Tarifname, insan olmayan konakçi embriyolarin bir ön-morula embriyoyu (diger bir ifadeyle, bir 8 hücre asamasi embriyo) içermesini saglar. Modifiye edilmis pluripotent hücreleri içeren insan olmayan konakçi embriyolarin her biri, gebelige yönelik bir tasiyici anneye yerlestirilir. Tasiyici annelerin her biri, hedeflenen genom modifikasyonunu içeren FO dölünü üretir (diger bir ifadeyle, söz konusu polinükleotid içinde hedeflenen modifikasyona sahip olan bir FO XY erkegi ve söz konusu polinükleotid içinde hedeflenen modifikasyona sahip olan ve Sry proteininin seviyesi ve/veya aktivitesini azaltan genetik modifikasyona sahip olan bir FO XY dogurgan disisi). Açiklama, hedeflenen genomik modifikasyonlarin her birinin genn hatti boyunca aktarilabilmesini saglar. Bu FO hayvanlarinin her biri, söz konusu polinükleotid içinde bir homozigot hedeflenen modifikasyonu içeren bir F1 hayvani olusturmak üzere birbiriyle çiftlestirilebilir. F1 jenerasyonunun dörtte birinin, söz konusu polinükleotid içinde hedeflenen modifikasyona yönelik hoinozigot olmasi beklenir. F1 dölü, Sry genine hedeflenen modifikasyonu tutmak üzere seçilebilir veya F1 dölü, Sry genine hedeflenen modifikasyonu tutmamak üzere seçilebilir. Diger bir düzenlemede hedefleme vektörü (ve spesifik düzenlemelerde Talen, Crispr veya Zfn gibi nükleazlar) kullanilarak Sry geninin hedeflenen modifikasyonun eklenmesi, söz konusu polinükleotidin genetik modifikasyonunu hedefleyen vektör ile es zamanli olarak meydana gelebilir. Bu tür yöntemler, Sry proteininin seviyesi ve/veya aktivitesini azaltan bir genetik modifikasyona sahip olan ve ayni zamanda söz konusu polinükleotide hedeflenen modifikasyonu içeren bir XY ES hücresinin olusumuna olanak saglar. 00850-P-0044 Tarifname, F 1 jenerasyonu dölünün tam olarak donör ES hücresinden türetilen bir genomu içerrnesini açiklar. Diger düzenlemelerde tam olarak ES hücresinden türetilen farelere neden olan FO jenerasyonu erkek ve F0 jenerasyonu disi farelerin çaprazlama sikligi %100"dür. 11. Y Kromozomu üzerinde Zorlu bir Hedef Genomik Lokus veya bir Hedef Genomi'k Lakusun Modifiye Edilmesine Yönelik Yöntemler ve Bilesimler Yöntemler ve bilesimler, bir hücrede Y kromozomu üzerinde bir hedef genomik lokusun modifiye edilmesini saglayacak sekilde saglanir. Bu tarifnamede ayrica bir "zorlu" genomik lokusun modifiye edilmesine olanak saglayan yöntemler saglanir. "Zorlu lokus" ifadesi, geleneksel gen hedefleme stratejileri ile hedeflenmesi zor olan bir kromozomal bölgeyi içerir. Bu tür lokuslar, Y kromozomu, X kroinozomu veya bir otozom üzerine yerlestirilebilir. Bu tarifname, zorlu lokuslarin gen açisindan zayif, tekrar açisindan zengin ve/veya büyük ölçüde heterokromatik kromozomal bölgelerin içinde veya yakininda yerlestirilmesini saglar. Bakiniz örnegin, Bernardini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. DNA,nin erisilebilirliginin kromatin yapisi ile sinirlandirildigi kromozomal bölgelerin içine veya yakinina yerlestirilmesini saglar. Bu tarifname, zorlu lokusun en az yaklasik %-20, en az yaklasik %-30, en az yaklasik %40, en az yaklasik %50, en az yaklasik %60 veya en az yaklasik %70 heterokromatin gibi heterokroinatinin yüksek bir yüzdesi ile karakterize edilen kroinozomal bölgelerin içinde veya yakininda olmasini saglar. Bu tarifname, zorlu lokusun çogalmalara ve yeniden düzenlemelere maruz kalan veya tekrarlarin veya ters tekrarlarin varligi ile karakterize edilen kromozomal bölgelerin içine veya yakinina yerlestirilmesini saglar. Bakiniz örnegin, Gubbay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. materyali sikistiran ve organize eden nükleoprotein komplekslerini içerir. 00850-P-0044 olarak transkripsiyonal olarak çekinik olan genomdaki bölgeleri içerir. Heterokroinatin genel olarak daha siki bir sekilde sarilir ve genel olarak ökromatinden daha tekrarli DNA dizilerine sahiptir. "Ökromatin" ifadesi, genel olarak transkripsiyonal olarak aktif ve erisilebilir olan daha fazla uzatilmis ve daha az yogunlastirilmis kromatin domenleri ile karakterize edilen genomdaki bölgeleri içerir. getirildigi herhangi bir yöntemin kullanilmasini içerir. Yöntemler ve bilesimler, bu tarifnamede bir hücrede Y kromozomu üzerinde bir zorlu hedef genoinik lokusun veya bir hedef genomik lokusun modifiye edilmesini saglayacak sekilde saglanir. Y kromozomunun benzersiz yapisal özellikleri nedeniyle Y-bagli genler üzerinde mutasyonlar olusturmak üzere fare embriyonik kök hücrelerinde geleneksel gen hedeflemesi stratejileri, sinirli basariya sahip olmustur. Bu nedenle murin Y-bagli genlerin fonksiyonlarinin anlasilmasi genel olarak spontane delesyonlar, rastgele gen tuzaklari eklentileri veya otozomal transgenleri tasiyan farelerin çalismalarindan elde edilen sezgiler ile sinirlidir. Burada bu tarifnamedeki yöntemler, bir nükleaz ajaninin yoklugunda veya bununla kombinasyon halinde bir hedefleme vektörü kullanilarak Y kromozomu üzerinde bir genomik lokusun hedeflenmesine olanak saglayacak sekilde saglanir. Bu tür yöntemler, bir küçük hedefleme vektörünü veya küçük TVEC kullanir. Bir küçük TVEC üzerindeki bir homoloji kolunun uzunlugu, yaklasik 400-1000 bp olabilir. Küçük TVEClnin bir homoloji kolu, örnegin yaklasik 400 hp ila yaklasik yaklasik 900 hp ila yaklasik 1000 bp dahil olmak üzere karsilik gelen bir hedef 00850-P-0044 alan ile bir homolog rekombinasyon olayini gelistirmek üzere yeterli olan herhangi bir uzunlukta olabilir. Bir küçük TVEC üzerindeki bir homoloji kolunun tercih edilen bir uzunlugu, yaklasik 700 hp ila yaklasik 800 bp`dir. Diger bir düzenlemede küçük TVEC"nin 5" ve 3° homoloji kollarinin genel toplami yaklasik 7 kb, yaklasik 8 kb ila yaklasik 9 kb9dir veya en az 10 kb"dir. Bu tür yöntemlerde homoloji kollarinin kisa uzunlugu, daha uzun kollari olan bir hedefleme vektörü ile karsilastirildiginda hedefleme etkinligini arttirir. Yüksek oranda tekrarli dizilere sahip olan Y kromozomunun yapisi nedeniyle küçük TVEC,lerin kisa kollari, Y kromozomu üzerinde yüksek oranda spesifik hedefleme saglar. Yöntemler, bir hücrede Y kroinozomu üzerinde bir hedef genomik lokusun modifiye edilmesine yönelik, asagidaki adimlari içerir: (a) bir nükleaz ajanina yönelik bir tanima alanini içeren Y kromozomu üzerinde bir hedef genomik lokusu içeren bir hücrenin saglanmasi, (b) hücreye birinci ve ikinci hedef alana karsilik gelen birinci ve ikinci homolog kol ile bitisik olan birinci bir ek polinükleotid içeren birinci bir hedefleme vektörünün eklenmesi; ve (c) genomunda Y kromozomu üzerinde hedef genomik lokusta entegre edilen birinci ek nükleotidi içeren en az bir hücrenin tanimlanmasi. Bu tarifname, hedetleme vektörünün birinci homoloji kolu ve ikinci homoloji kolunun genel toplaminin yaklasik 7 kb, yaklasik 8 kb ila yaklasik 9 kb olmasini veya en az 10 kb veya en az 10 kb ve en az 150 kb olmasini saglar. Bazi düzenlemelerde, küçük TVEC kullanilir. Spesifik düzenlemelerde bir LTVEC kullanilir. Benzer yöntemler, bir 00850-P-0044 zorlu hedef genomik lokus hedeflenirken kullanilabilir. Sinirlayici olinayan bir düzenlemede bu tür yöntemler, burada açiklanan XY FO dogurgan disilerinin gelisimini arttiran kültür ortamlari kullanilarak ve böylece XY FO dogurgan disi hayvanlar olusturularak gerçeklestirilir. Diger örneklerde burada açiklanan yöntemler, burada diger bir yerde açiklandigi üzere Sry geninde hedeflenen genetik modifikasyon üretmek üzere kullanilir. Burada ayrica bir hücrede Y kromozomu üzerinde bir hedef genomik lokusun modifiye edilmesine yönelik yöntemler saglanir, asagidaki adimlari içerir: (a) bir nükleaz ajanina yönelik bir tanima alanini içeren Y kromozomu üzerinde bir hedef genomik lokusu içeren bir hücrenin saglanmasi, (b) hücreye (i) nükleaz ajanin, burada nükleaz ajani birinci tanima alaninda bir çentik veya çift sarmalli bir kirilmayi indükler; ve (ii) birinci tanima alanina yeteri kadar yakin olarak yerlestirilen birinci ve ikinci hedef alana karsilik gelen birinci ve ikinci homolog kol ile bitisik olan birinci bir ek polinükleotid içeren birinci bir hedefleme vektörünün eklenmesi; ve (c) genomunda Y kromozomu üzerinde hedef genomik lokusta entegre edilen birinci ek polinükleotid içeren en az bir hücrenin tanimlanmasi. Bu tarifname, hedefleme vektörünün birinci homoloji kolu ve ikinci homoloji kolunun genel toplaminin yaklasik 0.5 kb, 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 3 kb, olmasini veya en az 10 kb veya en az 10 kb ve en az 150 kb olmasini açiklar. Bazi düzenlemelerde, küçükTVEC kullanilir. Spesifik düzenlemelerde bir LTVEC kullanilir. Benzer yöntemler, bir zorlu hedef genomik lokus hedeflenirken kullanilabilir. Sinirlayici olmayan bir düzenlemede bu tür yöntemler, burada açiklanan XY FO dogurgan disilerinin gelisimini arttiran kültür ortamlari kullanilarak ve böylece XY FO dogurgan disi hayvanlar olusturularak gerçeklestirilir. Diger örneklerde burada açiklanan yöntemler, burada diger bir 00850-P-0044 yerde açiklandigi üzere Sry geninde hedeflenen genetik modifikasyon üretmek üzere kullanilir. Bir hedefleme vektörünü, bir küçük TVEC veya bir LTVEC kullanarak Y kromozomunun bir genomik lokusunda (veya herhangi bir zorlu genomik lokus) hedeflenen bir modifikasyon olusturmak üzere burada açiklanan çesitli yöntemlerin herhangi bir hücre türünde gerçeklestirilebileeegi ve bir XY pluripotent ve/veya totipotent hücre ile sinirli olmadigi kabul edilir. Bu tür hücre türleri, bunlarla sinirli olmamak üzere bir insan hücresini, bir insan olmayan hücreyi, bir memeli hücresini, insan olmayan memeli hücresini, bir kemirgen hücresini, bir fare hücresini, bir siçan hücresini, bir hamster hücresini, bir fibroblast hücresini veya diger herhangi bir konakçi hücreyi içerir. Bu tür hücreler, örnegin indüklü pluripotent kök (iPS) hücrelerini, fare einbriyonik kök (ES) hücrelerini, siçan embriyonik kök (ES) hücrelerini, insan einbriyonik (ES) hücrelerini veya gelisimsel olarak sinirli insan progenitör hücreleri içeren pluripotent hücreleri içerir. Yöntemler ayrica burada saglanan (örnegin, Cas9; ZFNs; veya TALEN°ler ile kombinasyon halinde CRISPR gRNAslar) çesitli nükleaz ajanlarinin herhangi birini kullanan Y kromozomu üzerinde büyük bir delesyon olusturmak üzere açiklanir. Y kromozomu üzerindeki bu tür bir delesyon, bir endojen nükleik asit dizisinin bir delesyonu olabilir. Delesyon, yaklasik 5 kb ila yaklasik 10 kb, Mb, yaklasik 2 Mb ila yaklasik 2.5 Mb veya yaklasik 2.5 Mb ila yaklasik 3 Mb 00850-P-0044 araliginda olabilir. Bir düzenlemede delesyon, 500 kb,den fazladir. Diger bir düzenlemede delesyon, yaklasik 500 kb ila yaklasik 600 kb"dir. Spesifik bir düzenlemede delesyon, yaklasik 500 kbsdir. Y kromozomu üzerindeki bu tür bir delesyon, herhangi bir nükleik asit dizisinin bir delesyonu olabilir. Bir düzenlemede delesyon, dogurganlik/infertilite ile iliskilendirilen bir geni içerir. Y kromozomu üzerindeki delesyon, birçok genein bir delesyonunu içerebilir. Bu tür düzenlemelerde KdmSd geni (Lisin (K)-spesif`ik demetilaz 5d; örnegin, Entrez Geni ID 20592 (mus müskülus)) ve/Veya Usp9y geni (ubikuitin spesifik peptidaz 9, y-bagli; örnegin, Entrez Geni ID 107868(mus müskülus)), delesyona yönelik hedeflenir. Diger düzenlemelerde Sry geni, delesyona yönelik hedeflenir. A. Nükleaz Ajanlari ve Nükleaz Ajanlarina Yönelik Tanima Alanlari sarmal kirilmasinin bir nükleaz ajani ile indüklendigi bir DNA dizisi içerir. Bir nükleaz ajanina yönelik tanima alani, hücre için endojen (veya natif) olabilir veya tanima alani hücreye ekzojen olabilir. Spesifik düzenlemelerde tanima alani, hücreye ekzojendir ve böylece hücrenin genomunda dogal olarak bulunmaz. Diger düzenlemelerde tanima alani, hücreye ve bir kisinin hedef lokusta konumlandirilmasini istedigi söz konusu polinükleotidlere ekzojendir. Diger düzenlemelerde ekzojen veya endojen tanima alani, konak hücrenin genomunda yalnizca bir kere bulunur. Spesifik düzenlemelerde genom içinde yalnizca bir kere bulunan bir endoj en veya natif alan tanimlanir. Bu tür bir alan akabinde endojen tanima alaninda bir çentik veya çift-sarmal kirilmasi üretecek olan nükleaz ajanlarini tasarlamak üzere kullanilabilir. Tanima alaninin uzunlugu çesitlilik gösterebilir ve örnegin, bir çinko parmak nükleazi (ZFN) çifti için yaklasik 30-36 bp (diger bir ifadeyle her bir ZFN için yaklasik 15-18 bp), bir Transkripsiyon Aktivatör-Benzeri Efektör Nükleaz 00850-P-0044 (TALEN) için yaklasik 36 hp veya bir CRlSPR/Cas9 kilavuz RNA için yaklasik hp olan tanima alanlarini içerir. Bir düzenlemede nükleaz ajaninin her bir monomeri, en az 9 nükleotidin tanima alanini tanir. Diger düzenlemelerde tanima alani, uzunluk olarak yaklasik 9 ila yaklasik 12 nükleotid, uzunluk olarak yaklasik 12 ila yaklasik 15 nükleotid, uzunluk olarak yaklasik 15 ila yaklasik 18 nükleotid veya uzunluk olarak yaklasik 18 ila yaklasik 21 nükleotid ve bu tür alt araliklarin herhangi bir kombinasyonu (örnegin, 9-18 nükleotid) olur. Verilen bir nükleaz ajaninin tanima alanini baglayabildigi ve bu baglama alanini klevaj edebildigi veya alternatif olarak nükleaz ajaninin tanima alanindan farkli olan bir diziye baglanabildigi kabul edilir. Ayrica tanima alani ifadesi, çentik/klevaj alaninin nükleaz ajani baglama alaninin içinde veya disinda olmasina bakilmaksizin nükleaz ajani baglama alanini ve çentik/klevaj alanini içerir. Diger bir varyasyonda nükleaz ajani ile klevaj, bir künt uçlu kesik üretmek üzere birbirine zit nükleotid pozisyonlarinda meydana gelebilir, diger durumlarda kesikler, 5, çikintilari veya 3" çikintilari olabilen, ayni zamanda "yapiskan uçlar" olarak adlandirilan tek sarmalli çikintilar üretmek üzere sallandirilabilir. Istenilen bir tanima alaninda bir çentik veya çift-sarmal kirilmasi indükleyen herhangi bir nükleaz ajani, burada açiklanan yöntemlerde ve bilesimlerde kullanilabilir. Bir dogal-olusumlu veya natifnükleaz ajani, nükleaz ajani istenilen bir tanima alaninda bir çentik veya çift-sarmal kirilmasi indükledigi sürece kullanilabilir. Alternatif olarak, bir modifiye edilmis veya mühendislik uygulanmis nükleaz ajani kullanilabilir. Bir "mühendislik uygulanmis nükleaz ajani", arzu edilen tanima alaninda spesifik olarak tanimak ve bir çentik veya çift- sarmal kirilmasi indüklemek için bunun natif formundan mühendislik uygulanan (modifiye edilen veya türetilen) bir nükleaz içerir. Böylelikle, bir mühendislik uygulanmis nükleaz ajani, bir natif, dogal-olusumlu nükleaz ajanindan türetilebilir veya bu yapay olarak olusturulabilir veya sentezlenebilir. Nükleaz ajaninin modifikasyonu, bir protein klevaj ajaninda bir amino asit veya bir nükleik asit 00850-P-0044 klevaj ajaninda bir nükleotid kadar küçük olabilir. Bazi düzenlemelerde, mühendislik uygulanmis nükleaz, bir tanima alaninda bir çentik veya çift-sarmal kirilmasi indükler, burada tanima alani bir natif (mühendislik-uygulanmamis veya modifiye-edilmemis) nükleaz ajani tarafindan taninacak olan bir dizi olmaz. Bir tanima alaninda veya baska DNA'da bir çentik veya çift-sarmal kirilmasi üretme, burada tanima alanini veya baska DNA'yi "kesme" veya "klevaj" olarak ifade edilebilir. Ömeklendirilen tanima alanlarinin aktif varyantlari ve fragmentleri saglanir. Bu Özdesligi içerebilir, burada aktif` varyantlar biyolojik aktiviteyi muhafaza eder ve dolayisiyla dizi-spesifik bir sekilde bir nükleaz ajani tarafindan taninabilir ve klevaj edilebilir. Bir tanima alaninin bir nükleaz ajani tarafindan çift-sarmal kirilmasini ölçmek üzere analizler teknikte bilinir (örnegin, TaqMan® qPCR Spesifik düzenlemelerde, tanima alani seleksiyon belirtecini kodlayan polinükleotid içinde konumlandirilir. Bu tür bir pozisyon seleksiyon belirtecinin kodlama bölgesi içinde veya seleksiyon belirtecinin ekspresyonunu etkileyen regülatör bölgeler içinde yer alabilir. Böylelikle, nükleaz ajaninin bir tanima alani, seleksiyon belirtecinin bir intronu, bir promotör, bir hizlandirici, bir regülatör bölge veya seleksiyon belirtecini kodlayan polinükleotidin herhangi bir protein- kodlamayan bölgesi içinde yer alabilir. Spesifik düzenlemelerde, tanima alaninda bir çentik veya çift-sarmal kirilmasi seleksiyon belirtecinin aktivitesini bozar. Bir fonksiyonel seleksiyon belirtecinin varligi veya yoklugu için analiz için yöntemler Bir düzenlemede, nükleaz ajani bir Transkripsiyon Aktivatör-Benzeri Efektör Nükleaz'dir (TALEN). TAL efektör nükleazlar, bir prokaryotik veya ökaryotik organizmanin genomu içinde spesifik hedef dizilerde çift-sarmal kirilmalari 00850-P-0044 yapmak için kullanilabilen dizi-spesifik nükleazlarin bir sinifidir. TAL efektör nükleazlar, bir natif veya mühendislik uygulanmis transkripsiyon aktivatör- benzeri (TAL) efektörü veya bunun fonksiyonel parçasini bir endonükleazin katalitik alanina, örnegin, mesela, Fokl'e, kaynastirilmasi ile olusturulur. Essiz, modüler TAL efektör DNA baglama domeni, potansiyel olarak herhangi bir verilen DNA tanima özgüllügüne sahip olan proteinlerin tasarimina olanak saglar. Böylelikle, TAL efektör nükleazlarin DNA baglama domenlerine spesifik DNA hedef alanlarini tanimasi için mühendislik uygulanabilir ve böylelikle bunlar istenilen hedef dizilerde çift-sarmal kirilmalari yapmak için 29:143-148. Uygun TAL nükleazlarinin örnekleri ve uygun TAL nükleazlarinin A1 içinde açiklanir. Çesitli düzenlemelerde örnegin söz konusu bir lokus veya söz konusu bir genomik lokus, içinde bir hedef nükleik asit dizisi içinde veya yakininda kesen TAL efektör nükleazlarina mühendislik uygulanir, burada hedef` nükleik asit dizisi bir hedefleme vektörü tarafindan modifiye edilecek olan bir dizide veya yakinindadir. Burada saglanan çesitli yöntemler ve bilesimler ile kullanilmasi için uygun TAL nükleazlari, burada tarif edildigi üzere hedefleme vektörleri tarafinda modifiye edilecek olan hedef nükleik asit dizilerinde veya yakininda baglamasi için spesifik olarak tasarlananlari içerir. Bir düzenlemede, TALEN'in her bir monomeri, iki hiper-degisken rezidü vasitasiyla bir tek baz çiftini taniyan 33-35 TAL tekrari içerir. Bir düzenlemede, nükleaz ajani bir bagimsiz nükleaza uygulanabilir bir sekilde bagli bir TAL 00850-P-0044 tekrari-temelli DNA baglama domeni içeren bir kimerik proteindir. Bir düzenlemede, bagimsiz nükleaz, bir Fokl endonükleazidir. Bir düzenlemede, nükleaz ajani, bir birinci TAL-tekrari-temelli DNA baglama domeni ve bir ikinci TAL-tekrari-temelli DNA baglama doineni içerir, burada birinci ve ikinci TAL- tekrari-temelli DNA baglama domeninin her biri bir Fold nükleaz alt-birimine uygulanabilir bir sekilde baglanir, burada birinci ve ikinci TAL-tekrari-temelli DNA baglama domeni, çesitli uzunluklardaki (12-20 bp) bir aralayici dizi ile ayrilmis hedef DNA dizisinin her bir sarmalinda bitisik iki hedef DNA dizisini tanir ve burada Fok] nükleazi alt-birimleri bir hedef dizide bir çift sarmal kirilmasi yapan bir aktif nükleaz olusturmak için dimerize olur. Burada açiklanan çesitli yöntemlerde ve bilesimlerde kullanilan nükleaz ajani ilaveten, bir çinko-parmak nükleazi (ZFN) içerebilir. Bir düzenlemede, ZFN'nin her bir monomeri, 3 veya daha fazla çinko parmagi-temelli DNA baglama domeni içerir, burada her bir çinko parmagi-temelli DNA baglama domeni bir 3 bp'lik alt- alani baglar. Diger düzenlemelerde, ZFN bir bagimsiz nükleaza uygulanabilir bir sekilde bagli