TEKNIK ALAN Mevcut bulus, insan distrofin geninde ekzon 51,in atlanmasina neden olan bir antisens oligomeri ve 01i gomeri içeren bir farmasötik bilesim ile ilgilidir. TEKNIGIN ALT YAPISI Duchenne kas distrofisi (DMD), yaklasik 3500 yeni dogan erkekten birini etkileyen kalitsal ilerleyici kas distrofisinin en sik görülen formudur. Her ne kadar motor fonksiyonlar bebeklik ve çocukluk döneminde saglikli insanlardan nadiren farkli olsa da, yaklasik 4-5 yas arasi çocuklarda kas zayifligi görülür. Daha sonra kas zayifligi, yaklasik 12 yasinda ambulasyon kaybina ve yirmili yaslarda kardiyak veya solunum yetmezligine bagli ölümlere dogru ilerler. DMD bu türlü ciddi bir hastaliktir. Hali hazirda, mevcut DMD için etkili bir terapi mevcut degildir ve yeni bir terapötik ajan gelistirilmesi siddetle arzu edilmektedir. DMD'nin distrofin genindeki bir mutasyondan kaynaklandigi bilinmektedir. Distrofin geni, X kromozomunda bulunur ve 2.2 milyon DNA nükleotid çiftinden olusan büyük bir gendir. DNA, mRNA öncülerine kopyalanir ve intronlar, 79 ekzonun bir araya getirildigi 1 1,058 baz mRNA'sini sentezlemek için uçbirlestime ile çikarilir. Bu mRNA, distrofin proteinini üretmek için 3,685 amino aside çevrilir. Distrofin proteini, kas hücrelerinde membran stabilitesinin korunmasi ile iliskilidir ve kas hücrelerinin daha az kirilgan hale gelmesi için gereklidir. DMD hastalarindan gelen distrofin geni bir mutasyon içerir ve bu nedenle kas hücrelerinde fonksiyonel olan distrofin proteini nadiren eksprese edilir. Bu nedenle, kas hücrelerinin yapisi DMD'li hastalarin vücudunda muhafaza edilemez, bu da büyük miktarda kalsiyum iyonunun kas hücrelerine akmasina neden olur. Sonuç olarak, için fibrozu tesvik etmek için entlamasyon benzeri bir yanit olusur, böylece kas hücreleri zorlukla yeniden üretilebilir. Becker müsküler distrofisine (BMD) de distrofin genindeki bir mutasyon neden olur. Semptomlar, kas atrofisinin eslik ettigi kas zayifligini içerir, ancak DMD ile karsilastirildiginda kas zayifliginin ilerlemesi tipik olarak hafif ve yavastir. Çogu durumda, baslangici yetiskinliktedir. DMD ve BMD arasindaki klinik semptomlardaki farkliliklarin, distrofin mRNA'sinin distrofin proteinine dönüstürülmesinde amino asitler için okuma çerçevesinin mutasyon tarafindan bozulup bozulmadigi tespit edilmistir (Patent Disi Belge 1). Daha spesifik olarak, DMD'de mutasyonun varligi, amino asit okuma çerçevesini kaydirir, böylece fonksiyonel distrofin proteininin ekspresyonunu ortadan kaldirilir, oysa BMD'de, amino asit okuma çerçevesi korunurken kusurlu olsa da islev gören distrofin proteini üretilirken ekzonlarin bir bölümü mutasyonla silinir. Ekzon atlamanin, DMD tedavisinde bir yöntem olarak hizmet etmesi beklenmektedir. Bu yöntem, distrofin mRNA'nin amino asit okuma çerçevesini geri kazanmak ve kismen geri kazanilmis fonksiyona sahip distrofin proteininin ekspresyonunu saglamak için atlamayi modifiye etmeyi içerir (Patent Disi Belge 2). Ekzon atlama için bir hedef olan amino asit dizisi bölümü kaybolacaktir. Bu nedenle, bu tedavi ile eksprese edilen distrofin proteini normal olandan daha kisa hale gelir, ancak amino asit okuma çerçevesi korundugu için, kas hücrelerini stabilize etme islevi kismen korunur. Sonuç olarak, ekzon atlamanin DMD`yi daha hafif olan BMD'nin semptomlarina benzer semptomlara götürmesi beklenmektedir. Ekzon atlama yaklasimi fareler veya köpekler kullanilarak yapilan hayvan testlerinden geçmistir ve hali hazirda insan DMD hastalari üzerindeki klinik deneylerde degerlendirilmektedir. Bir ekzonun atlanmasi, 5' veya 3' yapisma bölgesini veya her iki bölgeyi veya ekzon-iç bölgelerini hedefleyen antisens nükleik asitlerin baglanmasiyla indüklenebilir. Bir ekzon, sadece her iki ek bölgesi spliceosome kompleksi tarafindan tanindiginda mRNA'ya dahil edilecektir. Böylece ekzon atlama, ekleme bölgelerini antisens nükleik asitlerle hedefleyerek indüklenebilir. Ayrica, bir SR proteininin bir ekzonik yapisma arttiriciya (ESE) baglanmasi, bir ekzonun, yapisma mekanizmasi tarafindan taninmasi için gerekli kabul edilir. Buna göre ekzon atlama, ESE'yi hedef alarak da uyarilabilir. Distrofin geninin bir mutasyonu, DMD hastalarina bagli olarak degisebildiginden, antisens nükleik asitlerinin, ilgili genetik mutasyonun yeri ya da tipine göre tasarlanmasi gerekir. Geçmiste, 79 ekzon için ekzon atlama islemini uyaran antisens nükleik asitler, Steve Wilton, et al., University of Western Australia (Patent Disi Belge 3) tarafindan üretildi ve 39 ekzon atlamasi için ekzon atlamayi indükleyen antisens nükleik asitler Annemieke Aartsma-Rus, et al., Netherlands (Patent Disi Belge 4) tarafindan üretilmistir. Tüm DMD hastalarinin yaklasik %l3`ünün ekzon 51 atlanarak tedavi edilebilecegi düsünülmektedir (bundan böyle "ekzon 51" olarak anilacaktir). Son yillarda, distrofin geninde ekzon 51'in ekzon atlama için hedeflendigi çalismalarda çok sayida arastirma kurulusu bildirilmistir (Patent Belgeleri 1 ila 7; Patent Disi Belgeler 5 ila 6). Bununla birlikte, ekzon 51'in yüksek verimle atlanmasi için bir morfolin alt birimi içeren bir antisens bilesigi tarif ederken, distrofin 45 veya ekzon 51'in en az bir ekzonik yapisma arttiricisi ile hibritlesebilen küçük bir nükleer RNA'yi (snRNA) kodlayan bir nükleik asidi tarif 02265-P-0001 ÖNCEKI TEKNIKLE ILGILI BELGELER Patent Belgesi Patent Disi Belge 3: Wilton S. D., e t a1., Molecular Therapy 2007: 15: p. 1288-96 Patent Disi Belge 4: Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12: 571-877 BULUSUN AÇIKLAMASI BULUS TARAFINDAN ÇÖZÜLECEK SORUNLAR Yukarida belirtilen sartlar altinda, yüksek verimli bir distrofin geninde ekzon 51 "i atlamayi indükleyen antisens oligomerleri ve bu oligomerlerini içeren kas distrofi terapötikleri arzu edilmektedir. 02265-P-0001 SORUNU ÇÖZMEK IÇIN ARAÇLAR Yukaridaki belgelerin teknik içeriginin ve distrofin geninin yapisinin detayli incelemelerinin bir sonucu olarak, mevcut bulus sahipleri SEQ ID NO: 1 ve 2 ile temsil eden nükleotid dizilerine sahip olan antisens oligomerinin uygulanmasiyla ekzon 51 atlamanin yüksek bir verimlilikle indüklenebilecegini bulmuslardir. Bu bulguya dayanarak, mevcut bulus sahipleri bu bulusu gerçeklestirmistir. Diger bir deyisle, mevcut bulus asagidaki gibidir. (a) SEQ ID NO: 1 veya 2'nin bir nükleotid dizisini içeren bir antisens oligomeri; (b) SEQ ID NO: 1 veya 2'nin nükleotid dizisinde 1 ila 5 nükleotidin delesyonu, sübstitüsyonu, insersiyonu ve/veya eklenmesine sahip bir nükleotid dizisinden olusan ve insan distrofin genindeki 51'inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip bir antisens oligomeri; (c) SEQ ID NO: 1 veya 2'nin nükleotid dizisi ile en az %80 özdeslige sahip bir nükleotid dizisine sahip olan ve insan distrofin geninde 51'inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip olan bir antisens oligomeri; ve (d) SEQ ID NO: 1 veya 2'nin nükleotid dizisini tamamlayan bir nükleotid dizisinden olusan bir oligonükleotidi siki sartlar altinda hibritleyen ve insan distrofin geninde 51'inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip olan bir antisens oligomeri. 02265-P-0001 (e) SEQ ID NO: 1 veya 2'nin nükleotid dizisinden olusan bir antisens oligomeri; (I) SEQ ID NO: 1 veya 2'nin nükleotid dizisinde 1 ila 3 nükleotidin delesyonu, sübstitüsyonu, insersiyonu ve/Veya eklenmesine sahip bir nükleotid dizisinden olusan ve insan distrofin genindeki Slsinci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip bir antisens oligomeri; (g) SEQ ID NO: 1 veya 2`nin nükleotid dizisi ile en az %80 özdeslige sahip bir nükleotid dizisinden olusan ve insan distrofin geninde 51'inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip olan bir antisens oligomeri; ve (h) SEQ ID NO: 1 veya 2`nin bir nükleotid dizisini tamamlayan bir nükleotid dizisinden olusan bir oligonükleotidi yüksek sert sartlar altinda hibritleyen ve insan distrofin geninde 51'inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip olan bir antisens oligomeri. (i) SEQ ID NO: 1 veya 2'nin bir nükleotid dizisinden olusan bir antisens oligomeri; ve G) SEQ ID NO: 1 veya 2'nin nükleotid dizisi ile en az %90 özdeslige sahip bir nükleotid dizisine sahip olan ve insan distrofin geninde 5 1 'inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip olan bir antisens oligomeri. olup, bir oligonükleotidtir. oligonükleotidi olusturan en az bir nükleotidin seker molekül bölümü ve/veya fosfat baglayici bölgesi modifiye edilmistir. 