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TW201503898A - 神經浸潤抑制劑 - Google Patents

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TW201503898A
TW201503898A TW103137144A TW103137144A TW201503898A TW 201503898 A TW201503898 A TW 201503898A TW 103137144 A TW103137144 A TW 103137144A TW 103137144 A TW103137144 A TW 103137144A TW 201503898 A TW201503898 A TW 201503898A
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TW
Taiwan
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antibody
inhibitor
receptor
infiltration
pancreatic cancer
Prior art date
Application number
TW103137144A
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English (en)
Inventor
Shuichi Mitsunaga
Atsushi Ochiai
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Japan Government
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Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd, Japan Government filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本發明發現胰臟癌神經浸潤模式中，藉由抑制IL-6而抑制神經浸潤。而且確定人胰臟癌細胞株表現IL-6受體，及IL-6增進胰臟癌細胞的趨化能力、移動能力及細胞內訊息，發現抑制IL-6可治療胰臟癌。再者，藉由投予小鼠神經浸潤模式IL-6抑制劑，發現可抑制人胰臟癌的神經浸潤。

Description

神經浸潤抑制劑
本發明關於神經浸潤抑制劑，更詳細地關於以介白素6(IL-6)抑制劑為有效成分的神經浸潤抑制劑。
介白素6(IL-6)又稱為B細胞刺激因子2(BSF2)或干擾素β2的細胞激素。IL-6被發表為B淋巴球系細胞活性化相關的分化因子(非專利文獻1)，之後了解其為影響多種細胞功能的多功能細胞激素(非專利文獻2)。IL-6已知誘導T淋巴球系細胞成熟化(非專利文獻3)。
IL-6經由細胞上兩種蛋白質傳達其生物活性。其中一種為，與IL-6結合的配體(ligand)結合性蛋白的IL-6受體，分子量約80kD(非專利文獻4、5)。IL-6受體除了為貫穿細胞膜表現於細胞膜上的膜結合型以外，主要以細胞外區域所形成的可溶型IL-6受體存在。
另一種蛋白為關於非配體結合性訊號傳遞的膜蛋白gp130，分子量為130kD。IL-6與IL-6受體形成IL-6/IL-6受體複合體，之後藉由與gp130結合，使IL-6生物活性傳遞至細胞內(非專利文獻6)。
胰臟癌目前多數病例在被診斷時為不能切除的狀態，或者唯一可治癒的切除病例中多數在術後早期再復發。不 能切除的病例中，行為能力狀態(performance status；PS)或主要臟器功能良好者，可適應化學治療，但是即使以目前的治療標準，治療效果仍然不佳。例如，第一位選擇藥為健擇(gemcitabine)鹽酸鹽，症狀緩和效果的有效率為23.8%，存活時間的中間值為5.7個月，1年的存活率為18%(海外臨床第3名試驗結果)。日本一年有20000人診斷為胰臟癌，死亡人數為22,260人(根據2004年的厚生勞動省人口動態調查)，為癌症死因第5位。
神經浸潤為胰臟癌的特徵浸潤形式之一，胰臟癌中約100%認為有神經浸潤，神經浸潤為重要的預後因子，神經浸潤導致肝細胞功能異常，造成貧血、行為能力狀態(performance status；PS)變差、或營養不良等與惡液質症狀相關者，是至今本發明人所知者。各文獻指出，神經浸潤為癌性疼痛等原因，或神經浸潤好發部位的放射線照射，或該上方位置切除神經可獲得一定的症狀控制等。然而，神經浸潤的機制及起因於神經浸潤的症狀之表現機制，確實不了解，因此現狀缺乏對神經浸潤的控制及神經浸潤所引起的症狀機制之了解。另一方面，神經浸潤被認為廣泛存在各癌症種類，已知在前列腺癌、胃癌、頭頸癌中為預後因子。
與本案發明相關的先前技術文獻資料如下所示。
【先前技術文獻】
【非專利文獻】
【非專利文獻1】Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76.
【非專利文獻2】Akira, S. et al., Adv. In Immunology(1993) 54, 1-78.
【非專利文獻3】Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988)167, 1253-1258.
【非專利文獻4】Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981.
【非專利文獻5】Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828.
【非專利文獻6】Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581.
因此，本發明提供新穎的神經浸潤抑制劑。本發明並提供新穎的胰臟癌治療劑。
本發明人等為了解決上述課題致力研究的結果，發現在胰臟癌的神經浸潤模式中，經由抑制IL-6而抑制神經浸潤，進而完成本發明。本發明更進一步了解人胰臟癌細胞株中表現IL-6受體，及IL-6增進胰臟癌細胞的趨化能力及移動能力以及細胞內訊號，發現可藉由抑制IL-6而治療胰臟癌。本發明更發現投予鼠神經浸潤模式IL-6抑制劑，可抑制人胰臟癌神經浸潤。
本發明更體提供以下[1]~[32]。
[1]以介白素6(IL-6)抑制劑為有效成分之胰臟癌治療劑。
[2]以IL-6抑制劑為有效成分之細胞的神經浸潤抑制劑。
[3]抑制癌細胞的神經浸潤為特徵之[2]抑制劑。
[4]抑制胰臟癌細胞的神經浸潤為特徵之[3]抑制劑。
[5]抑制向中央處的神經浸潤為特徵之[2]~[4]任一種抑制劑。
[6]該IL-6抑制劑為與IL-6受體結合的物質之[1]~[5]任一種治療劑或抑制劑。
[7]該IL-6抑制劑為抗IL-6受體抗體之[6]治療劑或抑制劑。
[8]該抗IL-6受體抗體為鑲嵌抗體、人型化抗體、或人抗體之[7]治療劑或抑制劑。
[9]胰臟癌的治療方法，包括投予對象IL-6抑制劑之步驟。
[10]細胞的神經浸潤抑制方法，包括投予對象IL-6抑制劑之步驟。
[11]抑制癌細胞的神經浸潤為特徵之[10]方法。
[12]抑制胰臟癌細胞的神經浸潤為特徵之[11]方法。
[13]抑制向中央處的神經浸潤為特徵之[10]~[12]任一種方法。
[14]該IL-6抑制劑為與IL-6受體結合之物質之[9]~[13]任一種方法。
[15]該IL-6抑制劑為抗IL-6受體抗體之[14]方法。
[16]該抗IL-6受體抗體為鑲嵌抗體、人型化抗體、或人抗體之[15]方法。
[17]IL-6抑制劑之使用，用於製造胰臟癌治療劑。
[18]IL-6抑制劑之使用，用於製造細胞的神經浸潤抑制 劑。
[19]抑制癌細胞的神經浸潤為特徵之[18]使用。
[20]抑制胰臟癌細胞的神經浸潤為特徵之[19]使用。
[21]抑制向中央處的神經浸潤為特徵之[18]~[20]任一種使用。
[22]該IL-6抑制劑為與IL-6受體結合之物質之[17]~[21]任一種使用。
[23]該IL-6抑制劑為抗IL-6受體抗體之[22]使用。
[24]該抗IL-6受體抗體為鑲嵌抗體、人型化抗體、或人抗體之[23]使用。
[25]IL-6抑制劑，使用於治療胰臟癌之方法。
[26]IL-6抑制劑，使用於抑制細胞神經浸潤之方法。
