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TW201522368A - 抗組織因子路徑抑制劑之前藥抗體 - Google Patents

抗組織因子路徑抑制劑之前藥抗體 Download PDF

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TW201522368A
TW201522368A TW103109453A TW103109453A TW201522368A TW 201522368 A TW201522368 A TW 201522368A TW 103109453 A TW103109453 A TW 103109453A TW 103109453 A TW103109453 A TW 103109453A TW 201522368 A TW201522368 A TW 201522368A
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TW
Taiwan
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antibody
prt
artificial sequence
tfpi
masking
Prior art date
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TW103109453A
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English (en)
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Zhuo-Zhi Wang
John Murphy
Terry Hermiston
Ying Zhu
Ruth Winter
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Bayer Healthcare Llc
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Abstract

本發明提供僅在暴露於凝血級聯的蛋白酶之後才會特異地結合至組織因子路徑抑制劑(TFPI)的前藥抗體。所述前藥抗體可用於治療諸如血友病的出血障礙。當使用於此等治療時，這些前藥抗體相對於其他抗TFPI抗體顯示半衰期增加，同時減輕諸如血栓的副作用可能性。

Description

抗組織因子路徑抑制劑之前藥抗體
依據37 C.F.R.1.821(c)，本文以符合ASCII文字檔案的形式呈交一份在2013年3月15日創建的序列表，名為「BAYRP0004USP1_ST25.txt」且具有~71千位元的大小。前述檔案的內容以其整體併入做為參考。
技術領域是有關於治療血友病以及其他凝血障礙。
血液凝固是血液形成穩定血塊而停止出血的一個過程。這個過程涉及一些在血液中循環的酶原以及輔因子原(procofactor)(或「凝血因子」)。彼等酶原以及輔因子原透過數個路徑交互作用，它們藉著該等路徑依序或同時轉換成活化形式。最後，該過程使得凝血酶原因為活化因子X(FXa)在因子Va、離子性鈣與血小板存在下而活化成凝血酶。活化的凝血酶又引起血小板聚集並且將血纖維蛋白原轉換成血纖維蛋白，而血纖維蛋白被活化因子XIII(FXIIIa)交叉連結而形成血塊。
活化因子X的過程可以透過兩個不同路徑發生：接觸活化路徑(先前已知為內在路徑)以及組織因子路徑(先前已知為外在路徑)。先前認為凝血級聯由兩個連結至一個共同路徑之具有相等重要性的路徑所組成。現在知道血液凝固起始的主要路徑為組織因子路徑。因子X可以被組織因子(TF)組合活化因子VII(FVIIa)所活化。因子VIIa與其主要輔因子(TF)的複合體是凝血級聯的有效引發劑。
凝血的組織因子路徑受到組織因子路徑抑制劑(「TFPI」)負向地調控。TFPI是一種FVIIa/TF複合體的天然FXa依賴性回饋抑制劑。其為多價Kunitz型絲胺酸蛋白酶抑制劑的一個成員。在生理學上，TFPI結合至活化的因子X(FXa)而形成異型二聚體複合體，其接而與FVIIa/TF複合體交互作用而抑制其活性，因此關閉了凝血的組織因子路徑。原則上，阻斷TFPI活性可回復FXa以及FVIIa/TF活性，因而延長組織因子路徑的作用持續時間並放大FXa的生成，而FXa是A型血友病與B型血友病的共有缺陷。
當然，一些初步實驗證據指出，藉由抗TFPI的抗體阻斷TFPI活性可使得延長的凝血時間常規化或縮短出血時間。例如，Nordfang等人證明在以針對TFPI的抗體處理血漿之後，血友病血漿的延長稀釋凝血酶原時間常規化(Thromb.Haemost.,1991,66(4)：464-467)。同樣地，Erhardtsen等人證明，A型血友病兔模型中的出血時間會因為抗TFPI抗體而明顯縮短(Blood Coagulation and Fibrinolysis,1995,6：388-394)。這些研究暗示，透過抗TFPI抗體抑制TFPI對於治療A型或B型血友病可能是有用的。在這些研究中只有使用多株抗TFPI抗體。
使用融合瘤技術，可以製備並且鑑別出抗重組人類TFPI(rhTFPI)的單株抗體。參見Yang et al.,Chin.Med.J.,1998,111(8)：718-721。測試單株抗體對於稀釋凝血酶原時間(PT)及活化部分凝血活酶時間(APTT)的影響。實驗顯示，抗TFPI單株抗體縮短因子IX缺陷型血漿的稀釋凝血酶原凝固時間。暗示著組織因子路徑不僅在生理學凝血，還有在血友病的出血中也扮演重要的角色(Yang et al.,Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao,1997,22(4)：297-300)。
授予Kjalke等人的美國專利第7,015,194號揭示包含FVIIa以及TFPI抑制劑的組合物，其包括多株或單株抗體或其片段，該組合物用以治療或預防出血事件或凝血治療。亦揭示在正常哺乳動物血漿中使用該組合物減少凝血時間。進一步暗示因子VIII或其變體可被納入所揭示的FVIIa與TFPI抑制劑的組合物中。並未暗示FVIII或因子IX與TFPI單株抗體的組 合。除了治療血友病以外，其亦暗示TFPI抑制劑(包括多株抗體或單株抗體)可用來治療癌症(參見授予Hung的美國專利第5,902,582號)。
因此，需要一種對TFPI具有特異性之改良抗體供治療血液學疾病與癌症。
因此，依據本發明提供一種抗體，其包含(a)第一可變域，包括第一輕鏈與第一重鏈可變區，該第一可變域在免疫學上結合至組織因子路徑抑制劑(TFPI)；(b)連接到第一輕鏈及/或第一重鏈可變區的胺基末端的掩蔽域(masking domains)；及(c)蛋白酶可切割連接子，插入第一輕鏈及/或第一重鏈可變區和掩蔽域之間。蛋白酶可切割域可以是凝血酶、血纖維蛋白溶解酶、因子VIIa或因子Xa切割位點。掩蔽域可以包含第二可變域，該第二可變域包括第二輕鏈與第二重鏈可變區。該抗體可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD以及IgE抗體。該抗體可以是人類或人類化抗體，及/或單鏈抗體。該抗體可以是二價並且包含兩個掩蔽域，一個連結到各個第一輕鏈可變區的胺基末端，或二價並且包含兩個掩蔽域，一個連結到各個第一重鏈可變區的胺基末端，或二價並且包括四個掩蔽域，一個連結到各個第一輕鏈可變區和各個第一重鏈可變區的胺基末端，例如，其中兩個掩蔽域是第二個輕鏈可變區，而兩個掩蔽域是第二重鏈可變區，其中該第二輕鏈和重鏈可變區形成第二可變域。第二可變域可以結合至組織因子(TF)、紅血球或白蛋白。掩蔽域可以是白蛋白結合蛋白。該抗體可結合至人類組織因子路徑抑制劑的Kunitz域2。
亦提供一種表現載體，其包含如上所述抗體且受到啟動子控制的編碼區，以及包含該一表現載體的細胞。亦提供一種醫藥調配物，其包含如上所述抗體與醫藥上可接受緩衝劑、載劑或稀釋劑一起調配。
在另一個具體例中，提供一種在個體中治療凝血障礙的方法，包含向該個體投與數量足以在該個體中促進凝血的抗體，該抗體包含(a)第一可變域，包括第一輕鏈與第一重鏈可變區，該第一可變域在免疫學上 結合至組織因子路徑抑制劑(TFPI)；(b)連接到第一輕鏈及/或第一重鏈可變區的胺基末端的掩蔽域；及(c)蛋白酶可切割連接子，插入第一輕鏈及/或第一重鏈可變區和掩蔽域之間。蛋白酶可切割域可以是凝血酶、血纖維蛋白溶解酶、因子VIIa或因子Xa切割位點。掩蔽域可以包含第二可變域，該第二可變域包括第二輕鏈與第二重鏈可變區。該抗體可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD以及IgE抗體。該抗體可以是人類或人類化抗體，及/或單鏈抗體。該抗體可以是二價並且包含兩個掩蔽域，一個連結到各個第一輕鏈可變區的胺基末端，或二價並且包含兩個掩蔽域，一個連結到各個第一重鏈可變區的胺基末端，或二價並且包括四個掩蔽域，一個連結到各個第一輕鏈可變區和各個第一重鏈可變區的胺基末端，例如，其中兩個掩蔽域是第二個輕鏈可變區，而兩個掩蔽域是第二重鏈可變區，其中該第二輕鏈和重鏈可變區形成第二可變域。第二可變域可以結合至組織因子(TF)、紅血球或白蛋白。掩蔽域可以是白蛋白結合蛋白。該個體可以是人類或非人類哺乳動物。該個體可能患有外傷、血友病(例如A型或B型)或癌症。該抗體可全身性地投與，或者局部或區域性地投與至出血位點。該抗體可以皮下、靜脈內或動脈內投與。該抗體可結合至人類組織因子路徑抑制劑的Kunitz域2。
預期本文所述任一方法或組合物可以利用本文所述任一其他方法或組合物來加以實施。
當與術語「包含」一起在申請專利範圍及/或說明書中使用單字「一或一種」時，可表示「一」，但其亦與「一或多」、「至少一」以及「一或一個以上」的意思一致。
預期本說明書中論及的任一具體例可利用本發明任一方法或組合物加以實施，且反之亦然。此外，本發明之組合物與套組可用以達到本發明之方法。
在本申請案通篇中，術語「約」用來指明該數值包括用來測定數值之裝置、方法的誤差的固有變異性，或存在於研究主體的變異性。
下列圖式構成本說明書的一部分且被納入以進一步顯示本發明的特定態樣。本發明可藉由參照此等圖式的一或多者與本文提供之特定具體例的詳細說明組合而更為容易理解。
圖1. 抗TFPI前藥抗體的一個具體例及其如何在活體內發揮作用的例示說明。
圖2. 抗TFPI前藥抗體的有效掩蔽策略的例示說明。
圖3A-B. TF結合前藥的載體圖譜，其中抗TFPI以及TF的可變區前後地連結。(圖3A)HC1-pTTF5 gA200抗TFPI前藥抗體片段的載體圖譜。(圖3B)LC1-pTTF 641抗TFPI前藥抗體片段的載體圖譜。
圖4A-C. TF結合前藥與RBC結合前藥的載體圖譜，其中抗TF或RBC的scFV連結至抗TFPI抗體重鏈的胺基末端。(圖4A)pQM1-3E10sc-gA200HC抗TFPI前藥抗體片段的載體圖譜。(圖4B)pQM1-T119sc-gA200HC抗-TFPI前藥抗體片段的載體圖譜。(圖4C)pQM1/gA200LC抗-TFPI前藥抗體片段的載體圖譜。
圖5A-B. 白蛋白-結合前藥的載體圖譜。(圖5A)pQM1-56E4-gA200H抗TFPI前藥抗體片段的載體圖譜。(圖5B)pQM1-56E4-gA200L抗TFPI前藥抗體片段的載體圖譜。
圖6. 3E10-scFv-gA200以及Ter119-scFv-gA200抗TFPI IgG使用考馬斯染色並且在非還原條件下不使用二硫蘇糖醇(DTT)以及在還原條件下使用DTT的SDS-PAGE。
圖7. 測定56E4-gA200相對於天然gA200之結合親和力的TFPI結合ELISA圖。
圖8. Ter119sc-gA200結合至RBC作為抗體濃度之函數的圖。
圖9. 不同抗TFPI前藥抗體以及未修飾的抗TFPI抗體gA200相對於TFPI在人類血清白蛋白(HSA)存在或不存在下之結合百分比的BIACORETM測量結果圖。