02265-P-0001 oligonükleotidi olusturan en az bir nükleotidin seker molekül bölümü, içinde 2'-OH grubunun OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NRz, N3, CN, F, C1, Br ve Iadan (burada R, bir alkil veya bir arildir ve R' bir alkilendir) olusan gruptan seçilen herhangi biri ile degistirildigi bir ribozdur; olup, burada oligonükleotidi olusturan en az bir nükleotidin fosfat baglayici bölgesi, bir fosforoditioat bagi, bir fosforotiyoat bagi, bir fosforoditioat bagi; bir alkilfosfonat bagi, bir fosforarnidat bagi ve bir boranofosfat bagidir. olup, bir morfolin oligomeridir. halkasi molekül bölümü, fosfat baglayici bölge, morfolin oligomeri olusturan en az bir morfolinonun, 3'-uç ve/veya 5'-ucu modifiye edilir. morfolin oligomeri olusturan en az bir morfoline ait fosfat baglayici bölge, bir fosforodiamidat bagi, bir fosforotiyoat bagi, bir fosforoditioat bagi, bir alkilfosfonat bagi, bir fosforamidat bagi ve bir boranofosfat bagidir. morfolin oligomeridir. antisens oligomeri olup, burada 5' uç asagidaki (1) ila (3) arasindaki kimyasal formüllerden herhangi biridir: EN.j OVNH r`iJ »CHJ N .CH-, 0-? N O"lî' N`CH› 1 ' 2 . 3 I 02265-P-0001 olarak yukaridaki [1] ila [12]'den herhangi birine göre bir antisens oligomeri veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzu veya hidratini içerir. kabul edilebilir bir tasiyici içerir. hastaya yukarida [1] ila [12]'den herhangi birine göre antisens oligomerinin veya yukaridaki [13] veya [14]'e göre farmasötik bilesim uygulanmasini içerir. hasta bir insandir. göre, kas distrofisinin tedavisi için farmasötik bilesimin üretiminde kullanimidir. arasindakilerden herhangi birine göre antisens 01i gomeridir. olan bir hastadir. bir insandir. BULUSUN ETKILERI Mevcut bulusa ait antisens oligomeri, insan distrofin geninde ekzon 51,in atlanmasini yüksek verim ile indükleyebilir. Ayrica, Duchenne kas distrofisi 02265-P-0001 semptomlari, mevcut bulusa ait farmasötik bilesim uygulanarak etkin bir sekilde hafifletilebilir. ÇIZIMLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, insan rabdomiyosarkom hücre hattinda (RD hücreleri) insan distrofin geninde ekzon 51'in atlama etkinligini göstermektedir. BULUSU GERÇEKLESTIRME MODU Bundan böyle, mevcut bulus ayrintili olarak açiklanmaktadir. Asagida tarif edilen uygulamalarin sadece bulusu tarif etmek için örnek yoluyla sunulmasi amaçlanmistir, ancak sadece asagidaki uygulamalarla sinirli degildir. Mevcut bulus, bulusun özünden ayrilmadan çesitli formlarda uygulanabilir. l. Antisens oligomeri Mevcut bulus, insan distrofin geninde ekzon 51'in yüksek verimle atlanmasini saglayan antisens oligomerini (bundan böyle "mevcut bulusa ait antisens oligomeri" olarak anilacaktir) saglar. Mevcut bulusta "gen" terimi, bir genomik gen anlamina gelir ve ayrica cDNA, mRNA öncüsü ve mRNA içerir. Tercihen gen, mRNA öncüsüdür, yani pre- mRNA'dir. Insan genomunda, insan distrofin geni, Xp2l.2 lokusunda bulunur. Insan distrofin geninin 2.2 milyon nükleotid çifti büyüklügündedir ve bilinen insan genleri arasinda en büyük gendir. Bununla birlikte, insan distrofin geninin kodlama bölgeleri, insan distrofin geni boyunca 79 ekzon olarak dagitilan 02265-P-0001 distrofin geninin transkripti olan pre-mRNA, 14 kb'lik olgun mRNA üretmek için yapismaya tabi tutulur. Insan yabani tipli distrofin geninin nükleotid dizisi bilinmektedir (GenBank Erisim No. NM_004006). Insan yabani tipli distrofin geninde ekzon 5 1 'in nükleotid dizisi SEQ ID NO: 3 ile temsil edilmektedir. Mevcut bulusa ait antisens oligomeri, insan distrofin geninde ekzon 51'in atlanmasini saglamak, böylece DMD tip distrofin geni tarafindan kodlanan proteini BMD tip distrofin proteini içine modifiye etmek için tasarlanmistir. Buna göre, antisens oligomeri tarafindan atlanma hedefi olan distrofin genindeki ekzon 51, hem yabani hem de mutant tiplerini içerir. Mevcut bulusa ait antisens oligomeri, spesifik olarak, asagidaki (a) ila (d)'den olusan bir gruptan seçilen antisens oligomeridir. oligomeri; (b) SEQ ID NO: 1 veya 2'nin nükleotid dizisinde 1 ila 5 nükleotidin delesyonu, sübstitüsyonu, insersiyonu ve/veya eklenmesine sahip bir nükleotid dizisinden olusan ve insan distrofin genindeki 51"inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip bir antisens oligomeri; (c) SEQ ID NO: 1 veya 2'nin nükleotid dizisi ile en az %80 özdeslige sahip bir nükleotid dizisine sahip olan ve insan distrofin geninde 51'inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip olan bir antisens oligomeri; ve (d) SEQ ID NO: 1 veya 2'nin nükleotid dizisini tamamlayan bir nükleotid dizisinden olusan bir oligonükleotidi siki sartlar altinda hibritleyen ve 02265-P-0001 insan distrofin geninde 51`inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip olan bir antisens oligomeri. (b) ila (d)'nin antisens oligomerleri, özellikle (a)'nin antisense oligomerinin mutantlaridir ve örnegin hastalarin distrofin geninin mutasyonlarina, örnegin polimorfizme karsilik gelmesi amaçlanir. Baska bir uygulama olarak, mevcut bulusa ait antisens oligomeri, spesifik olarak asagidaki (k) ila (n)'den olusan bir gruptan seçilen antisens oligomeridir. (k) SEQ ID NO: 6 ila 33'ten herhangi biri ile gösterilen nükleotid dizisini (1) SEQ ID NO: 6 ila 33'ten herhangi biri ile gösterilen nükleotid dizisinde 1 ila 5 nükleotidin delesyonu, sübstitüsyonu, insersiyonu ve/veya eklenmesine sahip bir nükleotid dizisinden olusan ve insan distrofin genindeki 51,inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip bir antisens oligomeri; (m) SEQ ID NO: 6 veya 33'ün nükleotid dizisi ile en az %80 özdeslige sahip bir nükleotid dizisine sahip olan ve insan distrofin geninde 51'inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip olan bir antisens oligomeri; ve (n) SEQ ID NO: 6 veya 33'ün nükleotid dizisini tamamlayan bir nükleotid dizisinden olusan bir oligonükleotidi siki sartlar altinda hibritleyen ve insan distrofin geninde 51`inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip olan bir antisens oligomeri. (1) ila (n)'nin antisens oligomerleri, özellikle (k)'nin antisens oligomerinin mutantlaridir ve örnegin hastalarin distrofin geninin mutasyonlarina, örnegin polimorfizme karsilik gelmesi amaçlanir. Ayrica, mevcut bulusa ait antisens oligomeri, asagidaki (0) ila (r)'den olusan bir gruptan seçilen antisens oligomeridir. 02265-P-0001 (o) SEQ ID NO: 6 veya 33'ün nükleotid dizisinden olusan bir antisens oligomeri; (p) SEQ ID NO: 6 veya 33'ün nükleotid dizisinde 1 ila 3 nükleotidin delesyonu, sübstitüsyonu, insersiyonu ve/veya eklenmesine sahip bir nükleotid dizisinden olusan ve insan distrorin genindeki Slsinci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip bir antisens oligomeri; (q) SEQ ID NO: 6 veya 33'ün nükleotid dizisi ile en az %80 özdeslige sahip bir nükleotid dizisinden olusan ve insan distrofin geninde 51'inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip olan bir antisens oligomeri; ve (r) SEQ ID NO: 6 veya 33'ün bir nükleotid dizisini tamamlayan bir nükleotid dizisinden olusan bir oligonükleotidi yüksek sert sartlar altinda hibritleyen ve insan distrofin geninde 51'inci ekzonun atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip olan bir antisens oligomeri. Ayrica, mevcut bulusa ait antisens oligomeri, asagidaki (i) ve G) 'den olusan bir gruptan seçilen antisens oligomeridir: (i) SEQ ID NO: 6 ila 33'ten herhangi birinin nükleotid dizisinden olusan bir antisens oligomeri; veya (i) SEQ ID NO: 6 ila 33'ten herhangi birinin nükleotid dizisine sahip en az geninde ekzon 51`in atlanmasini saglayacak bir aktiviteye sahip olan bir antisens oligomeri. Burada kullanildigi haliyle, "siki sartlar altinda hibritlenen antisens oligomeri" terimi, örnegin, koloni hibridizasyonu, plak hibridizasyonu, Southern hibridizasyonu veya benzerleri tarafindan, örnegin SEQ ID NO: l'in nükleotid dizisini tamamlayan bir nükleotid dizisinden olusan oligonükleotidi tamamen veya bir kismini bir prob olarak kullanarak elde edilen bir antisens oligomeri anlamina gelmektedir. Kullanilabilecek hibridizasyon yöntemi, örnegin, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold 02265-P-0001 Spring Harbor, Laboratory Press 2001," "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997" vb.