SU944491A3 - Способ получени биологически активного вещества, обладающего иммуностимулирующим действием - Google Patents

Description

валина, N-метилизолейцина и N-метил-аллоизолейцина .

Процентное содержание различных компонентов продукта, обозначенных А, В, С и D, определ ют после разделени  их методом жидкостной хроматографии при высоком давлении в инвертированной фазе и измер ют при помощи интегратора. Процентные содержани  различных компонентов определ ют по отношению к суммарной площади пиков четырех компонентов в зависимости от их остаточного поглощени  в УФ-области при 25 нм. Процентное содержание каждого из пептидных компонентов лежит в пределах: А 2-5; В 10-16 С 32-39; D .

Компонент А при частичном гидролизе в щелочной среде дает три молекулы лактона, образующиес  при разрыве эфирных св зей и последующей циклизации в лактон о -гидроксиизовалерил-N-метилвалина . При полном гидролизе в кислой среде происходит разрыв и эфирных, и аминных св зей. Результатом такого гидролиза  вл етс  получение трех молекул N-метилвалина и трех молекул о -гидроксиизовалериановой кислоты. Компонент В при частичном гидроли- -j вод т

зе в щелочной среде дает две молекулы лактона, образующегос  при циклизации о -гидроксиизовалери л-N-метилвалина и одну молекулу лактона, образующегос  при циклизации cii-гидроксиизовалерил-М-мети/1-изолейцина 91ли -аллоизолейцина . При полном гидролизе в кислой среде компонента В получают три молекулы гидроксиизовалериановой кислоты, две молекулы N-метилвалина и одну молекулу гидроксиизовалерил-М-метилизолейцина или N-метил-аллоизолейцина .

Компонент С при щелочном гидролизе дает одну молекулу лактона, образующегос  при циклизации 0 1-гидроксиизс5валерил-Н-метилвалина и две молекулы лактона, образующегос  при циклизации 0 -гидроксиизовалерил-N-метилизолейцина или N-метил-алоизолейцина . При полном гидролизе в кислой среде получают три молекулы о -гидроксиизовалериановой кислоты, одну молекулу N-метилвалина и две молекулы N-метилизолейцина или N-метил-аллоизолейцина .

Компонент D при частичном гидролизе в щелочной среде дает три молекулы лактона, образующегос  при циклизации о -гидроксиизовалерил-М-метилизолейцина или N-метил-аллоизолейцина . При полном гидролизе в кислой среде компонент D дает три молекулы ск -гидроксиизовалериановой кислоты и три молекулы N-метилизолейцина или N-метил-аллоизолейцина.

При гидролизе всего биологически активного продукта по предлагаемому способу получаюто -гидроксиизовалериановую кислоту, N-метилвалин, N-метилизолейцин (в эритро-форме) и N-метил-аллоизолейцин (в трио-форме), при этом N-метил-аллоизолейцин не может быть отнесен ни к одному конкретному компоненту.

Способ осуществл ют следующим образом .

Провод т аэробную ферментацию штамма Fusarium eguiseti № 213107 в глубоких сосудах при 29±5°С и рН в пределах при перемешивании, продолжительность каждой стадии 36-iS ч, собирают в конце ферментации мицелий, извлекают его хлорсодержащим раство-. рйтелем - трихлорэтиленом, отдел ют органическую фазу, отгон ют растворитель досуха, в остаток ввод т углеводород {пентан или гексан), проВОДНЫМ спиртом с противотоке: водный раствор спирта представл ет собой смесь метанола и воды, после чего отдел ют спиртовую фазу, концентрируют ее, осаждают продукт пептидного характера и очищают его с применением хроматографии на колонке с окисью алюмини .

П.р и м е р 1. Идентификаци  штамма.

Ферментационна  среда № 1, г: сахароза 25; глюкоза 25; нитрат аммони  10; сульфат магни  2,5 однозамещенный фосфат кали  5- рН после стерилизации 5- Компактный мицелий имеет пушистую нитевидную структуру и оранжевую окраску. При переворачивании чашки Петри культура принимает желто-оранжевую окраску (цвет персика ) , переход щую в охристый оранжевый цвет у более развитой культуры

Зернова  среда.

Мицелий дает ровную, пушистую культуру , располагающуюс  в виде характерных колец. Пигментаци  слаба , обратна  сторона при развитии культуры приобретает темно-желтую окраску.

