KR101729710B1

KR101729710B1 - 물에 안정하게 분산되는 멜라닌 나노입자를 포함하는 핵자기 공명 영상 조영제

Info

Publication number: KR101729710B1
Application number: KR1020120037004A
Authority: KR
Inventors: 이진규; 주국연; 이정희
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2012-04-09
Filing date: 2012-04-09
Publication date: 2017-04-24
Anticipated expiration: 2032-04-09
Also published as: WO2013154329A1; US9808540B2; KR20130114543A; US20150139914A1

Abstract

본 발명은 핵자기 공명 영상 조영제에 관한 것으로, 구체적으로 균일한 형상과 크기의 멜라닌 나노입자를 기반으로 하여, 물에 잘 분산되고, 세포 독성이 없으며, 생체 내 잔류 시간이 긴 핵자기 공명 영상 조영제를 제공하기 위한 것이다.

Description

물에 안정하게 분산되는 멜라닌 나노입자를 포함하는 핵자기 공명 영상 조영제{Nuclear magnetic resonance image contrast agent comprising water-dispersible melanin nanoparticles}

본 발명은 물에 잘 분산되고, 세포 독성이 없으며, 생체 내 잔류 시간이 길어 MRI 조영제로 유용하게 사용될 수 있는 핵자기 공명 영상 조영제에 관한 것이다.

자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)은 시료에 낮은 전자기 에너지를 조사(irradiate) 후에 물 분자로부터 나온 자기공명영상 신호를 검출하는 것으로, 최근 급속히 발전하는 진단 영상분야이다. 자기공명영상은 고해상도의 조직 해부능과 짧은 시간에 여러 번 반복이 가능한 비침습적인(non-invasive) 자기공명 영상획득이 가능하여 환자의 질병 진단 및 약물 처리를 관찰에 가장 적합한 방법으로 알려져 있다. 자기공명영상 신호는 두 개의 시간 매개변수인, T1과 T2 이완 시간 (T1 and T2 relaxation time)과 스핀 밀도 (spin density)로 부터 나오는 물 분자의 양성자 양에 의해서 결정된다. 자기공명 영상의 대비도(contrast)는 조영제에 의해서 조절된다.

T1 조영제로 사용되는 상자성 제제의 대표적인 예는 가돌리늄(Gd) 제제를 들 수 있다. 그러나, 가돌리늄(Gd) 자체는 독성이 높기 때문에 착화합물(chelates)형태로 하여 안정성을 개선하여야 하며, 대표적으로 Gd를 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA)과 결합시킨 자기공명영상 조영제(Gd-DTAP)가 많이 사용되고 있다.

그러나, Gd-DTPA를 포함하여 대부분의 T1 조영제들은 장기, 조직, 특정 세포에 특이적인 조영제가 아니며, 각 조직의 혈관의 영상을 조영하는 조영제들이 대부분을 차지하고 있다. 또한, 기존의 조영제는 체내 체류 시간을 짧기 때문에, 이를 증가시키기 위한 노력도 병행되고 있다.

한편, 멜라닌(melanin)은 식물, 동물, 원생 생물 등 여러 생명체들의 다양한 부위에 존재하는 생물학적 고분자(bio-polymer)로서, 흑갈색의 유멜라닌(Eumelanin)과 황적색의 페오멜라닌(pheomelanin)으로 분류된다. 상기 유멜라닌은 3,4-디하이드로시-L-페닐알라닌(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine, L-DOPA) 또는 2-(3,4-디하이드로시페닐)에틸아민[2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethylamine, dopamine]으로부터 파생된 것이고, 상기 페오멜라닌은 시스테인(cysteine), 글루타티온(glutathione) 등의 메르캅토기(-SH) 함유 물질 존재하에서 L-DOPA 또는 도파민(dopamine)으로부터 파생된 것이다. 여기서, 유멜라닌은 포유류에서 우세하게 존재하는 형태의 멜라닌으로서, 카테콜아민(catecholamine)의 산화로 유발된 o-퀴논(o-quinones)의 아민기(amine group) 부분의 분자 내 첨가(intramolecular addition)에 의해 형성된 인돌 유닛(indole units)을 포함하는 불균일한 구조의 생체 고분자로 알려져 있다.

생체 내에 존재하는 흑색종은 생체 내 상자기성 금속이온과 배위결합을 통해 강한 T1-MRI 신호를 나타내는 것으로 알려져 있다. 이는 생체 내 존재하는 흑색종을 MRI를 통해 감지해 낼 수 있을 뿐만 아니라, 멜라닌을 이용한 MRI 프로브(probe)의 가능성을 시사하고 있다.