°de açiklanmaktadir. Burada kullanildigi haliyle, "siki sartlar" terimi, düsük siki sartlar, orta siki sartlar veya yüksek siki sartlar arasinda olabilmektedir. "Düsük siki sart" terimi, örnegin, 5x SSC, 5x Denhardt çözeltisi, %05 SDS, 32 °C`de %50 formamiddir. "Orta siki kosul" terimi, örnegin, 5x SSC, 5x Denhardt çözeltisi, %05 SDS, 42 °C`de %50 formamiddir. "Yüksek siki sart" terimi, örnegin, (1) 5x SSC, 5x Denhardt 01)( SSC, 65 °C'de %01 SDS,dir, ancak bunlarla sinirli degildir. Bu sartlar altinda, yüksek homolojiye sahip antisens oligomerinin, yüksek sicakliklarda verimli bir sekilde elde edilmesi beklenir, bununla birlikte, sicaklik, prob konsantrasyonu, prob uzunlugu, iyonik kuvvet, zaman, tuz konsantrasyonu ve digerleri dahil olmak üzere hibridizasyon katiligina birden fazla faktör dahil edilir. Bu teknik benzer sikiliga ulasmak için yaklasik olarak bu faktörleri seçebilir. Ticari olarak temin edilebilir kitler hibridizasyon için kullanildiginda, örnegin, bir Alkphos Dogrudan Etiketleme ve Algilama Sistemi (GE Healthcare) kullanilabilir. Bu durumda, ekli protokole göre, gece boyunca etiketli bir sonda ile ekimden sonra, membran 55 °C'de %01 (w/v) SDS içeren bir birincil yikama tamponu ile yikanir, böylece hibritlestirilmis antisens oligomeri tespit edilir. Alternatif olarak, prob, SEQ ID NO: 3 nükleotid dizisinin tamamlayici dizisinin tamamina veya bir kismina dayanan bir probun üretilmesinde ticari olarak temin edilebilir bir reaktif (örnegin Bir PCR Etiketleme Karisimi (Roche Diagnostics), vb.) kullanilarak digoksijen ile (DIG) etiketlendiginde, hibridizasyon bir DIG N ükleik Asit Tayin Kiti (Roche Diagnostics) ile tespit edilebilir. Yukarida tarif edilen antisens oligomere ek olarak, hibritlenebilen diger antisens oligomeri, varsayilan parametreleri kullanarak PASTA ve BLAST gibi homoloji 02265-P-0001 arama yazilimi tarafindan hesaplandigi gibi, SEQ ID NO: 1 veya 2'nin nükleotid dizisi ile %90 veya daha yüksek, %91 veya daha yüksek, %92 veya daha yüksek, içerir. veya daha yüksek, %96 veya daha yüksek, %97 veya daha yüksek, %98 daha yüksek ve 99.9 veya daha yüksek özdeslige sahip antisens oligomerleri Nükleotid dizileri arasindaki özdeslik, Karlin ve Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA Tarafindan Lokal Hizalama Arama Araci) kullanilarak belirlenebilir. BLAST algoritmasina dayali blastn, blastx, tblastn ve tblastx isimli programlar gelistirilmistir (Altschul dizildiginde, parametreler örnegin skor = 100 ve kelime uzunlugu : 12'dir. BLAST ve Gapped BLAST programlari kullanildiginda, her program için varsayilan parametreler kullanilir. ait antisens oligomerinin, insan distrofin geninin transkriptin ekzon 51"ine (örnegin pre-mRNA) karsilik gelen bölgeye baglanmasi ile kastedilmektedir, örnegin, ekzon 53'ün 5' ucuna karsilik gelen nükleotid dizisi, transkript yapismasina maruz kaldiginda ekzon 52'nin delesyonu ile DMD hastalarinda ekzon 50'nin 3' ucuna karsilik gelen nükleotid dizisine yapisir, böylece kodon çerçeve kaymasi olmaksizin matür mRN A olusumu ile sonuçlanir. Burada yukarida tarif edilen "baglanma" terimi, mevcut bulusa ait antisens oligomeri insan distrofin geninin transkriptiyle karistirildiginda, her ikisinin de çift Zincirli bir nükleik asit olusturmak için fizyolojik sartlar altinda hibritlendigi 02265-P-0001 anlamina gelir. "Fizyolojik sartlar altinda" terimi, in vivo ortam, pH, tuz bilesimi ve sicaklik olarak taklit edilmek üzere ayarlanan sartlari belirtir. Sartlar örnegin sodyum klorür konsantrasyonudur. Insan distrofin geninde ekzon 51'in atlanmasinin saglanip saglanmadigi, mevcut bulusun antisens oligomeri bir distrofin ekspresyon hücresine (örnegin insan rabdomiyosarkom hücreleri) dahil edilerek, insan distrofin geninin mRNA'sinin 51 ekzonunu çevreleyen bölgenin, RT-PCR ile distrofin ekspresyon hücresinin toplam RNA'sindan amplifiye edilmesi ve PCR ile amplifiye edilmis ürün üzerinde yuvalanmis PCR veya dizi analizi yapilmasi ile onaylanabilir. Atlama etkinligi asagidaki gibi belirlenebilir. Insan distrofin geni için mRNA, test hücrelerinden toplanir; mRNA'da, ekzon 51`in atlandigi bandin "A" polinükleotid seviyesi ve ekzon 51'in atlanmadigi bandin polinükleotid seviyesi "B" ölçülür. Bu Atlama etkinligi (%) : A/(A+B) X 100 Tercihen, mevcut bulusa ait antisens oligomeri, %10 veya daha yüksek, %20 veya ve %90 veya daha yüksek verime sahip ekzon 51"in atlanmasini saglar. Atlamanin basvurulabilir. Mevcut bulusun antisens oligomeri, örnegin, 16 ila 35 nükleotid uzunluga sahip bir oligonükleotid, morfolin oligomer veya peptit nükleik asit (PNA) içerir. oligomerler tercih edilir. 02265-P-0001 Yukarida tarif edilen oligonükleotid (bundan böyle "mevcut bulusa ait oligonükleotidi" olarak anilacaktir), kurucu birimler olarak nükleotidlerden olusan mevcut bulusa ait antisens oligomeridir. Bu nükleotidler, herhangi bir ribonükleotid, deoksiribonükleotid ve modifiye nükleotid olabilir. Modifiye edilmis nükleotid, ribonükleotidi veya deoksiribonükleotidi olusturan tamamen veya kismen modifiye edilmis nükleobazlara, seker molekül bölümlerine ve/veya fosfat baglayici bölgelere sahip olanlari belirtir. Mevcut bulusta, nükleobaz, örnegin, adenin, guanin, hipoksantin, sitozin, timin, urasil ve bunlarin modifiye edilmis bazlarini içerir. Bu gibi modifiye edilmis bazlarin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, psödoürasil, 3- metilürasil, dihidrourasil, 5-alkilsitosinler (Örnegin 5-metilsitosin), 5-a1kilorasiller (örnegin, 5-etülorasil), 5-halourasiller (5-bromoürasil), 6-azapirimidin, 6- alkilpirimidinler (6-metilürasil), 2-ti0urasil, 4-ti0urasil, 4-asetilsitozin, 5- (karboksihidroksimetil)urasi1, 5'-karb0ksimetil-2-tiorasil, 5-karb0ksimetil-2- tiourasil l-metilhitoksantin, 2,2-dimetilguanin, 3-metilsitosin, 2-metilamin0den, 2-metilguanin, N6-metiladenin, 7-metilguanin, 5-metoksiaminometil-2-ti0urasil, -metilaminometilurasil, 5-metilkarbonilmetilürasil, 5-metilasiilasil, 5-metil-2- tiourasil, 2-metiltio-N6-izopenteniladen, uracil-S-oksi, 2-0ksi, 2-0ksiasit, 2- tiolasetik , 6-diaminopurin, 2-amin0purin, izoguanin, indol, imidazol, ksantin, vb. Seker molekül bölümünün modifikasyonu, örnegin, ribozun 2'-pozisyonundaki modifikasyonlari ve sekerin diger pozisyonlarindaki modifikasyonlari içerebilir. Ribozun 2'-pozisyonundaki modifikasyon, 2'-OH ribozun OR, R, R'OR, SH, SR, NHz, NHR, NR-z, N3, CN, F, Cl, Br veya 1 ile degistirilmesini içerir, burada R, bir alkil veya bir arili temsil eder ve R', bir alkileni temsil eder. Sekerin diger pozisyonlari için modifikasyon, , örnegin LNA (kilitli nükleik asit) veya ENA (2'-O, 4`-C-etilen köprülü nükleik asitler), ancak bunlarla sinirli 02265-P-0001 olmayan, sekerin 2' ile 4' pozisyonlari arasinda köprüleme yaparak, örnegin O'nun ribozun 4` pozisyonunda veya deoksiribozun S ile degistirilmesini içerir. Fosfat baglanma bölgesinin bir modifikasyonu, örnegin, fosfodiester baginin fosforotiyoat bag, fosforoditiyoat bag, alkil fosfonat bag, fosforoamid bag, veya boranofosfat bag ile degistirilmesini içerir (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Bu bulusta, alkil tercihen 1 ila 6 karbon atomuna sahip düz veya dallanmis bir alkildir. Spesifik örnekler metil, etil, n-propil, izopropil, n-bütil, izobütil, sec- butil, terr-bütil, n-pentil, izopentil, neopentil, tert-pentil, n-heksil ve izoheksildir. Alkil istege bagli olarak ikame edilebilir. Bu gibi sübstitüentlere örnekler bir halojen, bir alkoksi, siyano ve nitrodur. Alkil, 1 ila 3 sübstitüent ile sübstitüe edilebilir. Spesifik örnekler arasinda siklopentil, sikloheksil, sikloheptil, sikloositil, siklodesil ve siklododesil bulunur. Bu bulusta, halojen flor, klor, brom ve iyot içerir. Alkoksi, metoksi, etoksi, n-propoksi, izopropoksi, n-butoksi, izobutoksi, sec- butoksi, tert-butoksi, n-pentiloksi, izopentiloksi, n-heksiloksi, izoheksiloksi, vb gibi 1 ila 6 karbon atomuna sahip düz veya dallanmis bir alkoksidir. Digerlerinin yani sira, 1 ila 3 karbon atomuna sahip bir alkoksi tercih edilir. Bu bulusta, aril, tercihen 6 ila 10 karbon atomuna sahip bir arildir. Spesifik örnekler fenil, a-naftil ve ß-naftil içerir. Digerleri arasinda, fenil tercih edilir. Aril istege bagli olarak sübstitüe edilebilir. Bu gibi sübstitüentlerin örnekleri bir alkil, bir halojen, bir alkoksi, siyano ve nitrodur. Aril, bu sübstitüentlerden bir ila üçü ile sübstitüe edilebilir. 