[27]抑制癌細胞的神經浸潤為特徵之[26]IL-6抑制劑。
[28]抑制胰臟癌細胞之神經浸潤為特徵之[27]IL-6抑制劑。
[29]抑制向中央處的神經浸潤為特徵之[26]~[28]任一種IL-6抑制劑。
[30]該IL-6抑制劑為與IL-6受體結合之物質之[25]~[29]任一種IL-6抑制劑。
[31]該IL-6抑制劑為抗IL-6受體抗體之[30]IL-6抑制劑。
[32]該抗IL-6受體抗體為鑲嵌抗體、人型化抗體、或人抗體之[31]IL-6抑制劑。
第1圖顯示人胰臟癌細胞株中，IL-6受體(IL-6R)的mRNA表現量(A)及IL-6β受體(gp130)的mRNA表現量(B)。
第2圖顯示使用人重組IL-6測定IL-6對人胰臟癌細胞株的增殖能力、趨化能力、移動能力的影響之結果。A及B：顯示細胞數的經時計測，測定細胞的增殖能力之結果；C：顯示趨化性分析測定趨化能力之結果；D：顯示傷口癒合分析(wound healing assay)測定移動能力之結果。
第3圖顯示使用人重組IL-6(rhIL-6)以西方點漬法(Western Blot)評價IL-6對人胰臟癌細胞株Capan-1的細胞內訊息的影響之結果。A：顯示細胞內磷酸化STAT3蛋白質的表現；B：顯示細胞內磷酸化Erk1/2蛋白質的表現；C：顯示細胞內磷酸化Akt蛋白質的表現。
第4圖為人胰臟癌細胞株之鼠神經浸潤模式之照片及圖。A：顯示4週後神經浸潤的肉眼可見的照片；B：顯示經時的浸潤距離；C：顯示4週後神經浸潤的組織圖。
第5圖為神經浸潤模式及各種神經損傷模式中鼠IL-6表現分布之照片及圖。A：神經浸潤模式照片；B及C：顯示以RT-PCR(B)或螢光免疫染色(C)的神經浸潤模式及其他神經損傷模式中鼠IL-6的表現量。
第6圖顯示神經浸潤部位中，胰臟癌細胞的磷酸化STAT3蛋白質表現的結果。
第7圖顯示剔除gp130的神經浸潤距離的抑制效果。
第8圖顯示剔除IL-6R的神經浸潤距離的抑制效果。
第9圖顯示投予鼠神經浸潤模式JAK抑制劑AG490或抗 IL-6受體抗體，對神經浸潤的影響。A：顯示JAK抑制劑AG490投予時的經時浸潤鉅離。DMSO：表示控制組；AG490：表示AG490處理組。B：顯示投予抗IL-6受體抗體的經時浸潤距離。hIgG：表示控制組；MRA：表示抗IL-6受體抗體的投予群。
本發明之「IL-6抑制劑」為阻斷經IL-6的訊息傳遞，抑制IL-6生物活性之物質。IL-6抑制劑的具體例，包括與IL-6結合之物質、與IL-6受體結合之物質、與gp130結合之物質等。IL-6抑制劑為抑制經IL-6的細胞內訊息之重要的STAT3磷酸化之物質，例如AG490等。IL-6抑制劑可包括抗IL-6抗體、抗IL-6受體抗體、抗gp130抗體、IL-6改變體、可溶性IL-6受體改變體、IL-6部分胜肽、IL-6受體部分胜肽、顯示與前述相同活性之小分子化合物等，沒有特別限制。
IL-6抑制劑的較佳態樣可例如IL-6受體抑制劑，特別是抗IL-6受體抗體。
本發明使用的抗體來源沒有特別限制，但較佳可例如來自哺乳動物，更佳為來自人的抗體。
本發明使用之抗體可為公知方法取得的多株抗體或單株抗體。本發明使用之抗體較佳為來自哺乳動物之單株抗體。來自哺乳動物的單株抗體為由融合瘤(hybridoma)產生者，及經基因工程之方法將含該抗體基因的表現載體轉形宿主中而產生者。通常該抗體與IL-6、IL-6受體、gp130等結合，會抑制向細胞內傳遞的IL-6生物活性。
產生單株抗體的融合瘤(hybridoma)基本上使用公 知技術如以下所述製造。即，將IL-6受體、IL-6、gp130等作為致敏化抗原，以一般免疫方法產生免疫，將得到的免疫細胞經一般細胞融合法與公知的親代細胞融合，在經過一般篩選方法，篩選產生單株抗體的抗體產生細胞而製作。
具體地說，製作單株抗體可如以下製作。例如，製作抗IL-6受體抗體時，取得抗體的致敏化抗原可使用人IL-6受體，如歐洲專利申請案公開號EP325474所揭示之IL-6受體基因/胺基酸序列，及鼠IL-6受體，如日本專利申請公開號特開平3-155795揭露之IL-6受體基因/胺基酸序列。
IL-6受體蛋白有在細胞膜上表現及脫離細胞膜(可溶性IL-6受體)(Yasukawa,K.et al.,J.Biochem.(1990)108,673-676.)兩種。可溶性IL-6受體為結合於細胞膜的IL-6受體，實質地構成在細胞外區域，缺少在貫穿細胞膜區域或貫穿細胞膜區域與細胞內區域，與膜結合型IL-6受體不同。IL-6受體蛋白只要能作為製作本發明之抗IL-6受體抗體的致敏化抗原使用，也可使用任何的IL-6受體。
將IL-6受體的基因序列插入公知的表現載體，轉形適當宿主細胞後，由該宿主細胞中或培養上清液中以公知方法純化目的IL-6受體蛋白，此純化的IL-6受體蛋白可作為致敏化抗原使用。此外，表現IL-6受體的細胞或IL-6受體蛋白與其他蛋白融合的融合蛋白，也可作為致敏化抗原。
相同地，將IL-6作為取得抗體的致敏化抗原時，使用Eur.人J.Biochem(1987)168,543-550；J.Immunol.(1988)140,1534-1541；或Agr.Biol.Chem.(1990)54,2685-2688所 揭示的IL-6基因/胺基酸序列，可獲得人IL-6。此外，取得抗gp130抗體的致敏化抗原可使用歐洲專利申請案公開號EP411946揭示之gp130基因/胺基酸序列。
以致敏化抗原造成免疫的哺乳動物沒有特別限制，但較佳考慮細胞融合使用的親代細胞的適合性來選擇，一般為囓齒類動物，例如小鼠、大鼠、豚鼠等。
以致敏化抗原使動物免疫，可以公知方法進行。例如可進行一般方法，將致敏化抗原注射在哺乳動物腹腔內或皮下。具體地說，將致敏化抗原以PBS(磷酸緩衝生理食鹽水)或生理食鹽水等適量稀釋、懸浮，視需要適量混合一般的佐劑，例如弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)，經乳化後，投予哺乳動物4-21天、每日數次者為佳。也可在致敏化抗原產生免疫時，使用適當載體。
如此產生免疫，確認血清中所希望的抗體濃度升高者後，自哺乳動物中取出免疫細胞，進行細胞融合。進行細胞融合的較佳免疫細胞特別例如脾細胞。
可與前述免疫細胞融合的其他親代細胞之哺乳動物的骨髓瘤(myeloma)細胞，可適當使用已公知的各種細胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney,J.F.et al.J Immunol.(1979)123,1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein,C.Eur.J.Immunol.(1976)6,511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.,Cell(1976)8,405-415)、SP2/0(Shulman,M.et al.,Nature(1978)276,269-270)、FO(de St.Groth.S.F.et al.,J. Immunol.Methods(1980)35,1-21)、S194(Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.(1978)148,313-323)、R210(Galfre,G.et al.,Nature(1979)277,131-133)等。
前述免疫細胞及骨髓瘤細胞的細胞融合可以基本公知方法為準進行，例如Milstein等人的方法(Kohler G.and Milstein,C.Methods Enzymol.(1981)73,3-6)等。
更具體地，前述細胞融合例如可在細胞融合促進劑存在下，於一般營養培養液中實施。融合促進劑例如使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(hemagglutinating virus of Japan；HVJ)等，更可視需要添加提高融合效率的二甲基亞碸等補助劑。
免疫細胞及骨髓瘤細胞的使用比例較佳為，骨髓細胞為免疫細胞的1~10倍。前述細胞融合使用的培養液可使用例如適合前述骨髓瘤細胞株增殖的RPMI1640培養液、MEM培養液、其他用於此種細胞培養用的一般培養液，可併用胎牛血清(FCS)等血清補充液。
