TW201439322A

TW201439322A - 製造經蛋白分解處理之多肽之方法

Info

Publication number: TW201439322A
Application number: TW102142485A
Authority: TW
Inventors: Andreas Rummel
Original assignee: Syntaxin Ltd
Priority date: 2012-11-21
Filing date: 2013-11-21
Publication date: 2014-10-16
Also published as: CA3062150A1; KR102083371B1; US10087432B2; AU2012395188A1; TW201839132A; US10808236B2; MX381995B; KR20150085844A; AU2017221793B2; CN104870468A; MX2015002390A; TW201839134A; CN112048009A; TW201839135A; KR20180077343A; WO2014079495A1; CA3062150C; BR112015003591A2; US20150225709A1; JP2019030333A

Abstract

本發明關於具蛋白分解活性之多肽及彼之多種用途。

Description

製造經蛋白分解處理之多肽之方法

本發明關於具蛋白分解活性之多肽及彼於篩選及製造方法之多種用途。

肉毒芽胞梭菌(Clostridium botulinum)及破傷風芽胞梭菌(Clostridium tetani)皆產生高度強效之神經毒素，分別為肉毒神經毒素(BoNT)及破傷風神經毒素(TeNT)。這些芽胞梭菌之神經毒素(CNT)與神經元細胞專一性結合，擾亂神經傳遞物質的釋放。肉毒芽胞梭菌(Clostridium botulinum)分泌七種以A至G命名之不同抗原性之肉毒神經毒素(BoNT)血清型。所有血清型以及由破傷風芽胞梭菌(Clostridium tetani)分泌之相關破傷風神經毒素(TeNT)，皆為阻斷突觸胞吐作用之Zn²⁺-內蛋白酶，彼等切割與控制細胞膜融合之SNARE複合體形成有關之蛋白。CNT造成在肉毒症及破傷風中可見之弛緩性肌肉痳痺。此外，CNT活性也顯示會影響腺體分泌。這些CNT在肌肉及腺體活性之生理作用，日益用於多種治療及美容應用。肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)於1989年在美國被核准用於治療人類的斜視、瞼痙攣及其他異常。市面上可購得肉毒神經毒素A之蛋白製劑，例如商品名BOTOX(Allergan Inc.)及商品名DYSPORT(Ipsen Ltd)。在治療應用上，該包含神經毒素與其他細菌蛋白之複合物被直接注射至待治療之肌肉。在生理性pH之下，毒素會自該蛋白複合物釋放(Eisele et al.2011,Toxicon 57(4)：555-65.)，然後發生所欲之藥理作用。一種經改善之不含複合蛋白之BoNT/A製劑業已上市，商品名為XEOMIN或Bocouture(Merz Pharmaceuticals GmbH,Frankfurt/Germany)。BoNT之作用僅為暫時性，所以經常需要重複投予BoNT以維持治療效應。

各種CNT剛開始皆被合成為不活化之單鏈多肽。以BoNT為例，該神經毒素多肽具有約150kDa之分子量。此單鏈多肽之轉譯後處理涉及在稱為圈環(loop)之暴露區域(見表1)之限制性蛋白分解及形成鄰近之雙硫鍵。活性雙鏈神經毒素，係由蛋白水解該單鏈前體多肽所產生之二個切割產物組成：約50kDa之N端輕鏈及約100kDa之重鏈，二者由雙硫鍵連接。CNT的結構由三個結構域組成，即酶催化性輕鏈、包含轉位結構域(N端半體)及受體結合結構域(C端半體)之重鏈(參照Krieglstein 1990,Eur J Biochem 188：39；Krieglstein 1991,Eur J Biochem 202：41；Krieglstein 1994,J Protein Chem 13：49；Lacy et al.,1998,Nat.Struct.Biol.5(10)：898-902)。根據存在單鏈上介於形成該酶催化性結構域之胺基酸殘基，與形成該轉位結構域之胺基酸殘基之間的切割位點數量，內肽酶活性可產生二個大型切割產物(即輕鏈和重鏈)，還有代表前述之在神經毒素之單鏈中橋接輕鏈及重鏈之圈環區域之特徵性短肽(參照下表1)。

自醱酵溶液純化CNT是一項特別的挑戰，因為其中包含的神經毒素為未經處理多肽、部分處理多肽及完全處理多肽之混合物，彼等全都具有非常類似之生化及物理特性。當內蛋白分解活性水解該輕鏈與該圈環之間的肽鍵，然而該圈環與該重鏈N端之間的肽鍵仍為完整時，通常產製部分處理之神經毒素。另外，當該內蛋白分解活性自該重鏈釋放該圈環肽，但該圈環肽與該輕鏈之C端之間的肽鍵尚未被水解時，也會產生部分處理之神經毒素。根據醱酵條件及神經毒素之種類，不含圈環肽之完全處理多肽可受到5%至90%之部分處理或未處理多肽的嚴重污染。然而在一些情況中，神經毒素主要為未經處理，在治療使用之前需要經內肽酶處理以變成具有生物活性。

現有技術描述多種利用異源性蛋白酶處理芽胞梭菌神經毒素，以減少未經處理或部分處理之前體蛋白的量之方法。最廣為使用來活化芽胞梭菌神經毒素之蛋白酶係胰蛋白酶，雖然可有用地活化芽胞梭菌神經毒素血清型B(BoNT/B)及E(BoNT/E)(DasGupta & Sugiyama 1972,Biochem.Biophys.Res.Commun.48：108-112；Kozaki et al.,1974,Infect.Immun.10：750-756)，但其會產生二次產物(想必藉由靠近BoNT/A之重鏈次單位之C端的蛋白分解作用)，因此破壞毒素與其細胞受體之結合(Shone et al.,1985,Eur.J.Bioch.151：75-82)。理論上，自天然宿主(例如產製BoNT/A之肉毒芽胞梭菌)分離之內源性蛋白酶應可產製更專一之切割產物。因此，許多研究嘗試自天然宿主細胞分離參與芽胞梭菌神經毒素之蛋白分解活化之內源性蛋白酶。Dekleva與DasGupta(Dekleva & DasGupta,1989,Biochem.Biophys.Res.Commun.162：767-772)自產製BoNT/A之肉毒芽胞梭菌培養液，純化能蛋白分解切割BoNT/A成為重鏈及輕鏈次單位之組分。相同作者稍後之研究，進一步特徵化自肉毒芽胞梭菌分離之內源性蛋白酶(Dekleva & DasGupta,1990,J.Bact.172：2498-2503)，顯示一種由15.5kDa多肽與48kDa多肽組成之62kDa之蛋白。然而，觀察CNT在限制性暴露於Dekleva與DasGupta之62kDa蛋白之後的大型斷裂，該經分離之蛋白酶可能不是在芽胞梭菌細胞培養及感染期間負責活化CNT之尚未經識別之蛋白分解酶。事實上，其他學者最近指出梭菌蛋白酶(Clostripain)，也被稱為梭菌肽酶B(Mitchel & Harrington,1968,JBC 243：4683-4692)，可能參與CNT之特定活化(Sebaihia et al.,2007,Genome Res.17(7)：1082-1092；WO2009/014854)。有趣的是，此酶之結構及受質專一性讓人想起溶組織芽胞梭菌(Clostridium histolyticum)所分泌之α梭菌蛋白酶的該些特性(Dargatz et al.1993)，彼之同系物(具有74%胺基酸一致性)存在於肉毒芽胞梭菌(C.botulinum)中(CBO1920)。溶組織芽胞梭菌α梭菌蛋白酶是一種對精胺醯基鍵具有嚴格專一性之半胱胺酸內肽酶。其被合成為非活化之前原酶，經歷自催化切割以產生15.4及43kDa多肽，二者相連以形成異二聚體活性酶(Dargatz et al.1993)。溶組織芽胞梭菌α梭菌蛋白酶與肉毒芽胞梭菌62kDa蛋白酶皆需要還原劑及鈣以達完全活性，且容易受到相同的蛋白酶抑制劑抑制。這些資料強烈指出，α梭菌蛋白酶之肉毒芽胞梭菌同系物(CBO1920)是負責蛋白分解切割肉毒芽胞梭菌之神經毒素的內源性蛋白酶。編碼梭菌蛋白酶(CPE0846)之基因亦存在於產氣莢膜芽胞梭菌(C.perfringens)中，研究發現該基因受到二成分系統VirR/VirS之正調節(Shimizu et al.2002b)。

然而直到今日，仍缺乏進一步結論性的實驗證據，該領域仍然沒有能夠有效轉換單鏈前體CNT，成為真正成熟切割產物(即雙鏈神經毒素)之蛋白酶。本發明解決上述一或多個問題。

用於減少未經處理及/或部分處理之神經毒素肽，藉以改善神經毒素製劑之品質的手段和方法係高度所欲但尚不可得。因此，本發明之潛在技術問題可被視為藉由符合前述需求提供用於改善神經毒素多肽之製造之手段和方法。該技術問題係藉由以下申請專利範圍及本文中所述之實施態樣解決。

因此，本發明之一態樣關於一種具蛋白分解活性之多肽，其包含與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列。在另一態樣中，本發明關於一種具蛋白分解活性之多肽，其係由與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列組成。在另一態樣中，本發明關於一種具蛋白分解活性之多肽，其係由如SEQ ID NO：1所示之多肽序列組成。

此處所使用之用語「具蛋白分解活性之多肽」，係指本發明之多肽的酶催化功能，且表示本發明之多肽可水解肽鍵。在一態樣中，「具蛋白分解活性之多肽」係指能夠水解包含選自SEQ ID NO：4至25之任一者之胺基酸序列的多肽之多肽。此處所使用之用語「不具蛋白分解活性之多肽」，係指本發明之多肽的酶催化功能，且表示本發明之多肽無法水解肽鍵。

藉由測定多肽之蛋白分解活性，技藝人士可決定根據此處所述之序列定義之多肽，是否為本發明之多肽。一種用於檢測蛋白分解活性之試驗或測定系統包含：使包含與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列之多肽，與測試底物接觸。測試底物通常是已知可被本發明之多肽切割之多肽。較佳地，該測試底物係CNT，諸如BoNT或彼之片段。該測試底物可為例如未經切割/未經處理之BoNT(在此處稱為「scBoNT」)且可以是例如血清型A、B、C1、D、E、F或G(例如，「scBoNT/A」、「scBoNT/B」等)，或者該測試底物可為破傷風神經毒素。或者，該測試底物可為芽胞梭菌神經毒素之片段，該片段包含選自SEQ ID NO：4至25之任一者之胺基酸序列。該片段可為具有50個或更多胺基酸殘基之多肽，或具有最多49個胺基酸殘基之肽。在本說明書中，用語「多肽」係指具有50個或更多胺基酸殘基之分子，而用語「肽」係指具有2至49個胺基酸殘基之分子。在一態樣中，該測試底物係稱為LH_N之可溶性神經毒素片段，其包含輕鏈多肽、暴露圈環肽區域及重鏈多肽之N端半體(即轉位結構域H_N)。在另一態樣中，該測試底物係，或包含選自SEQ ID NO：4至25之任一者之肽(參照表1)。在另一態樣中，該測試底物係嵌合性神經毒素，其包含源自二或多種血清型之胺基酸殘基。

用於測定蛋白分解活性之分析，通常包含測定該測試底物轉換成彼之切割產物之程度的步驟。在多肽與測試底物接觸之後，觀察到產生一或多個切割產物，或觀察到切割產物之量增加，表示該多肽具有蛋白分解活性。該測定步驟可能涉及比較底物與切割產物。該比較可能涉及測定底物之量及/或一或多種切割產物之量，且亦可能涉及計算底物與切割產物之比率。此外，用於測定蛋白分解活性之分析可能包含比較試樣與參考試樣之步驟，其中該參考試樣通常包含(a)多肽，其包含與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列，且已知具有蛋白分解活性，及(b)測試底物，其已知可被(a)之多肽切割。在一態樣中，用於測定蛋白分解活性之分析包含，藉由電泳或管柱層析及(可任選的)光譜分析，分離底物與切割產物。很方便的是，以一或多種標記標示測試底物，以更輕易地檢測測試底物之減少及/或產物之增加。此處所使用之用語「標記」係指可檢測之標誌，包括例如放射性標記、抗體、螢光標記。測試底物及/或切割產物之量可藉由例如放射顯影術或光譜法測定，包括基於至少二種標記之間的能量共振轉移之方法。或者，可使用免疫學方法例如西方墨點或ELISA來檢測。用於測定本發明之多肽的蛋白分解活性之較佳方法，係描述於下列用於說明本發明之實施方式中。在本發明特別較佳之實施態樣中，在37℃下、120分鐘內使用選自100mM Tris-HCl，pH 8.0或PBS(50mM Na₂HPO₄,150mM NaCl,pH 7.4)之緩衝液，若超過20%、較佳地超過95%之測試底物被轉換成切割產物例如輕鏈及重鏈，則多肽具有蛋白分解活性。若測試底物不是全長神經毒素，而是例如該全長神經毒素之片段或該神經毒素之衍生物，仍適用該相同條件。很明顯的，此時切割產物將有所不同。不過，技藝人士仍可定量該對應之切割產物。在另一態樣中，該分析通常使用100ng之具蛋白分解活性之多肽及相對於底物1：100之莫耳比。在又一態樣中，可間隔採集試樣以了解不同時間之酶催化活性。此分析可藉由使用例如多種量之具蛋白分解活性之多肽加以改良。

SEQ ID NO：2顯示衍生自肉毒芽胞梭菌株ATCC 3502之不具蛋白分解活性之多肽的多肽序列，GenBank寄存編號「CAL82988.1」，其具有581殘基之胺基酸長度。SEQ ID NO：1顯示SEQ ID NO：2之具蛋白分解活性之衍生物，其缺乏SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1至248。

用語「包含與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列之多肽」係指一種多肽，其與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%之序列一致性。此外，該用語係指一種多肽，其包含與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列。該多肽可具有額外之胺基酸，例如在SEQ ID NO：1所示之序列的內部位置或N或C端，或在與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%一致性之胺基酸序列的內部位置或N或C端，其中甲硫胺酸可能存在於該多肽之N端。此外，該用語係指一種多肽，其缺乏例如在SEQ ID NO：1所示之序列的內部位置或N或C端之一或多個胺基酸殘基或在與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%一致性之序列的內部位置或N或C端之一或多個胺基酸殘基。

此處所使用之用語「序列一致性」係指，測定參考胺基酸序列與詢問序列之間的一致性，其中該等序列係經排比以獲得最高等級之匹配，且該一致性可利用電腦程式編碼之公開技術或方法計算，例如BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul 1990,J MoI Biol 215： 403)。一致性之百分比數值在一態樣中係針對整個胺基酸序列計算。在另一態樣中，序列一致性係針對最高50aa殘基、最高100aa殘基、最高150aa殘基、最高250aa、300aa、350aa、400aa、450aa、500aa或550aa殘基之序列長度計算。在另一態樣中，序列一致性係針對至少50aa殘基、至少100aa殘基、至少150aa殘基或至少250aa殘基計算。在較佳之實施態樣中，序列一致性係針對SEQ ID NO：1或2的整體長度測定，即分別針對333aa或581aa的長度。根據多種演算法之程式系列可被技藝人士取得，以用來比較不同序列。在此情況下，尼德曼和文施(Needleman and Wunsch)演算法或史密斯和華特曼(Smith and Waterman)演算法產生特別可靠之結果。為了進行序列比對及計算此處列舉之序列一致性數值，針對整體序列區域使用根據Clustal W演算法之商用程式DNASTAR Lasergene MegAlign(7.1.0版)，設定如下：成對排比參數：缺口罰分：10.00，缺口長度罰分：0.10，蛋白重量矩陣：Gonnet 250(除非另行說明，否則總是被用來作為序列排比之標準設定)。

此處所使用之用語「至少50%之序列一致性」，係指至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%。

本發明之具蛋白分解活性之多肽可與如SEQ ID NO：1所示之參考多肽序列具有相同數量之胺基酸。本發明亦包含具有額外或較少胺基酸殘基之多肽。在一態樣中，本發明之具蛋白分解活性之多肽係(或包含)SEQ ID NO：1或2之截短突變物，或與SEQ ID NO：1或2之序列具有至少50%序列一致性之多肽之截短突變物。SEQ ID NO：2之截短突變物可能缺乏例如胺基酸位置249之N端的一或多個胺基酸殘基。截短突變物可為具有蛋白分解活性之N端或C端截短突變物及/或內部截短突變物。在一態樣中，SEQ ID NO：2之該截短突變物缺乏SEQ ID NO：2之胺基酸位置1至248。在另一態樣中，SEQ ID NO：2之截短突變物係C端截短突變物。在一態樣中，該截短突變物缺乏最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50、100、150或最多170個連續胺基酸殘基。在另一態樣中，本發明之具蛋白分解活性之多肽具有至少200aa殘基、至少250aa殘基、至少300aa殘基、或至少333aa殘基之胺基酸長度。在另一態樣中，本發明之具蛋白分解活性之多肽具有最多333aa殘基、最多350aa殘基、最多573殘基、最多581aa殘基、最多592aa殘基、最多600aa殘基、或最多617aa殘基。

在另一態樣中，本發明之具蛋白分解活性之多肽包含：在SEQ ID NO：1(或與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列)之多肽鏈的N或C端及/或內部位置包含額外胺基酸殘基之多肽。這些額外的胺基酸殘基可包含最多5、最多10或甚至最多200、300或最多400個連續胺基酸殘基。在一態樣中，該額外之胺基酸殘基作為蛋白分解活性之抑制劑。在另一態樣中，該額外之胺基酸殘基可藉由蛋白酶移除。在另一態樣中，排除抑制本發明之多肽之蛋白分解活性之額外殘基。該額外之胺基酸殘基可能側接一或多個蛋白酶切割位點。在另一態樣中，該額外之胺基酸序列作為可檢測標籤及/或允許與固體支持結合。