圖10A-G. (圖10A)峰凝血酶作為針對抗TFPI前藥抗體56E4-gA200，和抗TFPI抗體gA200之抗體濃度的函數之圖。(圖10B)凝血酶生成作為不同濃度的抗TFPI前藥抗體56E4-hA200，和抗TFPI抗體gA200的函數的圖，顯示出在各個抗體濃度下所生成的凝血酶濃度。(圖10C)前藥TPP-2654與其親本抗體gA200的凝血酶生成型態比較，前藥TPP-2654可以由凝血酶和FXa活化所活化。凝血酶活化TPP-2654的能力是透過加入外源性凝血酶接著水蛭素，然後不活化所添加之凝血酶來進行評估。對照包括其中添加緩衝液代替凝血酶的反應。(圖10D)顯示活化前藥TPP-2654所需的凝血酶滴定濃度測試。測試的凝血酶濃度在生理學可能達到的範圍內。(圖10E)間接評估FXa活化前藥TPP-2654的能力。FXa和凝血酶水平是透過增加用於起始TGA反應的TF濃度而增加。藉由比較外源性凝血酶提升TPP-2654反應的能力與因為FXa和凝血酶活化所達致者，可衡量FXa活化前藥的相對貢獻。(圖10F)顯示前藥TPP-2652的凝血酶生成，其受單獨凝血酶所活化。在此滴定研究指出，前藥TPP-2652需要~2.5U/mL凝血酶來轉換成活性TFPIAb。(圖10G)TPP-2652對FXa的相對不敏感性可在TF滴定實驗的結果中觀察到。相對於被設計成受到FXa與凝血酶活化而被活化的TPP-2654，TPP-2652顯示在凝血酶生成上以更高的TF使用劑量價產生一個較小的增長(圖10G與圖10E進行比較)。圖11.不同濃度的白蛋白對抗TFPI前藥的抗體和未修飾抗TFPI抗體的影響的圖。
圖12. 可組合以製備本發明之抗TFPI前藥抗體的重鏈與輕鏈序列。
圖13. 本發明之抗TFPI前藥抗體之重鏈與輕鏈序列。
圖14. 依據本發明之抗TFPI前藥抗體之選定重鏈與輕鏈的胺基末端序列。
圖15a. 在人類或猴白蛋白不存在或存在下，白蛋白結合抗TFPI前藥的TFPI結合(表面電漿共振-Biacore數據)；圖15b. 在人類/猴白蛋白不存在或存在下，以或不以凝血酶或FXa處理之後，白蛋白結合抗TFPI前藥的TFPI結合(表面電漿共振)。
圖16. 抗TFPI前藥TPP-2652與TPP-2654在蛋白酶切割後的質譜。
本揭示內容說明抗組織因子路徑抑制劑(TFPI)用於血友病及其他療法的安全和長效抗體。目前，抗TFPI抗體在分別臨床前和臨床開發中，但抗TFPI抗體的活體內半衰期比其他IgG抗體的半衰期相對還短。這可能是由於目標媒介的清除。此外，也已提出抗TFPI抗體在帶有發炎或以FVIIa治療的患者體內可能會引起副作用的問題。
為了解決這些問題，已開發出本發明中所描述的抗TFPI前藥抗體。這些抗體在它們暴露於從凝血級聯產生的蛋白酶之前，顯著減少對TFPI的結合。一旦凝血開始且蛋白酶產生了，蛋白酶藉由切割掩蔽域而活化了抗TFPI抗體，從而增加其對TFPI的結合。這些前藥抗體可用於治療出血障礙(如血友病)，同時比先前描述過的抗TFPI抗體提供更佳的安全性和藥動學型態。
1. 抗TFPI前藥抗體
本文揭示的抗體特異性地結合至TFPI；亦即，彼等以其對不相干抗原(例如BSA、酪蛋白)的結合親和力還高的親和力(例如至少兩倍高)結合到TFPI。如本文所用術語「組織因子路徑抑制劑」或「TFPI」意指由細胞天然表現的人類TFPI的任何變體、同型異構體和物種同源物。
在一些具體例中，前藥抗體以至少約105M-1至約1012M-1(例如105M-1、105.5M-1、106M-1、106.5M-1、107M-1、107.5M-1、108M-1、108.5M-1、109M-1、109.5M-1、1010M-1、1010.5M-1、1011M-1、1011.5M-1、1012M-1)的親和力結合至TFPI。可以使用技藝中已知的任何方法來分析抗體結合至抗原的親和力(Kd)，技藝中已知的任何方法包括例如免疫分析(諸如酶聯免疫特異性分析(ELISA))、雙分子交互作用分析(BIA)(例如，Sjolander & Urbaniczky；Anal.Chem.63：2338-2345,1991；Szabo,et al.,Curr.Opin.Struct. Biol.5：699-705,199，在此併入作為參考)，以及螢光活化細胞分選(FACS)用以量化結合至表現抗原之細胞的抗體。BIA是一種在沒有標記任何交互作用物的情況下即時分析生物特異性交互作用的技術(例如，BIACORETM)。光學現象表面電漿共振(SPR)的變化可以用作生物分子之間的即時反應的指標。
抗TFPI前藥抗體可以使用一個基本上全長免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgE、IgA)、其抗原結合片段(諸如Fab或F(ab’)2)，或包含抗原結合位點(如scFv、Fv或雙抗體)的構築體來建構，其能夠特異性地結合至TFPI。術語「抗體」還包括其他蛋白支架，能夠定向抗體互補決定區(CDR)插入在天然抗體中所發現的相同活性結合構型中，使得在此等嵌合蛋白所觀察到對TFPI的結合維持在從中衍生CDR的天然抗體的TFPI結合活性。
如本文所用「經單離的抗體」是一種抗體，它基本上無具有不同抗原特異性的其他抗體(例如，結合至TFPI的經單離抗體基本上無結合至TFPI以外之抗原的抗體)。但是，結合人類TFPI的表位、同型異構體或變體之經單離抗體可對其他相關抗原具有交叉反應性，其他相關抗原為例如來自其它物種(例如，TFPI物種同源物)。經單離抗體基本上可能無其他細胞材料和/或化學物質。
特定抗TFPI抗體揭示於美國專利公開案US2012/20268917、US2012/0108796、US2011/0229476及國際專利公開案WO2012/135671中，這些文件中每一者的全部內容併入本文做為參考。
A. 掩蔽抗體(Masked Antibodies)
在一些具體例中，本文揭示的前藥抗體經工程改造成具有掩蔽域，其降低抗體結合至TFPI的能力。這些掩蔽域可以識別凝血級聯的要素或其他相關標記。在一些具體例中，該掩蔽域包括辨識下列生物分子的要素，諸如組織因子(TF)、紅血球(RBC)及/或白蛋白。這些掩蔽域如圖1中所示透過蛋白酶切割位點附接至該抗體的可變區。這些掩蔽域可以是抗 體、肽、蛋白質，或另一種支架。無論如何，掩蔽域防止抗體透過其可變區結合至TFPI，直至掩蔽域被除去。
本文揭示的前藥的抗體經工程改造成包括被一或多個蛋白酶所辨識的蛋白酶切割位點，其切割會釋放掩蔽域並允許該抗體結合至TFPI。如本文所用，「蛋白酶切割位點」意指被蛋白酶識別和切割的胺基酸序列。在一些具體例中，蛋白酶切割位點被定位以掩蔽抗TFPI抗體的可變區並顯示於圖1中。在一些具體例中，抗TFPI前藥抗體包括一或多個蛋白酶切割位點，其可被凝血酶、血纖維蛋白溶解酶及/或因子Xa所切割。還能預想到，可使用因凝血級聯而被活化或上調之蛋白酶的其他蛋白酶切割位點。在一些具體例中，掩蔽抗TFPI前藥抗體之可變區的胺基酸序列除了蛋白酶切割位點及/或抗體、肽、蛋白質，或其它支架以外還包含多肽連接子(如圖所示，例如在圖1中)，其結合TF、RBC，或白蛋白。連接子可以是單一個胺基酸或多肽序列(例如，至多100個胺基酸)。例如，連接子可以是GGGGS(SEQ ID NO：149)。其它可供使用的連接子包括那些於SEQ ID NO：151-176中所示者。在其它具體例中沒有連接子存在，而切割位點自身以與結合至TF、RBC或白蛋白的抗體、肽、蛋白質，或另一種支架如圖1中所示掩蔽其結合至TFPI的方式被插入到可變區上。
已確定至少兩個凝血酶的最佳切割位點：(1)X1-X2-P-R-X3-X4(SEQ ID NO：147)，其中X1和X2是疏水性胺基酸和X3和X4都是非酸性胺基酸；和(2)GRG。在精胺酸殘基之後特異地切割凝血酶。血纖維蛋白溶解酶也可切割上述兩個切割位點，但具有比凝血酶還低的特異性。其他可供使用的凝血酶切割位點提供如SEQ ID NO：1-60。其他可供使用的血纖維蛋白溶解酶切割位點提供如SEQ ID NO：12、47、48、53，和61-130。在一些具體例中，切割位點是LVPRGS(SEQ ID NO：137)。
在一些具體例中，使用因子Xa切割位點，諸如I-(E或D)-G-R(SEQ ID NO：148)。其他可供使用的因子Xa切割位點提供如SEQ ID NO：29、59，及61-69。
除了切割位點以外，可以將蛋白酶的第二個結合位點(所謂外結合位點)引入抗TFPI前藥以製造出更有效率的切割。凝血酶的外結合位點可以來自蛋白酶受質或抑制劑(諸如PAR1、血纖維蛋白原以及水蛭素)的天然外結合位點。外結合位點也可以是其他蛋白質外結合位點的衍生物。
B. 抗體合成
抗TFPI前藥抗體可以合成或重組的方式生產。一些技術可供用於生產抗體。例如，噬菌體-抗體技術可用於生成抗體(Knappik et al.,J.Mol.Biol.296：57-86,2000，其併入本文做為參考)。用於獲得抗體的另一種方法是，如在WO 91/17271與WO 92/01047(兩者均併入本文做為參考)中所述從B細胞中篩選DNA庫。在這些方法中產生噬菌體庫，其中成員在其外表面上展示不同的抗體。抗體通常展示為Fv或Fab片段。噬菌體展示抗體透過結合至選定蛋白質的親和力集富而被篩選。抗體還可以使用三源雜交瘤方法學製備(例如Oestberg et al.,Hybridoma 2：361-367,1983；U.S.專利第4,634,664號；美國專利第4,634,666號，全都併入本文做為參考)。
抗體也可以從表現該等抗體的任何細胞純化，任何細胞包括已轉染了編碼抗體之表現構築體的宿主細胞。宿主細胞可在使抗體表現的條件下進行培養。經純化抗體可從可與抗體在細胞中相締合的其他細胞組分(如某些蛋白質、碳水化合物，或脂質)，使用本技藝中熟知的方法進行分離。這些方法包括，但不限於尺寸篩除層析、硫酸銨區分、離子交換層析、親和力層析，和製備型凝膠電泳。製劑的純度可以透過本技藝中已知的任何方法(例如SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳)來評估。製備經純化的抗體可以包含超過一種類型的抗體。
或者，抗TFPI前藥抗體可使用化學方法合成其胺基酸序列(諸如藉由使用固相技術的直接肽合成)(例如Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154,1963；Roberge et al.,Science 269：202-204,1995，兩者均併入本文做為參考)來製造。蛋白質的合成可以使用手動技術或透過自動化來進行。視情況，抗體的片段可以分別合成並使用化學方法予以合併而產生全長分子。
在一些具體例中，抗TFPI前藥抗體也可以被構成呈「單鏈Fv(scFv)格式」，其中一個蛋白酶切割位點以掩蔽其識別TFPI的能力這樣的方式被插入或圍繞一個肽連接子、抗體、肽、蛋白質，或另一個支架。因為肽連接子對於將scFv的兩個可變區維持在一起以供抗原結合是必要的，故肽連接子或側翼區的切割允許感興趣的蛋白酶不活化或下調scFv對其抗原的結合。
在一些具體例中，抗TFPI前藥抗體被構築呈「IgG形式」，其具有兩個結合位點，並且可以掩蔽其識別的TFPI的能力這樣的方式包括一個、兩個、三個或四個介於可變區和抗體、肽、蛋白質或另一個支架之間的蛋白酶切割位點。在每種情況下，蛋白酶切割位點在一側或兩側可以是連接子。此外，在每種情況下，切割位點可以是相同的或不同的。
2. 多核苷酸
本發明亦提供編碼前藥抗體的多核苷酸。此等多核苷酸可用來例如生產大量抗體供治療使用。
編碼抗體的cDNA分子可以利用標準分子生物技術使用mRNA作為模板來製造。之後，cDNA分子可以使用技藝中已知並且揭示於諸如Sambrook,et al.,(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor,N.Y.；1989)Vol.1-3，併入本文做為參考)的手冊中的分子生物技術來複製。諸如PCR的擴增技術可用來獲得多核苷酸的額外複本。或者，可使用合成化學技術來合成編碼抗TFPI前藥抗體的多核苷酸。
為了要表現編碼抗體的多核苷酸，該多核苷酸可以被插入到含有被插入編碼序列的轉錄和轉譯所必需的要素的表現載體中。可使用習於技藝者所熟知的方法來構築含有編碼抗體和合適的轉錄和轉譯控制要素之序列的表現載體。這些方法包括活體外重組DNA技術、合成技術和活體內遺傳重組。此等技術描述於例如Sambrook,et al.(1989)與Ausubel,et al., (Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y.,1995)中，均併入本文做為參考。
