TW201221138A - Stable formulations of Neisseria meningitidis rLP2086 antigens - Google Patents

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201221138 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於如本文所描述之腦膜炎奈瑟菌（ medagzUb ) rLP2086亞族B抗原的致免疫組成物之調製 劑類。本發明亦關於保存腦膜炎奈瑟菌rLP2〇86抗原之構 形的方法及用於測定腦膜炎奈瑟菌rLP2086抗原之效力的 方法。 【先前技術】 rLP2086爲一種重組28kDa脂蛋白，其誘導對抗多種腦 膜炎奈瑟菌菌株之交叉反應性細菌抗體。根據推導之胺基 酸序列同源性可鑑定出兩種不同之rLP2086亞族：A及B。 此兩種亞族可用於MnB-rLP2086疫苗樣本之調製劑，該等 疫苗樣本係在1 OmM組胺酸（pH値6.0 ) 、150mM氯化鈉及 0.5毫克/毫升鋁中分別包含20、60、120及200微克/毫升之 各亞族，及不同含量之聚山梨酸酯80(PS-80)。聚山梨 酸酯80 (亦稱爲吐溫80 ( TWEEN 80))爲一種自山梨醇 衍生之非離子性表面活性劑及乳化劑且經常作爲藥學調製 劑之乳化劑、增溶劑和安定劑。咸信，MnB rLP2086致免 疫組成物中存有聚山梨酸酯80可防止在調製、加工、過濾 、充塡及運送期間發生聚集、減少過濾膜吸收及減少管道 吸收。 【發明內容】 -5- 201221138 於一些體系中，本發明提供安定之致免疫組成物，其 中係將LP20 86亞族B多肽之效力維持至少約1-12個月、約 6-18個月、約12-24個月、約24-36個月或約36-48個月。於 —些體系中，該致免疫組成物進一步包含LP2086亞族A多 肽。 於一些體系中，該致免疫組成物進一步包含清淨劑。 於一些體系中，該清淨劑對蛋白質之莫耳比爲約〇·5:1至約 10:1;約1:1至約5: 1;或約1.4:1至約4.2:1。於一些體系 中，該清淨劑對蛋白質之莫耳比爲約2·8:1。於—些體系中 ，該清淨劑之量足以減少容器（諸如注射器或小瓶）中與 矽結合之多肽。於一些體系中’該清淨劑爲非離子性清淨 劑，諸如聚山梨酸酯清淨劑。於一些體系中，該清淨劑爲 聚山梨酸酯-80。 於一些體系中，該致免疫組成物進一步包含多價陽離 子。於一些體系中，該多價陽離子爲鈣或鋁。於一些體系 中，該致免疫組成物包含磷酸鈣。於一些體系中，該致免 疫組成物包含爲磷酸鋁、氫氧化鋁、硫酸鋁或明礬形式之 鋁。於一些體系中，該鋁之濃度爲約0.1毫克/毫升至1.0毫 克/毫升。於一些體系中，該銘之濃度爲約〇·5毫克/毫升。 於一些體系中，該致免疫組成物進一步包含組胺酸》 於一些體系中，該組胺酸之濃度爲約2mM至約20mM或約 5mM至約15mM。於一些體系中，該組胺酸之濃度爲約 10mM。於一些體系中，該組胺酸之pH値爲約5.0至約8.0或 約5.8至約6.0。於一些體系中，該組胺酸之濃度爲10mM， -6- 201221138 pH 6·〇 〇 於一些體系中，該致免疫組成物進一步包含琥珀酸鹽 。於一些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲約2mM至約10mM 或約3mM至約7mM。於一些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲 約5 mM。於一些體系中，該琥珀酸鹽之PH値爲約5.0至約 8.0或約5.8至約6.0。於一些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲 約 5mM，pH値 6.0。 於一些體系中，該致免疫組成物係經凍乾。於一些體 系中’該經凍乾之組成物係再懸浮於包含鋁之緩衝劑中。 於一些體系中，該鋁係以磷酸鋁、氫氧化鋁、硫酸鋁或明 礬之形式存在。 於一些體系中，該致免疫組成物包含莫耳比莫耳比約 2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、0.5毫克/毫升爲AlP〇4形 式之銘、10mM組胺酸pH 6.0及150mM氯化鈉。於一些體系 中’該致免疫組成物實質上係由下列所組成：200微克/毫 升LP2086 (fHBP)亞族B多肽、莫耳比約2·8:1之聚山梨酸 醋80:蛋白質、〇.5毫克/毫升爲α1Ρ04形式之鋁、i〇mM組 胺酸pH 6.0及150mM氯化鈉。於一些體系中，該致免疫組 成物實質上係由下列所組成：200微克/毫升rLP2086 ( fHBP)亞族A多肽、200微克/毫升LP2086 ( fHBP)亞族B 多肽、莫耳比約2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、〇.5毫克/ 毫升爲AlP〇4形式之銘、i〇mM組胺酸pH 6.0及i5〇mM氯化 鈉0 於一些體系中’該致免疫組成物包含莫耳比約2.8:1之 201221138 聚山梨酸酯80:蛋白質、〇·5毫克/毫升爲AlP〇4形式之鋁、 5mM琥珀酸鹽pH 6.0及150mM氯化鈉。於一些體系中，該 致免疫組成物實質上係由下列所組成：200微克/毫升 LP2086 ( fHBP )亞族B多肽、莫耳比約2.8:1之聚山梨酸酯 8〇:蛋白質、0.5毫克/毫升爲AlP〇4形式之鋁、5mM琥珀酸 鹽pH 6.0及1 5 OmM氯化鈉。於一些體系中，該致免疫組成 物實質上係由下列所組成：200微克/毫升rLP2086 ( fHBP )亞族A多肽、200微克/毫升LP2 086 (fHBP)亞族B多肽 、莫耳比約2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、0.5毫克/毫升 爲AlP〇4形式之鋁、5mM琥珀酸鹽PH 6.0及150mM氯化鈉 〇 於另一觀點，本發明提供用於安定致免疫組成物中之 LP2086亞族B多肽之效力的方法，該方法係將LP2086亞族 B多肽儲存在其中該清淨劑對蛋白質之莫耳比爲約0.5:1至 約10:1 ;約1:1至約5:1 ;或約1.4:1至約4.2:1之緩衝劑中。 於一些體系中，該清淨劑對蛋白質之莫耳比爲約2.8:1。於 一些體系中，該清淨劑之量足以減少容器（諸如注射器或 小瓶）中與矽結合之多肽。於一些體系中，該清淨劑爲非 離子性清淨劑，諸如聚山梨酸酯清淨劑。於一些體系中， 該清淨劑爲聚山梨酸酯- 80。 於一些體系中，該緩衝劑進一步包含多價陽離子。於 一些體系中，該多價陽離子爲鈣或鋁。於一些體系中，該 緩衝劑包含磷酸鈣。於一些體系中，該緩衝劑包含爲磷酸 鋁、氫氧化鋁、硫酸鋁或明礬形式之鋁。於一些體系中， -8 - 〆 201221138 該鋁之濃度爲約0.1毫克/毫升至1.0毫克/毫升。於一些體 系中，該鋁之濃度爲約0.5毫克/毫升。 於一些體系中，該緩衝劑進一步包含組胺酸。於一些 體系中’該組胺酸之濃度爲約2mM至約20mM或約5mM至 約1 5 mM。於一些體系中，該組胺酸之濃度爲約丨0Π1Μ。於 一些體系中’該組胺酸之pH値爲約5.0至約8.0或約5.8至約 6.0。於一些體系中，該組胺酸之濃度爲l〇mM，pH 6.0。 於一些體系中，該緩衝劑進一步包含琥珀酸鹽。於一 些體系中’該琥珀酸鹽之濃度爲約2mM至約10mM或約 3mM至約7mM。於一些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲約 5mM。於一些體系中，該琥珀酸鹽之PH値爲約5.0至約8.0 或約5.8至約6.0。於一些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲約 10mM，pH値 6.0。 於一些體系中，該致免疫組成物係經凍乾。於一些體 系中，該經凍乾之組成物係再懸浮於包含鋁之緩衝劑中。 於一些體系中，該鋁係以磷酸鋁、氫氧化鋁、硫酸鋁或明 _之形式存在。 於一些體系中，該緩衝劑實質上係由下列所組成：莫 耳比約2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、0.5毫克/毫升爲 A1P〇4形式之鋁、10mM組胺酸pH 6.0及150mM氯化鈉。於 一些體系中，該致免疫組成物實質上係由下列所組成： 20〇微克/毫升1^2086 (阳6?)亞族8多肽、莫耳比約2.8:1 之聚山梨酸酯80:蛋白質、0.5毫克/毫升爲A1P04形式之 鋁、10mM組胺酸pH6.0及150mM氯化鈉。 201221138 於一些體系中，該緩衝劑實質上係由下列群體所組成 :莫耳比約2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、0.5毫克/毫升 爲AlP〇4形式之鋁、5mM琥珀酸鹽pH 6.0及150mM氯化鈉 。於一些體系中，該致免疫組成物實質上係由下列所組成 :200微克/毫升LP2086 (fHBP)亞族B多肽、莫耳比約 2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、0.5毫克/毫升爲A1P04形 式之鋁、5mM琥拍.酸鹽pH 6.0及150mM氯化鈉。 於另一觀點中，本發明提供用於安定致免疫組成物中 之LP2086亞族A多肽及LP2086亞族B多肽之效力的方法， 該方法係將LP2086亞族A多肽及LP2086亞族B多肽儲存在 其中具有約0.1毫克/毫升至約10毫克/毫升之鋁且清淨劑對 蛋白質之莫耳比爲約0.5:1至約10:1之緩衝劑中。於一些體 系中，該清淨劑對蛋白質之莫耳比爲約1 : 1至約5 : 1 ;或約 1_4:1至約4.2:1。於一些體系中，該清淨劑對蛋白質之莫 耳比爲約2 · 8 ·· 1。於一些體系中，該清淨劑之量足以減少容 器（諸如注射器或小瓶）中與矽結合之多肽。於一些體系 中，該清淨劑爲非離子性清淨劑，諸如聚山梨酸酯清淨劑 。於一些體系中，該清淨劑爲聚山梨酸酯-80。 於一些體系中，該鋁係以磷酸鋁、氫氧化鋁、硫酸鋁 或明礬之形式存在。於一些體系中，該鋁之濃度爲約0.5 毫克/毫升。 於一些體系中’該緩衝劑進一步包含組胺酸。於一些 體系中，該組胺酸之濃度爲約2mM至約20mM或約5mM至 約15mM。於一些體系中，該組胺酸之濃度爲約10mM。於 -10- 201221138 一些體系中，該組胺酸之pH値爲約5 · 0至約8 · 0或約5.8至約 6_0。於一些體系中，該組胺酸之濃度爲l〇mM，pH 6.0。 於一些體系中，該緩衝劑進一步包含琥珀酸鹽。於一 些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲約2mM至約1 OmM或約 3mM至約7mM。於一些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲約 5mM。於一些體系中，該琥珀酸鹽之pH値爲約5.0至約8.0 或約5.8至約6.0。於一些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲約 10mM，pH値 6.0。 於一些體系中，該致免疫組成物係經凍乾。於一些體 系中，該經凍乾之組成物係再懸浮於包含鋁之緩衝劑中。 於一些體系中，該鋁係以磷酸鋁、氫氧化鋁、硫酸鋁或明 礬之形式存在》 於一些體系中，該緩衝劑實質上係由下列群體所組成 :莫耳比約2.8:1之聚山梨酸酯80.:蛋白質、0.5毫克/毫升 爲A1P04形式之鋁、10mM組胺酸pH 6.0及150mM氯化鈉。 於一些體系中，該致免疫組成物實質上係由下列群體所組 成：200微克/毫升LP2086 (fHBP)亞族A多肽、200微克/ 毫升1^2086 (阳8?)亞族8多肽、莫耳比約2.8:1之聚山梨 酸酯80:蛋白質、0.5毫克/毫升爲A1P04形式之鋁、10mM 組胺酸pH 6.0及1 5 OmM氯化鈉。 於一些體系中，該緩衝劑實質上係由下列群體所組成 :莫耳比約2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、0.5毫克/毫升 爲A1P04形式之銘、5mM號班酸鹽pH 6.0及150mM氯化鈉 。於一些體系中，該致免疫組成物實質上係由下列群體所 -11 - 201221138 組成：200微克/毫升LP2086 (fHBP)亞族A多肽、200微 克/毫升LP2086 (fHBP)亞族B多肽、莫耳比約2.8:1之聚 山梨酸酯80:蛋白質、0.5毫克/毫升爲A1P04形式之鋁、 5mM號拍酸鹽pH 6.0及150mM氯化鈉。 於另一觀點中，本發明提供用於測定rLP2086 ( fHBP )亞族A多肽及/或rLP2086 (fHBP)亞族B多肽之效力的 方法，其包含下列步驟：（a )將可辨識各亞族蛋白質上 構形抗原決定部位之第一及第二功能性單株抗體與致免疫 組成物結合，及（b)定量與該多肽結合之抗體。於一些 體系中，該定量係藉由電化學發光進行。於一些體系中係 定量該顯現出可被兩種抗體辨識之抗原決定部位的多肽。 於一些體系中，該第一抗體係與一種標籤（諸如生物素） 共軛結合。於一些體系中，該第一抗體係藉由可與該經共 軛結合之標籤結合的化合物（諸如鏈黴抗生物素蛋白小珠 或鏈黴抗生物素蛋白管柱）分離。於一些體系中，該第二 抗體係與定量標籤結合。於一些體系中係將該致免疫組成 物之效力與參考物質之效力相比較。 [發明之詳細說明] 除非另外定義，此處所使用之所有技術及科學術語具 有與本發明所屬之技藝領域中之一般技術人士所通常理解 者相同的含義。雖然可使用類似或等同於此處所描述者之 方法及材料來操作或測試本發明，下文中描述合適之方法 及材料。該材料、方法及實例僅用於說明，而不欲用於限 -12- 201221138 制。此處提及之所有出版物、專利及其他文件之全部內容 納爲參考資料。 本專利說明書全文中，“包含（comprise) ” 一字或 其變化，諸如“包含（comprises) ”或“包含（comprising )”將被理解爲意味著包括指定之整數或整數群組，但不 排除任何其他整數或整數群組。 定義 除非文意另外清楚規定，此處所使用之單數型“一（ a ) ” “一（ an ) ”及“該（the ) ”包括複數引用。因此 ’例如，“該方法（the method ) ”之引用包括一或多種 此處所描述之類型的方法及/或步驟及/或本技藝之一般技 術人士在閱讀本揭露內容後將清楚明白者，等。 除非文意另外清楚規定，此處所使用之複數型包括數 單引用。因此，例如，“該方法（the methods ) ”之引用 包括一或多種此處所描述之類型的方法及/或步驟及/或本 技藝之一般技術人士在閱讀此揭露內容後將清楚明白者， 等。 此處所使用之“約”意指在一個數値（諸如規定的濃 度範圍、時限、分子量、溫度或pH値）之統計學上有意義 的範圍內。這類範圍可在指定數値或範圍之一個量級內， 通常係在2 0 %以內，較常在1 0 %以內，甚至更常在給定値 或範圍之5 %內。包含在“約” 一詞內之可容許的變動將取 決於所硏究之特定系統，且可由本技藝之一般技術人士輕 -13- 201221138 易地察知。每當本申請案中列舉一個範圍時，在此範圍爲 之每一個整數亦被考慮爲本發明之體系。 “佐劑”一詞係指可增強抗原之免疫反應的化合物或 混合物（如本發明將進一步描述及例證者）。可用於本發 明之疫苗中的佐劑之非限制性實例包括RIBI佐劑系統（ Ribi公司，蒙大拿卅漢密爾頓）、明礬、礦物凝膠（諸如 氫氧化鋁凝膠、水包油乳劑、油包水乳劑，諸如，例如弗 氏（Freund )完全及不完全佐劑、嵌段共聚物（CytRx， 喬治亞州亞特蘭大）、QS-2 1 (劍橋生物技術公司，麻薩 諸塞州劍橋）、S A F - M ( C h i r ο η公司，加利福尼亞州 Emeryville ) 、A Μ Ρ ΗIG ΕΝ ® 佐劑、皂素、Q u i 1 A 或其他皂 素部分、單磷醯脂質A及Avridine脂胺佐劑。 “鋁對蛋白質之結合作用”一詞係指組成物中與鋁結 合之蛋白質分子的百分比。鋁對蛋白質之結合作用可使用 本文所揭露或本技藝中已知之方法測定。 此處所使用之“有效之致免疫量”一詞係指包含可在 脊椎動物宿主中有效地引出免疫反應之多肽的量或包含該 種多肽之組成物的量。例如，本發明之rLP20 86蛋白質的 有效致免疫量爲可在脊椎動物宿主中有效地引出免疫反應 之量。該特定之“有效的致免疫性劑量或量”將取決於該 宿主之年齡、重量和醫療條狀況，以及投藥方法》本技藝 之一般技術人士可很容易地測定合適之劑量。 此處所使用之“莫耳比” 一詞係指組成物中兩種不同 成分之莫耳數的比例。於一些體系中，該莫耳比爲清淨劑

