0.txt

<110> 國立大學法人山口大學

<120> CAR表現載體及CAR表現T細胞

<130> FH26-030WO

<150> JP 2014-208200

<151> 2014-10-09

<160> 12

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 2A肽裂解區

<220>

<223> 發明人：玉田耕治(Tamada,Koji) 發明人：佐古田幸美(Sakoda,Yukimi) 發明人：安達圭志(Adachi,Keishi)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Val或Ile

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> 任何胺基酸

<400> 1

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 2A肽(F2A)

<400> 2

<210> 3

<211> 177

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類IL-7

<400> 3

<210> 4

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類CCL19

<400> 4

<210> 5

<211> 595

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類SHP1DN

<400> 5

<210> 6

<211> 593

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類SHP2DN

<400> 6

<210> 7

<211> 1674

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 抗FITC CAR

<400> 7

<210> 8

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> F2A-MCS

<400> 8

<210> 9

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 小鼠IL-7-F2A-小鼠CCL19

<400> 9

<210> 10

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 抗人類CD20 scFv

<400> 10

<210> 11

<211> 1788

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 小鼠SHP1DN

<400> 11

<210> 12

<211> 1782

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 小鼠SHP2DN

<400> 12

Claims

一種CAR表現載體，其含有編碼嵌合抗原受體CAR的核酸和編碼T細胞之免疫功能促進因子的核酸，其特徵在於，所述編碼免疫功能促進因子的核酸為編碼介白素7的核酸和編碼CCL19的核酸、編碼相對於SHP-1的顯性失活突變體的核酸、或者編碼相對於SHP-2的顯性失活突變體的核酸。
如請求項1所述之CAR表現載體，其中，編碼免疫功能促進因子的核酸為編碼介白素7的核酸和編碼CCL19的核酸。
如請求項2所述之CAR表現載體，其中，編碼CAR的核酸與編碼T細胞之免疫功能促進因子的核酸經由編碼自剪切型肽的序列而連接。
如請求項2或請求項3所述之CAR表現載體，其中，編碼介白素7的核酸與編碼CCL19的核酸經由編碼自剪切型肽的序列而連接。
如請求項1至請求項4中任一項所述之CAR表現載體，其中，編碼CAR的核酸含有編碼識別FITC或CD20的單鏈抗體之多肽的核酸。
如請求項1至請求項5中任一項所述之CAR表現載體，其中，編碼CAR的核酸含有編碼CD8的細胞膜貫通區之多肽的核酸。
如請求項1至請求項6中任一項所述之CAR表現載體，其中，編碼CAR的核酸含有編碼CD28的胞內區、4-1BB的胞內區以及CD3ζ的胞內區之多肽的核酸。
一種CAR表現T細胞，其導入了以下的(a)或(b)所示之載體，(a)請求項1至請求項7中任一項所述之CAR表現載體；(b)含有編碼CAR的核酸和編碼介白素7的核酸的CAR表現載體、和含有編碼CAR的核酸和編碼CCL19的核酸的CAR表現載體。
一種抗癌劑，其含有請求項8所述之CAR表現T細胞和藥學上允許的添加劑。