bir çinko parmagi-temelli DNA baglama domeni içeren bir kimerik proteindir. Bir düzenlemede, bagimsiz endonükleaz, bir Fokl endonükleazidir. Bir düzenlemede, nükleaz ajani bir birinci ZFN ve bir ikinci ZFN içerir, burada birinci ZFN'nin ve ikinci ZFN'nin her biri bir Fold nükleaz alt-birime uygulanabilir bir sekilde baglidir, burada birinci ve ikinci ZFN yaklasik 5-7 bp`lik aralayici ile ayrilmis hedef DNA dizisinin her bir sarmalinda iki bitisik hedef DNA dizisini tanir ve burada Fokl nükleazi alt-birimleri bir çift sarinal kirilmasi yapan bir aktif nükleaz olusturmak için dimerize olur. Bakiniz Diger bir düzenlemede, nükleaz ajani bir meganükleazdir. Meganükleazlar, korunan dizi motiflerine bagli olarak dört ailede siniflandirilmistir, aileler LAGLlDADG, GlY-YlG, H-N-H ve His-Cys kutu aileleridir. Bu motifler, metal 00850-P-0044 iyonlarinin koordinasyonuna ve fosfodiester baglarin hidrolizine katilir. HEaz'lar bunlarin uzun tanima alanlarina yönelik ve bunlarin DNA substratlarinda bazi dizi polimorf'izmlerini tolere etmek üzere dikkate degerdir. Meganükleaz doinenleri, yapisi ve fonksiyonu bilinir, örnegin, bakiniz, Guhan and Muniyappa (2003) Crit Bazi örneklerde, bir dogal olusumlu varyant ve/veya mühendislik uygulanmis türev meganükleaz kullanilir. Kinetikleri, kofaktör etkilesimlerini, ekspresyonu, optimal kosullari ve/veya tanima alani özgüllügünü modifiye etmek ve aktivite için taramak için yöntemler bilinir, bakiniz, örnegin, Epinat et al., (2003) Nucleic Nucleic Acids Res 302e29; Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res Bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, l-Scel, l-Scell, l-Scelll, l-SceIV, l-SceV, [- SceVl, l-SceVlI, l-Ceul, l-CeuAllP, l-Crel, l-CrepsblP, l-CrepsbllP, I- CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, PI-Pspl, F-SceI, F-SceII, F-Suvl, F-TeVI, F-Tevll, l-Amal, I-Anil, l-Chul, l-Cmoel, l-Cpal, l-Cpall, l-Csml, [-Cvul, I- CvuAIP, I-Ddil, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-Hmul, I-HmuII, I-HsNIP, I-Llal, l- MsoI, I-Naal, I-Nanl, I-NcIIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp2361P, I-Pakl, I- PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PeuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I- SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-Spoml, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I- SquIP, I-Ssp6803l, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-Tevl, I- TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI- Mtul, PI-MtquP PI-MtqulP, Pl-Pful, Pl-Pfull, Pl-Pkol, Pl-Pkoll, Pl- 00850-P-0044 Rma438121P, Pl-SpBetalP, Pl-Scel, Pl-Tful, Pl-Tfull, Pl-Thyl, Pl-Tlil, Pl-Tlil veya bunlarin herhangi bir aktif varyantini veya fragmentini kapsayan herhangi bir meganükleaz burada kullanilabilir. Bir düzenlemede, meganükleaz 12 ila 40 baz çiftlik çift-sarmalli DNA dizilerini tanir. Bir düzenlemede, meganükleaz genom içinde bir mükemmel bir sekilde eslesmis hedef diziyi tanir. Bir düzenlemede, meganükleaz, bir yuvalanma nükleazidir. Bir düzenlemede yuvalanma nükleazi, yuvalanma nükleazinin bir LAGLIDADG ailesidir. Bir düzenlemede yuvalanma nükleazinin LAGLIDADG ailesi, I-Scel, I-CreI ve I-Dmol'den seçilir. Nükleaz ajanlari ilaveten, Tip I, Tip II, Tip III ve Tip IV endonükleazlarini içeren restriksiyon endonükleazlarini içerebilir. Tip I ve Tip III restriksiyon endonükleazlari, spesifik tanima yerlerini tanir, ancak tipik olarak nükleaz baglama alanindan bir degisken pozisyonda yarar, bu klevaj alanindan (tanima alanindan) yüzlerce baz çifti uzakta olabilir. Tip II sistemlerinde, restriksiyon aktivitesi, herhangi bir metilaz aktivitesinden bagimsizdir ve klevaj tipik olarak, baglama alani içinde veya yakininda spesifik alanlarda gerçeklesir. Çogu Tip II enzim, palindromik dizileri keser, bununla birlikte Tip Ila enziinleri palindromik- olmayan tanima alanlarini tanir ve tanima alaninin disini klevaj eder, Tip IIb enzimleri tanima alaninin disindaki her iki yer ile dizileri iki kez keser ve Tip lls enzimleri, bir asimetrik tanima alanini tanir ve bir yandan ve tanima alanindan yaklasik 1-20 nükleotid olan bir belirlenmis uzakliktan klevaj eder. Tip IV restriksiyon enzimleri, metillenmis DNA'yi hedef alir. Sinirlama enzimleri ayrica örnegin REBASE veritabani (web sayfasi rebase.neb.com; Roberts et al., (2003) (ASM Press, Washington, DC) içinde açiklanir ve siniflandirilir. Çesitli yöntemlerde ve bilesimlerde kullanilan nükleaz ajani ayrica, bir CRlSPR/Cas sistemi de içerebilir. Bu tür sistemler, bazi durumlarda, içinde bunun 00850-P-0044 eksprese edilecegi arzu edilen hücre tipi için kodon-optimize edilmis olan bir Cas9 nükleazi kullanabilir. Sistem ilaveten kodon-optimize edilmis Cas9 ile islev gösteren bir kaynastirilinis chNA-trachNA yapisini kullanir. Bu tek RNA siklikla, bir kilavuz RNA veya gRNA olarak ifade edilir. Bir gRNA içinde, crDNA kismi verilen tanima alani için 'hedef dizi' olarak tanimlanir ve trachNA siklikla, 'iskele' olarak adlandirilir. Bu sistemin, çesitli ökaryotik ve prokaryotik hücrelerde islev gösterdigi gösterilmistir. Kisaca hedef dizi içindeki bir kisa DNA fragmenti, bir kilavuz RNA ekspresyon plazmidi içine yerlestirilir. gRNA ekspresyon plazmidi, hedef dizi (bazi düzenlemelerde 20 nükleotid civarinda), trachNA dizisinin bir formunu (iskele) ayni zamanda hücre içinde aktif olan ve ökaryotik hücrelerde uygun isleme için gerekli elemanlari içerir. Sisteinlerin birçogu, bir çift sarmalli DNA olusturmak üzere tavlanan ve akabinde gRNA ekspresyon plazmidinde klonlanan özel, bütünleyici oligolara dayanir. gRNA ekspresyon kasedi ve Cas9 ekspresyon kasredi akabinde hücreye eklenir. Bakiniz Burada açiklanan yöntemler ve bilesimleri bir hücre içindeki bir genomu modifiye etmek üzere Kümeleninis Regüler Olarak Araliklandirilmis Kisa Palindromik Tekrarlardan (CRISPR)/CRISPR-iliskili (Cas) sistemlerinden veya bu tür sistemlerin bilesenlerinden yararlanabilir. CRISPR/Cas sistemleri, transkriptleri ve Cas genlerinin ekspresyonuna veya aktivitesini yönlendirmeye dahil edilen diger elemanlari içerir. Bir CRISPR/Cas sistemi bir tip 1, bir tip 11 veya bir tip III sistem olabilir. Burada açiklanan yöntemler ve bilesimler nükleik asitlerin yere- yönlendirilmis klevaji için (bir Cas proteini ile kompleks haline getirilmis bir kilavuz RNA (gRNA) içeren) CRISPR komplekslerinden yararlanma ile CRISPR/Cas sistemlerini kullanir. Burada açiklanan yöntemlerde kullanilan bazi CRISPR/Cas sistemleri, dogal- 00850-P-0044 olusumlu degildir. Bir "dogal-olusumlu olmayan" sistem, insan elinin dahlini gösteren herhangi bir seyi, örnegin, sistemin bunlarin dogal olusumlu halinden degistirilmis veya mutasyona ugratilmis olan, bunlarin dogada dogal olarak bununla iliskili oldugu en az bir baska bilesenden en azindan büyük ölçüde muaf olan veya bunlarin dogal olarak iliskili olmadigi en az bir baska bilesen ile iliskili olan bir veya birden fazla bilesenini, içerir. Örnegin, bazi CRISPR/Cas sistemleri dogal olarak birlikte bulunmayan bir gRNA ve bir Cas proteini içeren dogal- olusumlu olmayan CRISPR kompleksleri kullanir. A. CAS RNA-Kilavuzlu Endonükleazlar Cas proteinleri genel olarak, en az bir RNA tanima veya baglama domeni içerir. Bu tür domenler, kilavuz RNA'lar (gRNA'ar, asagida daha detayli bir sekilde tarif edilir) ile etkilesime girebilir. Cas proteinleri ayrica, nükleaz domenleri (örnegin, DNaz veya RNaz domenleri), DNA baglama domenleri, helikaz domenleri, protein-protein etkilesim domenleri, dimerizasyon domenleri ve diger domenleri içerebilir. Bir nükleaz domeni, nükleik asit klevajina yönelik katalitik aktiviteye sahiptir. Klevaj, bir nükleik asit molekülünün kovalent baglarinin kirilmasini içerir. Klevaj, küt uçlar veya yapiskan uçlar üretebilir ve bu tek-sarmalli veya çift- sarrnalli olabilir. Cas proteinlerinin örnekleri, Casl, CaslB, CasZ, Cas3, Cas4, CasS, CasSe (CasD), Casö, Casöe, Casöf, Cas7, CasSal, Ca58a2, CasSb, CasSc, Cas9 (Csnl or Csx12), CaslO, CaslOd, CasF, CasG, CasH, Csyl, Csy2, Csy3, Csel (CasA), Cse2 Csx14, CsxlO, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csx15, Csfl, CSIZ, Csf3, Csf4 ve Cu1966 ve bunun homologlari veya modifiye edilmis versiyonlarini içerir. Cas proteinleri bir tip II CRISPR/Cas sisteminden elde edilebilir. Örnegin, Cas proteini, bir Cas9 proteini olabilir veya bir Cas9 proteininden türetilebilir. Cas9 00850-P-0044 proteinleri tipik olarak, bir korunmus yapisi olan dört anahtar motifi paylasir. Motifler 1, 2 ve 4, RuVC-benzeri motiflerdir ve motif 3, bir HNH motifîdir. Cas9 proteini örnegin, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Nacardiopsi's dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces virz'dochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, AlicyclobacHlus acidocaldari'us, Bacillus pseudomycoides, Baci'llus selenz'ti'reducens, Exiguobacterium si'bi'ri'cum, Lactobacillus delbruecki'i', Lactobacillus sali'varius, Mi'crosci'lla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalem'vorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsom'i, Cyanothece sp., Microcystis aerugiriosa, Synechococcus sp., Acetohalobi'um arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becsci'i, Candidatus Desulfbrudis, Clostri'di'um bolulinum, Clostri'di'um diffici'le, Fi'negoldi'a magna, Natranaerobi'us thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Mari'nobacter sp., Nitrosococcus halophi'lus, Nitrosococcus watsom', Pseudoalteromonas haloplankti's, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evesti'gatum, Anabaena variabz'lz's, Nodularz'a Spumigena, Nostoc Sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospi'ra sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscz'llatoria sp., Petrotoga mobili's, T hermosi'pho africanus veya Acaryochlori's marina ,dan olabilir. Cas9 aile üyelerinin diger örnekleri WO Cas9 proteini tercih edilen bir enzimdir. S. pyogenes'ten elde edilen Cas9 proteinine, Q99ZW2 SwissProt erisim numarasi tayin edilir. Cas proteinleri dogal tip proteinler (diger bir ifadeyle, dogada bulunanlar), modifiye edilmis Cas proteinleri (diger bir ifadeyle Cas proteini varyantlari) veya dogal tip veya modifiye edilmis Cas proteinlerinin fragmentleri olabilir. Cas proteinleri ayrica, dogal tip veya modifiye edilmis Cas proteinlerinin aktif varyantlari veya fragmentleri olabilir. Aktif varyantlar ve fragmentler, dogal tip veya modifiye edilmis Cas proteinine veya bunun bir kismina en az %80, %85, 00850-P-0044 özdesligi içerebilir, burada aktif varyantlar istenilen bir klevaj alanindan kesme yetisini muhafaza eder ve böylelikle çentik-indükleme veya çift-sarmal-kirilmasi- indükleme aktivitesini muhafaza eder. Çentik-indükleme veya çift-sarmal- kirilmasi-indükleme aktivitesi için analizler bilinir ve genel olarak, klevaj alanini içeren DNA substratlari üzerinde Cas proteininin genel aktivitesini ve özgüllügünü ölçer. Cas proteinleri, nükleik asit baglama afmitesini, nükleik asit baglama özgüllügünü ve/Veya enzimatik aktiviteyi arttirmak veya azaltmak üzere modifiye edilebilir. Cas proteinleri ayrica proteinin herhangi bir baska aktivitesini veya özelligini, örnegin kararliligi degistirmek üzere modifiye edilebilir. Örnegin, Cas proteininin bir veya birden fazla nükleaz alani modifiye edilebilir, silinebilir veya etkisiz hale getirilebilir veya bir Cas proteini proteinin fonksiyonu için esas olmayan domenleri uzaklastirmak için veya Cas proteininin aktivitesini optimize etmek (örnegin, arttirmak veya azaltmak) üzere kirpilabilir. Bazi Cas proteinleri, en az iki nükleaz domenini örnegin DNaz alanini içerir. Örnegin, bir Cas9 proteini, bir RuvC-benzeri nükleaz domeni ve bir HNH-benzeri nükleaz domenini içerebilir. RuvC ve HNH domenlerinin her biri, DNA içinde bir çift-sarmal kirilmasi yapmak üzere çift-sarmalli DNA'nin farkli bir sarmalini Nükleaz doinenlerinin biri veya her ikisi silinebilir veya mutasyona ugratilabilir, böylece bunlar artik fonksiyonel degildir veya azaltilmis nükleaz aktivitesine sahiptir. Nükleaz domenlerinden biri silindiginde veya mutasyona ugratildiginda, elde edilen Cas proteini (örnegin, Cas9) bir nikaz olarak ifade edilebilir ve bir çift- sarmalli DNA içinde bir CRISPR RNA tanima dizisinde bir çift-sarmal kirilmasi degil bir tek-sarmal kirilmasi üretebilir (diger bir ifadeyle bu tamamlayici sarmali veya tamamlayici-olmayan sarmali klevaj edebilir ancak her ikisi klevaj etmez). Nükleaz domenlerinin her ikisi de silindiginde veya mutasyona ugratildiginda, 00850-P-0044 elde edilen Cas proteini (örnegin, Cas9), bir çift-sarmalli DNA'nin her iki sarinalini klevaj etmek üzere bir azaltilmis yetiye sahip olacaktir. Cas9'u bir nikaza dönüstüren bir mutasyonun bir örnegi, S. pyogenes'ten Cas9'un RuvC domeni içindeki bir DlOA (Cas9'un pozisyon 10'unda aspartattan alanine) mutasyonudur. Benzer sekilde, S. pyogenes'ten Cas9'un HNH domeni içindeki H939A (amino asit pozisyonu 839'da histidinden alanine) veya H84OA (amino asit pozisyonu 840'ta histidinden alanine), Cas9'u bir nikaza dönüstürebilir. Cas9'U bir nikaza dönüstüren mutasyonlarin diger örnekleri, S. thermaphilus'tan Cas9'a karsilik gelen mutasyonlari içerir. Bakiniz örnegin, Sapranauskas et al. mutasyonlar, yöntemler, örnegin, yere-yönlendirilmis mutajenez, PCR-aracili mutajenez veya toplam gen sentezi, kullanilarak üretilebilir. Nikazlar olusturan diger mutasyonlarin örnekleri, örnegin, Cas proteinleri ayrica füzyon proteinleri olabilir. Örnegin, bir Cas proteini bir klevaj domenine, bir epigenetik modifikasyon domenine, bir transkripsiyonel aktivasyon domenine veya bir transkripsiyonel baskilama domenine veya azaltilmis kararlilik saglayan bir heterolog polipeptide de kaynastirilabilir. Kaynastirilmis domen veya heterolog polipeptit N-ucunda, C-ucunda veya Cas proteini içinde içsel olarak yer alabilir. Bir Cas proteini hücreiçi lokalizasyon saglayan bir heterolog polipeptide kaynastirilabilir. Bu tür heterolog peptitler örnegin, bir nükleer lokalizasyon sinyalini (NLS), Örnegin çekirdege hedeIlemek üzere SV40 NLS, mitokondrileri hedeflemek üzere bir mitokondriyal lokalizasyon sinyali, bir ER retansiyon sinyali ve benzerlerini içerir. Bakiniz örnegin, Lange et al. (2007) J. Biol. Chem. Cas proteini içinde herhangi bir yerde yer alabilir. Bir NLS, bazik amino asitlerin bir uzamasini içerebilir ve bir tek-parçali dizi veya bir iki-parçali dizi olabilir. 00850-P-0044 Cas proteinleri ayrica, bir hücre-nüfuz etme domenine de baglanabilir. Örnegin, hücre-nüfuz etme alani, HIV-1 TAT proteininden, insan hepatit B Virüsünden TLM hücre-nüfuz etme motifinden, MPG'den, Pep-l'den, VP22'den, Herpes simpleks Virüsünden bir hücre nüfuz etme peptidinden veya bir poliarjinin peptit alani, N-ucunda, C-ucunda veya Cas proteininin herhangi bir alaninda yer alabilir. Cas proteinleri ayrica, izleme veya saflastirma kolayligi için bir heterolog polipeptit, örnegin, bir flüoresan protein, bir saflastirma etiketi veya bir epitop etiketi de içerebilir. Flüoresan proteinlerinin örnekleri, yesil flüoresan proteinleri (örnegin, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AeeGFP, ZsGreenl), sari flüoresan proteinleri (örnegin, YFP, eYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellowl), mavi flüoresan proteinleri (örnegin, eBFP, eBFPZ, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), siyan flüoresan proteinleri (örnegin, eCFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midoriishi-Cyan), kirmizi flüoresan proteinleri (mKate, mKateZ, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFPl, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HeRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), turuncu flüoresan proteinleri (mOrange, mKO, Kusabira- Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) ve herhangi bir baska uygun floresan proteinini içerir. Etiketlerin örnekleri, glutatyon-S- transferazi (GST), kitin baglama proteinini (CBP), inaltoz baglama proteinini, tioredoksini (TRX), poli(NANP), tandem afiniye saflastirma (TAP) etiketini, myc, ACVS, AUl, AU5, E, ECS, E2, FLAG, hemaglutinini (HA), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, Sl, T7, V5, VSV-G, histidini (His), biyotin karboksil tasiyici proteini (BCCP) ve kalmodülini içerir. Cas proteinleri, herhangi bir formda saglanabilir. Örnegin, bir Cas proteini bir protein, örnegin, bir gRNA ile kompleks hâline getirilmis bir Cas proteini formunda saglanabilir. Alternatif olarak, bir Cas proteini, Cas proteinini kodlayan bir nükleik asit, örnegin, bir RNA (örnegin, mesajci RNA (mRNA)) veya DNA 00850-P-0044 formunda saglanabilir. Istege bagli olarak Cas proteinini kodlayan nükleik asit Özel bir hücre veya organizma içinde proteine etkili translasyon için kodon optimize edilebilir. Cas proteinlerini kodlayan nükleik asitler hücrenin genomu içine kararli bir sekilde entegre edilebilir ve hücre içinde aktif olan bir promotöre uygulanabilir bir sekilde baglanabilir. Alternatif olarak, Cas proteinlerini kodlayan nükleik asitler bir ekspresyon yapisi içinde bir promotöre uygulanabilir bir sekilde baglanabilir. Ekspresyon yapilari, bir genin veya söz konusu bir baska nükleik asit dizisinin (örnegin, bir Cas geninin) ekspresyonunu yönlendirebilen ve söz konusu bu tür bir nükleik asit dizisini bir hedef hücre içine transfer edebilen herhangi bir nükleik asit yapisini içerir. Bir ekspresyon yapisi içinde kullanilabilen promotörler örnegin, bir pluripotent siçan, ökaryotik, memeli, insan-olmayan memeli, insan, kemirgen, fare veya hamster hücresi içinde aktif olan promotörleri içerir. Diger promotörlerin örnekleri burada baska yerde tarif edilir. (ii) B. Kilavuz RNA'lar (gRNA'lar) Bir "kilavuz RNA" veya "gRNA", bir Cas proteinini baglayan ve Cas proteinini bir hedef DNA içinde spesifik bir lokasyona hedefleyen bir RNA molekülünü içerir. Kilavuz RNA'Lar (gRNA), iki segment, bir "DNA-hedefleme segmenti" ve bir "protein-baglama segmenti", içerebilir. "Segment", bir molekülün bir seginentini, bölümünü veya bölgesini, örnegin, bir RNA içindeki nükleotidlerin kesintisiz bir uzamasini, içerir. Bazi gRNA'lar, iki ayri RNA molekülünü içerir: bir "aktivaktör-RNA" ve bir hedefleyici-RNA". Diger gRNA'lar, ayrica bir "tek- moleküllü gRNA", bir "tek-kilavuzlu RNA" veya bir "sgRNA" olarak da adlandirilabilen bir tek RNA molekülüdür (tekli RNA polinükleotidleridir). Bakiniz 00850-P-0044 moleküllü gRNA'lari içerir. Örnek bir iki moleküller gRNA, bir chNA-benzeri ("CRISPR RNA" veya gelen bir trachNA-benzeri ("trans-etkili CRISPR RNA" veya "aktivatör-RNA" veya "trachNA" veya "iskele") molekülünü içerir. Bir chNA, gRNA"n1n DNA- hedefleme segmentini (tek sarmalli) ve gRNA'nin protein-baglama segmentinin dsRNA dubleksinin bir yarisini olusturan nükleotidlerin bir gerilmesini içerir. Bir karsilik gelen trachNA (aktivatör-RNA), gRNA'nin protein-baglama segmentinin dsRNA dubleksinin diger yarisini olusturan nükleotidlerin bir uzamasini içerir. Bir chNA'nin nükleotidlerinin bir uzamasi, gRNA'nin protein- baglama alaninin dsRNA dubleksini olusturmak için bir trachNA'nin nükleotidlerinin bir uzamasina bütünleyicidir veya bununla hibridize olur. Benzer bir sekilde her bir chNAlnin karsilik gelen bir trachNA°ya sahip oldugu söylenebilir. chNA ve karsilik gelen trachNA, bir gRNA olusturmak üzere hibritlesir. chNA ayrica bir CRISPR RNA tanima dizisini hibritlestiren tek sarmalli DNA- hedefleme segmentini saglar. Bir hücre içinde modifikasyon için kullanildiginda, verilen bir chNA veya trachNA molekülünün tam dizisi, burada RNA moleküllerinin kullanilacagi türe spesifik olacak sekilde tasarlanabilir. Bakiniz Verilen bir gRNA,nin DNA hedefleme segmenti (chNA), bir hedef DNA°da bir diziye bütünleyici olan bir nükleotid dizisini içerir. Bir gRNA9nin DNA hedefleme segmenti, hibridizasyon (diger bir ifadeyle, baz çiftleme) ile dizi- spesifik bir sekilde bir hedef DNA ile etkilesime girer. Böylelikle, DNA- 00850-P-0044 hedefleme segmentinin nükleotid dizisi çesitlilik gösterebilir ve gRNA'nin ve hedef DNA'nin etkilesime girecegi hedef DNA içindeki lokasyonu belirler. Söz konusu bir gRNA'nin DNA-hedefleme segmenti, bir hedef DNA içinde arzu edilen herhangi bir diziye hibridize olmasi için modifiye edilebilir. Dogal olusumlu chNA'Lar Cas9 sistemine ve organizmaya bagli olarak farklilik gösterir, ancak siklikla her iki yaninda 21 ila 46 nükleotidlik bir uzunlukta iki dogrudan tekrar (DR) yer alan, 21 ila 72 nükleotid uzunlugundaki bir hedefleme DR'ler 36 nükleotid uzunlugundadir ve hedefleme segmenti 30 nükleotid uzunlugundadir. 