各種表現載體/宿主系統可用於包含和表現編碼抗體的序列。這些包括，但不限於微生物，如經重組噬菌體，質體或黏粒DNA表現載體轉形的細菌；經酵母菌表現載體轉形的酵母菌；感染病毒表現載體(如桿狀病毒)的昆蟲細胞系統；經病毒表現載體(例如花椰菜鑲嵌病毒，CaMV；菸草鑲嵌病毒，TMV)轉形的植物細胞系統；或細菌表現載體(例如，Ti或pBR322質體)，或動物細胞系統。
控制要素或調控序列為載體的那些非轉譯區(增強子、啟動子、5'和3'未轉譯區)，其與宿主細胞蛋白交互作用以執行轉錄和轉譯。這樣的要素在強度和特異性方面可能有所不同。根據載體系統和宿主，可以使用任何數量的合適轉錄和轉譯要素，包括組成型和誘導型啟動子。例如，當在細菌系統中進行選殖時，可以使用誘導型啟動子。桿狀病毒多角體啟動子可用於昆蟲細胞中。衍生自植物細胞基因體的啟動子或增強子(例如，熱休克，RUBISCO和貯藏蛋白基因)，或來自植物病毒的啟動子或增強子(例如，病毒啟動子或前導序列)可以被選殖到載體中。在哺乳動物細胞系統中，可以使用來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子。如果有必要產生包含編碼抗體之核苷酸序列的多複本的細胞株時，可使用帶有適當可篩選標記之以SV40或EBV為主的載體。
3. 製備TFPI抗體的方法
說明其他可用分子生物技術(包括製備抗體)的一般性文章為Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press,Inc.)；Sambrook,et al.,(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,(Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor,N.Y.；1989)Vol.1-3)；Current Protocols in Molecular Biology,(F.M.Ausabel et al.[Eds.],Current Protocols,a joint venture between Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc. (supplemented through 2000))；Harlow et al.,(Monoclonal Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988),Paul[Ed.])；Fundamental Immunology,(Lippincott Williams & Wilkins(1998))；以及Harlow,et al.(Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))，全部併入本文做為參考。
已使用遺傳工程來產生鼠、嵌合、人類化或完全人類抗，以生成用於人類疾病的治療性抗體。鼠單株抗體顯示作為治療劑會因為血清半衰期短、無法引起人類效應子功能以及產生人類抗小鼠抗體而具有限制性用途。Brekke and Sandlie,"Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century," Nature 2,53,52-62(January 2003)。嵌合抗體已顯示會引起人類抗嵌合抗體反應。人類化抗體進一步將抗體的小鼠組分減至最低。但是，完全人類抗體完全避免了與鼠要素有關的免疫原性。具體而言，若使用帶有鼠組分或鼠源的抗體，例如使用抗TFPI單株抗體治療血友病的慢性預防性治療，具有對療法產生免疫反應的高度風險，因為需要頻繁給藥且治療持續時間長。例如，A型血友病的抗體療法可能需要每週給藥持續患者終身。這對於免疫系統來說是持續的刺激。因此，對用於血友病與遺傳性和後天性凝血缺乏症或缺陷之抗體療法的完全人類抗體存在有需要。
已透過Koehler and Milstein在"Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity," Nature 256,495-497(1975)中所述融合瘤技術製造治療性抗體。完全人類抗體也可以在原核生物及真核生物中以重組方式製造。對於治療性抗體來說，偏好在宿主細胞中重組生產抗體而不是融合瘤製造。重組製造具有產品一致性更高、生產量可能更高，以及控制生產而減低或消除動物衍生蛋白質存在的益處。由於這些緣故，希望以重組方式生產單株抗TFPI抗體。
單株抗體可藉由在宿主細胞中表現根據本發明具體例之編碼單株抗體可變區的核苷酸序列來生產。在表現載體的幫助下，含有核苷酸序列的核酸可以被轉染和在適合生產的宿主細胞中被表現。因此，亦提 供了一種用於生產與人類TFPI結合之單株抗體的方法，包含：(1)將編碼本發明單株抗體的核酸分子轉染入宿主細胞中、(b)培養宿主細胞，以在宿主細胞中表現單株抗體，並且視情況(c)分離和純化生產的單株抗體，其中該核酸分子包含編碼本發明單株抗體的核苷酸序列。
在一個實例中，為了表現抗體或其抗體片段，將透過標準分子生物學技術獲得的編碼部分或全長輕鏈與重鏈的DNA插入表現載體中，使得該等基因可操作地連接到轉錄和轉譯控制序列。在上下文中，術語「可操作地連接」旨在表示抗體基因連接到載體，使得該載體內的轉錄和轉譯控制序列發揮其調控抗體基因的轉錄和轉譯的預期功能。表現載體和表現控制序列被選擇為與所使用的表現宿主細胞相容。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可以插入個別載體，或者更典型地，將兩個基因插入同一表現載體中。透過標準方法將抗體基因插入到表現載體(例如，在抗體基因片段和載體上互補限制位點的接合，或若沒有限制位點的話鈍端接合)。本文所述抗體的輕鏈和重鏈可變區可以用於藉由將它們插入已經編碼所要同型之重鏈恆定區和輕鏈的表現載體，使得VH段在載體內可操作地連接到CH段而VL段在載體內可操作地連接到CL段，來建立任一抗體同型的全長抗體基因。此外或或者，重組表現載體可以編碼促進抗體鏈自宿主細胞分泌的信號肽。抗體鏈基因可被選殖到載體中，使得信號肽符合讀框地連接到抗體鏈基因的胺基末端。該信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白蛋白質的信號肽)。
除了抗體鏈編碼基因以外，本發明的重組表現載體還帶有控制抗體鏈基因在宿主細胞中表現的調控序列。術語「調控序列」旨在包括啟動子、增強子和其他控制抗體鏈基因轉錄或轉譯的表現控制要素(例如聚腺苷酸化信號)。此類調控序列描述於例如Goeddel；Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。習於技藝者應當理解，表現載體(包括調控序列的選擇)的設計可以取決於下列因素，如待轉形宿主細胞的選擇、所需蛋白質的表現水平等。用於哺乳動物宿主細胞表現之調控序列的實例包括在哺乳動物細胞中指揮 高水平蛋白表現的病毒要素，例如源自巨大細胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動子及/或增強子。或者可使用非病毒調控序列，如泛素啟動子或β-球蛋白啟動子。
除了抗體鏈基因和調控序列，重組表現載體可以帶有其他序列，諸如調節載體在宿主細胞中複製的序列(例如，複製源點)和可篩選標記基因。可篩選標記基因有助於篩選已引入載體的宿主細胞(參見，例如美國專利第4,399,216號、第4,634,665號和第5,179,017號，所有均為Axel等人)中。例如，通常可篩選標記基因賦予已引入載體的宿主細胞對藥物(例如G418、潮黴素或甲胺喋呤)的抗性。可篩選標記基因的實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在使用甲胺喋呤選擇/擴增的情況下用於dhfr-宿主細胞中)和neo基因(用於G418篩選)。
對於輕鏈和重鏈的表現來說，編碼重鏈和輕鏈的表現載體是透過標準技術被轉染到宿主細胞中。各種形式的術語「轉染」意在涵括各種通常用於將外源性DNA引入原核或真核宿主細胞的技術，例如電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚醣轉染及類似技術。儘管在理論上可以在原核或真核宿主細胞中表現本發明的抗體，但在真核細胞中表現抗體為較佳，在哺乳動物宿主細胞中表現抗體最佳，因為這樣的真核細胞(尤其是哺乳動物細胞)比原核細胞更可以裝配和分泌正確折疊且具有免疫學活性的抗體。
用以表現重組抗體的哺乳動物宿主細胞的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞，描述於Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中，與DHFR可篩選標記一起使用，例如描述於R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞、HKB11細胞及SP2細胞。當編碼抗體基因的重組表現載體被引入哺乳動物宿主細胞中時，該等抗體是透過將宿主細胞培養一段時間足以允許抗體在宿主細胞中表現或抗體分泌至宿主細胞生長其中的培養基中來生產。抗體可以使用標準蛋白質純化方法(諸如超過濾、尺寸篩除層析、離子交換色譜和離心)從培養基中回收。
4. 使用部分抗體序列表現完整抗體
抗體與目標抗原主要是透過位在六個重鏈與輕鏈CDR上的胺基酸殘基交互作用。為此，個別抗體之間於CDR內的胺基酸序列比CDR外的序列更加多樣化。因為CDR序列負責大多數抗體-抗原交互作用，有可能藉由構築包括來自不同特異性天然抗體之CDR序列被移植到具有不同特性之不同抗體的骨架序列的表現載體來表現模擬特異性天然抗體的重組載體(參見，例如Riechmann,L.et al.,1998,Nature 332：323-327；Jones,P.et al.,1986,Nature 321：522-525；及Queen,C.et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033)。此類框架序列可以從公共DNA資料庫(包括生殖系抗體基因序列)來獲得。這些生殖系序列將不同於成熟抗體基因序列，因為它們將不包括完全組裝的可變區基因，這是在B細胞成熟期間由V(D)J接合所形成。不須要獲得特定抗體的完整DNA序列，以重現具有類似於原有抗體的結合性質的完整重組抗體(參見WO 99/45962)。跨越CDR區的部分重鏈和輕鏈序列通常就足夠用於這一目的。部分序列被用來確定哪些生殖系可變和接合基因段促成了重組抗體可變基因。然後將生殖系序列用來填補在可變區的缺失部分。重鏈和輕鏈前導序列在蛋白質成熟期間被切割且對最終抗體的性質沒有貢獻。出於這個原因，必須使用用於表現構築體的對應生殖系前導序列。對了要添加缺失的序列，經選殖的cDNA序列可以與合成寡核苷酸透過接合或PCR擴增予以合併。或者，整個可變區可以被合成為一套短的，重疊寡核苷酸，並透過PCR擴增合併以創建一個完全合成可變區選殖株。這個過程有一定的優勢，如消除或納入或特定限制位點，或特定的密碼子最佳化。
重鏈和輕鏈轉錄本的核苷酸序列被用來設計一組重疊的合成寡核苷酸，以創建與天然序列具有相同的胺基酸編碼能力的合成V序列。合成重鏈和κ鏈序列可能在三個方面不同於天然序列：重複核苷酸鹼基串被打斷，以促進寡核苷酸合成和PCR擴增；最佳化轉譯起始位點是根據Kozak規則(Kozak,1991,J.Biol.Chem.266：19867-19870)併入；以及HindIII位點工程改造在轉譯起始位點上游。
兩個重鏈和輕鏈可變區、最佳化編碼，和對應的非編碼鏈序列在對應非編碼寡核苷酸的大約中點處瓦解為30-50個核苷酸的部分。因此，對於每條鏈，寡核苷酸可被組裝成橫跨150-400個核苷酸段的重疊雙鏈組。該等池然後用作模板以產生150-400個核苷酸的PCR擴增產物。通常，單個可變區寡核苷酸組將瓦解成兩個池而分別擴增，以產生兩個重疊的PCR產物。這些重疊產物然後透過PCR擴增合併以形成完整的可變區。它也可能在PCR擴增時納入包括重鏈或輕鏈恆定區的重疊片段，以產生可容易地選殖至表現載體構築體中的片段。
經重新構築的重鏈和輕鏈可變區接著與經選殖的啟動子、轉譯起始、恆定區、3'非轉譯、聚腺苷酸化和轉錄終止序列，合併而以形成表現載體構築體。重鏈和輕鏈表現構築體可以被合併成單個載體，共轉染、連續轉染或分別轉染至宿主細胞中，然後融合形成表現兩條鏈的宿主細胞。