在另一態樣中，SEQ ID NO：1(或與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列)之多肽鏈係藉由交換一或多個胺基酸殘基修飾。此處所使用之用語「交換」係指以不同的胺基酸取代一胺基酸。例如，在多肽序列之內最多1aa、2aa、3aa、4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、15aa、20aa或最多50aa可能被取代。交換可能涉及保守性或非保守性胺基酸改變，以期例如增加或減少本發明之多肽的底物結合或蛋白分解活性。

在一態樣中，本發明之具蛋白分解活性之多肽包含能水解底物成為二或多個天然切割產物之多肽。在另一態樣中，本發明之多肽水解底物成為二或多個與該天然切割產物不同之切割產物。此處所使用之用語「天然切割產物」或「天然產物」係指，當與野生型細胞培養中自相同底物產製之產物比較時，具有一致胺基酸序列之源自該底物之產物。在一態樣中，該切割產物係肉毒神經毒素或破傷風神經毒素之雙鏈神經毒素，在另一態樣中，該雙鏈神經毒素係自肉毒芽胞梭菌血清型A、B、C1、D、E、F或G分離之神經毒素。在又一態樣中，該雙鏈神經毒素係天然雙鏈神經毒素。

表1顯示TeNT及BoNT/A-G之前體、天然雙鏈神經毒素，並識別包含被本發明之多肽切割之胺基酸序列之暴露圈環。

應了解的是，上述及下列用語之定義及解釋比照適用於本說明書中所述之所有態樣，除非另行說明。

本發明之具蛋白分解活性之多肽適用於多種應用。一種商業重要應用係彼之於產製治療性神經毒素之用途，例如該些自肉毒芽胞梭菌分離者。目前，用於製備商用肉毒神經毒素製劑之肉毒芽胞梭菌細胞培養，受到大量經部分處理及/或未經處理之神經毒素的污染，二者皆不良地損害(即減少)該等醫藥組成物之特定活性。在例如溶解肉毒芽胞梭菌之後使用本發明之具蛋白分解活性之多肽，將有可能處理包含未經處理及/或部分處理之神經毒素之組成物，且因此將該些污染物轉換成完全處理之神經毒素。因此，可提供具有增加神經毒素特定活性之商業製品，其中細菌蛋白之總量可被減少，進一步減少病患形成抗體之風險。

在另一態樣中，本發明關於一種包含編碼本發明之多肽之核酸序列及可任意選擇地調節元件之核酸分子。此處所使用之用語「調節元件」係指基因表現(包括轉錄及轉譯)之調節元件，且包括例如tata盒、啟動子、增強子、核糖體結合位點、Shine-Dalgarno序列、IRES區、聚腺苷酸化信號、末端加蓋結構及類似者。該調節元件可包含一或多種異源性調節元件或一或多種同源性調節元件。「同源性調節元件」係本發明之核酸分子所自其衍生之野生型細胞之調節元件，其與該野生型細胞中該核酸分子或該多肽之基因表現的調節有關。本發明亦包含包含異源性調節元件之核酸分子。用語「異源性調節元件」係與該野生型細胞中該核酸分子或該多肽之基因表現的調節無關之調節元件。也包含誘導性表現之調節元件，例如誘導性啟動子。該核酸分子可為例如hnRNA、mRNA、RNA、DNA、PNA、LNA及/或經修飾之核酸分子。該核酸分子可為環狀、線性、嵌入基因組或附加型核酸。也包含編碼融合蛋白之連環體，該融合蛋白包含本發明之3、4、5、6、7、8、9或10個多肽。另外，該核酸分子可包含編碼用於細胞內運輸之信號序列之序列，例如用於運輸進入細胞內區室或用於運輸通過細胞膜之信號。

在另一態樣中，本發明關於包含如本發明之核酸分子之核酸分子的載體。載體可適用於活體外及/或活體內表現本發明之多肽。該載體可為暫時及/或穩定基因表現之載體。在一實施態樣中，該載體另包含調節元件及/或選擇標誌。該載體在一實施態樣中係病毒來源，在另一實施態樣中係噬菌體來源，在又一實施態樣中係細菌來源。

在另一態樣中，本發明關於包含本發明之核酸分子或載體之細胞。此處所使用之用語「細胞」包含適用於表現該核酸分子或該載體及特別是本發明之多肽之原核及/或真核細胞。該細胞可為不表現本發明之多肽或彼之同系物之宿主細胞。此處所使用之用語「同系物」係指一種多肽，其包含與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列。然而，本發明亦包含表現本發明之多肽或彼之同系物之細胞，特別是野生型細胞。在特定態樣中，本發明之細胞係選自肉毒芽胞梭菌(C.botulinum)、酪酸芽胞梭菌(C.butyricum)、巴拉提尼芽胞梭菌(C.baratii)及破傷風芽胞梭菌(C.tetani)。在較佳之態樣中，該細胞係肉毒芽胞梭菌血清型A、B或F。在另一態樣中，該細胞係肉毒芽胞梭菌Hall株(ATCC 3502)。在另一態樣中，該細胞係肉毒芽胞梭菌之BoNT/A生產株ATCC 19397，又稱為NCTC 4587及NCTC 7272。在另一態樣中，該細胞係肉毒芽胞梭菌之BoNT/A生產株NCTC 2916。在另一態樣中，該細胞係肉毒芽胞梭菌之BoNT/A2生產株Kyoto-F及Mauritius/NCTC 9837。在另一態樣中，該細胞係肉毒芽胞梭菌之BoNT/A3生產株A254 Loch Maree/NCTC 2012。在另一態樣中，該細胞係肉毒芽胞梭菌之BoNT/A4及B生產株CDC657。在另一態樣中，該細胞係肉毒芽胞梭菌之BoNT/A5及B3'生產株H04402 065。在另一態樣中，該細胞係肉毒芽胞梭菌之BoNT/B1生產株Okra/NCTC 7273。在另一態樣中，該細胞係肉毒芽胞梭菌之BoNT/B及F生產株CDC4013/NCTC 12265。在另一態樣中，該細胞係肉毒芽胞梭菌之BoNT/F1生產株Langeland/NCTC 10281。在另一態樣中，該細胞係產芽孢梭菌(Clostridium sporogenes)、產氣莢膜芽胞梭菌(Clostridium perfringens)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、臘狀桿菌(B.cereus)、蘇力菌(B. thuringiensis)、蕈狀芽孢桿菌(B.mycoidis)、嗜熱溶蛋白芽孢桿菌(B.thermoproteolyticus)、炭疽桿菌(B.anthracis)、巨桿菌(B.megaterium)、枯草桿菌(B.subtilis)、大腸桿菌(E.coli)或酵母菌細胞。在一態樣中，本發明之多肽係於細胞內經修飾(即糖基化、磷酸化、經蛋白酶處理等)。修飾亦包括添加非蛋白性輔因子包括金屬離子。包含如上所述之不具蛋白分解活性、任何中間多肽產物以及此處揭示之最終具蛋白分解活性之多肽之細胞係包含於本發明中。本發明亦包含的是，包含本發明之多肽之表現誘導子之細胞。該表現誘導子可為核酸分子或多肽或化學實體，包括具有增加本發明之具蛋白分解活性之多肽於細胞培養或彼之溶解物中之量或活性的作用之小化學實體。該表現誘導子可例如增加編碼本發明之多肽之核酸分子的轉錄或轉譯。或者，該表現誘導子可為能活化該不具蛋白分解活性之多肽SEQ ID NO：2(或包含與SEQ ID NO：2之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列之多肽)的化合物。在一態樣中，該細胞包含誘導子，其係能移除該多肽之N端的抑制性胺基酸殘基之具蛋白分解活性之多肽。該誘導子可藉由例如該領域之技藝人士所知之重組方法表現。或者，該誘導子可自細胞分離，例如芽胞梭菌細胞。

本發明亦關於本發明之核酸分子於製造本發明之具蛋白分解活性之多肽之用途。

在相關態樣中，本發明關於一種製造具蛋白分解活性之多肽之方法，該方法包括下列步驟：(a)化學合成或自核苷酸序列轉譯多肽，該多肽包含與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列；及(b)純化步驟(a)之多肽。

用語「化學合成」係指藉由化學手段合成多肽。該等方法係回顧於例如Nilsson et al.,Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.2005.34：91-118。用語「純化多肽」係指自包含本發明之多肽之混合物移除除了該多肽以外之化合物。該用語亦表示自包含除了本發明之多肽以外之化合物的混合物移除該多肽。在特定態樣中，該用語表示自彼之不具蛋白分解活性之前體分離該具蛋白分解活性之多肽。

核酸可在細胞或無細胞系統中被轉譯。多種無細胞轉譯系統為該領域之技藝人士可用。本發明包含例如在無細胞蛋白轉譯系統中轉譯，包含兔網狀紅血球溶解物、小麥胚芽溶解物、大腸桿菌溶解物或其他細胞溶解物，例如產自肉毒芽胞梭菌之溶解物等。本發明亦包含自本發明之核苷酸序列或本發明之載體轉譯本發明之多肽。轉錄可能藉由一或多種異源性調節元件或同源性調節元件調節或控制。本發明之此態樣亦包含於野生型細胞中轉譯，即自天然分離之細胞，例如肉毒芽胞梭菌(C.botulinum)、酪酸芽胞梭菌(C.butyricum)、巴拉提尼芽胞梭菌(C.baratii)及破傷風芽胞梭菌(C.tetani)之任何已知分離株。在特定態樣中，該細胞係肉毒芽胞梭菌 (C.botulinum)Hall株(ATCC 3502)。多種標準手段和方法可被該領域之技藝人士所用，以將核酸分子或載體帶入細胞中並且在細胞中將本發明之多肽表現為重組蛋白。另外，技藝人士知曉許多自細胞或細胞溶解物或自無細胞表現系統分離多肽之標準技術(例如Recombinant DNA Principles and Methodologies,J.Green,Marcel Dekker Inc.,1998；The Condensed Protocols：From Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook et al,Cold Spring Harbor Laboratory,2006；Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory,2000)。任何這些手段和方法都可使用於本發明之方法中。

本發明之第一多肽可自編碼該具蛋白分解活性之多肽之核酸分子轉譯。SEQ ID NO：26係該核酸分子之一例。或者，該核酸分子可編碼一不具蛋白分解活性之前體多肽，但該前體多肽可被轉換成本發明之具蛋白分解活性之多肽。SEQ ID NO：27係該核酸分子之一例。該不具蛋白分解活性之前體亦稱為「不活化之BoNT水解酶」，簡稱iBH。此不具蛋白分解活性多肽可在例如轉譯期間或轉譯後活化，或藉由例如使該不具蛋白分解活性多肽與能移除該不具蛋白分解活性多肽之N端的不活化胺基酸殘基之蛋白酶接觸。不具蛋白分解活性多肽之一實例係由SEQ ID NO：2所表示之多肽。另一實例係包含與SEQ ID NO：2之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列之多肽。在一態樣中，用語「N端之不活化胺基酸殘基」關於該多肽之前248aa殘基。在另一態樣中，此用語係指該多肽之最多10aa、50aa、100aa、150aa、200aa、250aa殘基之片段。任何該等多肽皆可用於本發明之方法以製造具蛋白分解活性之多肽。在一態樣中，能自此多肽之N端移除不活化胺基酸殘基之蛋白酶係自例如肉毒芽胞梭菌、酪酸芽胞梭菌、巴拉提尼芽胞梭菌及破傷風芽胞梭菌分離。在另一態樣中，能移除該不活化胺基酸之蛋白酶係藉由提供該細胞之經分餾溶解物或不經分餾溶解物提供。不活化之胺基酸殘基可藉由使該不具蛋白分解活性之多肽與該溶解物接觸且培養直到該不具蛋白分解活性之多肽被轉變成為具蛋白分解活性之多肽加以移除。

在本發明之方法的另一態樣中，該多肽係於細胞中轉譯。該細胞可能是原核或真核細胞。在一態樣中，該細胞係選自大腸桿菌、枯草桿菌或酵母菌；大腸桿菌係高度較佳之宿主細胞。本發明亦包含在野生型細胞(即自天然分離之細胞)中轉譯本發明之多肽，例如肉毒芽胞梭菌、酪酸芽胞梭菌、巴拉提尼芽胞梭菌及破傷風芽胞梭菌之任何已知分離株。在特定態樣中，該細胞係肉毒芽胞梭菌(C.botulinum)Hall株(ATCC 3502)。在另一特定態樣中，該細胞係如上述之本發明之細胞。

由本發明之方法獲得之轉譯產物可藉由多種手段純化，該等手段皆為該領域之技藝人士所知(例如Recombinant DNA Principles and Methodologies,J.Green, Marcel Dekker Inc.,1998；The Condensed Protocols：From Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook et al,Cold Spring Harbor Laboratory,2006；Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory,2000)。典型之純化本發明之多肽之方法可能涉及離心細胞溶解物、硫酸銨沉澱蛋白、重懸蛋白、離心經重懸之蛋白、離子交換層析、分子排阻層析、疏水性交互作用層析及類似者。該等步驟之許多不同順序之組合可被用於純化本發明之多肽。純化本發明之多肽之較佳方法係描述於說明本發明之實施方式中。

在一態樣中，該純化步驟包含使本發明之多肽與固體支持結合。用語「固體支持」係指包含例如矽石、交聯葡聚糖、交聯聚丙醯胺或交聯洋菜糖及類似者之基材。亦包括特別是多肽、玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、耐綸、澱粉酶、天然及經改質之纖維素、聚丙醯胺、輝長岩及磁鐵礦。在本發明之一態樣中，固體支持係選自下列之多醣基材：瓊脂糖、葡聚糖凝膠、洋菜糖、葡聚糖纖維素、微晶纖維素及藻酸鹽珠。在另一態樣中，該固體支持可由玻璃珠及/或多肽基體組成。

在一態樣中，固體支持係與本發明之抗體連接。用語「連接」在一態樣中係指穩定連接或穩定相連。在另一態樣中，連接包括例如間接或直接、非可逆或可逆、物理化學、靜電及/或共價鍵交互作用。在一態樣中，該抗體係直接或經由連接子分子與該固體支持共價連接。該抗體可經由連接子與該固體支持連接，包括小分子化合物及肽(或多肽)連接子分子。該固體支持可具有幾乎任何可能的結構構型或安排，只要該經耦合之抗體能與彼之抗原結合。因此，該基材或固體支持可為球狀(如珠)或圓柱狀(如試管內側表面或棒桿之外側表面)。或者，該表面可為不規則或平面，例如薄板或測試條。

與固體支持連接之該抗體可被用於例如本發明之製造方法或診斷方法中。在一態樣中，該製造方法可包含親和性層析之步驟，其中該親和性層析係基於與固體支持連接之抗體。在一實施態樣中，該抗體係與本發明之具蛋白分解活性之多肽專一性結合之抗體。在另一實施態樣中，該抗體係與本發明之不具蛋白分解活性之多肽專一性結合之抗體。

在另一態樣中，製造本發明之具蛋白分解活性之多肽之方法包含自包含額外成分之混合物純化本發明之多肽。純化可根據例如極性、電荷及大小。因此，該方法在一態樣中可能包含一或多種選自下列之分離步驟：正相HPLC、逆相HPLC、親水性交互作用層析(HILIC)、疏水性交互作用層析(HIC)、離子交換層析(IEC)(包括陰離子交換層析及陽離子交換層析)、分子排阻層析(SEC)、凝膠滲透層析(GPC)。

在另一態樣中，該純化包含下列步驟：(a)藉由陰離子交換層析分離；(b)藉由分子排阻層析分離；(c)藉由疏水性交互作用層析分離；及(d)藉由分子排阻層析分離。

自層析管柱收集之一或多種組分可藉由例如沉澱或超過濾濃縮。

在一態樣中，本發明關於包含本發明之具蛋白分解活性之多肽之組成物。使用此處揭示之方法，有可能製造本發明之具蛋白分解活性之多肽，其實質上不含不具蛋白分解活性之多肽。換言之，本發明之方法提供具蛋白分解活性之多肽及包含無本發明之多肽的不活化前體蛋白實質污染之組成物。組成物被視為不包含實質污染或實質上不含不具蛋白分解活性之前體多肽，若使用西方墨點檢測方法，低於5%之不具蛋白分解活性之前體可被檢測，其中該5%係指不具蛋白分解活性之前體相對於具蛋白分解活性與不具活性之多肽總量之量。在另一態樣中，該組成物係實質上純的，且包含至少50%之本發明之具蛋白分解活性之多肽，其中該50%係指具蛋白分解活性前體相對於該組成物所包含之蛋白總量之量。在另一態樣中，該實質上純的組成物包含至少75%、80%、90%或至少98%具蛋白分解活性之多肽。

在另一態樣中，本發明亦關於可自上述及實施方式中所說明之製造具蛋白分解活性之多肽之方法獲得之多肽。該具蛋白分解活性之多肽在一態樣中係具有SEQ ID NO：1之多肽序列之具蛋白分解活性之多肽。在另一態樣中，具蛋白分解活性之多肽係與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽。在又一態樣中，具蛋白分解活性之多肽係包含與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列之多肽。此處所使用之用語「可獲得之多肽」在一態樣中係指自本發明之核酸轉譯之多肽。該多肽接著可進行轉譯後修飾，例如醯基化、烷基化、醯胺化、胺基酸添加、胺基酸刪除、糖基化、氧化、S-麩胱甘肽化、磷酸化、硫酸化、蛋白分解處理及類似者。另外，該多肽可能與金屬離子結合，例如Li⁺、Na⁺、K⁺、Ag⁺、Cs⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺或Zn²⁺。較佳地，該金屬離子係Zn²⁺、Mn²⁺或Co²⁺。