02265-P-0001 Bu bulusta, alkilen tercihen 1 ila 6 karbon atomuna sahip düz veya dallanmis bir alkilendir. Spesifik örnekler arasinda metilen, etilen, trimetilen, tetrametilen, pentametilen, heksametilen, 2-(etil)trimetilen ve 1-(metil)tetrameti1en bulunur. Bu bulusta asil, düz veya dallanmis bir alkanoil veya aroil içerir. Alkanoilin örnekleri arasinda formil, asetil, 2-metilasetil, 2,2-dimetilasetil, propiyonil, bütiril, izobütiril, pentanoil, 2,2-dimetilpr0piy0nil, heksanoil, vs. bulunur. Aroilin örnekleri arasinda benzoil, toluil ve naftoil bulunur. Aroil istege bagli olarak sübstitüe edilebilir pozisyonlarda sübstitüe edilebilir ve bir alkil(ler) ile sübstitüe edilebilir. Tercihen, mevcut bulusun oligonükleotidi, bu bulusun antisens oligomeri olup, asagidaki genel formül ile temsil edilen bir kurucu birim içerir, burada ribozun 2' pozisyonundaki -OH grubu, metoksi ile sübstitüe edilir ve fosfat baglayici bölge bir fosforotiyoat bagidir: burada baz, bir nükleobazi temsil eder. Mevcut bulusun oligonükleotidi, çesitli otomatiklestirilmis sentezleyici (örnegin AKTA oligopilot arti 10/ kullanilarak kolayca sentezlenebilir. Alternatif olarak, sentez ayrica bir üçüncü taraf kurulusa (örnegin Promega Inc., Takara C0. veya Japan Bio Service C0.) vb. emanet edilebilir. 02265-P-0001 Bu bulusun morfolin oligomeri, asagidaki genel formül ile temsil edilen kurucu birimi içeren, mevcut bulusun antisens oligomeridir: burada baz, yukarida tanimlandigi gibi ayni anlamliliga sahiptir ve W, asagidaki gruplardan biri tarafindan gösterilen bir grubu temsil eder: ZIP_ x y Yi L burada X, -CH2R', -OCH2R', -S-CH2R', -NR2R3 veya F'yi temsil eder; R1, H veya bir alkili temsil eder; ayni veya farkli olabilen R2 ve R3'ün her biri, H, bir alkil, bir sikloalkil veya bir arili temsil eder; Yi, 0, S, CHz veya NR'"i temsil eder; Yz, 0, S veya NR'"i temsil eder; Z, 0 veya S'yi temsil eder. 02265-P-0001 Tercihen, morfolin oligomeri, asagidaki genel formül ile temsil edilen bir kurucu birimi içeren bir oligomerdir (fosforodiamidat morfolin oligomeri (bundan böyle burada baz, R2 ve R3, yukarida tanimlandigi gibi ayni anlamliliga sahiptir. Mevcut bulusun morfolin oligomeri, morfolin oligomeri olusturan tamamen veya kismen modifiye edilmis nükleobazlara, morfolin halka molekül bölümlerine, fosfat baglayici bölgelere, 3'-uç ve/veya 5`-uçtan birine sahip olani içerir. Fosfat baglayici bölgenin bir modifikasyonu, örnegin, fosforodiamidat bagi, fosforotiyoat bagi, fosforoditioat bagi, alkilfosfonat bagi, fosforamidat bagi ve boranofosfat bagi ile bir degistirme modifikasyonunu içerir (Enya et al: Yayinlari). olarak üretilebilir. Özellikle PMO, WO 2009/06447l'de tarif edilen prosedürle üretilebilir veya asagida gösterilen prosesle üretilebilir. 02265-P-0001 Bir PMO'nun bir uygulamasi, örnegin, asagidaki genel formül (I) ile temsil edilen bilesiktir (bundan böyle PMO (D). burada baz, R2 ve R3, yukarida tanimlandigi gibi ayni anlamliliga sahiptir; ila 30 arasinda bir verilen tamsayidir, tercihen 29'dur. PMO (I) bilinen bir yönteme uygun olarak üretilebilir, örnegin prosedürler asagidaki adimlarla gerçeklestirilerek üretilebilir. Asagidaki adimlarda kullanilan bilesikler ve reaktifler, PMO hazirlamak için yaygin olarak kullanildigi sürece, özellikle sinirli degildir. Ayni zamanda, asagidaki adimlarin tümü sivi faz yöntemi veya kati faz yöntemi (kilavuzlar veya ticari olarak temin edilebilen kati faz otomatik sentezleyicileri kullanarak) ile gerçeklestirilebilir. Kati faz yöntemi ile PMO üretilmesinde, basit islem prosedürleri ve dogru sentez için otomatik sentezleyicilerin kullanilmasi arzu edilmektedir. 02265-P-0001 (1) Adim A: Asagidaki genel formül (II) ile temsil edilen bilesik (bundan böyle Bilesik (II) olarak anilacaktir) asagidaki genel formül (III) ile temsil edilen bilesigi (bundan böyle Bilesik (III) olarak anilacaktir) hazirlamak için bir asitle reaksiyona sokulur: burada n, R2 ve R3, yukarida tanimlandigi gibi ayni anlamliliga sahiptir; her bir BP bagimsiz olarak istege bagli olarak korunabilen bir nükleobazi temsil eder; T, tritil, monometotritil veya dimetoksititili temsil eder; ve, L hidrojen, bir asil veya asagidaki genel formül (IV) ile temsil edilen bir grubu temsil eder (bundan böyle grup (IV) olarak anilacaktir). kati tasiyici baglayici _ BP için "nükleobaz", BP ile gösterilen nükleobazdaki amino veya hidroksi grubunun korunabilmesi sartiyla, Bazdaki ile ayni "nükleobaz"i içerir. Amino için bu koruyucu grup, nükleik asitler için koruyucu bir grup olarak kullanildigi sürece özellikle sinirli degildir. Spesifik örnekler benzoil, 4-met0ksibenzoil, asetil, propiyonil, butiril, izobütiril, fenilasetil, fenoksiasetil, 4-tert-butilfenoksiasetil, 4- izopropilfenoksiasetil ve (dimetilamino) metilendir. Hidroksi grubu için koruyucu 02265-P-0001 grubun spesifik örnekleri istege bagli olarak sübstitüe edilebilir pozisyonlarda 1 ila 5 elektron çeken bir grup ile sübstitüe edilebilen 2-siyan0etil, 4-nitr0fenetil, fenilsülfoniletil, metilsülfoniletil ve trimetilsililetil, ve fenil, difenilkarbamoil, dimetilkarbamoil, dietilkarbamoil, metilfenilkarbamoil, 1-pirolidinilkarbamoil, morfolinkarbamoil, 4-(tert-butilkarb0ksi) benzil, 4-[(dimetilamino) oldugu sürece özellikle sinirli degildir. Kati tasiyicinin asagidaki özelliklere sahip olmasi istenir: örnegin (i) morfolin nükleik asit türevlerinin (örnegin, diklorometan, asetonitril, tetrazol, N-metilimidazol, piridin, asetik anhidrit, lutidin, trifloroasetik asit) sentezi için kullanilabilen reaktierr içinde az miktarda çözünür; (ii) morfolin nükleik asit türevlerinin sentezi için kullanilabilen reaktiflere kimyasal olarak stabildir; (iii) kimyasal olarak modifiye edilebilir; (iv) arzu edilen morfolin nükleik asit türevleri ile yüklenebilir; (v) muameleler sirasinda yüksek basinca dayanabilecek kadar bir güce sahiptir; ve (vi) uniform bir partikül çapi araligina ve dagilimina sahiptir. Spesifik olarak, sisebilir polistiren (örnegin çapraz baglanmis aminometil polistiren reçinesi %1 tarafindan imal edilmistir), Aminometillenmis Polistiren Reçine HCI edilmistir)), sismeyen polistiren (örn, Primer Destegi (GE Healthcare tarafindan imal edilmistir)), PEG zincirine bagli polistiren (örnegin, NH2-PEG reçinesi (Watanabe Chemical C0. tarafindan üretilmistir), TentaGel reçine), kontrollü gözenekli cam (kontrollü gözenekli cam; CPG) (örnegin CPG tarafindan imal edilmistir), oksalil kontrollü gözenekli cam (bakiniz örnegin Alul et al., Nucleic türevlendirilmis destek (örnegin Wright et al., cf., Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)) ve bir Poros-polistiren/divinilbenzen kopolimeri. 