因此，在另一個態樣中，人類抗TFPI抗體(例如TP2A8、TP2G6、TP2G7、TP4B7等)的結構特徵被用於創建該保留結合至TFPI的功能之結構上相近的人類抗TFPI抗體。更具體而言，本發明單株抗體的經特異性鑑別重鏈和輕鏈區的一或多個CDR可與已知人類骨架區和CDR以重組方式合併以創建額外經重組工程化的本發明人類抗TFPI抗體。
因此，在另一個具體例中提供一種用於製備抗TFPI抗體的方法，包含：製備一種抗體，其包含(1)人類重鏈骨架區和人類重鏈CDR，其中該人類重鏈CDR3包含選自胺基酸序列SEQ ID NO：388-430的胺基酸序列，及/或(2)人類輕鏈骨架區和人類輕鏈CDR，其中該輕鏈CDR3包含選自胺基酸序列SEQ ID NO：259-301的胺基酸序列；其中該抗體保留結合至TFPI的能力。在其它具體例中，該方法使用本發明的其它CDR來實施。
5. 醫藥組合物
抗TFPI前藥抗體可以呈藥物組合物提供，醫藥組合物包含醫藥上可接受的載體。醫藥上可接受的載體較佳是無熱原的。包含抗TFPI前藥抗體的醫藥組合物可以單獨投與或與至少一種其他藥劑組合投與，其 他藥劑為如穩定性化合物，它可以呈任何無菌，生物可相容的醫藥載體來投與，包括但不限於食鹽水、緩衝食鹽水、葡萄糖和水。可採用多種水性載體，例如0.4%食鹽水、0.3%甘胺酸及類似物。這些溶液是無菌的，且通常不含顆粒物質。這些溶液可以透過習用已知的滅菌技術(例如，過濾)來滅菌。該等組合物可視需要含有醫藥上可接受的輔助物質以接近生理條件，如pH調節劑和緩衝劑等。醫藥組合物中的抗TFPI前藥抗體濃度可以廣泛變化，即少於約0.5%，通常在或至少於1%到至高15%或20%(以重量計)，且主要是基於流體體積、黏度等，按照所選特定投與模式來選擇。例如參見美國專利第5,851,525號，其併入本文作為參考。如果需要的話，一個以上的不同抗TFPI前藥抗體可以被納入醫藥組合物中。
除了活性成分以外，藥物組合物可含有合適的醫藥上可接受的載劑，包括賦形劑和在醫藥上使用於促進組合物加工成製劑的助劑。藥物組合物可透過任何數量的路徑來投與，包括但不限於經口、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、穿皮、皮下、腹膜內、鼻內、非經腸、局部、舌下或直腸方式。
在已製備醫藥組合物之後，它們可以被放置在適當容器中，並標記為治療指定的病況。這種標籤將包括數量、給藥頻率和方法。組合物還可進一步封裝在包含被適當包裝材料(包括泡沫聚苯乙烯與塑膠吹塑成型容器)限制在一起的一或多個容器的套組中，視情況包括關於儲存和使用的說明。
6. 治療出血障礙的方法 A. 病症
血友病是一群損害身體在血管受損時用來停止出血以控制凝血或凝固的能力的遺傳性病症。A型血友病(凝血因子VIII缺乏症)是這種病症的最常見形式，每約5,000-10,000名男嬰中有1名。B型血友病(凝血因子IX缺乏症)在每約20,000-34,000名男嬰中有1名。
如同大多數隱性性聯X染色體病症，血友病更可能發生在男性甚於女性。這是因為女性有兩條X染色體，而男性只有一條，所以有缺陷的基因絕對會在帶有它的男性中表現。因為女性有兩條X染色體，血友病是罕見的，具有兩個缺陷副本的女性的機率很低，所以女性是幾乎病症的完全無症狀帶原者。女性帶原者可以從他們的母親或父親遺傳了有缺陷的基因，也可能是一個新的突變。雖然女性不是不可能患有血友病，但這不常見：帶有A型或B型血友病的女性就一定是一名血友病男性和一名女性帶原者的女兒，而因為凝血因子XI缺乏症，非性聯C型血友病對兩性都會有影響，於阿什肯納茲猶太人(東歐人)後代中更為常見，但少見於其他族群。
血友病降低正常凝血過程所需凝血因子的血漿凝血因子水平。因此，當血管受傷時會形成暫時的痂，但缺少的凝血因子防止血纖維蛋白形成，而血纖維蛋白形成對於維持血塊是必要的。血友病患者不會比沒有血友病的人出血地更厲害，但會出血持續更長的時間。在嚴重的血友病患者中，即使是輕微的損傷可導致失血持續幾天或數週，甚至永遠無法癒合完全。在如腦或關節內的區域，這可能是致命的或永久衰弱。
可以使用本發明抗體治療的其它出血病症包括後天血小板功能缺陷、先天性血小板功能缺陷、先天性蛋白C或S缺乏症、彌漫性血管內凝血(DIC)、因子II缺乏症、因子V缺乏症、因子VII缺乏症、因子X缺乏症、因子XII缺乏症、特發性血小板減少性紫癜(ITP)和溫偉伯氏病。
B. 醫藥組合物、路徑及劑量
包含一或多個抗TFPI前藥抗體的醫藥組合物可以單獨或與其他藥劑、藥物或凝血因子組合投與給患者以治療血友病或其它凝血障礙。「治療有效劑量」的抗TFPI前藥抗體意指抗TFPI前藥抗體能促進凝血或減少出血時間的數量。治療有效劑量的確定是在習於技藝者的能力範圍內。
治療有效劑量最初可以在細胞培養分析中或在動物模型(通常是大鼠、小鼠、兔，狗或豬)中估算。動物模型也可以用來確定適當的濃度範圍和給藥路徑。這樣的資訊隨後可用於確定在人類體內投與時的可用劑量和路徑。
治療效果和毒性，例如抗TFPI前藥抗體的ED50(在50%的群體中治療有效的劑量)和LD50(造成50%群體致死的劑量)可以透過標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中確定。毒性對治療效果的劑量比為治療指數，並且它可以表示為比率，LD50/ED50。
展現大治療指數的醫藥組合物是較佳的。從細胞培養分析和動物研究獲得的數據被用於調配一系列供人類使用的劑量。包含在該組合物中的劑量較佳在循環濃度的範圍內，包括具有很少或沒有毒性的ED50。劑量是根據所採用的劑型，患者的敏感性和投與路徑在此範圍內變化。
精確的劑量將基於與需要治療的患者相關之因素由臨床醫生決定。調整劑量和投與以提供足夠含量的抗TFPI前藥抗體或維持期望的效果。可納入考量的因素包括疾病狀態的嚴重性、個體的一般健康狀況、個體的年齡、體重和性別、飲食、投與時間和頻率、藥物組合、反應敏感性，及對治療的耐受性/反應。可以每3至4天、每週，或每兩週一次投與長效醫藥組合物，取決於特定調配物的半衰期和清除率。
在一些具體例中，抗TFPI前藥抗體的活體內治療有效劑量是在約5μg至約100mg/kg、約1mg到約50mg/kg、約10mg至約50mg/kg患者體重的範圍內。
包含抗TFPI前藥抗體之醫藥組合物的投與模式可以是將抗體遞送給宿主的任何適宜路徑(例如皮下、肌肉內、靜脈內或鼻內投與)。
在一些具體例中，抗TFPI前藥抗體在沒有其他治療劑的情況下被投與。在一些具體例中，抗TFPI前藥抗體在與其他藥劑組合的情況下被投與，其他藥劑為例如藥物或凝血因子，俾以提高凝血酶的初始生產，同時確保凝血酶水平保持在低於可能在某些帶有凝血障礙的人體內引起血栓的範圍。抗TFPI前藥抗體可以在投與其他藥劑之前、之後，或在基本上同時投與。
實例
納入下列實施例以進一步說明本發明的各個態樣。應為習於技藝者所理解，下列實例中所揭示的技術容許代表發明人所發現在實施特定具體例時充分發揮功用的技術及/或組合物，並且因此被視為對其實施來說構成較佳模式。然而，依據本發明，習於技藝者應理解，可在所揭示的特定具體例中做出許多變化並仍然獲得相同或類似的結果而不脫離本發明的精神和範圍。
實例1-抗TRPI前藥抗體設計策略
為了掩蔽抗TFPI活性，已想出至少三個策略，但是預期還有其他的策略。抗組織因子抗體域、抗紅血球抗體域或白蛋白結合肽可以用作掩蔽域。掩蔽功能可涉及前藥抗體結合至第一目標(諸如組織因子、紅血球或白蛋白)。當抗TFPI前藥抗體是呈其潛在形式，則對TFPI沒有結合或結合顯著減少，直到掩蔽區被由凝血級聯產生的蛋白酶所切割，如圖1中所示。已設計出不同形式的前藥抗體。雖然所有形式包括Fc區(其容許FcRn結合，以提供較長的半衰期)，可變區可以進行修改，包括串聯連接的可變區、scFv-可變區融合、肽可變區融合等。這些前藥抗體的代表圖顯示於圖2中。目前預想的前藥抗體的親本抗體是從人類抗體庫所發現。這些抗體已被廣泛地最佳化，以提高他們的親和力和功能性。親本抗體，gA200和gB9.7，對人類TFPI具有高親和力和特異性，促進組織因子(TF)啟動凝血。
掩蔽方法學 A. 組織因子結合
組織因子(TF)是存在於內皮下組織與白血球的蛋白質，對於引發從酶原凝血酶原形成凝血酶是必要的。組織因子僅在發生損傷時暴露於血流中從而啟動凝血。因此，靶定TF允許在損傷部位的抗TFPI前藥抗體活化。併入抗TFPI前藥抗體之TF結合掩蔽域可以是不阻斷TF功能的TF結合抗體、肽或另一種支架。
B. 抗紅血球結合
RBC(紅血球)已被用來作為遞送藥物或酶的載體或貯器。RBC是生物可相容的、生物可分解，具有長循環半衰期，並可以加載多種生物活性物質。使用抗體的表面修飾已被證實可以改善它們的目標特異性和增加其循環半衰期。在本發明中，抗RBC抗體被用作融合至抗TFPI抗體的N-末端的掩蔽域。此抗TFPI前藥抗體產生具有比未修飾親本抗TFPI抗體的潛伏循環時間更長的前藥。前藥對RBC的結合將進一步降低其結合TFPI的能力直到掩蔽域被切割。
C. 白蛋白結合肽
白蛋白已經成為一種用於治療和診斷劑的通用載體，主要用於診斷和治療糖尿病、癌症、類風濕性關節炎和感染性疾病。人類血清白蛋白在體內是最豐富的蛋白質，在循環中具有約40mg/mL的濃度。白蛋白具有67kDa的分子量。白蛋白結合部分可以用作融合至抗TFPI抗體的N-末端的掩蔽域，從而產生具有比親本抗TFPI抗體的與潛伏循環時間更長的抗TFPI前藥抗體。雖然有白蛋白結合肽用於前藥構築體，但白蛋白結合部分可以是肽、天然白蛋白結合域、支架、抗體或抗體片段(諸如Fab、scFv、域抗體和其他衍生物)。
D. 蛋白酶的篩選及切割位點的設計
當損傷發生時，組織因子(TF)變成暴露於血流並活化因VII以形成TF/FVIIa複合體。TF/FVIIa複合體從而活化因子X和FXa，將凝血酶原活化為凝血酶，導致纖維蛋白形成且血液凝固。組織因子路徑的主要作用是產生一個「凝血酶爆發(thrombin burst)」，其中凝血酶(凝血級聯中因為它的回饋活化作用而為最重要的組成)瞬間釋放的一個過程。此外，一系列其他凝血因子在凝血級聯中被活化：
˙TF-FVIIa活化FIX與FX。
˙FVII本身被凝血酶、FXIa、FXII及FXa所活化。
˙FXa及其輔因子FVa形成凝血酶原(prothrombinase)複合物，其將凝血酶原活化成凝血酶。
˙凝血酶接著活化凝血級聯的其他組分(包括FV與FVIII)，活化將結合至vWF的FVIII釋放。最後，凝血酶活化FXI，其又活化FIX。
˙FVIIIa是FIXa的輔因子，且它們一起形成活化FX的「X酶(tenase)」複合體；且因此持續循環。(「X酶」是用於酶之「十」與後綴「-酶」的縮寫)。
許多前述蛋白酶(諸如FVIIa、FXa及凝血酶)可用於活化抗TFPI前藥抗體。在本發明中，FXa和凝血酶的切割位點被設計成掩蔽域，但是可以預想的是，任何提及的其他蛋白酶也可併入抗TFPI前藥抗體中。
實例2.前藥抗體的載體圖譜
九個gA200-前藥重鏈(HC)和六個gA200輕鏈變體(LC)是使用Infusion cloning(Clontech)構築至表現質體pTTF5中。所有變體包含FXa的六個胺基酸切割位點EGRTAT。突變蛋白在切割位點兩側含有各種N-末端和C-末端缺失。HC1突變蛋白和LC1突變蛋白的代表性質體圖譜顯示於圖3A-B中。15個輕鏈和重鏈變體的DNA序列分別顯示於圖12中。HC突變蛋白被命名為HC1至HC9，LC突變蛋白被命名為LC1至LC6。與抗TFPI融合之scFV(抗RBC或抗TF)的代表性質體載體圖譜顯示於圖4A-4C中，而與抗TFPI稠合之白蛋白結合肽的代表性質體載體圖譜顯示於圖5A-B中。圖13-14提供包含帶有經工程化切割位點的各種輕鏈和重鏈組合之構築體的序列。
實例3-表現與生產前藥抗體