本發明在一態樣中亦關於與本發明之多肽專一性結合之抗體。此處所使用之用語「抗體」包含單株抗體、多株抗體、單鏈抗體、人抗體、人化抗體、靈長動物化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、合成性抗體、經化學或酶改質之衍生物、任何該等抗體之片段或由天然存在及/或化學修飾之核酸組成之適體。該等抗體之片段包括F(ab')2、F(ab)、Fv或scFv片段或任何該等片段之經化學或酶修飾之衍生物。

在一態樣中，本發明之抗體將與本發明之具蛋白分解活性之多肽或彼之不具蛋白分解活性之前體專一性結合。在一態樣中，對本發明之具蛋白分解活性之多肽具專一性之抗體與此處所述之不具蛋白分解活性之多肽交叉反應。在另一態樣中，該抗體能區別本發明之具蛋白分解活性之多肽與彼之不具活性之前體。在另一態樣中，該抗體專一性之表位係位於該不具蛋白分解活性之多肽之胺基酸區域，但不存在於具蛋白分解活性之多肽。例如，該表位可為由多肽之胺基酸殘基1至248所組成之多肽區域之表位，該多肽包含與SEQ ID NO：2之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列。

在另一態樣中，該表位係由位於多肽之胺基酸249之N端的胺基酸殘基所形成，該多肽包含與SEQ ID NO：2之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列。在另一態樣中，該表位係藉由蛋白分解處理自此處所述之不具蛋白分解活性之多肽移除。

在另一態樣中，本發明之抗體專一性之表位係位於多肽N端之表位，該多肽包含與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列。在本發明之此態樣中所使用之用語「N端」，係指包含該多肽序列之N端50個胺基酸殘基之多肽區域，較佳地該多肽序列之N端25個胺基酸殘基。在特定態樣中，該用語係指N端14個胺基酸殘基。此處所使用之用語「表位」關於由本發明之抗體所識別之抗原決定簇。在一態樣中，該表位係線性表位，在另一態樣中，該表位係構形表位。在特定態樣中，該抗原決定簇係由具有本發明之具蛋白分解活性之多肽之N端的胺基酸序列之肽組成，其中該肽可具有7至14個胺基酸長度，較佳地8、9、10、11、12、13或14個胺基酸殘基。

用語「專一性結合」或「專一性結合至」在一態樣中，係指本發明之抗體不與本發明之多肽上之其他表位或其他一般多肽顯著程度地交叉反應。表位專一性係本發明之抗體的一項重要特徵。抗體對於具蛋白分解活性與不具蛋白分解活性之多肽之專一性，在一態樣中將為至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%。專一性結合可藉由多種廣為周知之技術測定，包括例如競爭試驗。另一項重要特徵為抗體之敏感性。在本發明之一態樣中，敏感性將為使試樣所包含之至少70%、至少80%、至少90%、至少95%之表位被結合。敏感性可藉由廣為周知之技術測定。該領域之技藝人士將可藉由例行實驗決定各項測定之操作及理想測試條件。結合測定之習用技術包括放射性免疫測定、ELISA、平衡透析、恆溫微量熱計量、BIACORE®測定(表面電漿共振，SPR)或其他表面吸附方法。BIACORE® SPR系統測量抗體-抗原交互作用。SPR反應表現出當分析物結合或解離時，在檢測器表面之質量濃度的改變。根據SPR，即時BIACORE®測量值直接監測即時發生之交互作用，見BIAapplications Handbook,version AB(reprinted 1998),BIACORE® code No：BR-1001-86；BIAtechnology Handbook,version AB(reprinted 1998),BIACORE® code No：BR-1001-84。結合特性(例如本發明之抗體的敏感性)原則上可藉由利用存在於感測器表面之固定抗原(配體)之結合分析測定。受測抗體(分析物)將以流動相(即溶液)提供。在一些情況中，抗原經由與另一稱為捕捉分子之固定分子結合，而間接連接至該表面。當抗體以離散型脈衝注射流過具有固定抗原之表面時，基本上可次分出三相：(i)抗體與抗原在試樣注射期間結合；(ii)試樣注射期間之平衡或穩定狀態，其中抗體結合之速率與自該抗體-抗原複合物解離之速率平衡；(iii)在緩衝液流動期間抗體自表面解離。將了解的是，該分析可替代性地藉由固定所欲測試之抗體及使用包含抗原之溶液作為流動相實施。結合及解離相提供分析物-配體交互作用之動力學的資料(k_a及k_d，複合物形成及解離之速率，k_d/k_a=K_D)。平衡相提供分析物-配體交互作用之親和性的資料(K_D)。在本發明之一態樣中，本發明之抗體具有低於0.5μM、在另一態樣中低於0.05μM且在又一態樣中低於0.02μM之K_D。

本發明所提及之抗體可藉由使用例如Harlow and Lane,1988(Harlow and Lane,"Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,Cold Spring Harbor,1988)中所述之方法製造。單株抗體可藉由最初於Kohler & Milstein,1975(Kohler & Milstein 1975,Nature 256：495)及Galfre & Milstein,1981(Galfre & Milstein 1981,Meth Enzymol 73：3)中所述之技術製備。該技術包含融合小鼠骨髓瘤細胞與衍生經免疫接種哺乳動物的脾細胞。抗體可進一步藉由該領域中廣為周知之技術改善。例如，在BIACORE®系統使用之表面電漿共振可被用於增加與本發明之多肽內之前述表位結合之噬菌體抗體之效率(見Schier et al.,1996,Human Antibodies Hybridomas 7：97； Malmborg et al.,1995,J.Immunol Methods 183：7)。

在本發明之一態樣中，該抗體係藉由使用包含前述表位或由前述表位組成之肽產製。該肽可例如合成性產製，或藉由重組表現產製。或者，本發明之抗體可藉由使用天然存在之本發明之具蛋白分解活性或不具蛋白分解活性之多肽產製。在後者中，應了解的是所形成之抗體將進一步測試其對本發明之多肽之專一性。在本發明之其他態樣中，本發明之單株抗體係藉由使用本發明之多肽產製，其中本發明之多肽可藉由清潔劑處理以使該表位為免疫可用。然而，將了解的是，若該抗體將以構型表位為目標，則不應採取該清潔劑處理。在另一態樣中，免疫刺激劑例如鑰孔狀帽貝血藍素(KLH)也可應用於該方法中，特別是當使用合成性肽時。

本發明之抗體可被用於例如親和性層析、免疫沉澱及免疫定位本發明之多肽，以及用於監測該多肽於樣本或重組有機體中之存在。另外，本發明之抗體可被用於檢測方法或診斷方法中。在特定態樣中，本發明之抗體係用於西方墨點法或ELISA中。此外，本發明之抗體可被用於治療應用。特別是，該抗體可被用於抑制本發明之具蛋白分解活性之多肽之活性。因此，本發明之抗體也具有如下所述之許多治療應用。

本發明亦關於本發明之具蛋白分解活性之多肽於蛋白分解處理多肽之方法中之用途。在一態樣中，本發明關於一種製造經蛋白分解處理之多肽之方法，該方法包含使下列(a)與(b)接觸之步驟：(a)第一多肽，該第一多肽係本發明之多肽，(b)第二多肽，該第二多肽係易被該第一多肽蛋白分解，其中該接觸導致蛋白分解處理該第二多肽成為至少二個切割產物。

本發明亦關於使用來自產酶溶桿菌(Lysobacter enzymogenes)(ATCC 29487)之Lys-C及/或Lys-N及/或精胺醯基內肽酶(內蛋白酶Arg-C,LeR)(Wright DS,Graham LD,Jennings PA.Biochim Biophys Acta.1998 Dec 22；1443(3)：369-74)。另外，本發明亦包含使用纖維蛋白溶酶及/或omptin(OmpT)(一種切割(Arg/Lys)-(Arg/Lys)模體之膜結合絲胺酸蛋白酶)(K.Sugimura and T.Nishihara.J.Bacteriol.170(1988),pp.5625-5632)於蛋白分解處理CNT例如BoNT/A之方法中。在一態樣中，本發明關於一種製造經蛋白分解處理之多肽之方法，該方法包含使下列(a)與(b)接觸之步驟：(a)第一多肽，該第一多肽係Lys-C或Lys-N，(b)第二多肽，該第二多肽係易被該第一多肽蛋白分解，其中該接觸導致蛋白分解處理該第二多肽成為至少二個切割產物，且其中該第二多肽係BoNT/A單鏈。用語「Lys-C」係指專一性切割離胺酸C端之肽鍵之源自產酶溶桿菌之33kDa絲胺酸內蛋白酶Lys-C(離胺醯基內肽酶，LeK，Genbank編號Q7M135)或彼之具有至少50%序列一致性之同系物。在一實施態樣中，彼之與Lys-C具有至少50%序列一致性之同系物維持Lys-C之功能性(即蛋白分解活性)。因此，在一實施態樣中，該同系物能水解單鏈肉毒神經毒素(例如血清型A(BoNT/A))以產生雙鏈肉毒神經毒素(例如血清型A(BoNT/A))。在一實施態樣中，用語「Lys-C」亦包含功能性相等蛋白酶，例如該些和Lys-C辨識相同切割序列且水解Lys之羧基側之蛋白酶。用語「Lys-N」係指自多葉奇果菌(Grifola frondosa)及糙皮側耳(Pleurotus ostreatus)分離之金屬內肽酶Lys-N(Nonaka T et al.,1997,J Biol Chem.272：30032-30039；Nonaka T et al.,1998,J Biochem.1998 124：157-162；Hori T et al.,2001,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.57：361-368)。該用語亦包含該蛋白酶之具有至少60%序列一致性之同系物。

此方法可被用於例如製造經蛋白分解處理之多神經毒素(CNT)或肉毒神經毒素(BoNT)。本發明所使用之用語「BoNT」係指肉毒神經毒素且係指自肉毒芽胞梭菌(C.botulinum)獲得之神經毒素，諸如血清型A、B、C1、D、E、F或G之BoNT。用語「CNT」及「BoNT」也包含重組神經毒素及包含一或多種修飾(包括化學修飾或基因修飾)之經修飾之神經毒素。用語「基因修飾」係指刪除、取代或添加一或多種胺基酸殘基。使用本發明之方法，即有可能獲得受到顯著較少未經處理或部分處理之神經毒素污染之神經毒素組成物，因為該些污染物被有效地處理成為雙鏈神經毒素。在一態樣中，該雙鏈神經毒素係天然雙鏈神經毒素，其中該輕鏈之C端與該重鏈之N端係與自野生型芽胞梭菌分離之該對應之經完全處理之雙鏈神經毒素一致。

此處所使用之用語「接觸」係指使至少二種不同的化合物物理接近(physical proximity)以允許該等化合物之物理及/或化學交互作用發生。根據本發明之方法，該二種不同的化合物在一態樣中係溶液所包含之第一及第二多肽。接觸係於允許該第一及第二多肽足以發生交互作用之條件及時間下進行。此處所使用之用語「經蛋白分解處理之多肽」在一態樣中係指多肽，彼之多肽鏈之一或多個肽鍵已經水解或切割。在另一態樣中，該用語係指已被內蛋白酶或內肽酶蛋白分解切割之多肽。在另一態樣中，該用語係指已被切割至少50%之程度的多肽。在另一態樣中，該經蛋白分解處理之多肽係第二多肽。在另一態樣中，至少60%、70%、80%、90%或95%係經蛋白分解處理。

此處所使用之用語「第一多肽」係指本發明之多肽，即具蛋白分解活性之多肽，又稱為「活性BoNT水解酶」。由於該活性BoNT水解酶可自肉毒芽胞梭菌之上清液獲得，其最初被命名為天然BoNT水解酶，簡稱「nBH」。然而，用語「第一多肽」及「nBH」亦指可得自其他來源之BoNT水解酶。此處所使用之用語「第二多肽」係指該第一多肽之底物。用語「易被蛋白分解」係指第二多肽之特徵或條件，且用於此處係指第二多肽可被該第一多肽蛋白分解切割。換言之，用語「易被蛋白分解」係指第二多肽包含允許其作為第一多肽之底物之蛋白酶辨識及切割位點。該「第二多肽」係第一多肽之底物且經蛋白分解處理為二或多個切割產物(較佳地僅二肽，即經由雙硫鍵連接之L鏈或彼之片段及H鏈或彼之片段)。使用如上述之分析，技藝人士可根據本發明之定義測試給定多肽是否為第一多肽之底物，即「第二多肽」。用語「至少二個切割產物」包括例如最多二、三、四、五及最多六個切割產物。

此方法可被用於例如製備包含芽胞梭菌神經毒素之醫藥組成物或用於產製質譜法中所使用之多肽片段。第一多肽及第二多肽可於經蛋白分解處理之多肽之製造方法中的不同步驟接觸。在一態樣中，使第一多肽與第二多肽接觸之步驟係於細胞內。在此實施態樣之特定態樣中，該第一及第二多肽係於該細胞中表現。

在另一態樣中，該接觸步驟係於細胞溶解物或經純化之細胞溶解物中。此態樣包含添加第一多肽至溶解物或經純化之溶解物中。第一多肽可在自細胞溶解物純化第二多肽期間之不同步驟添加。例如，第一多肽可在下列步驟之前或之後添加：蛋白沉澱、離子交換層析、疏水交互作用層析及/或分子排阻層析。另外，亦包含添加第一多肽至醫藥組成物。在此態樣中，本發明之多肽被用於例如蛋白分解切割第二多肽，以例如活化包含於該醫藥組成物中作為治療劑之第二多肽。同樣設想到的是投予第一多肽至個體，以蛋白分解處理該個體體內之第二多肽。投予亦包括共投第一及第二多肽。此方法亦包含在足以切割該第二多肽之條件及時間下培養之步驟。在一態樣中，該條件可包含添加選自100mM Tris-HCl，pH 8.0或PBS(50mM Na₂HPO₄,150mM NaCl,pH 7.4)之緩衝液。較佳之緩衝液條件包括100mM Tris-HCl，pH 8.0。「足以切割之時間」可利用上述分析測定。在一態樣中，該「足以切割之時間」視經蛋白分解處理之多肽或包含彼之組成物所應具有之切割程度而定。在一態樣中，該方法包含培養第一及第二多肽至少30分鐘、60分鐘、120分鐘或至少240分鐘之步驟。在另一態樣中，第一及第二多肽係培養最多30分鐘、60分鐘、120分鐘、240分鐘、480分鐘或最多600分鐘。在另一態樣中，該方法包含於4℃或37℃培養第一及第二多肽之步驟。在另一態樣中，該方法包含培養最多1小時、最多2小時、4小時、6小時、10小時或最多16小時之步驟。

在一態樣中，該第二多肽之多肽鏈包含選自SEQ ID NO：4至25之任一者之序列。在更特定之態樣中，該第二多肽之多肽鏈包含選自SEQ ID NO：4至25之任一者之序列，且其中第二多肽在SEQ ID NO：4至25之任一者之該序列內的鹼性胺基酸殘基C端被切割。該序列代表本發明之具蛋白分解活性之多肽之已知底物的胺基酸序列。如此處所示，該底物在序列所包含之鹼性胺基酸殘基的C端被切割，比較表1中欄LC及H_N。在較佳之態樣中，該第二多肽包含選自SEQ ID NO：4至10之序列 (例如血清型BoNT/A1，SEQ ID NO：4)。在另一較佳態樣中，該第二多肽係BoNT/A或彼之衍生物，包括例如SEQ ID NO：3之多肽或彼之衍生物。在本發明之此態樣及其他態樣中所使用之用語「衍生物」，包含胺基酸突變例如添加、取代、刪除或截短一或多個胺基酸殘基。

在一態樣中，第二多肽包含SEQ ID NO：4至25之任一者或SEQ ID NO：3之衍生物，其中該衍生物具有一或多點突變及/或一或多個額外之胺基酸殘基。在另一態樣中，該衍生物具有最多1、最多2、最多3、最多4、最多5、最多6、最多7、最多8、最多9、最多10、最多15個點突變。藉由使用如此處所述之測定蛋白酶活性之活性分析，技藝人士可測定給定衍生物是否經本發明之具蛋白分解活性之多肽處理。在另一態樣中，該衍生物包含改變鹼性胺基酸成為非鹼性胺基酸殘基之點突變。在另一態樣中，衍生物與SEQ ID NO：4至25之任一者具有至少50%之序列一致性。在另一態樣中，該衍生物或包含該衍生物之多肽係第一多肽之底物且可被第一多肽蛋白分解切割。典型實例係SEQ ID NO：3之衍生物，其包含例如一或多個在輕鏈或重鏈中之點突變。

在另一態樣中，該第二多肽包含(a)與SEQ ID NO：3之序列具有至少30%序列一致性之多肽序列[(ATCC 3502之BoNT/A，Genbank編號AAA23262)]；或(b)選自破傷風神經毒素、凝血級聯因子X或凝血酶原(因子II)之蛋白、胰消化酶(如胰蛋白酶、胰凝乳酶)、胃蛋白酶、木瓜酶之多肽序列。至少30%係指至少30%、至少40%、至少50%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%。在特定態樣中，與SEQ ID NO：3之序列具有至少50%序列一致性之該第二多肽序列之序列一致性，係根據SEQ ID NO：3之胺基酸位置420至約466決定，在另一態樣中，該序列一致性係根據SEQ ID NO：4至25之任一者決定。換言之，該態樣係指包含多肽序列之第二多肽，該多肽序列與SEQ ID NO：3之胺基酸位置420至466之間的多肽序列具有例如至少30%之序列一致性或與SEQ ID NO：4至25之任一者之多肽序列具有至少30%之序列一致性。根據此定義之多肽可得自例如肉毒芽胞梭菌(C.botulinum)、破傷風芽胞梭菌(C.tetani)或產芽胞芽胞梭菌(C.sporogenes)。該第二多肽可為例如天然存在之神經毒素(例如BoNT/A、B、C1、D、E、F或G)或彼等之包含一或多個胺基酸突變(例如添加、取代、刪除或截短一或多個胺基酸殘基)之衍生物。包含例如缺乏例如天然神經毒素H_C結構域或彼之部分之衍生物或具有其他取代神經毒素H_C結構域之胺基酸殘基之衍生物以及具有BoNT之額外輕鏈或與輕鏈N端融合之另一蛋白貨物分子之衍生物。