-14- 201221138 之莫 耳比 根據 耳比 例如 具有 莫耳 蛋白 式列 酸酯 10:1 “聚 或聚 莫耳 將能 淨劑 一般 比低 成物 。於 的蛋 耳數對蛋白質之旲耳數的比例。於一些體系中，該莫 爲聚山梨酸酯80之莫耳數對蛋白質之莫耳數的比例。 蛋白質及聚山梨酸酯80之濃度，使用下列公式計算莫 莫耳比= χ2 1 6 %PS80 升蛋白質 :包含0.01%聚山梨酸酯80及200微克蛋白質之組成物 1〇·8:1[(〇.〇ι/〇.2)χ216]之清淨劑對蛋白質的莫耳比。3 聚山梨酸酯80對2莫耳蛋白質之比例將以3:2之PS8〇對 質的莫耳比表示。再者，若莫耳比係以單一數字之形 出’則其係指該單一數字對1之比例。例如：聚山梨 80-對-蛋白質比爲0.5、2及10係分別指0.5:1、2:1及 之比例。此處所使用之“清淨劑對蛋白質”莫耳比及 山梨酸酯80對蛋白質”莫耳比等詞一般係指清淨劑（ 山梨酸酯80)對蛋白質抗原（尤其是P2086抗原）之 比。根據本文所揭露之教示內容，熟習本技藝之人士 夠決定如何計算其他清淨劑之莫耳比以及具有其他清 之調製劑的最佳莫耳比。此處所使用之“低”莫耳比 係指該致免疫組成物中之清淨劑對蛋白質抗原的莫耳 於“高”莫耳比。“高”莫耳比一般係指該致免疫組 中之清淨劑對蛋白質抗原的莫耳比高於“低”莫耳比 一些體系中，清淨劑對蛋白質之“高莫耳比”清淨劑 白質係指大於10:1之莫耳比。於一些體系中，清淨劑 對蛋白質之“低莫耳比”係指莫耳比爲0.5:1至10:1。 此處所使用之“ORF2086 ” 一詞係指來自奈瑟菌種細 201221138 菌之開放閱讀框構2086。奈瑟菌ORF2086、由此編碼的蛋 白質、這些蛋白質之片段以及包含那些蛋白質之致免疫組 成物爲本技藝所已知且描述於，例如：美國專利申請刊物 編號US 20060257413及US 20090202593中（其全部內容納 爲此處之參考資料）。“ P2086 ” 一詞一般係指由 ORF2086編碼之蛋白質。本發明之P208 6蛋白質可爲脂化 的或非脂化的。“LP2086”及“P2086 ”通常分別指2086 蛋白質之脂化或非脂化形式。本發明之P2086蛋白質可爲 重組體。“ rLP2086 ”及“rP2086 ”通常分別指重組體 20 86蛋白質之脂化及非脂化形式。 此處所使用之“藥學上可接受之載體”欲包括與投服 之人類或其他脊椎動物宿主相容之任何及所有溶劑、分散 介質、塗層及抗細菌和抗真菌劑、等張劑及吸收延緩劑， 等。通常，藥學上可接受的載體爲由聯邦政府、州政府之 監管機構或其他監管機構核准或在美國藥典或其他普遍公 認之藥典中所列之用於動物（包括人類及非人類哺乳動物 )的載體。“載體”一詞係指與醫藥組成物一起投服之稀 釋劑、佐劑、賦形劑或載劑。這類藥學載體可爲無菌液體 ’諸如水及油類，包括石油、動物、植物或合成來源之油 類。水、生理鹽水溶液及右旋糖水溶液和甘油溶液可以作 爲液體載體，尤其是用於注射液。合適之藥學賦形劑包括 澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽糖、米、麵粉、 白堊粉、矽膠、硬脂酸鈉、一硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯 化鈉、乾燥脫脂奶、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇， (S： -16- 201221138 等。若需要時，該組成物亦可含有少量之濕潤劑、膨脹劑 '乳化劑或pH緩衝劑。這些組成物可爲溶液、懸浮液、乳 劑、持續釋出之調製劑，等之形式。合適之藥學載體的實 例描述於 E.W.Martin 之 “Remington's Pharmaceutical Sciences”中。調製劑應適應該投服模式。熟習本技藝之 人士將清楚明白適當之載體且大部分將取決於投藥途徑。 “效力”一詞係指抗原提升致免疫反應之能力。於一 些體系中，效力係藉由抗原決定部位結合抗體之能力測量 。由於抗原或抗原決定部位的完整性喪失或抗原或抗原決 定部位之構形變化，效力可能經時喪失或降低。效力可能 因包括，但不限於下列因素而喪失或降低：光、溫度、冷 凍/解凍循環、攪動及pH値。效力可藉由此處所揭露之方 法及本技藝已知之分析測量。這類效力測定分析包括，但 不限於動物疫苗接種模型、血清殺菌分析（SBA )、流式 細胞儀及活體外效力分析。用於測定效^之較佳方法爲 SB A及活體外效力分析。用於測定效力之更佳方法爲SB A 。於一些體系中，可以使用至少一種針對至少一種涉及免 疫反應之抗原決定部位的單株抗體來測定效力。於一些體 系中係將測試樣本之效力與參考標準的效力相比較。於一 些體系中，該參考標準爲在T〇之測試樣本。於一些體系中 ，該參考標準爲不含清淨劑之致免疫組成物。於一些體系 中，該參考標準爲具有大於10:1之清淨劑對蛋白質莫耳比 之致免疫組成物。 “保護性”免疫反應係指致免疫組成物引發免疫反應 -17- 201221138 (無論是由體液或細胞介導者）之能力，該免疫反應旨在 保護該受試者不受感染。所提供之保護不必是絕對的，即 ，感染不需要全然受到保護或根除，只要與受試者之對照 組（例如：未投服該疫苗或致免疫組成物之受感染的動物 )相比較時具有統計學上顯著之改善。保護可能僅限於減 輕感染症狀之嚴重程度或發病的速度。一般而言，“保護 性免疫反應”將包括在至少5 0%之受試者中誘導特異於特 定抗原之抗體水準增加，包括某一水準之對抗各抗原之可 測量的功能性抗體反應。在特定情況下，“保護性免疫反 應”可能包括在至少50%之受試者中誘導特異於特定抗原 之抗體水準增加兩倍或增加四倍，包括某一水準之對抗各 抗原之可測量的功能性抗體反應。於某些體系中，調理素 化抗體（opsonizing antibody )與保護性免疫反應相關。 因此，保護性免疫反應可藉由測量調理吞噬分析（例如描 述於下文中者）中減少之細菌計數百分比來檢測。於一些 體系中，與無致免疫組成物存在時之細菌計數相比較，細 菌計數減少至少 1 〇 %、2 5 %、5 0 %、6 5 %、7 5 %、8 0 %、8 5 % 、9 0 %、9 5 %或更多。 “蛋白質"、“多肽”及“肽”等詞係指胺基酸殘基 之聚合物且不限於該產物之最短長度。因此，肽類、寡肽 類、二聚體、多聚體，等都包含在該定義中。全長蛋白質 及其片段均包含在該定義中。該名詞亦包括對天然序列之 修改，諸如刪除、加入及置換（通常在性質上爲保存性， 但其可爲非保存性），較佳地，從而使該蛋白質保持在該 -18- 201221138 投服該蛋白質之動物體內引出免疫反應的能力。亦包括表 達後修改，諸如糖基化、乙醯化、脂化、磷酸化，等。 此處所使用之“重組體” 一詞係指藉由基因工程方法 產製之表達所欲基因的任何蛋白質、多肽或細胞。所用之 與蛋白質或多肽相關的“重組體”一詞係指經由表達重組 體多核苷酸所產製之多肽。本發明之蛋白質可從天然來源 分離出或藉由基因工程方法製造。此處所使用之“重組體 ”進一步描述由於其來源或操作，而不與其本質上聯結之 全部或部分多核苷酸相聯結之核酸分子。所用之與宿主細 胞相關的“重組體”一詞係指包含重組多核苷酸之宿主細 胞。 “安定”及“安定性”等詞係指抗原保持致免疫性一 段時間的能力。安定性可在一段時間之效力中測得。“安 定”及“安定性”等詞進一步指該致免疫組成物之物理、 化學、構形安定性。蛋白質組成物之不安定性可能由下列 因素造成：該蛋白質分子之化學降解或聚集形成高階聚合 物、二聚體解離成單體、去糖基化、修改糖基化或降低該 包含在本發明中之蛋白質組成物之至少一種生物活性的任 何其他結構修改。安定性可藉由本技藝所熟知之方法評估 ，包括測量樣本之光散射、光之表觀衰減（吸光度或光密 度）、尺寸（例如藉由尺寸排阻色層分析法）、藉由差示 掃描量熱法（DSC )測量活體外或活體內之生物活性及/或 性能。其他用於評估安定性之方法爲本技藝所已知且亦可 根據本發明使用。 -19- 201221138 於一些體系中，與參考標準相比較’在本發明之安定 調製劑中之抗原可能保持至少5〇%、60%、70% ' 75%、 80%、8 5% ' 90% ' 9 5%、96%、97%、98%、990/〇或 1 00%效 力至少1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、9 個月' 12個月、18個月、24個月、30個月、36個月、42個 月、48個月、54個月或60個月。於一些體系中’與參考標 準相比較，在本發明之安定調製劑中之抗原可能保持至少 50%效力至少1年、2年、3年、4年或5年。“安定”及“安 定性”等詞亦指抗原保持抗原決定部位或免疫反應性一段 時間的能力。例如，與參考標準相比較，在本發明之安定 調製劑中之抗原可能保持至少50%、60%、70%、75%、 8 0% ' 85% ' 9 0%、95%、96%、97%、98%、9 9 % 或 1 0 0 % 之 其抗原決定部位或免疫反應性至少1個月、2個月、3個月 、4個月、5個月、6個月、9個月、12個月、18個月、24個 月、30個月、36個月、42個月、48個月' 54個月或60個月 。於一些體系中，測量之安定性係關於環境條件。環境條 件之非限制性實例包括光、溫度、冷凍/解凍循環、攪動 及pH値。熟習本技藝之人士將能夠使用此處所揭露或本技 藝已知之其他方法測定抗原決定部位或免疫反應性之存在 。見’例如：McNeil et al. Vaccine，27: 3417-3421 ( 2009 )。於一些體系中，抗原之安定性係從其調製之日期開始 測量。於一些體系中’抗原之安定性係從其儲存條件改變 之曰期開始測量。儲存條件之變化的非限制性實例包括從 冷凍到冷藏之改變、從冷凍到室溫之改變、從冷藏到室溫 -20- 201221138 之改變、從冷藏到冷凍之改變'從室溫到冷凍 室溫到冷藏之改變 '從亮到暗之改變或引入攪 安定劑一詞係指結合抗原並保持該抗 定部位或免疫反應性一段時間的化合物。安定 所已知。安定劑之實例包括多價陽離子，例如 “受試者”一詞係指哺乳動物、鳥類、魚 物或任何其他動物。"受試者” 一詞亦包括人 者” 一詞亦包括家庭寵物。家庭寵物之非限制 :狗、貓、豬、兔、大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠 雪貂、鳥、蛇、蜥蜴、魚、龜及青蛙。“受試 包括家畜。家畜之非限制性實例包括：羊駝、 駱駝、牛、鹿、豬、馬、美洲駝、騾、驢、綿 兔子、馴鹿、犛牛、雞、鵝及火雞。 可以互換使用之“疫苗”或“疫苗組成物 包含至少一種可在受試者中誘導免疫反應之致 的醫藥組成物。 槪述 本發明來自於新發現 rLP2086亞族B抗原 亞族A抗原則不）在二價疫苗調製劑中一段時 效力，因而是不妄定的。經由改變該二價調製 而測定出在二價疫苗調製劑中之清淨劑對蛋白 比可能造成rLP2086亞族B抗原特別不安定。降 單價調製劑中之清淨劑對蛋白質的莫耳比可片 之改變、從 勖。 原之抗原決 劑爲本技藝 :鈣或鋁。 類、爬行動 類。“受試 性實例包括 、天竺鼠、 者” 一詞亦 美洲野牛、 羊、山羊、 ”等詞係指 免疫組成物 (但 r L P 2 0 8 6 間後會失去 劑中之組分 質的高莫耳 低在二價和 t 加 rLP2086 -21 - 201221138 亞族B抗原之安定性（此點由其效力可經時保持來測得） ，但不影響rLP2086亞族A抗原之安定性。此結果令人驚訝 ，因爲脂蛋白通常係使用高清淨劑濃度來純化和儲存，以 防止其疏水性脂質部分聚合。因此，於一些體系中，本發 明提供包含rLP 2 08 6亞族B抗原且其清淨劑對蛋白質之莫耳 比低的致免疫組成物。於一些體系中，本發明提供保持致 免疫組成物中之rLP2086亞族B抗原之安定性的方法，其包 含將rLP2086亞族B抗原儲存在包含低清淨劑對蛋白質之莫 耳比的緩衝劑之步驟。 進一步之硏究發現低莫耳比調製劑造成該低莫耳比致 免疫組成物被攪動時rLP2086亞族A及B抗原聚集。然而， 低莫耳比組成物中之鋁濃度增加可防止rLP2086亞族A及B 抗原聚集，即使是攪動時。此外，rLP0 2 86亞族A抗原在無 鋁存在時對低清淨劑莫耳比的影響更敏感。因此，於一些 體系中，本發明提供包含rLP2086亞族A抗原、rLP2086亞 族B抗原、高濃度之鋁及低清淨劑對蛋白質莫耳比之致免 疫組成物。於一些體系中，本發明提供保持致免疫組成物 中之rLP2 086亞族A抗原及rLP2 086亞族B抗原之安定性的方 法，其包含將rLP2086亞族A抗原及rLP2086亞族B抗原儲存 在包含高濃度之鋁及低清淨劑對蛋白質莫耳比之緩衝劑中 的步驟。 