Среда сне, г: карбоксиметилцеллюлоза 15; нитрат аммони  1; однозамеэкстракцию углеводородной фазы щенный фосфат кали  1; сульфат магни  0,5; экстракт дрожжей 1; дистиллированна  вода 1000. Эта среда может быть дополнена посредством добавлени  к ней сухих фрагментов культуры Phragmites communis. Мицелий редкий очень ровный, незаметный, не имеющий окраски. Воздействие света на спорул цию грибков. При воздействии белого света, который дают белые флуоресцентные источники света, интенсивностью 1000 л в течение 12 ч ежедневно, отмечают образование макроконидий в среде на основе CMC и в среде, дополненной культурой Phragmites. При использовании источника света Вуда (длина волны излучени  ЗбО,Зб5 нм), расположенного на рассто нии 33 см от испытуемых культур, макроконидии образуютс  в больших количествах по истечении -6 дней. Окраска культуральных сред, культивированных под воздействием источника света Вуда, несколько ослаблена по сравнению .с окраской сред, полученных при культивировании под воздействием белого света. Культура. Fusariurn eguiseti №21310 может-быть получена на классических средах, используемых дл  получени  культур вида Fusariurn. Насреде,содержащей tO г/л овс ной муки, среде на основе картофел  (50 г картофельной пульпы, 10 г глюкозы и 20 г агара на 1 л воды),. солодово-агаровой среде (2), агаризованной на 2, конидиогенез наблюдаетс  редко с образованием ненормальных конидий, со смешением несозревших макроконидий С микрокониди ми. По вление окраски в виде концентрических зон наблюдаетс  в большей степени при культивировании под воздействием света, чем дл  культур, полученных в темноте (на среде на основе картофел ). Куль тура на овс ной муке дает компактные ровные, гетерогенные, слабо окрашенные мицелии. Конидиогенез в этом слу чае не наблюдаетс . Морфологическа  характеристика ма роконидий. Макроконидии имеют удлиненную сер повидную форму, конечные клетки имею форму раскрытого клюва, промежуточны клетки несколько расширены, основна  клетка имеет форму ступни. Размеры значительно мен ютс  и завис т от ус 6 ловий культивировани : длина 25 60 мкм, ширина - мкм. Окрашенные конидии имеют стеклообразный вид. Ко.личество перегородок в молодых культурах А. Микроконидиофоры П.ПОХО различимы и по вл ютс  редко, дают разветвление в виде кисточки. Характеристика хламидоспор. Промежуточные хламидоспоры, одиночные или в виде цепей, имеют форму глобул с более плотными стенками диаметром мкм. Они образуютс  в более зрелых культурах при культивировании более 20 дней. Приготовление подложек. Скошенный агар, Из содержимого ампулы с лиофилизированным мицелием извлекают 2 мл стерилизованной воды. Полученную суспензию используют дл  высевани  культуры в четырех пробирках, содержащих по 10 мл скошенного агара, имеющего следующий состав, г: овс ные хлопь  30; глюкоза 10; агар 20; дистиллированна  вода 1000; услови  стерилизации 20 мин при 120С, первоначальный рН 6,6, рН после стерилизации 5,8. . Среду культивируют 6-8 дней в термостате при 28 С, после чего подвергают облучению солнечным светом в течение недели в лабораторных услови х при комнатной температуре. Чашка Ру. Из воздушного мицели , полученного на скошенном агаре, извлекают 10 мл стерилизованной воды. Полученную суспензию примен ют дл  высевани  в 5 чашках Ру, содержащих 200 мл агаровой композиции состава, идентичного приведенному. Среду культивируют 68 дней в термостате при 28 С, после чего подвергают облучению солнечным светом в течение недели в лабораторных услови х. Получение прививочного материала. Перва  стади . Из культуры, полученной в чашке Ру, получают суспензию мицели  в 100 мл стерилизованной воды путем сн ти  культуры со всей поверхности. Полученную суспензию используют дл  высевани  культуры в колбе, содержащей Ц л среды следующего состава, г/л: сахароза 25,0; глюкоза 25; нитрат аммони  10,0; однозамещенный фосфат кали  сульфат магни  2,5; водопроводна  вода 1,0 л. Услови  стерилизации 30 мин пои , первоначальный рН 5,5, рН после стерилизации А,75- Аэробное культивирование провод т при 28°С. в устройстве, обес печивающем барботирование стерилизованным воздухом с перемешиванием k8 ч (среднее значение 72 ч) . Втора  стади . Посев культуры () производ т исход  из одной -литровой колбы пре парата, полученного на первой стадии и 75 л среды следующего состава, г/л сахароза kO; целероза 5; нитрат аммо ни  10; однозамещенный фосфат кали  5; сульфат магни  2,5; водопроводна  вода 1,0 л. Услови  проведени  стери лизации 30 мин при 120 С, рН после стерилизации 5,6. Услови  ферментации: аэраци  3,5 м /ч, перемешивание 70 раз в мин, температура продолжительность 36 ч. Во врем  про ведени  ферментации провод т контрол стерильности, измерени  рН, микроскопические исследовани  и количественный анализ остаточных Сахаров с соблюдением стерильных условий. Треть  стади . Используют прививочный материал, полученный на второй стадии, дл  посева на 1200 л питательной среды, имеющей состав, идентичный описанному (посев 6,25)- Услови  проведени  ферментации: аэраци  70 м /ч, перемешивание 50 раз в мин, температура + 29-1 °С,, продолжительность ч. Во врем  проведени  ферментации провод т те же контрбльные исследовани , что и на предыдущей стадии . Производство. 