在另一態樣中，第二多肽可包含在N或C端或內部位置之額外胺基酸殘基。該額外之胺基酸殘基可能側接一或多個蛋白酶切割位點。在另一態樣中，該額外之胺基酸序列作為可檢測標籤及/或允許與固體支持結合。實例為his標籤或GST標籤。另一實例為包含Strep標籤之胺基酸序列VPPTPGSAWSHPQFEK，較佳地被加至C端。

在特定態樣中，該第二多肽係包含如GenBank編號CBZ04958.1、YP_002805603.1、ZP_02994746.1、YP_001788403.1、YP_001782718.1、ZP_02616437.1、ZP_02614241.1、YP_001392361.1、YP_001255575.1所示之多肽序列之多肽或彼之具有至少50%序列一致性之同系物。

在另一態樣中，該第二多肽之生物活性係由蛋白分解切割調節。技藝人士已知的是，許多多肽之功能可藉由蛋白分解處理加以調節。此處所使用之「調節」係指增加或減少、活化或未經活化。例如，許多芽胞梭菌神經毒素之生物活性係藉由蛋白分解處理單鏈神經毒素成為雙鏈神經毒素加以增加或引發，其中該雙鏈神經毒素由多肽輕鏈及重鏈組成，彼等經由雙硫鍵共價連接。神經毒素之生物活性包含至少三種不同活性：第一活性為位於該神經毒素之輕鏈中之「蛋白分解活性」，且負責水解涉及調節細胞膜融合之一或多種多肽之肽鍵。第二活性係位於經處理之神經毒素之重鏈N端之「轉位活性」，其涉及運輸輕鏈通過溶酶體膜及進入細胞質。第三活性係位於經處理之神經毒素之重鏈C端之「受體結合活性」，其涉及神經毒素與標靶細胞之結合及標靶細胞對神經毒素之攝取。在較佳態樣中，此處所使用之用語生物活性係指蛋白分解活性。在更佳之態樣中，該用語係指增加蛋白分解活性。

芽胞梭菌神經毒素之生物活性可藉由多種檢測測量，所有檢測皆為該領域之技藝人士所知。這些檢測允許測定上述之一或多種活性。例如，小鼠LD₅₀檢測或如Pearce et al.,1994(Pearce LB,Borodic GE,First ER,MacCallum RD(1994),Toxicol Appl Pharmacol 128：69-77)及Habermann et al.,1980(Habermann E,Dreyer F,Bigalke H.(1980),Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.311：33-40)所述之活體外小鼠膈神經半橫膈(MPN)測試允許測定給定神經毒素製劑對於活生物體或經分離之神經肌肉組織之毒性效應。為了建立LD₅₀檢測中之毒性效應，神經毒素必須具有上述三種活性中之各種生物活性。另外，還有許多其他檢測可測定例如神經毒素或該神經毒素之輕鏈是否具有蛋白分解活性。該等檢測係基於例如使BoNT/A與SNAP-25接觸。或者，可使用代表SNAP-25之切割位點之肽，其中該肽可經標示以方便檢測。在較佳之態樣中，生物活性係藉由使用如上述之MPN測試檢測。

在另一態樣中，該第一多肽係藉由蛋白分解處理不活化之前體多肽加以活化，該不活化之前體多肽包含與SEQ ID NO：2之序列具有至少60%序列一致性之多肽序列。此態樣基於具有SEQ ID NO：2之多肽序列之多肽係不具蛋白分解活性之觀察，然而彼之N端截短物具有蛋白分解活性。本發明亦包含使用此處所述之方法中之不具蛋白分解活性之多肽。此處所述之不具蛋白分解活性之多肽可藉由例如移除N端片段或移除包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1至248之整個N端加以活化。在一態樣中，N端係藉由蛋白酶移除，在另一態樣中，N端係藉由SEQ ID NO：2之自體蛋白水解移除。60%序列一致性係指與全長NT02CB1447之序列排比。

在另一態樣中，本發明之製造經蛋白分解處理之多肽之方法，包含純化該經蛋白分解處理之第二多肽或彼之至少一或二種或多種切割產物之步驟。肉毒芽胞梭菌表現之BoNT/A之純化基本上可如現有技術(DasGupta 1984,Toxicon 22,415；Sathyamoorthy 1985,J Biol Chemistry 260,10461)所述之方式進行。特別是，神經毒素之純化可包含一或多種沉澱及萃取步驟、一或多種濃縮步驟及其他不同的層析步驟。重組單鏈BoNT/A及彼之純化係描述於現有技術(Rummel et al.,2004,Mol Microbiol.51：631-43)。

在較佳之實施態樣中，芽胞梭菌株係例如產製BoNT/A或彼之衍生物之肉毒芽胞梭菌。在醱酵方面，可使用由DasGupta B.R.et al.in Toxicon,vol.22,No.3,p.414 to 424,1984所述之方法。因此，0.5%之酵母菌萃取物及0.6%之高壓滅菌酵母菌糊料係添加至2%之N-Z胺A型培養基，利用4N NaOH調整pH至7.2，以此方式製備之培養基之後將經高壓滅菌。在此培養基中加入另經高壓滅菌之葡萄糖(每體積重量20%)，以達培養基中最終葡萄糖濃度0.5%。培養可在例如37℃下不攪拌進行，其中醱酵在例如96小時後終止。在本發明之範圍內，除了前述之批式醱酵，也可進行半批式醱酵、重複批式醱酵或連續醱酵。

在實際醱酵及分離醱酵培養基與細胞之後，該醱酵培養基可進行第一次沉澱以移除大型蛋白。沉澱較佳為酸沉澱。該酸沉澱之反應條件係該領域之技藝人士所知。通常可使用1.5M H₂SO₄，以酸化上清液至pH 3.5。離心通常以2400 x g在4℃下進行20分鐘。離心獲得之團塊可以水清洗，較佳地重複清洗。接著，團塊可利用0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液pH 5.5萃取例如1小時。接著，可進行其他離心步驟，例如以9800 x g在4℃下離心20分鐘。如此獲得之團塊接著可選擇性地再次如上述萃取。萃取上清液及重複萃取之二次上清液接著可經硫酸魚精蛋白沉澱。沉澱可於例如8℃下持續隔夜。接著，該沉澱物可於例如4℃下以12,000 x g離心20分鐘。離心上清液可經沉澱(例如硫酸銨沉澱)處理，藉以移除其他較大蛋白。在硫酸銨沉澱步驟之後可增加另一離心步驟，接著所獲得之團塊可經重新溶解及可選擇性地經透析處理。較佳地經再次透析及離心之萃取物，可經連續層析步驟處理以達純化神經毒素之目的。各種層析步驟係用於移除污染物，例如硫酸魚經蛋白、剩餘DNA、較小蛋白及中型蛋白之部分，以及肉毒神經毒素蛋白複合物之血球凝集素。就此目的而言，一或多種層析步驟可被用於較佳之實施態樣中。可任意選擇地，例如最後層析步驟之流析液可經過濾以減少細菌。可任意選擇地，流析液在過濾前可經稀釋並添加適當佐劑。在其他步驟期間，另一滅菌過濾步驟可在添加佐劑之後進行。在一態樣中，過濾係於反應容器中進行，該容器接著可進行冷凍乾燥步驟。

本發明亦關於可藉由本發明之製造經蛋白分解處理之多肽之方法獲得之組成物。在一態樣中，該組成物包含經處理及未經處理之第二多肽之混合物，其中該混合物可包含低於5%、4%、3%、2%或低於1%之未經處理之第二多肽。在該組成物之態樣中，該第二多肽係BoNT或彼之衍生物。該BoNT可為例如選自BoNT血清型A、B、C、D、E、F及G，包括彼等之衍生物。該組成物可為例如液體或固體組成物，且可包含一或多種載劑、佐劑及/或賦形劑。

在另一態樣中，本發明亦關於製造藥物(即醫藥組成物)之方法，該方法包含前述方法之步驟及調製經純化之雙鏈神經毒素作為藥物之其他步驟。在一態樣中，該藥物包含經處理及未經處理之第二多肽之混合物，其中該混合物可包含低於5%之未經處理之第二多肽。在較佳之實施態樣中，該混合物包含低於4%、3%、2%或低於1%之未經處理之第二多肽。

本發明亦關於此處揭示之化合物之多種醫學用途：在一態樣中，本發明關於根據本發明之具蛋白分解活性之多肽用於作為藥物或醫藥組成物。

在另一態樣中，本發明關於根據本發明之組成物用於作為藥物或醫藥組成物。

在又一態樣中，本發明關於根據本發明之抗體用於作為藥物或醫藥組成物。在仍一態樣中，本發明關於根據本發明之抑制劑用於作為藥物或醫藥組成物。

特別是，本發明關於包含本發明之多肽、本發明之抗體、本發明之組成物或本發明之抑制劑之醫藥組成物。

此處所使用之用語「組成物」係指任何經調製為固體、液體、氣霧劑(或氣體)形式等之組成物。該組成物包含例如本發明之治療活性化合物與可任意選擇之適當助劑化合物例如稀釋劑或載劑或其他成分。在一態樣中，該治療活性化合物係本發明之具蛋白分解活性之多肽。在另一態樣中，該治療化合物係如此處上述之經蛋白分解處理之第二多肽，例如雙鏈神經毒素。在另一態樣中，該治療活性化合物係本發明之抗體。在另一態樣中，該治療活性化合物係本發明之具蛋白分解活性之多肽之抑制劑。

在一實施態樣中，本發明提供固體或液體醫藥組成物，其包含：(a)如此處所述之活性雙鏈BoNT(例如BoNT/A)蛋白，及(b)安定劑。

可用於本發明之組成物中的安定劑包括蛋白安定劑，諸如白蛋白特別是人血清白蛋白(HSA)，及非蛋白安定劑。

可用於本發明之組成物中的非蛋白安定劑包括表面活性劑，特別是非離子性表面活性劑。非離子性表面活性劑之實例包括聚山梨醇酯，諸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，及團聯共聚物諸如泊洛沙姆(poloxamer)(即聚乙烯與丙二醇之共聚物)。

在特定實施態樣中，該組成物不包含作為安定劑之蛋白。

根據本發明之特定實施態樣，該醫藥組成物係液體醫藥組成物，其包含：(a)如此處所述之活性雙鏈BoNT蛋白(例如BoNT/A)；(b)為表面活性劑之非蛋白安定劑；及(c)水；其中該液體醫藥組成物不包含蛋白安定劑。

在一實施態樣中，該活性雙鏈BoNT蛋白係以1至100ng/ml之濃度存在於該(如上述之)組成物中。在一實施態樣中，該活性雙鏈BoNT蛋白係以5至50ng/ml之濃度存在於該(如上述之)組成物中，例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml。在較佳之實施態樣中，該活性雙鏈BoNT蛋白係以約20ng/ml之濃度存在。

在一實施態樣中，該(如上述之)表面活性劑係聚山梨醇酯，諸如平均聚合程度為20至100個單體單元之聚山梨醇酯，可能為例如聚山梨醇酯80。在較佳之實施態樣中，該聚山梨醇酯係蔬菜來源。該表面活性劑之濃度較佳係低於1% v/v，例如以聚山梨醇酯80為例約0.005%至0.02% v/v。

本發明之醫藥組成物亦可包含結晶劑。

所謂結晶劑係指尤其是維持凍乾肉毒桿菌神經毒素複合物(A、B、C、D、E、F或G型)或高純度肉毒桿菌神經毒素(A、B、C、D、E、F或G型)之機械強度餅狀結構之劑。當包含於固體調製劑中時，結晶劑亦具有膨脹效果。結晶劑特別包含氯化鈉。結晶劑之濃度可為例如0.1至0.5M，較佳地0.1至0.4M，特別是約0.15至0.3M。

本發明之醫藥組成物亦可包含緩衝劑以維持介於5.5至7.5或介於6.0至7.0之pH值。該緩衝劑可為任何能維持該適當pH之緩衝劑。舉例來說，用於本發明之組成物的緩衝劑可選自琥珀酸鹽、磷酸氫二鈉/檸檬酸及胺基酸如組胺酸。緩衝劑之濃度可為例如1至50mM，較佳地5至20mM，較佳約10mM。

本發明之醫藥組成物亦可包含雙醣。

用於本發明之組成物中的雙醣可選自蔗糖、海藻糖、甘露醇及乳糖。在特定實施態樣中，該雙醣係蔗糖。雙醣之濃度可為例如5至50mM，較佳地5至25 mM，更佳地10至20mM，最佳約11.7mM。

在特定實施態樣中，該醫藥組成物係液體醫藥組成物，其包含：(a)如此處所述之活性雙鏈BoNT蛋白(例如BoNT/A)；(b)為表面活性劑之非蛋白安定劑；(c)氯化鈉；(d)維持pH介於5.5至7.5之緩衝劑；(e)雙醣；及(f)無菌水，其中該液體醫藥組成物不包含蛋白安定劑。

根據特定實施態樣，本發明之呈液體形式之醫藥組成物係密封於小瓶或立即可用之裝置，如針筒，不含液體/氣體介面，且於23至27℃維持穩定至少三個月或至少六個月，於2至8℃維持穩定至少12個月。

下表顯示包含活性雙鏈BoNT(例如BoNT/A)之六種例示性液體組成物。

在12周期間，六種調製劑的每月降解率可低於每月5%，顯示這六種組成物的雙鏈BoNT蛋白酶功能在25℃下維持穩定至少12周。

本發明之醫藥組成物可以冷凍乾燥、真空乾燥形式儲存於真空壓力容器中或儲存為穩定液體。在冷凍乾燥之前，活性雙鏈BoNT蛋白(例如BoNT/A)可與醫藥上可接受之賦形劑、安定劑及/或載劑例如白蛋白組合。冷凍乾燥材料可經鹽水或水重構以產生包含該活性雙鏈BoNT蛋白(例如BoNT/A)之待投予至病患之溶液或組成物。

在此背景下，應區別本發明之助劑化合物與其他成分，所謂助劑化合物是指為了達到所欲目的投予組成物時不造成由本發明之化合物所誘發之效應之化合物，其他成分是指造成其他效應或調節本發明之化合物之效應之化合物。適當之稀釋劑及/或載劑取決於所欲使用該組成物及其他成分之目的。該領域之技藝人士可決定該適當之稀釋劑及/或載劑無須贅言。

載劑必須為可與調製劑之其他成分相容且不會對彼之接受者有害。所採用之醫藥載劑可包括固體、凝膠或液體。例示性固體載劑係乳糖、白土、蔗糖、滑石、明膠、洋菜膠、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、硬脂酸及類似物。例示性液體載劑係磷酸緩衝鹽水溶液、糖漿、油、水、乳液、多種潤濕劑及類似物。同樣地，載劑或稀釋劑可包括該領域廣為周知之時間延遲性材料，例如單獨的甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯或與蠟組合。該適當載劑包含上述者及其他該領域廣為周知者，見例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania。

稀釋劑係經選擇以不影響該組合之生物活性。該稀釋劑之實例係蒸餾水、生理食鹽水、林格氏(Ringer's)液、葡萄糖溶液及漢氏(Hanks's)溶液，此外，該醫藥組成物或調製劑物亦可包括其他載劑、佐劑或非毒性、非治療性、非免疫原性安定劑及類似者。

在一態樣中，此處所使用之醫藥組成物包含藉由本發明之方法獲得之生物活性神經毒素及可任意選擇地一或多種醫藥上可接受之載劑。該活性神經毒素可以液體或冷凍乾燥形式存在。在一態樣中，該化合物可與甘油、蛋白安定劑(例如人血清白蛋白(HSA))或非蛋白安定劑(例如聚乙烯吡咯烷酮或玻糖醛酸)一起存在。該醫藥組成物在一態樣中係經局部投予。習用之藥物投予係經肌肉內、皮下(靠近腺體)投予。然而，依據化合物之特性及作用模式，該醫藥組成物也可藉由其他途徑投予。雙鏈神經毒素多肽係該組成物之活性成分，在一態樣中係以根據習用程序藉由組合該藥物與標準醫藥載劑所製成之習用劑量形式投予。這些程序可能涉及混合、造粒及壓製或溶解該適當成分至該所欲之製劑。應了解的是，該醫藥上可接受之載劑或稀釋劑之形式及特徵，受到其所欲組合之活性成分之量、投予途徑及其他廣為周知之變數影響。

治療有效劑量係指所欲使用於本發明之醫藥組成物中之神經毒素化合物之量，以預防、改善或治療伴隨本說明書中提及之疾病或病症之症狀。化合物之治療性療效及毒性可藉由在細胞培養或實驗動物中所進行之標準醫藥程序檢測，例如ED₅₀(對50%之族群有治療效果之劑量)及LD₅₀(對50%之族群致死之劑量)。治療與毒性效應之間的劑量比係治療指數，可由LD₅₀/ED₅₀之比表示。

給藥方案將由主治醫師及其他臨床因素決定。如醫學領域所廣為周知，任何病患之劑量取決於許多因素，包括該病患之體型大小、身體表面積、年齡、所欲投予之特定化合物、性別、投予時間及途徑、整體健康及其他併投之藥物。進展可藉由定期檢查加以監測。此處所述之醫藥組成物及調製劑係經投予至少一次以治療或改善或預防本說明書中列舉之疾病或病症。然而，該醫藥組成物可能經投予超過一次。