3' ucunda yer alan DR, nihayetinde Cas9 proteinini baglayan karsilik gelen trachNA'ya bütünleyicidir veya bununla hibridize olur. DNA-hedefleme segmenti, yaklasik 12 nükleotid ila yaklasik 100 nükleotid olan bir uzunluga sahip olabilir. Örnegin, DNA-hedefleme segmenti, yaklasik 12 nükleotid (nt) ila yaklasik 80 mt, yaklasik 12 mt ila yaklasik 50 mt, yaklasik 12 mt nt, yaklasik 12 mt ila yaklasik 20 nt veya yaklasik 12 nt ila yaklasik 19 nt olan bir uzunluga sahip olabilir. Alternatif olarak, DNA-hedefleme segmenti, yaklasik 19 yaklasik 20 nt ila yaklasik 100 nt olan bir uzunluga sahip olabilir. Hedef DNA'nin bir nükleotid dizisine (CRISPR RNA tanima dizisine) bütünleyici olan DNA-hedefleme segmentinin nükleotid dizisi, en az yaklasik 12 nt olan bir 00850-P-0044 uzunluga sahip olabilir. Örnegin, DNA-hedefleme dizisi (diger bir ifadeyle, hedef DNA içindeki bir CRISPR RNA tanima dizisine bütünleyiei olan DNA-hedefleme segmenti içindeki dizi) en az yaklasik 12 nt, en az yaklasik 15 nt, en az yaklasik 18 nt, en az yaklasik 19 nt, en az yaklasik 20 nt, en az yaklasik 25 nt, en az yaklasik 30 nt, en az yaklasik 35 nt veya en az yaklasik 40 mt olan bir uzunluga sahip olabilir. Alternatif olarak DNA-hedefleme dizisi, yaklasik 12 nükleotid (nt) nt ila yaklasik 50 nt veya yaklasik 20 nt ila yaklasik 60 nt olan bir uzunluga sahip olabilir. Bazi durumlarda, DNA-hedefleme dizisi, yaklasik 20 nt olan bir uzunluga sahip olabilir. TrachNA'lar, herhangi bir formda (örnegin, tam-boy trachNA'lar veya aktif parsiyel trachNA'lar formunda) ve çesitlilik gösteren uzunluklarda olabilir. Bunlar primer transkriptler veya islenmis formlar içerebilir. Örnegin, (bir tek- kilavuzlu RNA'nin parçasi olarak veya bir iki-moleküllü gRNA'nin parçasi olarak ayri bir molekül olarak) trachNA'lar bir dogal-tip trachNA dizisinin tümünü veya bir kismini (örnegin, bir dogal-tip trachNA dizisinin yaklasik 20, 26, 32, bunlardan olusabilir. S. pyogenes'ten dogal-tip trachNA dizilerinin örnekleri, içindeki trachNA'larin 00850-P-0044 örnekleri, sgRNA'larin +48, +54, +67 ve +85 versiyonlari içinde bulunan trachNA segmentlerini içerir, burada "+n", dogal-tip trachNA'nin +n nükleotidine kadarinin sgRNA'ya dâhil edildigini gösterir. Bakiniz US 8,697,359. DNA-hedefleme dizisi ve hedef DNA içindeki CRISPR RNA tanima dizisi arasindaki tamamlayicilik yüzdesi, en az %60 (Örnegin, en az %65, en az %70, en az %99 veya %100) olabilir. DNA-hedefleme dizisi ve hedef DNA içindeki CRISPR RNA tanima dizisi arasindaki tamamlayicilik yüzdesi, kesintisiz yaklasik nükleotid boyunca en az %60 olabilir. Bir örnek olarak, DNA-hedefleme dizisi ve hedef DNA içindeki CRISPR RNA tanima dizisi arasindaki tamamlayicilik yüzdesi, hedef DNA'nin bütünleyici sarmali içindeki CRISPR RNA tanima dizisinin 5' ucunda yer alan kesintisiz 14 nükleotidi boyunca %100'dür ve geri kalani boyunca %0 kadar düsüktür. Böyle bir durumda, DNA-hedeileme dizisinin, 14 nükleotid uzunlugunda oldugu düsünülebilir. Bir baska örnek olarak, DNA- hedefleme dizisi ve hedef DNA içindeki CRISPR RNA tanima dizisi arasindaki tamamlayicilik yüzdesi, hedef DNA'nin bütünleyici sarmali içindeki CRISPR RNA tanima dizisinin 5' ucunda yer alan kesintisiz yedi nükleotidi boyunca hedefleme dizisinin, 7 nükleotid uzunlugunda oldugu düsünülebilir. Bir gRNA'nin protein-baglama segmenti, nükleotidlerin bir digerine bütünleyici olan iki uzainasini içerebilir. Protein-baglama segmentinin bütünleyici nükleotidleri, bir çift-sarmalli RNA dubleks (dsRNA) olusturmak için hibridize olur. Söz konusu bir gRNA'nin protein-baglama segmenti, Cas proteini ile etkilesime girer ve gRNA bagli Cas proteinini DNA-hedefleme segmenti vasitasiyla hedef DNA içindeki bir spesifik nükleotid dizisine yönlendirir. Kilavuz RNA'lar, ilave arzu edilebilen özellikler (örnegin, modifiye edilmis veya regüle edilmis kararlilik; hücreiçi hedeIleme; bir Ilüoresan etiket ile izleme; bir protein veya protein kompleksi için bir baglama alani ve benzerlerini) saglayan 00850-P-0044 modifikasyonlar veya diziler içerebilir. Bu tür modifikasyonlarin örnekleri, Örnegin, bir 5' basligi (örnegin, bir 7-metilguanilat basligi (m7G)); bir 3' poli- adenillenmis kuyruk (diger bir ifadeyle, bir 3' poli(A) kuyrugu); (örnegin, proteinler ve/veya protein kompleksleri tarafindan regüle edilmis kararliliga ve/veya regüle edilmis erisilebilirlige olanak saglamak için) bir ribo-anahtar dizisi; bir kararlilik kontrol dizisi, bir dsRNA dubleksi (diger bir ifadeyle, bir keskin-dönüs) olusturan bir dizi; RNA'yi bir hücreiçi lokasyona (örnegin, nükleusa, mitokondrilere, kloroplastlara ve benzerlerini) hedefleyen bir modifikasyon veya dizi; izleme saglayan bir modifikasyon veya dizi (örnegin, bir flüoresan moleküle dogrudan konjugasyon, flüoresan saptamayi kolaylastiran bir kisma konjugasyon, flüoresan saptamaya olanak saglayan bir dizi ve benzerleri); proteinler (örnegin, DNA üzerinde etki eden, transkripsiyonel aktivatörleri, transkripsiyonel baskilayicilari, DNA metiltransferazlarini, DNA deinetilazlarini, histon asetiltransferazlarini, histon deasetilazlarini ve benzerlerini kapsayan proteinler) için bir baglama alani saglayan bir modifikasyon veya dizi ve bunlarin kombinasyonlarini içerir. Kilavuz RNA'lar, herhangi bir formda saglanabilir. Örnegin gRNA, iki molekül (ayrica chNA ve trachNA) olarak veya bir molekül (sgRNA) olarak ve istege bagli olarak bir Cas proteini ile bir kompleks formunda RNA formunda saglanabilir. gRNA ayni zamanda RNA,yi kodlayan DNA formunda saglanabilir. gRNA°yi kodlayan DNA, tek bir RNA molekülünü (sgRNA) veya ayri RNA moleküllerini (örnegin ayri chNA ve trachNA) kodlayabilir. Son bahsedilen durumda, gRNA'yi kodlayan DNA, sirasiyla chNA'yi ve trachNA'yi kodlayan ayri DNA molekülleri olarak saglanabilir. gRNA'lari kodlayan DNA'lar, hücrenin genomu içine kararli bir sekilde entegre edilebilir ve hücre içinde aktif olarak bir promotöre uygulanabilir bir sekilde baglanabilir. Alternatif olarak, gRNA'lari kodlayan DNA'lar bir ekspresyon yapisi içinde bir promotöre uygulanabilir bir sekilde baglanabilir. Bu tür promotörler, örnegin, bir pluripotent siçan, ökaryotik, memeli, insan-olmayan memeli, insan, 00850-P-0044 kemirgen, fare veya hamster hücresi içinde, aktif olabilir. Bazi durumlarda, promotör, bir RNA polimeraz III promotörüdür, örnegin, bir insan U6 promotörüdür, bir siçan U6 polimeraz III promotörüdür veya bir fare U6 polimeraz III promotörüdür. Diger promotörlerin örnekleri burada baska yerde tarif edilir. Alternatif olarak, gRNA'lar çesitli baska yöntemler ile hazirlanabilir. Örnegin, gRNA'lar, örnegin, T7 RNA polimeraz, kullanilarak in vitro transkripsiyon ile RNA'lar ayrica, kimyasal sentez ile hazirlanan bir sentetik olarak üretilmis molekül de olabilir. (iii) C. CRISPR RNA Tanima Dizileri için yeterli kosullarin var olmasi kaydiyla, bir gRNA'nin bir DNA-hedefleme segmentinin baglayacagi, nükleik asit dizilerini içerir. Örnegin, CRISPR RNA tanima dizileri, bir kilavuz RNA'nin bunlara tamamlayiciliga sahip olmasi için tasarlandigi dizileri içerir, burada bir CRISPR RNA tanima dizisi ve bir DNA hedefleme dizisi arasindaki hibridizasyon bir CRISPR kompleksinin olusumunu hizlandirir. Burada hibridizasyona neden olmasi için yeterli tamamlayicilik bulunmasi ve bir CRISPR kompleksinin olusumunu hizlandirrnasi kaydiyla, tam tamamlayicilik zorunlu bir sekilde gerekli degildir. CRISPR RNA tanima dizileri ayrica, asagida daha detayli bir sekilde tarif edildigi üzere, Cas proteinleri için klevaj yerleri de içerir. Bir CRISPR RNA tanima dizisi, örnegin, bir hücrenin nükleusu veya sitoplazmasi içinde veya bir hücrenin bir organeli, örnegin, bir mitokondri veya kloroplast, içinde yer alabilen herhangi bir polinükleotidi içerebilir. Bir hedef DNA içindeki CRISPR RNA tanima dizisi, Cas proteini veya gRNA tarafindan hedeflendirilebilir (veya tarafindan baglanabilir veya bunlarla hibridize 00850-P-0044 olabilir veya bunlara bütünleyici olabilir). Uygun DNA/RNA baglama kosullari, bir hücre içinde normal olarak bulunan fizyolojik kosullari içerir. Diger uygun DNA/RNA baglama kosullari (örnegin, bir hücresiz sistem içindeki kosullar) teknikte bilinir (bakiniz, örnegin, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001)). Hedef DNA'nin Cas proteinine veya gRNA'ya bütünleyici olan veya bunlar ile hibridize olan sarmali, sarmala" tamamlayici olan (ve bundan dolayi Cas proteinine veya gRNA'ya tamamlayici -olmayan) sarmali "tamamlayici -olmayan sarmal" veya "sablon sarmal" olarak adlandirilabilir. Cas proteini, bir gRNA'nin DNA-hedefleme segmentinin baglayacagi hedef DNA içinde bulunan nükleik asit dizisinin içindeki veya disindaki bir yerden nükleik asidi yarabilir. "Klevaj alani", bir nükleik asidin, bir Cas proteininin bir tek-sarmal kirilmasi veya bir çift-sarmal kirilmasi ürettigi pozisyonunu içerir. Örnegin, (bir CRISPR RNA tanima dizisine hibridize edilmis ve bir Cas proteini ile kompleks hâline getirilmis bir gRNA içeren) bir CRISPR kompleksinin olusumu, bir gRNA'nin bir DNA-hedefleme segmentinin baglayacagi bir hedef DNA içinde veya her iki sarmalin klevaji ile sonuçlanabilir. Klevaj alani gRNA'nin DNA- hedefleme segmentinin baglayacagi nükleik asit dizisinin disinda oldugunda, klevaj alaninin hala "CRISPR RNA tanima dizi" içinde oldugu düsünülür. Klevaj alani bir nükleik asidin yalnizca bir sarinali üzerinde veya her iki sarmali üzerinde olabilir. Klevaj yerleri nükleik asit her iki sarmali üzerinde ayni pozisyonda olabilir (küt uçlar üretir) veya her bir sarmal üzerinde farkli yerlerde olabilir (yapiskan uçlar üretir). Yapiskan uçlar, örnegin, her biri her bir sarmal üzerinde farkli bir klevaj alaninda bir tek-sarmal kirilmasi üreten, böylece bir çift-sarmal kirilmasi üreten, iki Cas proteini kullanilarak üretilebilir. Örnegin, bir birinci nikaz çift-sarmalli DNA'nin (dsDNA)'nin birinci sarmali üzerinde bir tek-sarmal kirilmasi olusturabilir ve bir ikinci nikaz, dsDNA'nin ikinci sarmali üzerinde bir 00850-P-0044 tek-sarmal kirilmasi olusturulabilir, böylece çikinti yapan dizileri olusturulur. Bazi durumlarda, birinci sarmal üzerinde nikazin CRlSPR RNA tanima dizisi en az 2, ile ikinci sarmal üzerindeki nikazin CRlSPR RNA tanima dizisinden ayrilir. Hedef DNA'nin Cas9 tarafindan yer-spesifik klevaji hedef DNA içinde, hem (i) gRNA ve hedef DNA arasindaki baz-eslesme tamamlayiciligi hem de (ii) proto- aralayici bitisik motif (PAM) olarak adlandirilan bir kisa motif ile belirlenen lokasyonlarda gerçeklesebilir. PAM'in her iki yaninda CRlSPR RNA tanima dizisi yer alabilir. Istege bagli olarak CRlSPR RNA tanima dizisinin her iki yaninda PAM yer alabilir. Örnegin, Cas9'un klevaj alani, PAM dizisinin yaklasik 1 ila yaklasik 10 veya yaklasik 2 ila yaklasik 5 baz çifti (örnegin, 3 baz çifti) upstream veya downstreain kisminda olabilir. Bazi durumlarda (örnegin, S. pyogenes'ten Cas9 veya bir yakin bir sekilde iliskili Cas9 kullanildiginda), tamamlayici- olmayan sarmalin PAM dizisi, 5'-N1GG-3"tür, burada N1, herhangi bir DNA nükleotididir ve hedef DNA'nin tamamlayici-olmayan sarmalinin CRlSPR RNA tanima dizisinin hemen 3' ucudur. Böylelikle, tamamlayici sarmalin PAM dizisi, '-CCN2-3' olacaktir, burada N2, herhangi bir DNA nükleotididir ve hedef DNA'nin tamamlayici sarmalinin CRlSPR RNA tanima dizisinin hemen 5' ucudur. Bazi bu tür düzenlemelerde, N, ve N2, tamamlayici olabilir ve Ni-Nz baz çifti herhangi bir baz çifti olabilir (örnegin, N1=C ve N2=G; N 1=G ve N2=C; Ni=A CRlSPR RNA tanima dizilerinin örnekleri, bir gRNA'nin DNA-hedefleme segmentine tamamlayici olan bir DNA dizisi veya bir PAM dizisine ek olarak bu tür bir DNA dizisi içerir. Örnegin, hedef motif, bir Cas proteini (bakiniz gelen bir 20-nükleotidlik DNA dizisi olabilir. 5' ucundaki guanin, hücrelerde RNA polimeraz tarafindan transkripsiyonu kolaylastirabilir. CRlSPR RNA tanima dizilerinin diger örnekleri, T7 polimeraz tarafindan in vitro etkili transkripsiyonu 00850-P-0044 kolaylastiran 5' ucunda iki guanin nükleotidi (örnegin, GGNZONGG; SEQ ID NO: CRlSPR RNA tanima dizisi, bir hücre için endojen veya ekzoj en olan herhangi bir nükleik asit dizisi olabilir. CRISPR RNA tanima dizisi bir gen ürününü (örnegin, bir proteini) kodlayan bir dizi veya bir kodlamayan dizi (örnegin, bir regülatör dizi) olabilir veya her ikisini de içerebilir. Bir düzenlemede hedef dizi, Protoaralik Bitisik Motif (PAM) dizisi ile bitisiktir. Bir düzenlemede söz konusu lokus, SEQ ID NO: l7in nükleotid dizisini içerir. Bir düzenlemede gRNA, Küinelenmis Düzenli Olarak Araliklandirilmis Kisa Palindromik Tekrarlari (CRISPR) RNA (cRNA) ve trans-etkili CRISPR RNA,yi (trachNA) kodlayan üçüncü bir nükleik asit dizisini içerir. Diger bir düzenlemede pluripotent siçan hücresinin genoinu, hedef dizisine bütünleyici olan bir hedef DNA bölgesini içerir. Bazi bu tür yöntemlerde Cas proteini, Cas9"dur. Bazi düzenlemelerde gRNA, (a) SEQ ID NO: 25nin nükleik asit dizisinin kimerik RNA"sini; veya (b) SEQ ID NO: 3"ün nükleik asit dizisinin kimerik RNA7S1n1 içerir. Bazi bu tür yöntemlerde chNA, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 veya SEQ NO: 7 veya SEQ ID NO: 8'de belirtilen diziyi içerir. Nükleaz ajanlarinin aktif varyantlari ve fragmentleri (diger bir ifadeyle, bir mühendislik uygulaninis nükleaz ajani) saglanir. Bu tür aktif varyantlar, natif varyantlar arzu edilen bir tanima alanindan kesme yetisini muhafaza eder ve böylelikle çentik veya çift-sarmal-kirilmasi-indükleme aktivitesini muhafaza eder. Örnegin, burada tarif edilen nükleaz ajanlarinin herhangi biri, bir natif endonükleaz dizisinden modifiye edilebilir ve natif nükleaz ajani tarafindan taninmayan bir tanima alaninda tanimasi ve bir çentik veya çift-sarmal kirilmasi Indüklemesi için tasarlanabilir. Böylelikle, bazi düzenlemelerde, mühendislik 00850-P-0044 uygulanmis nükleaz, karsilik gelen natif nükleaz ajani tanima alanindan farkli bir tanima alaninda bir çentik veya çift-sarmal kirilmasi indüklemesi için bir özgüllüge sahiptir. Çentik veya çift-sarmal-kirilmasi-indükleme aktivitesi için analizler bilinir ve genel olarak, tanima alani içeren DNA substratlari üzerinde endonükleazin genel aktivitesini ve özgüllügünü ölçer. Nükleaz ajani, teknikte bilinen herhangi bir araç ile hücreye eklenebilir. Nükleaz ajanini kodlayan polipeptid, dogrudan hücreye eklenebilir. Alternatif olarak nükleaz ajanini kodlayan bir polinükleotid, hücreye eklenebilir. Nükleaz ajanini kodlayan bir polinükleotid, hücreye eklendiginde nükleaz ajani geçici olarak, kosullu olarak veya yapici olarak hücre içinde eksprese edilebilir. Bu nedenle nükleaz ajanini kodlayan polinükleotid, bir ekspresyon kasedinde bulunabilir ve bir kosullu promotöre, bir indüklenebilir promotörü veya bir dokya spesifik promötöre uygulanabilir bir sekilde baglanabilir. Söz konusu bu tür promotörler, burada diger bir yerde daha detayli olarak açiklanir. Alternatif olarak nükleaz ajani, nükleaz ajanini kodlayan bir mRNA olarak hücrelere eklenir. Spesifik düzenlemelerde nükleaz ajanini kodlayan polinükleotid, hücrenin genomunda stabil olarak entegre edilebilir ve hücrede aktif olan bir promotöre uygulanabilir bir sekilde baglanabilir. Diger düzenlemelerde, diger örneklerde nükleaz ajanini kodlayan polinükleotid bir vektörde veya ek polinükleotid içeren hedefleme vektöründen ayri olan bir plazmidde olurken nükleaz ajanini kodlayan polinükleotid, ek polinükleotid içeren ayni hedetleme vektöründedir. Nükleaz ajani, nükleaz ajanini kodlayan bir polinükleotidin eklenmesi araciligiyla hücreye saglandiginda nükleaz ajanini kodlayan bu tür bir polinükleotid, nükleaz ajanini kodlayan dogal olarak meydana gelen bir polinükleotid dizisi ile karsilastirildiginda söz konusu hücrede daha yüksek bir kullanim sikligina sahip olan kodonlari sübstitüe etmek üzere modifiye edilebilir. Örnegin, nükleaz ajanini kodlayan polinükleotid, dogal olusumlu polinükleotid dizisi ile karsilastirildiginda, bir bakteriyel hücre, bir maya hücresi, bir insan hücresi, bir 00850-P-0044 insan-olmayan hücre, bir memeli hücresi, bir kemirgen hücresi, bir fare hücresi, bir siçan hücresi veya söz konusu herhangi bir baska konak hücre dahil olinak üzere verilen bir prokaryotik veya ökaryotik hücrede daha yüksek bir kullanim sikligina sahip olan kodonlari sübstitüe etmek için modifiye edilebilir. B. Zorlu Genomik Lokus veya bir Y Kromozomu Lokusunu Modifiye Etmek Üzere Bir Büyük Hedefleme Vektörü (LTVEC) veya Bir Küçük Hedefleme Vektörü (küçük TVEC) ile Kombinasyon Halinde CRISPR/Cas Sisteminin Kullanilmasi Bir zorlu genomik lokusun veya Y kromozomunun bir lokusunun modifiye edilmesine yönelik sinirlayici olmayan yöntemler, kromozomun (diger bir ifadeyle, Y kromozomu) en az 10 kbslik bir nükleik asit dizisini içeren bir büyük hedefleme vektörü (LTVEC) varliginda bir Cas proteini ve bir CRISPR RNA,ya maruz kalmasini içerir, burada CAS proteini, CRISPR RNA ve LTVEC"ye maruziyetin akabinde kromozom (diger bir ifadeyle, Y kromozomu), en az 10 kb nükleik asit dizisini içermek üzere modifiye edilir. Bu tarifnamenin yöntemi, burada açiklanan LTVECWer veya küçük TVECalerden herhangi birini kullanabilir. Bu tarifname, LTVEC veya küçük TVEC"nin en az dizisini içermesini açiklar. Diger düzenlemelerde LTVEC,nin 5° ve 3° homoloji kollarinin genel toplami yaklasik 10 kb ila yaklasik 150 kb, yaklasik 10 kb ila küçük TVECnin 57 ve 37 homoloji kollarinin genel toplaminin yaklasik 0.5 kb, 1 00850-P-0044 ila yaklasik 9 kb'dir veya en az 10 kb olmasini açiklar. Bu tarifnamede ayrica Y kroinozomunun üzerinde bir zorlu hedef lokusun veya bir hedef genomik lokusun modifiye edilmesine yönelik, asagidaki adimlari içeren bir yöntem saglanir: (a) Y kromozomunun üzerinde zorlu hedef lokusu veya hedef genomik lokusu içeren bir memeli hücresinin saglanmasi, burada hedef genomik lokus, bir kilavuz RNA (gRNA) hedef dizisini içerir; (b) memeli hücresine asagidakilerin eklenmesi: (i) hedef genomik lokus ile homolog olan hedefleme kollari ile bitisik olan birinci