02265-P-0001 Kullanilabilecek bir "baglayici", genellikle nükleik asitleri veya morfolin nükleik asit türevlerini baglamak için kullanilan bilinen bir baglayicidir. Örnekler, 3- aminopropil, süksinil, Bu adim Bilesik (II) bir asit ile reaksiyona sokularak gerçeklestirilebilir. Bu adimda kullanilabilecek "asit", örnegin, trifloroasetik asit, dikloroasetik asit ve trikloroasetik asit içerir. Kullanilan asit, uygun bir sekilde 1 mol Bilesik (II) bazinda, 0.1 mol esdegeri ila 1000 mol esdegeri araliginda, tercihen l mol Bilesik (II) bazinda 1 mol esdegeri ila 100 m0] esdegerine araligindadir. Yukarida açiklanan asitle kombinasyon halinde bir organik amin kullanilabilir. Organik amin özellikle sinirli degildir ve örnegin trietilamin içerir. Kullanilan organik aminin miktari, 1 mol asit bazinda, uygun bir sekilde, örnegin 0.01 mol esdegeri ila 10 mol esdegeri araliginda ve tercihen 0.1 mol esdegeri ika 2 mol esdegeri araligindadir. Bu adimda asit ve organik aminin bir tuzu veya karisimi kullanildiginda, tuz veya karisim örnegin bir trifloroasetik asit ve trietilaminin bir tuzunu veya karisimini ve daha spesifik olarak trietilaminin 1 esdegerinin ve triIloroasetik asidin 2 esdegerinin bir karisimini içerir. Bu adimda kullanilabilecek asit, %01 ila %30 konsantrasyonunda uygun bir çözücü ile seyreltme formunda da kullanilabilir. Çözücü, reaksiyona inert oldugu sürece özellikle sinirli degildir ve örnegin diklorometan, asetonitril, bir alkol (etanol, izopropanol, trifloroetanol, Vb.), su veya bunlarin bir karisimini içerir. Yukarida tarif edilen reaksiyondaki reaksiyon sicakligi, tercihen, örnegin, 10 °C ila 50 °C araliginda, daha fazla tercihen, 20 °C ila 40 °C araliginda ve en çok tercihen 25 0C ila 35 CC araligindadir. 02265-P-0001 Reaksiyon süresi, kullanilan asidin türüne ve reaksiyon sicakligina bagli olarak degisebilir ve genel olarak 0.1 ila 24 saat arasinda ve tercihen 1 dakika ila 5 saat arasinda degisir. Bu adimin tamamlanmasindan sonra, sistemde kalan asidi nötralize etmek için gerekirse bir haz eklenebilir. "Baz", özellikle sinirli degildir ve örnegin, diizopropilamin içerir. Baz ayrica %0.] (v/v) ila %30 (V/V) konsantrasyonda uygun bir çözücü ile seyreltme formunda da kullanilabilir. Bu adimda kullanilan çözücü, reaksiyona inert kaldigi sürece özellikle sinirli degildir ve diklorometan, asetonitril, bir alkol (etanol, izopropanol, trifloroetanol, vb.), su ve bunlarin bir karisimini içerir. Reaksiyon sicakligi tercihen örnegin 10 °C ila 50 °C, daha çok tercihen 20 CC ila 40 °C arasinda ve en çok tercihen 25 °C ila 35 0C arasindadir.. Reaksiyon süresi, kullanilan bazin türüne ve reaksiyon sicakligina bagli olarak degisebilir ve genel olarak 0.1 ila 24 saat arasinda ve tercihen 1 dakika ila 5 saat arasinda degisir. Bilesik (II)'de, asagidaki genel formül (IIa)'nin bilesigi (bundan böyle Bilesik (IIa)), burada 11, 1 ve L bir grup (IV)"tür, asagidaki prosedürle üretilebilir. kati tasiyici ' burada BP, T, baglayici ve kati tasiyici yukarida tanimlandigi gibi ayni anlamliliga sahiptir. 02265-P-0001 Asagidaki genel formül (V) ile temsil edilen bilesik, asagidaki genel formül (VI) ile temsil edilen bilesigi hazirlamak için bir asitlestirici madde ile reaksiyona sokulur (bundan böyle Bilesik (VI) olarak anilacaktir). burada BP, T ve baglayici yukarida tanimlandigi gibi ayni anlamliliga sahiptir; ve, R4 hidroksi, bir halojen, karboksil grubu veya aminoyu temsil eder. Bu adim, baslangiç malzemesi olarak Bilesik (V) kullanilarak, baglayicilarin dahil edilmesi için bilinen prosedürlerle gerçeklestirilebilir. Özellikle, asagidaki genel formül (VIa) ile temsil edilen bilesik, Bilesik (V) ve süksinik anhidrid kullanilarak esterlestirme olarak bilinen yöntemin gerçeklestirilmesiyle üretilebilir. o kEoj/BP (V 1 a) burada BP ve T, yukarida tanimlandigi gibi ayni anlamliliga sahiptir. 02265-P-0001 Bilesik (VI), Bilesik (IIa)'nin hazirlanmasi için yogunlastirici bir madde ile kati bir tasiyiciyla reaksiyona sokulur. burada BP, R4, T, baglayici ve kati tasiyici, yukarida tanimlandigi gibi ayni anlamliliga sahiptir. Bu adim, yogunlasma reaksiyonu olarak bilinen bir prosese uygun olarak Bilesik (VI) ve bir kati tasiyici kullanilarak gerçeklestirilebilir. Bilesik (II)'de, asagidaki genel formül (IIa2) ile temsil edilen bilesik, burada 11, 2 L, genel formül (IV) ile temsil edilen bir gruptur, baslangiç materyali olarak Bilesik (IIa) kullanilarak ve spesifikasyonda istenen sayida tarif edilen PMO üretim yönteminin A ve B adimlarinin tekrarlanmasiyla üretilebilir. burada BP, R2, R3, T, baglayici ve kati tasiyici yukarida tanimlandigi gibi 02265-P-0001 24°tür). (2) AdimB Bilesik (III), asagidaki genel formül (VII) ile temsil edilen bilesigi hazirlamak için (bundan böyle Bilesik (VII) olarak anilacaktir) bir baz varliginda morfolin monomer bilesigi ile reaksiyona sokulur: iii-iiriilim› !li-!unlu t Ii'dniii 4 "r › _ ni burada BP, L, n, R2, R3 ve T, yukarida tanimlandigi gibi ayni anlamliliga sahiptir. Bu adim, Bilesik (III)`ü bir baz varliginda morfolin monomer bilesigi ile reaksiyona sokmak suretiyle gerçeklestirilebilir. Morfolin monomer bilesigi, örnegin, asagidaki genel formül (VIII) ile temsil edilen bilesikleri içerir: 02265-P-0001 kEOIBP burada BP, R2, R3 ve T, yukarida tanimlandigi gibi ayni anlamliliga sahiptir. Bu adimda kullanilabilecek "baz", örnegin, diizopropilamin, trietilainin ve N- etilmorfolin içerir. Kullanilan bazin miktari uygum bir sekilde, 1 mol Bilesik (III) bazinda, 1 mol esdeger ila 1000 mol esdeger araliginda, tercihen 1 mol Bilesik (III) bazinda 10 mol esdeger ila 100 mol esdeger araligindadir. Bu adimda kullanilabilecek morfolin monomer bilesigi ve bazi ayrica %01 ila Çözücü, reaksiyona inert oldugu sürece özellikle sinirli degildir ve örnegin N, N- dimetilimidazolidon, N-metilpiperidon, DMF, diklorometan, asetonitril, tetrahidrofuran veya bunlarin bir karisimini içerir. Reaksiyon sicakligi tercihen 0 °C ila 100 0C araliginda ve daha çok tercihen 10 0C ila 50 °C araligindadir. Reaksiyon süresi, kullanilan bazin türüne ve reaksiyon sicakligina bagli olarak degisebilir ve genel olarak 1 ila 48 saat arasinda ve tercihen de 30 dakika ila 24 saat arasindadir. Ayrica, bu adimin tamamlanmasindan sonra, gerekirse bir asilleyici madde eklenebilir. "Asilleyici madde" örnegin asetik anhidrit, asetil klorür ve fenoksiasetik anhidrit içerir. Asilleyici madde ayrica %01 ila %30 konsantrasyonda uygun bir çözücü ile seyreltme olarak da kullanilabilir. Solvent, reaksiyona inert oldugu sürece özellikle sinirli degildir ve örnegin diklorometan, 02265-P-0001 asetonitril, tetrahidrofuran bir alkol(ler) (etanol, izopropanol, trifloroetanol, vb.), su veya bunlarin bir karisimini içerir. Gerekirse, piridin, lutidin, kollidin, trietilarnin, diizopropiletilamin, N- etilmorfolin, vb. gibi bir baz, asillestirici ajan ile kombinasyon halinde de kullanilabilir. Asilleyici maddenin miktari uygun bir sekilde 0.] mol esdegeri ila araligindadir. Bazin miktari, 1 mol asilleyici madde bazinda, örnegin 0.1 mol esdegeri ila 100 mol esdegeri, ve tercihen 1 mol esdegeri ila 10 mol esdegeri araligindadir. Bu reaksiyondaki reaksiyon sicakligi, tercihen 10 °C ila 50 0C araliginda, daha tercihen, 10 °C ila 50 °C araliginda, çok daha tercihen, 20 CC ila 40 °C araliginda ve en çok tercihen 25 °C ila 35 °C araligindadir. Reaksiyon süresi, kullanilan asilleyici maddenin türüne ve reaksiyon sicakligina bagli olarak degisebilir ve genel olarak 0.] ila 24 saat arasinda ve tercihen 1 dakika ila 5 saat arasinda uygun bir sekilde degisir. (3) Adim C: Adim B'de üretilen Bilesik (VII)'de, koruyucu grup, genel formül (IX) ile temsil edilen bilesigi hazirlamak için bir koruma uzaklastirilma maddesi kullanilarak çikarilir. R1 N 11; 2 "J J 1 . _. ' ':3 . |` _` 02265-P-0001 burada baz, BP, L, 11, R2, R3 ve T, yukarida tanimlandigi gibi ayni anlamliliga sahiptir. Bu adim, Bilesik (VII)`yi koruma uzaklastirilma maddesi ile reaksiyona sokulmasi suretiyle gerçeklestirilebilir. içerir. Bu adimda kullanilan "koruma uzaklastirma maddesi", örnegin su, metanol, etanol, izopropil alkol, asetonitril, tetrahidrofuran, DMF, N, N- dimetilimidazolidon, N-metilpiperidon veya bu çözücülerin bir karisimi ile bir seyreltme olarak da kullanilabilir. Bunlar arasinda etanol tercih edilir. Kullanilan koruma uzaklastirma