在本發明之其他態樣中，前述組成物係藥物或美容組成物。在一態樣中，該包含生物活性神經毒素之藥物可被用於預防及/或治療下列疾病或病狀之至少一者：隨意肌強度、局部肌張力障礙(包括頭、頸肌張力障礙及良性自發性眼瞼痙攣、半邊顏面痙攣及局部痙攣)、胃腸疾患、多汗症及美容除皺，在其他態樣亦包含眼瞼痙攣、口下頷肌張力障礙、張口型、閉口型、磨牙、梅傑氏(Meige)症候群、舌肌肌張力障礙、眼瞼肌肉運動失調、張口型頸肌張力障礙、頸項前屈、頸項後屈、頸項側屈、斜頸、咽部肌張力障礙、喉部肌張力障礙、痙攣性發聲障礙/內收肌型、痙攣性發聲障礙/外展肌型、痙攣性呼吸困難、四肢肌張力障礙、手臂肌張力障礙、特定任務性肌張力障礙、書寫痙攣、音樂家指痙攣、高爾夫手痙攣、腿部肌張力障礙、大腿內收、大腿外展膝關節彎曲、膝關節伸直、踝關節彎曲、踝關節伸直、馬蹄內翻足、畸形足肌張力障礙、紋狀趾、腳趾彎曲、腳趾伸直、中軸肌張力障礙、比薩症候群、肚皮舞者肌張力障礙、節段性肌張力障礙、半身性肌張力障礙、全身性肌張力障礙、lubag症候群中之肌張力障礙、皮質基底核退化中之肌張力障礙、lubag症候群中之肌張力障礙、遲發性肌張力障礙、脊髓小腦性失調症中之肌張力障礙、帕金森氏症中之肌張力障礙、亨汀頓氏舞蹈症中之肌張力障礙、髓素異常表象(Hallervorden Spatz disease)中之肌張力障礙、多巴誘發之運動困難/多巴誘發之肌張力障礙、遲發性運動困難/遲發性肌張力障礙、陣發性運動困難/肌張力障礙、運動性非運動性動作誘發之上顎肌陣攣、肌陣攣肌纖維顫動、僵硬、良性肌肉痙攣、遺傳性下巴顫抖、矛盾性下巴肌活動、半側咀嚼肌痙攣、肥厚性鰓肌病、嚼肌肥厚、脛骨前肌肥厚、眼球震顫、震動幻視核上性凝視麻痺、癲癇、持續性不全癲癇(partialis continua)、計畫痙攣性斜頸手術、外展肌聲帶麻痺、反抗性突變煩躁不安、上食道括約肌功能不全、聲帶肉芽腫、口吃性妥瑞氏症、中耳肌陣攣、保護性喉閉合、喉切除術術後、語言障礙、保護性垂瞼、眼瞼內翻、奧迪氏(Odii)括約肌功能異常、假性食道弛緩不能、非弛緩不能性食道運動障礙、陰道痙攣、術後制動震顫、膀胱功能失常、膀胱尿道括約肌失常、膀胱括約肌痙攣、半側臉痙攣、神經再生性運動困難、魚尾紋之美容使用、皺眉臉不對稱、頦肌皺縮、僵硬人症候群、破傷風性前列腺增生(tetanus prostate hyperplasia)、過胖、治療幼兒腦性麻痺斜視、混合麻痺性共同性斜視、在視網膜剝離手術之後、在白內障手術之後、在無晶體眼中肌炎性斜視、肌病性斜視、分離性垂直眼偏斜、作為斜視手術之輔助治療、內斜視、外斜視、弛緩不能、肛門裂、外分泌腺活性過高、Frey氏症候群、假哭性症候群、多汗症、腋窩掌足鼻漏、中風中之相對流涎過多、帕金森氏症中之相對流涎過多、肌萎縮性側索硬化痙攣症狀中之相對流涎過多、腦炎及脊髓炎自體免疫疾病中之相對流涎過多、多發性硬化症、橫貫性脊髓炎、戴維克氏(Devic)症候群、病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染、真菌感染、在遺傳性痙攣性截癱中風後症候群腦半球梗塞中、腦幹梗塞、脊椎梗塞、偏頭痛、中樞神經系統外傷、腦半球病灶、腦幹病灶、脊椎病灶、在中樞神經系統出血中、腦內出血、蜘蛛膜下腔出血、硬膜下出血、脊椎內出血、在癌中、腦半球性腫瘤、腦幹腫瘤、脊椎腫瘤、打鼾(WO 2000/033863)。細節及症狀見例如Jost 2007,Drugs 67(5),669或Dressler 2000 in Botulinum Toxin Therapy,Thieme Verlag,Stuttgart,New York。

在本發明之另一態樣中，該組成物係可如上述之醫藥組成物調製之美容組成物。同樣的就美容組成物而言，設想本發明之化合物在一態樣中係以實質上純的形式使用。美容組成物在另一態樣中係經肌肉內施予。在本發明之甚至其他態樣中，包含神經毒素之美容組成物可經調製為抗皺溶液。

在另一態樣中，該醫藥組成物包含本發明之抗體或抑制劑。由於本發明之多肽負責活化芽胞梭菌神經毒素，該抗體將可被用於減少芽胞梭菌感染時觀察到之毒性作用。因此，本發明之抗體在一態樣中可被用於治療芽胞梭菌感染，包括產氣莢膜芽胞梭菌(Clostridium perfringens)、難養芽胞梭菌(Clostridium difficile)、破傷風芽胞梭菌(Clostridium tetani)、肉毒芽胞梭菌 (Clostridium botulinum)、巴拉提尼芽胞梭菌(Clostridium baratii)、酪酸芽胞梭菌(Clostridium butyricum)、產芽孢梭菌(Clostridium sporogenes)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、溶血芽胞梭菌(Clostridium haemolyticum)、諾維氏芽胞梭菌(Clostridium novyi)及水腫芽胞梭菌(Clostridium oedematiens)。另外，本發明之抗體在另一態樣中可用於治療與該感染有關之症狀。另外，該抗體可用於治療與病狀有關之病況或症狀，其中該病狀係選自肉毒桿菌症、破傷風、偽膜性結腸炎、壞疽、食物中毒及類似者。

在另一態樣中，該醫藥組成物包含本發明之具蛋白分解活性之多肽。該醫藥組成物在一態樣中可被用於蛋白分解切割與兼同凝集有關之多肽，特別是治療兼同凝集功能不足之病患。在另一態樣中，該醫藥組成物可被用於纖維蛋白溶解，特別是治療心肌梗塞、肺栓塞、深層靜脈血栓栓塞之病患，即用於移除血栓。同樣設想到的是使用醫藥組成物治療中風。另外，在其他態樣中，該醫藥組成物可被用於治療外分泌胰功能不全以取代胰蛋白酶、胰凝乳酶及胃蛋白酶。另外在其他態樣中，該醫藥組成物可被用於治療有炎症反應之病患、用於治療癌病患，特別是用於蛋白水解切割表面暴露之腫瘤抗原。另外在另一態樣中，該醫藥組成物可被用於治療乳頭狀瘤。

本發明亦關於一種篩選抑制劑之方法，該方法包含下列步驟：(a)使本發明之具蛋白分解活性之多肽與已知底物及可任意選擇地假定抑制劑接觸；及(b)測定該假定抑制劑對底物轉換成切割產物之影響，其中切割產物之量減少表示該假定抑制劑之抑制作用。在一態樣中，該假定抑制劑係包含選自SEQ ID NO：4至25之任一者之胺基酸序列之肽，其中該胺基酸序列之至少一個鹼性胺基酸係由非鹼性胺基酸取代。在其他態樣中，該肽包含一或多種化學修飾。在另一態樣中，該抑制劑係該肽之擬肽。在另一態樣中，該假定抑制劑係化學化合物微陣列之一部分，即有機化學化合物之集。在另一態樣中，該抑制劑係本發明之抗體。此方法可用於識別能抑制本發明之具蛋白分解活性之多肽之化合物。初步篩選可根據例如包含選自SEQ ID NO：4至25之任一者之胺基酸序列之肽。能抑制本發明之多肽之肽可經修飾以增加抑制。修飾包括胺基酸取代或化學修飾。通常，此方法係藉由使本發明之多肽與已知底物在假定抑制劑存在及不存在下接觸(該方法之步驟(a))且藉由比較該假定抑制劑對於底物轉換為切割產物之影響進行。在假定抑制劑存在下轉換率減少，表示抑制效應。

本發明亦關於一種對本發明之具蛋白分解活性之多肽之抑制劑，其中該抑制劑係(a)包含如SEQ ID NO：4至25之任一者所示之胺基酸序列之抑制劑，其中包含於其中之鹼性胺基酸係由非鹼性胺基酸取代；或(b)本發明之抗體。

本說明書中引證之所有文獻以參照方式就彼等之整體揭示內容及本說明書中特別提及之揭示內容併入此處。

條款

1.一種具蛋白分解活性之多肽，其包含與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列。

2.一種核酸分子，其包含編碼條款1之多肽之核酸序列及可任意選擇地調節元件。

3.一種載體，其包含如條款2所述之核酸分子。

4.一種細胞，其包含如條款2所述之核酸分子或如條款3所述之載體。

5.一種製造具蛋白分解活性之多肽之方法，其包含下列步驟：(a.)化學合成或自核苷酸序列轉譯多肽，該多肽包含與SEQ ID NO：1之序列具有至少50%序列一致性之多肽序列；及(b.)純化步驟(a.)之多肽。

6.一種多肽，其可由條款5之方法獲得。

7.一種抗體，其與如條款1或6所述之多肽專一性結合。

8.一種如條款7所述之抗體於純化如條款1或6所述之多肽之方法中的用途。

9.一種製造經蛋白分解處理之多肽之方法，其包含使下述(a)與(b)接觸之步驟：(a)第一多肽，該第一多肽係選自如條款1或條款6所述之多肽、Lys-N、Lys-C、精胺醯基內肽酶、纖維蛋白溶酶或omptin，(b)第二多肽，該第二多肽係易被該第一多肽蛋白分解；其中該接觸導致蛋白分解處理該第二多肽成為至少二個切割產物。

10.如條款9之方法，其中該第二多肽包含與選自SEQ ID NO：3至25之任一者之多肽序列具有至少50%序列一致性之胺基酸序列；較佳地其中該第一多肽蛋白分解切割該第二多肽於位置緊鄰SEQ ID NO：3至25之任一者之該序列內之鹼性胺基酸殘基(例如His、Lys、Arg)的C端。

11.如條款9或條款10所述之方法，其中該第二多肽係芽胞梭菌神經毒素(例如BoNT/A)。

12.如條款11之方法，其中該芽胞梭菌神經毒素係選自缺乏功能性結合結構域(H_CC)因此無法與天然芽胞梭菌神經毒素受體結合之芽胞梭菌神經毒素多肽(例如包含芽胞梭菌神經毒素之LH_N片段或由該片段組成之多肽)、具有與天然芽胞梭菌神經毒素受體結合之經修飾之芽胞梭菌神經毒素結合結構域(H_CC)之芽胞梭菌神經毒素多肽，或具有使該芽胞梭菌神經毒素與非天然芽胞梭菌神經毒素受體結合之非芽胞梭菌結合結構域之芽胞梭菌神經毒素多肽(該多肽可選擇性地缺乏功能性結合結構域(H_CC)以最小化該芽胞梭菌神經毒素與天然芽胞梭菌神經毒素受體之結合)。

13.如條款12之方法，其中該芽胞梭菌神經毒素之L鏈及H鏈成分係源自相同或不同的芽胞梭菌神經毒素血清型及/或亞型。

14.如條款9至13項中任一項所述之方法，其中該第二多肽係藉由在大腸桿菌中重組表現製備之單鏈芽胞梭菌神經毒素。

15.如條款9至14項中任一項所述之方法，其中該第二多肽係單鏈芽胞梭菌神經毒素，且其中該第一與第二多肽之間的接觸導致芽胞梭菌神經毒素雙鏈多肽，其包含與芽胞梭菌神經毒素H鏈成分藉由雙硫鍵共價連接之芽胞梭菌神經毒素L鏈成分。

16.如條款9至15項中任一項所述之方法，其中該經蛋白分解處理之第二多肽係芽胞梭菌神經毒素雙鏈多肽，其中該L鏈之C端及該H鏈之N端，係與由野生型芽胞梭菌中之該相同單鏈芽胞梭菌神經毒素多肽所產製之對應雙鏈芽胞梭菌神經毒素的對應端一致。

17.如條款9至16項中任一項所述之方法，其中該經蛋白分解處理之第二多肽係芽胞梭菌神經毒素雙鏈多肽，當其與由野生型芽胞梭菌中之該相同單鏈芽胞梭菌神經毒素多肽所產製之對應芽胞梭菌神經毒素雙鏈多肽比較時，其具有一致之胺基酸序列。

18.一種如條款9至17項中任一項之方法之用途，其係用於評估產品品質或產製藥品。

19.一種藉由如條款9至18項中任一項之方法獲得之組成物，其中該組成物包含經處理與未經處理之第二多肽之混合物，該混合物包含低於5%之未經處理之第二多肽。

20.一種用於篩選抑制劑之方法，該方法包含下列步驟：(a)使如條款1或6所述之多肽與已知底物及可任意選擇地假定抑制劑接觸；及(b)測定該假定抑制劑對底物轉換成切割產物之影響，其中切割產物之量減少表示該假定抑制劑之抑制作用。

21.一種如條款1或6所述之具蛋白分解活性之多肽之抑制劑，其中該抑制劑係(a.)包含如SEQ ID NO：4至25中任一者所示之胺基酸序列之抑制劑，其中包含於其中之鹼性胺基酸係由非鹼性胺基酸取代；或(b.)如條款7之抗體。

22.一種醫藥組成物，其包含如條款1或6所述之多肽、如條款7所述之抗體、如條款19所述之組成物或如條款21所述之抑制劑。

圖1：自HiPrep 16/10 Q FF收集之組分的活性測試。

自HiPrep 16/10 Q FF流析收集之5μl組分，藉由於37℃下與2μg scBoNTA(第2行)培養1小時然後以10% SDS-PAGE以分析酶活性。第1行：低分子量標誌(LMW)：116kDa、66kDa、45kDa、35kDa。

圖2：藉由12.5% SDS-PAGE分析自SEC(HiLoad 16/60 Superdex 75)收集之組分中的nBH含量(分子量~37.3kDa)。組分9至11主要包含nBH。(第1行：LMW：116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18.4kDa、14.4kDa)

圖3：以12.5% SDS-PAGE分析測定三個nBH純化批量之純度及蛋白濃度。

第1行，LMW(116kDa，66kDa，45kDa，35kDa，25kDa，18.4kDa，14.4kDa)；第2行，nBH批號TE311206(192ng/μl成熟NT02CB1446/CBO1444，Genbank編號CAL82987.1之胺基酸254至594，MW：38.6kDa)；第3行，nBH批號TIK301009(130ng/μl成熟NT02CB1447/CBO1445，SEQ ID NO：1，Genbank編號CAL82988.1之胺基酸249至581，MW：37.3kDa)；第4行，nBH批號TIK280509(114ng/μl成熟NT02CB1447/CBO1445，SEQ ID NO：1，Genbank編號CAL82988.1之胺基酸249至581，MW：37.3kDa)。

圖4：ESI-MS/MS譜圖分析報告。

nBH批號TE311206之38.6kDa蛋白帶係經識別為NT02CB1446/CBO1444，Mascot得分725，肽MS/MS序列涵蓋率為整個開放閱讀框(ORF)之29.6%。沒有識別到源自N端253個胺基酸之肽(灰色框識別為MS肽；紅色方塊識別為在MS/MS衰變之後肽之胺基酸y-/b-離子)。批號TE311206之MS/MS分析顯示根據形成nBH之C端胺基酸254至594，序列涵蓋率為52%。

圖5：ESI-MS/MS譜圖分析報告。

nBH批號TIK301009之37.3kDa蛋白帶係經識別為NT02CB1447/CBO1445，Mascot得分555，肽MS/MS序列涵蓋率為整個開放閱讀框(ORF)之28.4%。除了一肽以外，所有肽(灰色框識別為MS肽；紅色方塊識別為在MS/MS衰變之後肽之胺基酸y-/b-離子)皆識別為源自C端333個胺基酸。批號TIK301009之MS/MS分析顯示根據形成nBH之C端胺基酸249至581，序列涵蓋率為49.5%。

圖6：比較源自三個純化批量之nBH的濃度依賴性蛋白分解活性。

A 利用12.5% SDS-PAGE之活性測試分析源自批號TIK301009、TIK280509及TE311206之nBH，使用濃縮nBH之下列稀釋液：1：10、1：30、1：100、1：300、1：1000。該測試係藉由於37℃下培養1μg scBoNT/A及2μl dH₂O與1μl之對應稀釋nBH 60分鐘進行。在SDS-PAGE分析中，添加3μl之還原性4x SDS Laemmli緩衝液至終體積10μl。150kDa scBoNT/A被切割成100kDa重鏈及50kDa輕鏈。

B 重鏈、輕鏈及scBoNT/A之蛋白帶之光學密度係經定量，將輕鏈及重鏈產物帶之總和除以LC、HC及scBoNT/A蛋白帶之總和。較高稀釋倍數之第一多肽減少切割率。三個不同批量之特定蛋白分解活性幾乎一致。

圖7：nBH對scBoNT/A野生型及包含修飾圈環之突變物的時間依賴性切割。

A 圈環序列修飾。在scBoNTAS Throm中，所有離胺酸殘基皆被移除，取而代之地插入凝血酶辨認區序列LVPRGS，然而在scBoNT Res中，該圈環缺乏任何鹼性胺基酸。縮短圈環至8個小型殘基或具有大型側鏈之5個胺基酸分別產生scBoNTAS(GGSG)₂及scBoNTAS FQWYI。在scBoNTAS CGS-C中，整個圈環被刪除且形成半胱胺酸之雙硫鍵被甘胺酸及絲胺酸取代。