細胞融合，可以一定量的前述免疫細胞與骨髓瘤細胞在前述培養液中混合，另外事先加熱至37℃左右的PEG溶液，例如平均分子量為1000-6000左右的PEG溶液，通常以30~60%(w/v)濃度添加，經混合形成目的融合細胞(融合瘤)。繼續逐次添加適當培養液，離心去除上清液，重複此操作。可去除融合瘤生長不佳的細胞融合劑等。
該融合瘤以一般的篩選培養液培養來選擇，例如HAT培養液(含次黃嘌呤(hypoxanthine)、胺基喋呤(aminopterin)及胸腺核苷(thymidine)的培養液)。以該HAT培養液培養，使 目的融合瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡的充足時間，通常持續數日~數週。最後，進行一般的限制稀釋法，篩選產生目的抗體的融合瘤及繁殖該融合瘤。
對人以外的動物進行抗原免疫，除了得到前述的融合瘤以外，將人淋巴球在活體外以所希望的抗原蛋白質或抗原表現細胞敏化，將敏化的B淋巴球與例如U266的人骨髓瘤細胞融合，可獲得具有結合所希望抗原或抗原表現細胞活性的所希望的人抗體(參考特公平1-59878)。再者，投予具有人抗體基因架構(repertory)的轉殖基因動物該抗原或抗原表現細胞，依前述方法取得所希望的人抗體(參考國際專利申請案公開號WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096、WO96/33735)。
產生該製作的單株抗體之融合瘤，可在一般培養液中繼代培養，或在液態氮中長期保存。
由該融合瘤取得單株抗體，可採用將該融合瘤以一般方法培養，得到該培養上清液的方法，或者將該融合瘤投予適合的哺乳動物使其增殖，取得腹水的方法等。前者的方法適合獲得高純度的抗體，後者方法適合大量生產抗體。
例如產生抗IL-6受體抗體的融合瘤之製作，可根據特開平3-139293揭示的方法進行。將產生PM1抗體的融合瘤注入BALA/c小鼠腹腔內，取得腹水，由該腹水中純化PM-1抗體的方法，或者將該融合瘤以適當培養基培養，例如含有10%胎牛血清、5%BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim製)的RPMI1640培養基、融合瘤SFM培養基(GIBCO-BRL製)、 PFHM-II培養基(GIBCO-BRL製)等，由該培養上清液中純化PM-1抗體之方法。
本發明之單株抗體可使用由融合瘤中選殖(cloning)該抗體基因，將該抗體基因重組於適當載體，導入宿主，使用基因重組技術形成的重組抗體(例如Borrebaeck C.A.K.and Larrick J.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD,1990)。
具體地為，從產生目的抗體的細胞，例如融合瘤細胞，分離編碼抗體可變(V)區的mRNA。mRNA的分離使用公知方法，例如胍(guanidine)超離心法(Chirgwin,J.M.et al.,Biochemistry(1979)18,5294-5299.)、AGPC法(Chromczynski,P.et al.,Anal.Biochem.(1987)162,156-159.)等，製造全RNA，使用mRNA純化套組(Pharmacia製)等，製造mRNA。也可使用快速製備mRNA純化套組(Pharmacia製)，直接製造mRNA。
由獲得的mRNA，使用反轉錄酶合成抗體V區的cDNA。cDNA的合成可使用AMV反轉錄酶第一股cDNA合成套組等。又cDNA的合成及放大，可使用5’-Ampli FINDER RACE套組(Clontech製)及PCR的5’-RACE法(Frohman,M.A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,8998-9002；Belyavsky,A.et al.,Nucleic acids Res.(1989)17,2919-2932)。由得到的PCR產物純化目標DNA片段，與載體DNA連結。再由此製作重組載體，將其導入如大腸桿菌等，選 擇菌落(colony)，製造所希望的重組載體。目標DNA的鹼基序列由公知方法確認，例如脫氧法。
如果可獲得編碼目的抗體V區的DNA，將其與編碼希望抗體的恆定區(C區)的DNA連結，將此重組入表現載體。或者，也可將編碼抗體V區的DNA重組入含抗體C區的DNA之表現載體中。
製造本發明使用的抗體，可將後述的抗體基因重組入以表現控制區域例如促進子(enhancer)、啟動子(promoter)的控制所表現之表現載體。之後，藉由該表現載體使宿主細胞轉形，可表現抗體。
本發明以對人異種抗原性低者為目的，可使用人造改變的基因重組型抗體，例如鑲嵌(chimeric)抗體、人型化(humanized)抗體等。此述之改變抗體可以已知方法製造。
鑲嵌抗體為，將前述編碼所得抗體V區的DNA與編碼人抗體C區的DNA連結，將其重組入表現載體，並導入宿主產生該抗體(參考歐洲專利申請案公開號EP125023、國際專利申請公開號WO92/19759)。使用此已知方法可獲得可用於本發明之鑲嵌抗體。
人型化抗體亦稱為重塑(reshaped)人抗體或人源化抗體，為將人以外之哺乳動物例如鼠抗體互補決定區(CDR)，移植到人抗體的互補性決定區，也已知為一般的基因重組方法(參考歐洲專利申請案公開號EP125023、國際專利申請公開號WO92/19759)。
具體地說，如連接小鼠抗體的CDR與人抗體的架 構區(FR；framework region)之DNA序列，以末端具有重疊部分，製作數個寡核苷酸，經PCR法合成。得到的DNA與編碼人抗體C區的DNA連接，之後重組入表現載體，將此導入宿主而產生(參考歐洲專利申請案公開號EP239400、國際專利申請公開號WO92/19759)。
經CDR而連接的人抗體FR，選擇互補性決定區形成良好抗原結合部位者。重塑人抗體的互補性決定區，視需要可以形成適當的抗原結合部位而取代抗體的可變區之架構區的胺基酸(Sato,K.et al.,Cancer Res.(1993)53,851-856)。
鑲嵌抗體、人型化抗體通常使用人抗體C區。人抗體重鏈C區，例如Cγ等，例如可使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。人抗體輕鏈C區可例如κ或λ。又為了改善抗體或其產生的安定性，也可修飾人抗體C區。
鑲嵌抗體由來自人以外的哺乳動物之可變區及來自人抗體的C區所構成，人型化抗體由來自人以外之哺乳動物之抗體的互補性決定區與來自人抗體的架構區及C區所構成，這兩種抗體因為在人體內的抗原性低的緣故，可作為醫藥品使用之抗體。
本發明使用之人型化抗體的較佳具體例，如人型化PM-1抗體(參考國際專利申請公開號WO92/19759)。
人抗體之取得方法，除了前述之方法外，已知有使用人抗體資料庫經淘選(panning)取得人抗體之技術。例如人抗體之可變區為單鏈抗體(scFv)，以噬菌體展示法(phage display)在噬菌體表面表現，可選擇結合抗原之噬菌體。如果 分析被選擇的噬菌體之基因，可決定編碼該與抗原結合之人抗體可變區的DNA序列。如果得知與抗原結合之scFv的DNA序列，製作包含該序列的適當表現載體，可取得人抗體。前述方法為已知，可參考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388。
如前述建構的抗體基因可以公知方法表現。使用哺乳動物時，可經由常用的有用啟動子、表現的抗體基因、3’端下游官能結合多腺苷訊息(poly A signal)的DNA、或含該DNA的載體而表現。例如啟動子/促進子可例如人巨細胞病毒立即早期啟動子/促進子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。
其他可用於本發明中使用的抗體表現之啟動子/促進子，也可使用反轉錄病毒(retrovirus)、多瘤病毒(polyomavirus)、腺病毒(adenovirus)、猿病毒40(SV40)等的病毒啟動子/促進子或人延長因子-1α(HEF1α)等的來自哺乳動物的啟動子/促進子。
例如使用SV40啟動子/促進子時，可根據Mulligan等人之方法(Mulligan,R.C.et al.,Nature(1979)277.108-114)，或使用HEF1α啟動子/促進子時，可根據Mizushima等人之方法(Mizushima,S.and Nagata,S.Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)而容易實施。