bir nükleik asidi içeren bir büyük hedefleme vektörü (LTVEC), burada LTVEC en az 10 kb"dir; (ii) bir Cas proteinini kodlayan ikinci bir nükleik aside uygulanabilir bir sekilde baglanan birinci bir promotörü içeren birinci bir ekspresyon yapisi ve (iii) gRNA hedef dizisi ve bir trans-aktive edici CRlSPR RNA"ya (trachNA) hibritlesen bir nükleotid dizisini içeren bir kilavuz RNA"y1 (gRNA) kodlayan üçüncü bir nükleik aside uygulanabilir bir sekilde baglanan ikinbi bir promotörü içeren ikinci bir ekspresyon yapisi, burada birinci ve ikinci promotörler, memeli hücresinde aktiftir; ve (0) Y kromozomu üzerinde zorlu hedef genomik lokusta veya hedef genomik lokusta hedeflenen bir genetik modifikasyonu içeren modifiye edilmis bir memeli hücresinin tanimlanmasi. Spesifik düzenlemelerde birinci ve ikinci ekspresyon yapisi, tek bir nükleik asit molekülünün üzerindedir. Diger düzenlemelerde Y kromozomunun hedef Yukarida belirtildigi üzere bir düzenlemede Cas proteini, bir Cas9 proteinini içerebilir. Diger bir düzenlemede gRNA hedef dizisi, Protoaralik Bitisik Motif (PAM) dizisi ile bitisiktir. Bu tarifnamenin yöntemi, burada açiklanan LTVEC"ler veya küçük TVEC°lerden herhangi birini kullanabilir. Bu tarifname, LTVEC veya küçük TVECinin en az 00850-P-0044 100 kb, en az 150 kb veya en az 200 kb olmasini saglar. Diger düzenlemelerde LTVECnin 5" ve 3, homoloji kollarinin genel toplami yaklasik 10 kb ila yaklasik ila 150 kb,dir. CRISPR/Cas sisteminini kullanan çesitli yöntemler (veya burada açiklanan herhangi bir yöntem), örnegin memeli hücreleri, insan olmayan memeli hücreleri, fibroblast hücreler, kemirgen hücreleri, siçan hücreleri, fare hücreleri veya hamster hücreleri üzerinde gerçeklestirilebilir. Hücre, bir pluripotent hücre, bir indüklü pluripotent kök (iPS) hücresi, fare embriyonik kök (ES) hücresi, bir siçan embriyonik kök (ES) hücresi, insan embriyonik (ES) hücresi veya gelisimsel olarak sinirli insan progenitör hücresi olabilir. Asagida detayli olarak açiklandigi üzere örnegin yukarida belirtilen CRISPR/Cas sisteminin kullanilmasini kullanan bir insan olmayan pluripotent hücrenin Y kromozomunun (diger bir ifadeyle, Sry lokusu) üzerinde bir zorlu genomik lokus veya söz konusu genomik lokusun modifikasyonunu takiben üretilen genetik olarak modifiye edilmis insan olmayan pluripotent hücre, insan olmayan bir konakçi embriyoya eklenebilir ve tasiyici annede modifiye edilmis pluripotent hücreyi içeren insan olmayan konakçi embriyo gebe birakilir. Tasiyici anne, hedeflenen genetik modifikasyonu içeren FO dölünü üretir. Spesifik düzenlemelerde hedeflenen genetik modifikasyon, germ hatti boyunca aktarilabilir. C. Seçim Belirteçleri Çesitli seçim belirteçleri, Y kromozomu üzerinde bir hedef genomik lokusun veya bir zorlu hedef genomik lokusun modifiye edilmesini saglayan burada açiklanan yöntemlerde ve bilesimlerde kullanilabilir. Bu tür belirteçler, burada diger bir 00850-P-0044 yerde açiklanir ve bunlarla sinirli olmamak üzere G418, higromisin, blastosidin, neomisin veya puroinisin gibi bir antibiyotige direnç uygulayan seçim belirteçlerini içerir. Seçici belirteçlerini kodlayan polinükleotid, hücre içinde aktif olan bir promotöre uygulanabilir bir sekilde baglanir. Bu tür ekspresyon kasetleri ve çesitli regülatör bilesenleri, burada diger bir yerde daha ayrintili olarak açiklanir. D. Hedef Genomik Lokus Bu tarifnamenin çesitli yöntemleri ve bilesimleri, Y kromozomunun üzerinde bir hedef genomik lokusta veya bir zorlu hedef genomik lokusta en az bir ek polinükleotidin entegrasyonunu saglayacak sekilde saglanir. Burada kullanildigi üzere "Y kromozomunun üzerinde bir hedef genomik lokus", bir ek polinükleotid entegre etmeyi isteyen Y kromozomunun üzerinde DNA`nin herhangi bir segmentini ve bölgesini içerir. Y kromozomunun üzerindeki genomik lokus veya hedeflenen zorlu hedef genomik lokus, hücreye natif olabilir veya alternatif olarak hücrenin kromozomuna entegre edilen DNAanin bir heterolog veya egzojen seginentini içerebilir. DNAsnin bu tür heterolog veya egzojen segmentleri, transgenleri, ekspresyon kasetlerini, polinükleotid kodlayici seçim belirteçlerini veya genomik DNA"nin heterolog veya egzojen bölgelerini içerebilir. Y kromozomunun üzerindeki hedef genomik lokus veya zorlu hedef genomik lokus, örnegin tanima alani, seçim belirteci, önceden entegre edilen ek polinükleotidleri, nükleaz ajanlarini kodlayan polinükleotidleri, promotörleri, vb. içeren hedeflenen genomik entegrasyon sisteminin herhangi birini içerebilir. Alternatif olarak Y kromozomunun üzerinde hedef genomik lokus veya zorlu hedef genomik lokus, bir maya yapay kromozomunda (YAY), bakteriyel yapay kromozomda (BAC), bir insan yapay kromozomunda veya uygun bir konakçi hücrede yer alan diger degistirilmis genomik bölgelerde yerlestirilebilir. Bu nedenle bu tarifname, Y kromozomunun üzerinde hedeflenen genomik lokus veya zorlu hedef genomik 00850-P-0044 lokusun, bir insan olmayan memeli, bir insan olmayan hücre, bir kemirgen, bir insan, bir siçan, bir fare, bir hamster, bir tavsan, bir domuz, bir büyükbas, bir geyik, bir keçi, bir tavuk, bir kedi, bir köpek, bir dag gelincigi, bir primat (örnegin, marmoset, Hint sebegi), evcillestirilmis memeli veya tarimsal bir hayvan veya söz konusu diger herhangi bir organizma veya bunun bir kombinasyonundan natif, heterolog veya egzojen genomik nükleik asit dizisini içerebilir. Y kromozomunun üzerindeki hedef genomik lokusun sinirlayici olmayan Örnekleri, Sry geni, Uty geni, Eif2$3y geni, Ddx3y geni, gen, Ubely geni, Tspy geni, Usp9y geni, Zfyl geni ve Zfy2 geni ve Kdm5d, Eif283y, Tspy, Uty, DdX3y ve Usp9y genlerini kapsayan Y kromozomunun üzerindeki bölgeyi içerir. Y kromozomunun üzerindeki bu tür bir lokus, bir insan olmayan memeli, bir memeli, bir kemirgen, bir insan, bir siçan, bir fare, bir hamster, bir tavsan, bir domuz, bir büyükbas, bir geyik, bir koyun, bir keçi, bir tavuk, bir kedi, bir köpek, bir dag gelincigi, bir primat (örnegin, marrnoset, Hint sebegi), evcillestirilmis memeli veya tarimsal bir hayvan veya söz konusu diger herhangi bir organizma veya bunun bir kombinasyonundan olabilir. Bu tür hücreler, örnegin indüklü pluripotent kök (iPS) hücrelerini, fare embriyonik kök (ES) hücrelerini, siçan embriyonik kök (ES) hücrelerini, insan embriyonik kök (ES) hücresini veya gelisimsel olarak sinirli insan progenitör hücreleri içeren pluripotent hücreleri Burada diger bir yerde açiklandigi üzere çesitli yöntemler ve bilesimler, Sry proteininin düsük aktivitesine veya seviyesine sahip olan XY pluripotent ve/veya totipotent hücreleri (örnegin XY ES hücreleri veya iPS hücreleri) içerecek sekilde saglanir. Y kromozomunun üzerindeki genomik lokusu modifiye etmek üzere burada açiklanan çesitli yöntemler ayni zamanda Y kromozomunun üzerinde bulunmayan söz konusu polinükleotidlere hedeflenen genetik modifikasyonlari eklemek üzere kullanilabilir. 00850-P-0044 E. Hedefleme Vektörleri ve Ek Polinükleotidler Yukarida belirtildigi üzere burada saglanan yöntemler ve bilesimler, tek basina veya bir nükleaz ajani ile kombinasyon halinde hedefleme vektörlerini kullanir. geçisli alanlarda iki DNA molekülü arasinda DNA fragmentlerinin degisimini i'. Ek Polinükleotid Burada kullanildigi üzere "ek polinükleotid,", hedef genomik lokusta entegre olmak isteyen bir DNA segmentini içerir. Spesifik düzenlemelerde hedef genomik lokus, Y kromozomunun üzerindedir. Diger düzenlemelerde hedef genomik lokus, bir zorlu genomik lokustur. Bir düzenlemede ek polinükleotid, söz konusu bir veya daha fazla polinükleotidi içerir. Diger düzenlemelerde ek polinükleotid, bir ekspresyon kasedini içerebilir. Verilen bir ekspresyon kasedi, söz konusu bir polinükleotidi, bir seçim belirtecini kodlayan bir polinükleotidi ve/veya ekspresyonu etkileyen çesitli regülatör bilesenler ile birlikte bir raportör geni içerebilir. Ek polinükleotidin içinde bulunabilen söz konusu polinükleotidlerin, seçim belirteçlerinin ve raportör genlerin sinirlayici olmayan örnekleri, burada diger bir yerde detayli olarak açiklanir. Spesifik düzenlemelerde ek polinükleotid, bir genomik nükleik asidi içerebilir. Bir düzenlemede genomik nükleik asit, bir hayvan, bir fare, bir insan, bir insan olmayan, bir kemirgen, bir insan olmayan, bir siçan, bir hamster, bir tavsan, bir domuz, bir büyükbas, bir geyik, bir koyun, bir keçi, bir tavuk, bir kedi, bir köpek, bir dag gelincigi, bir primat (örnegin, marmoset, Hint sebegi), evcillestirilmis memeli veya tarimsal bir hayvan, bir kus veya söz konusu diger herhangi bir organizma veya bunun bir kombinasyonundan türetilir. Diger düzenlemelerde ek polinükleotid, bir kosullu alleli içerir. Bir düzenlemede 00850-P-0044 alleldir. Spesifik düzenlemelerde kosullu allel asagidakileri içerir: (a) bir hedef genin transkripsiyonuna iliskin sens oryantasyonunda bir tahrik dizisi ve sens veya antisens oryantasyonda bir ilaç seçim kasedi; (b) antisens oryantasyonunda söz konusu bir nükleotid dizisi (N51) ve bir evirme ile kosullu modül (COIN, bir ekson-bölme intronu ve evrilebilir gen tuzagi benzeri bir modül; bakiniz tahrik dizisi ve DSC içermeyen ve (ii) sens oryantasyonunda NSI içeren ve antisens oryantasyonda COlN içeren bir kosullu allel olusturmak üzere yeniden birlesen yeniden birlestirilebilir birimler. Ek polinükleotid, yaklasik 5kb ila yaklasik 200kb, yaklasik 5kb ila yaklasik lOkb, yaklasik 350kb veya yaklasik 350kb ila yaklasik 400kb olabilir. Spesifik düzenlemelerde ek polinükleotid, alana spesifik rekombinasyon hedef dizileri ile bitisik olan bir nükleik asit içerir. Tüm ek polinükleotid bu tür alana spesifik rekombinasyon hedef dizisi ile bitisik olabilirken ek polinükleotid içindeki herhangi bir bölge veya söz konusu ayri polinükleotidin ayni zamanda bu tür alanlar ile bitisik olabilecegi kabul edilir. Burada kullanildigi üzere ve bir rekombinasyon olayina yönelik bir substrat olarak islev görebilen bir nükleotid dizisini içerir. Burada kullanildigi üzere "alana spesifik rekombinaz" ifadesi, iki rekombinasyon alaninin tek bir nükleik asit molekülü içinde veya ayri 00850-P-0044 nükleik asit molekülleri üzerinde fiziksel olarak ayrildigi rekoinbinasyon alanlari arasindaki rekombinasyonu kolaylastirabilen bir grup enzimi içerir. Alana spesifik rekombinazlarin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere Cre, Flp ve Dre rekombinazlarini içerir. Alana spesifik rekombinaz, hücreye rekombinaz polipeptitinin eklenmesi veya konakçi hücreye alana spesifik rekombinazi kodlayan bir polinükleotidin eklenmesi dahil olmak üzere herhangi bir sekilde hücreye eklenebilir. Alana spesifik rekombinazi kodlayan polinükleotid, ek polinükleotid içine veya ayri bir polinükleotid içine yerlestirilebilir. Alana spesifik remombinaz, örnegin bir indüklenebilir promotör, hücreye endojen olan bir promotör, hücreye heterolog olan bir promotör, hücreye spesifik bir promotör, dokuya spesifik bir proinotör veya gelisimsel asamaya spesifik bir promotör dahil olmak üzere hücrede aktif olan bir promotöre uygulanabilir bir sekilde baglanabilir. Ek polinükleotidi veya ek polinükleotid içindeki söz konusu herhangi bir polinükleotidi ile bitisik olabilen alana spesifik remombinasyon kombinasyonunu içerebilir. Diger düzenlemelerde alana spesifik rekombinasyon alanlari, ek polinükleotid içinde bulunan bir seçim belirtecini ve/veya bir raporför genini kodlayan bir polinükleotidi ile bitisik olur. Bu tür örneklerde hedeflenen genomik lokusta ek polinükleotidin entegrasyonunun akabinde alana spesifik rekombinasyon alanlari arasindaki diziler kaldirilabilir. Bir düzenlemede ek polinükleotid, bir seçim belirtecini kodlayan bir polinükleotidi içerir. Bu tür seçim belirteçleri, bunlarla sinirli olmamak üzere neomisin fosfotransferaz (neor), higromisin B fosfotransferaz (hygr), puromisin- N-asetiltransferaz (puror), blastisidin S deaminaz (bsrr), ksantin/guanin fosforibosil transferaz (gpt) veya herpes simpleks virüsü tiinidin kinazi (HSV-k) veya bunlarin bir kombinasyonunu içerir. Bir düzenlemede, seçici belirtecini kodlayan polinükleotid, hücre içinde aktif olan bir promotöre uygulanabilir bir 00850-P-0044 sekilde baglanir. Hedeflenen genomik lokusa söz konusu polinükleotidler seri olarak yerlestirildiginde seçim belirteci, yukarida belirtildigi üzere bir nükleaz ajanina yönelik bir tanima alanini içerebilir. Bir düzenleinede seçim belirtecini kodlayan polinükleotid, alana spesifik bir rekombinasyon hedef dizisi ile bitisik Ek polinükleotid ayrica bir promotöre uygulanabilir bir sekilde bagli bir raportör geni içerir, burada raportör gen LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, güçlendirilmis sari flüoresan proteini (EYFP), Emerald, güçlendirilmis yesil flüoresan proteini (EGFP), CyPet, siyan flüoresan proteini (CFP), Cerulean, T-Sapphire, lüsiferaz, alkalin fosfataz ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilen bir raportör proteini kodlar. Bu tür raportör genler, hücre içinde aktif olan bir promotöre uygulanabilir bir sekilde bagli olabilir. Bu tür promotörler, bir indüklenebilen promotör, raportör gene veya hücreye endojen olan bir promotör, raportör gene veya hücreye heterolog olan bir promotör, bir hücre-spesifik promotör, bir doku-spesifik promotör veya bir gelisimsel evre-spesifik promotör olabilir. i'i'. Hedefleme Vektörleri' Hedefleme vektörleri, Y kromozomu üzerinde hedeflenen genomik lokusa veya bir zorlu hedef lokusa veya söz konusu diger bir kroinozoma ek polinükleotidi eklemek üzere kullanilir. Hedefleme vektörü, ek polinükleotidi içerir ve ayrica ek polinükleotid ile bitisik olan bir yukari yönlü ve bir asagi yönlü homolojiyi içerir. Ek polinükleotid ile bitisik olan homoloji kollari, hedeflenen genomik lokus içindeki genomik bölgelere karsilik gelir. Referansin kolayligina yönelik hedeflenen genomik lokus içindeki karsilik gelen genomik bölgeler burada "hedef alanlar" olarak refere edilir. Bu nedenle bir örnekte bir hedefleme vektörü, seçim belirtecini kodlayan polinükleotid içinde birinci tanima alanina yeterli yakinlikta yerlestirilen birinci ve ikinci hedef alana karsilik gelen birinci ve ikinci homoloji 00850-P-0044 kolu ile bitisik olan birinci bir ek polinükleotid içerebilir. Böylece hedefleme vektörü, hücrenin genomunda homoloji kollari ile karsilik gelen hedef alanlar arasinda meydana gelen bir homolog rekombinasyon olayi araciligiyla hedeflenen genoinik lokusa ek polinükleotidin entegrasyonuna yardimci olur. Hedefleme vektörünün bir homoloji kolu, örnegin yaklasik 400 bp ila yaklasik karsilik gelen bir hedef alan ile bir homolog rekombinasyon olayini gelistirmek üzere yeterli olan herhangi bir uzunlukta olabilir. Bu tarifname, hedefleme kollarinin genel toplaminin en az 0.5 kb, l kb, 1.5 kb, 2 kb, 3 kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb veya en az 10kb olmasini açiklar. Bu tarifname, homoloji kollarinin genel toplaminin yaklasik 0.5 kb ila yaklasik 1 kb, yaklasik 1 kb ila yaklasik 1.5 yaklasik 9kb veya yaklasik 10kb ila yaklasik 150kb arasinda oldugunu açiklar. Asagida daha detayli olarak belirtildigi üzere büyük hedefleme vektörleri, daha fazla uzunluktaki hedefleme kollarini kullanabilir. Hedefleme vektörlerinin yukari yönlü ve asagi yönlü homoloji kollarina karsilik gelen hedeflenen genomik lokus içindeki hedef alanlar, seçici belirteci kodlayan polinükleotid içine yerlestirilen "tanima alanina yeterli yakinlik" içine yerlestirilir. Burada kullanildigi üzere bir hedefleme vektörünün yukari yönlü ve asagi yönlü homoloji kollari, mesafe tanima alaninda bir çentik veya çift sarmalli bir kirilma üzerine hedef alanlar ve homoloji kollari arasinda bir homolog rekombinasyon olayinin olusumunu gelistirecek sekilde oldugunda bir tanima alanina "yeteri kadar yakin olarak yerlestirilir". Bu nedenle spesifik düzenlemelerde hedefleme 00850-P-0044 vektröünün yukari yönlü ve/Veya asagi yönlü homoloji kollarina karsilik gelen hedef alanlar, verilen bir tanima alaninin yaklasik 10 kbasine en az 10 nükleotid içindedir. Spesifik düzenlemelerde tanima alani, hedef alanlarin en az bir veya ikisine bitisiktir. Seçim belirticini kodlayan polinükleotid içinde tanima alanina hedefleme vektörünün homoloji kollarina karsilik gelen hedef alanlarin alansal iliskisi degisiklik gösterebilir. Örnegin iki hedef alan, tanima alanina göre 5" olarak yerlestirilebilir, hedef alanlarin ikisi, tanima alanina 3, olarak yerlestirilebilir veya hedef alanlar, tanima alanina bitisik olabilir. Spesifik düzenlemelerde hedef genomik lokus, (i) bir 5, homoloji koluna homolog olan bir 5, hedef dizisini; ve (ii) 3" homoloji koluna homolog olan bir 3, hedef dizisini içerir. Spesifik düzenlemelerde 5" hedef dizisi ve 3, hedef dizisi, en az 5 kb ancak 3 Mblden az, en az 5 kb ancak 10 kblden az, en az 10 kb ancak 20 kb ancak yaklasik 300 kaen az, en az yaklasik 300 kb ancak yaklasik 400 kb'den az, en az yaklasik 400 kb ancak yaklasik 500 kb"den az, en az yaklasik 500 kb ancak yaklasik 1Mb"den az, en az yaklasik 1 Mb ancak yaklasik 1.5 Mbaden az, en az yaklasik 1.5 Mb ancak yaklasik 2 Mb"den az, en az yaklasik 2 Mb ancak yaklasik 2.5 Mbaden az veya en az yaklasik 2.5 Mb ancak yaklasik 3 Mbaden az ayrilir. Burada kullanildigi üzere bir hoinoloji kolu ve bir hedef alan, iki bölge homolog bir rekombinasyon reaksiyonuna yönelik substratlar olarak islev görmek üzere dizi özdesliginin yeterli bir seviyesini paylastiginda birbirine "karsilik gelir" veya özdes olan dizisiyi paylasan DNA dizileri anlamina gelir. Hedefleme vektörü üzerinde bulunan verilen bir hedef alan ile karsilik gelen homoloji kolu arasindaki 00850-P-0044 dizi özdesligi, homolog rekombinasyonun meydana gelmesini saglayan dizi özdesliginin herhangi bir derecesi olabilir. Örnegin hedefleme vektörünün (veya bunun bir fragmenti) homoloji kolu ve hedef alan (veya bunun bir fragmenti) diziler, homolog rekombinasyona maruz kalir. Ayrica homoloji kolu ile karsilik gelen hedef alan arasindaki homolojinin karsilik gelen bir bölgesi, klevaj edilmis tanima alaninda homolog rekombinasyonu gelistirmek üzere yeterli olan herhangi bir uzunlukta olabilir. Örnegin verilen bir homoloji ve/Veya karsilik gelen hedef alan, uzunluk olarak yaklasik 400 bp ila yaklasik 500 hp, yaklasik 500 hp ila bp (burada diger bir yerde açiklanan küçük TVEC vektörlerinde açiklananlar kilobases veya daha fazla (burada diger bir yerde açiklanan LTVEC vektörlerinde açiklananlar gibi) olan homolojinin karsilik gelen bölgelerini içerebilir böylece homoloji kolu, hücrenin genomu içinde karsilik gelen hedef alanlar ile homolog rekombinasyona maruz kalmak üzere yeterli homolojiye sahiptir. Referans kolayligina yönelik homoloji kollari, burada bir yukari yönlü ve asagi yönlü homoloji koluna refere edilir. Bu terminoloji, hedefleme vektöründe ek polinükleotide homoloji kollarinin nispi pozisyonu ile ilgilidir. Hedefleme vektörlerinin homoloji kollari bu nedenle Y kromozomu üzerindeki veya bir zorlu hedef lokus içindeki hedeflenen genomik lokus ile bir hedef alana karsilik gelmek üzere tasarlanir. Bu nedenle homoloji kollari, hücreye natif olan bir genomik lokusa karsilik gelebilir veya alternatif olarak bunlar, bunlarla sinirli olmamak üzere transgenleri, ekspresyon kasetlerini veya genomik DNAsnin heterolog veya egzojen bölgelerini içeren Y kroinozomuna entegre edilen 00850-P-0044 DNA,nin heterolog veya egzojen bir segmentinin bir bölgesine karsilik gelebilir. Alternatif olarak hedefleme vektörünün homoloji kollari, bir maya yapay kromozomunda (YAY), bakteriyel yapay kromozoinda (BAC), bir insan yapay kromozomunun bir bögesine veya uygun bir konakçi hücrede yer alan diger degistirilmis genomik bölgelere karsilik gelebilir. Ayrica hedefleme vektörünün homoloji kollari, bir BAC kütüphanesinin, bir kozmid kütüphanesinin veya bir PI faj kütüphanesinin bir bölgesine karsilik gelebilir veya bundan türetilebilir. Bu nedenle spesifik düzenlemelerde hedefleme vektörünün homoloji kollari, Y kromozomunun üzerindeki bir genomik lokusa veya bir insan olmayan memeli, bir kemirgen, bir insan, bir siçan, bir fare, bir hamster, bir tavsan, bir domuz, bir büyükbas, bir geyik, bir koyun, bir keçi, bir tavuk, bir kedi, bir köpek, bir dag gelincigi, bir primat (örnegin, marrnoset, Hint sebegi), evcillestirilmis memeli veya tarimsal bir hayvan, bir kus veya söz konusu diger herhangi bir organizmaya natif, heterolog veya egzojen olan bir zorlu hedef lokusa karsilik gelir. Diger düzenlemelerde homoloji kollari, geleneksel bir yöntem kullanilarak hedeflenemeyen veya bir nükleaz ajani tarafindan indüklenen bir çentik veya çift sarmalli bir kirilma yoklugunda sadece yanlis olarak veya sadece önemli derecede düsük etkinlik ile hedeflenebilen hücrenin bir genomik lokusuna karsilik gelir. Bir düzenlemede homoloji kollari, bir yapay DNA"dan türetilir. Diger düzenlemelerde yukari yönlü ve asagi yönlü homoloji kollari, hedeflenen genom ile ayni genoma karsilik gelir. Bir düzenlemede homoloji kollari, ilgili bir genomdandir, örnegin hedeflenen genom, birinci bir susun bir fare genoinundandir ve hedefleme kollari, ikinci bir susun bir fare genomundandir, burada birinci sus ve ikinci sus farklidir. Diger düzenlemelerde homoloji kollari, ayni hayvanin genomundandir veya ayni susun genomundandir, örnegin hedeflenen genom, birinci bir susun bir fare genomudur ve hedefleme kollari, ayni fareden veya ayni sustan bir fare genomundandir. Hedefleme vektörü (büyük bir hedefleme vektörü gibi) ayni zamanda burada diger bir yerde açiklandigi üzere bir seçim kasedi veya bir raportör geni içerebilir. 