그러나, 자연계에서 얻는 멜라닌의 경우, 체내에서 멜라닌을 얻을 때 멜라닌 이외 다른 단백질 등의 생체 물질들도 함께 얻기 때문에 순수한 멜라닌만을 얻기 어려우며, 또한 정제를 하여 생체 물질들을 제거하더라도 멜라닌 자체의 입자 형태가 훼손되어 조영 효과가 저하되는 문제가 있었다. 한편, 종래 합성 방법을 통해 얻은 멜라닌의 경우, 물에 분산되지 않기 때문에, 생체 조영제로서의 이용에 한계가 있었다. 특히, 물에 잘 분산되지 않아 생체 내에서 사용되기 힘들고, 생체 내로 투입되더라도 침전/응집되거나 체외로 빠르게 배출되어 원하는 조영 효과를 얻을 수 없는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 멜라닌 나노입자를 일정한 크기와 형상으로 제조하고, 이에 상자기성 이온을 배위결합시키고, 멜라닌 나노입자의 표면에 PEG를 결합시킬 경우, 물에 잘 분산되고, 세포 독성이 없으며, 생체 내 잔류 시간이 길어 MRI 조영제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. US 5,310,539 2. 한국특허공개 2011-0044712

본 발명은 물에 잘 분산되고, 세포 독성이 없으며, 생체 내 잔류 시간이 길어 MRI 조영제로 유용하게 사용될 수 있는 핵자기 공명 영상 조영제를 제공하기 위한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 핵자기 공명 영상 조영제의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 멜라닌 나노입자의 표면에 상자기성 금속 이온이 배위결합되어 있고, 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 상기 멜라닌 나노입자 표면에 화학적으로 결합되어 있는 멜라닌 나노입자 복합체를 포함하는, 핵자기 공명 영상 조영제를 제공한다.

본 발명에서 사용하는 용어 '핵자기 공명 영상(nuclear magnetic resonance image)'이란, 자기장 내에서 원자핵의 자기모멘트에 특정한 외부의 에너지가 작용하여 그 에너지를 흡수하고 다른 에너지 준위로 전이하는 핵자기 공명 현상을 이용하여 이를 영상화하는 것을 의미한다.

본 발명에서는 핵자기 공명 영상을 위한 조영제를 제공하기 위한 것으로, 조영제의 기본 입자로 멜라닌 나노입자를 사용하고, 강한 핵자기 공명 신호를 나타내는 상자기성 금속 이온을 상기 멜라닌 나노입자의 멜라닌에 배위결합시킨 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용되는 용어 '멜라닌'이란, 식물, 동물, 원생 생물 등 여러 생명체들의 다양한 부위에 존재하는 생물학적 고분자를 의미하며, 일반적으로 흑갈색의 유멜라닌(Eumelanin)과 황적색의 페오멜라닌(pheomelanin)으로 분류된다. 본 발명에서는 멜라닌 나노입자를 사용하는 것으로, 멜라닌 나노입자의 직경은 30 nm 내지 600 nm이며, 바람직하게는 30 nm 내지 200 nm 이다. 상기 멜라닌 나노입자는 30일 이상 중성의 물에서 안정하게 분산될 수 있으며, PEG를 이용하여 표면 처리 후에는 180일 이상 물에 안정하게 분산될 수 있다.

상기 멜라닌 나노입자는 자연계에서 추출하거나, 또는 화학적으로 합성하여 제조할 수 있다. 자연계에서 추출하는 경우에는, 오징어 먹물로부터 원심분리하여 회수할 수 있다. 화학적으로 합성하는 경우에는, dopamine, DOPA 또는 cysteine의 멜라닌 전구체로부터 합성될 수 있다. 일례로, 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다:

1) 도파민·H⁺X^-를 포함하는 용액에 염기를 첨가하여 중화반응하는 단계, 및

2) 상기 단계 1)의 용액의 도파민을 중합하는 단계,

여기서, 상기 도파민·H⁺X^-과 염기의 몰비는 1:0.1 내지 1:1이다.

상기 단계 1은 도파민·H⁺X^-를 염기와 반응시켜 중화시키는 단계로서, 상기 도파민·H⁺X^-과 염기의 몰비를 1:0.1 내지 1:1로 조절하면 멜라닌을 일정한 형상을 갖는 나노입자의 형태로 제조할 수 있다. 상기 단계 2는, 염기로 중화시킨 후 중합시켜 멜라닌 나노입자를 제조하는 단계이다.

상기 X^-는 할라이드 이온, HSO₄ ^-, NO₃ ^-, H₂PO₄ ^- 및 CH₃COO^-로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 염기는 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 토금속 수산화물, 알칼리 금속의 탄산염, 알칼리 토금속의 탄산염, 알칼리 금속의 중탄산염, 알칼리 토금속의 중탄산염, 알칼리 금속의 아세트산염, 알칼리 금속의 인산염, 알칼리 금속 알콕사이드(탄소수 1 ~ 20), 암모니아, 암모니아수 및 아민으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기의 제조방법으로 제조된 멜라닌 나노입자의 경우, 자연계에서 추출한 멜라닌 나노입자와 비교하여, 입자의 형상이 보다 균일하고, 물에 보다 잘 분산되는 특징이 있다.

또한, 본 발명의 핵자기 공명 영상 조영제는, 상자기성 금속 이온이 멜라닌 나노입자의 멜라닌과 배위결합된 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용되는 용어 '상자기성 금속 이온'은, 핵자기 공명 영상을 나타내는 물질을 의미하는 것으로, 내부에 존재하고 있던 Unpaired Spin들이 평소 때는 열운동에 의한 불규칙적 스핀배열을 보이고 있다가 외부자기장이 걸리면 그 영향으로 인하여 일정방향으로 스핀정렬이 일어나게 되는 결과, 평소에는 자성을 띄지 않다가 외부자기장을 걸어 주었을 경우 자기장 방향으로 자화되는 특성을 가지는 물질을 의미한다. 이의 예로, 가돌리늄(Gd), 철(Fe), 망간(Mn), 니켈(Ni), 구리(Cu), 에르븀(Er), 유로퓸(Eu), 홀뮴(Ho) 및 크롬(Cr)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 금속의 이온을 사용할 수 있다.