當宿主為原核細胞時，有細菌細胞的生產系統。細菌細胞已知有大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌。
使用大腸桿菌時，可使常用的啟動子、抗體分泌 的訊息序列、表現的抗體基因官能結合而表現。例如啟動子可為lacZ啟動子、araB啟動子等。使用lacZ啟動子時，可根據Ward等人之方法(Ward,E.S.et al.,Nature(1989)341,544-546；Ward,E.S.et al.,FASEB J.(1992)6,2422-2427.)，使用araB啟動子時，可根據Better等人之方法(Better,M.et al.,Science(1988)240,1041-1043)。
抗體分泌的訊息序列在大腸桿菌胞外質(periplasm)形成時，可使用pelB序列(Lei,S.P.et al.,J.Bacteriol.(1987)169,4379-4383.)。分離胞外質所產生的抗體後，適當再摺疊(refold)抗體結構而使用(如WO96/30394)。
複製的起源可使用來自SV40、多瘤病毒(polyomavirus)、腺病毒(adenovirus)、牛乳突瘤病毒(BPV)等者，而且為了放大宿主細胞系統的基因複製數量，表現載體可包含胺基糖苷磷酸轉移酶(aminoglycosidephosphotransferase；APH)基因、胸苷激酶(thymidine kinase；TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥糞嘌呤磷酸核糖轉移酶(xanthine-guanylphosphoribosyl transferase；Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酵素(dhfr)基因等作為篩選標識(marker)。
為了本發明使用之抗體的製造，可使用任意的生產系統。抗體製造的生產系統為活體外及活體內生產系統。活體外生產系統例如使用真核細胞的生產系統或使用原核細胞的生產系統。
宿主為真核細胞時，有動物細胞、植物細胞或真菌細胞之生產系統。動物細胞已知有(1)哺乳類動物，例如 CHO、COS、骨髓瘤(myeloma)、BHK(嬰兒豚鼠腎臟)、HeLa、Vero等；(2)兩生類，例如南非爪蛙(Xenopus laevis)卵母細胞、或(3)昆蟲細胞，例如sf90、sf21、Tn5等。植物細胞已知來自菸草(Nicotiana tabacum)的細胞，可將其組織(callus)培養。真菌細胞已知為酵母菌，例如酵母菌屬(Saccharomyces)，例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；絲狀菌，例如麴菌屬(Aspergillus)，例如黑麴菌屬(Aspergillus niger)等。
將目的抗體基因經轉形導入前述細胞中，經轉形細胞在活體外培養而獲得抗體。培養以公知方法進行。例如可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作為培養液，併用胎牛血清(FCS)等血清補充液。或者也可將導入抗體基因的細胞移到動物腹腔，在活體內產生抗體。
另一方面，活體內生產系統例如動物生產系統或植物生產系統。使用動物時有哺乳類動物、昆蟲的生產系統。
哺乳類動物可使用山羊、豬、羊、鼠、牛等(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Applications,1993)。昆蟲可使用蠶。使用植物時，可使用例如菸草。
將抗體基因導入前述之動物或植物，使在動物或植物體內產生抗體並回收抗體。例如將抗體基因插入編碼原本生產山羊β酪蛋白乳汁之蛋白質的基因中，製造融合基因。將含有插入抗體基因的融合基因之DNA片段，注入山羊胚胎，將該胚胎導入母山羊。由容許該胚胎生長的山羊所產生的轉殖基因山羊或其子代產生的乳汁中獲得抗體。為了增加由轉殖基因山羊產生的含有所希望抗體的乳汁量，也可對轉殖基因山羊 使用適當的荷爾蒙(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699-702.)。
使用蠶時，將插入目的抗體基因的昆蟲桿狀病毒(Baculovirus)感染蠶，由蠶的體液得到所希望的抗體(Maeda,S.et a.,Nature(1985)315,592-594)。使用菸草時，將目的抗體基因插入如pMON530的植物表現載體，將此載體導入如農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的細菌中。將此農桿菌感染例如菸草(Nicotiana tabacum)，由此菸草葉獲得所希望的抗體(Julian,K.-C.Ma et al.,Eur.J.Immunol.(1994)24,131-138.)。
如上述在活體外或活體內生產系統中產生抗體時，編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別重組於表現載體，與宿主同時轉形，或者將編碼H鏈或L鏈的DNA重組於單一表現載體，轉形宿主(WO94/11523)。
本發明使用之抗體只要是本發明適宜使用即可，可為抗體片段或其修飾物。例如抗體片段例如Fab、F(ab’)2、Fv，或H鏈與L鏈的Fv以適當配體連接的單鏈Fv(scFv)。
具體而言，使抗體經酵素例如木瓜酵素、胃蛋白酶處理，產生抗體片段，或者建構編碼前述抗體片段之基因，將其導入表現載體後，以適當宿主表現(例如Co,M.S.et a.,J.Immunol.(1994)152,2968-2976；Better,M.& Horwitz,A.H.Methods in Enzymology(1989)178,476-496；Plueckthun,A.& Skerra,A.Methods in Enzymology(1989)178,497-515；Lamoyi,E.,Methods in Enzymology(1989)121,663-66；Bird,R.E.et a.,TIBTECH(1991)9,132-137.)。
scFv由連接抗體H鏈V區及L鏈V區而得。此scFv中以連接物(linker)連結H鏈V區及L鏈V區，較佳為經由胜肽連接物連結(Huston,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,5879-5883.)。scFv中的H鏈V區及L鏈V區也可來自前述記載之任一抗體。例如連結V區的胜肽連接物可使用例如胺基酸12-19殘基所組成之任一單鏈胜肽。
編碼scFv的DNA可獲自以編碼前述抗體之H鏈或編碼H鏈V區之DNA、及編碼L鏈或編碼L鏈V區之DNA為鑄模，在此述序列中編碼所希望胺基酸序列的DNA部分，使用規定兩端的引子對，經PCR放大，之後再組合連接編碼胜肽連接部分的DNA及其兩端的H鏈、L鏈之引子對，經放大而獲得。
如果一旦製作編碼scFv的DNA，可根據慣例獲得含有該DNA的表現載體及由該表現載體轉形之宿主，可依慣例使用該宿主獲得scFv。
前述之抗體片段可如前述相同取得其基因，使其表現，經宿主而產生。本發明中所謂「抗體」也包括此述之抗體片段。
抗體修飾物可使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合的抗體。本發明中所謂「抗體」也包括此述之抗體修飾物。取得此抗體修飾物可將所得的抗體進行化學修飾而得。此述方法皆已確立於此技術領域中。
如前述產生、表現之抗體可由細胞內外、宿主分離，至均勻而純化。本發明使用之抗體分離、純化可根據親和 層析法進行。親和層析法使用的柱，例如蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱使用的載體例如HyperD、POROS、SepharoseF.F.等。也可使用其他一般蛋白質使用之分離、純化方法，沒有特別之限制。
適當選擇及組合例如除上述親和層析法以外的層析法、過濾、超過濾、鹽析、透析等，可分離、純化本發明使用之抗體。層析法例如離子交換層析法、疏水性層析法、膠體過濾法等。此述之層析法可適用於高壓液相層析法(High performance liquid chromatography；HPLC)。也可使用逆相HPLC(reverse phase HPLC)。