B scBoNT/A野生型及突變物之時間依賴性切割之SDS-PAGE分析。

C scBoNTAS野生型被nBH以時間依賴性方式在120分鐘內活化成為輕鏈及重鏈。缺乏離胺酸及插入單一精胺酸殘基延長該圈環之切割(scBoNTAS Throm)。缺乏任何鹼性殘基之圈環仍可被切割(scBoNTAS Res)。縮短圈環至8聚體肽、導入具有大型側鏈之5個胺基酸或刪除整個圈環產生不可切割之scBoNT/A。

圖8：以nBH消化scBoNT/A後50kDa及100kDa切割產物之MS/MS分析。

A 50kDa切割產物之分析，其被識別為BoNT/A之輕鏈，Mascot得分1460。最C端肽涵蓋胺基酸G433至K438，其對應BoNT/A LC之生理性觀察C端。

B 100kDa切割產物之分析，其被識別為BoNT/A之重鏈，Mascot得分96。最N端肽涵蓋胺基酸A449至K456，其對應BoNT/A HC之生理性觀察N端。

圖9：A 以12.5% SDS-PAGE分析三次匯集之抗nBH-IgY的蛋白含量(mg/ml)。B ELISA：Nunc Maxisorp F96微滴定盤係以不同批量之PBS中之nBH(500ng/mL)於4℃下隔夜包覆，接著以含有0.1% Tween-20及2%無脂脫脂奶粉之PBS封閉緩衝液封閉1小時。在清洗後，添加每次匯集之IgY稀釋液(10μg/ml於封閉緩衝液中)1小時，接著利用經生物素標記之驢抗雞IgY、鏈黴抗生物素蛋白-辣根過氧化酶(二者皆為Dianova,Hamburg,Germany)及3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(Sigma)檢測。

圖10：A 重組表現及藉由Talon IMAC分離不具活性之BH 1-581(63kDa)。10% SDS-PAGE分析Talon IMAC組分(LMW：116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa；SS34，清澈溶解物；TD，流出物；W，清洗組分；E1-E7，咪唑洗脫組分1至7)。B 在37℃下培養1小時後沒有觀察到有scBoNT/A被重組iBH(SEQ ID NO：2；“E”；63kDa)內蛋白分解成LC(50kDa)及HC(100kDa)(第6行)(LMW：116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa)。

圖11：使用經純化之活性BoNT水解酶(nBH)獲得經蛋白分解處理之多肽。

A 200μg之重組純化scBoNT/A係與350ng之經純化之活性BoNT水解酶於37℃下培養12分鐘。要停止反應，藉由SEC(管柱Superdex 200 10/300 GL，緩衝液：50mM NaP pH 7.5，150mM NaCl，樣本體積=0.3ml，流速=0.25ml/分鐘)移除nBH，切割之量藉由10% SDS-PAGE分析。B 包含~40%經處理之BoNT/A之組分1(1800μl)係與350ng經純化之活性BoNT水解酶於37℃下培養15分鐘，並藉由超過濾濃縮至300μl。最後要停止反應，藉由SEC(管柱Superdex 200 10/300 GL，緩衝液：50mM NaP pH 7.5，150mM NaCl，樣本體積=0.3ml，流速=0.25ml/分鐘)移除nBH，切割之量藉由10% SDS-PAGE分析。C 包含~80%經處理之BoNT/A之組分1及2(1800μl)係經組合並與120ng經純化之活性BoNT水解酶於37℃下培養25分鐘，並藉由超過濾濃縮至300μl。最後要停止反應，藉由SEC(管柱Superdex 200 10/300 GL，緩衝液：50mM NaP pH 7.5，150mM NaCl，樣本體積=0.3ml，流速=0.25ml/分鐘)移除nBH，切割之量藉由10% SDS-PAGE分析。獲得>95%經處理之BoNT/A(SEQ ID NO.3)。

圖12：藉由Lys-C活化肉毒神經毒素(BoNT)。

圖12A顯示BoNT/A1藉由Lys-C活化以產生成熟雙鏈形式，其中重鏈係藉由單一雙硫鍵與輕鏈連接。SDS-PAGE凝膠上之總蛋白經染色，在還原條件下電泳。第1行代表分子量標記。第2行代表在以Lys-C處理前之單鏈BoNT/A。第3至10行代表經Lys-C處理後之BoNT/A1(在37℃下分別以12.5、6.25、3.12、1.56、0.72、0.39、0.20及0.1μg/ml之酶：底物比處理2小時)。

圖12B顯示顯示BoNT/A1具有90%之純度，使用Lys-C達到97%活化。染色SDS-PAGE凝膠上之總蛋白。第1行代表在以Lys-C處理前之單鏈BoNT/A1非還原樣本。第2行係BoNT/A1在經Lys-C處理後、製備成儲存樣本之前之非還原樣本。第3及4行分別指BoNT/A1在無及有還原劑存在下，經內蛋白酶Lys-C處理之最終儲存樣本。第5行代表分子量標記。

圖13：比較Lys-C蛋白酶與胰蛋白酶活化之肉毒神經毒素(BoNT)。

圖13A顯示總蛋白經染色之SDS-PAGE。第1及2行代表在氧化(第1行)及還原(第2行)條件下之胰蛋白酶處理前的BoNT/A1。第3至12行代表在氧化及還原條件下經胰蛋白酶處理(37℃，各種酶：底物比處理2小時)後之BoNT/A1。第13行代表分子量標記。

圖13B顯示總蛋白經染色之SDS-PAGE。第1行代表分子量標記。第2行代表在蛋白酶處理前之BoNT/A1。第 3行代表在以Lys-C處理後之BoNT/A1。第4行代表在以胰蛋白酶處理後之BoNT/A1。

圖14：經Lys-C蛋白酶處理後之肉毒神經毒素A1切割產物的質譜分析。

單鏈BoNT/A1具有如圖所示之一級胺基酸序列。Lys-C之蛋白分解活化切割輕鏈與重鏈區域之間的至少二個肽鍵；此產生成熟雙鏈形式。胺基酸TKSLDKGYNK(在該圖以粗體、較大字型且畫底線表示)自該成熟形式被切除。

圖15：分析經Lys-C蛋白酶處理後之肉毒神經毒素(BoNT)之功能性，與經胰蛋白酶切割之BoNT比較。

參考圖15A，單鏈重組BoNT/A1係經Lys-C蛋白分解活化，接著進一步純化(藉由苯基瓊脂糖管柱層析)以分離成熟雙鏈BoNT/A1與Lys-C。多種濃度之此經純化、經活化之BoNT/A1被添加至生長中之大鼠胚胎脊椎神經元(eSCN)原代培養，培養24小時。接著收集該經處理之eSCN，進行西方墨點分析以測量BoNT/A1對25kDa細胞內突觸相關蛋白(SNAP25)之切割。相同實驗也利用天然BoNT/A1進行。比較經重組Lys-C活化之BoNT/A1及天然BoNT/A1切割細胞內SNAP25之相對效價。重組Lys-C活化之BoNT/A1以11.94±0.10之pEC50(1.2pM)切割SNAP25。天然BoNT/A1以12.09±0.03之pEC50(0.49pM)切割SNAP25。因此重組Lys-C活化之BoNT/A1與天然BoNT/A1具有類似高效價。

相較於Lys-C活化之BoNT/A1，藉由胰蛋白酶活化之重組BoNT/A1顯示降低活性。參照圖15B，單鏈重組BoNT/A1係藉由胰蛋白酶蛋白分解活化，接著(藉由苯基瓊脂糖管柱層析)進一步純化以分離成熟雙鏈BoNT/A1與胰蛋白酶。此經純化、經活化之BoNT/A1以和Lys-C活化材料相同之方式測試切割細胞內eSCN SNAP25之效價(相較於天然BoNT/A1)。重組、胰蛋白酶活化之BoNT/A1以10.23±0.19之pEC50(59.3pM)切割SNAP25。天然BoNT/A1以11.56±0.08之pEC50(2.8pM)切割SNAP25。因此重組、胰蛋白酶活化之BoNT/A1之效價相較於天然BoNT/A1及重組、Lys-C活化之BoNT/A1皆減少。

圖16：胰蛋白酶切割除A1亞型以外之其他肉毒神經毒素A亞型的活化區域以外。

溶解於緩衝液(25mM Tris/HCl pH 8.0，125mM NaCl)中之單鏈重組BoNT/A5(0.5mg/ml)係藉由胰蛋白酶(1：50至1：200酶：底物比)於37℃下蛋白分解活化5至30分鐘，之後該反應藉由莫耳過量之大豆胰蛋白酶抑制劑抑制。圖16A顯示，BoNT/A5的結構域間區域被切割，產製其中重鏈藉由單一雙硫鍵與輕鏈連接之雙鏈形式。胰蛋白酶還切割重鏈內之至少一個額外位點，產生截短重鏈。重鏈有清楚的運動位移，因為被截短。SDS-PAGE中的總蛋白被染色。第1行代表分子量標記。第2及3行代表在氧化(第2行)及還原(第3行)條件下之胰蛋白酶處理前的BoNT/A5。第4至9行代表在氧化及還原條件下經胰蛋白酶處理(37℃，各種酶：底物比處理5分鐘)後之BoNT/A5。第10行代表分子量標記。

參考圖16B，BoNT/A1之C端的胰蛋白酶切割位點之一級序列保留於其他BoNT/A亞型。

圖17：以Lys-C蛋白酶處理肉毒神經毒素除了A1亞型以外之A2亞型。

溶解於緩衝液(25mM Tris/HCl pH 8.0，125mM NaCl)中之單鏈重組BoNT/A2(0.3mg/ml)係藉由Lys-C(1：750酶：底物比)於37℃下蛋白分解活化2小時，之後該反應藉由0.4μM之專一性絲胺酸蛋白酶抑制劑4-(2-胺基乙基)苯磺醯基)氟鹽酸鹽(AEBSF)(Lys-C活化)抑制。SDS-PAGE中的總蛋白被染色。第1行代表分子量標記。第2行代表在蛋白酶處理前之BoNT/A2。第3及4行代表經Lys-C處理後之BoNT/A2。BoNT/A2藉由Lys-C活化以產生成熟雙鏈形式，其中重鏈係藉由單一雙硫鍵與輕鏈連接。

圖18：以Lys-C蛋白酶處理肉毒神經毒素除了A1亞型以外之A6亞型。

溶解於緩衝液(50mM Tris/HCl pH 8.0，125mM NaCl)中之單鏈重組BoNT/A6(0.5mg/ml)係藉由Lys-C(0.4μg/ml)於4℃下蛋白分解活化20小時，接著進一步純化(苯基瓊脂糖管柱層析)以分離成熟雙鏈BoNT/A1與Lys-C。SDS-PAGE中的總蛋白被染色。第1行代表分子量標記。第2行代表在Lys-C處理後之BoNT/A6。第2行在還原條件下電泳。連接輕鏈與重鏈之雙硫鍵在這些條件下被還原，各鏈根據彼之分子量移動。如圖所示，BoNT/A6被Lys-C活化以產生成熟雙鏈形式。

圖19：形成橋接輕鏈與重鏈之HN部分之鏈間雙硫鍵的二個半胱胺酸殘基之胺基酸位置。

BoNT之胺基酸序列廣為周知。該圖顯示BoNT/A亞型A1至A6各者中形成橋接輕鏈與重鏈之HN部分的鏈間雙硫鍵之二個半胱胺酸殘基之胺基酸位置(位置430及454)。

圖20：藉由Arg-C活化肉毒神經毒素(BoNT)。

圖20顯示BoNT/A1藉由Lys-C活化以產生成熟雙鏈形式，其中重鏈係藉由單一雙硫鍵與輕鏈連接。SDS-PAGE凝膠上之總蛋白經染色，在還原條件下電泳。第1行代表分子量標記。第2至6行代表經Arg-C處理(在8℃下處理2小時，活化蛋白酶濃度分別為2000、400、80、16、3.2及0.39U/μl)後之BoNT/A1。第8行代表未暴露於Arg-C之單鏈BoNT/A(未活化)。

圖21：藉由纖維蛋白溶酶活化肉毒神經毒素(BoNT)。

圖21顯示BoNT/A1藉由纖維蛋白溶酶活化以產生成熟雙鏈形式，其中重鏈係藉由單一雙硫鍵與輕鏈連接。SDS-PAGE凝膠上之總蛋白經染色，在還原條件下電泳。第1行代表分子量標記。第2至9行代表經纖維蛋白溶酶處理(在8℃下處理2小時，活化蛋白酶濃度分別為5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08及0.04μg/μl)後之BoNT/A1。第10行代表未暴露於纖維蛋白溶酶之單鏈BoNT/A(未活化)。

圖22：藉由Lys-N活化肉毒神經毒素(BoNT)(4℃反應)。

圖22顯示BoNT/A1藉由Lys-N活化以產生成熟雙鏈形式，其中重鏈係藉由單一雙硫鍵與輕鏈連接。SDS-PAGE凝膠上之總蛋白經染色，在還原條件下電泳。第1行代表分子量標記。第2行代表未暴露於Lys-N之單鏈BoNT/A(未活化)。第3至10行代表經Lys-N處理後之BoNT/A1(在4℃下分別以12.5、6.25、3.12、1.56、0.72、0.39、0.20及0.10μg/μl之活化蛋白酶濃度處理2小時)。

下列實施方式說明本發明，無論如何不應被視為對其範圍之限制。

實施例1：天然BoNT水解酶(nBH)之純化及特徵化，其專一性切割單鏈BoNT/A成為彼之活性雙鏈形式

(1)讀取系統/活性測試：為了專一性檢測及純化在肉毒芽胞梭菌(C.botulinum)之培養上清液中及層析步驟之間水解肉毒神經毒素A(BoNT/A)成為50kDa輕鏈(LC)及100kDa重鏈(HC)之酶活性，我們在大腸桿菌(E.coli)中表現150kDa BoNT/A為單鏈(sc)多肽。培養該重組scBoNT/A與適當酶活性(nBH)應產生可藉由還原性10-13% SDS-PAGE看見之50kDa LC及100kDa HC。

(2)芽胞梭菌蛋白酶表現：肉毒芽胞梭菌株ATCC 3502之單一菌落係於100ml腦心浸液(BHI)培養基中培養，該培養液於37℃、厭氧條件下隔夜培養。10ml之O/N培養液係經接種至1l BHI培養基，厭氧培養48至72小時。

(3)硫酸銨沉澱：1l培養上清液係藉由離心收集(4℃，6500xg，25分鐘)。添加硫酸銨至終濃度85%(在此為575g)，於4℃攪拌懸浮液6小時，接著離心(4℃，6500xg，30分鐘)。成團塊之硫酸銨沉澱係經溶解於小體積(在此為5ml)之50mM NaP pH 7.5，並以50mM NaP，150mM NaCl pH 7.5透析。最後，該透析液經離心(4℃，40000xg，60分鐘)，上清液用於IEC。

(4)離子交換層析(IEC，管柱HiPrep 16/10 Q FF)：取(3)之上清液(圖1，第3行)施用於HiPrep 16/10 Q FF陰離子交換管柱，該管柱經包含50mM NaP pH 7.5，150mM NaCl之緩衝液平衡及流析。流析以1ml/分鐘之流速進行。活性測試係藉由於37℃下培養5μl之所有其他組分與2μg scBoNTA進行，接著利用SDS-PAGE分析(圖1)。組合組分6至24，利用超過濾 (Amicon-Ultra MWCO 10,000)將彼之體積濃縮至3.5ml。

(5)分子排阻層析(SEC，HiLoad 16/60 Superdex 200)：接著，將(4)之濃縮蛋白溶液裝入HiLoad 16/60 Superdex 200管柱，以50mM NaP pH 7.5，150mM NaCl平衡。分離以1ml/分鐘之流速進行。滯留體積介於80ml至100ml之組分係利用活性測試(1)分析，含有該酶活性(nBH)之適當組分係經組合(~10ml)並藉由超過濾濃縮至3ml。接著，添加硫酸銨至終濃度12.5%=500mM(+0.2g)。

(6)疏水交互作用層析(HIC，HiTrap苯基瓊脂糖)：nBH係與苯基瓊脂糖於緩衝液A(50mM NaP pH 7.5，500mM硫酸銨)中結合。經結合之nBH藉由減少硫酸銨之量洗脫(以1ml/分鐘之流速線性增加緩衝液B(50mM NaP pH 7.5)梯度)。所有含蛋白之組分利用活性測試(1)分析，適當組分係經組合及藉由超過濾濃縮至3.5ml。溶液之緩衝液調整至50mM NaP pH 7.5；150mM NaCl。

(7)SEC(HiLoad 16/60 Superdex 75)：最後，藉由SEC純化nBH，使用HiLoad 16/60 Superdex 75管柱，流速1ml/分鐘之50mM NaP pH 7.5,150mM NaCl。滯留體積介於70ml至80ml之組分係藉由12.5% SDS-PAGE(圖2)分析，移動至~37.3kDa之含有nBH之組分8至12係經組合(~10ml)並藉由超過濾濃縮至1ml。

(8)移動至約37.3kDa之主要蛋白(nBH)係根據Edman降解程序藉由N端肽定序分析。該識別肽之序列係V Q G Q S V K G V G，對應SEQ ID NO：1的前十個殘基。

(9)二批nBH(NT02CB1447，37.3kDa，圖3第3行：TIK301009，第4行：TIK280509)係根據上述方法可再現性分離。經下述調整分離方法得到nBH異構體NT02CB1446(38.6kDa，圖3第2行，批號TE311206)：(i)肉毒芽胞梭菌培養生長：18小時而非48至72小時；(ii)層析步驟變化：IEC->SEC Superdex 75->HIC苯基瓊脂糖，而非IEC->SEC Superdex 200->HIC苯基瓊脂糖->SEC Superdex 75。