maddesinin miktari, uygun olarak 1 mol Bilesik (VII) bazinda, l mol esdegeri ila 100000 mol esdegeri araliginda ve tercihen 10 mol esdegeri ila 1000 mol esdegeri arasindadir. daha da tercihen 50 °C ila 60 °C araligindadir. Korumanin uzaklastirilmasi için reaksiyon süresi, Bilesik (VII) türüne, reaksiyon sicakligina, Vb. bagli olarak degisebilir ve uygun bir sekilde 10 dakika ila 30 saat, tercihen 30 dakika ila 24 saat arasinda ve daha çok tercihen 5 saat ila 20 saat araligindadir. (4) Adim D: PMO (I), C adiminda üretilen Bilesik (IX)'u bir asitle reaksiyona sokmak suretiyle üretilir: 02265-P-0001 burada baz, n, R2, R3 ve T, yukarida tanimlandigi gibi ayni anlamliliga sahiptir. Bu adim, Bilesik (IX)'a bir asit ilave edilerek gerçeklestirilebilir. Bu adimda kullanilabilecek "asit", örnegin, trikloroasetik asit, dikloroasetik asit, asetik asit, fosforik asit, hidroklorik asit, vb. içerir. Kullanilan asit, çözeltinin 0.1 ila 4.0 araliginda ve daha çok tercihen pH 10 ila 30 araliginda bir pH degerine sahip olmasini saglamak için uygun bir sekilde kullanilir. Çözücü, reaksiyona inert kaldigi sürece özellikle sinirli degildir ve örnegin asetonitril, su veya bu çözücülerin bir karisimini içerir. Reaksiyon sicakligi uygun bir sekilde 10 °C ila 50 °C araliginda, tercihen 20 0C ila 40 0C araliginda ve daha fazla tercihen de 25 0C ila 35 °C araligindadir. Korumanin kaldirilmasi için reaksiyon süresi, Bilesik (IX) türüne, reaksiyon sicakligina, vb. bagli olarak degisebilir ve uygun bir sekilde 0.1 dakika ila 5 saat, tercihen 1 dakika ila 1 saat arasinda ve daha çok tercihen 1 dakika ila 30 dakika arasindadir. PMO (I), bu adimda elde edilen reaksiyon karisiminin, ekstraksiyon, konsantrasyon, nötrlestirme, filtrasyon, santrifüj ayirma, yeniden kristalizasyon, ters faz kolon kromatografisi Cg ila Cis, katyon degisimi kolon kromatografisi, anyon degistirme kolon kromatografisi, jel filtrasyon kolon kromatografisi, yüksek performansli sivi kromatografisi, diyaliz, ultrafiltrasyon, Vb., gibi 02265-P-0001 geleneksel ayirma ve saIlastirma yöntemlerine tek baslarina veya bunlarin kombinasyon halinde tabi tutulmasiyla elde edilebilir. Bu nedenle, arzu edilen PMO (I) izole edilebilir ve saflastirilabilir (bakiniz örnegin WO 1991/09033). Ters faz kromatografisi kullanilarak PMO (I)'in saflastirilmasmda, örnegin, 20 mM trietilamin/asetat tamponu ve asetonitrilin bir çözelti karisimi bir elüsyon çözücüsü olarak kullanilabilir. Iyon degistirme kromatografisi kullanilarak PMO (I)'in sailastirilmasinda, örnegin 1 M tuzlu su çözeltisi ve 10 mM sodyum hidroksit sulu çözeltisinin bir çözelti karisimi bir elüsyon çözücüsü olarak kullanilabilir. Bir peptit nükleik asidi, kurucu birim olarak asagidaki genel formül ile temsil edilen bir gruba sahip olan mevcut bulusa ait oligomerdir: burada baz, yukarida tanimlandigi gibi yukarida tanimlandigi gibi ayni anlamliliga sahiptir. Peptid nükleik asitleri, örnegin asagidaki literatürlere referans verilerek hazirlanabilir. 02265-P-0001 3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, F. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995) 5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997). Mevcut bulusa ait oligomerde, 5' ucu, asagidaki kimyasal yapilar (1) ila (3)"den herhangi biri olabilir ve tercihen (3)-0H'dir. E 3 N,CH`-, 0-: N'CHJ o-P src"2 1 '2' J Bundan böyle, yukarida (1), (2) ve (3) ile gösterilen gruplar sirasiyla "Grup (1)", 2. Farmasötik bilesim Mevcut bulusa ait oligomer, önceki teknikteki antisens oligomerlerine kiyasla daha yüksek bir verimlilikle ekzon 51,in atlanmasini saglamaktadir. Bu nedenle, kas distrofisi rahatsizliklarinin, Ekzon 51 atlayarak örnegin çerçeve içine dönüstürülen mutasyona sahip olan DMD hastalarina, örnegin ekzon 29-50 delesyonuna sahip hastalar, ekzon 50 delesyonuna sahip hastalar, ekzon 45-50 delesyonuna sahip hastalar, ekzon 48-50 delesyonuna sahip hastalar, ekzon 49-50 delesyonuna sahip hastalar, ekzon 52 delesyonuna sahip hastalar, ekzon 52-63 delesyonuna sahip hastalar, ekzon 13-50 delesyonuna sahip hastalar, ekzon 19-50 delesyonuna sahip hastalar, ekzon 43-50 delesyonuna sahip hastalar veya ekzon 02265-P-0001 47-50 delesyonuna sahip hastalara mevcut bulusa ait oligomeri içeren farmasötik bilesigin uygulanmasi ile yüksek verimde hafifletilmesi beklenir. Örnegin, mevcut bulusa ait oligomeri içeren farmasötik bilesim kullanildiginda, ayni terapötik etkiler önceki teknikteki oligomerlerden daha küçük bir dozda bile elde edilebilir. Buna göre, yan etkiler hafifletilebilir ve ekonomiktir. Baska bir uygulamada, mevcut bulus, bir aktif içerik olarak mevcut bulusa ait oligomeri, bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunu veya hidratini içeren (bundan böyle "mevcut bulusum bilesimi" olarak anilacak olan, kas distrofisinin tedavisi için bir farmasötik bilesim saglar. Ayni zamanda, mevcut bulus, DMD hastalarina mevcut bulusa ait oligomerin uygulanmasini içeren, kas distrofisinin tedavisi için bir yöntem saglar. Bahsedilen tedavi yönteminde, mevcut bulusa ait oligomer, kas distrofisinin tedavisi için farmasötik bilesim olarak uygulanabilir. Bundan baska, mevcut bulus, kas distrofisinin tedavisi için farmasötik bilesimin üretiminde kullanilmasini ve mevcut bulusa ait oligomerin kas distrofisinin tedavisi için kullanilmasini saglar. Mevcut bulusa ait bilesimde yer alan mevcut bulusun oligomerinin farmasötik olarak kabul edilebilir tuzunun örnekleri, sodyum, potasyum ve lityum tuzlari gibi alkali metal tuzlari; kalsiyum ve magnezyum tuzlari gibi toprak alkali metal tuzlari; alüminyum, demir, çinko, bakir, nikel, kobalt, vb. gibi metal tuzlari; amonyum tuzlari; t-oktilamin, dibenzilamin, morfolin, glukosamin, fenilglisin alkil ester, etilendiamin, N-metilglisamin, guanidin, dietilamin, trietilamin, disikloheksilamin, N, N'-dibenziletilendiamin, kloroprokain, prokain, dietanolamin, N-benzilfenetilamin, piperazin, tetrametilamonyum, tris(hidroksimetil)aminometan; hidroIloratlar, hidroklorürler, hidrobromidler ve hidroiodürlerin tuzlari gibi hidrohalid tuzlari; nitratlar, perkloratlar, sülfatlar, 02265-P-0001 fosfatlar vb. gibi inorganik asit tuzlari; metansülfonatlar, triflorometansülfonatlar ve etansülfonatlar gibi düsük alkan sülfonatlar; benzensülfonatlar ve p- tolüensülfonatlar gibi arilsülfonatlar; asetatlar, malatlar, fumaratlar, süksinatlar, sitratlar, tartarlar, oksalatlar, maleatler, vb. gibi organik asit tuzlari; ve glisin, lisin, arginin, ornitin, glutamik asit ve aspartik asit tuzlari gibi amino asit tuzlaridir. Bu tuzlar bilinen yöntemlerle üretilebilir. Alternatif olarak, mevcut bulusa ait bilesimde bulunan mevcut bulusa ait oligomer bir hidrat formunda olabilir. Mevcut bulusa ait bilesim için uygulama yolu, uygulama için farmasötik olarak kabul edilebilir bir yol oldugu sürece özellikle sinirli degildir ve tedavi yöntemine bagli olarak seçilebilir. Kas dokularina uygulamada kolaylik göz önüne alindiginda, tercih edilenler intravenöz uygulama, intraarteriyal uygulama, intramüsküler uygulama, sübkütan uygulama, oral uygulama, doku uygulamasi, transdermal uygulama, vb.'dir. Ayrica, mevcut bulusun bilesimi için mevcut dozaj formlari; özellikle sinirli degildir ve örnegin çesitli enjeksiyonlari, oral ajanlari, damlamalari, inhalasyonlari, merhemleri, losyonlari vb. içerir. Mevcut bulusa ait oligomerin, kas distrofisi olan hastalara uygulanmasinda, mevcut bulusa ait bilesim, oligomerin kas dokularina uygulanmasini desteklemek için bir tasiyici içerebilir. Bu türlü bir tasiyici, farmasötik olarak kabul edilebilir oldugu sürece özellikle sinirli degildir ve örnekler, katyonik lipozomlar, katyonik polimerler, vb. gibi katyonik tasiyicilari veya viral zarf kullanan tasiyicilari içerir. Katyonik lipozomlar, örnegin, temel bilesenler olarak 2-O(2- dietilaminoetil)karabamoi1-1,3-O-dioleoilgliserin ve fosfolipitlerden olusan lipozomlar (bundan böyle "lipozom A" olarak anilacaktir), Oligofectamine (bundan böyle "lipozom A" olarak anilacaktir), (lnvitrogen