上述所得之抗體的濃度測定可進行吸光度測定或ELISA等。測定吸光度時，以PBS(-)適當稀釋後，測定280nm的吸光度，以1mg/ml為1.35OD來計算。ELISA測定濃度時可如下述測定。以0.1M碳酸氫鹽緩衝液(pH9.6)稀釋為1μg/ml的山羊抗人IgG(TAG製)100μl，加入96位盤(Nunc製)，4℃下培養一晚，使抗體固相化。阻止反應後，添加100μl的適當稀釋的本發明抗體或含有抗體之樣本、或人IgG(CAPPEL製)為標準品，室溫下培養1小時。
洗淨後，加入5000倍稀釋的鹼性磷酸酶標識之抗人IgG(BIO SOURCE製)100μl，室溫下培養1小時。洗淨後加入基質溶液，培養後，以微盤讀器(MICROPLATE READER)3550型(Bio-Red製)測定405nm的吸光度，計算目的抗體的濃度。
抗IL-6抗體的具體例，沒有特別限定，例如MH166 (Matsude,T.et al.,Eur.J.Immunol.(1998)18,951-956)或SK2抗體(Sato K et al.，第21回日本免疫會總會，學術紀錄(1991)21,166)等。
抗IL-6受體抗體的具體例，沒有特別限定，例如MR16-1抗體(Tamura,T.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90,11924-11928)、PM-1抗體(Hirata,Y.et al.,J.Immunol.(1989)143,2900-2906)、AUK12-20抗體、AUK64-7抗體或AUK146-15抗體(WO92/19759)。其中例如對人IL-6受體較佳的單株抗體之PM-1抗體，或是對鼠IL-6受體較佳的單株抗體之MR-16，但沒有特別限制。人形化抗IL-6受體抗體的較佳例，如人形化PM-1抗體(Tocilizumab,MRA)。人形化抗IL-6受體抗體的其他較佳例如WO2009/041621記載。抗IL-6受體抗體的其他較佳態樣，例如辨識與人形化PM-1抗體(Tocilizumab,MRA)所辨識的抗原決定部位相同之抗原決定部位的抗IL-6受體抗體。
抗gp130抗體的具體例，沒有特別限定，例如AM64抗體(特開平3-219894)、4B11抗體、2H4抗體(US5571513)、B-P8抗體(特開平8-291199)等。
本發明使用之IL-6改變體為具有與IL-6受體結合活性，且不會傳達IL-6生物活性之物質。即IL-6改變體與IL-6對IL-6受體競爭結合，但不傳遞IL-6生物學活性，因此阻斷因IL-6造成的訊息傳遞。
IL-6改變體由取代IL-6胺基酸序列的胺基酸殘基，導入變異而製作。形成IL-6改變體的IL-6不論其來源， 但是考慮抗原性等，較佳為人IL-6。具體地說，IL-6的胺基酸序列使用公知分子模型程式，例如WHATIF(Vriend et al.,J.Mol.Graphics(1990)8,52-56)，預測其二次結構，再對被取代的胺基酸殘基對整體的影響進行評估。決定適當的取代胺基酸殘基後，以含有編碼人IL-6基因的鹼基序列之載體作為鑄模，以一般進行的PCR法如胺基酸取代導入變異，獲得編碼IL-6改變體之基因。此可視需要重組入表現載體，經前述重組抗體的表現、產生及純化方法，獲得IL-6改變體。
IL-6改變體的具體例，例如Brakenhoff et al.,J.Biol.Chem.(1994)269,86-93及Savino et al.,EMBO J.(1994)13,1357-1367、WO96/18648、WO96/17869揭示之IL-6改變體。
IL-6受體的部分胜肽為IL-6受體的胺基酸序列中有關於IL-6與IL-6受體結合區域的部分或全部之胺基酸序列所組成之胜肽。該胜肽通常由10~80個、較佳為20~50個、更佳為20~40個胺基酸殘基所構成。
IL-6受體的部分胜肽之製作，選定IL-6受體的胺基酸序列中有關於IL-6與IL-6受體的結合區域，以該特定區域的部分或全部的胺基酸序列，經一般已知方法，例如基因工程方法或胜肽合成法製作。
以基因工程方法製作IL-6受體的部分胜肽，可將編碼所希望的胜肽之DNA序列重組於表現載體，依該重組抗體的表現、產生、純化方法而獲得。
以胜肽合成法製作IL-6受體的部分胜肽，可使用胜肽合成中一般使用之方法，例如固相合成法或液相合成法。
具體地說，可根據續醫藥品的開發第14卷胜肽合成 監修矢島治明廣川書店1991年記載之方法。固相合成法，例如可使不溶於有機溶劑之支持體合成的胜肽C端的胺基酸結合，將α-胺基及側鏈官能基以適當保護基保護的胺基酸，由C端向N端方向的順序使1個胺基酸縮合的反應，及使結合於樹脂上的胺基酸或胜肽的α-胺基的保護基脫離的反應，交叉重複進行，使胜肽鏈延長之方法。固相胜肽合成方法使用的保護基種類與Boc法及Fmoc法有大的差異。
因此，合成目的胜肽後，進行脫保護反應及胜肽鏈支持體的切斷反應。胜肽鏈的切斷反應通常使用Boc法的氟化氫或三氟甲烷磺酸，或使用Fmoc法的TFA。Boc法中例如在氟化氫中，在甲苯醚存在下處理上述的保護胜肽樹脂。之後進行保護基脫離及由支持體切斷，回收胜肽。經冷凍乾燥後，獲得粗胜肽。另外Fmoc法可在TFA中同上述操作進行脫保護反應及由胜肽鏈支持體切斷反應。
得到的粗胜肽可用於HPLC而分離、純化。每溶出者使用一般用於蛋白質純化的水-乙腈系溶劑，在最適條件下進行。分取該層析法的圖形峰之部分，使其冷凍乾燥。如此純化的胜肽部分經質譜儀分析測定分子量、胺基酸組成、或胺基酸序列。
本發明之IL-6抑制劑可用於神經浸潤之抑制。本發明中「神經浸潤」為癌細胞或其他細胞侵入神經組織而發育的樣式，伴隨組織破壞(破壞性發育)等。本發明中較佳神經浸潤例如癌細胞的神經浸潤。抑制癌細胞浸潤的情形，對於對象 癌症的種類沒有特別限制，可為胰臟癌、胃癌、前列腺癌、頭頸癌、乳癌、肺癌、大腸癌、卵巢癌等任何的癌種類，但較佳為抑制胰臟癌細胞的浸潤。神經浸潤的抑制，可抑制向末梢端的神經浸潤，也可抑制向中央處的神經浸潤，任何地方皆可，但因為胰臟癌細胞傾向中央處的神經浸潤，因此較佳抑制向中央處的神經浸潤(例如由神經損傷部位向中央處的神經浸潤)。
本發明中「神經浸潤的抑制」表示神經浸潤發生的抑制、神經浸潤的發生率降低、神經浸潤的距離縮短、神經浸潤的速度延遲等。
以本發明之IL-6抑制劑抑制神經浸潤，可治療、抑制伴隨神經浸潤的各種症狀(例如癌性疼痛等的痛、貧血、行為能力狀態(performance status；PS)降低、低營養等)。因此，本發明亦包括含IL-6抑制劑之伴隨神經浸潤的各症狀之治療劑、抑制劑。
本發明之胰臟癌治療劑可使用於胰臟癌治療及/或預防。
本發明中「胰臟癌治療」表示胰臟癌發生的抑制、胰臟癌發生率的降低、胰臟癌細胞的增殖抑制、胰臟癌組織縮小、胰臟癌症狀改善、胰臟癌的轉移抑制等。
本發明使用之IL-6抑制劑之效果，例如可以訊號傳遞抑制活性作為指標予以評價，但不限於此。IL-6抑制劑的訊號傳遞抑制活性可以一般使用之方法評價。具體地說，培養IL-6依賴性人骨髓腫株(S6B45、KPMM2)、人lennert T淋巴腫細胞株KT3、或IL-6依賴性細胞株MH60.BSF2，添加IL-6， 同時與IL-6抑制劑共存，測定IL-6依賴性細胞中進入的3H-胸苷。或者培養IL-6受體表現細胞之U266，添加125I標識的IL-6，同時添加IL-6抑制劑，測定與IL-6受體表現細胞結合的125I標識的IL-6。上述分析系統中，IL-6抑制劑存在組與未含IL-6抑制劑的陰性對照組，比較兩者所得之結果，評估IL-6抑制劑的IL-6抑制活性。
本發明之治療劑或抑制劑的投予對象為哺乳動物，哺乳動物較佳為人。
本發明之治療劑或抑制劑可以醫藥品型式投予，可經口或非經口投予全身或局部投予。例如可選擇點滴等靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射、栓塞劑、灌腸、經口性腸溶劑等，根據患者年齡、症狀選擇適當投予方法。有效投予量為一次以每1kg體重為0.01mg-100mg的範圍。或者選擇每一患者1-1000mg投予量，較佳為5-50mg投予量。較佳投予量、投予方法，例如在抗IL-6受體抗體的情形時，血中游離抗體存在程度的量為有效投予量，具體例如每1kg體重1個月(4週)單次或數次投予0.5mg~40mg、較佳為1mg~20mg，例如以每週2次、每週1次、每兩週1次、每4週1次等投藥時程，以點滴等靜脈內注射、皮下注射等方法投予。投予時程可觀察患者狀態及血液檢查值的變化，由每週2次或每週1次延長為每兩週1次、每3週1次、每4週1次等投予間隔而調整。