致免疫組成物 包含由來自腦膜炎奈瑟菌ORF2086之核苷酸序列編碼 -22- 201221138 的蛋白質之致免疫組成物爲本技藝所已知。示範之致免疫 組成物包括美國專利申請案刊物編號US 20060257413及US 200902025 93 (其全部內容納爲此處之參考資料）中所描 述者。其中所描述之這類致免疫組成物包括顯現殺菌活性 ，被鑑定爲ORF2086蛋白質之蛋白質、其致免疫部分及/或 其生物同等物。該ORF2086蛋白質係指由奈瑟菌種之開放 閱讀框構2086編碼的蛋白質。 該蛋白質可能爲重組蛋白質或從天然奈瑟菌種分離出 之蛋白質。例如，奈瑟ORF208 6蛋白質可能從，諸如奈瑟 菌種之菌株（包括腦膜炎奈瑟菌（血清型A、B、C、D、 W-135、X、Y、Z&29E)、淋病奈瑟菌和乳醯胺奈瑟菌） 分離出，以及該蛋白質之致免疫性部分及/或生物同等物 〇 該ORF2086蛋白質包括2086亞族A蛋白質及亞族B蛋白 質、其致免疫性部分及/或其生物同等物。該ORF2086蛋白 質或其同等物，等可爲脂化或非脂化的。較佳地，該奈瑟 菌ORF2086蛋白質爲脂化的。 於一體系中，該致免疫組成物包含經分離之與由來自 奈瑟菌ORF2086之核苷酸序列編碼的蛋白質具有至少95% 之胺基酸序列同一性的蛋白質。 於一體系中，該致免疫組成物包含經分離之與由來自 奈瑟菌ORF208 6之核苷酸序列編碼的亞族A蛋白質具有至 少95%之胺基酸序列同一性的蛋白質。較佳地，該致免疫 組成物包含經分離之由來自奈瑟菌ORF 2086之核苷酸序列 -23- 201221138 編碼的亞族A蛋白質。 ’ 於另一體系中’該致免疫組成物包含經分離之與由來 自奈瑟菌ORF2 086之核苷酸序列編碼的亞族B蛋白質具有 至少9 5 %之胺基酸序列同一性的蛋白質。較佳地’該致免 疫組成物包含經分離之由來自奈瑟菌ORF2086之核苷酸序 列編碼的亞族B蛋白質。於一些體系中，該ORF2086亞族B 蛋白質爲B01變種。 於另一體系中，該致免疫組成物包含經分離之與由來 自奈瑟菌ORF 2086之核苷酸序列編碼的亞族A蛋白質具有 至少9 5 %之胺基酸序列同一性的蛋白質，及經分離之與由 來自奈瑟菌ORF2086之核苷酸序列編碼的亞族B蛋白質具 有至少95%之胺基酸序列同一性的蛋白質。較佳地’該致 免疫組成物包含經分離之由來自奈瑟菌〇RF20 86之核苷酸 序列編碼的亞族A蛋白質及經分離之由來自奈瑟菌 ORF2086之核苷酸序列編碼的亞族B蛋白質。 於一體系中，該致免疫組成物包含比例爲1:1之亞族A 蛋白質及亞族B蛋白質。 該致免疫組成物可能包含由來自奈瑟菌ORF20 86之核 苷酸序列、多核苷酸或其同等物編碼之蛋白質作爲該致免 疫組成物中唯一之活性免疫原。或者，該致免疫組成物可 能進一步包含活性免疫原，包括其他奈瑟菌種致免疫性多 肽或一或多種其他微生物病原（如：病毒、普里昂蛋白（ prion )、細菌或真菌，但不限於此）之免疫活性蛋白質或 莢膜多醣。該組成物可依選定之指示的需要包含一或多種 -24- 201221138 所需之蛋白質、片段或製藥化合物。 任何多抗原或多價致免疫組成物均在本發明之考量內 。例如，該致免疫組成物可包含以適合所需投服（如：黏 膜投遞）之形式存在的二或多種ORF 2086蛋白質之組合物 、ORF2086蛋白質與一或多種 Ρ〇Γ A蛋白質之組合物、 ORF20 86蛋白質與腦膜炎雙球菌血清群A、C、Y及W135多 醣及/或多醣共軛物之組合物、ORF2086蛋白質與腦膜炎雙 球菌及肺炎球菌組合之組合物、或前述任一項之組合。熟 習本技藝之人士將能輕易地調製這類多抗原或多價致免疫 組成物。 本發明亦考量多次免疫化攝生法，其中可將任何可用 於對抗病原體之組成物倂入本發明之組成物中或伴隨本發 明之組成物。例如，但不限於此，患者可投服本發明之致 免疫組成物及另一用於對人類乳頭瘤病毒（HPV)進行免 疫化之免疫組成物（諸如HPV疫苗GARDASIL®)以作爲多 次免疫化攝生法的一部分。熟習本技藝之人士將可輕易地 選出與本發明之致免疫組成物一起使用之致免疫組成物以 發展及實施多次免疫化攝生法。 ORF 2086多肽、片段及同等物可作爲共軛結合致免疫 組成物之一部分；其中一或多種蛋白質或多肽係與載體共 軛結合以產生具有對抗數種血清型及/或對抗數種疾病之 致免疫性質的組成物。另外，ORF2 086多肽之一可作爲用 於其他致免疫多肽之載體蛋白質。這類致免疫組成物之調 製劑爲熟習本技藝之人士所周知。 -25- 201221138 較佳地，本發明之致免疫組成物包含藥學上可接受之 載體。合適之藥學上可接受的載體及/或稀釋劑包括任何 及所有傳統溶劑、分散介質、塡料、固態載體、水溶液、 塗層、抗細菌及抗真菌劑、等張性及吸收延遲劑，等。合 適之藥學上可接受之載體包括，例如一或多種水、生理鹽 水、磷酸鹽緩衝之生理鹽水、右旋糖、甘油、乙醇，等以 及彼等之組合。 藥學上可接受之載體可進一步包括少量可增長抗體之 保質期或有效性之佐劑，諸如濕潤或乳化劑、防腐劑或緩 衝劑。該藥學上可接受之載體的製備方法和用途爲本技藝 所周知。除了與活性成分不相容之情況外，任何傳統介質 或作用劑均可考慮用於本發明之致免疫組成物中。 致免疫組成物可經由腸胃道外途徑投服，例如：經由 注射（皮下或肌肉內注射），以及口服或鼻內途徑。 Wolff et al. Biotechniques; 1 1 (4): 474-85， （1991)。及 Sedegah et al. PNAS Vol. 91，pp. 9866-9870, ( 1 994 )中描 述用於肌肉內免疫化之方法。其他投服模式使用例如，但 不限於口服調製劑、肺部調製劑、栓劑及透皮施用。例如 :口服調製劑包含這類通常使用之賦形劑，例如，但不限 於製藥級之甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖 維素、碳酸鎂，等。較佳地，該致免疫組成物係經由肌肉 內注射投服。 本發明之致免疫組成物可包含一或多種佐劑。示範之 佐劑包括，但不限於氫氧化鋁；磷酸鋁；STIMULONtm -26- 201221138

Q S -2 1 ( Aquila Biopharmaceuticals, Inc ·，Framingham，Mass );MPLTM (3-0-去醯基化之單磷醯脂質A; Corixa，蒙大 拿卅，漢彌爾頓）、529 (胺烷基葡糖胺磷酸酯化合物， C.orixa，蒙大拿卅，漢彌爾頓）、IL-12 (遺傳學硏究所， 麻薩諸塞州，劍橋）；GM-CSF ( Immunex公司，華盛頓州 西雅圖市），N·乙醯-胞壁醯-L-蘇胺醯-D-異麩醯胺（thr-MDP ) ; N-乙醯-正-胞壁醯-L-丙胺醯-D-異麩醯胺（CGP 1 1 637，稱爲nor-MDP) ; N-乙醯胞壁醯-L-丙胺醯-D-異麩 醯胺-L-丙胺酸-2- ( 1'-2’-二棕櫚醯-sn-甘油-3-羥基磷醯氧 基-乙胺）（CGP 19835A，稱爲MTP-PE);及霍亂毒素。 於某些較佳體系中，該佐劑爲QS-21。 其他示範之佐劑包括霍亂毒素之無毒性衍生物，包括 其A次單位及/或腦膜炎奈瑟菌多狀與霍亂毒素或其B次單 位（“ CTB ” ）之共軛物或經基因工程處理之融合物、霍 亂前原類毒素（procholeragenoid)、真菌多醣，包括 schizophyllan、胞壁醯二狀、胞壁醯二肽（“MDP” ）衍 生物、佛波醇酯、大腸桿菌熱不安定性毒素、嵌段聚合物 或皂素。 磷酸鋁已在第一階段之臨床試驗中作爲佐劑，濃度爲 0.125毫克/劑量，遠低於美國聯邦法規法典[610.15(a)]中 所具體指明之限値0 · 8 5毫克/劑暈。含鋁佐劑廣泛應用於人 類以在經由肌肉內或皮下投服時加強抗原之免疫反應。 於某些較佳體系中，本發明之蛋白質係用於口服致免 疫組成物中，該口服致免疫組成物中包含黏膜佐劑且用於 -27- 201221138 治療或預防人類宿主中之腦膜炎奈瑟菌感染。該黏膜佐劑 可爲霍亂毒素：然而，較佳地，除了霍亂毒素以外之可根 據本發明使用之黏膜佐劑包括霍亂全毒素之非毒性衍生物 (其中該A次單位係經誘變）、經化學改質之霍亂毒素或 經由修改霍亂毒素胺基酸序列所製造之相關蛋白質。在可 特定用於製備本發明之致免疫組成物的特殊霍亂毒素方面 可參見已發表之國際申請案WO 00/1 8434 (其全部內容納 爲本文之參考）中所揭露之變種霍亂全毒素E29H。這些可 加入本發明之多肽中或與其共軛結合。同樣的技術可應用 於具有黏膜佐劑或遞送性質之其他分子上，諸.如大腸桿菌 熱不安定性毒素（LT )。可使用其他具黏膜佐劑或遞送活 性之化合物，諸如膽汁；聚陽離子，諸如DEAE-右旋糖酐 及聚鳥胺酸；清淨劑，諸如十二烷基苯硫酸鈉；與脂質共 軛結合之物質；抗生素，諸如鏈黴素；維生素A;及其他 可改變黏膜表面之結構或功能完整性之化合物。其他黏膜 活性化合物包括微生物構造之衍生物，諸如MDP;吖啶及 西咪替丁。亦可使用如上所述之STIMULONtm QS-21、 MPL及 IL-1 2 » 本發明之致免疫組成物可以ISCOMS (免疫刺激複合 物）、含CTB之ISCOMS、脂質體之形式投遞或可封裝在 化合物（諸如丙烯酸酯或聚（DL -丙交酯-共-乙交酯）） 中以形成具有適合吸收之尺寸的微球。本發明之蛋白質亦 可被納入油性乳劑中。 投予患者之致免疫組成物的量（即劑量）可根據本技 -28- 201221138 藝之一般技術人員已知的標準技術，考慮諸如特定抗原、 佐劑（若存在時）、特定患者之年齡、性別、體重、物種 、病況及投藥途徑等因素測定。 例如：用於青春期人類患者之給藥量可包括至少〇. 1 微克、1微克、10微克或50微克之奈瑟菌ORF2086蛋白質 ，及最多80微克、100微克、150微克或200微克之奈瑟菌 ORF20 86蛋白質。可結合任何最低値及任何最高値來定義 合適之範圍。 活體外效力試驗 效力係經由使用對抗rLP2086參考物質中之構家特異 性單株抗體定量致免疫組成物中之亞族A和亞族B蛋白質中 之功能性抗原決定部位來測定。效力係經由定量測量可在 活體內引起免疫反應產生殺菌抗體之亞族A或亞族B rLP2 08 6蛋白質中之功能性抗原決定部位來測定。定量技 術係以選定之單株抗體（mAbs )用於效力分析。選擇用於 致免疫組成物中之各亞族rLP2 08 6蛋白質的二種構形及非 重疊功能性單株抗體。在兩種純化之單株抗體之間，該第 一抗體係與第一標籤共軛結合（其中該第一標籤係用來捕 捉rLP2086蛋白質分子）。於一些體系中，該第一標籤爲 生物素、麩胱甘肽-S轉移酶（GST) 、6xHis標籤或小珠（ 如：羧基化聚苯乙烯小珠或順磁性小珠）。於一些體系中 ，該第一標籤係使用鏈黴抗生物素蛋白小珠、鏈黴抗生物 素蛋白管柱、鎳小珠、鎳管柱、離心或磁場來捕捉。該第 -29- 201221138 二抗體係與第二標籤共軛結合，其中該第二籤係可定量。 於一些體系中，該第二個標籤爲生物素、辣根過氧化物酶 (HRP )、螢光團或放射線標記。於一些體系中，該第二 標籤係以與螢光團或HRP共軛結合之鏈黴抗生物素蛋白藉 由電化學發光、偵測螢光或偵測放射性進行偵測。在各致 免疫組成物中，僅有顯現出可被兩種單株抗體辨認之抗原 決定部位之蛋白質可被測得。該蛋白質中之任何一個或兩 個抗原決定部位中之變化將被反映出。相對於該參考物質 之效力來報告該樣本之效力。 於一些體系中，本發明包括用於測定2086蛋白質之效 力之方法。於一些體系中，該方法包括下列步驟：（1) 將第一單株抗體及第二單株抗體與包含2086蛋白質之致免 疫組成物一起培育，其中該第一單株抗體係與用於捕捉該 單株抗體之第一標籤共軛結合，該第二單株抗體係與可偵 測之第二標籤共軛結合，其中該第一和第二單株抗體係針 對20 86參考蛋白質上不同構形抗原決定部位；（2 )使用 該第一標籤捕捉該與第一單株抗體結合之2086蛋白質；及 (3 )使用該第二標籤偵測並定量該經捕捉之與第二單株 抗體結合之2086蛋白質的量。於一些體系中，該2086蛋白 質爲亞族A蛋白質。於—些體系中，該2086蛋白質爲亞族B 蛋白質。於一些體系中，該2086蛋白質爲經脂化的。於一 些體系中’該2 086蛋白質爲爲未經脂化的。於一些體系中 ’該20 86蛋白質爲重組體。於一些體系中，該第—標籤爲 生物素、6xHis標籤或小珠（如：羧基化之聚苯乙烯小珠

-30- 201221138 或順磁性小珠）。於一些體系中’該第一標籤係以鏈黴抗 生物素蛋白小珠、鏈黴抗生物素蛋白管柱、麩胱甘肽小珠 、麩胱甘肽管柱、鎳小珠、鎳管柱、離心或磁場捕捉。於 一些體系中，該第二標籤爲生物素、HRP、螢光團或放射 線標記。 於一些體系中’該第二標籤係以與螢光團或HRP共軛 結合之鏈黴抗生物素蛋白藉由電化學發光、偵測螢光或偵 測放射性進行偵測。於一些體系中，該致免疫組成物包含 數種2086蛋白質變種。 rLP2 086亞族B抗原效力之安定性 於一些體系中’本發明提供用於使rLP2086亞族B抗原 可經時安定的致免疫組成物，其包含具低清淨劑對蛋白質 莫耳比之緩衝劑。 於一些體系中’該致免疫組成物中之清淨劑對蛋白質 的莫耳比爲約0.5至約10。於一些體系中，該致免疫組成 物中之清淨劑對蛋白質的莫耳比爲約1至約5。於一些體系 中’該致免疫組成物中之清淨劑對蛋白質的莫耳比爲約 1.4至約4.2。於一些體系中，該致免疫組成物中之清淨劑 對蛋白質的莫耳比爲約0.5、約〇.6、約〇.7、約〇.8、約 0.9 %、約1 · 〇、約1 · 1 '約1.2、約】· 3、約〗· 4、約丨5、約 1 . 6、約 1 · 7、約 1 · 8、約 1.9、約 2.0、約 2.1、約 2,2、約 2.3 、約 2.4、約 2.5、約 2.6、約 2.7、約 2.8、約 2.9、約 3.0、 約 3.1、約 3.2、約 3.3、約 3.4、約 3.5、約 3.6、約 3.7、約 -31 - 201221138 3.8、約 3_9、約 4.0、約 4.1、約 4.2、約 4.3、約 4.4、約 4_5 、約 4.6、約 4.7、約 4.8、約 4.9、約 5.0、約 5.5、約 6.0、 約 6.5、約 7.0、約 7.5、約 8.0、約 8.5、約 9 0、約 9.5、或 約10。於一些體系中’該清淨劑爲非離子型清淨劑。於一 些體系中，該清淨劑爲聚山梨酸酯清淨劑。於一些體系中 ，該清淨劑爲聚山梨酸酯80。 於一些體系中’該致免疫組成物進一步包含多價陽離 子。於一些體系中’該多價陽離子爲鈣或鋁。於一些體系 中，該鋁係以一或多種下列形式存在：aipo4、ai(oh)3、 Al2(S〇4)3及明礬。於一些體系中，該致免疫組成物包含約 0.1毫克/毫升至約1毫克/毫升；約0.25毫克/毫升至約0.75 毫克/毫升或約〇·4毫克/毫升至約0.6毫克/毫升之鋁。