1200 л прививочного материала, по лученного на третьей стадии, перенос т дл  посева в 7 м питательной ер ды, имеющей следующий состав, г/л: сахароза 50; целероза 5,0; нитрат аммони  10,0; однозамещенный фосфат кали  3,0; сульфат магни  2,5; сульфат цинка 0, карбонат кальци  2,0 водопроводна  вода 1,0 л; услови  пр ведени  стерилизации 30 мин при +20 рН после стерилизации 6,5-Услови  фе ментации: аэраци  250 , перемеши вание 20 раз в мин, температура + 29 41 °С, продолжительность 0 ч. Во вре м  проведени  ферментации осуществл ют те же контрольные исследовани , что и на предыдущих стади х, Значение рН, близкое к 3 на 2А ч, медленн повышают и стабилизируют около значе ни  5,3-5,5 к концу ферментации. Ми целии отдел ют от ферментационного русла фильтрованием под давлением и сушат в вентилируемом сушильном шкафу . Таким способом получают после измельчени  в среднем 120 кг сухого мицели . Экстракци . Экстракци  неочищенного продукта. На 100 кг мицели . Из измельченного мицели  извлекают 400 л трихлорэтилена, перемешивают 2 ч и сушат. Полученный остаток промывают 100 л трихлорэтилена и провод т вторичную экстракцию 300 л трихлорэтилена при перемешивании 1 ч, после чего оп ть сушат. Остаток промывают 100 л трихлорэтилена, объедин ют экстракты, концентрируют их при пониженном давлении до получени  густой массы. На 10 кг полученной массы. Массу раствор ют в 90 л гексана, осветл ют фильтрованием и экстрагируют из гексанового раствора водным раствором метанола в противотоке (cor став водного раствора вода:спирт 80:20 по объему); перва  экстракци  50 л смеси, втора  25 л, треть  12,5 л и четверта  10 л. Метанольные экстракты объедин ют и концентрируют досуха при пониженном давлении. Хроматографи  на кислотной окиси алюмини . Получение окиси алюмини . 1 кг окиси алюмини  перевод т в суспензию в 5 л дистиллированной воды и при слабом перемешивании добавл ют концентрированную сол ную кислоту в количестве, необходимом дл  поддержани  рН ,0 в течение 2Ц ч. Суспензию фильтруют через нейлоновый фильтр и обильно промывают дистиллированной водой, после чего промывают ацетоном дл  удалени  остатков воды сушат окись алюмини  в сушильном и шкафу при в течение одлой ночи. Хроматографи . На 20 кг метанольного экстракта. Метанольный экстракт раствор ют в 80 л хлористого метилена, осветл ют раствор фильтрованием и подвергают хроматографическому разделению в хлористом .метилене на стекл нной колонке высотой 0,8 м, заполненной 0 кг окиси алюмини  таким образом, чтобы расход раствора в хлористом метилене составл л 15 л/ч. Окись алюмини  промывают 80 л хлористого метилена при том же часовом расходе. Выделение активного вещества. Отмытое хлористым метиленом вещество концентрируют при пониженном давлении до получени  густой массы, которую затем раствор ют в 200 л эти лового спирта и осветл ют фильтрованием . Раствор в этиловом спирте охлаждают до- k С и добавл ют при медленном перемешивании 8 ч, поддержива  при этом температуру и при перемешиваний 20, ч, после чего отдел ют выделившиес  кристаллы фильтрованием . Полученный остаток промывают смесью метанол:вода 1:2, предварительно охлажденной, затем 50 л дистил-15 ни  лированной воды. Кристаллический деп сипептид сушат в сушильном шкафу при пониженном давлении и 40С до по сто нного веса. Депсипептид получают в виде кристаллического порошка белого или светло-желтого цвета, без запаха, имеющего горький вкус. Он очень плохо растворим в воде и легко раствор етс  в хлороформе, метиловом и этиловом спирте при 95°С. Температура плавлени  безводного продукта, определенна  методом Кофлера, равна 121i5 С, удельное вращениеСо ,-80°±5°С 5, метанол. Общее содержание азбта 6,2±0,3%. Идентификаци  компонентов методом тонкослойной хроматографии. Приготовление носител . Из расчета на 5 хроматографически пластинок 20-20 см готов т гомогенну смесь из 4 г целлюлозы Мп 300,8 г це люлозы Ип 300 G .и б5 мл воды, после чего нанос т полученную суспензию на тщательно обезжиренные пластинки в . виде сло  толщиной 0,25 мм. Обработа ные таким способом хроматографические пластинки сушат на воздухе при 110 С 2 ч, охлаждайт и погружают в вертикальном положении в смесь формамид:ацетон 1: на глубину около 2 см от кра . После этого их сушат 1 мин на открытом воздухе дл  удалени  ацетона. Растворитель дл  хроматографии. Используют гептан, насыщенный фор мамидом (пересыщенный раствор). Готов т раствор в метаноле из рас чета 10 мг вещества на 1 л. (О мл раствора помещают на рассто нии I см от кра  пластинки, н обраб танного формалином. После распространени  раствора на рассто ние около 10 см пластинку сушат 1 ч при и опрыскивают Э 10 0,5%-ным раствором иода в хлороформе. При этом образуютс  четыре п тна желтого цвета, два из которых, наиболее интенсивные, соответствуют Rf около 0,55 и 0,5, одно, менее интенсивное, Rf около 0,35, и одно очень слабое Rf около 0,3Разделение дипсипептида на компоненты методом жидкостной хроматографии при высоком давлении (ЖХВД). Относительные содержани , компонен-тов А, В, С и D определены дл  различных промышленных образцов после разделени  их методом ЖХВД и измереплощадей пиков с помощью интегратора . Относительные содержани  компонентов в процентах рассчитаны относительно суммы площадей пиков всех четырех компонентов при предположении , что остаточное поглощение в УФ-области при 25 нм остаетс  одинак .овым дл  всех компонентов. Услови  проведени  разделени : носитель фаза Bonsapak с 18 (Waters Associates ) длина 30 см, внутренний диаметр 3,9 мм. Элюент метанол:вода 8:2 по объему. Скорость пропускани  1,5 мл/мин. Рабочие растворы: 10 мг . вещества на 1 л метанола, дозирование по 10 мл. Детектирование: УФ-область, длина волны 25 нм. Чувствительность D 0,02 от всей шкалы. Измерение площадей с применением интегратора ICAP 5. Следующие результаты соответствуют среднему составу дл  различных образцов депсипептидного продукта,%: А 3,9; В 15,3; С 38,1; D k2,7. Наличие продукта подтверждаетс  также приводимыми ИК-спектрами. Пример 2. Фармацевтические композиции на основе депсипептида. Створоженный раствор в изо-пропилмиристате , г: экстракт депсипептида Fusarlum eguiseti 0,050; эссенци  Нероли 0,050; эвкалиптол 0,050; сахарин О , 001 25; изо-пропилмиристат 2,5 мл; флюген 12-7,5 мл. Водна  суспензи , г: экстракт депсипептида Fusarium eguiseti 0,050; полио.ксиэтиленсорбитанмоноолеат твин 80 0,010; хлористый натрий GJ80; эссенци  Нероли 0,050.; эвкапмптол 0,05; сахаринат натри  0,010, дистиллированна  вода 20. В обоих случа х продукт распредел ют с помощью дозировочного шприца емкостью 0,080 г на доз, что соответствует 200 мг активного препарата на дозу.