本發明之治療劑或抑制劑亦可添加保存劑或安定劑等製劑上可容許載體。製劑上容許載體表示可與上述藥劑一 起投予之材料。製劑上容許之材料例如滅菌水或生理食鹽水、安定劑、賦形劑、緩衝劑、界面活性劑、螯合劑(EDTA等)、結合劑等。
本發明中界面活性劑可例如非離子界面活性劑，例如山梨聚醣單辛酸酯、山梨聚醣單月桂酸酯、山梨聚醣單棕櫚酸酯等山梨聚醣脂肪酸酯；甘油單辛酸酯、甘油單肉荳蔻酸酯、甘油單硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；聚甘油單硬脂酸酯、聚甘油二硬脂酸酯、聚甘油單亞麻油酸酯等聚甘油脂肪酸酯；聚環氧乙烷山梨聚醣單月桂酸酯、聚環氧乙烷山梨聚醣單油酸酯、聚環氧乙烷山梨聚醣單硬脂酸酯、聚環氧乙烷山梨聚醣棕櫚酸酯、聚環氧乙烷山梨聚醣三油酸酯、聚環氧乙烷山梨聚醣三硬脂酸酯等聚環氧乙烷山梨聚醣脂肪酸酯；聚環氧乙烷山梨醣醇四硬脂酸酯、聚環氧乙烷山梨醣醇四油酸酯等聚環氧乙烷山梨醣醇脂肪酸酯；聚環氧乙烷甘油單硬脂酸酯等聚環氧乙烷甘油脂肪酸酯；聚環氧乙烷乙二醇二硬脂酸酯等聚環氧乙烷乙二醇脂肪酸酯；聚環氧乙烷月桂酸醚等聚環氧乙烷烷醚；聚環氧乙烷聚環氧丙烷乙二醇、聚環氧乙烷聚環氧丙烷丙醚、聚環氧乙烷聚環氧丙烷十六烷醚等聚環氧乙烷聚環氧丙烷烷醚；聚環氧乙烷壬烷苯醚等聚環氧乙烷烷基苯醚；聚環氧乙烷篦麻油、聚環氧乙烷硬化篦麻油、聚環氧乙烷山梨醣醇蜜蠟等聚環氧乙烷蜜蠟衍生物；聚環氧乙烷羊毛脂等聚環氧乙烷羊毛脂衍生物；聚環氧乙烷硬脂酸醯胺等聚環氧乙烷脂肪酸醯胺等具有HLB6-18者之典型例。
界面活性劑也可例如陰離子界面活性劑，例如十 六烷基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、油醇基硫酸鈉等具有碳數10-18烷基之烷基硫酸鹽；聚環氧乙烷月桂硫酸納等環氧乙烷平均莫耳數為2-4、烷基碳數10-18之聚環氧乙烷醚硫酸鹽；月桂基磺酸基琥珀酸酯鈉等碳數8-18烷基之烷基磺酸基琥珀酸酯鹽；天然界面活性劑，例如卵磷脂、甘油磷脂質、神經鞘磷脂等神經鞘脂質；碳數12-18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等典型例子。
本發明之藥劑可添加1種或2種以上的前述界面活性劑之組合。本發明之製劑使用的較佳界面活性劑為聚山梨糖醇(polysorbitol)20、40、60、80等聚環氧乙烷山梨聚糖脂肪酸酯，更佳為聚山梨糖醇20、80。Poloxamer(Pluronic-68(登錄商標)等)代表之聚環氧乙烷聚環氧丙烷甘油亦佳。
界面活性劑的添加量根據使用的界面活性劑種類而異，如為聚山梨糖醇20或聚山梨糖醇80時，一般為0.001-100mg，較佳為0.003-50mg，更佳為0.005-2mg。
本發明中緩衝劑可例舉磷酸、檸檬酸緩衝液、醋酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、磷酸鉀、葡萄糖酸、辛酸、脫氧膽酸、水楊酸、三乙胺、富馬酸等其他有機酸等，或碳酸緩衝液、Tris緩衝液、組胺酸緩衝液、咪唑緩衝液等。
可調配溶液製劑，依照溶液製劑領域中溶於公知的水性緩衝液者。緩衝液的濃度通常為1-500mM，較佳為5-100mM，更佳為10-20mM。
本發明之藥劑也可包含其他低分子量的多胜肽、血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白等之蛋白質、胺基酸、多醣及 單糖等糖類、或碳水化合物、糖醇。
本發明中，胺基酸可例舉鹼性胺基酸，例如精胺酸、賴胺酸、組胺酸、鳥胺酸等或前述之胺基酸無機鹽(較佳為鹽酸鹽、磷酸鹽的型態，即磷酸胺基酸)。使用游離的胺基酸時，較佳的pH值可根據適當的生理容許緩衝物質，例如無機酸，特別是鹽酸、磷酸、硫酸、醋酸、甲酸或前述鹽類的添加而調整。此時，磷酸鹽的使用因為可獲得特別安定的冷凍乾燥物而特別有利。調製物為實質上不包含如蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸等之有機酸，或不存在對應的陰離子(蘋果酸離子、酒石酸離子、檸檬酸離子、琥珀酸離子、富馬酸離子)時，特別有利。較佳胺基酸為精胺酸、賴胺酸、組胺酸、或鳥胺酸。而且，也可使用酸性胺基酸，例如麩醯胺酸及天冬胺酸及其鹽型態(較佳為鈉鹽)或者中性鹽，例如異亮胺酸、亮胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸、或丙胺酸、或芳族胺基酸，例如苯基丙胺酸、酪胺酸、色胺酸，或衍生物的N-乙醯基色胺酸。
本發明中，多糖及單糖等糖類或碳水化合物，可例如葡聚糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木醇糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、植物蜜糖(raffinose)等。
本發明中，糖醇可列舉例如甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇等。
作為本發明藥劑注射用之水溶液可混合包含例如生理食鹽水、葡萄糖或其他輔助藥(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇)之等張溶液。該水溶液也可併用適當之溶解 輔助劑(例如醇(乙醇等)、聚醇(丙二醇、PEG等)、非離子界面活性劑(聚山梨糖醇80、HCO-50)等)。
也可視需要再包含稀釋劑、溶解輔助劑、pH調整劑、無痛化劑、含硫還原劑、抗氧化劑。
本發明中，含硫還原劑可列舉例如N-乙醯半胱胺酸、N-乙醯高胱胺酸、硫辛酸(lipoic acid)、硫代二乙二醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、硫代乙二醇酸及其鹽、硫代硫酸鈉、麩胱苷肽，及碳數1-7之硫代烷酸等之具有硫氫基者。
本發明中，抗氧化劑可例如抗壞血酸(Erythorbic acid)、二丁基羥基甲苯、丁基羥基甲苯醚、α-生育酚、乙酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三胺、沒食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、甲基磷酸鈉等螯合劑。
也可視需要封入微膠囊(羥甲基纖維素、明膠、聚[甲基甲基丙烯酸]等的微膠囊)，作成膠體藥物遞送系統(微脂體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊等)(參考Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition,Oslo Ed.,1980等)。或將藥劑作成緩慢釋放藥劑脂方法，也是已知，可適用於本發明(Langer et al.,J.Biomed.Mater.Res.1981,1：167-277；Langer,Chem.Tech.1982,12：98-105；USP 3,773,919；EP58,481；Sidman et al.,Biopolymers 1983,22：547-556；EP133,988)。
所使用的製劑上容許載體可根據劑型由上述中適當選擇或組合，但不限於此。
本發明關於抑制對象中神經浸潤之方法，包括投予神經浸潤發病對象或可能發病之對象IL-6抑制劑之步驟。
又本發明關於對象中治療及/或預防胰臟癌之方法，包括投予胰臟癌發病對象或可能發病之對象IL-6抑制劑之步驟。
本發明中所謂「對象」為投予本發明治療劑或抑制劑之生物體或該生物體內之一部分。生物體沒有特別限制，但包括動物(例如人、家畜動物種、野生動物)。
「生物體內之一部分」沒有別特別限制，較佳可列舉患處等。
本發明中「投予」包括經口或非經口投予。經口投予例如以所謂經口劑型投予，經口劑型可選擇顆粒劑、散劑、錠劑、膠囊劑、溶劑、乳液劑、或懸浮劑等劑型。
非經口投予可例如注射型態的投予，注射劑可例如皮下注射劑、肌肉注射劑、或腹腔內注射劑等。或者使用含有應投予的寡核苷酸之基因的基因療法，導入生物體，可達到本發明方法之效果。或者本發明之藥劑也可局部投予施以處置的區域。例如手術中局部注入、導管的使用，或也可為編碼本發明胜肽之DNA為標的的基因遞送投予。