於一 些體系中，該致免疫組成物包含約0.1毫克/毫升、約0.15 毫克/毫升；約0.2毫克/毫升、約0.25毫克/毫升、約0.3毫 克/毫升、約0.35毫克/毫升、約0.4毫克/毫升、約0.45毫克 /毫升、約0.5毫克/毫升、約0.55毫克/毫升、約0.6毫克/毫 升、約0.65毫克/毫升、約0.7毫克/毫升、約0.75毫克/毫升 、約0.8毫克/毫升、約0.85毫克/毫升、0.9毫克/毫升、約 0.95毫克/毫升或約1毫克/毫升之鋁。於一些體系中，至少 有9 0 %、至少9 5 %、至少9 6 %、至少9 7 %、至少9 8 %、至少 9 9 %或1 0 0 %之鋁與蛋白質結合。 於一些體系中，該致免疫組成物進一步包含含有組胺 酸之緩衝劑。於一些體系中’該組胺酸之濃度爲約2πιΜ至 約20mM;約5mM至約15mM或約8mM至12mM。於一些體系 -32- 201221138 中，該組胺酸之濃度爲約2mM、約3mM、約4mM、約5mM 、約 6mM、約 7mM、約 8mM、約 9mM、約 10mM、約 llmM 、約 12mM、約 13mM、約 14mM、約 15mM、約 16mM、約 17mM、約 18mM、約 19mM或約 20mM。 於一些體系中，該致免疫組成物進一步包含含有琥珀 酸鹽之緩衝劑》於一些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲約 2mM至約20mM;約2mM至約10mM或約3mM至7mM。於一 些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲約2mM、約3mM、約4mM 、約 5mM、約 6mM、約 7mM、約 8mM、約 9mM、約 10mM、 約 llmM、約 12mM、約 13mM、約 14mM、約 15mM、約 16mM、約 17mM、約 18mM、約 19mM 或約 20mM。 於一些體系中，該致免疫組成物之pH値爲約5.0至約 8.0;約5.5至約7.0;或約5.8至約6.0。於一些體系中’該 致免疫組成物之p Η値爲約5.0、約5 . 1、約5.2、約5.3、約 5.4、約 5.5、約 5.6、約 5.7、約 5.8、約 5.9、約 6.0、約 6.1 、約 6 · 2、約 6 · 3、約 6 · 4 或約 6.5。 於一些體系中，該MnB rLP2086亞族Β蛋白質抗原致 免疫組成物之調製劑爲包含0.5毫克/毫升爲磷酸鋁形式之 鋁及莫耳比爲2.8之聚山梨酸酯80:蛋白質的l〇mM組胺酸 緩衝之生理鹽水，p Η値6.0。 於一些體系中，該MnB rLP2086亞族Β蛋白質抗原致 免疫組成物之調製劑爲包含0.5毫克/毫升爲磷酸鋁形式之 鋁及莫耳比爲2.8之聚山梨酸酯80:蛋白質的5mM琥珀酸鹽 緩衝之生理鹽水，pH値6.0。 -33- 201221138 於一些體系中’本發明提供使rLP2086亞族B抗原可經 時安定之方法’其包含將該抗原儲存在具低清淨劑對蛋白 質莫耳比之緩衝劑中。 於一些體系中，該緩衝劑中之清淨劑對蛋白質的莫耳 比爲約〇·5至約1 0。於一些體系中，該緩衝劑中之清淨劑 對蛋白質的莫耳比爲約1至約5。於一些體系中，該緩衝劑 中之清淨劑對蛋白質的莫耳比爲約1.4至約4.2。於一些體 系中，該緩衝劑中之清淨劑對蛋白質的莫耳比爲約0.5、 約 0 · 6、約 0 · 7、約 0 _ 8、約 0 _ 9、約 1 · 0、約 1 · 1、約 1 _ 2、約 1 . 3、約 1 . 4、約 1 . 5、約 1.6、約 1.7、約 1 · 8、約 1 · 9、約 2 . 〇 、約 2 · 1、約 2 · 2、約 2 · 3、約 2 · 4、約 2.5、約 2.6、約 2.7、 約 2.8、約 2 · 9、約 3.0、約 3 · 1、約 3 · 2、約 3.3、約 3.4、約 3.5、 約 3.6、約 3.7、約 3.8、約 3.9、約 4.0、約 4.1、約 4.2 、約 4.3、約 4.4、約 4.5、約 4.6、約 4.7、約 4.8、約 4.9、 約 5.0、約 5.5、約 6.0、約 6.5、約 7.0、約 7_5、約 8.0、約 8.5、 約9.0、約9.5或約10。於一些體系中，該清淨劑爲非 離子型清淨劑。於一些體系中，該清淨劑爲聚山梨酸酯清 淨劑。於一些體系中，該清淨劑爲聚山梨酸酯80。 於一些體系中，該緩衝劑進一步包含多價陽離子。於 一些體系中，該多價陽離子爲鈣或鋁。於一些體系中，該 鋁係以一或多種下列形式存在：aipo4、ai(oh)3、ai2(so4)3 及明礬。於一些體系中，該緩衝劑中之安定劑爲約〇. 1毫 克/毫升至約1毫克/毫升；約0.25毫克/毫升至約0.75毫克/ 毫升或約〇.4毫克/毫升至約〇·6毫克/毫升之鋁。於一些體 -34- 201221138 系中’該緩衝劑中之安定劑爲約〇」毫克/毫升、約〇.15毫 克/毫升；約0.2毫克/毫升、約〇·25毫克/毫升、約〇·3毫克/ 毫升、約0.35毫克/毫升、約〇.4毫克/毫升、約0.45毫克/毫 升、約0.5毫克/毫升、約0.55毫克/毫升、約〇·6毫克/毫升 、約0.65毫克/毫升、約0.7毫克/毫升、約0.75毫克/毫升、 約〇·8毫克/毫升、約0.85毫克/毫升、0.9毫克/毫升、約 0.95毫克/毫升或約1毫克/毫升之鋁。於一些體系中，至少 90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%或100%之鋁與蛋白質結合。 於一些體系中’該緩衝劑進一步包含組胺酸。於—些 體系中，該組胺酸之濃度爲約2mM至約20mM;約5mM至 約1 5mM或約8mM至1 2mM。於一些體系中，該組胺酸之濃 度爲約2 m Μ、約3 m Μ、約4 m. Μ、約5 m Μ、約6 m Μ、約7 m Μ 、約 8 m Μ、約 9 m Μ、約 1 0 m Μ、約 1 1 m Μ、約 1 2 m Μ、約 13mM、約 14mM、約 15mM、約 16mM' 約 17mM、約 18mM 、約 1 9mM或約 20mM。 於一些體系中，該緩衝劑進一步包含琥珀酸鹽。於一 些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲約2mM至約2〇mM ;約 2mM至約10mM或約3mM至7mM。於一些體系中，該琥珀 酸鹽之濃度爲約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM 、約 7mM、約 8mM、約 9mM、約 10mM、約 llmM、約 12mM 、約 1 3 m Μ、約 1 4 m Μ、約 1 5 m Μ、約 1 6 m Μ、約 1 7 m Μ、約 18mM、約 19mM或約 20mM。 於一些體系中，該緩衝劑之pH値爲約5.0至8.0 ;約5.5 -35- 201221138 至約7.0;或約5.8至約6·0。於一些體系中’該緩衝劑之pH 値爲約5.0、約5 _ 1、約5 · 2、約5 · 3、約5.4、約5 · 5、約5.6 、約 5 · 7、約 5 · 8、約 5 · 9、約 6.0、約 ό · 1、約 6 · 2、約 6 · 3、 約6.4或約6.5。 於一些體系中，該儲存MnB rLP208 6亞族Β蛋白質抗 原之緩衝劑爲包含〇·5毫克/毫升爲磷酸鋁形式之鋁及莫耳 比爲2.8之聚山梨酸酯80:蛋白質的l〇mM組胺酸緩衝之生 理鹽水，P Η値6.0。 於一些體系中，該儲存MnB rLP20 86亞族Β蛋白質抗 原之緩衝劑爲包含0.5毫克/毫升爲磷酸鋁形式之鋁及莫耳 比爲2.8之聚山梨酸酯80 :蛋白質的5mM琥珀酸鹽緩衝之生 理鹽水，pH値6.0。 rLP2086亞族A及B抗原效力之安定性 於一些體系中，本發明提供使rLP208 6亞族A及/或 rLP2086亞族B抗原可經時安定之致免疫組成物，其包含具 有高安定劑濃度及低清淨劑對蛋白質莫耳比之緩衝劑。 於一些體系中’該致免疫組成物中之清淨劑對蛋白質 的莫耳比爲約0.5至約10。於一些體系中，該致免疫組成 物中之清淨劑對蛋白質的莫耳比爲約】至約5。於一些體系 中’該致免疫組成物中之清淨劑對蛋白質的莫耳比爲約 1.4至約4.2 »於一些體系中’該致免疫組成物中之清淨劑 對蛋白質的莫耳比爲約0.5、約〇.6、約0.7、約0.8、約0.9 、約 1 _ 0、約 1 · 1、約 1.2、約 1 .3、約 1 4、約 1 .5、約 1 · 6、 -36- 201221138 約 1.7、約 1.8、約 1.9、約 2.0、約 2.1、約 2.2、約 2.3、約 2.4、約 2.5、約 2.6、約 2.7' 約 2.8、約 2.9、約 3.0、約 3.1 、約 3.2、約 3.3' 約 3.4、約 3.5、約 3.6、約 3.7、約 3.8、 約 3.9、約 4.0、約 4.1、約 4 · 2、約 4.3、約 4 · 4、約 4 · 5、約 4.6、約 4.7、約 4.8、約 4.9、約 5.0、約 5.5、約 6.0、約 6.5 、約 7.0、約 7.5、約 8.0、約 8.5、約 9.0、約 9.5、或約 10。 於一些體系中，該清淨劑爲非離子型清淨劑。於一些體系 中，該清淨劑爲聚山梨酸酯清淨劑。於一些體系中，該清 淨劑爲聚山梨酸酯8 0。 於一些體系中，該致免疫組成物進一步包含多價陽離 子。於一些體系中，該多價陽離子爲鈣或鋁。於一些體系 中，該鋁係以一或多種下列形式存在：Α1Ρ〇4、Α1(ΟΗ)3、 Al2(S04)3及明礬。於一些體系中，該致免疫組成物包含約 0·1毫克/毫升至約1毫克/毫升；約0.25毫克/毫升至約0.75 毫克/毫升或約0.4毫克/毫升至約0.6毫克/毫升之鋁。於一 些體系中，該致免疫組成物包含約0.1毫克/毫升、約0.15 毫克/毫升；約0.2毫克/毫升、約0.25毫克/毫升、約0.3毫 克/毫升、約0.35毫克/毫升、約0.4毫克/毫升、約0.45毫克 /毫升、約0.5毫克/毫升、約0.55毫克/毫升、約0.6毫克/毫 升、約0.65毫克/毫升、約0.7毫克/毫升、約0.75毫克/毫升 、約〇_8毫克/毫升、約0.85毫克/毫升、0.9毫克/毫升、約 0.95毫克/毫升或約1毫克/毫升之鋁。於一些體系中，至少 90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%或100%之鋁與蛋白質結合。 -37- 201221138 於一些體系中，該致免疫組成物進一步包含含有組胺 酸之緩衝劑。於一些體系中，該組胺酸之濃度爲約2mM至 20mM;約5mM至約15mM或約8mM至12mM。於一些體系中 ，該組胺酸之濃度爲約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、 約 6mM、約 7mM、約 8mM、約 9mM、約 10mM、約 llmM、 約 12mM、約 13mM、約 14mM、約 15mM、約 16mM、約 17mM、約 18mM、約 19mM 或約 20mM。 於一些體系中，該致免疫組成物進一步包含含有琥珀 酸鹽之緩衝劑。於一些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲約 2mM至約20mM;約2mM至約10mM或約3mM至7mM。於一 些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲約2mM、約3mM、約4mM 、約 5mM、約 6mM、約 7mM、約 8mM、約 9mM、約 10mM、 約 1 1 m Μ、約 1 2 m Μ、約 1 3 m Μ、約 1 4 m Μ、約 1 5 m Μ、約 16mM、約 17mM、約 18mM、約 19mM或約 20mM。 於一些體系中，該致免疫組成物之pH値爲約5.0至約 8.0;約5.5至約7.0;或約5.8至約6.0。於一些體系中，該 致免疫組成物之pH値爲約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約 5.4、約 5 . 5、約 5.6、約 5 · 7、約 5 · 8、約 5.9、約 6 · 0、約 6.1 、約 6.2、約 6.3、約 6.4或約 6.5。 於—些體系中，該MnB rLP2086亞族A及B蛋白質抗原 致免疫組成物之調製劑爲包含0.5毫克/毫升爲磷酸鋁形式 之鋁及莫耳比爲2.8之聚山梨酸酯80:蛋白質的10mM組胺 酸緩衝之生理鹽水，pH値6.0。 於—些體系中，該MnB rLP208 6亞族B蛋白質抗原致 is) -38- 201221138 免疫組成物之調製劑爲包含〇·5毫克/毫升爲磷酸鋁形式之 鋁及莫耳比爲2.8之聚山梨酸酯80 :蛋白質的5mM琥珀酸鹽 緩衝之生理鹽水’ PH値6.0。 於一些體系中’本發明提供用於使rLP2086亞族A及/ 或rLP2086亞族B抗原可經時安定之方法，其包含將該抗原 儲存在具有高安定劑濃度及低清淨劑對蛋白質莫耳比之緩 衝劑中。 於一些體系中，該清淨劑對蛋白質的莫耳比小於10:1 。於一些體系中’該緩衝劑中之清淨劑對蛋白質的莫耳比 爲約0.5至約10。於一些體系中’該緩衝劑中之清淨劑對 蛋白質的莫耳比爲約1至約5。於一些體系中，該緩衝劑中 之清淨劑對蛋白質的莫耳比爲約1 · 4至約4.2。於‘一些體系 中，該緩衝劑中之清淨劑對蛋白質的莫耳比爲約0.5、約 〇. 6、約 〇 _ 7、約 〇 · 8、約 〇 · 9、約 1 . 〇、約 1 . 1、約丨.2、約 1 . 3 、約 1.4、約 1.5、約 1.6、約 1.7' 約 1.8、約 1.9、約 2.0、 約 2 _ 1、約 2 · 2、約 2.3、約 2 4、約 2.5、約 2.6、約 2.7、約 2 _ 8、約 2 9、約 3.0、約 3 . 1、約 3 · 2 ' 約 3.3、約 3.4、約 3 · 5 、約 3.6、約 3.7、約 3.8、約 3,9、約 4.0、約 4.1、約 4.2、 約 4.3、約 4.4、約 4.5、約 4 · 6、約 4.7、約 4.8、約 4.9、約 5.0、約 5.5、約 6_0、約 6.5、約 7.0、約 7.5' 約 8.0、約 8.5 、約9.0、約9.5或約10。於一些體系中，該清淨劑爲非離 子型清淨劑。於一些體系中’該清淨劑爲聚山梨酸酯清淨 劑。於一些體系中，該清淨劑爲聚山梨酸醋80。 於一些體系中’在緩衝劑中之安定劑爲一種多價陽離 -39- 201221138 子。於一些體系中’該多價陽離子爲鈣或鋁。於—些體系 中’該鋁係以一或多種下列形式存在：A1P04、Α1(ΟΗ)3、 Al2(S〇4)3及明礬。