1твороженный раствор, г: экстракт депсипептида Fusarium eguiseti 0,015; ароматизирующий агент 0,0075; изо-пропилмиристат 0,75 мл, фреон 122 ,25 мл. Сосуд оборудован клапаном на 25 мкл и содержит 3 мл раствора. При каждом срабатывании клапана получаетс  доза депсипептида в 125 мкг.

Створоженный раствор, г: экстракт депсипептида Fusarium ego i set 0,030 ароматизирующий агент 0,015; изо-про пилмиристат 0,750 ел, фреон 122 ,23 МЛ- Этот рецепт дает возможност иметь 250 мкг депсипептида в каждой дозе при общем количестве доз 120. Маслообразный раствор, г: экстрак депсипептида Fusarium eguiseti 0,05; сахарин 0,0015; ароматизирующий аген 0,05; изо-пропилмиристат 6 мл, сосуд оборудован дозатором, позвол ющим по лучать дозу в 30 мкл при каждом нажа тии . Водна  суспензи , мг: экстракт депсипептида Fusarium eguiseti 50; полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат 15; хлористый натрий 120; двузамещенный фосфат натри  17,25; двузамещенный фосфат кали  3; хлористый кальций 1,5; хлористый магний 1,5; мышь ковистый меркаптид натри  0,0375; вода 15- Суспензию помещают в сосуд емкостью 15 мл, оборудованный дозато ром, обеспечивающим получение дозы в 75 мкл при каждом впрыскивании. Каждое впрыскивание содержит 250 мкг активного вещества. Водный раствор дл  инъекций: депсипептид Fusarium eguiseti 100 мг, кремофор EL 0,10 г, хлористый натрий 0,8 г, вода 100 мл. Пример 3- Фармакологическое изучение экстракта депсипептида. Изучение гуморального иммуностимулировани  у мышей по отношению к эритроцитам баранов (GRM). Иммунизаци . Каждой мыши СД швейцарской породы 5 весом 20 г, ввод т пороговую имуннуюдозу в 10 миллионов эритроцитов барана внутривенно. Кровь барана предварительно обрабатывают раствором Эльзевира. Эритроци ты- трижды промывают физиологической сывороткой, а затем перевод т в суспензию в этой же среде дл  проведени прививки. Кажда  группа иммунизированных мышей состоит из 8 особей. Обработкаживотных. В каждом эксперименте имеют одну группу контрольных животных и две