상기 상자기성 금속 이온은, 멜라닌 나노입자의 멜라닌과 배위결합할 수 있으며, 이를 도 1에 나타내었다. 상기 상자기성 금속 이온을 멜라닌 나노 입자의 멜라닌에 배위시킬 경우, 종래 Gd계 조영제보다 T1 감쇄효과가 보다 우세하여 T1 강조 영상에서 우수한 핵자기 공명 영상 조영 효과를 발휘할 수 있다.

상기 상자기성 금속 이온은, 멜라닌 나노입자 중량 대비 1 ㎍ 내지 10 ㎍이 결합될 수 있으며, 바람직하게는 2 ㎍ 내지 7 ㎍이 결합될 수 있다. 또한, 멜라닌 나노입자의 크기가 작을수록 멜라닌 나노입자 중량 대비 표면적이 넓어지므로, 상자기성 금속 이온의 결합량을 고려하여, 멜라닌 나노입자의 크기가 작은 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 핵자기 공명 영상 조영제는, PEG(폴리에틸렌글리콜)이 상기 멜라닌 나노입자 표면에 화학적으로 결합됨으로써 멜라닌 나노입자 표면이 개질된 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 사용되는 'PEG(폴리에틸렌글리콜)'는 멜라닌 나노입자가 물에 잘 분산될 수 있도록 사용하는 것으로, PEG의 분자량은 1 KDa 내지 40 KDa인 것이 바람직하다. 아민기 또는 티올기와 같은 작용기를 갖는 PEG를 멜라닌 나노입자와 반응시켜 PEG를 멜라닌 나노입자 표면에 화학적으로 결합시킬 수 있다.

상기 PEG로 개질된 멜라닌 나노입자는 물에 대한 분산성이 매우 높아지게 된다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 PEG로 개질되지 않은 멜라닌 나노입자는 물에서 침전되나, PEG로 개질된 멜라닌 나노입자는 물에서 잘 분산되어 현탁 상태로 존재할 수 있다. 물에 대한 분산성이 향상될 경우, 체내에서 오래 존재할 수 있으며, 이에 따라 멜라닌 나노입자가 특정 조직이나 세포에 부착될 시간을 확보할 수 있어, 원하는 조영효과를 효과적으로 얻을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명에 따른 핵자기 공명 영상 조영제는 투입 후 24시간이 지난 후에도 조영 효과를 얻을 수 있었으며, 따라서 짧은 시간 동안만 조영 효과를 얻을 수 있는 종래 핵자기 공명 영상 조영제 보다 현저히 우수한 효과를 갖는다.

또한, 본 발명의 핵자기 공명 영상 조영제는, 상기 PEG 외에 추가적으로 상기 멜라닌 나노입자 표면에 3-머캅토프로피온산이 결합됨으로써 멜라닌 나노입자의 표면이 추가로 개질된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 핵자기 공명 영상 조영제는, 상기 멜라닌 나노입자 표면에 항체가 추가로 결합된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 멜라닌 나노입자의 표면에는 다양한 작용기가 존재하므로 항체가 결합될 수 있다. 상기 항체는 멜라닌 나노입자가 원하는 부분, 예컨대 특정 조직이나 세포에 결합될 수 있도록 하여 조영효과를 높이는 기능을 부여하기 위한 것이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 항체는, Cetuximab, Herceptin를 들 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체가 결합된 본 발명의 핵자기 공명 영상 조영제는 특정 세포에만 축적될 수 있으며, 이에 따라 조영 효과를 높일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 핵자기 공명 영상 조영제의 제조방법을 제공한다:

멜라닌 나노입자를 포함하는 용액에 상자기성 금속 이온을 포함하는 용액을 첨가하여 상자기성 금속 이온을 멜라닌 나노입자의 멜라닌에 배위결합하는 단계(단계 1); 상기 단계 1)의 용액에 PEG를 첨가하는 단계(단계 2); 및 상기 단계 2)의 용액으로부터 멜라닌 나노 입자 복합체를 회수하는 단계(단계 3).

상기 멜라닌 나노입자, 상자기성 금속 이온, PEG는 앞서 설명한 부분과 동일하다.

상기 단계 1은 상자기성 금속 이온을 멜라닌 나노입자의 멜라닌에 배위결합하는 단계이다. 멜라닌 나노입자를 포함하는 용액에 상자기성 금속 이온을 포함하는 용액을 첨가한 후 약 3시간 동안 교반시켜 배위결합시킬 수 있다.

상기 단계 2는 멜라닌 나노입자의 표면에 PEG를 결합시킴으로써 나노입자 표면을 개질하는 단계이다. 이때 단계 1의 용액에 PEG를 포함하는 용액을 첨가하거나, 또는 단계 1에서 제조된 멜라닌 나노입자를 원심분리하여 회수한 후, 이를 세척 및 건조한 멜라닌 나노입자를 분산시킨 용액에 첨가할 수 있다.