00850-P-0044 Seçim kasedi bir seçim belirtecini kodlayan bir nükleik asit dizisi içerebilir, burada nükleik asit dizisi bir promotöre uygulanabilir bir sekilde baglidir. Bu tür promotörler, bir indüklenebilen promotör, raportör gene veya hücreye endojen olan bir promotör, raportör gene veya hücreye heterolog olan bir promotör, bir hücre-spesifik promotör, bir doku-spesifik promotör veya bir gelisimsel evre- spesifik promotör olabilir. Bir düzenlemede, seçim belirteci neoinisin fosfotransferaz (neor), higromisin B fosfotransferaz (hygr), puromisin-N- asetiltransferaz (puror), blastisidin S deaminaz (bsrr), ksantin/guanin fosforibosil transferaz (gpt) ve herpes simpleks virüsü timidin kinazi (HSV-k) ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilir. Hedefleme vektörünün seçim belirtecinin iki yaninda yukari yönlü ve asagi yönlü homoloji kollari yer alabilir veya homoloji kollarina 5' veya 3' ucunda bulunabilir. Bir düzenlemede hedefleme vektörü (büyük bir hedefleme vektörü gibi), bir promotöre uygulanabir olarak bagli bir raportör geni içerir, burada raportör gen LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, güçlendirilmis sari tlüoresan proteini (EYFP), Emerald, güçlendirilmis yesil Ilüoresan proteini (EGFP), CyPet, siyan Ilüoresan proteini (CFF), Cerulean, T-Sapphire, lüsiferaz, alkalin fosfataz ve bunlarin bir koinbinasyonundan olusan gruptan seçilen bir raportör proteini kodlar. Bu tür raportör genler, hücre içinde aktif olan bir promotöre uygulanabilir bir sekilde bagli olabilir. Bu tür promotörler, bir indüklenebilen promotör, raportör gene veya hücreye endojen olan bir promotör, raportör gene veya hücreye heterolog olan bir promotör, bir hücre-spesifik promotör, bir doku-spesifik promotör veya bir gelisimsel evre-spesifik promotör olabilir. Sinirlayici olmayan bir düzenlemede hedetleme vektörünün (örnegin bir büyük hedefleme vektörünü içeren) nükleaz ajani ile kombine edilmis kullanimi, tek basina hedefleme vektörünün kullanimi ile karsilastirildiginda artan bir hedefleme etkinligine neden olur. Bir düzenlemede hedefleme vektörü, nükleaz ajani ile baglantili olarak kullanildiginda hedefleme vektörünün hedefleme etkinligi, 00850-P-0044 hedefleme vektörünün tek basina kullanilmasi ile karsilastirildiginda en az iki kati, en az üç kati, en az 4 kati veya en az 10 kati arttirilir. i'i'i. Büyük Hedefleme Vektörleri Burada kullanildigi üzere "büyük hedefleme vektörü" veya "LTVEC" ifadesi, hücrelerde homolog hedefleme gerçeklestirmeyi amaçlayan diger yaklasimlar tarafindan tipik olarak kullanilanlardan daha büyük olan nükleik asit dizilerine karsilik gelen ve bunlardan türetilen homoloji kollarini içeren ve/veya hücrelerde homolog rekombinasyon hedeflemesi gerçeklestirmeyi amaçlayan diger yaklasimlar tarafindan tipik olarak kullanilanlardan daha büyük nükleik asit dizilerini içeren büyük hedefleme vektörlerini içerir. Spesifik düzenlemelerde, LTVEC'in homoloji kollari ve/veya ek polinükleotid, bir ökaryotik hücrenin genoinik dizisini içerir. LTVEC'in boyutu, hedefleme olaylarinin geleneksel analizler, örnegin, Southern blotlama ve uzun-aralikli (örnegin, 1 kb-5 kb) PCR, ile taranmasina olanak saglamak için çok büyüktür. LTVEC'in örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bir bakteriyel yapay kromozomdan (BAC), bir insan yapay kromozomundan veya bir maya yapay kromozomundan (YAC) türetilen vektörleri, içerir. LTVECslerin sinirlayici olmayan örnekleri ve bunlarin yapilmasina yönelik yöntemler, örnegin, US Pat. No. açiklanir. LTVEC, bunlarla sinirli olmamak üzere en az yaklasik lOkb, yaklasik 15kb, 00850-P-0044 275kb veya yaklasik 275kb ila yaklasik 300kb dahil olmak üzere herhangi bir uzunlukta olabilir. Bir düzenlemede LTVEC, yaklasik 5kb ila yaklasik 200kb, yaklasik 5kb ila araliginda olan bir ek polinükleotid içerir. Diger örneklerde LTVEC tasarimi, burada açiklandigi üzere yaklasik 5kb ila yaklasik 200kb veya yaklasik 5kb ila yaklasik 3.0Mb olan verilen bir dizinin replasmanina olanak saglayacak sekilde olabilir. Bir düzenlemede replasman, 00850-P-0044 yaklasik 2Mb, yaklasik 2Mb ila yaklasik 2.5Mb veya yaklasik 2.5Mb ila yaklasik 3Mb*dir. Bir düzenlemede LTVECSnin homoloji kollari, bir BAC kütüphanesinden, bir kozmid kütüphanesinden veya bir PI faj kütüphanesinden türetilir. Diger düzenlemelerde homoloji kollari, hücrenin hedeflenen genomik lokusundan türetilir ve bazi örneklerde LTVEC"nin hedef genomik lokusu, geleneksel bir yöntem kullanilarak hedeflenebilir olmayan hedefe yönelik tasarlanir. Diger düzenlemelerde homoloji kollari, bir yapay DNAldan türetilir. Bir düzenlemede LTVEC içindeki yukari yönlü homoloji kolu ve asagi yönlü homoloji kolunun genel bir toplami en az 10 kb°dir. Tarifname, yukari yönlü homoloji kolunun yaklasik 5 kb ila yaklasik 100 kb araliginda olmasini saglar. Bir düzenlemede asagi yönlü homoloji kolu, yaklasik 5 kb ila yaklasik 100 kb araligindadir. Tarifname, yukari yönlü ve asagi yönlü homoloji kollarinin genel toplaminin yaklasik 5kb yaklasik 10kb, yaklasik 10kb yaklasik 20kb, yaklasik saglar. Bir düzenlemede delesyon boyutu, LTVEC°nin 5" ve 3, homoloji kollarinin genel toplaminin boyutu ile ayni veya buna benzerdir. Bir düzenlemede LTVEC, bir seçim kasedini veya burada diger bir yerde açiklandigi üzere bir raportör geni içerir. 00850-P-0044 iv. Homolog Rekombinasyon ile Y Kromozomunnn Üzerinde Tanima Alaninin Yakininda bir Ek Polinükleotidin Entegre Edilmesi Yöntemleri Yöntemler, bir hücrede Y kromozoinu üzerinde bir hedef genomik lokusun modifiye edilmesine yönelik, asagidaki adimlari içerir: (a) Y kromozomu üzerinde bir hedef genomik lokusu içeren bir hücrenin saglanmasi, (b) hücreye birinci ve ikinci hedef alana karsilik gelen birinci ve ikinci homolog kol ile bitisik olan birinci bir ek polinükleotid içeren birinci bir hedefleme vektörünün eklenmesi; ve (c) genomunda Y kromozomu üzerinde hedef genomik lokusta entegre edilen birinci ek nükleotidi içeren en az bir hücrenin tanimlanmasi. Benzer yöntemler, bir zorlu kromozomal lokusu hedeflemek üzere gerçeklestirilebilir. Burada diger bir yerde açiklandigi üzere hedefleme vektörünün birinci homoloji kolu ve ikinci homoloji kolunun genel toplaminin yaklasik 0.5 kb, l kb, 1.5 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, olmasini veya en az 10 kb veya en az 10 kb ve en az 150 kb olmasini açiklar. Spesifik düzenlemelerde bir LTVEC kullanilir. Bu tarifname, bir küçük TVEClnin kullanilmasini açiklar. Sinirlayici olmayan bir düzenlemede bu tür yöntemler, burada açiklanan XY F0 dogurgan disilerinin gelisimini arttiran kültür ortamlari kullanilarak ve böylece XY F0 dogurgan disi hayvanlar olusturularak gerçeklestirilir. Diger örneklerde burada açiklanan yöntemler, burada diger bir yerde açiklandigi üzere S13/ geninde hedeflenen genetik modifikasyon üretmek üzere kullanilir. Burada ayrica bir hücrede Y kromozomu üzerinde bir hedef genomik lokusun modifiye edilmesine yönelik yöntemler saglanir, asagidaki adimlari içerir: (a) bir nükleaz ajanina yönelik bir tanima alanini içeren Y kromozomu üzerinde bir hedef genomik lokusu içeren bir hücrenin saglanmasi, (b) hücreye (i) nükleaz ajanin, burada nükleaz ajani birinci tanima alaninda bir çentik veya çift sarmalli bir 00850-P-0044 kirilmayi indükler; ve (ii) birinci tanima alanina yeteri kadar yakin olarak yerlestirilen birinci ve ikinci hedef alana karsilik gelen birinci ve ikinci homolog kol tarafindan desteklenen birinci bir eklenti polinükleotidi içeren birinci bir hedefleme vektörünün eklenmesi; ve (c) genomunda Y kromozoinu üzerinde hedef genomik lokusta entegre edilen birinci eklenti polinükleotidi içeren en az bir hücrenin tanimlanmasi. Benzer yöntemler, bir zorlu hedef lokusu hedeflemek üzere gerçeklestirilebilir. Burada diger bir yerde açiklandigi üzere hedefleme vektörünün birinci homoloji kolu ve ikinci homoloji kolunun genel toplaminin yaklasik 7 kb, yaklasik 8 kb ila yaklasik 9 kb olmasini veya en az 10 kb veya en az 10 kb ve en az 150 kb olmasini açiklar. Spesifik düzenlemelerde bir LTVEC kullanilir. Bu tarifname, bir küçük TVEC"nin kullanilmasini açiklar. Sinirlayici olmayan bir düzenleinede bu tür yöntemler, burada açiklanan XY F0 dogurgan disilerinin gelisimini arttiran kültür ortamlari kullanilarak ve böylece XY F0 dogurgan disi hayvanlar olusturularak gerçeklestirilir. Diger örneklerde burada açiklanan yöntemler, burada diger bir yerde açiklandigi üzere Sry geninde hedeflenen genetik modifikasyon üretmek üzere kullanilir. Çesitli yöntemler ayni zamanda genomik hedef` lokusta entegre edilen ek polinükleotide sahip olan hücreleri tanimlamak üzere kullanilabilir. Genoinik hedef lokusunda ek polinükleotidin eklenmesi, bir "allelin modifikasyonuna" neden olur. "Allelin modifikasyonu" veya "MOA" ifadesi, bir genomda gen(ler)in veya kromozomal lokusun (lokuslar) birininin tam DNA dizisinin modifikasyonunu içerir. "Allelin modifikasyonunun (MOA)" örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere tek bir nükleotid kadar küçük delesyonlari, sübstitüsyonlari veya eklentileri veya söz konusu bir geni veya kromozomal lokusu (lokuslar) kapsayan birçok kilobazin delesyonunu ayrica bu iki uç arasindaki herhangi bir veya bütün olasi modifikasyonu içerir. 00850-P-0044 Çesitli düzenlemelerde hedeflenen modifikasyonun tanimlanmasini kolaylastirmak üzere bir yüksek çiktili nicel analiz, diger bir ifadeyle allelin modifikasyonu (MOA) analizi kullanilir. Burada açiklanan MOA analizi, bir genetik inodifikasyonu takiben bir parental kromozomda modifiye edilmis bir allelin büyük ölçekli taramasini saglar. MOA analizi, bunlarla sinirli olmamak üzere bir nicel PCR, örnegin gerçek zamanli PCR (qPCR) dahil olmak üzere çesitli analitik teknikler ile gerçeklestirilebilir. Örnegin gerçek zamanli PCR, hedef lokusu taniyan birinci bir öncül-prob grubunu ve hedeflenmeyen bir referans lokusu taniyan ikinci bir öncül-prob grubunu içerir. Ayrica öncül-prob grubu, güçlendirilmis diziyi tanimlayan bir floresan probunu içerir. Nicel analizi ayni zamanda bunlarla sinirli olmamak üzere floresan aracili in situ hibridizasyon (FISH), karsilastirmali genomik hibridizasyon, izotermik DNA genlesmesi, immobilize prob(lar)a nicel hibridizasyon, Invader Probes®, MMP assays®, TaqMan® Molecular Beacon ve EclipseTM probu teknolojisini içeren çesitli analitik teknikler ile gerçeklestirilebilir. (Bakiniz örnegin, USZOOS/O 144655). Çesitli düzenlemelerde çentik veya çift sarmalli bir kirilmanin varliginda hedef genomik lokusta bir hedefleme vektörünün (bir LTVEC veya bir küçük TVEC gibi) hedefleme etkinligi, çentik veya çift sarmalli bir kirilmanin yoklugunda oldugundan en az yaklasik 2 kati daha yüksek, en az yaklasik 3 kati daha yüksek, en az yaklasik 4 kati daha yüksektir (örnegin, söz konusu genomik lokusta ayni hedefleme vektörünü ve ayni homoloji kollarini ve karsilik gelen hedef alanlari kullanarak ancak çentik veya çift sarinalli bir kirilma yapaan eklenmis bir nükleaz ajani yoklugunda). Yukarida belirtilen çesitli yöntemler, Y kromozomunun üzerindeki verilen bir hedeflenen genomik lokusa veya bir zorlu hedef lokusa birkaç eklen polinükleotidinin hedeflenen entegrasyonuna olanak saglamak üzere sirali olarak tekrar edilir. Bu nedenle çesitli yöntemler, Y kromozomunun üzerindeki hedef 00850-P-0044 saglar. Belirli düzenlemelerde bu tür sirali yerlestirme yöntemleri, Y kromozomu üzerinde hedeflenen bir genomik lokusabir hayvan hücresinden veya bir memeli hücresinden (diger bir ifadeyle, bir insan, bir insan olmayan, bir kemirgen, bir fare, bir maymun, bir siçan, bir hamster, evcillestirilmis bir memeli veya tarimsal bir hayvan) büyük genomik bölgelerin yeniden yapilandirilmasini saglar. Bu tür örneklerde kodlayici ve kodlayici olmayan bölgeleri içeren genomik bölgelerin aktarimi ve yeniden yapilandirilmasi, verilen bir bölgenin kompleksitesinin natif genomik bölgede bulunan kodlayici bölgeleri, kodlayici olmayan bölgeleri ve kopya sayisi varyasyonlarini en azindan kismi olarak tutarak muhafaza edilmesine olanak saglar. Bu nedenle çesitli yöntemler, örnegin herhangi memeli hücresinde veya söz konusu hayvanda "heterolog" veya "egzojen" genomik bölgeleri olusturmak üzere yöntemler saglar. Sinirlayici olmayan bir örnekte insan olmayan hayvanvaki "insanlastirilmis" genoinik bölge olusturulur. Ayrica Y kromozomunun üzerinde hedef genomik lokusun modifiye edilmesiyle birlikte burada açiklanan çesitli yöntemler ve bilesimlerin ayni zamanda diger bir kromozom üzerinde hedeflenen hedef genetik modifikasyon olusturmak üzere kullanilabilecegi kabul edilir. Söz konusu herhangi bir polinükleotid, çesitli ek polinükleotidlemde bulunabilir ve böylece Y kromozomunun üzerinde hedef genoinik lokusta veya bir zorlu hedef lokusa entegre edilebilir. Burada açiklanan yöntemler, söz konusu en az 1, 2, 3, 4, 5, 6 veya daha fazla polinükleotidin hedegflenen genomik lokusa entegre edilmesini saglar. Y kromozomunun üzerindeki hedef genomik lokusta veya bir zorlu hedef genomik lokusta entegre edildiginde ek polinükleotid içindeki söz konusu polinükleotid, hücreye bir veya daha fazla genetik modifikasyon ekleyebilir. Genetik modifikasyon, bir endojen nükleik asit dizisinin bir delesyonunu ve/Veya 00850-P-0044 bir egzojen veya heterolog veya ortolog polinükleotidin hedef genomik lokusa eklenmesini içerebilir. Bir düzenlemede genetik modifikasyon, hedef genomik lokusta söz konusu bir egzojen polinükleotid ile bir endojen nükleik asit dizisinin replasmanini içerir. Böylece burada saglanan yöntemler, bir knockout, bir delesyon, bir eklenti, bir replasmani ("knock-in"), bir nokta mutasyonu, bir domen degisimi, bir ekson degisimi, bir intron degisimi, bir regülatör dizi degisimi, bir gen degisimi veya Y kromozomu üzerinde bir hedef genomik lokus içinde bunlarin bir kombinasyonunu içeren bir genetik modifikasyonun olusmasina olanak saglar. Bu tür modifikasyonlar, birinci, ikinci, üçüncü, dördüncü, besinci, altinci, yedinci veya herhangi bir siradaki ek polinükleotidlerin hedef genomik lokusa entegrasyonu üzerine meydana gelebilir. Ek polinükleotidin içindeki ve/veya hedef genomik lokusa entegre edilen söz konusu polinükleotid, bunun eklendigi hücreye natif veya homolog olan bir diziyi içerebilir; söz konusu polinükleotid, bunun eklendigi hücreye heterolog olabilir; söz konusu polinükleotid, bunun eklendigi hücreye egzojen olabilir; söz konusu polinükleotid, bunun eklendigi hücreye ortolog olabilir; veya söz konusu polinükleotid, bunun eklendigi hücreden farkli bir türden olabilir. Bir diziye referans ile burada kullanildigi üzere "homolog", hücreye natif olan bir dizidir. Bir diziye referans ile burada kullanildigi üzere "heterolog", yabanci bir türden kaynaklanan veya ayni türden olmasi halinde kasti insan müdahale ile bilesiminde ve/veya genomik lokusunda natif formundan büyük oranda modifiye edilmis olan bir dizidir. Bir diziye referans ile burada kullanildigi üzere,"heterolog", yabanci bir türden kaynaklanan bir dizidir. Burada kullanildigi üzere "ortolog", diger bir türdeki (diger bir ifadeyle, bir tür varyanti) bilinen referans diziye fonksiyonel olarak esdeger olan bir türden bir polinükleotittir. Söz konusu polinükleotid, bunlarla sinirli olmamak üzere insan olmayan, bir kemirgen, bir hamster, bir fare, bir siçan, bir insan, bir maymun, bir kus, bir tarimsal memeli veya tarimsal olmayan bir memeliyi içeren söz konusu herhangi bir organizmadandir. Söz konusu polinükleotid ayrica bir kodlayici bölge, kodlayici olmayan bir bölge, bir 00850-P-0044 regülatör bölge veya bir genomik DNA`yi içerebilir. Bu nedenle 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. ve/Veya herhangi bir siradaki ek polinükleotidler, bu tür dizileri içerebilir. Bir düzenlemede ek polinükleotid içindeki ve/Veya Y kromozoinunun üzerinde hedef genomik lokusa entegre edilen söz konusu polinükleotid, bir fare nükleik asit dizisine, bir insan nükleik asidine, bir insan olmayan nükleik asidine, bir kemirgen nükleik asidine, bir siçan nükleik asidine, bir hamster nükleik asidine, bir maymun nükleik asidine, bir tarimsal memeli nükleik asidine veya tarimsal olmayan memeli nükleik asidine homologdur. Diger düzenlemelerde hedef lokusa entegre edilen söz konusu polinükleotid, genomik nükleik asidin bir fragmentidir. Bir düzenlemede genomik nükleik asit, bir fare genoinik nükleik asidi, bir insan genomik nükleik asidi, bir insan olmayan nükleik asidi, bir kemirgen nükleik asidi, bir siçan nükleik asidi, bir hamster nükleik asidi, bir maymun nükleik asidi, bir tarimsal memeli nükleik asidi veya tarimsal olmayan bir memeli nükleik asidi veya bunlarin bir kombinasyonudur. Bir düzenlemede söz konusu polinükleotid, yukarida açiklandigi üzere yaklasik 500 nükleotid ila yaklasik 200kb araliginda olabilir. Söz konusu polinükleotid, yaklasik 500 nükleotid ila yaklasik 5kb, yaklasik 5kb ila yaklasik 200kb, yaklasik ila yaklasik 200kb olabilir. Ek polinükleotid içindeki ve/veya Y kromozomu üzerinde hedef genomik lokusa entegre edilen veya zorlu hedef lokustaki söz konusu polinükleotid, bir polipeptiti kodlayabilir, bir miRNA,yi kodlayabilir, bir uzun kodlayici olmayan RNA"yi 00850-P-0044 kodlayabilir veya bu, örnegin bir regülatör dizi, bir promotör dizi, bir genisletici dizi, bir transkripsiyonal baskilayici baglama dizisi veya protein kodlayici olmayan dizinin bir delesyonu dahil olmak üzere herhangi bir regülatör bölogeyi veya söz konusu kodlayici olmayan bölgeleri içerebilir ancak bir protein kodlayici dizinin delesyonunu içermez. Ayrica ek polinükleotid içindeki ve/veya Y kromozomu üzerindeki hedef genomik lokusta veya bir zorlu hedef lokusta entegre edilen söz konusu polinükleotid, sinir sistemi, iskelet sistemi, sindirim sistemi, dolasim sistemi, kas sistemi, solunum sistemi, kardiyovasküler sistem, lenfatik sistem, endokrin sistemi, üriner sistem, üreme sistemi veya bunlarin bir kombinasyonunda eksprese edilen bir proteini kodlayabilir. Ek polinükleotid içinde bulunan ve/Veya Y kromozomunun üzerindeki hedef genoinik lokusta veya bir zorlu hedef lokusta entegre edilen söz konusu polinükleotid, bir kodlayici dizideki bir genetik modifikasyonu içerebilir. Bu tür genetik modifikasyonlar, bunlarla sinirli olmamak üzere bir kodlayici dizinin delesyon mutasyonunu veya iki kodlayici dizinin füzyonunu içerir. Ek polinükleotid içinde bulunan ve/veya Y kromozomunun üzerindeki hedef genomik lokusta veya bir zorlu hedef lokusta entegre edilen söz konusu polinükleotid, bir mutant proteini kodlayan bir polinükleotidi içerebilir. Bir düzenlemede mutant proteini, degistirilen bir baglama özelligi, degisitirilmis lokalizasyon, degistirilmis ekspresyon ve/veya degistirilmis ekspresyon desen ile karakterize edilir. Bir düzenlemede ek polinükleotid içinde bulunan ve/veya Y kromozomunun üzerindeki genomik hedef lokusta veya bir zorlu hedef lokusta entegre edilen söz konusu polinükleotid, en az bir hastalik allelini içerir. Bu tür örneklerde hastalik alleli, baskin bir allel olabilir veya hastalik alleli, bir çekinik alleldir. Ayrica hastalik alleli, bir tek nükleotid polimorfizm (SNP) allel içerebilir. Mutant proteini kodlayan söz konusu polinükleotid, bunlarla sinirli olmamak üzere bir mutant proteini kodlayan bir memeli, bir insan olmayan memeli, kemirgen, fare, siçan, bir insan, bir maymun, bir tarimsal memeli veya bir evcil memeli polinükleotidi dahil olmak üzere herhangi bir organizmadan olabilir. 