Corp. tarafindan üretilmistir), Lipofectin (tescilli marka) (lnvitrogen Corp. tarafindan üretilmistir), Lipofectamine (tescilli marka) (lnvitrogen Corp. tarafindan üretilmistir), Lipofectamine 2000 (tescilli marka) (lnvitrogen Corp. tarafindan üretilmistir), DMRIE- C (tescilli marka) (lnvitrogen Corp. tarafindan üretilmistir), GeneSilencer (tescilli marka) (Gene Therapy Systems tarafindan üretilmistir), 02265-P-0001 TransMessenger (tescilli marka) (QIAGEN, Inc. tarafindan üretilmistir), TransIT TKO (tescilli marka) (Mirus tarafindan üretilmistir) ) ve Nucleofector IFdir (Lonza). Digerlerinin yani sira, lipozom A tercih edilir. Katyonik polimerlerin örnekleri, JetSI (tescilli ticari marka) (Qbiogene, Inc. tarafindan imal edilmistir) ve Jet-PEFdir (tescilli ticari marka) (polietilenimin, Qbiogene, Inc. tarafindan imal edilmistir). Viral örtü kullanan tasiyicilara bir örnek GenomeOneidir (tescilli ticari markadir) (Ishihara Sangyo tarafindan üretilen HVJ -E lipozomu). Alternatif olarak, 2924179 sayili Japon Patentinde tarif edilen tibbi cihazlar ve Japon Yurtiçi W096/ 14057, " New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990) pages 33-104", ve benzerlerine bakilabilir. Mevcut bulusa ait bilesimde yer alan mevcut bulusa ait oligomerin bir konsantrasyonu, tasiyicinin türüne, vb. bagli olarak ve uygun bir sekilde 0.1 nM ila 100 uM araliginda, tercihen 100 nM ila 10 uM araliginda degisebilir. Mevcut bulusun bilesiminde bulunan mevcut bulusa ait oligomerin agirlik orani ve tasiyici (mevcut bulusa ait tasiyici/antisens oligomeri), oligomerin özelligine, tasiyici tipine vb. bagli olarak degisebilir ve uygun bir sekilde 0.] ila 100 arasinda, tercihen 0.1 ila 10 arasindadir. Mevcut bulusa ait oligomerine ve yukarida tarif edilen tasiyiciya ek olarak, farmasötik olarak kabul edilebilir katki maddeleri de istege bagli olarak mevcut bulusun bilesiminde formüle edilebilir. Bu tür katki maddelerinin örnekleri, emülsiyonlastirma yardimcilari (örnegin, 6 ila 22 karbon atomuna sahip yag asitleri ve farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlari, albümin ve dekstran), stabilizatörler (örnegin, kolesterol ve fosfatidik asit), izotonize edici ajanlar (örnegin sodyum klorid, glukoz, maltoz) , laktoz, sukroz, trehaloz) ve pH kontrol edici maddelerdir (örnegin hidroklorik asit, sülfürik asit, fosforik asit, asetik asit, sodyum hidroksit, potasyum hidroksit ve trietanolamin). Bu katki maddelerinin 02265-P-0001 biri veya daha fazlasi kullanilabilir. Mevcut bulusa ait bilesimdeki katki maddesinin içerigi uygun olarak agirlik olarak %90 veya daha az, tercihen agirlik olarak %70 veya daha az ve daha çok tercihen agirlik olarak %50 veya daha azdir. Mevcut bulusa ait bilesim, mevcut bulusa ait oligomer bir tasiyici dispersiyona ilave edilerek ve karisimin uygun sekilde karistirilmasiyla hazirlanabilir. Katki maddeleri, mevcut bulusa ait oligomerin ilavesinden önce veya sonra uygun bir adimda ilave edilebilir. Mevcut bulusa ait oligomerin eklenmesinde kullanilabilen bir sulu çözücü, farmasötik olarak kabul edilebilir oldugu sürece özellikle sinirli degildir ve örnekler, enjekte edilebilir su veya enjekte edilebilir damitilmis su, fizyolojik salin vb. gibi elektrolit sivisi ve seker sivisi, glikoz sivisi, maltoz sivisi ve benzeridir. Teknikte uzman bir kisi bu madde için pH degeri ve sicaklik sartlarini uygun sekilde seçebilir. Mevcut bulusa ait bilesim, örnegin bir sivi formda ve liyofilize edilmis preparat halinde hazirlanabilir. Liyofilize preparat, mevcut bulusa ait bilesimi, geleneksel bir sekilde sivi halde liyofilize ederek hazirlanabilir. Liyofilizasyon, örnegin, mevcut bulusun bilesiminin bir sivi formda uygun sekilde sterilize edilmesiyle, bir alikotun bir sise kabina dagitilmasi, yaklasik -40 ila -20 °C arasindaki sartlarda 2 saat boyunca ön donma, azaltilmis basinç altinda yaklasik 0 ila 10 °C'de bir birincil kurutma ve daha sonra azaltilmis basinç altinda yaklasik 15 ila 25 °C`de bir ikincil kurutmanin gerçeklestirilmesi suretiyle gerçeklestirilebilir. Genel olarak, mevcut bulusa ait bilesimin liyofilize edilmis preparasyonu, flakon içeriginin azot gaziyla degistirilmesi ve kapatilmasiyla elde edilebilir. Mevcut bulusa ait bilesimin liyofilize preparati, istege bagli olarak uygun bir solüsyon (yeniden yapilandirma sivisi) ilave edilerek ve preparatin yeniden çözünmesiyle genel olarak kullanilabilir. Böyle bir sulandirma sivisi, enjekte edilebilir su, fizyolojik salin ve diger infüzyon sivilarini içerir. Sulandirma sivisinin bir hacmi, kullanim amacina, vb. bagli olarak degisebilir, özellikle sinirli 02265-P-0001 degildir ve uygun olarak liyofilizasyondan önce hacimden 0.5 ila 2 kat daha fazladir veya en fazla 500 mL'dir. Asagidaki faktörleri dikkate alarak, uygulanacak olan mevcut bulusun bilesiminin bir dozunun kontrol edilmesi arzu edilmektedir: mevcut bulusa ait oligomerin türü ve dozaj formu; yas, vücut agirligi vb. dahil olmak üzere hastalarin sartlari; uygulama yolu; ve hastaligin Özellikleri ve kapsami. Bu bulusun antisens oligomerinin miktari olarak hesaplanan günlük bir doz, genellikle 0.1 mg ila 10 g/insan ve tercihen 1 mg ila 1 g/insan araligindadir. Bu sayisal aralik, bazen hedef hastaligin türüne, uygulama yoluna ve hedef moleküle bagli olarak degisebilir. Bu nedenle, araliktan daha düsük bir doz bazi durumlarda yeterli olabilir ve bunun tersine araliktan daha yüksek bir doz gerekli olabilir. Bilesim, günde bir ila birkaç kez veya bir gün ila birkaç gün araliklarla uygulanabilir. Mevcut bulusa ait bilesimin yine bir baska uygulamasinda, mevcut bulusun oligonükleotidini ve yukarida tarif edilen tasiyiciyi eksprese edebilen bir vektörü içeren bir farmasötik bilesim saglanmaktadir. Böyle bir ekspresyon vektörü, mevcut bulusa ait çok sayida oligonükleotidi eksprese edebilen bir vektör olabilir. Bilesim, mevcut bulusa ait oligomeri içeren mevcut bilesimde oldugu gibi farmasötik olarak kabul edilebilir katki maddeleri ile formüle edilebilir. Bilesimde yer alan ekspresyon vektörünün bir konsantrasyonu, tasitici türüne vb. bagli olarak degisebilir ve uygun bir sekilde 0.1 nM ila 100 uM araliginda, tercihen içerisindeki ekspresyon vektörünün agirlik orani, ekspresyon vektörünün özelligine, tasiyicinin tipine vb. bagli olarak degisebilir ve uygun bir sekilde 0.] ila 100 araliginda, tercihen 0.] ila 10 araligindadir. Bilesimde yer alan tasiyicinin içerigi, mevcut bulusa ait oligomeri içeren mevcut bulusun bilesimi ile aynidir ve mevcut bulusun bilesiminde oldugu gibi üretim yöntem de aynidir. 02265-P-0001 Bundan böyle, mevcut bulus asagidaki ÖRNEKLER ve TEST ÖRNEKLERI referans alinarak daha detayli olarak tarif edilecektir, ancak bunlarla sinirli oldugu kabul edilmez. ÖRNEKLER Amino polistiren recinesi üzerine yüklenen 4-{[(gS,6R)-6-(4-Benzamid0-g oksopirimidin-l-il)-4-tritilmorfolin-2-illmet0ksi}-4-0ksobutan0ik asit tritilmorfolin-2-i1]met0ksi}-4-0ks0butan0ikasit üretimi 2-i1]-2-okso-l,2-dihidropirimidin-4-il}benzamid ve 1.1 g 4-dimeti1aminopiridin (4-DMAP), 50 mL diklorometan içerisinde süspanse edildi ve süspansiyona 0.90 g süksinik anhidrid ilave edildi, ardindan oda sicakliginda 3 saat karistirildi. Reaksiyon karisimina 10 mL metanol ilave edildi ve karisim, indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Kalinti, etil asetat ve 0.5 M sulu potasyum dihidrojenfosfat çözeltisi kullanilarak ekstrakte çikarildi. Nihai organik katman, sirasiyla 0.5M sulu potasyum dihidrojenfosfat çözeltisi, su ve brin ile belirtilen sirada yikandi yikandi. Nihai organik katman, sodyum sülfat üzerinde kurutuldu ve indirgenmis basinç altinda konsantre edilerek 4.0 g ürün verdi. Adim 2; Amino polistiren reçinesi üzerine yüklenen 4-{[(ZS,6R)-6-(4- oksobutanoik asit üretimi i1]metoksi}-4-oksobutanoik asit, içerisinde 02265-P-0001 dimetilaminopropil)karbodiimid hidroklorid eklendi. Daha sonra, 25.0 g amino polistiren reçinesi Primer destekleyici 200 amino (GE Healthcare Japan Co., Ltd., ardindan oda sicakliginda 4 gün çalkalandi. Reaksiyonun tamamlanmasindan sonra, reçine süzülerek alindi. Elde edilen reçine sirayla piridin, metanol ve diklorometan ile belirtilen sirada yikandi ve azaltilmis basinç altinda kurutuldu. Elde edilen reçineye , `15 mL asetik anhidrit ve mL 2,6-lutidin ilave edildi ve karisim, oda sicakliginda 2 saat çalkalandi. Reçine süzülerek alindi, sirayla piridin, metanol ve diklorometan ile belirtilen sirada yikandi ve 26.7 g ürün verecek sekilde indirgenmis basinç altinda kurutuldu. Ürünün yükleme miktari, bilinen bir yöntem kullanilarak 409 nm`de UV absorbansi ölçülerek, reçine basina tritilin m01 miktarindan belirlendi. Reçinenin yükleme miktari 192.2 pmol/g idi. UV ölçüm sartlari Cihaz: U- Çözücü: metansülfonik asit Dalga boyu: 265 nm Asagidaki ÖRNEK 1, 2 ve REFERANS ÖRNEK 1'deki açiklama1ara göre, TABLO 1'de PMO No. 1-3 ile gösterilen PMO sentezlendi. Sentezlenen PMO enjeksiyon için suda çözüldü (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. tarafindan üretildi). 