또한, 상기 단계 2에서 3-머캅토프로피온산을 추가로 첨가하여, PEG와 3-머캅토프로피온산을 함께 멜라닌 나노입자 표면에 결합시킴으로써 나노입자 표면을 개질할 수 있다.

또한, 상기 제조된 멜라닌 나노 입자를 항체와 결합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 핵자기 공명 영상 조영제는, 종래 사용되는 핵자기 공명 영상 조영제와 비교하여 세포 독성이 없으며, 생체 내 잔류 시간이 길어 MRI 조영제로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵자기 공명 영상 조영제는 Fe₂O₃, MnO, Hollow Mn₃O₄에 비하여 r₁값 및 r₂/r₁값이 우수하였으며, Gd-DTPA와 유사한 r₂/r₁을 나타내었다. 또한, Gd-DTPA는 조영 효과를 나타내는 시간이 짧은 반면, 본 발명에 따른 핵자기 공명 영상 조영제는 체내 체류 시간이 길어 특정 조직이나 세포에 결합될 시간을 확보할 수 있어 보다 효과적이다.

또한, 멜라닌 나노입자의 멜라닌에는 다양한 기능기가 존재하므로, 이를 이용하여 멜라닌 나노입자의 표면에 항체를 결합할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 특정 세포(암 조직)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 결합시킴으로써, MRI 조영시 특정 세포에 대한 영상 효과를 얻을 수 있었다.

본 발명에 따른 핵자기 공명 영상 조영제는, 균일한 형상과 크기의 멜라닌 나노입자를 기반으로 하여, 물에 잘 분산되고, 세포 독성이 없으며, 생체 내 잔류 시간이 길어 MRI 조영제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은, 상자기성 금속 이온이 멜라닌 나노입자의 멜라닌에 배위결합되는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 멜라닌 나노입자(MelNPs)의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 멜라닌 나노입자(sepia melanin)의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 멜라닌 나노입자(MelNPs 및 sepia melanin)의 적외선 스펙트럼(도 4A) 및 UV/Vis 스펙트럼(도 4B)을 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 멜라닌 나노입자(MelNPs)의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 Fe³⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자(Fe³⁺-MelNPs 및 Fe³⁺-sepia melanin)의 Fe³⁺ 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 일 실시예에 따른 Fe³⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자(Fe³⁺-MelNPs 및 Fe³⁺-sepia melanin)의 ESR signal을 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 일 실시예에 따른 Fe³⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자(Fe³⁺-MelNPs 및 Fe³⁺-sepia melanin)의 입자 크기에 따른 Fe³⁺ 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 일 실시예에 따른 PEG가 결합된 Fe³⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자(PEGylated Fe³⁺+-MelNPs)의 TEM 이미지(도 9A), FT-IR 스펙트럼(도 9B), 분산성(도 9C) 및 T1 여기 시간 그래프(도 9D)을 나타낸 것이다.
도 10은, 본 발명의 일 실시예에 따른 PEG가 결합된 Fe³⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자(PEGylated Fe³⁺-MelNPs)의 Hela 세포 생존을 나타낸 것이다. 도 10A는 멜라닌 나노입자의 농도별로 세포 생존률을 나타낸 것이고, 도 10B는 대조군으로 아무것도 처리하지 않은 것이고, 도 10C는 PEGylated Fe³⁺-MelNPs를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은, 본 발명의 일 실시예에 따른 Fe³⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자(Fe³⁺-MelNPs 및 Fe³⁺-sepia melanin)의 MRI 특성을 나타낸 것이다. 각 멜라닌 나노입자의 농도는 4 mg/mL이었다.
도 12는, 본 발명의 일 실시예에 따른 PEG가 결합된 Fe³⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자(PEGylated Fe³⁺-MelNPs)를 정상 마우스에 꼬리 정맥 (tail vein)으로 투여 전(pre injection)과 투여 후 1, 3, 6, 24 시간에 얻은 T1 강조 영상 (bright signal enhancement)을 나타낸 것이다. 도 12에서, Sp는 비장(spleen), Ki는 신장(kidney), Li는 간(liver), St는 위(stomach)를 나타낸다. 투여 후 6시간까지 멜라닌 나노입자에 의한 비장, 간, 신장에서 시그날 증가가 관찰되고, 24시간 영상에서는 투여 후 6시간 영상보다는 시그날이 감소된 결과를 보여준다.
도 13은, 본 발명의 일 실시예에 따른 PEG가 결합된 Fe³⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자(PEGylated Fe³⁺-MelNPs)를 간암 발병 마우스에 꼬리 정맥(tail vein)으로 투여 전(pre injection)과 투여 후 1, 6, 24 시간에 얻은 T1 강조 MRI 이미지를 나타낸 것이다. 도 13A는 PEGylated Fe³⁺-MelNPs에 대한 결과를, 도 13B는 IgG(Control 항체)가 결합된 PEGylated Fe³⁺-MelNPs에 대한 결과를, 도 13C는 Cetuximab(치료항체)가 결합된 PEGylated Fe³⁺-MelNPs에 대한 결과를 나타낸 것이다. 도 13에서, Tu는 종양(tumor), Li는 간(liver)을 나타낸다. PEGylated Fe³⁺-MelNPs만 투여한 도13A에서는 멜라닌이 전반적으로 분포되어 간 전반에 시그날 증가가 관찰되지만, 종양의 시그날 증가가 관찰되지 않아 멜라닌 나노입자가 종양에 24시간까지 도달하지 못하였음을 보여준다. IgG(control 항체, 치료항체와 같은무게)가 결합된 PEGylated Fe³⁺-MelNPs를 투여한 도 13B는 도 13A의 항체를 결합하지 않은 조영제와 같이 종양의 시그날이 24시간까지 증가되지 않는 것을 보여준다. 치료항체로 Cetuximab이 결합된 PEGylated Fe³⁺-MelNPs를 투여한 도 13C는 종양부위의 시간에 따른 시그날이 증가하여 투여 24시간 후에는 정상 간에 비해 종양 시그날이 증가되는 것을 보여준다. 도 13은 특정 세포(암 조직)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 결합시킴으로써, MRI 조영 시 특정 세포에 대한 영상이 가능한 것을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 멜라닌 나노입자의 제조