於一些體系中’該緩衝劑中之安定劑爲 約0.1毫克/毫升至約1毫克/毫升；約0.25毫克/毫升至約 0.75毫克/毫升或約0.4毫克/毫升至約0.6毫克/毫升之鋁。 於一些體系中，該緩衝劑中之安定劑爲約0.1毫克/毫升、 約0.15毫克/毫升；約0.2毫克/毫升、約0.25毫克/毫升、約 0.3毫克/毫升、約0.35毫克/毫升、約0.4毫克/毫升、約 0_45毫克/毫升、約0.5毫克/毫升、約〇·55毫克/毫升 '約 0.6毫克/毫升、約0.65毫克/毫升、約0.7毫克/毫升、約 0.75毫克/毫升、約0.8毫克/毫升、約0.85毫克/毫升、0.9 毫克/毫升、約0.95毫克/毫升或約1毫克/毫升之鋁。於一 些體系中，至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至 少9 8% '至少99%或100%之鋁與蛋白質結合。 於一些體系中，該緩衝劑進一步包含組胺酸。於一些 體系中，該組胺酸之濃度爲約2mM至約20mM ;約5mM至 約15mM或約8mM至12mM。於一些體系中，該組胺酸之濃 度爲約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM、約7mM 、約 8mM、約 9mM、約 10mM、約 llmM、約 12mM、約 13mM、約 14mM、約 15mM、約 16mM、約 17mM、約 18mM 、約 1 9 m Μ 或約 2 0 m Μ。 於一些體系中，該緩衝劑進一步包含琥珀酸鹽。於一 些體系中，該琥珀酸鹽之濃度爲約2mM至約20mM ;約 2mM至約10mM或約3mM至7mM。於一些體系中，該號拍 -40- 201221138 酸鹽之濃度爲約2mM、約3mM、約4mM、約5mM'約6mM 、約 7mM、約 8mM' 約 9mM、約 l〇mM、約 llmM、約 12mM 、約 13mM、約 14mM、約 15mM、約 16mIV[、約 17mM、約 1 8 m Μ、約 1 9 m Μ 或約 2 0 m Μ。 於一些體系中，該緩衝劑之ΡΗ値爲約5·〇至約8.0;約 5.5至約7.0;或約5.8至約6.0。該於一些體系中，該緩衝 劑之pH値爲約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、 約 5.6、約 5.7、約 5.8、約 5.9、約 6_0、約 6.1、約 6.2、約 6.3、約 6.4或約 6.5。 於一些體系中，該儲存MnB rLP2086亞族A及B蛋白質 抗原之緩衝劑爲包含0.5毫克/毫升爲磷酸鋁形式之鋁及莫 耳比爲2.8之聚山梨酸酯80:蛋白質的l〇mM組胺酸緩衝之 生理鹽水，pH値6.0。 於一些體系中，該儲存MnB rLP2086亞族A及B蛋白質 抗原之緩衝劑爲包含0.5毫克/毫升爲磷酸鋁形式之鋁及莫 耳比爲2.8之聚山梨酸酯80:蛋白質的5 mM琥珀酸鹽緩衝之 生理鹽水，pH値6.0。 下列實例是爲了使本發明更容易被理解。這些實例僅 用於說明，而不應被解釋爲限制本發明之範圍。 此處所引用之所有參考資料均納爲本文之參考。 【實施方式】 實例1 :實驗程序 鋁結合程度之測定方法 -41 - 201221138 將包含鋁及至少一種蛋白質抗原之組成物離心從而使 鋁沈澱成小九。將吸收蛋白質之鋁離心的方法爲本技藝所 已知。見，例如£呂&116131.，''/3。(^1^，\?〇1.27(24):3175-3 1 80 ( 2009 )。與鋁結合之蛋白質亦被沈澱成小九，而未 與鋁結合之蛋白質則保留在上清液中。藉由Lowry分析法 測定在上清液及小九中之全部蛋白質。將上清液中之全部 蛋白質除以添加在組成物中之全部蛋白質，.再乘以1 0 0 %以 計算經結合之蛋白質的百分比。類似地，將上清液中之全 部蛋白質除以添加在組成物中之全部蛋白質，再乘以1 00% 以計算未經結合之蛋白質的百分比。 在同時包含亞族A及亞族B抗原之組成物方面，藉由離 子交換層析法測定上清液中之個別亞族A及亞族B蛋白質濃 度。使用強陰離子柱及高鹽濃度洗提液將亞族A及亞族B蛋 白質分離及洗提出。使用設定在激發=2 80運轉且發射=3 10 運轉之螢光偵測器偵測及定量亞族A及B蛋白質二者。亞族 A及亞族B蛋白質在不同的保留時間洗提出並使用針對 rLP208 6蛋白質參考物質產生之標準曲線定量之。將上清 液中之全部蛋白質除以添加在組成物中之全部蛋白質，再 乘以100%來計算未經結合之蛋白質的百分比。從100%減 去未經結合之蛋白質的百分比以計算經結合之蛋白質的百 分比。 活體外效力分析 rLP20 8 6效力分析爲一種依賴兩種可辨識rLP2086藥品 201221138 之單一蛋白質分子上的構形及非重疊抗原決定部位之功能 性單株抗體的均相捕捉分析或三明治分析。一種純化之單 株抗體係作爲捕捉抗體（mAb )且係以化學方式共軛結合 羧基化之聚苯乙烯小珠，該羧基化聚苯乙烯小珠具有獨特 之顏色編碼的識別符號。第二種抗體係經生物素化且作爲 隨後與鏈黴抗生物素蛋白結合之偵測抗體，該鏈黴抗生物 素蛋白係與螢光團R-藻紅蛋白質（SA-PE )共軛結合。 BioPlex偵測儀器之射流技術定量個別微粒及其相關之SA-PE信號。來自R-藻紅蛋白質之與微球相關之螢光信號僅能 藉由該與小珠共軛結合之抗體、抗原及偵測抗體間形成的 三元複合物偵測且將與rLP2086樣本中之功能性抗原決定 部位的數量成比例。相對於參考標準，造成螢光損失之一 或兩個抗原決定部位中的變化表示效力喪失。 試劑 • 與共軛結合單株抗體之微球（與 Luminex M i c r ο P1 e X微球小珠區# 1 2共軛結合或與小珠區 # 66共軛結合）。 • 生物素化之單株抗體。 • rLP2086參考物質、亞族A及B，2毫克/毫升。儲 存在-70°C。 • rLP2086亞族A及B二價對照組 • 鏈黴抗生物素蛋白、與R-藻紅蛋白質共轭結合， 經凍乾的 -43- 201221138 緩衝劑 . 1 0 m Μ組胺酸、1 5 0 m Μ氣化鈉，p Η値6.0 . 在Ο . 8 5 %重量/體積生理鹽水中之5 %重量/體積聚 山梨酸酯80 ( PS-80 )。 • 基質緩衝劑（10mM組胺酸、0.02%聚山梨酸酯80 、150mM氯化鈉，pH値 6.0)。 • 分析緩衝劑（PBS，pH値7.4，含有0.1%BSA、 0.0 2 %聚山梨酸酯8 0、0.1 %疊氮化物）。 • lOOx鏈黴抗生物素蛋白，與R-藻紅蛋白質（SA-PE )共軛結合-打開經凍乾的鏈黴抗生物素蛋白 、R-藻紅蛋白質的小瓶並添加1毫升蒸餾水。 振盪混合至完全溶解。 程序 將200微升之亞族A蛋白質及200微升之亞族B蛋白質加 入600微升基質緩衝劑中，使各亞族之濃度爲400微克/毫 升。將原液在分析緩衝劑中稀釋以產生8種濃度（ 3333-1.5 毫微克/毫升）之標準曲線。 將200微升之二價對照組加入8〇〇微升之基質緩衝劑中 ’使各亞族之濃度爲400微克/毫升。將400微克/毫升之原 液在分析緩衝劑中稀釋以製備100、50及12.5毫微克/毫升 之操作濃度。1〇〇及12.5毫微克/毫升分別代表高（CH )及 低（CL)對照組。 (S) -44- 201221138 將測試樣本在基質緩衝劑中稀釋成濃度爲400微克/毫 升。從該400微克/毫升原液製備100、50及12.5毫微克/毫 升之操作溶液。 在分析緩衝劑中使用濃度爲2x1 05珠/毫升之共軛結合 的小珠及濃度爲30微克/毫升之偵測抗體製備均相分析混 合物。將0.4毫升之標準、對照組、樣本或空白液加入2毫 升之96孔深孔盤中以準備樣本盤。在96孔MultiScreenHTS-BV濾盤中加入100微升分析緩衝劑以將過濾器預先濕潤， 然後藉由真空抽吸，透過過濾器將分析緩衝劑吸出。將25 微升製備好之均相分析混合物加入96孔盤中。在該96孔過 濾盤之各個孔中加入2 5微升之各標準、對照組、樣本或空 白液。將盤在室溫下培育一小時並一邊搖動。 培育後，藉由真空抽吸，透過過濾器將該抗原-抗體 培育緩衝劑移出。以1 00微升之分析緩衝劑清洗各孔之過 濾器，再藉由真空抽吸移出該分析緩衝劑。最後一次清洗 後’在各個孔中加入50微升之lx SA-PE。將盤在黑暗中， 室溫下培育10分鐘並在滴定器上一邊搖動。 SA-PE培育後，在盤內之各孔中加入75微升之分析緩 衝劑使總體積爲125微升。在Bio-Pl ex 200系統上立即讀取 該分析盤。 血清殺菌分析 藉由全細胞 ELISA預先審查自加拿大Charles River ( St-Constant ’ QC ’加拿大）取得之紐西蘭白色雌兔2.5-3.0 -45- 201221138 公斤以鑑定那些對兩種不同之腦膜炎球菌菌株（自各 P20 8 6亞族中各取一種菌株）具低反應性者。一般而言， 兔子具有非常低的背景値並選出那些具有最低値者來使用 。在第0、4及9週經由肌肉內途徑爲兔子接種單價 rLP2086-A05、單價 rLP2086-B01或二價 rLP2086-A05 + B01 疫苗來進行免疫化。每一劑量中含有經調製於1 OmM組胺 酸緩衝劑（卩：96.0)、150111^1氯化鈉'0.02%聚山梨酸酯 80及250微克A1P04中之100微克用於單價疫苗之蛋白質及 1〇〇微克用於二價疫苗之各蛋白質。經由肌肉內途徑將疫 苗注射到右後腿（0.5毫升/劑量）中。爲一組兔子接種單 獨之調製劑緩衝劑以作爲對照組。取得免疫前（〇週）及 免疫（第1 〇週）血清樣本以供分析。所有動物規程均遵守 已建立之機構動物管理及使用委員會準則。 使用包含人類補體之SB As測定以rLP2086疫苗免疫化 之兔子的血清殺菌抗體。將兔子免疫血清加熱滅活以去除 內因性補體活性，隨後在含有Ca2+及Mg2+之Dulbecco氏 PBS ( D-PBS )的96孔微滴定盤中將血清進行1:2之連續稀 釋，以測試對抗腦膜炎奈瑟菌株的血清殺菌活性。使該分 析中使用之細菌生長在輔以凱洛格氏（Kellogg )補充劑 (GCK)之GC介質中並藉由650 nm處之光密度監測。收穫 細菌，使在D-PBS中稀釋最終〇D65Q爲0.50-0.5 5以用於分析 中並將1000-3000 CFU加入含有20%人類補體之分析混合物 中〇 使用不具有可偵測到之殺菌活性的人血清作爲外源性 -46 - 201221138 補體來源。測試補體來源對各個別測試株之合適性。補體 來源僅用於當不添加免疫血清之對照組中存活的細菌數> 75 %時。執行本硏究中所描述之SB As時需要10種獨特之補 體來源。 在37°C，5%C02下培育30分鐘後，在反應混合物中加 入D-PBS並將各等份轉移入塡滿 5 0%GCK基質之微過濾盤 中。將微過濾盤過濾，在37°C，5%C02下培育一整夜並將 小菌落染色及定量。血清殺菌力價之定義爲與不含免疫血 清之對照孔相比較時可使CFU減少50%之內插的血清稀釋 度倒數。SBA力價之定義爲在37°C下培育30分鐘後使細菌 量減少50%之內插的測試血清稀釋度倒數。與對應之免疫 前血清相比較，若P2086免疫血清之SBA力價上升4倍或更 高則確立以P20 8 6免疫血清滅殺之敏感性。兔子血清之偵 測限値爲力價8。在開始稀釋時對檢測菌株爲陰性之血清 被指定爲該分析之偵測限値的一半力價（即，在兔子方面 爲4 )。 流式細胞儀 令MNB細胞生長至OD65G爲0.45-0.55，接著在1% (體 積/體積）多聚甲醛（在lxPBS中）中固定10分鐘。將100 微升/孔之細菌平皿接種在96孔U型底聚苯乙烯盤中，旋轉 降速並在1% (重量/體積）BSA (在lxPBS中）中清洗一次 。將抗LP 20 86單株抗體加入細菌小九中，再懸浮後在冰上 培育30分鐘。在1% (重量/體積）BSA/PBS中清洗二次後 -47- 201221138 ’將生物素化之山羊抗小鼠IgG (子類1+2a + 2b + 3 )(傑克 遜（Jackson) Immunoresearch)加入細胞小九中，再懸浮 後在冰上培育3 0分鐘。將細胞清洗二次後，再懸浮於鏈黴 抗生物素蛋白-PE(BD Biosciences)中，並在冰上培育30 分鐘。在1%BSA/PBS中清洗二次後，將細胞小九再懸浮於 1 %多聚甲醛中。包含小鼠IgG以作爲陰性對照組。在BD L S R 11流式細胞儀上測得二萬（2 0 0 0 0 )項/孔並使用 FlowJo V7 軟體（Treestar，奧勒岡州，Ashland)分析。 該PE道之螢光強度（MFI)的平均値係以各樣本在FSC對 SSC散點對數圖中計算出的細菌細胞數目來測定。若MFI 爲對照組小鼠IgG MFI之三倍，則MFI被認爲是陽性。 實例2 :結合rLP2086蛋白質之聚山梨酸酯80 爲了了解與各rLP2086蛋白質A及B結合之聚山梨酸酯 80的安定性，將包含200微克/毫升亞族A及鋁之rLP2086調 製樣本及包含200微克/毫升亞族B之另一 rLP2086調製樣本 二者儲存在2-8 °C及25 t 5個月後，測試其蛋白質及聚山梨 酸酯80含量。亦分析安慰劑（緩衝劑+鋁’但不含蛋白質 )。聚山梨酸酯80在安慰劑中之分佈顯示於第14圖中’而 亞族A及B之聚山梨酸酯80分佈分別顯示於第15及16圖中。 亞族B之相對效力（％)與結合莫耳比之比較顯不於第17 圖中。 結果 -48 - 201221138 如第14圖中所示’全部％聚山梨酸酯80及上清液中之 %聚山梨酸酯80相同（0.017%)，其指出聚山梨醇酯80未 與鋁結合或被捕捉在小九中。此外，聚山梨醇酯80在2-8 °(3及25°(：下5個月後仍保持安定。 在經結合（小九）與未經結合（上清液）及全部 rLP2086亞族A和亞族B樣本中之聚山梨酸酯80的分佈分別 顯示在第15及16圖中。雖然在2-8 °C及25 t下5個月之時點 處亞族A之上清液及小九中的％聚山梨酸酯沒有改變。然 而’在25 °C下5個月之時點處亞族B樣本之小九中可觀察到 較多之聚山梨酸酯80。儘管在2-8 °C及25。(：下，上清液及 小九中之聚山梨酸酯80的濃度不同，兩個亞族均可達到精 確的質量平衡。由於rLP2086蛋白質與此基質中之磷酸鋁 100%結合，與小九聯結之聚山梨酸酯80最有可能與蛋白質 分子結合。 雖然蛋白質A及B二者均與聚山梨醇酯80結合，儲存在 2-8 °C及25 °C之樣本中的蛋白質A之結合程度相同，而儲存 在25 °C之樣本的蛋白質B之結合程度幾乎爲儲存在2-8 °C之 樣本的二倍。在TQ時及5個月之時點處測定亞族B在2-8 t 及25 °C之相對效力且發現其表現如第17圖之描述，與結合 莫耳比（Bound Molar Rate)成反比。在5個月/25 °C，％效 力TQ之120下降到16%，而在同一時期，結合莫耳比從5.3 上升到1 3.9。 