當中國倉鼠卵巢細胞用作為宿主細胞時，使用Amaxa的核轉染(Neucleofection)技術進行轉染。簡言之，將每個反應2×106個細胞以1000rpm離心5分鐘成丸粒。細胞丸粒再懸浮於每個反應100μl的Nucleofector溶液V中。分別將2μg的pQM1-3E10sc-gA200HC與pQM1-gA200LC、pQM1-Ter119sc-gA200HC與pQM1-gA200LC，或pQM1-56E4-gA200HC與pQM1-56E4-gA200LC加入到細胞中。然後將溶液V中的DNA/細胞轉移到Nucleocuvette容器。在Nucleofector®中使用程式U024進行電穿孔。電穿孔 之後，立刻將0.5mL溫熱培養基加入到細胞中，然後轉移至含有每孔4.5mL預熱的Qmix1培養基(無抗生素)的6孔盤，並放回37℃培養箱的震動器上。在轉染後3-4天測定前藥抗體的表現。對於陽性表現細胞，生成穩定的池。將細胞稀釋至0.5×106/mL，並添加G418達0.7mg/mL。一旦細胞密度達到3-4 x 106/mL，將細胞再次稀釋至0.4x106/mL並全時維持在含有0.7mg/mL的G418的Qmix1中。在篩選了大約兩週之後是生產階段。當細胞生存力恢復至>95%，且細胞密度達到3.5-4 x 106/mL，將培養溫度轉換至30℃。溫度轉換後4-7天收取條件培養基。透過在5000rpm下離心30分鐘來移除細胞。使用Millipore濃縮器將條件培養基濃縮5倍，接著在9000rpm下額外離心40分鐘。
當HEK293-6E細胞作為宿主細胞時，它們被保持在補充有4mM L-麩醯胺酸、0.1% Pluronic F68，和25mg/L G418的F17培養基中作為懸浮培養物。使用聚乙烯亞胺(PEI，25KD，線性)進行轉染。簡言之，在轉染前一天接種1×106細胞/ml。於轉染當天，調整細胞密度至1.7×106/ml。為了轉染1L細胞，0.5mg的每個VEC-4581和VEC-4568(用於TPP2652)，或VEC-4583和4568(用於TPP2654)稀釋於500ml的F17培養基中，而2ml的PEI(PEI原液為1mg/ml)稀釋於500ml的F17中。合併稀釋的DNA和PEI，且在於室溫下10'培育之後添加至細胞。然後將細胞放回至37℃培養箱的125rpm震動器上。轉染後24小時，用1%超低IgG FBS以及0.5mM丙戊酸餵養細胞。轉染後3-4天測定前藥抗體的表現，並且在細胞活力下降到70%時終止表現。透過在2000rpm下離心十分鐘收取條件培養基以移除細胞，並隨後在9000rpm下額外離心40分鐘。
實例4-純化抗TFPI前藥抗體
使用MabSelect蛋白A管柱(5mL HiTrap，GE HealthCare，# 28-4082-55)從CHO細胞條件培養基中純化前藥蛋白。培養基藉由超過濾被濃縮5至10倍，或不經濃縮就使用。以1-1.5mL/分的流速將培養基泵送到管柱之前，將管柱以「平衡緩衝液」(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.0) 進行平衡。加載之後，用5到10倍管柱體積(CV)的平衡緩衝液以4mL/分的流速洗滌管柱。然後以「醋酸洗滌緩衝液」(50mM醋酸鈉，150mM NaCl，pH 5.4)進行再平衡。
使用三個步驟溶離以1mL/分的流速從管柱溶離出結合的蛋白：(1)50mM醋酸鈉，150mM NaCl，pH 3.4；(2)50mM醋酸鈉，150mM NaCl，pH 3.2；以及(3)100mM甘胺酸-HCl，pH 3.0。將溶離份(1mL/溶離份)收集到含有1ml「調配緩衝液」(50mM醋酸鈉，50mM NaCl，pH 5.4)的小管中以提高pH。用100mM甘胺酸，pH 2.8再生管柱，然後用dH2O洗滌並保存於20%乙醇中。
含有蛋白質的溶離份(如透過在280nm下的吸光度監測來確定)被集中且緩衝液藉由在4℃下過夜透析或通過旋轉去鹽管柱交換到調配緩衝液中。最終蛋白質溶液的濃度是藉由使用10kDa濃縮器的超過濾來達致。在濃縮或透析期間可能形成任何的沉澱物是透過在2000xg下離心30分鐘而去除。最終樣本是使用0.22mm匣予以無菌過濾。
經純化蛋白質是藉由SDS-PAGE、分析型尺寸篩除層析(aSEC)以及西方墨點來進行特徵鑑定。亦測量內毒素含量。依據aSEC以及SDS-PAGE的純度通常大於90%。SDS-PAGE顯示於圖6中。
實例5-GA200及56E4-GA200活體外TFPI結合ELISA
在4℃下將Maxisorb 96孔盤(Nunc)上塗覆1μg/mL於PBS中之TFPI過夜。在室溫下將該盤於5%無脂奶粉PBS/0.5%Tween-20中阻斷歷時1小時。未經消化抗體和經消化抗體的連續3倍稀釋液加入各孔中(100μL/孔)並在室溫下培育歷時1小時。以PBS-T將盤洗滌5次。添加偵測用二級抗Fab-HRP結合抗體(100μL的1：10,000稀釋)與Amplex Red(Invitrogen)溶液。HSA結合前藥抗體比其親本抗TFPI抗體gA200略微減少對TFPI的結合，可在圖7中看出。
實例6-TER119SC-GA200前藥抗體的RBC結合ELISA
ELISA被用來測試前藥抗體對RBC的結合。透明96孔Maxisorp微量滴定盤的孔中以107/mL的濃度塗覆100μL再懸浮於DPBS中的鼠鬼RBC(不含Ca或Mg)。用膠帶密封盤，並在4℃下培育過夜。用DPBST(DPBS+0.05% Tween 20)洗滌孔一次，然後在室溫下以5%牛奶/DPBST阻斷歷時1小時。阻斷緩衝液被丟棄且每孔添加50μL的經稀釋樣品。樣品在PBS中連續地1：3稀釋。在室溫下培育盤歷時1小時，然後用DPBST快速洗滌5x。每孔加入1：5000稀釋於PBST中的100μL二級抗體(HRP-山羊抗hFAB，Jackson ImmunoResearch，cat # 109-035-097)。在室溫下培育盤歷時1小時，然後用DPBST洗滌5X。添加HRP受質(Amplex Red，Invitrogen A22177)，並於SpectraMax M2e(Molecular Devices)上在485nM的激發波長和595nM的發射波長處取得螢光讀值。可以在圖8中看到結合到RBC的前藥抗體濃度超過10nM。
實例7-抗TFPI前藥抗體的BIACORETM分析
方法.使用胺偶合套組依據製造商說明將人類TFPI固定在CM4或CM5晶片上。在有或沒有15μg/mL人類血清白蛋白(HSA)的情況下，以10μg/mL抗體使抗TFPI前藥抗體或親本抗TFPI抗體通過該系統。在每次注射完成後，以2秒測量結合水平。在動力學分析中，以一系列濃度注射抗體，隨後為30-分解離時間。抗體的解離與締合速率是採用BiaEvaluation軟體來建立模型。
結果. 圖9顯示結合至人類TFPI的不同前藥抗體。如圖9中所示，在HSA不存在的情況下，ABP-gA200前藥抗體以179反射單位(RU)結合至TFPI，而在HSA存在的情況下，訊號降低80%達36RU。相反地，人類白蛋白不會明顯影響親本抗體gA200結合至TFPI。
RBC結合前藥抗體Ter119scFv-gA200以與gA200相同的水平結合至TFPI，而TF結合前藥抗體3E10scFv-gA200以22%的殘留水平結合至TFPI。
為了進一步測量彼等前藥抗體的結合，進行動力學分析以測量親和力。如表1a中所示，抗TF前藥抗體3E10scFv-gA200以及抗RBC前藥抗體Ter119scFv-gA200分別以29.71倍與14.66倍降低對TFPI的結合。白蛋白結合前藥抗體ABP-gA200不會降低對TFPI的結合，但在與HSA混合並培育之後，其對TFPI的結合也降低15.34倍。
為了進一步最佳化ABP-gA200的切割，修飾ABP-gA200的切割位點。不同的切割位點被插入白蛋白結合肽和重鏈可變區之間。如圖14a-b中所示，間隔子GGGGS被插入至切割位點周圍。而TPP-2651、TPP-2652、TPP-2653和TPP2655含有凝血酶切割位點，TPP-2654包含可被FXa和凝血酶所切割的連接子。如表1b中所示，在人類或猴白蛋白存在的情況下，這些抗體降低它們對TFPI的結合至高達28.6倍(TPP-2654)和39.6倍(TPP-2652)，而親本抗體gA200在白蛋白不存在或存在的情況下具有類似的TFPI結合親和力。沒有顯示TPP-2653的數據。純化前藥抗體並藉由蛋白酶予以消化(無論是凝血酶或因子Xa)。移除這些蛋白酶之後，使用LC-MS分析抗體。結果指明，蛋白酶切割白蛋白結合肽。TPP-2652和TPP-2654的代表性數據顯示於圖16a-C中。
為了進一步平衡抗TFPI前藥的切割效率以及掩蔽功能，吾人改變連接子長度並截短抗體gA200的FR1域。帶有ABP的前藥的胺基末端序列顯示於圖14中。
實例8-抗TFPI前藥抗體的凝血酶生成分析
TFPI前藥抗體的凝血酶生成分析(TGA)是利用人類HemA血漿來進行。缺乏血小板血漿(PPP)試劑和校準品是以1mL蒸餾水還原。1：2連續稀釋的抗TFPI前藥抗體(從100nM的最終濃度至1.56nM)被添加至HemA人類血漿。只有血漿的樣品用作為對照。在96-孔TGA盤中，加入20μL的PPP試劑或校準品至各孔中，然後加入80μL含有不同濃度抗TFPI前藥抗體的血漿樣品。該盤置於TGA儀器中，然後儀器自動在每個孔中分配20μL的FluCa(Fluo受質+CaCl2)。測定凝血酶生成歷時60分鐘。當Ter119scFv-gA200在TGA中測試時，HemA血漿中摻入小鼠RBC血影(RBC ghost)。Ter119scFv-gA200在室溫下與RBC-GOLD一起培育歷時15分鐘。
如圖10A-B中所示，56E4-gA200產生比其親本抗體gA200還低的凝血酶峰，指明血漿中的人類白蛋白可能會降低抗TFPI的活性。由56E4gA200產生的凝血酶形狀是低的且寬峰也指明該抗體是在時間為零時的活性較低，並且可能因為所生成的FXa或凝血酶而變得活化。
在生理條件下，前藥TFPI抗體轉化為更具有活性的TFPI抗體的可行性是藉由下列來建立：1)外源性凝血酶(生理水平)增加TFPI Ab媒介的TGA反應的能力，以及2)在TGA反應中產生FXa和凝血酶並監控隨後在TFPI抗體引起之反應中的增加。
在生理學可達到的水平下，外源性凝血酶添加直接評估前藥TFPI抗體對酶的易感性，並且是將1200nM Ab與0.5至2.5U/mL凝血酶一起預先培育歷時1小時，接著是使用0.5至2.5U/mL凝血酶特異性不可逆抑制劑水蛭素來不活化凝血酶歷時1小時。為了衡量在TGA反應中水蛭素殘留的影響，用緩衝液取代凝血酶來評估水蛭素殘留對TGA反應的影響。在一些情況下，不相關Ab或親本抗體gA200(無白蛋白掩蔽序列或蛋白酶敏感性位點)用來代替原TFPI Ab作為對照。抗體-凝血酶-水蛭素混合物連續稀釋至10至100nM的Ab濃度，並且在TGA反應中將混合物額外1：10稀釋。如上所述進行TGA反應，不同之處在於所用的引發劑是PPP-Low，其含有1pM TF-4μM血小板。那些使用前藥TFPI抗體的TGA結果要減去使用不相干抗體的TGA結果。
前TFPI Ab TPP-2654在蛋白酶切割之前和之後的TGA概況顯示於圖10C中。親本gA200的TGA反應是不因凝血酶培育而改變，而TPP-2654(其中含有凝血酶和FXa敏感性切割位點)顯示與凝血酶一起預先培育時增加反應。然而，峰TGA反應是小於使用gA200，指明TFPI Ab活性的完整揭露可能需要更高水平的凝血酶存在或最佳化的蛋白酶敏感性位點，以增加蛋白酶切割的效率。
使用某個範圍的凝血酶濃度(0.5至2.5U/mL)的濃度滴定實驗確定，在1U/mL凝血酶下，前藥TFPI抗體轉換成更具活性的TFPI抗體可以達致最高，在活體內可達到的水平(圖10D)。
為了評估FXa或凝血酶能否更有效率地將前藥抗體轉化為活性TFPI抗體，特別是在含有蛋白酶敏感性位點的前藥抗體中，評估原位增加FXa和凝血酶的影響。FXa原位生成是透過增加用作引發劑之TF的濃度而增加。在這些實驗中，TF濃度藉由使用PPP-Low(1pM TF-4μM PL)或PPP試劑(5pM TF-4μM PL)作為引發劑在TGA反應中從1pM改變至5pM。增加TF將透過TF-FVIIa的直接作用而增加FXa，然後增加凝血酶生成。如上所述實施TGA反應，且藉由比較使用1pM與5pM TF的TGA反應之間的反應差異來分析結果。
TPP-2654的FXa和凝血酶易感性在1pM和5pM TF引發劑之間的峰凝血酶反應差異(△峰)有明顯增加(圖10E)，尤其是前藥TFPI抗體與2.5U/mL一起預先培育的情況下。前TFPI Ab TPP-2654增加峰凝血酶反應的能力更超出初始凝血酶預先培育所達到的反應，指明FXa切割可進一步促進白蛋白結合肽完整揭露。