1) 실시예 1-1(MelNPs)

180 mg의 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride; Aldrich Chemical)을 90 mL의 탈이온화 증류수에 용해하였다. 50℃에서 760 ㎕의 1 N NaOH 용액을 상기 도파민 하이드로클로라이드 용액에 격렬히 교반하면서 첨가하였다. NaOH를 첨가하자마자 용액이 연노란색으로 변하였고, 점차적으로 짙은 갈색으로 변하였다. 5시간 반응 후, 멜라닌 나노입자를 원심분리(18,000 rpm)하여 회수하고, 탈이온화 증류수로 수회 세척하여 회수하였다. 저속도로 원심분리하여(4000 rpm) 침전물을 제거한 후, 분산용액으로 멜라닌 나노입자를 보관하였다.

2) 실시예 1-2(MelNPs)

상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 멜라닌 나노입자를 제조하되, NaOH의 첨가량을 400 내지 950 ㎕, 탈이온화 증류수의 양을 45 내지 180 mL, 반응온도를 20 내지 70℃로 변화시켜 멜라닌 나노입자를 제조하였다.

구체적으로, 180 mg의 도파민 하이드로클로라이드를 90 mL의 삼차 증류수에 녹인 후, 격렬하게 교반중에 760 ㎕의 1N NaOH를 상온에서 첨가하였다. 5시간 후 여러번의 원심분리를 통해 316 nm 크기의 멜라닌 나노입자를 얻을 수 있었다. 또한, 동일한 방법으로 제조하되, 1N NaOH의 양을 450 ㎕로 줄여 577 nm 크기의 멜라닌 나노입자를 얻을 수 있었다.

3) 실시예 1-3(sepia melanin)

한국 갑오징어를 해부하여 얻어진 오징어 먹물로부터 흡입기(syringe)로 추출하여 세피아 멜라닌(sepia melanin)을 얻었다. 이를 원심분리하여(18,000 rpm) 5차례 세척하고 물에 재분산시켜 보관하였다.

상기 실시예 1-1 및 1-3에서 각각 제조된 멜라닌 나노입자의 TEM 이미지를 Hitachi-7600 electron microscope로 얻었으며, 그 결과를 각각 도 2(실시예 1-1) 및 도 3(실시예 1-3)에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1-1에서 제조된 멜라닌 나노입자의 경우, 평균 직경은 약 95 nm이었으며, 제조된 나노입자의 형상 및 크기가 균일함을 확인할 수 있었다. 반면, 도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1-3에서 제조된 세피아 멜라닌의 경우 입자의 직경은 30 내지 200 nm이었으며, 입자의 크기가 다소 불균일함을 확인할 수 있었다.

또한, 실시예 1-1 및 1-3에서 제조된 멜라닌 나노입자의 적외선 스펙트럼을 JASCO FT-IR-600 Plus로 기록하였고, UV/Vis 스펙트럼은 SINCO S-3100로 얻었으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1-1 및 1-3에서 제조된 멜라닌 나노입자의 적외선 스펙트럼 및 UV/Vis 스펙트럼은 서로 유사함을 확인할 수 있었다.

또한, 실시예 1-2에서 제조된 멜라닌 나노입자의 TEM 이미지를 Hitachi-7600 electron microscope로 얻었으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

실시예 2: 상자기성 금속이온이 배위결합된 멜라닌 나노입자의 제조

1) 실시예 2-1(Fe³ ⁺-MelNPs)

100 ㎕의 Fe³ ⁺ 용액(1 mg/mL)을 상기 실시예 1-1에서 제조된 10 mL의 멜라닌 나노입자 용액(1mg/mL)에 격렬히 교반하면서 첨가하였다. 3시간 후, Fe³ ⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자를 원심분리(19,000 rpm)하여 회수하고, 상층액은 막 필터(membrane filter; 0.45 ㎛ pore size)로 여과하여 ICP-AES로 Fe³ ⁺의 농도를 측정하여, 멜라닌 나노입자에 결합된 Fe³ ⁺의 양을 측정하였다.

상기 회수된 Fe³ ⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자는 탈이온화 증류수로 수 회 세척하고, 희석시켜 보관하였다.