進行本發明方法時，本發明之藥劑也可將至少1種其他藥劑(例如其他的神經浸潤抑制劑或其他胰臟癌治療劑)作為藥學組成物的一部分投予。具體實施例中，本發明之藥劑與其他藥劑也可實質地同時投予。
本說明書中引用的所有先前技術文獻作為參考，併入本說明書中。
本發明以下述實施例更進一步詳細說明，但本發明不侷限於以下實施例。該技術領域人士可能進行的各種變更或修飾，皆包含於本發明範疇。
<材料與方法>
細胞
人胰臟癌細胞株Capan-1、BxPC-3，由美國菌種保存中心(ATCC)購入，根據ATCC建議的操作方法，使用維持在37℃、5%CO2條件下的恆溫槽，繼代培養。
細胞數計算
由培養盤(dish)中採取細胞，使用trypan blue及血球計測盤，計算活細胞數。
趨化分析
將底面具有8μm孔的細胞培養薄膜(cell culture insert)(BD Falcon)置入24孔位(well)，該細胞培養薄膜作為上層，該孔位(well)作為下層。在下層中注入600μl的非血清培養液及人重組IL-6(hrIL-6)(R&D systems)調製的hrIL-6載體0、1、10、100ng/ml，上層加入100μl的細胞懸浮液2x106個/ml。培養24小時後，計算通過孔的細胞數。每群進行12次測定，除以0ng/ml的hrIL6通過孔的平均細胞數，作為調整值，予以紀錄。
傷口癒合分析(wound healing assay)
以毎位1ml的3x105個/ml的細胞懸浮液注入24孔位中， 培養24小時。以非血清培養基替換，培養24小時後，孔位中央處以玻璃棒摩擦，製作帶狀的無細胞區域。計算該區域寬度，以hrIL-6載體0、1、10、100ng/ml替換培養基。培養24小時後，測定無細胞區域的寬度變化。每群進行12次的測量，除以0ng/ml的hrIL6的平均變化長度，作為調整值，予以紀錄。
抗體
西方點漬法(Western blotting)使用的初级抗體為，抗磷酸化STAT3抗體(Santa Cruz)、抗STAT3抗體(Santa Cruz)、抗磷酸化Erk1/2抗體(Cell Signaling)、抗Erk1/2抗體(Cell Signaling)、抗磷酸化Akt抗體(Cell Signaling)、抗Akt抗體(Cell Signaling)、抗肌動蛋白(Actin)抗體(Santa Cruz)。螢光免疫染色使用之初級抗體為抗S100抗體(DAKO)、抗鼠IL-6抗體(Santa Cruz)，核染色使用DRAQ5(AXXORA)。免疫染色使用抗磷酸化STAT3抗體(Santa Cruz)。
西方點漬法(Western blotting)
使用胞解緩衝液(20mM Hepes-NaOH pH7.0、0.5% NP-40、15%甘油、300mM NaCl、1mM EDTA、10mM NaF)，製作細胞溶解液。蛋白濃度以BCA蛋白分析套組(PIERCE)測定，之後使用7.5%或12%丙烯醯胺膠電泳該含有20mg蛋白的細胞溶解液，再轉寫至聚二氟伸乙烯膜(Millipore)。在該膜上添加抗體，以增強化學螢光試劑(Amersham Biosciences)使蛋白的表現影像化。
磷酸化STAT3免疫染色及其評價方法
使抗原在10mM的檸檬酸緩衝液內，經95℃ 10分鐘微波 進行加熱處理，使抗原具有活性，使用DAB顯色。檢體為經過4周的26隻小鼠神經浸潤模式中採取26條坐骨神經。神經浸潤部位的中央處端及末梢端為關注區域，使用40倍物鏡，計算每1視野中癌細胞數及磷酸化STAT3陽性的癌細胞數，再以算式(磷酸化STAT3陽性的癌細胞數/癌細胞數)，計算出標識指數(labeling index)。
神經浸潤模式
使用的小鼠為6週齡重度免疫不全雄鼠(SCID鼠)。將barbitol投予該鼠腹腔50mg/kg，使其麻醉，露出左坐骨神經。使用30號(gaze)針微注射器直接注射該坐骨神經2.5μl的1.0x104個/μl的癌細胞懸浮液。評價時，採取注入癌細胞之坐骨神經，埋入4%福馬林中4℃靜置過夜，固定製作組織標本。將已固定的坐骨神經切片3μm厚度，為測定神經浸潤距離以蘇木酸及嗜伊紅素(Hematoxylin．eosin)染色或免疫染色。神經浸潤距離之測定，使用神經長方向切片的切片及物體微測器(三啟)，計算全部腫瘤範圍的長。組織中mRNA的萃取，使用直接以多檢體細胞破碎機(multi bead shocker)(安井器械)破碎採集組織的檢體。
RNA萃取及即時RT-PCR
自培養盤(dish)中採取的細胞pellet或破碎的組織碎片，使用TRIzol(Life Technologies)採集所有RNA。cDNA的合成由1x103ng的全部RNA以ExScript RT試劑套組(Takara-BIO)及Takara PCR熱循環方塊(Takara-BIO)根據該公司操作手冊而合成。即時RT-PCR使用Smart Cycler II系統(Cepheid)、SYBR RT-PCR套組(Takara-BIO)。引子為可各自特異放大人IL-6α受體(IL-6R)、人IL-6β受體(gp130)、人GAPDH、鼠IL-6、鼠EGF、鼠GAPDH的cDNA之引子。引子序列為：人IL-6R：順向tgagctcagatatcgggctgaac(序列識別號：1)；反向cgtcgtggatgacacagtgatg(序列識別號：2)；人gp130：順向gaagcaagtgggatcacctatgaa(序列識別號：3)；反向ctgtagccttgagtatgggatgga(序列識別號：4)；人GAPDH：順向gcaccgtcaaggctgagaac(序列識別號：5)；反向atggtggtgaagacgccagt(序列識別號：6)；鼠IL-6：順向ccacttcacaagtcggaggctta(序列識別號：7)；反向gcaagtgcatcatcgttgttcatac(序列識別號：8)；鼠EGF：順向catcatggtggtggctgtctg(序列識別號：9)；反向cacttccgcttggctcatca(序列識別號：10)；鼠GAPDH：順向aaatggtgaaggtcggtgtg(序列識別號：11)；反向tgaaggggtcgttgatgg(序列識別號：12)。
定量方法根據製造供私的操作方法進行。
剔除mRNA
mRNA表現的剔除(knockdown)使用Ambion公司製作的siRNA。使用的siRNA為人IL-6siRNA、人gp130siRNA、控制#1 siRNA。將2x105個癌細胞培養於3.5cm培養盤(dish)48小時，之後加入20μM及DharmaFECT轉感染試劑4(Dharmacon)8μl。24小時後採集細胞，用於mRNA表現分析或神經浸潤模式。
統計分析
分析軟體為STATVIEW5.0。平均值的差以student-t兩端測定。圖中error bar表示標準差。
[實施例1]
人胰臟癌細胞株中IL-6α受體(IL6R)及人IL-6β受體(gp130)的細胞內mRNA表現，使用即時RT-PCR檢討。確認人胰臟癌細胞株中IL6R mRNA(第1A圖)及gp130 mRNA(第1B圖)明顯表現。
[實施例2]
使用人重組IL-6，以細胞數的經時測量(第2A、2B圖)、趨化分析(第2C圖)、傷口癒合分析(wound healing assay)(第2D圖)檢討對IL-6人胰臟癌細胞株的增殖能力、趨化能力、移動能力的影響。IL-6對胰臟癌細胞株的細胞增殖沒有影響，但明顯增進趨化能力及移動能力。
[實施例3]
使用人重組IL-6(rhIL6)，以西方點漬法評價磷酸化STAT3(第3A圖)、磷酸化Erk1/2(pErk1/2)(第3B圖)、磷酸化Akt(pAkt)(第3C圖)對IL-6的人胰臟癌細胞株Capan-1的細胞內訊息的影響。細胞內磷酸化STAT3蛋白表現在添加rhIL6的15分鐘後，磷酸化Erk1/2蛋白表現在1小時後，各自明顯增進。不認為對磷酸化Akt表現有影響。
[實施例4]
胰臟癌的重要浸潤型態為神經浸潤的距離。重現神經浸潤及製作可測量神經浸潤距離的鼠神經浸潤模式，在檢討控制胰臟癌重要腫瘤浸潤型態的治療方法上為重要。神經浸潤模式係 以對免疫不全鼠的坐骨神經直接注射人胰臟癌細胞株Capan-1而製作。神經浸潤部分由肉眼看明顯較正常神經表面非常不平整(第4A圖)。組織學上神經浸潤的距離，與注入時Capan-1神經內擴散距離相比，1週後明顯變長，該距離經時變大(第4B圖)。神經浸潤由注入部位向中央處進展(第4C圖)，與胰臟癌神經浸潤為相同特徵。