原TFPI Ab(TPP-2652)(其中掩蔽白蛋白結合肽因為凝血酶切割而移除)的TGA反應顯示於圖10F和10G中。TPP-2652的凝血酶敏感性如圖10F中所示，指明在測試凝血酶的最大濃度(2.5U/mL)下，在測試抗體的最高水平下於TGA反應中偵測到僅有少量增加。藉由增加用於啟動TGA之TF濃度來增加的FXa(和凝血酶)僅略微增加TPP-2652的TGA反應(圖10F)。這與在經凝血酶預先處理的TPP-2654進一步暴露於使用5pM TF所生成的FXa時，TPP-2654的凝血酶反應大幅增加呈對比(比較圖10E與圖10G)。
這些結果暗示，不同的蛋白酶敏感性位點可能影響前藥TFPI抗體轉換成活性TFPI Ab。
實例9-抗TFPI前藥抗體的FXA分析 材料與方法
下列試劑用於FXa分析：
分析緩衝液：1X緩衝液為25mM Hepes 7.4、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1% BSA。
TFPI-R&D(Cat# 2974-PI，MW~35kDa)。TFPI是依照產品插頁說明藉由添加10μL的25mM Tris與150mM NaCl，pH 7.5還原成100μg/mL(2.86μM)。2.86μM原液1/143稀釋而生成20nM工作原液。
FXa-Haematologic Technologies(Cat# HCX-0060，MW-58.9kDa)預先在分析緩衝液中製作原液2μM等分式樣並儲存在-80℃下。2μM原液1/1000稀釋作為2nM工作原液。
S-2765-Chromogenix(Cat # S-2765，MW-714.6Da)藉由將25mg凍乾材料溶解於7mL蒸餾水中而生成5mM工作原液。直接將5mM工作原液添加至分析孔中。
在分析緩衝液中產生抗TFPI抗體的4X劑量曲線。60μL的每種抗體的濃度與4X(20nM)濃度的TFPI合併。在室溫下培育抗體/TFPI混合物歷時30分鐘。120μL的2X(2nM)濃度的FXa被添加至Ab/TFPI混合物，並在室溫下培育歷時30分鐘。Ab/TFPI/FXa混合物然後以二重複的方式以每孔100μL轉移至分析盤，隨後為20μL的5mM受質。立刻在Molecular Devices Spectramax盤讀取儀中在405nm下以動力學的方式讀取盤歷時3分鐘。當結合白蛋白的抗TFPI前藥抗體56E4-gA200進行測試時，34μL的8X抗TFPI抗體在96孔圓底聚丙烯盤中組合不同濃度的34μL白蛋白。然後在室溫下培育該溶液歷時15分鐘並將68μL的20nM(4X)TFPI添加至α-TFPI Ab/白蛋白。
如圖11中所示，gA200的Vmax未受到人類或猴白蛋白影響。結合白蛋白的前藥抗體56E4-gA200隨著白蛋白濃度增加而降低Vmax。當人類或猴白蛋白濃度達到5μM時，前藥抗體的抗TFPI活性有90%受到抑制。
實例10-抗TFPI前藥抗體的蛋白酶消化
針對前藥的蛋白酶切割以及蛋白酶耗盡使用Novagen凝血酶切割捕獲套組(69022-3)以及Novagen因子Xa套組(69037-3)。
如下簡述般將生物素化凝血酶用於前藥切割。
各個前藥的50uL反應含有5μg前藥、5μL 10x套組凝血酶切割/捕獲緩衝液、1單位凝血酶，去離子水補至50μL。在37℃下培育反應歷 時1小時。切割反應後，將生物素化凝血酶用為每單位酵素16ml靜置樹脂(50%漿液的32ml)的比率以卵白素瓊脂糖(套組中提供)予以移除。瓊脂糖加入到反應管中之後，在室溫下培育管歷時30分鐘並輕輕搖動。整個反應轉移至套組提供的樣品杯與旋轉過濾器。然後在500×g下離心管歷時5分鐘。收集管中的濾液含有被切割的前藥，無生物素化凝血酶。
當因子Xa用於前藥切割時，每個前藥的50μL反應含有5μg前藥、5μL 10x套組因子Xa切割/捕獲緩衝液、1單位因子Xa和去離子水補至50μL總體積。在37℃下培育反應歷時1小時。在切割反應後，以XarrestTM瓊脂糖(套組內提供)移除因子Xa。Xarrest瓊脂糖先藉由每靜置樹脂體積的Xarrest瓊脂糖加入11倍體積的1x因子Xa切割/捕獲緩衝液予以平衡。Xarrest瓊脂糖在1000×g下離心歷時5分鐘。移除上清液並丟棄。將瓊脂糖再懸浮於10倍體積的1X因子Xa切割/捕獲緩衝液，並在1000×g下離心歷時5分鐘。移除上清液並丟棄。一個靜置樹脂體積的1X Xa因子切割/捕獲緩衝液被添加至管且將樹脂充分再懸浮。所製備的Xarrest瓊脂糖被轉移到具有2ml旋轉過濾器的樣品杯(包含在套組內)。前藥切割反應的總體積加入到所製備的Xarrest瓊脂糖。在室溫下培育管歷時5分鐘，並在1000×g下離心歷時5分鐘以除去Xarrest瓊脂糖。結合的因子Xa被保留在樣品杯中，並切割的前藥在離心期間流入濾液管中。
實例11-抗TRPI前藥抗體的LC-MS
在完整或還原條件下進行抗TFPI前藥抗體TPP-2652與TPP-2654的LC-MS分析。就完整蛋白質而言，直接加載2μg至PLRP管柱。關於還原樣品而言，在加載至PLRP管柱之前，測試樣品已在37℃下使用10mM DTT處理歷時30分。
使用Agilent 1200 Capillary LC System與PLRP-S(8μm 4000A，0.3x150mm)在70℃下進行LC分離。LC的緩衝系統為A：水加0.1%甲酸+0.01%TFA，B：乙腈加0.1%甲酸+0.01%TFA，流速10μL/min。梯度：2分內10% B，15分內90%B，90%B歷時5分，10%B平衡歷時10分。
使用Agilent 6520 Q-TOF系統施行MS分析。條件為DualEsi源，氣體溫度：350℃，乾燥氣體：7psi，噴霧器：10psi，掃瞄範圍：500-3000amu，1譜/s。每個循環兩個實驗：還原形式為3500v，175v切割電壓，65v錐孔電壓，而完整蛋白質為4000v、350v切割電壓，100v錐孔電壓。參考離子：1221.990637與2421.91399amu，50ppm窗，Min 1000純化前藥抗體並藉由蛋白酶(凝血酶或因子Xa)消化。移除這些蛋白酶之後，使用LC-MS分析抗體。結果指明，蛋白酶切割白蛋白結合肽。TPP-2652與TPP-2654的代表性數據顯示於圖16a-c中。
所有本文揭示和請求的組合物和方法可以在根據本揭示內容來做出與進行而無須過度實驗。儘管本發明的組合物和方法已說明了較佳具體例，對於習於技藝者來說各種變化可以應用於所述組合物和方法中，以及在本文所述方法的步驟或步驟順序中而不脫離本發明的概念、精神和範疇。更具體而言，某些在化學和生理學上相關的試劑明顯可置換本文所述試劑而達到相同或相似的結果。所有這些類似的替代和修改對於習於技藝者來說顯然被認為是落在隨附申請專利範圍所定義之本發明的精神、範疇與概念內。
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<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<212> PRT
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<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<212> PRT
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<223> 蛋白酶切割位點
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<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<212> PRT
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<223> 蛋白酶切割位點
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<223> 蛋白酶切割位點
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<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<212> PRT
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<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<212> PRT
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<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 109
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 112
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 113
<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 114
<210> 115
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 115
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 116
<210> 117
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 117
<210> 118
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 118
<210> 119
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 119
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 120
<210> 121
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 121
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 122
<210> 123
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 123
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 124
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 125
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 126
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 127
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 128
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 129
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 130
<210> 131
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-1輕鏈
<400> 131
<210> 132
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點及連接子
<400> 132
<210> 133
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-1重鏈
<400> 133
<210> 134
<211> 1590
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼Fab-1的序列
<400> 134
<210> 135
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-2輕鏈
<400> 135
<210> 136
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-2重鏈