實例3:關鍵莫耳比硏究 -49- 201221138 爲了測定安定rLP2086所需之聚山梨酸酯80的關鍵濃 度，依表1中之描述，製備四十（40)種具有不同聚山梨 酸酯80濃度之劑量爲200微克/毫升及400微克/毫升之僅含 亞族A、僅含亞族B及包含亞族A和B兩者之rLP2086調製劑 。在時間零（T〇) 、14天及1個月時測定在2-8 °C及25 °C之 各樣本的全部及經結合之蛋白質，以及全部、上清液及小 九中之°/。聚山梨酸酯80。這項硏究之結果顯示於第18圖至 第24圖中。 全部蛋白 質抗原 蛋白質 亞族 聚山梨酸酯肋 0 安慰劑 0.003 X 0.005 X X X 0.02 200 A X 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01 0.02 200 B 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01 0.02 400 A+B X X X 0.007 X 0.01 0.02 400 A X X X 0.007 X 0.01 0.02 400 B X X X 0.007 X 0.01 0.02 表1 結果 測定所有40種包含磷酸鋁之rLP2086調製劑樣本的上 清液、小九中及全部聚山梨酸酯80濃度。測定亞族A及B二 者之全部及經結合之莫耳比，如第1 8圖及第1 9圖所分別顯 示者，在200微克/毫升，含有0.005 %聚山梨酸酯80 (5.4莫 耳比）或更少之亞族A及B之測量結果似乎類似。然而，對 含有0.0065%聚山梨酸酯80 ( 7.〇莫耳比）或更多之樣本而 言，亞族B之總莫耳比較經結合之莫耳比要高得多。如第 20圖所述’對含有0.008 %聚山梨酸酯8〇 (8.6莫耳比）或 -50- 201221138 更少之調製劑而言，400微克/毫升亞族A'亞族B及亞族 A + B之全部及經結合之莫耳比的各數據亦很類似，然而， 對含有0.017%聚山梨酸酯80 (18.4莫耳比）之調製劑而言 ，總莫耳比較經結合之莫耳比要高得多。 實例4:聚山梨酸酯80隨著時間推移之結合 在T〇、14天/2 5°C、1個月/4°C及1個月/2 5°C測定包含 磷酸鋁之亞族A及B調製劑樣本之上清液和小九中的百分比 (%)聚山梨酸酯80。對保存在2-8 °C之樣本而言，亞族A 及B調製劑樣本之上清液中的％聚山梨酸酯80幾乎相同。 然而’對保存在25 °C之樣本而言，上清液中之％聚山梨酸 酯80僅經過14天後即大幅下降。亞族A及B二者之小九中的 %聚山梨酸酯80在T〇 /5°C及1個月/5 °C時非常類似。然而， 對儲存在25 °C之樣本而言，上清液中之％聚山梨酸酯80顯 著增加，尤其是含有0.008%聚山梨酸酯80 ( 8.6莫耳比） 或更多之亞族B。亦測定在T〇、14天/25°C、1個月/4。(：及1 個月/2 5°C時含有磷酸鋁之rLP2086亞族A及B調製劑之上清 液及小九中的％聚山梨酸酯80。如第21圖中所示，包含 0.008 %聚山梨酸酯80之樣本中的聚山梨酸酯8〇濃度在所有 4個時點處大約相同。然而，該保存在25。(3，包含0.017 % 聚山梨酸酯80的樣本中之聚山梨酸酯80的濃度增加。在含 有0.008 %聚山梨酸酯80或更少之樣本的上清液中沒有發現 聚山梨酸酯80。如第22圖中所示，包含0.008 %聚山梨酸醋 80或更少之樣本中的經結合之莫耳比在所有4個時點處保 -51 - 201221138 持安定。然而，該保存在25 °C之包含0.017 %聚山梨酸酯80 的樣本中之經結合的莫耳比增加。 在T〇及14天/25 °C時測定含有磷酸鋁之亞族A及B調製 劑樣本之效力（分別爲第23圖及第25圖）。如第23圖中之 描述’在5 °C及25 °C二種溫度下，具有不同的總莫耳比之 亞族A的效力係在91至102之範圍內。雖然，經結合之莫耳 比結果在任一溫度下亦幾乎相同，當總莫耳比/經結合之 莫耳比增加時可見到效力略有增加。 總莫耳比高達9.0時，5 °C樣本中之亞族B的效力爲約 95%。然而’當總莫耳比增加至18.1時，亞族B之效力下降 至7 9%。此外’與其他樣本相比較，總莫耳比爲1 8.1之樣 本具有較高之經結合之莫耳比。在25 °C下，當總莫耳比從 5.3上升到18.1時，亞族b效力顯示出從83%顯著下降到5% 。當2 5 °C樣本之總莫耳比增加時，其經結合之莫耳比從 5 · 3增加至1 3 · 8。因此，亞族b之效力與經結合之莫耳比成 反比。 亞族A及亞族B蛋白質兩者均與聚山梨酸酯80結合。對 儲存於2 - 8 °C及2 5 °C之樣本而言，亞族A之結合程度相同.， 但對儲存於25 °C之樣本而言，亞族B之結合程度幾乎爲二 倍。此外，關鍵莫耳比硏究指出2 00微克/毫升之調製劑樣 本當含有0.008%聚山梨酸酯80或更少（相當於總莫耳比等 於4.2或更少）時可保持安定。 實例5:清淨劑濃度及rLP2086亞族B抗原效力 201221138 改變聚山梨酸酯8 0濃度所進行之額外的安定性硏究證 實聚山梨酸酯80對蛋白質的莫耳比對保持效力具有關鍵性 。在一項實驗中，該致免疫組成物係經調製於pH値6.3， 含有0.5毫克/毫升鋁（爲磷酸鋁之形式）之l〇mM組胺酸緩 衝之生理鹽水（HBS )中，劑量爲200微克（總蛋白質濃 度 400微克/毫升），並攙入0.01%、0.02%、0.05%或0.1% 聚山梨酸酯80 (聚山梨酸酯80對rLP20 86蛋白質之對應莫 耳比爲5.3、10.7、26.7及53.4)。將經調製之樣本在25 °C 下培育並將對照組樣本保存在2-8 °C。聚山梨酸酯80濃度 高達0.1%時’時間“ 0”處之效力無顯著變化。然而，在 2-8 °C及25 °C下保存較時期者，可觀察到效力降低爲溫度 及聚山梨酸酯80濃度之函數。當該致免疫組成物中之聚山 梨酸酯8 0的濃度從0.0 1 %增加至〇 . 1 %時，該3個月安定性 對點顯示出在25 °C及2-8 °C下，亞族B蛋白質之效力分別降 低至少於10%和25% (第1圖）。 進行一個額外之安定性硏究（第2圖）以評估在HBS 中，濃度爲4毫克/毫升且攙入最終濃度爲〇.〇6、0.5和1 %之 聚山梨酸酯80 (對應之莫耳比爲3.3、26.7及53.4)的亞族 B蛋白質。該對照組含有0.09%聚山梨酸酯80。在〇.〇6%聚 山梨酸酯80 (莫耳比爲3.3)中之亞族B蛋白質是安定的。 同一種樣本當包含之聚山梨酸酯80的濃度增加至0.5 %及1 % (莫耳比分別爲26.7和53.4 )時則變得不安定。在400微克 /毫升之致免疫組成物調製劑方面，所有包含〇 . 0 1 %聚山梨 酸酯80 (5.3莫耳比）或更高濃度之調製劑中均可注意到 -53- 201221138 亞族B蛋白質不安定。然而’在4毫克/毫升蛋白質及0·06% 聚山梨酸酯80濃度下，效力並未降低’因爲該聚山梨酸醋 80對蛋白質之比例（3.3)低於400微克/毫升蛋白質加 〇 · 0 1 %聚山梨酸酯8 0濃度（莫耳比5 . 3 )之比例。因此’由 聚山梨酸酯80造成之亞族Β蛋白質效力降低與聚山梨酸酯 80清淨劑：蛋白質之比相關，而不是聚山梨酸酯80在基質 中的絕對濃度。 因此，致免疫組成物中之聚山梨酸酯80的濃度必須降 低以保持疫苗中之亞族Β蛋白質之安定性’及隨後儲存在 2-8 °C下之安定性。設計用於劑量爲2〇和200微克’具有不 同莫耳比之聚山梨酸酯80(0、1.1、2.7及5.3)的致免疫 組成物之加速的28天安定性硏究（第3圖及第4圖）。製備 在pH値6.0，含有0.5毫克/毫升鋁（爲磷酸鋁之形式）之1〇 mM組胺酸緩衝之生理鹽水（HBS )中’具有不同聚山梨酸 酯80濃度的二價（亞族A及亞族B )調製劑。將樣本在25 °C 下培育並將對照組置於2-8°C。在第〇 ' 7、14及28天分析 樣本之效力。所有包含聚山梨酸酯80:蛋白質之莫耳比低 於5.3的組別中之亞族A (數據未顯示）及亞族B均保持安 定。效力數値大於80%被認爲是在分析變異之內。莫耳比 爲5.3時，在25°C之樣本中可觀察到亞族B蛋白質之效力有 下降趨勢。 進行全面性硏究以評估在加速之貯存安定性條件下所 有以不同之聚山梨酸酯80對蛋白質之莫耳比調製的可能臨 床劑量（20、60、120及200微克劑量）以調查聚山梨酸酯 S") -54- 201221138 80對蛋白質之莫耳比對 MnB rLP2086蛋白質之安定性的 影響。使用以約1.4至ΐ〇·7之聚山梨酸酯80對蛋白質莫耳比 調製的二價MnB rLP2086致免疫組成物。爲了產生以逐漸 增加之聚山梨酸酯80對蛋白質莫耳比（1.4、2.4、3.4、 3.9、4.3、4.7及10.7)調製之致免疫組成物，經由加入聚 山梨酸酯80將抗原調整爲可變之莫耳比，致使調製致免疫 組成物期間不需再加入額外之聚山梨酸酯80。本硏究中使 用之抗原批次有兩組。一組亞族A及B之批次係以聚山梨酸 酯80對蛋白質莫耳比爲丨.4產生，而另一組爲24。使用莫 耳比爲2.4之蛋白質組，經由攙入額外之聚山梨酸酯8〇將 莫耳比調整爲3.4、3.9、4.3、及10.7。該致免疫組成物之 最終基質爲10mM組胺酸、l50mM氯化鈉（pH 6.0) 、〇.5 毫克/毫升之磷酸鋁且具有上文中所提及之聚山梨酸酯8〇 對蛋白質莫耳比。儲存在2-8 °C或25 t —段特定時間後， 在測試前以搖桿輕輕混合24小時。測試總蛋白質（藉由 IEX-HPLC) '效力、外觀、上清液部分在320nm的光密度 及pH。 2 00和20微克劑量之效力結果分別顯示於第5圖及第6 圖中。本硏究中使用之效力分析較其他測試更敏感。總體 而言’對所有莫耳比爲4.3及更低之所有劑量而言，與起 始時間點之效力相比較，亞族A或B抗原之效力並未觀察到 顯著減少。莫耳比爲4.7之調製劑被認爲處於臨界點，因 爲儲存在25 °C之亞族B蛋白質的效力略爲下降。在莫耳比 爲10.7之調製劑中的亞族B抗原方面，儲存在25 t之樣本 -55- 201221138 的效力較儲存在2-8 °C之樣本明顯降低。 實例6:鋁濃度及rLP2086亞族A和B抗原效力 進行許多實驗以測定磷酸鋁之最佳水準，以確保亞族 A及B蛋白質兩者之結合程度超過95%。初步硏究的重點係 將pH値6.5之調製劑優化。製備在pH値6.5，含有0.02 %聚 山梨酸酯80及0.25或0.5毫克/毫升鋁（爲磷酸鋁之形式） 之1 OmM組胺酸緩衝劑（HBS )中的調製劑，其目標劑量爲 200微克/毫升之來自亞族A及B蛋白質的各蛋白質。亞族B 蛋白質與磷酸鋁之結合程度低於亞族A蛋白質（第7圖）。 鋁含量從0.25毫克/毫升增加至0.5毫克/毫升可使亞族B蛋 白質之結合程度增加至> 80%。由於蛋白質與鋁懸浮液之 間的結合機制主要爲離子之交互作用，該懸浮液之PH値爲 影響結合之一種因素。 將調製劑pH値最優化，以確保亞族B蛋白質之結合程 度大於90 %-95 %。檢査數種具有200微克/毫升之各A及B蛋 白質之調製劑，其pH値隨著不同.批次之致免疫組成物而爲 5.6至6.5 (第8圖）。當調製劑之pH値爲5.6至6.4時兩種蛋 白質之結合程度大於90%-95%。當調製劑之pH値增加到 6.5以上時，亞族B蛋白質之結合程度顯著降低。建議之目 標pH値爲6.0以確保亞族A及B蛋白質二者之結合程度超過 9 0%。 亦經由改變p Η値、緩衝劑、蛋白質及聚山梨酸酯8 0濃 度來評估在調製劑變量及/或限制下的調製劑堅實性（第9 -56- 201221138 圖）。雖然總蛋白質濃度高達5 00微克/毫升（各蛋白質爲 2 5 0微克/毫升）時，亞族A蛋白質之結合程度一貫保持在 高水準（295% )，亞族B蛋白質之結合程度對蛋白質濃度 和pH値更爲敏感。當使用劑量爲2 00微克之市售調製劑時 ，從此實驗取得之結果進一步支持pH値6.0，含有0.5毫克/ 毫升磷酸鋁之建議的調製劑》 評估含有及不含有磷酸鋁之調製劑，以調查提供不含 磷酸鋁且含有足夠低之聚山梨酸酯80濃度以安定亞族B蛋 白質之安定調製劑的可行性。配製在組胺酸緩衝之生理鹽 水緩衝劑中且聚山梨酸酯80濃度爲0至5.3莫耳比之劑量爲 20及200微克的致免疫組成物。進行測試前，以設定在 5〇〇rpm，脈衝模式（2秒開及1秒關）之數位多管震盪混合 器將一半樣本攪動24小時。採用此條件以模擬1STA測試（ 國際安全運輸協會），此測試通常係在最後的致免疫組成 物運輸包裝階段執行以模擬運輸條件期間之極端振動。 經由攪動使不含磷酸鋁之調製劑沉澱（最終將導致亞 族A及B抗原兩者之效力損失）。外觀測試（第10圖）及在 λ =3 2 Onm處測量吸光度（第11圖）證明當攪動不含磷酸鋁 之調製劑時，形成聚集物及/或沈澱。這些樣本之效力測 試（第1 2圖及第1 3圖）證明在所有測試時間點下亞族A及B 蛋白質兩者之效力均明顯損失。效力的損失在含有低量之 聚山梨酸酯80的調製劑中最爲顯著。由於低量之聚山梨酸 酯8對維持亞族B蛋白質之安定是有必要的，在調製劑中包 含磷酸鋁對保存安定性是需要的。rLP20 86致免疫組成物 -57- 201221138 可與磷酸鋁一起調製，從活體外效力分析可測得磷酸鋁可 增強效力之安定性。 實例7:作爲緩衝劑之琥珀酸鹽及組胺酸 製備一系列調製劑以比較rLP2086亞族A及B蛋白質在 號珀酸鹽及組胺酸中之結合程度，以及pH値、聚山梨酸酯 80及MgCl2對結合程度的影響（表2 )。經由改變pH値、緩 衝劑、蛋白質及聚山梨酸酯80之濃度來評估在調製劑變量 及/或限制下的調製劑堅實性（第25及62圖）。不論使用 何種緩衝劑（組胺酸或琥珀酸鹽），鋁與亞族A及亞族B蛋 白質之結合程度相似。 表2 :用於評估組胺酸和琥珀酸鹽緩衝劑、MgCl:、聚山梨酸酯80 及pH S.6-6.0對rLP2086與AlP〇4結合之影響的調製劑1 oooooooooooooooooooooo 0000055500000000555000 2222222222222222222222 000^000000000000000000 0000055500000000555000 2222222222222222222222 00000000000101010101010101052010 555555551020500000000000 0.020 0.9 0 6.0 0.020 0.9 0 5.8 0.020 0.9 0 5.6 0.010 0.9 0 6.0 0.005 0.9 0 6.0 0.020 0.9 0 6.0 0.020 0.9 0 5.8 0.020 0.9 0 5.6 0.020 0.9 0 6.0 0.020 0.9 0 6.0 0.020 0.9 10 6.0 0.020 0.9 0 6.0 0.020 0.9 0 5.8 0.020 0.9 0 5.6 0.010 0.9 0 6.0 0.005 0.9 0 6.0 0,020 0.9 0 6.0 0.020 0.9 0 5.8 0.020 0.9 0 5.6 0.020 0.9 0 6.0 0.020 0.9 0 6.0 0.020 0.9 10 6.0 -58- 1 表2中描述之所有調製劑含有0.5毫克鋁/¾升。 