2) 실시예 2-2(Fe³ ⁺-MelNPs)

상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 Fe³ ⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자를 제조하되, 실시예 1-1에서 제조된 멜라닌 나노입자 대신, 실시예 1-2에서 제조된 멜라닌 나노입자를 사용하여, Fe³ ⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자를 제조하였다.

2) 실시예 2-3(Fe³ ⁺-sepia melanin)

상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 Fe³ ⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자를 제조하되, 실시예 1-1에서 제조된 멜라닌 나노입자 대신, 실시예 1-3에서 제조된 멜라닌 나노입자를 사용하여, Fe³ ⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자를 제조하였다.

상기 실시예 2-1 및 2-3에서, 배위결합된 Fe³ ⁺의 농도를 측정한 결과를 도 6에 나타내었다.

또한, 상기 실시예 2-1 및 2-3에서 제조된 Fe³⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자의 ESR 스펙트럼을 Fe³⁺가 배위결합되지 않은 실시예 1-1 및 1-3과 함께 JEOL JES-FA200로 얻었으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 2-1 및 2-3는 각각 실시예 1-1 및 1-3에 비하여 ESR signal의 강도가 감소하였음을 확인할 수 있었다. 이러한 ESR signal 강도의 감소를 통해 멜라닌 나노 입자의 디히드록실기(dihydroxyl group)에 상자기성 금속이온인 Fe³⁺ 이온이 배위되어 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 실시예 2-2에서 제조된 Fe³ ⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자의 배위결합된 Fe³ ⁺의 농도를 측정한 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, 멜라닌 나노입자의 크기가 커질수록 배위결합되는 Fe³ ⁺의 양이 적어짐을 확인할 수 있었다.

실시예 3: PEG 가 결합된 상자기성 금속 이온이 배위결합된 멜라닌 나노입자의 제조( PEGylated Fe ³ ⁺ - MelNPs )

150 mg의 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)티올(methoxy-poly(ethylene glycol)thiol; mPEG-SH; 2 kDa; 썬바이오(한국))을 실시예 2-1에서 제조된 10 mL의 Fe³⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자 용액(1 mg/mL)에 첨가하고, NH₄OH(28 wt%)를 첨가하여 pH를 약 10.3으로 조절하였다. 1 시간 동안 교반한 후, 원심분리(18,000 rpm)하여 표면 개질된 멜라닌 나노입자를 회수하고, 이를 재분산/농축 공정으로 탈이온화 증류수로 수 회 세척하여, PEG가 결합된 Fe³ ⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자를 제조하였다.

상기에서 제조된 멜라닌 나노입자의 TEM 이미지, FT-IR 스펙트럼을 측정하여 도 9a 및 도 9b에 각각 나타내었다. 또한, 상기 제조된 멜라닌 나노입자의 분산성을 육안으로 확인하였으며(도 9c), T1 여기 시간을 Fe³ ⁺의 농도에 대한 그래프를 구하였다(도 9d).

실시예 4: MPA / PEG 가 결합된 상자기성 금속이온이 배위결합된 멜라닌 나노입자의 제조

160 mg의 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)티올(methoxy-poly(ethylene glycol)thiol; mPEG-SH; 2 kDa; 썬바이오(한국))과 10 mL의 MPA(3-mercaptopropionic acid)을 실시예 2-1에서 제조된 10 mL의 Fe³⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자 용액(1 mg/mL)에 첨가하고, NH₄OH(28 wt%)를 첨가하여 pH를 약 10.3으로 조절하였다. 1 시간 동안 교반한 후, 원심분리(18,000 rpm)하여 표면 개질된 멜라닌 나노입자를 회수하고, 이를 재분산/농축 공정으로 탈이온화 증류수로 수회 세척하여, MPA/PEG가 결합된 Fe³⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자를 제조하였다.

실시예 5: 항체가 결합된 멜라닌 나노입자의 제조

실시예 5-1) Cetuximab가 결합된 멜라닌 나노입자의 제조

0.2 μmol의 EDC 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(EDC) hydrochlorie)을, 상기 실시예 4에서 제조한 1 mL 멜라닌 나노입자 용액(1 mg/mL)에 첨가하여 1시간 동안 교반하였다. 다음으로, 4 ㎕의 Cetuximab 용액(1 mg/mL)을 첨가하고 4시간 동안 교반한 후, Cetuximab가 결합된 멜라닌 나노입자를 농축/재분산의 정제 과정으로 회수하였다.

실시예 5-2) IgG가 결합된 멜라닌 나노입자의 제조

상기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 제조하되, Cetuximab 대신 IgG 항체를 사용하여, IgG 항체가 결합된 멜라닌 나노입자를 제조하였다.