02265-P-0001 1 Fuçgnm($ 1 2 5' uç: grup (3) 2 SEQ ID NO'ya karsilik gelen dizi; 588, Patent Dokümani 3, 5' ucunda: grup (3) il]met0ksi}4-0ksobutan0ik asit, bir aminopolistiren reçinesi üzerinde desteklendi (Referans Örnek 1) (26 umol), bir filtre ucu ile bir kolona dolduruldu. Daha sonra, asagida gösterilen sentetik döngü bir nükleik asit sentezleme makinesi (AKTA Oligopilot 10 plus) kullanilarak baslatilmistir. Arzu edilen morfolin monomer bilesigi, her bir birlesme döngüsüne, baslik bilesiginin nükleotid dizisini verecek sekilde ilave edildi (asagidaki Tablo 2'ye bakiniz). Adim Reaktif Hacim Süre l deblokaj çözeltisi 18-32 1.8-3.2 2 nötrlestirme ve yikama çözeltisi 30 1.5 3 baglanti çözeltisi B 5 0.5 4 baglanti çözeltisi A 1.3 0.25 Adim 3 ve 4'te eklenen reaktiflerle birlestirme 120-300 02265-P-0001 Adim Reaktif Hacim Süre reaksiyonu 6 asetonitril 20 1 .O 7 kapatma çözeltisi 9 2.0 8 asetonitril 30 2.0 Kullanilan deblokaj çözeltisi, %3 (w/v) trifloroasetik asit içeren diklorometan çözeltisidir. Kullanilan nötrlestirici ve yikama çözeltisi, %35 (v/v) asetonitril içeren diklorometan içinde N,N-diizopr0piletilaminin %10 (v/v) ve tetrahidrofuranin %5 (v/v) olarak çözünmesiyle elde edilen bir solüsyondu. Kullanilan birlestirme çözeltisi A, morfolin monomer bilesiginin tetrahidrofuran içinde 0.10 M olarak çözünmesiyle elde edilen bir çözeltiydi. Kullanilan birlestirme çözeltisi B, asetonitrilde N,N-diizopropiletilaminin %20 (v/v) ve tetrahidrofuranin %10 (v/v) olarak çözünmesiyle elde edilen bir çözeltiydi. Kullanilan kapatma çözeltisi, %20 (v/v) asetik anhidrid ve %30 (v/v) 2,6-lutidinin asetonitril içerisinde çözündürülmesiyle elde edilen bir çözeltiydi. Yukarida sentezlenen PMO ile yüklenen aminopolistiren reçinesi, reaksiyon kabindan geri kazanilmis ve düsük basinç altinda en az 2 saat oda sicakliginda kurutulmustur. Aminopolistiren reçinesi üzerine yüklenen kurutulmus PMO, bir reaksiyon kabina yüklenmistir ve buna, 5 mL %28'lik amonyak su-etanol (1/4) eklenmistir. Karisim 55 °C'de 15 saat karistirildi. Aminopolistiren reçinesi süzülerek ayrildi ve 1 mL su-etanol (l/4) ile yikandi. Olusan süzüntü azaltilmis basinç altinda konsantre edildi. Elde edilen kalinti, 10 mL 20 mM asetik asit - trietilamin tamponu (TEAA tamponu) ve 10 ml asetonitril (4/1) çözelti karisimi içinde çözündü ve bir membran filtre içinden süzüldü. Elde edilen süzüntü, ters fazli HPLC ile saflastirildi. Kullanilan sartlar, asagidaki Tablo 3'te gösterildigi 02265-P-0001 Kolon XBridge 5 um C18 (Waters, (pl9X50 mm, 1 CV=l4 mL) Akis hizi 10 mL/dak Kolon sicakligi Oda sicakligi Çözelti A 20mM TEAA tampon Çözelti B CH3CN Gradyan (B) kons. 10-›70 %/ 15 CV CV: kolon hacmi Her fraksiyon analiz edildi ve hedef ürün geri kazanildi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Konsantre kalintiya, 0.5 mL 2 M fosforik asit sulu çözeltisi ilave edildi ve karisim, 15 dakika karistirildi. Ayrica, karisimi alkalin yapmak için 2 mL 2 M sodyum hidroksit sulu çözeltisi ilave edildikten sonra bir membran filtreden (0.45 um) süzülür. Hedef ürünü içeren sonuçtaki sulu çözelti bir anyonik degisim reçinesi kolonu ile saflastirilmistir. Kullanilan sartlar asagidaki Tablo 4'te gösterildigi gibidir. Kolon Kaynak 15Q (GE Healthcare, (plO x 108 mm, 1 CV = Akis hizi 8,5 mL/ dak Kolon Oda sicakligi sicakligi Çözelti A 10 mM sodyum hidroksit sulu çözeltisi Çözelti B 10 mM sodyum hidroksit sulu çözeltisi, 1 M sodyum klorür sulu çözeltisi Gradyan (B) kons. 1-›50 %/ 40CV 02265-P-0001 Her bir fraksiyon analiz edildi (HPLC'de) ve hedef ürün sulu bir çözelti halinde elde edildi. Elde edilen 5qu çözeltiye, nötralizasyon için 0.1 M fosfat tamponu (pH 6.0) ilave edildi. Daha sonra, elde edilen karisim asagidaki Tablo 5'te tarif edilen sartlar altinda ters faz HPLC ile demineralize edildi. Kolon XBridge 5 pm C8 (Waters, @10x50 mm, 1 CV=4 mL) Akis hizi 4 InL/dak Kolon sicakligi 60°C Çözelti A su Çözelti B CH3CN Gradyan (B) kons. 0-›50 %/ 20CV Hedef ürün geri kazanildi ve karisim, indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Elde edilen kalinti su içinde çözündü. Elde edilen sulu çözelti, beyaz pamuk benzeri bir kati halinde hedef bilesigi verecek sekilde dondurularak kurutuldu. ESI-TOF-MS Hesaplanan: 10021 .46 Basliktaki bilesik, asagidaki prosedüre uygun olarak üretildi. ÖRNEKI. [KARSILASTIRMALI ÖRNEK 1] Basliktaki bilesik, asagidaki prosedüre uygun olarak üretildi. ÖRNEKl. In vitro analiz Bu bulusun antisens oligomerleri PMO No. 1 ve 2 ve antisens oligomeri PMO No. 3 kullanilarak deneyler yapildi. Çesitli antisens oligomerlerinin dizileri, asagidaki Tablo 6'da verilmistir. Nükleotid dizisi PMO No. Nükleotid dizisi PMO No. Mevcut bulusun Nucleofector II (Lonza), 0.3, 1, 3, 10 nM oligomerleri PMO No. 1 ve 2 oligomerleri ve PMO No. 3 antisens oligomeri üzerinde bir Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L kullanilarak RD (insan rabdomiyosarkom hücre dizisi) hücrelerinin 3.5x 105'i ile transfekte edildi. T-030 Programi kullanildi. Transfeksiyondan sonra, hücreler, üç gün boyunca, 2 mL Eagle'nin minimal esansiyel ortaminda (EMEM) (Sigma tarafindan üretilmistir, bundan böyle ayni), üretildi, bundan böyle ayni), bundan böyle hücrelere 500 ul ISOGEN II (Nippon Gene tarafindan üretildi) eklendi. Hücrelerin lize edilmesi için hücrelerin birkaç dakika oda sicakliginda beklemelerine izin verilmesinden sonra, lizat bir Eppendorf tüpünde toplandi. Toplam RNA, ISOGEN`e eklenen protokole göre ekstrakte edildi. Ekstrakte edilen toplam RNA konsantrasyonu bir NanoDrop ND- kullanilarak belirlenmistir. Bir Adimli RT-PCR, bir Qiagen One-Step RT-PCR Kiti (Qiagen tarafindan üretildi) kullanilarak 400 ng ekstrakte edilmis toplam RNA ile gerçeklestirildi. Kite bagli protokole uygun olarak bir reaksiyon çözeltisi hazirlandi. Termal döngüleyici olarak bir PTC- kullanildi. Kullanilan RT-PCR programi asagidaki gibidir. 50 °C, 30 dak: ters transkripsiyon reaksiyonu 95 0C, 15 dakika: termal denatürasyon amplifikasyonu 72 °C, 10 dak: son uzatma RT-PCR için kullanilan ileri primer ve ters primerin nükleotid dizileri asagida verilmistir. Ileri primer: 5'- CTGAGTGGAAGGCGGTAAAC-3` (SEQ ID NO: 5) Ters primer: 5'- GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3' (SEQ ID NO: 6) Yukaridaki 1 pL RT-PCR reaksiyon ürünü, bir Biyoanalizör (Agilent Technologies, Inc. tarafindan imal edilmistir) kullanilarak analiz edildi. Ekzon 51 atlama olan grubun polinükleotid seviyesi "AII ve ekzon 51 atlama olmayan grubun polinükleotid seviyesi "B" ölçülmüstür. "A" ve "B" nin bu ölçüm degerlerine dayanarak, atlama etkinligi asagidaki denklem ile belirlenmistir: Atlama etkinligi (%) = A/(A+B) x 100 Deneysel sonuçlar Sonuçlar Sekil 1'de gösterilmektedir. Bu deney, bu bulusun antisens oligomerlerinin, ekzon 51'i, antisens oligomeri PMO No.3'ten belirgin bir sekilde daha yüksek bir verimlilikle atlamayi etkileyebilecegini ortaya koydu. Baslik bilesim ÖRNEK 1'in prosedürüne uygun olarak üretildi. Çesitli antisens oligomerlerinin dizileri asagida verilmistir. TR TR TR TR