實施例2：藉由質譜法(MS)自肉毒芽胞梭菌識別nBH之序列

(1)胰蛋白酶消化：切除在SDS-PAGE移動至大約38kDa之蛋白帶(nBH)以供胰蛋白酶消化，使其在37℃下於50mM NH₄HCO₃，50%乙腈中輕搖30分鐘以脫色。重複脫色直到凝膠斑點變透明。添加乙腈(100%)並在3分鐘後移除。接著在真空離心乾燥機(Eppendorf,Germany)中乾燥斑點。添加胰蛋白酶(10ng/μl)(在50mM NH₄HCO₃中)，於冰上培養1小時。接著，移除剩餘之胰蛋白酶溶液，加入小體積50mM NH₄HCO₃，於37℃下進行隔夜消化。收集上清液，利用5% TFA，10 %乙腈萃取凝膠片二次。匯集組合所有液體，在真空離心乾燥機中乾燥，萃取肽係儲存於4℃。

(2)介質輔助雷射脫附離子化飛行時間(MALDI-TOF/TOF)MS：樣本於MALDI-TOF/TOF質譜儀(Ultraflex1 Bruker Daltonik GmbH)中以線性模式、加速電壓25kV分析。檢測自700m/z至4,500m/z之質量。樣本(2μl)以含有50%乙腈及0.2%三氟醋酸(TFA)之2μl芥子酸溶液直接在不鏽鋼MALDI標靶板上共結晶。每個樣本收集500發雷射點。

(3)逆相層析肽分離：肽分離係藉由逆相層析進行，使用由自動採樣機及梯度幫浦組成之奈米HPLC系統(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)。該樣本係溶解於緩衝液A(5%乙腈，0.1%甲酸)，取最多10μl之等分以流速5μl/分鐘注射至C18管柱(Zorbax SB-C18，5μm，300A，0.5mm內徑，長度15cm)。在裝載後，管柱以緩衝液A清洗15分鐘，肽利用自0%至100%洗脫液B之洗脫液A及洗脫液B(70%(v/v)乙腈於0.1%(v/v)甲酸中)之梯度於75分鐘內洗脫。

(4)電噴灑離子化(ESI)介接及離子阱質譜法：HPLC出口係直接與離子阱質譜儀之奈米型ESI來源連接，使用Agilent共軸鞘液體噴霧器(Agilent Technologies)。出口毛細管係由環繞式鋼針持握，突出0.1至0.2mm。噴霧係藉由N₂作為噴霧器氣體(5l/分鐘)加以穩定。離子化電壓設定於4,500V，乾燥氣體以 5psi及250℃供應。光譜以Esquire3000+離子阱質譜儀(Bruker Daltonik)每秒13,000m/z之掃描速度收集。使用正離子模式之ESI，質譜資料在50至1600m/z掃描模式獲得，視資料需求可在MS及MS/MS分析之間切換。為了增加MS/MS譜圖之品質，MS/MS分析僅選擇來自一譜圖之二種前驅離子，主動排除設定於2分鐘以排除已經被測量過的前驅離子。

(4)資料處理：資料處理利用Data Analysis(3.0版)及BioTools(3.0版)套裝軟體(Bruker Daltonik)進行。蛋白識別係利用MASCOT軟體(2.1版)及MSDB資料庫(Matrix Science,London,UK)進行。

(5)結果：

第2行之38.6kDa蛋白帶(nBH批號TE311206)係經識別為NT02CB1446/CBO1444，Mascot得分725，肽MS/MS序列涵蓋率為整個開放閱讀框(ORF)之29.6%。沒有識別到源自N端253個胺基酸之肽(圖4)。批號TE311206之MS/MS分析顯示根據形成nBH之C端胺基酸254至594，序列涵蓋率為52%。

第3行(nBH批號TIK301009)及第4行(nBH批號TIK280509)之37.3kDa蛋白帶分別被識別為具有Mascot得分555及609之NT02CB1447/CBO1445。除了一肽以外，所有識別之肽皆源自C端333個胺基酸(圖5)。批號TIK301009之MS/MS分析顯示根據形成nBH之C端胺基酸249至581，序列涵蓋率為49.5%。

實施例3：nBH之酶專一性特徵。

(1)比較源自三個純化批量之nBH的濃度依賴性蛋白分解活性(圖6)。分析源自批號TIK301009、TIK280509及TE311206之nBH的不同稀釋倍數之活性測試顯示較高稀釋倍數降低切割率。這三種不同批號之蛋白分解活性幾乎一致，顯示成熟異構體NT02CB1446(TE311206)展現與成熟NT02CB1447(SEQ ID NO：1)類似之專一活性。

(2)使用活性測試分析nBH對scBoNT/A野生型及突變物之時間依賴性切割(圖7)。超過95%之scBoNTAS野生型被nBH以時間依賴性方式在120分鐘內活化成輕鏈及重鏈。圈環序列係經修飾以特徵化該切割位點。在scBoNTAS Throm中，所有離胺酸殘基皆被移除且插入凝血酶辨認序列LVPRGS，如此延長該切割速率。在 scBoNT Res中，該圈環缺乏任何鹼性胺基酸，如此大幅延緩完全水解，顯示nBH對於在切割位點之鹼性殘基如離胺酸及精胺酸具有高度辨識偏好。另外，nBH對圈環之可接近性受到縮短該圈環至8個小型殘基或具有大型側鏈之5個胺基酸的阻礙(scBoNTAS(GGSG)₂及scBoNTASFQWYI)。

(3)以nBH消化scBoNT/A後對50kDa切割產物的MS/MS分析，顯示最C端肽涵蓋胺基酸G433至K438，其對應BoNT/A LC之生理性觀察C端(圖8A)。對於被識別為BoNT/A之重鏈的100kDa切割產物之分析，顯示最N端肽涵蓋胺基酸A449至K456，其對應BoNT/A HC之生理性觀察N端(圖8B)。因此，經分離之nBH產生經生理性處理之BoNT/A且較佳地水解在離胺酸及精胺酸殘基C端之肽鍵。

實施例4：BoNT水解酶之演化保守性及彼之異構體

SEQ ID NO：2(Genbank編號CAL82988.1/YP_001253958.1)之蛋白序列分析顯示三個保守性結構域。殘基18至573對應鋅金屬蛋白酶(彈性蛋白酶)或涉及胺基酸運輸及代謝之LasB，Blast得分738。殘基148至212對應肽酶前肽及YPEB結構域或PepSY(Blast 得分97)。殘基336至573係包括嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、溶蛋白素(protealysin)、溶金菌素及中性蛋白酶之肽酶M4家族的一部份(Blast得分803)。

肉毒芽胞梭菌ATCC 3502之基因組定序顯示存在編碼iBH異構體之六個ORF(Sebaihia et al.,2007,Genome Res.17(7)：1082-1092)。其他基因組資料可得自10個第一組肉毒芽胞梭菌(C.botulinum)菌株及非BoNT分泌性產芽胞芽胞梭菌(C.sporogenes)，所有皆包含編碼iBH之5至7個ORF。nBH(SEQ ID NO：1)與其他63種異構體共享最少64%胺基酸序列一致性。

實施例5：產製對BoNT水解酶具專一性之抗體

(1)產製IgY：16周齡之雞[ISA Brown and Lohmann Selected Leghorn(LSL),Spreenhagener Vermehrungsbetrieb für Legehennen GmbH,Bestensee,Germany]被養在專門為了養雞建造之個別飼籠(Ebeco,Castrop-Rauxel,Germany)。食物(ssniff Legehühner-Zucht 1 and 2；ssniff Spezialitäten GmbH,Soest,Germany)及水可自由採食，雞從23至25周齡開始下蛋。每天收集、標示雞蛋，存放於4℃直到進一步處理。所有動物飼養及實驗根據柏林當地主管機關規定進行(No.H0069/03)。雞隻在1年期間經肌肉注射(左右側胸肌)免疫接種及補強免疫共10次，每次間隔4至8周。使用之間隔係根據先前研究顯示要到免疫後至少3周，才出現記憶細胞(Pei and Collisson,2005)。使用之抗原濃度係每次注射約20μg(nBH)。每次免疫不注射超過500μl之抗原溶液。第一次免疫使用完全弗氏(Freund’s)佐劑，之後的補強注射使用FIA。IgY之純化方法係改編自Polson et al.(1980)。簡言之，蛋黃以無菌PBS(pH 7.4,Roche,Mannheim,Germany)稀釋1：2。為了去除脂肪及脂蛋白，添加3.5%(w/v)聚乙二醇(PEG)6000(Roth,Karlsruhe,Germany)。輕柔搖晃之後離心(於4℃下以10,000×g離心20分鐘)，倒出上清液，加入固體PEG 6000至終濃度12%(w/v)。混合物接著如上述離心。沉澱物經溶解於10ml之PBS，添加PEG至12%(重量/體積)，然後溶液經離心。最後，沉澱物被溶解於1.2ml之PBS，轉移至為透析裝置(QuixSep,Roth,Germany)，於4℃下對PBS進行透析。蛋白含量(mg/ml)藉由12.5% SDS-PAGE分析(圖9A)，於280nm下以光度測量，根據Lambert-Beer規則計算IgY之消光係數為1.33。

(2)ELISA：Nunc Maxisorp F96微滴定盤(VWR International GmbH,Darmstadt,Germany)係以不同批量之PBS中之nBH(500ng/mL)於4℃下隔夜包覆，接著以含有0.1% Tween-20及2%無脂脫脂奶粉之PBS封閉緩衝液(Merck,Darmstadt,Germany)封閉1小時。在清洗後，添加IgY稀釋液(10μg/ml於封閉緩衝液中)1小時，接著利用經生物素標記之驢抗雞IgY、鏈黴抗生物素蛋白-辣根過氧化酶(二者皆為Dianova,Hamburg,Germany)及3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(Sigma)檢測。被檢測到之nBH係如圖9B所示。

(3)西方墨點法：nBH以12.5% SDS-PAGE分離，使用標準免疫墨點技術轉移至聚偏二氟乙烯膜(Invitrogen GmbH,Karlsruhe,Germany)上。膜於4℃隔夜封閉，與IgY(1：5,000於封閉緩衝液中)一起培養1小時。清洗後，膜以經生物素標記之驢抗雞IgY探測30分鐘，使用鹼性磷酸酶及CDP-Star(Perkin Elmer,Waltham,MA)發色。

實施例6：重組表現BoNT水解酶

(1)質體建構：編碼天然BH(SEQ ID NO：1)及彼之前肽(SEQ ID NO：2)之基因部分係藉由PCR擴增，使用適當之寡核苷酸及肉毒芽胞梭菌ATCC 3502之基因組DNA，彼等與編碼His6標籤之寡核苷酸融合並插入至pQE3(Qiagen)以分別產生表現質體pQ-BH1445H6-249-581及pQ-BH1445H6-1-581。核苷酸序列係藉由DNA定序證實。

(2)純化重組蛋白：與羧基端His6標籤融合之nBH及iBH係利用大腸桿菌株M15pREP4(Qiagen)在室溫下培養10小時產製，並使用Talon-瓊脂糖珠(Clontech Inc.)根據廠商說明純化。包含所欲蛋白之組分係經匯集，在液態氮中冷凍，保存於--70℃。iBH係經分離為MW 63kDa之重組蛋白(圖10A)。iBH之不具活性利用活性測試顯示：在37℃下培養1小時後，沒有scBoNT/A wt被水解成LC及HC(圖10B)。

實施例7：抑制BoNT水解酶

(1)篩選BH之肽抑制劑：缺乏一或多個鹼性殘基之根據SEQ ID NO：4至25之肽將被合成。各肽將被添加至根據活性測試之混合物。能減少經處理之scBoNT/A之量、延長完全處理scBoNT/A所需之時間或阻斷處理scBoNT/A之肽被認為是nBH之抑制劑。

(2)篩選抗體基底抑制劑：針對源自nBH之表位產製之抗體如實施例5之IgY係與nBH一起培養，接著進行活性測試。能減少經處理之scBoNT/A之量、延長完全處理scBoNT/A所需之時間或阻斷處理scBoNT/A之抗體被認為是nBH之抑制劑。

實施例8：使用經純化之活性BoNT水解酶(nBH)獲得經蛋白分解處理之多肽

(1)200μg之重組純化scBoNT/A係與350ng之經純化之活性BoNT水解酶於37℃下培養12分鐘。要停止反應，藉由SEC(管柱Superdex 200 10/300 GL，緩衝液：50mM NaP pH 7.5，150mM NaCl，樣本體積=0.3ml，流速=0.25ml/分鐘)移除nBH，切割之量藉由10% SDS-PAGE分析(圖11A)。

(2)包含~40%經處理之BoNT/A之組分1(1800μl)係與350ng經純化之活性BoNT水解酶於37℃下培養15分鐘，並藉由超過濾濃縮至300μl。最後要停止反應，藉由SEC(管柱Superdex 200 10/300 GL，緩衝液：50mM NaP pH 7.5，150mM NaCl，樣本體積=0.3ml，流速=0.25ml/分鐘)移除nBH，切割之量藉由10% SDS-PAGE分析(圖11B)。

(2)包含~80%經處理之BoNT/A之組分1及2(1800μl)係經組合並與120ng經純化之活性BoNT水解酶於37℃下培養25分鐘，並藉由超過濾濃縮至300μl。最後要停止反應，藉由SEC(管柱Superdex 200 10/300 GL，緩衝液：50mM NaP pH 7.5，150mM NaCl，樣本體積=0.3ml，流速=0.25ml/分鐘)移除nBH，切割之量藉由10% SDS-PAGE分析(圖11C)。獲得>95%經處理之BoNT/A(Seq ID NO.3)。若該第二肽在37℃下於一步驟中處理50分鐘(200μg scBoNT/A與350ng nBH培養)，則獲得相同的經完全處理之第二多肽(>95%經處理之BoNT/A)。在37℃下培養1小時後，超過97%之BoNT/A係經處理。

實施例9：藉由Lys-C活化肉毒神經毒素(BoNT)

溶解於緩衝液(50mM Tris/HCl pH 8.0，125mM NaCl)中之單鏈重組BoNT/A1(0.5mg/ml)係藉由Lys-C(1：500至1：2500酶：底物比)於37℃或4℃下蛋白分解活化2至20小時，之後該反應藉由0.4μM 4-(2-胺基乙基)苯磺醯基)氟鹽酸鹽(AEBSF)(專一性絲胺酸蛋白酶抑制劑)抑制。圖12A顯示BoNT/A1藉由Lys-C活化以產生成熟雙鏈形式，其中重鏈係藉由單一雙硫鍵與輕鏈連接。圖12B顯示BoNT/A1具有90%之純度，使用Lys-C達到97%活化。

實施例10：比較Lys-C蛋白酶與胰蛋白酶活化之肉毒神經毒素(BoNT)

溶解於緩衝液(25至50mM Tris/HCl pH 8.0，125mM NaCl)中之單鏈重組BoNT/A1(0.2-0.5mg/ml)係藉由胰蛋白酶(1：50至1：500酶：底物比)或藉由Lys-C(1：500至1：2500酶：底物比)於37℃或4℃下蛋白分解活化2至20小時，之後該反應藉由莫耳過量之大豆胰蛋白酶抑制劑(胰蛋白酶活化)或0.4μM之專一性絲胺酸蛋白酶抑制劑4-(2-胺基乙基)苯磺醯基)氟鹽酸鹽(AEBSF)(Lys-C活化)抑制。

圖13A顯示BoNT/A1藉由胰蛋白酶活化。結構域間區域經切割，產生雙鏈形式。重鏈內之至少一個額外位點經切割，產生重鏈截短之雙鏈形式。重鏈有清楚的運動位移，因為被截短。

圖13B顯示BoNT/A1藉由Lys-C或胰蛋白酶活化。二種蛋白酶皆切割結構域間區域，產生雙鏈形式。不像Lys-C的是，胰蛋白酶還切割重鏈內之至少一個額外位點，產生截短重鏈。經Lys-C及胰蛋白酶切割之BoNT/A的重鏈之間的移動差異反映胰蛋白酶的此截短作用。

實施例11：經Lys-C蛋白酶處理後之肉毒神經毒素(BoNT)切割產物的質譜分析

為了證實Lys-C切割之產物對應預期之BoNT/A1成熟雙鏈形式，使用質譜分析以測定各結構域之質量。簡言之，單鏈BoNT/A1(0.5mg/ml)係於4℃下經Lys-C(0.4μg/ml)活化20小時。該反應藉由添加蛋白酶抑制劑亮抑酶肽(leupeptin)停止，樣本經濃縮至1.3mg/ml。樣本藉由電噴灑離子化質譜法(ESI-MS)分析。二個主要尖峰在質譜圖上被發現。這些尖峰具有預期質量50055(預期50050Da)及98173(預期98152Da)。這些資料證實使用Lys-C切割單鏈BoNT/A1產製全長LC及HC。參考圖14，單鏈BoNT/A1具有如圖所示之一級胺基酸序列。Lys-C之蛋白分解活化切割輕鏈與重鏈區域之間的至少二個肽鍵；此產生成熟雙鏈形式。胺基酸TKSLDKGYNK(在該圖以粗體、較大字型且畫底線表示)自該成熟形式被切除。

實施例12：經Lys-C蛋白酶處理後之肉毒神經毒素(BoNT)切割產物的N端序列分析

為了補足實施例11報告之質譜資料，LC及HC之樣本係藉由N端定序分析。簡言之，經Lys-C處理之BoNT/A1樣本進行SDS-PAGE處理。自膠體切除蛋白帶，經處理以進行Edman N端蛋白定序。LC之N端序列為PFVNK。HC之N端序列為ALNDL。這些資料顯示使用Lys-C切割單鏈BoNT/A1產製包含完整N端之全長LC及HC。