группы животных, прошедших специальную обработку. Мышей подвергают обработке , спуст  различное врем  после иммунизации различными способами: внутривенно или внутрибрюшинно. Культуру псевдодифтерийнрй палочки Согупеbacterium Parvum готов т в виде суспензии в физиологической сыворотке. Депсипептид раствор ют в пропиленгликоле , исход  из концентрации мг/мл, после чего указанный концентрированный раствор разбавл ют физиологической сывороткой в соотношении 1:20 дл  мышей, получавших дозу 50 мкг депсипептида , и в соотношении 1:100 дл  мышей, получавших 10 мкг депсипептида. Вз тие пробы. В определенные дни у мышей берут пробу крови посредством ретроорбитальпункции . Сыворотки хран т при ной дл  предотвращени  разложени . Дл  каждой данной группы исследованных животных изучают характеристики индивидуальных сывороток, а также характеристики объединенной сыворотки.. Анализ антител. Определение степени гемагглютинации . Методика микрогемагглютинации на пластинках. К 0,75 мл суспензии эритроцитов барана, нанесенных на тампон Майера с титром мл (0, им 0,700) добавл ют 0,025 мл сыворотки , разбавленной в отношении 2:2, на том же самом.тампоне. Пластинки оставл ют на 2 ч при комнатной температуре , затем в течение ночи при С, Гемагглютинацию наблюдают при помощи увеличительного зеркала. Степень гемаглютинации определ ют по наибольшему разбавлению сыворотки, при котором наблюдаетс  свободна  гемагглютинаци . Степень определ ют в качестве логарифма при основании 2 от степени разбавлени , так при разбавлении 1, степень гемагглютинации 6. Свободна  гемагглютинаци  может быть сосчитана только при значении степени более или равным 4, при меньших значени х этого показател  счет становитс  слишком затрудненным. Определение показател  гемолиза. Методика микрогемолйза на пластинках . К 0,025 мл суспензии эритроцитов барана на тампоне Майера (10 на мл) добавл ют 0,025 мл эликсина морской свинки Mericux, разбавленHord в соотношении 1/100 на тампоне Майера, и 0,025 мл сыворотки, раз13S бавленной в соотношении 2:2. Пластинки помещают на 1 ч в сушильный шкаф при ЗУС, после этого на 2 ч при С и провод т расчет при помощи оптических приспособлений. Гемолитический показатель определ ют дл  наиболее сильного разбавлени  сыворотки, при котором еще происходит полное растворение осадка эритроцитов крови барана . Этот показатель определ ют таким же способом, что и показатель степени гемагглютинации. Обработка результатов. Вычисл ют средние значени  индивидуальных показателей(± стандартное отклонение), а также показатели объединенной сыворотки дл  каждой группы в зависимости от времени вз ти  пробы . Функциональные изменени  дл  группы, не подвергнутой специальной обработке, определ ют из оценки разности средних показателей и разности показателей по группам. При расчетах используют билатеральное т -распределение Стьюдента или метод х в тех случа х, когда метод Стьюдента не может примен тьс . Изучение пороговых  влений. Изучено большое количество различных доз эритроцитов крови барана дл  нахождени  порогового значени  гуморального ответа у мышей швейцарской породы и дл  обнаружени  сверхпорогового эффекта. 10 эритроцитов дают возможность дл  изучени  кинетики в имевшихс  услови х проведени  эксперимента . Кинетические изучени  ответа у контрольных животных. Изучены несколько групп животных, иммунизированных введением 10 эритроцитов . Показатели гемагглютинации. По вление антител-гемагглютинантов наблюдают у некоторых групп животных на -е сут после иммунизации, э У некоторых только на сут, при этом результаты, имеющие сильный разброс на -е сут, имеют тенденцию к сближению на 11-е сут. Показатели при этом не превышают k.

Показатели гемолиза.

По вление гемолитических антител практически не наблюдаетс  до .сут результаты имеют тенденцию к сближению в более поздней стадии проведени  эксперимента.

Изучение, сравнительного иммуностимул тора .

внедрение меченного предшествующего вещества.

Эталонные услови .