실험예 1: 독성 평가

세포 생존은 WST-1 assay로 평가하였다. 세포(HeLa cell)를 96-well 플레이트에 3×10³ 세포/well의 밀도로 24시간 동안 배양한 후, 실시예 3에서 제조된 mPEG-SH로 표면 처리된 멜라닌 나노입자(PEGylated Fe³ ⁺-MelNPs)로 처리하였다. 농도를 증가시키면서 24시간 배양후, 10 ㎕의 WST-1 용액(2-(4-nitrophenyl)-5-(2-sulfophenyl)-3-[4-(4-sulfophenylazo)-2-sulfophenyl]-2H-tetrazolium disodium salt, Daeil Science, Korea)를 각 well에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 630 nm를 reference로 하여, 455 nm에서 각 well의 흡수를 Bio-Tek model ELx800TM microplate reader (Bio-Tek Instruments,Winooski, VT)로 측정하였고, 멜라닌 나노입자 자체의 흡수를 보정하였다. 세포 생존은 하기의 식으로 계산하였다:

% cell viability = (mean absorbance in test wells)/(mean absorbance in control well)×100

각 실험은 3회 반복하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이, 농도를 200 g/mL로 처리한 경우에, Hela 세포의 생존력이 100%이었으며, 이로부터 본 발명의 mPEG-SH로 표면 처리된 멜라닌 나노입자(PEGylated Fe³⁺-MelNPs)는 세포 독성을 나타나지 않아 높은 생체 적합성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 3: MRI relaxation 특성

Eppendorf tube에 다양한 농도로 제조된 Fe³ ⁺가 배위결합된 멜라닌 나노입자(실시예 2-1(Fe³ ⁺-MelNPs) 및 2-3(Fe³ ⁺-sepia melanin))의 T1 및 T2 이완시간(relaxation time)을, 3.0 T clinical MRI scanner(Philips, Achieva ver. 1.2, Philips Medical Systems, Best, The Netherlands, 80 mT/m gradient amplitude, 200 ms/m slew rate)로 측정하였다. Look-Locker sequence (TR/TE = 10/1 ms, flip angle = 5)를 사용하여, 다른 반전 지연 시간(inversion delay time)에서 17 gradient echo 이미지를 얻었다(minimum inversion time: 87 ms, phase interval: 264 ms, in-plane image resolution: 625×625 mm², slice thickness: 500 mm). Matlab program를 사용하여, 3-parameter function에 맞추어 이미지로부터 T1 값을 계산하였다. T2 측정은 10개의 다른 시간을 사용하여 multislice turbo spin echo sequence(TR/TE= 5000/20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200 ms, in-plane resolution: 200×200 mm², slice thickness: 500 mm)에서 수행하였다. Matlab program를 사용하여, Levenberg-Margardt 법에 맞추어 이미지로부터 T2 값을 계산하였다. T1-1 및 T2-1 대 조영제 농도의 그래프로부터, r₁ 및 r₂를 계산하였다. T1 맵(60-80 픽셀) 및 T2 맵(200-300 픽셀)에서 각 ROI의 신호 강도는 각 농도에서 측정되었고, 각각 r₁과 r₂ 계산에 사용하였다. ICP-AES로 측정된 철 원자의 몰 농도에 기반하여 relaxivity를 유도하였다. 상기 결과를 도 11에 나타내었다.

또한, 대조군으로 Gd-DTPA, Fe₂O₃, MnO, Hollow Mn₃O₄를 동일한 방법으로 특정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

조영제	직경(nm)	r₁(mM^-1S^-1)	r₂(mM^-1S^-1)	r₂/r₁	B₀(T)
Gd-DTPA		4.5	5	1.1	3
Fe₂O₃	2.2	4.7	17.5	3.6	3
MnO	7	0.3	1.7	4.7	3
Hollow Mn₃O₄	20	1.4	7.7	5.5	3
실시예 2-1	95	17	18	1.1	3
실시예 2-3	30-200	10	16	1.6	3

실험예 4: In vivo MRI 실험

In vivo MRI 실험은, 7T/20 micro-MRI System(Bruker-Biospin, Fallanden, Switzerland, 100 μsec rise-time에서 400 mT/m까지 공급할 수 있는 20 cm gradient set)으로 수행하였다. 새장형 코일(birdcage coil; 72 mm i.d.; Bruker-Biospin, Fallanden, Switzerland)을 여기(excitation)를 위하여 사용하였고, actively decoupled phased array coil을 신호의 수신을 위하여 사용하였다.

MRI 동안, 동물들을 2% 이소플루란(isoflurane)로 호흡시켜 마취하였다. 직장(rectal) 온도는 주의깊게 관찰하여 36±1℃로 유지하였다. 실시예 3, 5-1 및 5-2에서 제조된 멜라닌 나노입자를 쥐 몸무게 1 kg 당 20 mg을 쥐의 꼬리 정맥을 통하여 주입하였다. 이때 주입된 Fe의 양은, ICP-AES로 측정하여 쥐 몸무게 1 kg당 144 ㎍이었다. 주입된 멜라닌 나노입자가 쥐의 몸에서 확산되는 시간을 조사하기 위하여, MRI는 주입전, 주입후 1, 3, 6, 24, 48시간에서 촬영하였다.