實施例13：分析經Lys-C蛋白酶處理後之肉毒神經毒素(BoNT)之功能性，與經胰蛋白酶切割之BoNT比較

藉由Lys-C蛋白分解活化之BoNT/A1產生相較於天然BoNT/A1具完整活性之成熟雙鏈形式。相對地，藉由胰蛋白酶活化產製之截短形式之BoNT/A1顯示減少活性。被胰蛋白酶移除之BoNT/A重鏈之C端對應該蛋白之細胞結合功能性結構域。此結構域包含授予BoNT/A專一性、高親和性神經元結合性之蛋白及神經節苷酯結合位點。

在這些實驗中，天然BoNT/A比較材料係得自List Laboratories Inc.。天然BoNT/A係於純化前在生長中之芽胞梭菌培養內經蛋白分解活化。因此，和重組BoNT/A1不同的是，經純化之天然BoNT/A1不需要進一步蛋白分解活化步驟。

實施例14：胰蛋白酶切割除A1亞型以外之其他肉毒神經毒素A亞型的活化區域以外

溶解於緩衝液(25mM Tris/HCl pH 8.0，125mM NaCl)中之單鏈重組BoNT/A5(0.5mg/ml)係藉由胰蛋白酶(1：50至1：200酶：底物比)於37℃下蛋白分解活化5 至30分鐘，之後該反應藉由莫耳過量之大豆胰蛋白酶抑制劑抑制。

參考圖16A，BoNT/A5的結構域間區域被切割，產製其中重鏈藉由單一雙硫鍵與輕鏈連接之雙鏈形式。胰蛋白酶還切割重鏈內之至少一個額外位點，產生截短重鏈。重鏈有清楚的運動位移，因為被截短。

實施例15：以Lys-C蛋白酶處理肉毒神經毒素除了A1亞型以外之A2亞型

溶解於緩衝液(25mM Tris/HCl pH 8.0，125mM NaCl)中之單鏈重組BoNT/A2(0.3mg/ml)係藉由Lys-C(1：750酶：底物比)於37℃下蛋白分解活化2小時，之後該反應藉由0.4μM之專一性絲胺酸蛋白酶抑制劑4-(2-胺基乙基)苯磺醯基)氟鹽酸鹽(AEBSF)(Lys-C活化)抑制。圖17顯示BoNT/A2藉由Lys-C活化以產生成熟雙鏈形式，其中重鏈係藉由單一雙硫鍵與輕鏈連接。

實施例16：經Lys-C蛋白酶處理後之肉毒神經毒素A2切割產物的N端序列分析

為了進一步分析實施例15報告之經Lys-C處理之BoNT/A2，LC及HC之樣本係藉由N端定序分析。簡言之，經Lys-C處理之BoNT/A2樣本進行SDS-PAGE處理。自膠體切除蛋白帶，經處理以進行Edman N端蛋白定序。LC之N端序列為PFVNK。HC之N端序列為ALNDL。這些資料顯示使用Lys-C切割單鏈BoNT/A2產製包含完整N端之全長LC及HC。

實施例17：以Lys-C蛋白酶處理肉毒神經毒素除了A1亞型以外之A6亞型

溶解於緩衝液(50mM Tris/HCl pH 8.0，125mM NaCl)中之單鏈重組BoNT/A6(0.5mg/ml)係藉由Lys-C(0.4μg/ml)於4℃下蛋白分解活化20小時，接著進一步純化(苯基瓊脂糖管柱層析)以分離成熟雙鏈BoNT/A6與Lys-C。圖18顯示經Lys-C活化之BoNT/A6產生成熟雙鏈形式。

實施例18：經Lys-C蛋白酶處理後之肉毒神經毒素A6切割產物的N端序列分析

為了進一步分析實施例17報告之經Lys-C處理之BoNT/A6，經處理之BoNT/A6的LC及HC樣本係藉由N端定序分析。簡言之，樣本進行SDS-PAGE處理。自膠體切除蛋白帶，經處理以進行Edman N端蛋白定序。LC之N端序列為PFVNK。HC之N端序列為ALNDL。這些資料顯示使用Lys-C切割單鏈BoNT/A6產製包含完整N端之全長LC及HC。

實施例19：經Lys-C蛋白酶處理後之肉毒神經毒素A6切割產物的質譜分析

為了補足實施例18報告之N端定序資料，且為了證實Lys-C切割之產物對應預期之BoNT/A6成熟雙鏈形式，使用質譜分析以測定各結構域之質量。簡言之，單鏈BoNT/A6(0.5mg/ml)係於4℃下經Lys-C(0.4μg/ml)活化20小時。該反應藉由添加蛋白酶抑制劑亮抑酶肽(leupeptin)停止，樣本經濃縮至1.3mg/ml。樣本藉由電噴灑離子化質譜法(ESI-MS)分析。二個主要尖峰在質譜圖上被發現。這些尖峰具有預期質量50233(預期50151Da)及98162(預期98080Da)。這些資料顯示使用Lys-C切割單鏈BoNT/A6產製全長LC及HC。

序列表說明如下：

SEQ ID NO：1：衍生自肉毒芽胞梭菌株ATCC 3502之具蛋白分解活性之多肽，GenBank寄存編號CAL82988.1，缺乏248個N端胺基酸殘基

SEQ ID NO：2：衍生自肉毒芽胞梭菌株ATCC 3502之不具蛋白分解活性之多肽，GenBank寄存編號CAL82988.1

SEQ ID NO：3：ATCC 3502之BoNT/A，Genbank編號AAA23262

SEQ ID NO：4：BoNT/A1之圈環

SEQ ID NO：5：BoNT/A2/A6之圈環

SEQ ID NO：6：BoNT/A3之圈環

SEQ ID NO：7：BoNT/A3之圈環

SEQ ID NO：8：BoNT/A4之圈環

SEQ ID NO：9：BoNT/A5之圈環

SEQ ID NO：10：BoNT/A7之圈環

SEQ ID NO：11：BoNT/B1/B4bv/B6之圈環

SEQ ID NO：12：BoNT/B2/B3之圈環

SEQ ID NO：13：BoNT/B5np之圈環

SEQ ID NO：14：BoNT/C/CD之圈環

SEQ ID NO：15：BoNT/D之圈環

SEQ ID NO：16：BoNT/DC之圈環

SEQ ID NO：17：BoNT/E1至E5之圈環

SEQ ID NO：18：BoNT/E6之圈環

SEQ ID NO：19：BoNT/F1/F6之圈環

SEQ ID NO：20：BoNT/F2/F3之圈環

SEQ ID NO：21：BoNT/F4之圈環

SEQ ID NO：22：BoNT/F5之圈環

SEQ ID NO：23：BoNT/F7之圈環

SEQ ID NO：24：BoNT/G之圈環

SEQ ID NO：25：TeNT之圈環

SEQ ID NO：26：編碼SEQ ID NO：1之核酸序列

SEQ ID NO：27：編碼SEQ ID NO：2之核酸序列

<110> 辛泰森公司(Syntaxin Limited)

<120> 製造經蛋白分解處理之多肽之方法

<140> TW102142485

<141> 2013-11-21

<150> PCT/EP2012/073283

<151> 2012-11-21

<160> 27

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 333

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<400> 1

<210> 2

<211> 581

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<400> 2

<210> 3

<211> 1296

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<400> 3

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/A1圈環

<222> (1)..(25)

<400> 4

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/A2/A6圈環

<222> (1)..(25)

<400> 5

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/A3圈環

<222> (1)..(25)

<400> 6

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/A3圈環

<222> (1)..(25)

<400> 7

<210> 8

<211> 25

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/A4圈環

<222> (1)..(25)

<400> 8

<210> 9

<211> 25

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/A5圈環

<222> (1)..(25)

<400> 9

<210> 10

<211> 25

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/A7圈環

<222> (1)..(25)

<400> 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/B1/B4bv/B6圈環

<222> (1)..(10)

<400> 11

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/B2/B3圈環

<222> (1)..(10)

<400> 12

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/B5np圈環

<222> (1)..(10)

<400> 13

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/C/CD圈環

<222> (1)..(17)

<400> 14

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/D圈環

<222> (1)..(14)

<400> 15

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/DC圈環

<222> (1)..(14)

<400> 16

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/E1-E5圈環

<222> (1)..(15)

<400> 17

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/E6圈環

<222> (1)..(15)

<400> 18

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/F1/F6圈環

<222> (1)..(17)

<400> 19

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/F2/F3圈環

<222> (1)..(17)

<400> 20

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/F4圈環

<222> (1)..(17)

<400> 21

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/F5圈環

<222> (1)..(15)

<400> 22

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/F7圈環

<222> (1)..(15)

<400> 23

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> 肉毒芽胞梭菌

<220>

<221> BoNT/G圈環

<222> (1)..(15)

<400> 24

<210> 25

<211> 29

<212> PRT

<213> 破傷風芽胞梭菌(Clostridium Tetani)

<220>

<221> TeNT圈環

<222> (1)..(29)

<400> 25

<210> 26

<211> 1005

<212> DNA

<213> 肉毒芽胞梭菌

<400> 26

<210> 27

<211> 1746

<212> DNA

<213> 肉毒芽胞梭菌

<400> 27

Claims

一種具蛋白分解活性之多肽於製造經蛋白分解處理之多肽之用途，其中該具蛋白分解活性之多肽係Lys-C或彼之與其具有至少60%序列一致性之同系物；其中該經蛋白分解處理之多肽係雙鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)且其中該具蛋白分解活性之多肽水解單鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)以產生該雙鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)。
如申請專利範圍第1項之用途，其中該單鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)係天然存在之神經毒素、重組神經毒素或經改質之神經毒素，諸如缺乏天然H_c結構域或彼之部分之神經毒素或以其他胺基酸殘基取代該神經毒素H_c結構域之衍生物。
如申請專利範圍第2項之用途，其中該單鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)包含與選自SEQ ID NO：3至10之任一者之多肽序列具有至少50%序列一致性之胺基酸序列；較佳地其中該具蛋白分解活性之多肽水解該單鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)於位置緊鄰SEQ ID NO：3至10之任一者之該序列內之鹼性胺基酸殘基的C端。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該雙鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)之L鏈的C端及H鏈的N端係與自野生型梭菌分離之該對應雙鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)一致。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該雙鏈梭菌神經毒素血清型A(BoNT/A)當與自野生型梭菌之該相同的單鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)多肽所產製之該對應雙鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)多肽比較時，具有一致的胺基酸序列。
一種製造經蛋白分解處理之多肽之方法，其包含使下述(a)與(b)接觸之步驟：(a)第一多肽，該第一多肽係Lys-C或彼之與其具有至少60%序列一致性之同系物；(b)第二多肽，該第二多肽係易被該第一多肽蛋白分解；其中該接觸導致蛋白分解處理該第二多肽成為至少二個切割產物；其中該第二多肽係單鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)且其中該第一多肽水解該單鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)以產生雙鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)。
如申請專利範圍第6項之方法，其中該單鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)係天然存在之神經毒素、重組神經毒素或經改質之神經毒素，諸如缺乏天然H_c結構域或彼之部分之神經毒素或以其他胺基酸殘基取代該神經毒素H_c結構域之衍生物。
如申請專利範圍第7項之方法，其中該第二多肽包含與選自SEQ ID NO：3至10之任一者之多肽序列具有至少50%序列一致性之胺基酸序列；較佳地其中該第一多肽蛋白分解切割該第二多肽於位置緊鄰SEQ ID NO：3至10之任一者之該序列內之鹼性胺基酸殘基的C端。
如申請專利範圍第6至8項中任一項之方法，其中該雙鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)之L鏈的C端及H鏈的N端係與自野生型梭菌分離之該對應雙鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)一致。
如申請專利範圍第6至8項中任一項之方法，其中該雙鏈梭菌神經毒素血清型A(BoNT/A)當與自野生型梭菌之該相同的單鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)多肽所產製之該對應雙鏈肉毒神經毒素血清型A(BoNT/A)多肽比較時，具有一致的胺基酸序列。
如申請專利範圍第6至8項中任一項之方法，其中該接觸發生於細胞內、細胞溶解物中、經純化之細胞溶解物中或個體體內。
一種如申請專利範圍第6至11項中任一項之方法之用途，其係用於評估產品品質或產製藥品。
一種組成物，其包含藉由如申請專利範圍第6至11項中任一項之方法所獲得之經處理多肽及醫藥上可接受之載劑。
如申請專利範圍第13項之組成物，其中該組成物包含經處理與未經處理之第二多肽之混合物，該混合物包含低於5%之未經處理之第二多肽。
如申請專利範圍第13項之組成物，其中該組成物係調製為固體、液體或氣霧(或氣體)形式。
如申請專利範圍第13至15項之組成物，其中該組成物係藥品或美容組成物。
如申請專利範圍第13至15項中任一項之組成物，其係用於治療選自下列之疾病或病狀：隨意肌強度、局部肌張力障礙(包括頭、頸肌張力障礙及良性自發性眼瞼痙攣、半邊顏面痙攣及局部痙攣)、胃腸疾患、多汗症及美容除皺，在其他態樣亦包含眼瞼痙攣、口下頷肌張力障礙、張口型、閉口型、磨牙、梅傑氏(Meige)症候群、舌肌肌張力障礙、眼瞼肌肉運動失調、張口型頸肌張力障礙、頸項前屈、頸項後屈、頸項側屈、斜頸、咽部肌張力障礙、喉部肌張力障礙、痙攣性發聲障礙/內收肌型、痙攣性發聲障礙/外展肌型、痙攣性呼吸困難、四肢肌張力障礙、手臂肌張力障礙、特定任務性肌張力障礙、書寫痙攣、音樂家指痙攣、高爾夫手痙攣、腿部肌張力障礙、大腿內收、大腿外展膝關節彎曲、膝關節伸直、踝關節彎曲、踝關節伸直、馬蹄內翻足、畸形足肌張力障礙、紋狀趾、腳趾彎曲、腳趾伸直、中軸肌張力障礙、比薩症候群、肚皮舞者肌張力障礙、節段性肌張力障礙、半身性肌張力障礙、全身性肌張力障礙、lubag症候群中之肌張力障礙、皮質基底核退化中之肌張力障礙、lubag症候群中之肌張力障礙、遲發性肌張力障礙、脊髓小腦性失調症中之肌張力障礙、帕金森氏症中之肌張力障礙、亨汀頓氏舞蹈症中之肌張力障礙、髓素異常表象(Hallervorden Spatz disease)中之肌張力障礙、多巴誘發之運動困難/多巴誘發之肌張力障礙、遲發性運動困難/遲發性肌張力障礙、陣發性運動困難/肌張力障礙、運動性非運動性動作誘發之上顎肌陣攣、肌陣攣肌纖維顫動、僵硬、良性肌肉痙攣、遺傳性下巴顫抖、矛盾性下巴肌活動、半側咀嚼肌痙攣、肥厚性鰓肌病、嚼肌肥厚、脛骨前肌肥厚、眼球震顫、震動幻視核上性凝視麻痺、癲癇、持續性不全癲癇(partialis continua)、計畫痙攣性斜頸手術、外展肌聲帶麻痺、反抗性突變煩躁不安、上食道括約肌功能不全、聲帶肉芽腫、口吃性妥瑞氏症、中耳肌陣攣、保護性喉閉合、喉切除術術後、語言障礙、保護性垂瞼、眼瞼內翻、奧迪氏(Odii)括約肌功能異常、假性食道弛緩不能、非弛緩不能性食道運動障礙、陰道痙攣、術後制動震顫、膀胱功能失常、膀胱尿道括約肌失常、膀胱括約肌痙攣、半側臉痙攣、神經再生性運動困難、魚尾紋之美容使用、皺眉臉不對稱、頦肌皺縮、僵硬人症候群、破傷風性前列腺增生(tetanus prostate hyperplasia)、過胖、治療幼兒腦性麻痺斜視、混合麻痺性共同性斜視、在視網膜剝離手術之後、在白內障手術之後、在無晶體眼中肌炎性斜視、肌病性斜視、分離性垂直眼偏斜、作為斜視手術之輔助治療、內斜視、外斜視、弛緩不能、肛門裂、外分泌腺活性過高、Frey氏症候群、假哭性症候群、多汗症、腋窩掌足鼻漏、中風中之相對流涎過多、帕金森氏症中之相對流涎過多、肌萎縮性側索硬化痙攣症狀中之相對流涎過多、腦炎及脊髓炎自體免疫疾病中之相對流涎過多、多發性硬化症、橫貫性脊髓炎、戴維克氏(Devic)症候群、病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染、真菌感染、在遺傳性痙攣性截癱中風後症候群腦半球梗塞中、腦幹梗塞、脊椎梗塞、偏頭痛、中樞神經系統外傷、腦半球病灶、腦幹病灶、脊椎病灶、在中樞神經系統出血中、腦內出血、蜘蛛膜下腔出血、硬膜下出血、脊椎內出血、在癌中、腦半球性腫瘤、腦幹腫瘤、脊椎腫瘤、打鼾。
一種具蛋白分解活性之多肽於產製用於質譜法中之多肽片段之用途，其中該具蛋白分解活性之多肽係Lys-C或彼之與其具有至少60%序列一致性之同系物；其中該具蛋白分解活性之多肽水解多肽以產製該多肽片段。
一種產製用於質譜法中之多肽片段之方法，該方法包含使下述(a)與(b)接觸之步驟：(a)第一多肽，該第一多肽係Lys-C或彼之與其具有至少60%序列一致性之同系物；(b)第二多肽，該第二多肽係易被該第一多肽蛋白分解；其中該接觸導致蛋白分解處理該第二多肽成為至少二個多肽片段。