<400> 136
<210> 137
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 137
<210> 138
<211> 1530
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-2編碼序列
<400> 138
<210> 139
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子1，輕鏈胺基酸序列
<400> 139
<210> 140
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子1，重鏈胺基酸序列
<400> 140
<210> 141
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子1，輕鏈DNA序列
<400> 141
<210> 142
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子1，重鏈DNA序列
<400> 142
<210> 143
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子2，輕鏈胺基酸序列
<400> 143
<210> 144
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子2，重鏈胺基酸序列
<400> 144
<210> 145
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子2，輕鏈DNA序列
<400> 145
<210> 146
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子2，重鏈DNA序列
<400> 146
<210> 147
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶切割位點
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(2)
<223> Xaa=疏水性胺基酸
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(6)
<223> Xaa=非酸性胺基酸
<400> 147
<210> 148
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子Xa切割位點
<220>
<221> 變體
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=Glu或Asp
<400> 148
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 149
<210> 150
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：133的胺基酸95-152
<400> 150
<210> 151
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 151
<210> 152
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 152
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 153
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 154
<210> 155
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 155
<210> 156
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 156
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 157
<210> 158
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 158
<210> 159
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 159
<210> 160
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 160
<210> 161
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 161
<210> 162
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 162
<210> 163
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 163
<210> 164
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 164
<210> 165
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 165
<210> 166
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 166
<210> 167
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 167
<210> 168
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 168
<210> 169
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 169
<210> 170
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 170
<210> 171
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 171
<210> 172
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 172
<210> 173
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 173
<210> 174
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 174
<210> 175
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 175
<210> 176
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 176
<210> 177
<211> 442
<212> PRT
<213> 智人
<400> 177
<210> 178
<211> 212
<212> PRT
<213> 智人
<400> 178
<210> 179
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶可切割抗-TFPI scFv抗體
<400> 179
<210> 180
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶可切割抗-TFPI scFv抗體編碼序列
<400> 180
<210> 181
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 181
<210> 182
<211> 565
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 182
<210> 183
<211> 561
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 183
<210> 184
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 184
<210> 185
<211> 562
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 185
<210> 186
<211> 558
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 186
<210> 187
<211> 563
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 187
<210> 188
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 188
<210> 189
<211> 555
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 189
<210> 190
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 190
<210> 191
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 191
<210> 192
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 192
<210> 193
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 193
<210> 194
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 194
<210> 195
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 195
<210> 196
<211> 690
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 196
<210> 197
<211> 683
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 197
<210> 198
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 198
<210> 199
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 199
<210> 200
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 200
<210> 201
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 201
<210> 202
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 202
<210> 203
<211> 700
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 203
<210> 204
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 204
<210> 205
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 205
<210> 206
<211> 710
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 206
<210> 207
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 207