201221138 以三種常用的緩衝鹽評估緩衝鹽及混合時間對鋁結合 程度的影響，選擇這些緩衝鹽係由於其pKa係在生理範圍 內且因爲這些鹽一般被視爲是安全的。在適合每種鹽之 pKa的pH値下將rLP2086亞族A及B蛋白質與該三種緩衝鹽 之一一起調製：5mM號拍酸鹽、10mM組胺酸或10mM碟酸 鹽，以測定在各條件下之結合程度。在測量經結合之蛋白 質量前令樣本混合5或120分鐘以評估達到結合完成所需的 時間。 如第27圖所示，亞族B蛋白質顯現出在ΡΗ6·8，磷酸鹽 緩衝液中之結合程度降低，而亞族Α蛋白質在相同的條件 下未被明顯影響。在以組胺酸或琥珀酸鹽調製之樣本中， 與鋁結合之蛋白質量類似。因此，選擇此兩種緩衝鹽以供 進一步評估。雖然不欲受限於理論，磷酸鹽緩衝液中之結 合程度降低有可能是因爲與加入之磷酸根離子競爭A1P04 上之結合位點。 在這些條件及蛋白質和aipo4濃度下，在室溫下攪拌 5分鐘後完成結合，與混合2小時後得到之結果類似。 爲了進一步檢查亞族B蛋白質在PH6.8之磷酸鹽緩衝液 中結合減少是由於pH値或緩衝鹽之間的差異，在組胺酸或 琥珀酸鹽緩衝之調製劑中，於pH 5. 3至7.0之範圍內測定結 合程度。製備包含0.2毫克/毫升各亞族蛋白質（總蛋白質 〇·4毫克/毫升）、0.02% PS80、0.5毫克鋁/毫升及150mM氯 化鈉之二價調製劑。在l〇mM組胺酸或5mM琥珀酸鹽中調 製樣本以比較緩衝鹽之效果。調製後，個別驗證各樣本之 -59- 201221138 pH値。 第28圖顯示亞族A蛋白質、第29圖顯示亞族B蛋白質在 pH5.3至7.0之結合略圖。亞族A蛋白質顯示出蛋白質之結 合量的變化不大，在整個測試之p Η値範圍內結合水準保持 在高於95%。目標之pH値爲7.0之含有組胺酸的調製劑所產 生之pH値爲6.8。pH値並未被調整爲7.0(例如：經由加入 鹼），以避免對蛋白質及aipo4之可能的影響，因此，此 數據點無可用之結果。 亞族B蛋白質之結合略圖（顯不在第29圖中）顯示出 爲pH依賴之趨勢。然而，無論結合反應是在組胺酸或琥珀 酸鹽緩衝之調製劑中進行，與鋁結合之蛋白質的量類似。 結合係依賴調製劑之pH値而非該緩衝鹽。在pH至高爲6.5 下，結合水準保持在95% (在組胺酸中爲94%，在琥珀酸 鹽中爲95%)，但當 pH値高於6.5時則下降。在pH 7.0時 ，結合水準下降至約82%，緩衝鹽之間有些微差別。 爲了在這些濃度下取得亞族B蛋白質與AlP〇4堅實的結 合，pH値在6.5或更低較佳。 實例8:安全性、耐受性及致免疫性硏究 進行一項硏究以評估根據〇及2個月；或〇、2及6個月 ;〇及2個月，接著在12個月給予加強劑量之治療攝生法投 予健康之青少年族群rLP2086疫苗的安全性、耐受性及致 免疫性。 該致免疫組成物爲rLP2086疫苗（脂化之重組株）° -60- 201221138 該致免疫組成物包含表達在大腸桿菌中之腦膜炎奈瑟菌血 清型B重組體ORF2086蛋白質且調製成由rLP2086之一種亞 族A株及一種亞族B株組成的二價疫苗中。特別是，該致免 疫組成物係經調製成0.5毫升劑量中各包含60微克、120微 克或200微克之純化之亞族A及純化的亞族B rLP2086蛋白 質、2.8莫耳比之聚山梨酸酯80及0.25毫克八13+(爲八1?〇4 之形式）、lOmM的組胺酸緩衝之生理鹽水（pH 6.0 )。 0.5毫升劑量之對照組組成物中包含生理鹽水溶液（0.9% 氯化鈉）。 將受試者隨機分配到5組中。見表3。該受試者分爲兩 種年齡組211至<14歲及214至<19歲。 表3 : 硏究設計 第1次 第2次 第2次1 第3次 第3次 第4次 第4次 接種疫苗 接種疫苗 接種疫苗 接種酿 接種疫苗 接種疫苗 接種Μ 後抽血 後抽血 後抽血 訪視 1 2 3 4 5 6 7 編號 近似乏 0 2 3 6 7 12 13 月數 第1組 rLP2086 rLP2086 生理鹽水 生理鹽水 第2組 rLP2086 rLP2086 rLP2086 生理鹽水 第3組 rLP2086 rLP2086 生理鹽水 rLP2086 第4組 rLP2086 生理鹽水 rLP2086 生理鹽水 第5組 生理鹽水 生理鹽水 rLP2086 rLP2086 抽血 20毫升 20毫升 20毫升 20毫升 20毫升 使用生理鹽水作爲安慰劑，因爲沒有被證明爲安全、 -61 - 201221138 具致免疫性且有效之抗Μ η B疫苗可以作爲一個活性對照組 〇 根據表3，受試者在每一次疫苗接種的訪視（例如： 第1、2、4及6訪視）時接受一個劑量之rLP2086疫苗或生 理鹽水。觀察到標準之接種疫苗操作，該疫苗未注射入血 管中。在上方三角肌中注射〇 . 5毫升以經由肌肉內途徑投 服rLP2086疫苗。經由肌肉內途徑將生理鹽水投予至上方 三角肌中。 A. 訪視1 在訪視1，第1天、第1次接種疫苗時，該受試者先抽 血，再接受疫苗接種。訪視1之抽血及第1次接種疫苗係在 同一天進行。接種疫苗前，從受試者收集血液樣本（約20 毫升）。在隨機分配至第1、2、3及4組之受試者方面，經 由肌肉內單次注射將0.5毫升rLP2 08 6疫苗投予至上方三角 肌中。在第5組之受試者方面，經由肌肉內單次注射將〇. 5 毫升之生理鹽水投予至上方三角肌中。 B. 訪視2 (訪視1後42至70天），第2次接種疫苗 在第1、2及3組方面，經由肌肉內單次注射將〇.5毫升 rLP2086疫苗投予至上方三角肌中。在第4及5組方面，經 由肌肉內單次注射將〇·5毫升之生理鹽水投予至上方三角 肌中》 C ·訪視3 (訪視2後2 8至4 2天），第2次接種疫苗後抽 血 從受試者收集血液樣本（約20毫升）。 -62- 201221138 D. 訪視4(訪視2後105至126天），第3次接種疫苗 在第2、4及5組方面，經由肌肉內單次注射將0.5毫升 rLP2086疫苗投予至上方三角肌中。在第1及3組方面，經 由肌肉內單次注射將〇.5毫升之生理鹽水投予至上方三角 肌中。 E. 訪視5 (訪視4後28至42天），第3次接種疫苗後抽 血 從受試者收集血液樣本（約20毫升）。 F. 訪視6(訪視4後161至175天），第4次接種疫苗 在訪視6時，該受試者先抽血，再接受疫苗接種。訪 視6之抽血及第4次接種疫苗係在同一天進行。接種疫苗前 ，從受試者收集血液樣本（約20毫升）。在第3及5組方面 ，經由肌肉內單次注射將0.5毫升rLP2086疫苗投予至上方 三角肌中。在第1、2及4組之受試者方面，經由肌肉內單 次注射將0.5毫升之生理鹽水投予至上方三角肌中。 G. 訪視7 (訪視6後28至42天），第4次接種疫苗後抽 血 從受試者收集血液樣本（約20毫升）。 致免疫性結果 此硏究之主要目的係以表達LP2086亞族A及B蛋白質 之MnB株進行，藉由SBA測量來評估60微克、120微克及 200微克rLP2086疫苗之致免疫性。 本硏究之第二個目的係藉由定量測定與rLP2086疫苗 -63- 201221138 亞族A及B蛋白質結合之Ig來評估60微克、120微克及200微 克rLP2086疫苗之致免疫性。 依表4所示，使用3種亞族A及3種亞族B株來評估SBA 活性。 表4 : SBA力價達到從第1次給藥前上升2 4倍之受試者的分析-πιΙΤΤ群 (硏究 6108A1-2001-WW/B1971005) 菌株 隨機分配之疫苗組 N* nb (%) (95%CIC) p_Valued 第2次給藥後1個月 亞族A菌株1 對照組 80 1(1-3) (0.0, 6.8) >0.9999 60微克rLP2086疫苗 18 16(88.9) (65.3, 98.6) 0.0007 120微克rLP2086疫苗 115 96(83.5) (75.4, 89.7) <0.0001 200微克rLP2086疫苗 106 93 (87.7) (79.9, 93.3) <0.0001 亞族B菌株1 對照組 84 0 (0.0) (0.0,4.3) >0.9999 60微克rLP2086疫苗 21 15(71.4) (47.8, 88.7) 0.0392 120微克rLP2〇86疫苗 121 72 (59.5) (50.2, 68.3) 0.0225 200微克rLP2086疫苗 114 68 (59.6) (50.1,68.7) 0.0244 第3次給藥後1個月 亞族A菌族1 對照組 73 4 (5.5) (1.5, 13.4) >0.9999 60微克rLP2086疫苗 19 17(89.5) (66.9, 98.7) 0.0004 120微克ΛΡ2086疫苗 111 103 (92.8) (86.3, 96.8) <0.0001 200微克rLP2086疫苗 100 94 (94.0) (87.4, 97.8) <0.0001 亞族B菌族1 對照組 79 1(1-3) (0.0, 6.9) >0.9999 60微克rLP2086疫苗 21 17(81.0) (58.1,94.6) 0.0036 120微克rLI>2086疫苗 112 97 (86.6) (78.9, 92.3) <0.0001 200微克rLP2086疫苗 105 89 (84.8) (76.4, 91.0) <0.0001 縮寫：CI =信賴區間;SBA =血清殺菌分析。 注意：該分析驗證支持亞族Α菌株1之定量下限(LLOQ) = 9且亞族Β菌株1 =】0 »高於LLOQ之 SBA力價被認爲準確且其定量數讎做報告。低於LLOQ或預示爲低於LLOQ之數値在分析時將 設爲 0.5*LLOQ。 力價達到界定水準之受試者的比例列於表5中。在此 兩種亞族方面，給予第3個劑量後達到界定之S B A力價水 準的受試者比例高於給予第2個劑量後。 -64 - 201221138 UUI%S6) ％ qU -M(JUI%S6) ％~CU^I(JUI%S6) ％„u eM~~0 % qs ~錄酲&繼迷 蠢S6) vas SOON 80s 枢藥 09 油I_11^1_ (soou6ia/AVAV_loo«s-IVooOI9iKia)&HIJ 日-1#誠g^ipp^-RvasNi^^r®細趣塱 Ϊ 婶w:!/>* (oodoo) 000 (寸·CNirnT)寸·ς S(sssozlu (Γ9Ζ.is) (rs6 νε8) (6·66 οίέ (8ΊΙΠ*6_εε) (9.6Δ η£9) (S *9.寸8) <n6 (ςτ/ΓΟ) η (S6 (寸.Sr500·£(N6 (loorrs) 001 i 〇6 (οβςεΓίο) 00o si L 06 ίεΓί.ο) 0.0 0 SI 606 (8νηε<ΝΌ) 0.0 on 9CS寸 6寸 sii (ς·εζ-ί5ε) ε.寸寸 rtNz,S3ΠI (S.88VO·寸卜)9rsi8 rl6SI SII (9·66η{;6) £·86 LL9 L9 66p.s/.fsr00$) 9.Ζ.9 6Ό6 06 66 (Γ86ν68)寸·ιη6 0.66 86 66 (sij 0Ό0Ι irs PS0I--"寸.89 Π 61 SI 8。1 „(έίζ/176 81 61 801 801 5li)卜寸6 8Ϊ 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第9圖：pH値、緩衝劑及蛋白質濃度對rLP2086亞族A 及B之結合程度的影響。 第10圖：不具有磷酸鋁之rLP2086調製劑的視覺外觀 〇 第11圖：2-8°C之外觀樣本的OD測量値。 第12圖：含有及不含有A1PCU之調製劑的亞族A之效力 結果。 第13圖：含有及不含有Α1Ρ〇4之調製劑的亞族B之效力 -73- 201221138 結果。 第14圖：在含有〇·5毫克/毫升鋁之rLP2086安慰劑中的 聚山梨酸酯80的結果。 第15圖：亞族A之聚山梨酸酯80的結果。 第16圖：亞族B之聚山梨酸酯80的結果。 第1 7圖：亞族B之效力與結合莫耳比之相關性。 第18圖：亞族A之莫耳比的結果。 第1 9圖：亞族B之莫耳比的結果。 第20圖：在4〇〇微克/毫升之濃度下的rLP2086調製劑 的莫耳比結果。 第21圖：rLP2086藥品在不同時間點之聚山梨酸酯80 的結果。 第22圖：rLP20 86藥品在不同時間點之結合莫耳比之 結果。 第23圖：亞族A之效力及結合莫耳比之結果。 第24圖：亞族B之效力及結合莫耳比之結果。 第25圖：亞族A與AlP〇4在琥珀酸鹽及組胺酸緩衝劑 中之結合。 第26圖：亞族B與AlP〇4在琥珀酸鹽及組胺酸緩衝劑 中之結合。 第27圖：在琥珀酸鹽、組胺酸及磷酸鹽緩衝劑中之結 合作用的比較。 第28圖：亞族A與AlP〇4之pH-依賴性結合。 第29圖：亞族B與AlP〇4之pH·依賴性結合。 -74-

Claims (1)