[實施例5]
人胰臟癌的神經浸潤已報導會損害腫瘤周圍的神經組織。神經損傷中了解損傷部位的末梢端神經組織中IL-6的表現增強。為了檢討因神經浸潤的神經組織IL-6表現動態，使用神經浸潤模式，經即時RT-PCR法分別評價神經浸潤中央處及末梢端的神經組織內(第5B圖)所表現的鼠IL-6(mIL6)mRNA。mIL6在神經浸潤中央處呈現高表現，但在其他神經損傷模式中不認為有這種傾向(第5B圖)。以螢光免疫染色法確認mIL6蛋白表現，與許旺細胞(Schwann cell)標識(marker)S100陽性細胞區域中一致，認為是IL-6陽性顆粒(第5C圖)。神經浸潤模式中，顯然mIL6分泌細胞之一為許旺細胞(Schwann cell)。另外，EGF為神經損害中高表現的分子，但是鼠EGF(mEGF)mRNA表現動態與mIL6不同，不認為有在中央處高表現的傾向。此結果暗示神經浸潤部位的腫瘤-神經交互作用與IL-6強烈有關。
[實施例6]
以免疫染色檢討IL-6的重要細胞內訊息之磷酸化STAT3(pSTAT3)蛋白在胰臟癌細胞內的表現，與神經浸潤中央 方向相同，使磷酸化STAT3的表現增強(第6圖)。此結果與神經浸潤中央處的神經組織中IL-6表現亢進的分佈相同。
[實施例7]
經IL-6的細胞內訊息必須有gp130的媒介。使用siRNA及剔除胰臟癌細胞gp130的mRNA表現之胰臟癌細胞株製作的神經浸潤模式，神經浸潤距離受到抑制(第7圖)。此結果顯示神經浸潤中，由gp130媒介之含有來自IL-6的訊息是為重要。
[實施例8]
經IL-6的細胞內訊息必須要有IL-6受體(IL6R)存在。使用siRNA及剔除胰臟癌細胞IL6R的mRNA表現之胰臟癌細胞株製作的神經浸潤模式，神經浸潤距離受到抑制(第8圖)。此結果顯示神經浸潤中，由IL-6媒介的訊息是為重要。
[實施例9]
其次，對鼠神經浸潤模式投予JAK抑制劑或抗IL-6受體抗體，確認這些抑制劑對神經浸潤的影響。
JAK抑制劑對鼠神經浸潤模式的投予實驗
將抑制STAT3磷酸化的JAK抑制劑AG490(CALBIOCHEM)溶於DMSO，以生理食鹽水稀釋，調製成1%DMSO中AG490溶液。從製作神經浸潤模式2日後，連日投予鼠腹腔內0.5mg的AG490，在模式製作的2週後，採集注入癌細胞的坐骨神經，測定神經浸潤距離。控制群投予1%DMSO溶液，以相同方法投予。使用的小鼠數AG490群與DMSO群總計7隻。
抗IL-6受體抗體對鼠神經浸潤模式的投予實驗
將抑制人IL-6受體的抗IL-6受體抗體(中外製藥， Tocilizumab；MRA)溶於生理食鹽水，在製作鼠神經浸潤模式1週後，每週投予2次5μg/g的抗IL-6抗體抑制抗體。在製造該模式的3週後，採集注入癌細胞的坐骨神經，測定神經浸潤距離。控制群投予溶於生理食鹽水的人IgG(Sigma)5μg/g，以相同方法投予。使用的小鼠數為，抗IL-6受體抗體群6隻，控制群4隻。
統計分析
分析軟體為STATVIEW5.0。平均值的差以student-t兩端測定。圖中error bar表示標準差。
在IL-6的細胞內訊息中重要的STAT3磷酸化之JAK(Janus Kinase)抑制劑AG490，在癌細胞注入的2天後連續投予腹腔內12天，明顯抑制神經浸潤(第9A圖)。此結果顯示神經浸潤中，IL-6下游的細胞內訊息JAK-STAT是重要的。
為了產生人IL-6的抑制作用，將抗人IL-6受體抗體注入癌細胞1週後，每週2次，連續投予2週，明顯抑制神經浸潤(第9B圖)。此結果被認為人胰臟癌的神經浸潤因抗人IL-6受體抗體而被抑制。
[產業上可利用性]
本發明中顯示經由投予抗人IL-6受體抗體可抑制胰臟癌中的神經浸潤，而且顯示藉由投予抗IL-6受體抗體可治療胰臟癌。
<110> 中外製藥股份有限公司(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA)及 國立癌症中心總長代表之日本國(JAPAN AS REPRESENTED BY PRESIDENT OF NATIONAL CANCER CENTER)
<120> 神經浸潤抑制劑
<130> C1-A0803P
<150> JP 2008-147944
<151> 2008-06-05
<160> 12
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
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<223> 人工合成引子序列
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Claims (25)

  1. 一種胰臟癌治療劑，包括介白素6(IL-6)抑制劑為有效成分。
  2. 一種神經浸潤抑制劑，包括IL-6抑制劑為有效成分。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之神經浸潤抑制劑，其係抑制癌細胞的神經浸潤。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之神經浸潤抑制劑，其係抑制胰臟癌細胞的神經浸潤。
  5. 如申請專利範圍第2-4項任一項所述之神經浸潤抑制劑，其係抑制向中央處的神經浸潤。
  6. 如申請專利範圍第1-5項任一項所述之治療劑或抑制劑，其中該IL-6抑制劑為與IL-6受體結合的物質。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之治療劑或抑制劑，其中該IL-6抑制劑為抗IL-6受體抗體。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之治療劑或抑制劑，其中該抗IL-6受體抗體為鑲嵌抗體、人型化抗體、或人抗體。
  9. 一種胰臟癌之治療方法，包括投予對象IL-6抑制劑之步驟。
  10. 一種細胞之神經浸潤抑制方法，包括投予對象IL-6抑制劑之步驟。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之細胞之神經浸潤抑制方法，其係抑制癌細胞的神經浸潤。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之細胞之神經浸潤抑制方法，其係抑制胰臟癌細胞的神經浸潤。
  13. 如申請專利範圍第10-12項任一項所述之細胞之神經浸潤抑制方法，其係抑制向中央處的神經浸潤。
  14. 如申請專利範圍第9-13項任一項所述之方法，其中該IL-6抑制劑為與IL-6受體結合之物質。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該IL-6抑制劑為抗IL-6受體抗體。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該抗IL-6受體抗體為鑲嵌抗體、人型化抗體、或人抗體。
  17. 一種IL-6抑制劑之使用，用於製造胰臟癌治療劑。
  18. 一種IL-6抑制劑之使用，用於製造細胞的神經浸潤抑制劑。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之IL-6抑制劑之使用，其係抑制癌細胞的神經浸潤。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之IL-6抑制劑之使用，其係抑制胰臟癌細胞的神經浸潤。
  21. 如申請專利範圍第18-20項任一項所述之IL-6抑制劑之使用，其係抑制向中央處的神經浸潤。
  22. 如申請專利範圍第17-21項任一項所述之IL-6抑制劑之使用，其中該IL-6抑制劑為與IL-6受體結合之物質。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之IL-6抑制劑之使用，其中該IL-6抑制劑為抗IL-6受體抗體。
  24. 如申請專利範圍第23項所述之IL-6抑制劑之使用，其中該抗IL-6受體抗體為鑲嵌抗體、人型化抗體、或人抗體。
  25. 一種IL-6抑制劑，用於治療胰臟癌之方法。
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