00850-P-0044 Ek polinükleotid içinde bulunan ve/Veya Y kromozomunun üzerindeki hedef genomik lokusta veya bir zorlu hedef lokusta entegre edilen söz konusu polinükleotid ayrica örnegin bir promotör diziyi, bir genisletici diziyi, bir transkripsiyon baskilayici baglama dizisi veya bir transkripsiyonal sonlandirici diziyi içeren bir regülatör diziyi içerebilir. Spesifik düzenlemelerde ek polinükleotid içinde bulunan ve/veya Y kromozomunun üzerindeki hedef genomik lokusta veya bir zorlu hedef lokusta entegre edilen söz konusu polinükleotid, bir protein kodlayici olmayan dizinin bir delesyonuna sahip olan bir polinükleotidi içerir ancak bir protein kodlayici dizinin delesyonunu içermez. Bir düzenlemede protein kodlayici olmayan dizinin delesyonu, bir regülatör dizinin bir delesyonunu içerir. Diger bir düzenlemede regülatör elementin delesyonu, bir promotör dizinin delesyonunu içerir. Bir düzenlemede regülatör elementin delesyonu, bir gelistirici dizinin delesyonunu içerir. Söz konusu bu tür bir polinükleotid, bunlarla sinirli olmamak üzere bir mutant proteini kodlayan bir memeli, bir insan olmayan memeli, kemirgen, fare, siçan, bir insan, bir maymun, bir tarimsal memeli veya bir evcil memeli polinükleotidi dahil olmak üzere herhangi bir organizmadan olabilir. Burada açiklanan çesitli yöntemler, bir zorlu genomik lokusta veya Y kromozomu lokusunda (Sry gibi) çesitli modifikasyonlar olusturmak üzere kullanilabilir. Bu tür modifikasyonlar, örnegin bir endojen nükleik asit dizisinin bir homolog veya bir ortolog nükleik asit dizisi ile replasmani; bir endojen nükleik asit dizisinin delesyonu; bir endojen nükleik asit dizisinin delesyonu, burada delesyon yaklasik 00850-P-0044 yaklasik 1.5 Mb ila yaklasik 2 Mb, yaklasik 2 Mb ila yaklasik 2.5 Mb veya yaklasik 2.5 Mb ila yaklasik 3 Mb araligindadir; bir egzojen nükleik asit dizisinin eklenmesi; yaklasik 5kb ila yaklasik lOkb, yaklasik 10 kb ila yaklasik 20 kb, veya yaklasik 350 kb ila yaklasik 400 kb araliginda degisen bir egzojen nükleik asit dizisinin eklenmesi; bir homolog veya bir ortolog nükleik asit dizisini içeren bir egzojen nükleik asit dizisinin eklenmesi; bir insan veya insan olmayan nükleik asit dizisini içeren bir kimerik nükleik asit dizisinin eklenmesi; alana spesifik rekoinbinaz hedef dizileri ile bitisik olan bir kosullu allelin eklenmesi; memeli hücresinde aktif olan üçüncü bir promotöre uygulanabilir bir sekilde baglanan seçilebilir bir belirteç veya bir raportör geninin eklenmesi; veya bunlarin bir kombinasyonu. Yukarida belirtildigi üzere yöntemler ve bilesimler, zorlu bir hedef lokusta Y kroinozomunun üzerine yerlestirilen söz konusu bir veya daha fazla polinükleotidlerin hedeflenen genetik modifikasyonunu veya Sry proteininin seviyesi ve/Veya aktivitesinde bir azalma saglamak üzere burada saglanir. Ayrica Y kroinozomunun üzerinde veya bir zorlu hedef kromozomal lokus üzerinde bir diziye hedeflenen genetik modifikasyonun yani sira ilave bir hedeflenen genetik modifikasyonun diger kromozomlar üzerinde yapilabilecegi kabul edilir. Bu hedeflenen genetik modifikasyonlara olanak saglayan bu tür sistemler, çesitli bilesenleri kullanabilir ve referans kolayligina yönelik buradaki "hedeflenen genomik entegrasyon sistemi" ifadesi genel olarak bir entegrasyon olayina (diger bir ifadeyle, çesitli nükleaz ajanlari, tanima alanlari, ek DNA polinükleotidleri, hedefleme vektörleri, hedef genomik lokus ve söz konusu polinükleotidler) yönelik gerekli olan bütün bilesenleri içerir. 00850-P-0044 Burada saglanan yöntemler, hedeflenen genoinik entegrasyon sisteminin çesitli bilesenlerini içeren bir veya daha fazla polinükleotid veya polipeptit yapisinin bir hücreye eklenmesini içerir. "Ekleme", dizi hücrenin iç kismina erisim elde edecek sekilde hücreye dizinin (polipeptit veya polinükleotid) sunulmasi anlamina gelir. Burada saglanan yöntemler, hedeflenen genomik entegrasyon sisteminin herhangi bir bileseninin hücreye eklenmesine yönelik belirli bir yönteme bagli degildir, yalnizca polinükleotid, en az bir hücrenin iç kismina erisim kazanir. Polinükleotidlerin çesitli hücre türlerine eklenmesine yönelik yöntemler teknikte bilinir ve bunlarla sinirli olmamak üzere stabil transfeksiyon yöntemlerini, geçici transfeksiyon yöntemlerini ve Virüs aracili yöntemleri içerir. Bazi düzenlemelerde yöntemler ve bilesimlerde kullanilan hücreler, stabil bir sekilde genoinlarina yerlestirilen bir DNA yapisina sahiptir. "Stabil olarak yerlestirilen" veya "stabil olarak eklenen", nükleotid dizisi hücrenin genomine entegre edilecek ve bunun dölü tarafindan kazanilabilecek sekilde bir polinükleotidin hücreye eklenmesi anlamina gelir. Herhangi bir protokol, DNA yapilarinin veya hedeflenen genomik entegrasyon sisteminin çesitli bilesenlerinin stabil olarak yerlestirilmesine yönelik kullanilabilir. Polipeptitlerin veya polinükleotidlerin eklenmesine yönelik protokollerin yani sira transfeksiyon protokolleri degisebilir. Sinirlayici olmayan transfeksiyon yöntemleri, kimyasal bazli transfeksiyon yöntemlerini içerir, lipozomlar; 67, Bacchetti et al. (: 1590-4 and, Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97); dendrimerler; veya katyonik polimerler örnegin DEAE-dekstran veya polietilenimin kullanimini içerir. Kimyasal olmayan yöntemler, elektroporasyon; Sono-porasyon; ve optik transfeksiyonu içerir. Partikül bazli transfeksiyon, bir gen tabancasi, miknatis destekli transfeksiyonu Ayrica Viral yöntemler, transfeksiyona yönelik kullanilabilir. 00850-P-0044 Bu tarifnamenede nükleaz ajani, hedefleme vektörü, küçük TVEC veya büyük hedefleme vektörü (LTVEC) ile es zamanli olarak hücreye eklenir. Alternatif olarak nükleaz ajani, bir zainan periyodu üzerinde hedefleme vektörü, küçük TVEC veya LTVECiden ayri olarak eklenir. Diger düzenlemelerde nükleaz ajani, hedefleme vektörü, küçük TVEC veya LTVEC`nin eklenmesinin akabinde eklenirken bu tarifnamede nükleaz ajani, hedefleme vektörü, küçük TVEC veya LTVECinin eklenmesinden önce eklenir. Insan olmayan hayvanlar, burada açiklanan çesitli yöntemler kullanilarak olusturulabilir. Bu tarifnamenin bu tür yöntemleri, (1) burada açiklanan yöntemler kullanilarak Y kromozomunun hedeflenen genomik lokusunda ek polinükleotid içeren genetik olarak modifiye edilmis pluripotent hücreyi olusturmak üzere insan olmayan hayvanin bir pluripotent hücresinin Y kromozomunun hedef genomik lokusunda söz konusu bir veya daha fazla polinükleotidin entegre edilmesi; (2) Y kromozomunun hedef genomik lokusunda söz konusu bir veya daha fazla polinükleotide sahip olan genetik olarak modifiye edilmis pluripotent hücrenin seçilmesi; (3) bir ön-morula asamasindan insan olmayan hayvanin bir konakçi embriyosuna genetik olarak modifiye edilmis pluripotent hücrenin eklenmesi; ve (4) genetik olarak modifiye edilmis pluripotent hücreden türetilen bir FO jenerasyonu olusturmak üzere bir yasiyici anneye genetik olarak modifiye edilmis pluripotent hücreyi içeren konakçi embriyonun yerlestirilmesini içerir. Benzer yöntemler, bir zorlu hedef kromozomal lokusu hedef almak üzere kullanilabilir. Insan olmayan hayvan, insan olmayan memeli, bir kemirgen, bir fare, bir siçan, bir hamster, bir maymun, bir tarimsal memeli veya bir evcil memeli veya bir balik veya bir kus olabilir. Pluripotent hücre, bir insan ES hücresi, bir insan olmayan ES hücresi, bir kemirgen ES hücresi, bir fare ES hücresi, bir siçan ES hücresi, bir hamster ES hücresi, bir maymun ES hücresi, bir tarimsal memeli ES hücresi veya bir evcillestirilmis memeli ES hücresi olabilir. Diger düzenlemelerde pluripotent hücre, bir memeli hücresi, insan hücresi, bir insan olmayan memeli hücresi, bir 00850-P-0044 insan pluripotent hücresi, bir insan ES hücresi, bir insan yetiskin kök hücresi, gelisimsel olarak sinirli insan progenitör hücresi, bir insan iPS hücresi, bir insan hücresi, bir kemirgen hücresi, bir siçan hücresi, bir fare hücresi, bir fare hücresidir. Bir düzenlemede hedeflenen genetik modifikasyon, Sry proteininin seviyesi ve/veya aktivitesini azaltir. Bu tür örneklerde pluripotent hücre, bir XY ES hücresini veya bir XY iPS hücresini içerebilir. F0 dogurgan XY disi insan olmayan hayvanlarin gelisimini arttirmak üzere bu tür hücrelerin kültürlenme yöntemleri, burada diger bir yerde detayli olarak açiklanir. Nükleer aktarim teknikleri ayrica bu tarifnamenin insan olmayan memeli hayvanlarini olusturmak üzere kullanilabilir. Kisaca nükleer aktarima yönelik yöntemler asagidaki adimlari içerir: (1) bir oositin çekirdeginin çikartilmasi; (2) çekirdegi çikartilan oositi ile kombine edilmek üzere bir donör hücrenin veya cekirdegin izole edilmesi; (3) yeniden yapilandirilan bir hücre olusturmak üzere hücre veya çekirdegin çekirdegi çikartilmis oosite yerlestirilmesi; (4) bir embriyo olusturmak üzere yeniden yapilandirilan hücrenin bir hayvanin rahmine yerlestirilmesi; ve (5) embriyonun gelismesinin saglanmasi. Bu tür yöntemlerde bunlarin ayrica canli hayvanlarin yumurta kanallari ve/veya yumurtaliklarindan izole edilebilmesine ragmen oositler genel olarak ölü hayvanlardan geri alinir. Oositler, çekirdek çikarmanin öncesinde teknikte uzman kisiler tarafindan bilinen çesitli ortamlarda olgunlastirilabilir. Oositin çekirdeginin çikartilmasi, teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinen birkaç sekilde gerçeklestirilebilir. Yeniden yapilandirilmis bir hücre olusturmak üzere donör hücre veya çekirdegin çekirdegi çikartilmis oosite eklenmesi genel olarak füzyondan önce zona pellucida altinda bir donör hücresinin mikroenjeksiyonu ile yapilir. Füzyon, temas/füzyon düzlemi (elektrofüzyon) boyunca bir DC elektrik pulsu uygulamasi, hücrelerin polietilen glikol gibi Eizyon baslatici kimyasallara maruziyeti veya Sendai virüsü gibi etkisizlestirilmis bir virüs araciligiyla indüklenebilir. Yeniden yapilandirilan bir hücre tipik olarak nükleer donör ve alici oositin füzyonundan önce, bu sirada ve/veya sonra elektrikli ve/veya elektrikli olmayan araçlar ile aktiflestirilir. Aktivasyon yöntemler, elektrik pulslarini, kimyasal olarak indüklenen sok, sperm 00850-P-0044 ile penetrasyon, oositte divalent katyonlarin seviyesinin arttirilmasini ve oositte hücresel proteinlerin (kinaz inhibitörleri ile) fosforilasyonunun azalmasini içerir. Aktiflestirilen yeniden yapilandirilan hücreler veya einbriyolar tipik olarak teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinen ortamda kültürlenir ve akabinde bir hayvanin rahmine aktarilir. Bakiniz Burada açiklandigi üzere germ hattinda bir veya daha fazla genetik modifikasyon içeren bir insan olmayan hayvanin yapilmasina yönelik diger yöntemler, bu tarifnamede saglanir, asagidaki adimlari içerir: (a) burada açiklanan çesitli yöntemler kullanilarak bir prokaryotik hücrede bir insan olmayan hayvanin Y kromozomu üzerinde hedeflenen bir genomik lokusun modifiye edilmesi; (b) hedeflenen genomik lokusta genetik modifikasyonu içeren modifiye edilmis bir prokaryotik hücrenin seçilmesi; (c) genetik olarak modifiye edilmis hedefleme vektörünün modifiye edilmis prokaryotik hücrenin genomundan izole edilmesi; ((1) Y kromozomunun hedeflenen genomik lokusunda ek nükleik asidini içeren genetik olarak modifiye edilmis pluripotent hücre olusturmak üzere insan olmayan hayvanin bir pluripotent hücresine genetik olarak modifiye edilmis hedefleme vektörünün eklenmesi; (e) genetik olarak modifiye edilmis pluripotent hücrenin seçilmesi; (f) bir pre-morula asamasinda insan olmayan hayvanin bir konakçi embriyosuna genetik olarak modifiye edilmis pluripotent hücrenin eklenmesi; ve (g) genetik olarak modifiye edilmis pluripotent hücreden türetilen bir F 0 jenerasyonu olusturmak üzere bir tasiyici anneye genetik olarak modifiye edilmis pluripotent hücreyi içeren konakçi embriyonun yerlestirilmesi. Bu tür yöntemlerde hedefleme vektörü, büyük bir hedefleme vektörünü veya bir küçük TVEC'yi içerebilir. Benzer yöntemler, bir zorlu hedef lokusu hedef almak üzere kullanilabilir. Insan olmayan hayvan, insan olmayan memeli, bir kemirgen, bir fare, bir siçan, bir hamster, bir maymun, bir tarimsal memeli veya bir evcil memeli olabilir. Pluripotent hücre, bir insan ES hücresi, bir insan olmayan ES hücresi, bir kemirgen ES hücresi, bir fare ES hücresi, bir siçan ES hücresi, bir 00850-P-0044 hamster ES hücresi, bir maymun ES hücresi, bir tarimsal memeli ES hücresi veya bir evcil memeli ES hücresi olabilir. Diger düzenlemelerde pluripotent hücre, bir memeli hücresi, insan hücresi, bir insan olinayan memeli hücresi, bir insan pluripotent hücresi, bir insan ES hücresi, bir insan yetiskin kök hücresi, gelisimsel olarak sinirli insan progenitör hücresi, bir insan iPS hücresi, bir insan hücresi, bir kemirgen hücresi, bir siçan hücresi, bir fare hücresi, bir fare hücresidir. Bir düzenlemede hedeflenen genetik modifikasyon, Sry proteininin seviyesi ve/veya aktivitesini azaltir. Bu tür örneklerde pluripotent hücre, bir XY ES hücresini veya bir XY iPS hücresini içerebilir. F0 dogurgan XY disi insan olmayan hayvanlarin gelisimini arttirmak üzere bu tür hücrelerin kültürlenme yöntemleri, burada diger bir yerde detayli olarak açiklanir. Bu tarifnamenin diger yöntemlerinde izole etme adimi (c) ayrica (cl) genetik olarak modifiye edilmis hedefleme vektröünün (diger bir ifadeyle, genetik olarak modifiye edilmis LTVEC) dogrusallastirilmasini içerir. Bu tarifnamenin diger yöntemlerinde ekleme adimi (d) ayrica (dl) pluripotent hücreye burada açiklandigi üzere bir nükleaz ajaninin eklenmesini içerir. Bir düzenlemede seçme adimlari (b) ve/veya (e), prokaryotik hücreye veya pluripotent hücreye burada açiklandigi üzere seçilebilir bir ajanin uygulanmasiyla gerçeklestirilir. Bu tarifnamede seçme adimlari (b) ve/veya (e), burada açiklandigi üzere allel (MOA) analizinin bir modifikasyonu araciligiyla gerçeklestirilir. Bir prokaryotik hücrede bakteriyel homolog rekombinasyon (BHR) araciligiyla bir hayvan hücresinin bir hedef genomik lokusunun modifiye edilmesine yönelik diger yöntemler saglanir ve asagidaki adimlari içerir: (a) Y kromozomunun bir hedef genomik lokusunu içeren bir prokaryotik hücrenin seçilmesi; (b) birinci bir yukari yönlü homoloji kolu ve birinci bir asagi yönlü homoloji kolu ile bitisik olan bir ek polinükleotidi içeren bir hedefleme vektörünün (yukarida açiklandigi üzere) prokaryotik hücreye eklenmesi, burada ek polinükleotid, bir memeli genomik bölgesini içerir ve birinci tanima alaninda veya yakininda bir çentik veya çift sarmalli bir kirilma yaoan bir nükleaz ajaninin prokaryotik hücreye eklenmesi 00850-P-0044 ve (c) kromozomun hedef genomik lokusunda ek polinükleotidi içeren hedeflenen bir prokaryotik hücrenin seçilmesi, burada prokaryotik hücre, BHR,ye neden olan bir rekombinazi eksprese edebilir. Benzer yöntemler, bir zorlu hedef lokusu hedef almak üzere kullanilabilir. Adimlar (a)-(c), prokaryotik hücrede hedeflenen genomik lokusta birçok ek polinükleotidin eklenmesini saglamak üzere burada açiklandigi üzere seri olarak tekrar edilebilir. Hedefleneri genomik lokus, prokaryotik hücre ile "olusturuldugunda" Y kromozomunun modifiye edilmis hedef genomik lokusunu içeren bir hedefleme vektörü, prokaryotik hücreden izole edilebilir ve bir memeli hücresinde Y kromozomunun bir hedef genomik lokusuna eklenebilir. Y kromozomunun modifiye edilmis genomik lokusunu içeren memeli hücreleri akabinde insan olmayan transgenik hayvanlar haline getirilebilir. Bir prokaryotik hücrede bakteriyel homolog rekombinasyon (BHR) araciligiyla bir hayvan hücresinin bir hedef genomik lokusunun modifiye edilmesine yönelik diger yöntemler saglanir ve asagidaki adimlari içerir: (a) Y kromozomunun bir hedef genomik lokusunu içeren bir prokaryotik hücrenin seçilmesi; (b) birinci bir yukari yönlü homoloji kolu ve birinci bir asagi yönlü homoloji kolu ile bitisik olan bir ek polinükleotidi içeren bir hedefleme vektörünün (yukarida açiklandigi üzere) prokaryotik hücreye eklenmesi, burada ek polinükleotid, bir memeli genomik bölgesini içerir ve (c) kromozomun hedef genomik lokusunda ek polinükleotidi içeren hedeflenen bir prokaryotik hücrenin seçilmesi, burada prokaryotik hücre, BHRlye neden olan bir rekombinazi eksprese edebilir. Benzer yöntemler, bir zorlu hedef lokusu hedef alinak üzere kullanilabilir. Adimlar (a)- (c), prokaryotik hücrede hedeflenen genomik lokusta birçok eklenti polinükleotidinin eklenmesini saglamak üzere burada açiklandigi üzere seri olarak tekrar edilebilir. Hedeflenen genomik lokus, prokaryotik hücre ile içeren bir hedefleme vektörü, prokaryotik hücreden izole edilebilir ve bir memeli hücresinde Y kromozomunun bir hedef genomik lokusuna eklenebilir. Y kroinozomunun modifiye edilmis genomik lokusunu içeren memeli hücreleri akabinde insan olmayan transgenik hayvanlar haline getirilebilir. 