Определение оптимальной дозы митогена производ т из кривых зависит, мостей эффект/доза дл  начала наступлени  платоактивности на этих кривых. Концентрации митогена, при которых достигаетс  наибольший стимулирующий эффект при услови х проведени  испытаний , следующие, мкг/мл: фитогемаглютинин в растворе 100 мкг/мл физиологической сыворотки (ПГА) 1; липопоI Введение культуры Corynebacterium parvum на 3-6-й день иммунизации способствует про влению иммунного эффекта . Изучение предварительной фазы сверхпорогового эффекта (4-е сут) позвол ет обнаружить образование гемолитических и гемагглютинантных антител у животных, подвергавшихс  воздействию стимул тора. Наблюдени  на более поздней стадии ( сут) подтверждают полученные результаты. Разброс результатов объ сн етс  гетерогенностью использованного при опытах швейцарского штамма. Изучение активности предлагаемого депсипептида. Депсипептид, введенный в течение 3 сут, с 3-х по 6-е сутки до проведени  иммунизации, вызывает увеличение количества гемагглютинирующих и гемолитических антител, а также по вление гемолитических антител на Ц-е сутки иммунного испытани , при этом дозы в 10 ив 50 мкг/день на мышь дают аналогичные результаты. Стимулирование , полученное при применении депсипептида в предлагаемых услови х аналогично стимулированию, достигаемому, при применении культуры G. parvum внутрибрюшинно в дозах 500 мкг/день на мышь с точки зрени  кинетики протекани  процесса. При этом сравнимый эффект получают при применении депсипептида в активных дозах, меньших в 10-50 раз. Изучение лимфобласттрансформации. При ТТЛ-дозировании дипсепептида воспроизвод т услови  2j в отношении оптимальной концентрации метогена, при этом испытуемый продукт остаетс  в контакте в течение всего времени превращени , при этом происходит наиболее полное и воспроизводимое внедрение предшествующего вещества, а биологический эффект продукта может быть представлен через ингибирование Э лисахарид культуры Escherichia Со Ii 026 б растворе в концентрации 1 мкг/мл в физиологической сыворотке (ЛПС) 5- Лимфоциты, превращаемый ПГА представл ют собой только клетки Т, а ЛПС концентрируетс  только в клетках В. Кинетические исследовани  позвол ют определить наступление максимальной стимулирующей акти ности ПГА на 66-й ч, а ЛПС на 8-й При указанной дозировке ПГА предста л ет собой лучший митоген, внедрени в этом случае в два раза большее, чем в случае ЛПС, а результаты, пол ченные с его использованием, более воспроизводимы. Из полученных резул татов следует, что экстракт депсипе тида Fusarium eguiseti не  вл етс  митогенным агентом и ингибирует внед рение тритий-замещенного тимидина, вызываемое митогенными агентами. Изучение иммунного эффекта депсипептида . Стимулирующее или тормоз щее воздействие указанного препарата изучено по отношению к гуморальному и клеточному эффекту. Гуморальный эффект изучают при введении ЛПС, который вызывает увеличение клеток в спинномозговом веществе. Клеточный эффект изучают при введении оксазолона . Эффект, вызываемый этим продуктом , сосредоточен преимущественно е клетках. Изучение клеток, продуцирующих антитрла. Количество клеток, продуцирующих антитела,в колонии лимфоцитов, определ ют количественно посредством изу чени  гемолитических пластинок в полужидкой среде, содержащей меченые эритроциты. Эксперимент провод т с использованием пр мых гемолитических пластинок, и отмечаютс  клетки, продуцирующие IQ.M. в чашку Петри, содержащую слой 3 -ного агара, вливают второй агаровый слой (0,6), содержащий 110 лимфоцитов и эритроцитов, объединенных на 30. Полученную среду выдерживают 1 ч при 37 С, после чего в нее добавл ют алексин морских свинок 1/10 и вновь оставл ют на час при 37° С. Изучение гемолитических пластинок провод т с применением бинокул рной лупы и результаты выражают в расчете на 10 лимфоцитов или на орган . Мечеными считаютс  эритроциты крови барана, чувствительные одно16 временно по отношению к оксазалону и к ЛПС. Иммуно-цитохимическое изучение клеточных суспензий, розеток и клеток, продуцирующих антител. Изучение общего лимфоцитоза в лимфатическом узле в селезенке. Дл  авторадиографического изучени  клеточные суспензии выдерживают 30 мин при 37 С с тритий-замещенными тимидином с дозой излучени  20 мкюри/мл, после чего их подвергают обработке дл  определени  поверхностного имуноглобулина . Клетки нанос т на глютаральдегид , обрабатывают диаминобензидином, согласно способу Грэхома и Карновски, (1966), дл  обнаружени  пероксидазы, после чего обрабатывают осмиевой кислотой и заключают в пластмассу (эпон). Результаты. Изучение иммунного ответа с использованием оксазалона. Изучение числа клеток. На 5 день увеличение числа клеток превышает 50%, при этом наиболее важные результаты наблюдают при внутрибрюшинном введении. На 9 день увеличение количества клеток становитс  менее заметным. Количество клеток, содержащих тритий-замещенный тимидин, сравнимо у контрольных животных и у животных, прошедших обработку и составл ет величину пор дка -6 на 100. Изучение числа клеток, узнающих антиген . На 5 день наблюдаетс  очень сильное увеличение числа клеток, узнающих антиген (257 на 100), привод щее-одновременно к увеличению числа клеток в лимфатическом узле и увеличению количества клеток, узнающих антиген, из расчета на 10 клеток. Эти изменени  не наблюдают на 9 день. Изучение количества клеток, образующих гемолитические пластинки. Заметное увеличение числа, клеток, образующих гемолитические пластинки, на 5 день приводит к росту числа клеток , в то врем  как на 9 день увеличиваетс  количество клеток, образующих гемолитические пластинки из расчета на 10 клеток. Изучени.е количеств антител. На 5 день количество антител остаетс  посто нным, однако на 9 день количество гемагглютинантных и гемолитических антител увеличиваетс , в особенности- это касаетс  гемолитических антител. Изучение числа клеток на 1 г поверхности . Количество клеток на 1 г поверхности рассчитывают на полутонких сре зах дл  начальной клеточной суспензии , при этом процентное отношение у контрольных животных и у животных, прошедших обработку, составл ет 35 на 100. Иммуноцитологическое исследование под электронным микроскопом. Природа клеток, образующих розетки и пластинки одна и та же у контрольных животных, и у животных, прошедших обработку. Речь идет о розетках лимфоцитов на 1 г поверхности и клетках Т, которые на дев тый день имеютс  в количестве 0-50 на 100, 8случае гемолитических пластинок речь идет о плазмоцитах. Изучение иммунного ответа на ЛПС. Изучение количества клеток. Отмечают заметное увеличение на 9день в случае депсипептида. Изучение числа клеток, узнающих антиген. Воздействие не наблюдаетс , или ж вызывает уменьшение в том случае, когда результаты рассчитываютс  на 10клеток -или на орган. Указанное уменьшение становитс  особенно замет ным на 9 день. Изучение числа клеток, образующих гемолитические пластинки. Полученные результаты не позвол ю говорить о наличии какого-либо действи  в сторону уменьшени  или увели чени  . Изучение количества антител. Наблюдает.