FSE(fast spin-echo) T1 강조 MRI 시퀀스 및 FSE(fast spin-echo) T2 강조 MRI 시퀀스로 고해상의 멜라닌 나노입자 조영이 각 쥐의 복부로부터 얻었으며, 모든 이미지는 Paravasion software(Bruker-Biospin, Fallanden, Switzerland)로 분석하였다. 시퀀스 파라미터는 다음과 같았다:

- FSE(fast spin-echo) T1 강조 MRI 시퀀스

repetition time(TR)/echo time(TE)= 300/7.9 ms, 실험 횟수(number of experiment; NEX)= 4, echo train length= 2, 100×100 μm² in plane resolution, a slice thickness: 800μm, 10 slices)

- FSE(fast spin-echo) T2 강조 MRI 시퀀스

repetition time(TR)/echo time(TE)= 3000/60 ms, 실험 횟수(number of experiment; NEX)= 4, echo train length= 4, 100×100 μm² in plane resolution, a slice thickness: 800 μm, 10 slices)

상기 결과를 도 12에 나타내었다. PEGylated Fe³ ⁺-MelNPs 투여 후, 각각 1시간에서 비장(spleen)과 간(liver)에서 T1 강조 MRI 이미지가 나타났으며, 이는 RES(reticuloendotherial system)의 세포에 PEGylated Fe³ ⁺-MelNPs가 선택적으로 축적되는 것에 기인한다.

6시간 후, 간에서는 투여 전과 유사한 영상을 조영을 나타내었으나, 비장에서는 여전히 T1 강조 MRI 이미지가 나타났다. 24시간 후에는 모든 기관에서 일반 조영으로 회복되었고, 이는 PEGylated Fe³ ⁺-MelNPs가 분해 및/또는 제거되었음을 나타낸다. 이는 또한 다른 무기 나노입자와 달리, 멜라닌류 물질은 다른 생체물질과 유사하게 생분해성을 나타냄을 의미한다.

상기와 유사하나, 간암이식 쥐를 대상으로 하여 동일한 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 13a에 나타내었다.

PEGylated Fe³ ⁺-MelNPs 투여 후 1시간에서 일반 간 조직에 T1 강조 MRI 영상이 나타났으며, 암 조직에서는 강조 신호가 관찰되지 않았다(도 13a). 이러한 일반 간에서의 선택적 축적은 종양의 가음성 조영(pseudonegative contrast)으로 인한 것이며, 이는 또한 암 세포와 일반 간 세포 사이의 RES 셀의 활성 또는 양의 차이로 설명될 수 있다.

상기와 유사하나, 간암이식 쥐를 대상으로 하되, 항체가 결합된 PEGylated Fe³⁺-MelNPs를 사용하여 동일한 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 13b 및 도 13c에 나타내었다.

간암에서 선택적으로 타겟팅하기 위한 Cetuximab를 결합시킨 PEGylated Fe³⁺-MelNPs를 투여한 후 6시간까지, 일반 간에서와 동일한 영상이 관찰되었고, 24시간 후에는 일반 간은 투여 전과 유사한 조영으로 회복되었으나 종양 부위는 뚜렷하게 가시화되었다(도 13c).

이러한 조직-특이적 타겟팅 결과는, IgG가 결합된 PEGylated Fe³ ⁺-MelNPs가 나타내는 종양 부위의 가음성 강조만을 나타내는 결과(도 13b)와도 비교될 수 있다.

Claims

멜라닌 나노입자의 표면에 상자기성 금속 이온이 배위결합되어 있고, 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 상기 멜라닌 나노입자 표면에 화학적으로 결합되어 있는 멜라닌 나노입자 복합체를 포함하는, 핵자기 공명 영상 조영제.
제1항에 있어서, 상기 멜라닌 나노입자는 오징어 먹물에서 추출하여 30 nm 내지 600 nm 크기의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 핵자기 공명 영상 조영제.
제1항에 있어서, 상기 멜라닌 나노입자는 dopamine, DOPA 또는 cysteine의 멜라닌 전구체로부터 합성된 30 nm 내지 600 nm 크기의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 핵자기 공명 영상 조영제.
제1항에 있어서, 상기 상자기성 금속이온은 가돌리늄(Gd), 철(Fe), 망간(Mn), 니켈(Ni), 구리(Cu), 에르븀(Er), 유로퓸(Eu), 홀뮴(Ho) 및 크롬(Cr)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 금속의 이온인 것을 특징으로 하는 핵자기 공명 영상 조영제.
제1항에 있어서, 상기 PEG는 아민기 또는 티올기로 상기 멜라닌 나노입자 표면에 화학적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 핵자기 공명 영상 조영제.
제1항에 있어서, 상기 PEG의 분자량은 1 KDa 내지 40 KDa인 것을 특징으로 하는 핵자기 공명 영상 조영제.
제1항에 있어서, 상기 멜라닌 나노입자 표면에 3-머캅토프로피온산이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는 핵자기 공명 영상 조영제.
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하기 단계를 포함하는 제1항의 핵자기 공명 영상 조영제의 제조방법:
1) 멜라닌 나노입자를 포함하는 용액에 상자기성 금속 이온을 포함하는 용액을 첨가하여 상자기성 금속 이온을 멜라닌 나노입자의 멜라닌에 배위결합하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 용액에 아민기 또는 티올기를 갖는 PEG를 첨가하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 용액으로부터 멜라닌 나노 입자 복합체를 회수하는 단계.
제10항에 있어서, 상기 단계 2에서 3-머캅토프로피온산을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 핵자기 공명 영상 조영제의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 제조된 멜라닌 나노 입자를 항체와 결합하는 단계를 추가로 포함하는 핵자기 공명 영상 조영제의 제조방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 의하여 제조된 핵자기 공명 영상 조영제.