1. 201221138 ο 七、申請專利範圍： 1. —種包含1^2 08 6 (^8?)亞族8多肽之致免疫組成 物，該LP20 86 ( fHBP )亞族Β多肽係經調製，致使該 LP2 08 6 ( fHBP )亞族B多肽之效力可經時安定。 2. 如申請專利範圍第1項之致免疫組成物，其中至少 • 50%之該LP2086 ( fHBP )亞族B多肽的效力維持至少1個月 . 、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、9個月、12個月 、18個月' 24個月、30個月、36個月、42個月' 48個月、 54個月或60個月。 3. 如申請專利範圍第1項之致免疫組成物，其進一步 包含LP2086 (fHBP)亞族A多肽。 4 .如申請專利範圍第1項之致免疫組成物，其進一步 包含清淨劑。 5_—種包含清淨劑及LP2086 (fHBP)亞族B多肽之致 免疫組成物’該清淨劑對蛋白質之莫耳比係少於1 〇: 1。 6. 如申請專利範圍第1 - 5項中任一項之致免疫組成物， . 其中該清淨劑對蛋白質之莫耳比爲約0.5·· 1至約10:1。 7. 如申請專利範圍第6項之致免疫組成物，其中該清 淨劑對蛋白質之莫耳比爲約1 : 1至約5 : 1。 8. 如申請專利範圍第7項之致免疫組成物，其中該清 淨劑對蛋白質之莫耳比爲約1 . 4 : 1至約4.2 : 1。 9. 如申請專利範圍第8項之致免疫組成物，其中該清 淨劑對蛋白質之莫耳比爲約2.8 :1。 10. 如申請專利範圍第1-5項中任一項之致免疫組成物 -75- 201221138 ’其中該清淨劑之量係足以減少容器中與矽結合之多肽。 11.如申請專利範圍第ίο項之致免疫組成物，其中該 容器爲注射器或小瓶。 1 2 ·如申請專利範圍第1 - 5項中任一項之致免疫組成物 ，其中該清淨劑爲非離子性清淨劑。 1 3 ·如申請專利範圍第1 2項之致免疫組成物，其中該 清淨劑爲聚山梨酸酯清淨劑。 14.如申請專利範圍第13項之致免疫組成物，其中該 清淨劑爲聚山梨酸酯80。 1 5 ·如申請專利範圍第1 _ 5項中任一項之致免疫組成物 ，其進一步包含多價陽離子。 1 6 ·如申請專利範圍第丨5項之致免疫組成物，其中該 多價陽離子爲耗或銘。 1 7 .如申請專利範圍第丨6項之致免疫組成物，其中該 致免疫組成物包含（Ca)3(P〇4)2。 1 8 ·如申請專利範圍第1 6項之致免疫組成物，其中該 銘之濃度爲約0.1毫克/毫升至約1毫克/毫升。 1 9.如申請專利範圍第i 8項之致免疫組成物，其中該 鋁之濃度爲約0.5毫克/毫升。 2 0 .如申請專利範圍第！ 6項之致免疫組成物，其中該 組成物包含aipo4、ai(oh)3、Al2(S〇4)3及明礬之一或多者 〇 2 1 ·如申請專利範圍第！ _ 5項中任一項之致免疫組成物 ’其進一步包含組胺酸。 -76- 201221138 2 2 .如申請專利範圍第2 1項之致免疫組成物，其中該 組胺酸之濃度爲約2mM至約20mM。 23.如申請專利範圍第22項之致免疫組成物，其中該 組胺酸之濃度爲約5 m Μ至約1 5 m Μ。 2 4.如申請專利範圍第1-5項中任一項之致免疫組成物 ，其進一步包含琥珀酸鹽。 2 5.如申請專利範圍第24項之致免疫組成物，其中該 琥珀酸鹽之濃度爲約2mM至約10mM。 2 6.如申請專利範圍第25項之致免疫組成物，其中該 琥珀酸鹽之濃度爲約3mM至約7mM。 2 7.如申請專利範圍第25項之致免疫組成物，其中該 琥珀酸鹽之濃度爲約5 m Μ。 2 8 .如申請專利範圍第1 - 5項中任一項之致免疫組成物 ，其中pH値爲約5.0至約8.0。 29 ·如申請專利範圍第2 8項之致免疫組成物，其中pH 値爲約5 . 8至約6.0。 30.如申請專利範圍第29項之致免疫組成物，其中該 組胺酸之濃度爲約lOmM，pH 6.0。 3 1 ·如申請專利範圍第1 -5項中任一項之致免疫組成物 ，其中該組成物係經凍乾。 3 2 ·如申請專利範圍第3 1項之致免疫組成物，其中該 經凍乾之組成物係再懸浮於包含鋁之緩衝劑中。 3 3.如申請專利範圍第32項之致免疫組成物，其中該 緩衝劑包含aipo4、ai(oh)3、ai2(so4)3或明礬。 -77- 201221138 3 4 ·如申請專利範圍第1或5項之致免疫組成物，其中 該組成物包含莫耳比約2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、 0.5毫克/毫升爲Α1Ρ〇4形式之鋁、10niM組胺酸pH 6.0及150 mM氯化鈉。 3 5 .如申請專利範圍第1或5項之致免疫組成物，其中 該組成物實質上係由下列所組成：200微克/毫升LP2086 ( fHBP)亞族B多肽、莫耳比約2.8:1之聚山梨酸酯8〇:蛋白 質、0.5毫克/毫升爲Α1Ρ〇4形式之鋁、l〇mM組胺酸pH 6.0 及150mM氯化鈉。 3 6 ·如申請專利範圍第丨或5項之致免疫組成物，其中 該組成物實質上係由下列所組成：200微克/毫升rLP2086 (fHBP)亞族A多肽、200微克/毫升LP2086 (fHBP)亞族 B多肽、莫耳比約2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、〇.5毫克 /毫升爲AlP〇4形式之鋁、i〇mM組胺酸pH 6.0及150mM氯化 鈉。 3 7.如申請專利範圍第1或5項之致免疫組成物，其中 該組成物包含莫耳比約2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、 0.5毫克/毫升爲A1P04形式之鋁、5mM琥珀酸鹽pH 6.0及 1 5 0 m Μ氯化鈉。 3 8 .如申請專利範圍第1或5項之致免疫組成物，其中 該組成物實質上係由下列所組成：200微克/毫升LP2086 ( fHBP)亞族Β多肽、莫耳比約2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白 質、0.5毫克/毫升爲AlP〇4形式之鋁、5mM琥珀酸鹽pH 6.0 及1 5 0 m Μ氯化鈉。 -78- 201221138 3 9.如申請專利範圍第1或5項之致免疫組成物，其中 該組成物實質上係由下列所組成：200微克/毫升rLP2086 (fHBP)亞族A多肽、200微克/毫升LP2086 (fHBP)亞族 B多肽、莫耳比約2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、0.5毫克 /毫升爲Α1Ρ〇4形式之鋁、5mM琥珀酸鹽pH 6.0及150mM氯 化鈉。 40. —種用於安定致免疫組成物中LP2086 (fHBP)亞 族B多肽之效力之方法，該方法包含步驟（a)將LP2 086 ( fHBP )亞族B多肽以清淨劑對蛋白質之莫耳比爲約0.5:1至 約1 〇 : 1調製成組成物。 41. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該清淨劑對 蛋白質之莫耳比爲約1 : 1至約5 : 1。 42. 如申請專利範圍第4 1項之方法，其中該清淨劑對 蛋白質之莫耳比爲約1.4:1至約4.2:1。 43 .如申請專利範圍第42項之方法，其中該清淨劑對 蛋白質之莫耳比爲約2.8:1。 44.如申請專利範圍第40-43項中任一項之方法，其中 該清淨劑之量係足以減少容器中與矽結合之多肽。 4 5.如申請專利範圍第44項之方法，其中該容器爲注 射器或小瓶。 46. 如申請專利範圍第40-43項中任一項之方法，其中 該清淨劑爲非離子性清淨劑。 47. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該清淨劑爲 聚山梨酸酯清淨劑。 -79- 201221138 48. 如申請專利範圍第〇項之方法，其中該清淨劑爲 聚山梨酸酯80。 49. 如申請專利範圍第4〇_43項中任一項之方法，其中 該組成物進一步包含多價陽離子。 50·如申請專利範圍第49項之方法，其中該多價陽離 子爲鈣或鋁。 5 1 ·如申請專利範圍第5 0項之方法，其中該組成物包 含（Ca)3(P04)2。 52. 如申請專利範圍第50項之方法，其中該鋁之濃度 爲約0.1毫克/毫升至約1毫克/毫升。 53. 如申請專利範圍第52項之方法，其中該鋁之濃度 爲約0.5毫克/毫升。 54. 如申請專利範圍第50項之方法，其中該組成物包 含 aipo4、ai(oh)3、ai2(so4)3 或明礬。 55. 如申請專利範圍第40-43項中任一項之方法，其進 一步包含組胺酸。 5 6 ·如申請專利範圍第5 5項之方法，其中該組胺酸之 濃度爲約2mM至約20mM。 5 7 ·如申請專利範圍第5 6項之方法，其中該組胺酸之 濃度爲約5mM至約15mM。 58. 如申請專利範圍第40_43項中任一項之方法，其進 —步包含琥珀酸鹽。 59. 如申請專利範圍第58項之方法，其中該琥珀酸鹽 之濃度爲約2 m Μ至約1 0 m Μ。 s) -80- 201221138 6 0.如申請專利範圍第59項之方法，其中該琥珀酸鹽 之濃度爲約3 m Μ至約7 m Μ。 6 1 .如申請專利範圍第4 0 - 4 3項中任一項之方法，其中 t pH値爲約5.0至約8.0。 62. 如申請專利範圍第61項之方法，其中PH値爲約5.8 至約6.0。 63. 如申請專利範圍第62項之方法，其中該組胺酸之 濃度爲約10mM，pH6.0。 64. 如申請專利範圍第62項之方法，其中該琥珀酸鹽 之濃度爲約5mM，pH 6.0。 65. 如申請專利範圍第40-43項中任一項之方法，其進 一步包含步驟（b )將該致免疫組成物凍乾。 66. 如申請專利範圍第65項之方法，其進一步包含步 驟（c )將該經凍乾之組成物再懸浮於包含鋁之緩衝劑中 〇 67. 如申請專利範圍第66項之方法，其中該緩衝劑包 含 aipo4、A1(0H)3、Al2(S〇4)3 或明礬。 68·如申請專利範圍第40項之方法，其中該亞族B蛋白 質係經調製於實質上由下列所組成之組成物中：莫耳比約 2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、0.5毫克/毫升爲A1P04形 式之鋁、10mM組胺酸PH 6.0及150mM氯化鈉。 69.如申請專利範圍第40項之方法，其中該亞族B蛋白 質係經調製於實質上由下列所組成之組成物中：莫耳比約 2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、0.5毫克/毫升爲Α1Ρ〇4Β -81 - 201221138 式之鋁、5mM琥珀酸鹽pH 6.0及150mM氯化鈉。 70. —種用於安定致免疫組成物中LP2086 (fHBP)亞 族B多肽之效力之方法，該方法包含步驟（a)將LP2086 ( fH BP)亞族B多肽與約0.1毫克/毫升至約1毫克/毫升之鋁 且以清淨劑對蛋白質之莫耳比爲約0.5 : 1至約1 0 : 1調製成組 成物。 7 1 .如申請專利範圍第7 0項之方法，其中該清淨劑對 蛋白質之莫耳比爲約1 : 1至約5 : 1。 7 2.如申請專利範圍第7 1項之方法，其中該清淨劑對 蛋白質之莫耳比爲約1.4:1至約4.2:1。 7 3 .如申請專利範圍第7 2項之方法，其中該清淨劑對 蛋白質之莫耳比爲約2.8:1。 74. 如申請專利範圍第70-73項中任—項之方法，其中 該清淨劑之量係足以減少容器中與矽結合之多肽。 75. 如申請專利範圍第74項之方法，其中該容器爲注 射器或小瓶。 76. 如申§靑專利範圍第7〇_73項中任—項之方法，其中 該清淨劑爲非離子性清淨劑。 7 7.如申請專利範圍第76項之方法，其中該清淨劑爲 聚山梨酸酯清淨劑。 7 8.如申請專利範圍第77項之方法，其中該清淨劑爲 聚山梨酸酯80。 79_如申請專利範圍第70_73項中任—項之方法，其中 該iS之濃度爲約0·5毫克/毫升。 201221138 80.如申請專利範圍第70-73項中任一項之方法，其中 該組成物包含aipo4、ai(oh)3、ai2(so4)3或明礬。 8 1.如申請專利範圍第70-73項中任一項之方法，其進 一步包含組胺酸。 82.如申請專利範圍第81項之方法，其中該組胺酸之 濃度爲約2mM至約20mM。 8 3.如申請專利範圍第82項之方法，其中該組胺酸之 濃度爲約5 m Μ至約1 5 m Μ。 84. 如申請專利範圍第70-73項中任一項之方法，其進 一步包含琥珀酸鹽。 85. 如申請專利範圍第84項之方法，其中該琥珀酸鹽 之濃度爲約2mM至約10mM。 86. 如申請專利範圍第85項之方法，其中該琥珀酸鹽 之濃度爲約3mM至約7mM。 87. 如申請專利範圍第70-73項中任一項之方法，其中 pH値爲約5.0至約8.0。 88. 如申請專利範圍第87項之方法，其中pH値爲約5.8 至約6.0 。 89. 如申請專利範圍第88項之方法，其中該組胺酸之 濃度爲約10mM，pH6.0。 9 0.如申請專利範圍第70-73項中任一項之方法，其進 一步包含步驟（b)將該致免疫組成物凍乾。 91.如申請專利範圍第90項之方法，其進一步包含步 驟（c )將該經凍乾之組成物再懸浮於包含鋁之緩衝劑中。 -83- 201221138 9 2 .如申§靑專利範圍第9 1項之方法’其中該緩衝劑包 含 AlP〇4、Al(OH)3、Al2(S〇4)3或明礬。 93. 如申請專利範圍第70項之方法，其中該亞族B蛋白 質係經調製於實質上由下列所組成之組成物中：莫耳比約 2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、0.5毫克/毫升爲AlP〇4B 式之鋁、10mM組胺酸pH 6.0及150mM氯化鈉。 94. 如申請專利範圍第70項之方法，其中該亞族B蛋白 質係經調製於實質上由下列所組成之組成物中：莫耳比約 2.8:1之聚山梨酸酯80:蛋白質、0.5毫克/毫升爲AlP〇4形 式之鋁、5mM琥珀酸鹽pH 6.0及150mM氯化鈉》 95·—種用於測定致免疫組成物中2086 ( fHBP )多肽 之效力之方法，該方法包含以下步驟：（1)將第一單株 抗體及第二單株抗體與包含2086蛋白質之致免疫組成物一 起培育，其中該第一單株抗體係與用於捕捉該單株抗體之 第一標籤共軛結合，且該第二單株抗體係與可偵測之第二 標籤共軛結合，其中該第一和第二單株抗體係針對2〇86參 考蛋白質上不同構形的抗原決定部位；（2)使用該第一 標籤捕捉該與第一單株抗體結合之20 8 6蛋白質；及（3 ) 使用該第二標籤偵測並定量該經捕捉之與第二單株抗體結 合之2086蛋白質的量。 96. 如申請專利範圍第95項之方法，其中該第一標籤 爲生物素、GST、6xHis標籤或小珠。 97. 如申請專利範圍第96項之方法，其中該小珠爲羧 基化聚苯乙烯小珠或順磁性小珠。 ⑧ -84- 201221138 98. 如申請專利範圍第96項之方法，其中該第一標籤 係以鏈黴抗生物素蛋白小珠 '鏈黴抗生物素蛋白管柱、麩 胱甘肽小珠、麩胱甘肽管柱、鎳小珠、鎳管柱、離心或磁 場捕捉。 99. 如申請專利範圍第95-98項中任一項之方法，其中 該第二標籤爲生物素、HRP、螢光團或放射線標記。 10 0.如申請專利範圍第99項之方法，其中該第二標籤 係以與螢光團或HRP共軛結合之鏈黴抗生物素蛋白藉由電 化學發光、偵測螢光或偵測放射線活性進行偵測。 10 1.如申請專利範圍第9 5 -98項中任一項之方法，其中 該2086多肽爲亞族A多肽。 10 2.如申請專利範圍第9 5 -9 8項中任一項之方法，其中 該2086多肽爲亞族B多肽。 103. 如申請專利範圍第9 5 -98項中任一項之方法，其中 該2086多肽係經脂質化。 104. 如申請專利範圍第9 5 -98項中任一項之方法，其中 該20 86多肽未經脂質化。 105. 如申請專利範圍第95-98項中任一項之方法，其中 該2 0 8 6多肽爲重組多肽。 106. 如申請專利範圍第95-98項中任一項之方法，其中 該具有可被兩種抗體辨識之抗原結合部位的多肽可被定量 〇 1〇7·如申請專利範圍第9 5 -98項中任一項之方法，其中 將樣本之效力與參考物質之效力相比較。 -85 -