00850-P-0044 Bazi düzenlemelerde burada açiklanan hedef genomik lokuslarin çesitli genetik modifikasyonlari, VELOCIGENE® genetik mühendisligi teknolojisi kullanilarak Bakteriyel Yapay Kromozom (BAC) DNA`sindan türetilen bir LTVEC kullanilarak bakteriyel hücrede bir grup homolog rekombinasyon reaksiyonlari (BHR) ile gerçeklestirilebilir (bakiniz örnegin, US Pat. No. the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Bu tarifnamede burada açiklandigi üzere çesitli genetik modifikasyonlari içeren hedeflenen XY pluripotent ve/veya totipotent hücreleri (diger bir ifadeyle, XY ES hücreleri veya XY iPS hücreleri), ek donör hücreleri olarak kullanilir ve VELOCIMOUSE® yöntemi araciligiyla karsilik gelen bir organizmadan bir ön- morula asamasi embriyosuna, örnegin 8-hücre asamasi fare embriyosuna eklenir 0078000 A1). Genetik olarak modifiye edilmis XY pluripotent ve/veya totipotent hücreleri (diger bir ifadeyle, XY ES hücreleri veya XY iPS hücreleri) içeren insan olmayan hayvan embriyosu, blastrosist asamasina kadar inkübe edilir ve akabinde bir F0 jenerasyonu üretmek üzere bir tasiyici anneye yerlestirilir. Bu tarifnamede burada açiklandigi üzere çesitli genetik modifikasyonlari içeren hedeflenen memeli ES hücreleri, bir blastosist asamasi embriyosuna eklenir. Y kromozomunun genetik olarak modifiye edilmis genomik lokusunu tasiyan insan olmayan hayvanlar, bu tarifnamede açiklandigi üzere allel (MOA) analizinin modifikasyonu araciligiyla tanimlanabilir. Genetik olarak modifiye edilmis XY pluripotent ve/veya totipotent hücrelerden (diger bir ifadeyle, XY ES hücreleri veya XY iPS hücreleri) türetilen ortaya çikan F0 jenerasyonu insan olmayan hayvan, F1 jenerasyon yavrusu elde etmek üzere dogal sus insan olmayan hayvana çaprazlanir. Spesifik öncüller ve/veya problar ile genotiplestirme takip edilerek genetik olarak modifiye edilmis genomik lokusa yönelik heterozigot olan F1 insan olmayan hayvanlar, Y kromozomunun genetik olarak modifiye edilmis genomik lokusuna yönelik veya genetik olarak modifiye edilmis zorlu hedef 00850-P-0044 lokusa yönelik homozigot olan F2 jenerasyonu insan olmayan hayvan yavrusu üretmek üzere birbirleriyle çaprazlanir. Burada açiklanan çesitli yöntemler, Y kromozomuna yönelik veya bir hücrede bir zorlu hedef lokusa yönelik bir genomik lokus hedefleme sistemini kullanir. Bu tür hücreler, E. Coli dahil olmak üzere bakteriyel hücreler gibi prokaryotik hücreleri veya ökaryotik hücreleri örnegin maya, böcek, amfibi, bitki veya bunlarla sinirli olmainak üzere bir fare hücresi, bir siçan hücresi, bir tavsan hücresi, bir domuz hücresi, bir büyükbas hücresi, bir geyik hücresi, bir koyun hücresi, bir keçi hücresi, bir tavuk hücresi, bir kedi hücresi, bir köpek hücresi, bir dag gelincigi hücresi, bir primat (örnegin, marmoset, Hint sebegi) hücresi ve benzeri ve evcillestirilmis hayvanlardan hücreleri ve tarimsal hayvanlardan hücreleri içeren memeli hücrelerini içerir. Bu tür hücreler, insan olmayan özellikle insan olmayan memeli hücreleridir. Bazi düzenlemelerde uygun genetik olarak modifiye edilmis pluripotent hücrelerin halihazirda mevcut olmadigi bu memelilere yönelik diger yöntemler örnegin, bunlarla sinirli olmamak üzere Oct3/4, Sox2, KLF4, Myc, Nanog, LlN28 ve Glisl dahil olinak üzere pluripotensi-indükleyici faktörlerin bir kombinasyonunun somatik hücrelerine ekleme araciligiyla pluripotent hücrelerin içinde somatik hücreleri yeniden prograinlamak üzere kullanilir. Bu tür yöntemlerde hücre ayni zamanda bir memeli hücresi, bir insan hücresi, bir insan olmayan memeli hücresi, bir insan olmayan hücre, bir kemirgenden, bir siçandan, bir fareden, bir hamsterden bir hücre, bir fibroblast hücre veya diger herhangi bir konakçi hücre olabilir. Diger düzenlemelerde hücre, bir pluripotent hücre, indüklenen bir pluripotent kök (iPS) hücresi, bir insan olmayan embriyonik kök (ES) hücresidir. Bu tür hücreler, örnegin indüklü pluripotent kök (iPS) hücrelerini, fare embriyonik kök (ES) hücrelerini, siçan embriyonik kök (ES) hücrelerini, insan embriyonik (ES) hücrelerini veya gelisimsel olarak sinirli insan progenitör hücreleri, bir kemirgen embriyonik kök (ES) hücresini, bir fare embriyonik kök 00850-P-0044 (ES) hücresini veya bir siçan embriyonik kök (ES) hücresini içeren pluripotent hücreleri içerir. fragmenti" ifadeleri burada birbirinin yerine kullanilir. Bu ifadeler, nükleotid dizileri ve benzerini içerir. Bir polinükleotid, istege bagli olarak sentetik, dogal olmayan veya degistirilmis nükleotid bazlarini içeren tek sarmalli veya çift sarmalli olan RNA veya DNA"nin bir polimeri olabilir. Bir DNA polimeri formundaki bir polinükleotid, cDNA, genomik DNA, yapay DNA veya bunlarin karisimlarinin bir veya birkaç segmentinden olusabilir. Polinükleotidler, deoksiribonükleotidleri içerir ve ribonükleotidler, dogal olarak meydana gelen molekülleri ve yapay analoglari ve bunlarin herhangi bir kombinasyonunu içerir. Burada saglanan polinükleotidler ayni zamanda bunlarla sinirli olmamak üzere tek sarmalli formlar, çift sarmalli formlar, saç tokalari, kök-ve-döngü yapilari ve benzerini içeren bütün dizi formlarini kapsar. Ayrica rekombinant polinükleotidler saglanir. "Rekombinant polinükleotid" ve kullanilir. Rekombinant bir yapi, örnegin dogada birlikte bulunmayan regülatör ve kodlama dizileri olmak üzere nükleik asit dizilerinin yapay veya heterolog bir kombinasyonunu içerir. Diger düzenlemelerde rekombinant bir yapi, farkli kaynaklardan elde edilen regülatör dizileri ve kodlama dizilerini veya ayni kaynaktan elde edilen ancak dogada bulundugundan farkli bir sekilde düzenlenen regülatör dizileri ve kodlama dizilerini içerebilir. Bu tür bir yapi, tek basina kullanilabilir veya bir vektör ile birlikte kullanilabilir. Bir vektörün kullanilmasi halinde vektör seçimi, teknikte uzman kisilerce iyi bilindigi üzere konakçi hücreleri dönüstürmek amaciyla kullanilan yönteme baglidir. Örnegin bir plazmid vektör kullanilabilir. Tarama islemi, digerleri arasindan DNA,nin Southern analizi, mRNA ifadesinin Northern analizi, protein ifadesinin immünoblotlama analizi veya fenotipik analiz ile gerçeklestirilebilir. 00850-P-0044 Spesifik düzenlemelerde burada açiklanan bir veya daha fazla bilesen, pluripotent ve/Veya totipotent hücrede ekspresyona yönelik ekspresyon kasedinde saglanabilir. Kaset, burada saglanan bir polinükleotide uygulanabilir bir sekilde baglanan 5, ve 3, regülatör dizileri içerebilir. "Uygulanabilir bir sekilde bagli", iki veya daha fazla element arasindaki fonksiyonel bir baglanti anlamina gelir. Örnegin söz konusu bir polinükleotid ile bir regülatör dizi (diger bir ifadeyle, bir promotör) arasindaki uygulanabilir bir baglanti, söz konusu polinükleotidin ekspresyonunu saglayan fonksiyonel bir bagdir. Uygulanabilir sekilde baglanan elementler, bitisik veya bitisik olmayan olabilir. Iki protein kodlayici bölgenin birlestirilmesine refere etmek üzere kullanildiginda uygulanabilir bir sekilde bagli, kodlayici bölgelerin ayni okuma çerçevesinde oldugu anlamina gelir. Diger bir Örnekte bir proteini kodlayan bir nükleik asit dizisi, uygun transkripsiyonal regülasyonu sürdürmek üzere regülatör dizilere (örnegin, promotör, genisletici, susturucu dizi, vb.) uygulanabilir bir sekilde baglanabilir. Kaset ayrica ES hücresine birlikte eklenmek üzere söz konusu en az bir ilave polinükleotid içerebilir. Alternatif olarak söz konusu ilave polinükleotid, çoklu ekspresyon kasetlerinin üzerinde saglanabilir. Bu tür bir kaset, regülatör bölgelerin transkripsiyonal regülasyonu altinda olmak üzere bir rekombinant polinükleotidin ekleninesine yönelik birçok kisitlama alani ve/veya rekombinasyon alani ile saglanir. Ekspresyon kaseti ayrica seçim belirteci genlerini içerebilir. Ekspresyon kasedi, memeli hücresinde veya söz konusu konakçi hücrede transkripsiyonun 5,-3* yönünde bir transkripsiyonal ve translasyonel baslangiç bölgesini (diger bir ifadeyle, bir promotör), burada saglanan bir rekombinant polinükleotid ve bir transkripsiyonal ve translasyonel sonlandirma bölgesini (diger bir ifadeyle, sonlandirma bölgesi) içerebilir. Regülatör bölgeler (diger bir ifadeyle, promotörler, transkripsiyonal regülatör bölgeler ve transkripsiyonal ve translasyonel sonlandirma bölgeleri) ve/veya burada saglanan bir polinükleotid, konakçi hücreye veya birbirine natif/analog olabilir. Alternatif olarak burada saglanan regülatör bölgeler ve/veya bir polinükleotid, konakçi hücreye veya birbirine heterolog olabilir. Örnegin bir heterolog polinükleotide uygulanabilir bir 00850-P-0044 sekilde baglanan bir promotör, polinükleotidin türetildigi türlerden farkli bir türdendir veya ayni/analog türlerden olmasi halinde biri veya ikisi, büyük oranda bunlarin orijinal forinundan ve/veya genomik lokusundan modifiye edilir veya promotör, uygulanabilir bir sekilde bagli polinükleotide yönelik natif promotör degildir. Alternatif olarak burada saglanan regülatör bölgeler ve/veya bir rekombinant polinükleotid tamamen yapay olabilir. Sonlandirma bölgesi, transkripsiyonal baslangiç bölgesi ile natif olabilir, uygulanabilir bir sekilde bagli rekombinat polinükleotid ile natif olabilir, konakçi hücre ile natif olabilir veya diger bir kaynaktan (diger bir ifadeyle, yabanci veya heterolog) promotöre, rekombinant polinükleotide, konakçi hücreye veya bunlarin herhangi bir kombinasyonuna türetilebilir. Ekspresyon kasedinin hazirlanmasinda çesitli DNA fragmentleri, uygun oryantasyonda DNA dizilerinin saglanmasi amaciyla manipüle edilebilir. Bu amaçla adaptörler veya baglayicilar, DNA fragmentlerini birlestirmek üzere kullanilabilir veya diger manipülasyonlar, geleneksel kisitlama alanlari, fazla DNAlnin uzaklastirilmasi, kisitlama alanlarinin uzaklastirilmasi veya benzerini saglamak üzere dahil edilebilir. Bu amaçla in vitro mutajenez, öncü] onarim, kisitlama, tavlama, yeniden sübstitüsyon, örnegin geçisler ve degisimler dahil olabilir. Birkaç promotör, burada saglanan ekspresyon kasetlerinde kullanilabilir. Promotörler, istenen sonuca bagli olarak seçilebilir. Farkli uygulamalarin, söz konusu polinükleotidin zamanlamasi, lokasyonu ve/veya seviyesini modüle etmek üzere ekspresyon kasetlerinde farkli promotörlerin kullanimi ile genisletilebilecegi kabul edilir. Bu tür ekspresyon yapilari, istenmesi halinde bir promotör regülatör bölgeyi (örnegin, bir yetkili indüklenebilir, yapici, çevresel olarak veya gelisimsel olarak regüle edilen veya hücre veya dokuya spesifik/ seçici ekspresyon), bir transkripsiyon baslangici baslatma alani, bir ribozom baglama 00850-P-0044 alani, bir RNA isleme sinyali, bir transkripsiyon sonlandirrna alani ve/veya poliadenilasyon sinyalini içerebilir. Asagidaki örnekler, açiklama amaciyla ve kisitlama amaci olmadan sunulur. ÖRNEKLER Örnek 1. TALEN,ler veya CRISPR ile bitisik olan Y Kromozomu Geni Sahin Hedetlenmesi Sryiye yönelik bir lacZ replasmani allelini içeren hedeflenen bir delesyon, sirayla yaklasik olarak 700 bpslik bir yukari yönlü homoloji kolu, bir poliadenilasyon sinyali tarafindan takip edilen bir beta-galaktosidaz kodlayici dizi (lacZ), birinci ekson, birinci intron ve ikinci eksonun parçasi dahil olmak üzere bir insan ubikitin C promotörünü içeren loxP alanlari ile bitisik olan bir neomisin rezistans kasedi, bir neomisin fosfotransferaz kodlayici dizi ve bir poliadenilasyon sinyalini ve yaklasik olarak 650 bp`lik asagi yönlü bir homoloji kolunu içeren bir hedefleme vektörü ile olusturulur. Sry geminin hedefleme vektörü ile dogru hedeflenmesi ile olusturulan allel, yaklasik olarak 1 kb Sry açik okuma çerçevesinin bir delesyonunu ve lacZ-neo kasedi ile replamasini içerir böylece beta-galaktosidaz kodlayici dizi, Sry baslangiç kodonunda çerçeve içinde kaynastirilir. Hedefleme hibrit ES hücre hatlarinda Sry genini hedeflemek üzere kullanilmistir. VGFl (F1H4) faresi ES hücreleri, bir disi C57BL/6NTac faresi bir erkek 12986/SvEvTac faresine çaprazlanarak üretilen hibrit embriyolardan türetilmistir. Bu nedenle VGFl ES hücreleri, l29Sö/SvEvTac faresinden bir Y kromozomunu içerir. VGF] hücre hattindan üretilen disi XY fareleri, 129S6/SvEvTac faresinden türetilen bir Y kromozomunu içerir. 00850-P-0044 Örnek 2. Y Kromozomu Gen Srvade TALEN- veya CRISPR-indüklü Mutasyonlar 3 bp ila 1.2 kb araliginda degisen ve daha büyük olan delesyon mutasyonlari, büyük olasilikla çift sarmalli DNA kirilmalarinin homolog olmayan uç birlestirme (NHEJ) onariminin sonuçlari, Cas9 DNA endonükleazi ile kombinasyon halinde bir TALEN veya CRISPR kilavuz RNA7nin hareketi ile Sry geninde olusturulmustur (bakini, SEKIL l). Sry geninde TALEN- veya CRISPR-indüklü mutasyonlari içeren ES hücreleri, Sry kodlayici dizinin bir delesyonunu ve Sry baslangiç kodonu ile çerçeve içinde kaynastirilan lacZ ve 38 ve 37 kb"lik homoloji kollari ile bitisik olan ve bMQ kütüphanesinden (lZ9S7/SVEV Brd-Hprt b-m2) bir BACiye bagli olan bir neomisin dirençli geni içeren bir ek kaset ile repleasmanini içerenNIH KOMP proje VG12778 LTVEC "nin ("velocigene.com/komp/detail/ üzerinde internet araciligiyla bulunabilen) rastgele transgenik eklentilerini tasimistir. LTVEC, bunun homoloji kollarinda Sry ekspresyonuna yönelik bilinen tüm kontrol elemanlarini içerir. Bunun lacZ-kodlu beta-galaktosidazi, Sry geninin dokuya spesifik ve gelisimsel asamaya spesifik ekspresyonuna yönelik bir raportör olarak islev görür. LTVEC eklentileri ile birlikte TALEN- ve CRISPR- indüklü mutasyonlar, VGBö (aka. B ES hücre hatlarinda olusturulmustur. Sry geninde HMG kutusu DNA baglayici motif kodlayici dizinin (yukari yönlü tanima dizisi: 5`-TCCCGTGGTGAGAGGCAC-3' (SEQ ID NO: 72); asagi yönlü tanima dizisi: 5'-TATTTTGCATGCTGGGAT-3' (SEQ ID NO: 73)) parçasini hedeflemek üzere tasarlanan bir TALEN (TALEN-l) tarafimizca elde edilmistir. TALEN-l, çoklu deneylerde Sry lokusunda NHEJ mutasyonlarinin olusturulmasinda aktif olmustur. VGB6 ve VGFl faresi ES hücreleri, TALEN-indüklü mutasyonlar ile olusturulmustur. Tablo 1, bütün klonlarin ve bunlarin tasidigi delesyon 00850-P-0044 mutasyonlarinin boyutlarinin bir listesini içerir. (Tablo 13de ND, bir mutasyonun bir qPCR analizi ile tespit edildigini ancak mutasyonun tam moleküler yapisinin belirlenmedigini gösterir.) Bütün klonlar ayrica NIH KOMP projesi VG12778 LTVEC7nin en az bir kopyasini tasir. Sry Geninde TALEN- veya CRISPR-indüklü mutasyonlar ES hücresi Mutasyon indükleme ajani TALEN-l TALEN-l TALEN-l TALEN-l TALEN-l TALEN-l TALEN-l TALEN-l TALEN-l TALEN-l TALEN-l TALEN-l TALEN-l TALEN-l TALEN-l TALEN-l Delesyon (bp) 1200 1200 1200 00850-P-0044 Sry Geninde TALEN- veya CRISPR-indüklü mutasyonlar ES hücresi Klon Mutasyon indükleme ajani TC2 TALEN-l UA5 TALEN-l UB5 TALEN-l UE l 2 TALEN-l WE] 1 TALEN-l VGB6 OG6 CRlSPR-2 QES CRlSPR-3 VGFl AU-B6 CRISPR-4 AU-C 12 CRlSPR-4 AW-HS CRISPR-S *Ayrica bir 50 hp ekleme içermistir Delesyon (bp) 1200 Sry mutant klonlarinin mikroenjeksiyonlarinin sonuçlari, Tablo 27de belirtilir ve cinsiyeti degistirilen disilerin yetistirilme sonuçlari Tablo 3°te belirtilir. 00850-P-0044 8-hücreli embriyolarda Sry mutant ES hücresi klonlarinin mikroenjeksiyonu ile üretilen F0 j enerasyonu VeloviMice ES Hücresi Klon VGFl TA3 Sry mutasyonu 1 kb delesyon l kb delesyon 303 hp delesyon; 50 eklenti 627 hp delesyon 11 hp delesyon tip delesyon 1.201 hp delesyon 1.2 kb delesyon hp delesyon 9 bp delesyon Disi VM Erkek VM 00850-P-0044 Srygeninde mutasyonlar ile XY disi VelociMicelin yetistirme sonuçlari ES Klon Sry delesyonu XY Disi ID Üretilen Dogan Hücresi (bp) # Dogumlar yavrular 1460404 0 1460405 0 1460406 1 0* 1460408 0 1460409 0 1460410 0 1460429 0 1460430 0 1460431 0 1460432 0 1460436 0 1460437 0 1460438 0 1460410 0 00850-P-0044 Siygeninde mutasyonlar ile XY disi VelociMice°in yetistirme sonuçlari ES Klon Sry delesyonu XY Disi ID Üretilen Dogan Hücresi (bp) # Dogumlar yavrular 1525578 2 4 1525579 2 6 1525708 1 6 1525710 1 3 1525711 3 9 1525713 2 7 1594103 2 7 1594104 1 3 00850-P-0044 Siygeninde mutasyonlar ile XY disi VelociMice°in yetistirme sonuçlari ES Klon Sry delesyonu XY Disi ID Üretilen Hücresi (bp) # Dogumlar 1594105 2 15941 1 8 2 15941 19 1 94120 2 1594121 2 1594122 2 1594123 2 yavrular *XY Disi ID# 1460406"ya, kisinin kisa vadede bir nöbete sahip olmasi ve doguramamasi nedeniyle dogumdan önce Ötenazi yapilmasi gerekmistir. Ölü yavrulari (4 erkek, 5 disi), diseksiyon ile kurtarilmistir ve herhangi biri 313/ mutasyonu tasimamistir. VGB6 ES hücrelerinden türetilen Sry mutasyonlari ile VeloeiMieeWarm tamami, Srjy'nin etkisizlestirilmesine yönelik beklendigi gibi (Tablo 2) disi olmustur. Sry mutasyonlari olinayan anca NlH KOMP VG12778 LTVECSnin en az bir kopyasini tasiyanlar, sadece erkek VelociMice (Tablo 2, klonlar GB4 ve GGl) üretmistir. 17 3/32 mutant disi B6 VelociMiee test amaçli çiftlestirildiginde, yaklasik dört aylik bir çiftlestiime düzeninden sonra sadece biri hamile kalmistir (Tablo 3) ve bu disiye, yakin dönemde bir nöbet geçirmesi ve dogum yapamamasi nedeniyle dogumdan önce ötenazi yapilmistir. Diseksiyon ile kurtarilan ölü yavrularinin (4 erkek, 5 disi) tamami WT olmustur; herhangi biri Sry mutasyonu tasimamistir. VGB6 ES hücrelerinden yapilan neredeyse bütün Sry mutant farelerin, Sry mutasyonlari konusundaki literatür ile ayni görüste olarak steril 00850-P-0044 oldugu sonucu çikarilmistir. Ancak verilerimiz, VGF l klonlari ile oldukça farkli sonuçlar göstermistir. Birinci olarak VGFl ES hücreleri, alisildigi gibi disilesen KO-DMEM-benzeri düsük ozmotik mukavemetli büyüme ortamimizda muhafaza edilmistir: mutasyonlari tasimamalarina ragmen bu ortama mikro enjekte edilen XY klonlarinin bazilari, fogurgan XY disilerini, diger bir ifadeyle bir XY disi fenomen üretecektir. Bir örnek, herhangi bir Siy mutasyonuna sahip olmayan ancak NIH KOMP VG12778 LTVECnin en az bir kopyasini tasiyan klon TH4"tür. Bu klon, 2 disi ve 6 erkek VelociMice (Tablo 2) üretmistir. Herhangi bir Sry mutasyonu olmayan diger iki VGFl klonu (TA3 ve TA4, Tablo 2), saderece erkek VelociMice üretmistir. Sry içinde inutasyonlari olan VGFl XY ES hücrelerinign ayni zamanda ortam ile disilesebilip disilesemeyecegini belirlemek istemistik. Diger bir ifadeyle, VGB6 Srymutant ES hücrelerinin aksine bunlar, bazi dogurtan XY Sry mutant disileri üretebilecek mi? (VGB6 ES hücrelerinin KO-DMEM-benzeri düsük ozmotik mukavemetli ortamda muhafaza edilemeyecegi ve fare üretme yetenegini sürdürecegi belirtilir.) Cevap, Tablo 37te gösterildigi üzere evettir. bp ila 1 kb üzerinde bir aralikta olan TALEN-indüklü küçük delesyonlari olan alti VGF 1 ES hücre klonu mikroenjeksiyona tabi tutulmustur. Tamami, disi VelociMice vermistir, bunlarin 32,si çiftlestirilmistir. Önemli derecede Sry mutant XY disi VelociMice"larin tamami dogurgan olmustur; her biri en az bir yavru (Tablo 3) üretmistir. XY disilerinin bazirlari sadece bir veya iki küçük yavru üretirken Srjy mutant XY disilerinin birçogu normal yavru boyutlarinda birçok yavru üretmistir. Genotiplenmis bu çiftlestirmelerden 299 F1 faresi arasindan yaklasik olarak yarisi (146, %49) normal XY erkek veya normal XX disisi olmustur. 