<210> 208
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 208
<210> 209
<211> 565
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 209
<210> 210
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 210
<210> 211
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 211
<210> 212
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 212
<210> 213
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 213
<210> 214
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 214
<210> 215
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 215
<210> 216
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 216
<210> 217
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 217
<210> 218
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 218
<210> 219
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 219
<210> 220
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 220
<210> 221
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 221
<210> 222
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 222
<210> 223
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 223
<210> 224
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 224
<210> 225
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 225
<210> 226
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 226
<210> 227
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 227
<210> 228
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 228
<210> 229
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 229
<210> 230
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 230
<210> 231
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 231
<210> 232
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 232
<210> 233
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 233
<210> 234
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 234
<210> 235
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 235
<210> 236
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 236
<210> 237
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 237
<210> 238
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 238
<210> 239
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 239
<210> 240
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 240
<210> 241
<211> 82
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 241
<210> 242
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 242
<210> 243
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 243
<210> 244
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 244
<210> 245
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 245
<210> 246
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 246
<210> 247
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 247
<210> 248
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 248
<210> 249
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 249
<210> 250
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 250
<210> 251
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 251
<210> 252
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 252
<210> 253
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 253
<210> 254
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 254
<210> 255
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 255
<210> 256
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 256

Claims (35)

  1. 一種抗體，包含：(a)第一可變域，包括第一輕鏈與第一重鏈可變區，該第一可變域結合至組織因子路徑抑制劑(TFPI)；(b)連接到該第一輕鏈及/或第一重鏈可變區的胺基末端的掩蔽域；及(c)蛋白酶可切割連接子，其插入該第一輕鏈及/或第一重鏈可變區和該掩蔽域(masking domain)之間。
  2. 如請求項1之抗體，其中該蛋白酶可切割域是凝血酶、血纖維蛋白溶解酶、因子VIIa或因子Xa切割位點。
  3. 如請求項1之抗體，其中該掩蔽域包含第二可變域，該第二可變域包括第二輕鏈與第二重鏈可變區。
  4. 如請求項1之抗體，其中該抗體是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD以及IgE抗體。
  5. 如請求項1之抗體，其中該抗體是人類或人類化抗體。
  6. 如請求項1之抗體，其中該抗體是單鏈抗體。
  7. 如請求項1之抗體，其中該抗體為二價並且包含兩個掩蔽域，一個連結到各個第一輕鏈可變區的胺基末端。
  8. 如請求項1之抗體，其中該抗體為二價並且包含兩個掩蔽域，一個連結到各個第一重鏈可變區的胺基末端。
  9. 如請求項1之抗體，其中該抗體為二價並且包括四個掩蔽域，一個連結到各個第一輕鏈可變區和各個第一重鏈可變區的胺基末端。
  10. 如請求項9之抗體，其中兩個掩蔽域是第二個輕鏈可變區，而兩個掩蔽域是第二重鏈可變區，其中該第二輕鏈和重鏈可變區形成第二可變域。
  11. 如請求項3或10之抗體，其中該第二可變域結合至組織因子(TF)、紅血球或白蛋白。
  12. 如請求項1、7或8之抗體，其中該掩蔽域是白蛋白結合肽或蛋白。
  13. 一種表現載體，包含如請求項1至12中之抗體之受啟動子控制的編碼區。
  14. 一種細胞，包含如請求項13之表現載體。
  15. 一種醫藥組合物，包含如請求項1至12中之抗體與醫藥上可接受緩衝劑、載劑或稀釋劑一起調配。
  16. 一種在個體中治療凝血障礙的方法，包含向該個體投與數量足以在該個體中促進凝血的抗體，該抗體包含：(a)第一可變域，包括第一輕鏈與第一重鏈可變區，該第一可變域結合至組織因子路徑抑制劑(TFPI)；(b)連接到該第一輕鏈及/或第一重鏈可變區的胺基末端的掩蔽域；及(c)蛋白酶可切割連接子，其插入該第一輕鏈及/或第一重鏈可變區和該掩蔽域之間。
  17. 如請求項16之方法，其中該蛋白酶可切割域是凝血酶、血纖維蛋白溶解酶、因子VIIa或因子Xa切割位點。
  18. 如請求項16之方法，其中該掩蔽域包含第二可變域，該第二可變域包括第二輕鏈與第二重鏈可變區。
  19. 如請求項16之方法，其中該個體為人類。
  20. 如請求項16之方法，其中該個體為非人類哺乳動物。
  21. 如請求項16之方法，其中該抗體為單鏈抗體。
  22. 如請求項16之方法，其中該抗體為二價並且包含兩個掩蔽域，一個連結到各個第一輕鏈可變區的胺基末端。
  23. 如請求項16之方法，其中該抗體為二價並且包含兩個掩蔽域，一個連結到各個第一重鏈可變區的胺基末端。
  24. 如請求項16之方法，其中該抗體為二價並且包括四個掩蔽域，一個連結到各個第一輕鏈可變區和各個第一重鏈可變區的胺基末端。
  25. 如請求項24之方法，其中兩個掩蔽域是第二個輕鏈可變區，而兩個掩蔽域是第二重鏈可變區，其中該第二輕鏈和重鏈可變區形成第二可變域。
  26. 如請求項18或25之方法，其中該第二可變域結合至組織因子(TF)、紅血球或白蛋白。
  27. 如請求項16、22或23中任一項之方法，其中該掩蔽域是白蛋白結合蛋白。
  28. 如請求項16之方法，其中該個體患有外傷、血友病或癌症。
  29. 如請求項16之方法，其中該個體患有A型或B型血友病。
  30. 如請求項16之方法，其中該抗體被全身性地投與。
  31. 如請求項16之方法，其中該抗體被局部或區域性地投與至出血位點。
  32. 如請求項16之方法，其中該抗體被皮下、靜脈內或動脈內投與。
  33. 如請求項16之方法，其中該抗體為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD以及IgE抗體。
  34. 如請求項16之方法，其中該抗體為人類或人類化抗體。
  35. 如請求項16之方法，其中該抗體結合至人類組織因子路徑抑制劑的Kunitz域2。
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