с  тенденци  к уменьшению количества гемагглютинантных ант тел, в то врем  как количество гемолитических антител имеет тенденцию.к заметному увеличению на 5 день. Иммуноцитологическое исследование под электронным микроскопом. . Клетки, образующие розетки, и кле ки, образующие пластинки, как в случае контрольных животных, так и в слу чае животных, прошедших обработку, в основном представл ют собой плазмоци ты. В этом случае наблюдают количест во лимфоцитов на 1 г поверхности (в случае розеток). Среди иммуноцитов н наблюдаетс  Т клеток. Депсипептид действует следующим образом. Ответ на оксазалон стимулируетс . Заметное увеличение числа клеток в лимфатических узлах, достигает максимума на 5 день (50-80 на 100). Количество клеток, узнающих антиген, увеличиваетс  во всех случа х. Увеличение числа антител всегда незначительно , в особенности на 9 день. Ответ на ЛПС может быть скорее тормоз щим. Увеличение числа клеток в селезенке не наблюдаетс , число клеток, узнающих антиген, не измен етс  или же скорее уменьшаетс , изменение числа клеток, образующих пластинки,  вл етс  слишком случайным , а число антител либо уменьшаетс  (гемагглютинантные антитела), либо остаетс  неизменным (гемолитические антитела) . Вли ние депсипептида на имунный ответ. Материал. Депсипептид перевод т в раствор из расчета 100 мкг на 50 мл физиологического раствора дл  тех опытов, где максимальна  концентраци  2 мкг/мл. В случае использовани  больших концентраций примен ют суспензии, полученные перемешиванием 3 ч при комнатной температуре. Животные. Гуморальна  иммунна  способность - мыши-самцы С 57 В 6, лимфобласттрансформаци  - мыши СВА, самцы , активаци  макрофага + крысы ФИШЕР/1 со, самки. Антиген. Очищенный (фракци  по Кону) бычий серумальбумин Армор фармацевтикал Компани (Чикаго). Каждой мыши ввод т 300 мкг этого антигена в задние подошвенные подушечки. Вспомогательные средства. Добавки дл  сравнени  Difco - полна  добавка по Фрейнду, неполна  добавка поФрейнду . Депсипептид примен ют из расчета 10 мкг на мышь дл  испытани  гуморальной иммунной способности, в день О и 5мг на мышь дл  вызывани  иммунизации . Методы. Иммунизаци . День 0. Иммунизаци  20 мышей по 10 мкг/мышь депсипептида. При этом кажда  мышь получает 0,2 мл смеси, состо щей из двух объемов фосфатной выт жки БСА и депсипептида и трех объемов неполного реактива ло Фрейнду.Дес ть мышей получают ту же смесь, но без депсипептида, и дес ть мышей получают антиген с полным реактивом по Фрейнду. День 21. Паловину мышей каждой серии умертвл ют дл  измерени  количест19 ва антител, действующих против БСА посредством пассивной гемагглютинации . Второй половине животных делаю инъекцию дл  вызывани  эффекта в ви половинной от первоначальной дозы (0,1 мл вместо 0,2 мл). День 35. Умертвл ют оставшихс  м шей дл  определени  пассивной гемаг глютинации и определени  таким способом числа антител, специфических отношению к БСА. Исследовани  клеток. Митогенна  способность депсипепти да. 0, селезеночных лимфоцитов мышей СВА в 0,1 мл РПМИ помещают на культуру на 3 дн  при при содержании COg. с различными концентраци ми депсипептида. Группам мышей ввод т ПГА при разбавлении (1/200, Соп А в дозе 10 мкг/мл вЛПС в дозе 100 мкг/мл, 4 ч спуст  после выдержи вани  к каждой культуре добавл ют 1 мкюри тритий-замещенного тимидина В конечной фазе выдерживани  клетки фильтруют через фильтр Whatman GF/C и дважды промывают 10 мл физиологического раствора. Третий-замещенный тимидин, фиксированный на АДН остаетс  на фильтре и изучаетс  его радиоактивность с помощью счетчика fb-излучени . Показатель превращени  определ ют как отношение тимидина, вход щего в присутствии изучаемого соединени , к тимидину, вход щему в лимфоциты в отсутствии какого-либо ми то гена., Макрофагова  стимул ци . Брюшинные макрофаги не стимулированных крыс Фишера, вз тые при промы вании брюшной полости и изолированные на культуре, нанесенной на пласт массу NUNCLON, культивируют в течени ночи совместно с дозами депсипептида лежащими в пределах от 1 пг до 1 нг на 1 мл. Затем определ ют содержание протеинов с выходом лизo-fi-глюкopoни дазы и лейцинаминопептидезы цитоплаз мы в клетках, растворимых в 0,05 Triton Х-100. ЛПС культуры Escherichia и мурамилдипепсид (МДП)  вл етс  сравнительными эталонами. Потенцирующее воздействие на не специфическую клеточную иммунность. Лимфоциты: митогенна  способность В то врем  как по отношению к селезеночным лимфоцитам мышей фитогемагглютинин (ФГА) при обычном разбавлении 1/200, и конкавалин А(КонА при дозе 10 мкг/мл дают показатель 120 превращени  около 50, а ЛПС культуры Escherichia при дозе 100 мкг/мл имеет показатель И,8, предлагаемый депсипептид ингибирует внедрение тритийзамещенного тимидина (что соответствует показателю менее 1,0) при всех испытанных концентраци х (от 0,1 пг до 100 мг/мл). Подобное ингибирование  дерного метаболизма при применении очень малых доз депсипептида служит признаком очень большой активности указанного продукта в механизме, в котором принимают участие уничтоженные клетки или даже по отношению к модификации метаболизма и к клеточной проницаемости . Депсипептид сам по себе не  вл етс  митогеном и этот стимулирующий по отношению к лимфоцитам эффект не может быть предположен на основании представлений о классических митогенах . Активирование макрофагов. Зп V i tro. Энзиматическое дозирование: депси-пептид вызывает значительное увеличение макрофаговой гидролазы при дозе от 1 пг до 10 нг/мл. Выход протеина значительно увеличиваетс  при дозе 10-100 мг/r-tn. Начина  с дозы в 100 нг/мл, депсипептид становитс  токсичным, на что указывает падение выхода протеинов и внутриклеточных экзимов макрофага, наблюдаемое при дозе, равной или превышающей данную концентрацию. On V iVO Депсипептид заметно стимулирует метаболизм макрофагов. on vivo за 6 дней до промывани  брюиины животных делают инъекцию депсипептида при дозе 1-100 мкг внутрибрюшинно , в виде раствора в 1 мл физиологического раствора ЛПС, МДП, ВСА служат эталоном. Клетки, отобранные в результате брюшинного промывани , выдерживают 2ч дл  удалени  несросшихс  клеток, а попул цию сросшихс  клеток, состо щую на 30% из макрофага, дополнительно культивируютс  еще ч. При этом клетки раствор ют и определ ют выход протеинов и энзимов при дозах, приведенных дл  изучени  in vitro. Dn vivo энзиматическое дозирование: при дозе 1 мкг депсипептид вызывает увеличение лизоэнзимов (при испытани х на р-глюкуронидазе +35%) и цитоплазмическое (так. дл  лейцин-аминопептидазы +35), а также увеличение выхода протеинов (), что помещает этот продукт за ЛПС и ВСА по интенсивности стимулировани . ВСА в этой же дозе вызывает увеличение гидролазы на 39, а ЛПС увеличение на 42% лейцина-аминопептидазы и на 35 протеинов.