125 tanesi (%42) fenotipik erkekler olurken F1 farelerinden l74°ü (%58), fenotipik disiler olmustur. Disilerden 26"si (disilerin %153i, toplam F1 jenerasyonunun %8.7ssi), bir mutant Sry allelini kalitim yoluyla alan XY disileri olmustur. XY oositleri ile iliskili mayotik ayrilmama olaylari nedeniyle 00850-P-0044 bazilarinin mutant Sry allellerini içerdigi birkaç aberan genotip - XXY, XYY, XO, XXYY -, Sry mutant XY disi VelociMiceHn F1 dölünde gözlemlenmistir. XY ES hücrelerinden dogurgan XY disi VelociMice"in etkili olusumuna yönelik bir yöntem bulunmustur. Disilestirici büyüme ortaminda muhafaza edilen ES hücrelerinde Sry geninde etkisizlestirme mutasyonlarinin olusturulmasi halinde erkekler ile çiftlestirildiginde çogunlukla normal X ve Y kromozomlari olan erkek ve disi fareler veren dogurgan XY disi farelerin yüksek bir orani elde edilir. Örnek 3. Y Kromozomu Geni Sry içinde TALEN-indüklü Mutasyonlardan sonra KO-DMEM veya DMEM içinde Embriyo Onarimi LTVEC tarafindan fare Sry,sinin dogru hedeflenmesi, XY olan ve Sry mutasyonu tasiyan F0 disilerinden türetilen F 1 yavrularinin genotiplenmesiyle dogrulanmistir veya olumsuzlanmistir. LacZ/Neo kasetinin F1 farelerinde Sry mutasyonu (Sry LOA analizleri ile degerlendirildigi üzere) birlikte ayrilmasi güçlü bir sekilde dogru hedeflemeyi önerir. LacZ/Nednun mutasyon ile birlikte ayrilma konusunda basarisiz olmasi, orijinal klonun genom içinde diger bir yerde bir LacZ/Neo transgenik eklenti ile birlestirilen bir Sry delesyon mutasyonunu (TALEN ile indüklenen) içerdigini gösterir. XY disilerinde Srymutasyonlari olan yavrular, yüksek siklikta birçok anormal karyotip (XXY, XYY ve XO dahil) göstermistir. Cinsiyet kromozomu sayimi, X ve Y kromozomlari üzerindeki genlere yönelik iliskisiz allel kaybo (LOA) analizleri kullanilarak degerlendirilmistir. Sry°nin kopya sayisi akabinde LOA analizleri kullanilarak belirlenmistir. Mutant Sry allelinin varligi, Y kromozomunun kopya sayisinin Sry kopya sayisini astigi (Örnegin Y°nin 1 kopyasi ve Sry"nin 0 kopyasi veya Y°nin 2 kopyasi ve Siyinin 1 kopyasi) farelerde anlasilmistir. Son olarak LacZ ve Ne07nun varligi, TaqMan analizleri kullanilarak belirlenmistir. 00850-P-0044 TALEN nükleazi ile birlikte Sry LTVEC ile birlikte olusturulan ve KO-DMEM içinde büyütülen klonlarin orijinal gruplarinda, LacZ/Neo kasedinin Sry mutasyonu ile birlikte ayrilmadigi kanitlaninistir. Bu klonlardan bir numune yavru, Tablo 47te gösterilmistir. Tablo 4: TALEN nükleazi ile birlikte Sry LTVEC tarafindan üretilen klonlarin taranmasi Fare Cinsiy X Y Sry Lac Ne Genoti Yoruml et Kromozo Kromozo Kopya Z 0 p ar Kopyasi# Kopyasi# 2 o mevcut inutasyo 4 A mutasyo mevcut LacZ/Ne 165672 F 2 0 O 1 I X+X+ LacZ/Ne 00850-P-0044 Fare Cinsiy X Y Sry Lac Ne Genoti Yoruml et Kromozo Kromozo Kopya Z 0 p ar Kopyasi # Kopyasi # o mevcut mutasyo 6 YA mutasyo mevcut LacZ/Ne 165672 F 1 0 O 1 I X+ LacZ/Nc 8 o mevcut mutasyo TALEN nükleazi ile birlikte 3732 LTVEC ile birlikte olusturulan ve DMEM içinde 00850-P-0044 büyütülen klonlarin sonraki grubunda, LacZ/Neo kasedi, Sry mutasyonu ile tamamen birlikte ayrilmamistir, dogru hedeflemeyi gösterir. Bu klonlardan bir tipik yavru, Tablo Site gösterilmistir. Tablo 5: TALEN nükleazi ile birlikte Sry LTVEC tarafindan olusturulan klonlara yönelik tarama sonuçlari Fare Cinsiyet X Y Sry LacZ Neo Genotip Kromozomu Kromozomu Kopyasi Kopyasi# Kopyasi# # Örnek 4: Küçük TVEC,ler veya LTVEC"ler tarafindan Srylnin TALEN ve CRISPR-Destekli Hedeflenmesi SEKIL 2"de gösterildigi üzere Sry°ye yönelik bir lacZ replasman alleli içeren hedeflenen bir delesyon, Cas9 DNA endonükleazi ile kombinasyon halinde TALEN nükleazi veya CRISPR kilavuzu RNA"lari ile birlikte bir LTVEC veya bir küçük hedefleme vektörü (küçük TVEC) ile olusturulmustur. Küçük TVEC, 00850-P-0044 sirayla yaklasik olarak 700-800 bp"1ik bir yukari yönlü homoloji kolu, bir poliadenilasyon sinyali tarafindan takip edilen bir beta-galaktosidaz kodlayici dizi (lacZ), birinci ekson, birinci intron ve ikinci eksonun parçasi dahil olmak üzere bir insan ubikitin C promotörünü içeren loxP alanlari ile bitisik olan bir neomisin rezistans kasedi, bir neomisin fosfotransferaz kodlayici dizi ve bir poliadenilasyon sinyalini ve yaklasik olarak 700-800 bp,lik asagi yönlü bir homoloji kolunu içermistir. Sijy geninin hedefleme vektörü ile dogru hedeflenmesi ile olusturulan allel, yaklasik olarak 1 kb Sry açik okuma çerçevesinin bir delesyonunu ve lacZ- neo kasedi ile replamasini içerir böylece beta-galaktosidaz kodlayici dizi, Sry baslangiç kodonunda çerçeve içinde kaynastirilir. Hedefleme vektörü, VGFl (a.k.a. F lH4) C57BL6/129 Fl hibrit ES hücre hattinda ve VGB6 ES hücre hattinda (a.k.a. B6A6) Sry genini hedeflemek üzere kullanilmistir. Tablo 6lda gösterildigi üzere dört farkli gRNA ve bir TALEN çifti kullanilarak üretilen klonlar, TaqMan analizleri ile klevaj ve allel kaybina yönelik üretilmistir VC taranmistir. 00850-P-0044 Tablo 6: Klevaj ve allel kaybina yönelik tarama sonuçlari Küçük TVEC Hedefleme Lokasyon gRNA veya Taranan KO Toplam hedef Etkinlik TALEN Klonlar (%) HMG gRNA 2 192 4 2.1 HMG gRNA 3 192 5 2.6 3' ucu gRNA 4 192 3 1.6 3' ucu gRNA 5 192 5 2.6 HMG TALEN çifti 1 384 1 0.3 LTVEC transgenik klonlar, ayni lacZ deseni olan embriyolar üretmistir. SEKIL 3, embriyolarda LacZ ekspresyonunu gösterir. Tablo 7, Srylnin TALEN-destekli LTVEC destekli delesyon-replasman mutasyonlarina sahip olan geleneksel DMEM-bazli ortamda yetistirilen ES hücrelerinden türetilen XY Disilerinin dogurganlik sonuçlarini raporlar. Beklenmedik bir sekilde KO-DEMEM-bazli ortamda (Tablo 3) yetistirilen ES hücreleri ile benzer bir deneye yönelik sonuçlar ile karsilastirildiginda DMEM-bazli ortamda LTVEC hedeflemesi, dogru bir sekilde hedeflenen Sry delesyonlari ve lacZ-neo eklentileri olan klonlar üretmistir. Dört hedeflenen klondan türetilen 41 XYS'TWCZ) disiden kirki, %98 dogurganlik orani ile çiftlesme üzerine canli dogan yavrular üretmistir. Bu nedenle, mutant ES hücrelerinden yüksek oranda dogurgan XY disilerini üretmek üzere tarafimizca iki yeni yol bulunmustur: (1) KO-DMEM-bazli ortamda yetistirilen ES hücrelerinde 00850-P-0044 Sry içinde TALEN-indüklü etkisizlestirrne mutasyonlari; ve (2) DMEM-bazli ortamda yetistirilen ES hücrelerinde TALEN-destekli LTVEC hedefli tam delesyon-replasman mutasyonlari. Tablo 7: SU' 'l`.~'\l.lîl\' Mutant XY Disilcriiiin l'lrclinii Klon LS .`"C1C X` dlsl ÇIIIIUSITIIUI Dogurgim Dugurgginhk hücre açiklainasi VelocMiee XY xy 'ilanlari hatti dii|cü disileri Wc› 3( C4 VGFI Im? nr'a . ., _, , . X Elli VCFI Ir'ii Z nwi I I I IÜÜ v' 1 ' I' i 5 - 2 i hedeflenen g Ä-(Ü VUI'I /tli/I-iie'i'› 9 3 2 67 - hedeflenen VGFI loplam 55 41 40 98 Örnek 5: ZF N Aracili Y Kromozomu üzerinde Büyük Delesyon SEKIL 47te gösterildigi üzere 500 kb veya daha fazla büyük delesyonlar, Kdm5d ve Usp9y genlerini hedefleyen ZFN`ler kullanilarak Y kromozomu üzerinde yapilmistir. Tablo 8, Y kromozomu üzerinde çinko parmak dizilerin örneklerini Tablo 8: Y Kromozomu üzerinde Çinko Parmak Dizisi Hedef Y CHR ttAGGTAGGTAGACAGGGATgttttctg ZFNl 42 r43 102211 atCCAGTCtCTGAAGGAAGCTctgacta ZFN2 43 43108al NM011419- caAAAGCTTCAGGGGGActcttacactc ZFN3 44 00850-P-0044 Plakasi r19880al 19887a1 r17347al 17353211 r17350a1 17356al r8130a1 8 1 363 l r7172a1 7178211 r20472a1 20479a1 Çinko Parmak Dizisi ttTGAGCAgGCTACACAGGAGtataCtt aaGCGGTGgCAATAGGCAaaagatgtgg ctGAAGTCCCCAAGGGAGTAtggagatg agAAAGCGGTGGCAaTAGGCAaaagatg aaGTCCCCAAGGGAGTAtggagatgccc acTCCAACGACTATGACcactccgttca acAGATCAGATGAAGATgactggtCaaa ctTTCAAGGAAAAAAAGaacaaaaccca ggTCTGTGATAAGGACAGTTcaggatgg taAATCTGACTGAGAATGGGtagtagaa caGATGGTCCAGGAGAGGCTttgaaggc 00850-P-0044 Hedef Y CHR at TGGGCTTCCCTCTGGAat cacgagat ZFN7 56 r7267a1 ttTCAGTGATCGTGGAAGTGgatccagg ZFN8 57 7274211 NM148943- ctGGTTTGGAAATCGTActgtaaaagac ZFNl 58 r9256lal NM148943- gcAAAGAGGTTGAGGATttggacatatt ZFN2 59 92567211 NM148943- gaGGAGTTGTTGGAGAAGTthattgga ZFN3 60 r11830al NM148943- atATGAACAAGGCCAAGgtgatgctcca ZFN4 61 11836a1 NM148943- acTCAGAAGAAGGATTAGGAatgctttg ZFNS 62 r108581a1 NM148943- atGCTTAGaAATGTATCAGTTcatcttg ZFN6 63 108588a1 NM148943- tcCATAAGGATTTTGGAaaaagacacag ZFN7 64 r16244al 16251 1 agGCTGTGAGTGGATGGAAGtttgaaat ZFN8 65 Bir deneyde VGB6 klonlari D-G5 ve E-GTden (Tablo 3) 3.3 milyon ES hücresi, puromisin direncine yönelik seçim saglamak üzere ZFN mRNA çiftleri Kdm5d- ZFN5(NM ve Usp9y- 00850-P-0044 ZFN3(NM ile ve Ch25h genini hedefleyen LTVEC(0.67 ug) ile elektroporasyona tabi tutulmustur. Puromisin dirençli koloniler seçilmistir ve delesyona yönelik taranmistir. Sonuçlar Tablo 9'da gösterilir. yönelik Tarama Sonuçlari Parental # Puromisin dirençli # Taranan # Dogrulanan Silinmis Tablo 10, E-G7 parental klondan (Tablo 3) türetilen bir delesyon klonuna (4306A- D5) ve D-G5 parental klonundan (Tablo 3) türetilen iki delesyon klonuna (4306E- tam boyutlarini gösterir. Tablo 10: Kdm5d ve Usp9y°nin ZFN aracili delesyonlari Klon Y Kromozomu Üzerinde Delesyon Koordinatlari Boyut (bp) Kdm5d, Eif253y, Uty, Ddx3y ve Usp9y genlerinin delesyonu (SEKIL 4), SEKIL ,te gösterildigi üzere delesyon allel kaybi analizlerinde ve DNA diziliminde dogrulanmistir. Klon 4306A-D5, 8-hücre asamasi embriyolarina mikroenjeksiyon ve tasiyici annelere aktarim üzerinde dokuz XY disisi tam olarak ES hücresi ile 00850-P-0044 türetilen VelociMice üretmistir. Klon 4306A-D5°ten herhangi bir XY disisi dogurgan olmamistir. Örnek 6: CRISPR/Cas Aracili Y Kromozomu üzerinde Büyük Delesyon Kdm5d ve Usp9y genleri arasindaki bölgeyi hedefleyen Y kromozomu üzerindeki büyük delesyon, Cas9 DNA endonükleazi ile kombinasyon halinde CRISPR kilavuz RNAllari kullanilarak yapilmistir. gRNA"lar, Kdm5d geni Usp9y genini hedeflemek üzere tasarlanmistir. Asagidaki gRNAWar, Kdm5d°yi hedeflemek üzere tasarlanmistir: KdmSdgA (Kilavuz #1) UUUGCCGAAUAUGCUCUCGU (SEQ 1D NO:66); Kdm5dgB (Kilavuz #2) UUGCCGAAUAUGCUCUCGUG (SEQ ID NO:67); ve KdmSdgC (Kilavuz #5) CGGGCAUCUCCAUACUCCCU (SEQ ID NO:68). Asagidaki gRNA`lar, Usp9y"yi hedeflemek üzere tasarlanmistir: Usp9ygA (Kilavuz #1) UAGCUCGUUGUGUAGCACCU (SEQ NO:70); ve Usp9ng (Kilavuz #2) GGAUACCCUUCUAUAGGCCC (SEQ ID VGFl faresi ES hücreleri, puromisin direncine yönelik seçim saglamak üzere Cas9'u eksprese eden bir plazmidin 5 ug"si ve Kdm5d gRNA B ve Usp9y gRNA C`yi eksprese eden plazmidlerin her bir 10 ug,si ile ve Ch25h genini (0.67 ug) hedefleyen bir LTVEC ile elektroporasyona tabi tutulmustur. SEKIL 4°te gösterildigi üzere KdmSdgB (gRNA B) ve Usp9ng (gRNA C), Kdm5d ve Usp9y genlerinin delesyonunu hedeflemek üzere kullanilmistir. Ortaya çikan klonlar, Kdm5d ve Usp9y genlerinde ve arasindaki (ES/1253)), Uty ve Ddx3y) genlerde ve hedeIlenen delesyonun (ij/Z ve &32) disindaki genlere yönelik dizilere yönelik allel kaybi analizleri ile delesyona yönelik taranmistir. Tablo 11"de gösterildigi üzere büyük delesyonu içeren dört klon elde edilmistir. Klon R- A8, 8-hücre asamasi embriyolarina mikroenjeksiyon ve tasiyici annelere aktarim 00850-P-0044 üzerinde yedi XY erkegi ve 3 XY disisi tam olarak ES hücresi ile türetilen VelociMiee üretmistir. Tablo 11: CRISPR kilavuz RNA'lar ve Cas9 aracili büyük delesyonu dogrulayan TaqMan analizi Alle] Kaybi Kopya Sayisinin Belirlenmesi Zß22 Sry (EÜZSîy) (Uîy) (Ddx3y) Q-Fl 0 0 0 1 1 Büyük delesyon A8 yu y Büyük delesyon, kismi kayipY R- WT kontrol olarak 1 1 1 1 1 El 1 klon eklenmesi Tarifnamede bahsedilen bütün yayinlar ve patent basvurulari, bu bulusun ilgili oldugu teknikte uzman kisilerin seviyesinin göstergesidir. Bir alintiyla ilgili bir bilginin, örnegin bir depozit numarasinin zamanla degismesi halinde basvurunun etkili basvuru tarihinde geçerli olan bilginin versiyonu amaçlanir, etkili basvuru tarihi, birinci olarak alintiyi saglayan basvurunun gerçek basvuru tarihi veya rüçhan tarihi anlamina gelir. Herhangi bir düzenlemeden aksi anlasilmadigi süreve bulusun açisi, adimi veya özelligi, herhangi biri ile kombinasyon halinde kullanilabilir. Bir araliga referans, aralik içindeki herhangi bir tamsayisi veya aralik içindeki herhangi bir alt araligi içerir. Çoklu araliklara referans, bu tür araliklarin bilesiinlerini içerir. 00850-P-0044 DIZI LISTESI <110 F rendewey, David Droguett, Gustavo Gagliardi, Anthony Kuno, Junko Auerbach, Wojtek Valenzuela, David M. <120 HEDEFLENEN GENETIK MODIFIKASYONLARA YÖNELIK YÖNTEMLER VE BILESIMLER VE KULLANIM YÖNTEMLERI <160 71 <170 Windows Versiyonu 4.07a yönelik FastSEQ <210 1 <21 1 23 <212 DNA <213 bir kilavuz RNAArtiffne bagli bir hedef lokus <220 < bagli olan bir hedef lokus <220 <221 çesitli_özellik <223 n = A,T,C or G <400 1 <210 2 <21 l 80 00850-P-0044 <212 RNA <213 Yapay Dizi <220 <400 2 giiuuiugigc uigiaaiugr. .uguiiiiiuii iiggmiaquc ::giiiiiixmaac Liu-;aiiaagii !EC oscaccçaou cocuacuuuu <2 10 3 <21 1 42 <212 RNA <213 Yapay Dizi <220 <400 3 <210 4 <21 1 30 <212 RNA <213 Yapay Dizi <220 <223 a chNA <400 4 <210 5 <21 1 33 <212 RNA <213 Yapay Dizi <220 <223 a chNA <400 5 00850-P-0044 <210 6 <21 1 26 <212 RNA <213 Yapay Dizi <220 <223 a chNA <400 6 <210 7 <21 1 12 <212 RNA <213 Yapay Dizi <220 <223 a trachNA <400 7 <210 8 <21 1 50 <212 RNA <213 Yapay Dizi <220 <223 a trachNA <400 8 <210 9 <21 1 23 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 < bagli olan bir hedef lokus 00850-P-0044 <220 <221 çesitli_öze]1ik <223 n = A,T,C or G <400 9 <210 10 <21 1 23 <212 DNA <213 Yapay DiZi <220 <223 VG-l gRNA hedef dizisi <400 10 <210 11 <211 23 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 VG-2 gRNA hedef dizisi <400 11 <210 12 <211 23 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 VG-3 gRNA hedef dizisi <400 12 00850-P-0044 <210 13 <21 1 20 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay sryTFl primeri <400 13 <210 14 <211 19 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay sryTRl primeri <400 14 <210 15 <21 1 22 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay sryTP] probu <400 15 <210 16 <21 1 18 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay sryTF2 primeri 00850-P-0044 <400 16 <210 17 <21 l 18 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay sryTR2 primeri <400 17 <210 18 <21 1 26 <212 DNA <2l3 Yapay Dizi <220 <223 Yapay sryTP2 probu <400 18 <210 19 <211 20 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay sryTF 3 primeri <400 19 <210 20 <21 l 18 <212 DNA <213 Yapay Dizi 00850-P-0044 <220 <223 Yapay sryTR3 primeri <400 20 <210 21 <21 1 23 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay sryTP3 probu <400 21 <2 1 0 22 <21 l 19 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay sryTF4 primeri <400 22 <210 23 <21 1 20 <212 DNA <2 1 3 Yapay Dizi <220 <223 Yapay sryTR4 primeri <400 23 <210 24 <21 1 24 00850-P-0044 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay sryTP4 probu <400 24 <210 25 <21 1 24 <212 DNA <213 Yapay DiZi <220 <223 Yapay sryTF5 primeri <400 25 <210 26 <21 1 14 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay sryTRS primeri <400 26 <210 27 <21 1 15 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay sryTP5 probu <400 27 00850-P-0044 <210 28 <21 1 20 <212 DNA <2l3 Yapay Dizi <220 <223 Yapay 648TUF primeri <400 28 <210 29 <211 19 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay 648TUP probu <400 29 <210 30 <21 1 73 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay <400 30 inttinnica tnttt.tg:r.t atfgccicu; Ettqiggagt. [gitggigaa gtcrcarigg 43& <210 31 <211 65 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay 00850-P-0044 <400 31 <210 32 <211 63 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay <400 32 <2lO 33 <21 l 90 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay <400 33 cratcigira ggatatîtti gigtttfcir ittgtatgga qgigîtqttg giqaiqrcrn EE <210 34 <21 l 70 <212 DNA <2l3 Yapay Dizi <220 <223 Yapay <400 34 cratciqira ggatatttti gigttgftqg igiigtcrna rttggiigia tcagirqirg EE <210 35 <21 1 69 <212 DNA <2l3 Yapay Dizi 00850-P-0044 <220 <223 Yapay <400 35 <210 36 <21 1 69 <212 DNA <213 Yapay DiZi <220 <223 Yapay <400 36 <210 37 <211 69 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay <400 37 tnaqataqqa !attriigaq ttttcatatt gtafqqtlit agqaggagtt gttçqaqiag SEI <210 3 8 <21 1 49 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay <400 38 00850-P-0044 <210 39 <21 1 49 <212 DNA <2 1 3 Yapay Dizi <220 <223 Yapay <400 39 <210 40 <211 49 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay <400 40 <210 41 <21 l 38 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay <400 41 <210 42 <21 1 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay KDM5D ZFNl hedef dizisi 00850-P-0044 <400 42 <2 1 0 43 <21 l 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay KDMSD ZFN2 hedef dizisi <400 43 <210 44 <21 1 28 <212 DNA <2 1 3 Yapay Dizi <220 <223 Yapay KDM5D ZFN3 hedef dizisi <400 44 <210 45 <21 1 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay KDMSD ZFN4 hedef dizisi <400 45 <210 46 <21 1 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi 00850-P-0044 <220 <223 Yapay KDMSD ZFNS hedef dizisi <400 46 <210 47 <21 1 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay KDMSD ZFN6 hedef dizisi <400 47 <210 4 8 <21 l 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay KDMSD ZFN7 hedef dizisi <400 48 <210 49 <21 1 28 <212 DNA <2 1 3 Yapay Dizi <220 <223 Yapay KDM5D ZFN8 hedef dizisi <400 49 <210 50 <21 1 28 00850-P-0044 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay DDX3Y ZFNl hedef dizisi <400 50 <210 5 1 <21 1 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay DDX3Y ZFN2 hedef dizisi <400 51 <210 52 <21 1 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay DDX3Y ZFN3 hedef dizisi <400 52 <2 1 0 53 <21 l 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay DDX3Y ZFN4 hedef dizisi <400 53 00850-P-0044 <210 54 <21 1 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay DDX3Y ZFN5 hedef dizisi <400 54 <210 55 <211 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay DDX3Y ZFN6 hedef dizisi <400 55 <210 56 <21 l 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay DDX3Y ZFN7 hedef` dizisi <400 56 <210 57 <211 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay DDX3Y ZFN8 hedef dizisi 00850-P-0044 <400 57 <210 58 <21 l 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay USP9Y ZFNl hedef dizisi <400 58 <210 59 <21 1 28 <212 DNA <2l3 Yapay Dizi <220 <223 Yapay USP9Y ZFN2 hedef dizisi <400 59 <210 60 <211 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay USP9Y ZFN3 hedef dizisi <400 60 <210 61 <21 l 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi 00850-P-0044 <220 <223 Yapay USP9Y ZFN4 hedef dizisi <400 61 <210 62 <21 1 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay USP9Y ZFNS hedef dizisi <400 62 <210 63 <21 l 28 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay USP9Y ZFN6 hedef dizisi <400 63 <210 64 <21 1 28 <212 DNA <2 1 3 Yapay Dizi <220 <223 Yapay USP9Y ZFN7 hedef dizisi <400 64 <210 65 <21 1 28 00850-P-0044 <212 DNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay USP9Y ZFN8 hedef dizisi <400 65 <210 66 <21 1 20 <212 RNA <213 Yapay DiZi <220 <223 Yapay Kdm5dgA gRNA 1 <400 66 <210 67 <211 20 <212 RNA <213 Yapay Dizi <220 <400 67 <210 68 <211 20 <212 RNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Kdm5dgC gRNA 5 <400 68 00850-P-0044 <210 69 <21 1 20 <212 RNA <2l3 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Usp9ygA gRNA 1 <400 69 <210 70 <211 20 <212 RNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Usp9ygB gRNA l <400 70 <210 71 <21 1 20 <212 RNA <213 Yapay Dizi <220 <223 Yapay Usp9ng gRNA 2 <400 71 TR TR TR TR TR