При дозе в 100 мкг депсипептид вызывает наиболее сильное увеличение

протеинов (+32) и энзимов цитоплазмы (+59) из четырех испытанных иммуностимул торов . В отношении увеличени  гидролазы депсипептид стоит в этом р ду за ВСА (+37%)

В табл. i представлено увеличение выхода протеинов и энзимов в брюшинных макрофагах при стимулировании in vivo за 6 сут.

В табл. 2 представлен внутримакрофаговый выход энзимов и протеинов после инкубации с различными иммуностимул торами в течение 16 ч. Протеины , мкг/10 клеток, глюкуронидаза нМ гидролизованного субстрата(1 (гкл./ч)

23 Примечание. Степени значимости:

Увеличение выпадени  хрома, вводимого личинками Shistosofna mansoni, при применении различных иммуЭ + Э

Таблица 2

ностимул торов макрофагов по сравнению с кестимулированными макрофагами . ар 0,05; Ьр 0,025; Ср {: 0,001; NS - незначимо Цитотоксическа  способность: депсипептид исследован в отношении его воздействи  in vivo на цитотоксичность брюшинных макрофагов крыс в отношении личинок Shistosoma mansoni. Клетки, стимулированные in vitro или in vivo, помещают вместе с личинками Shistosoma mansoni мечеными хромом-5 дл  обнаружени  возможной цитотоксиВещества

Депсипептид +0,5(незначительно) ЛПС

МДПВСА

Депсипептид вызывает лишь незначительное увеличение выпадени  хрома-51 ,  вл ющегос  радиактивной меткой дл  шистосомул, в той же степени, что и МДП, в то врем  как ЛПС и ВСА дают макрофаги, значительно более токсичные по отношению к личинкам, по сравнению с- макрофагами животных, которые существуют только в физиологическом растворе. Таким образом, дeпcипептид не обладает воздействием in vivo на макрофаги,если испытани  провод тс  по отношению к шистосомам, меченым хромом-51. 19,67.13,1 I8,21t3,9 2i, 2,k Изучение вли ни  циклодепсипептида на врем  выживани  мышей, зараженных 55 лейкемией Л1210. Циклодепсипептид представл ет Собой иммуностимул тор in vivo по от+15 (незначительно) +10(незначительно)

(р 0,005) +10 (незначительно)

льно) +30% (р 0,025)

Питотоксическа  способность. Только ЛПС Е.соП, кроме депсипептида, не вызывает in vitro значительного увеличени  цитотоксичности макрофагов по отношению к шистосомулам, меченым хромом-51. Стимулирующие дозы депсипептида вызывают только небольшое увеличение содержани  радиоактивной метки.

Общее количество хрома, обнаруженное в шистосомулах, инкубированных в течение 16 ч с нормальными стимулированными в течение 2 ч макрофагами , и с различными дозами депсипептида представлены в табл. i.

Claims (1)

1. За вка Франции № 2269965,3. Матэ и др. Jmmunotherapie аскл . А 61 К 35/7, 1976.tive des cancers, 1976, ESF - Париж.