CA1117882A - Procede d'obtention d'un nouveau produit biologique et le produit en resultant - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet une nouvelle substance de structure depsipeptidique extraite du mycélium d'un fusarium equiseti. Cette substance est obtenue par épuisement à l'aide d'un solvant chloré du mycélium de fusarium equiseti et purification par les méthodes usuelles de la biochimie. Ladite substance possède des propriétés pharmacologiques intéressantes. Elle manifeste notamment des propriétés immunomodulatrices qui la rendent apte à être utilisée en thérapeutique humaine ou animale, comme médicament anti-microbien et anti-viral.

Description

~7~

La présente invention a pour objet un nouveau produit biologique extrait d'une culture de champignons.

La présente invention a plus particulièrement pour objet une substance biolo~ique obtenue à partir de cultures de fusarium, son procedé d'obtention et les compositions pharmaceutiques qui en contiennent .

La présente invention a spécifiquement pour objet une substance de nature peptldolique obtenue par extraction de mycélium de fusarium equiseti. Elle est formée d'un melange de composants de structure très voisine, de nature depsipeptidique dont l'hydro-lyse en milieu acide libère un seul acide alcool, l'acide ~-hydroxy isovalérique, et des acides -amines spécifiques, la N-methyl valine, la N-methyl isoleu~ine et la N-methyl allo isoleucine.

Le pourcentage des differents constituants dénommés A, B, C et D a ete determine après separation en chromatographie en phase liquide haute pression (HPLC) en phase inverse et mesure au moyen d'un integrateur.

Les pourcentages respectifs des differents constituants ont ete evalues par rapport à la somme des surfaces des pics des 4 composes en fonction de leur adoption residuelle en VV à 254 nm.

Les pourcentages respectifs des differents constituants peptidoliques peuvent varier sensiblement et s'echelonnent entre Composant A 2 - 5%
Composant B 10 - 16%
Composant C 32 - 3~%
Composant D 40 - 47%

.
.

z Le composant A fournit par hydrolyse partielle en milieu alcalin 3 molécules d'une lactone, résultant de la coupure des liaisons esters et recyclisation en lactone de a-hydroxy isovalé-royl N-méthyl valine.

Par hydrolyse complète en milieu acide il se produit une coupure des ~onctions esters et des fo~lctions amides. Il en résul-te l'obtentioll de 3 molécures de N-méthyl valine et de 3 molécules d'acide a-hydroxy isovalérique.

Le composé B fournit par hydrolyse partielle en milieu alcalin 2 molécules de lactone resultant de la cyclisation de ~ -hydro-xy isovaléroyl N méthyl valine et 1 molécule de la lactone formée par cyclisation de la a-hydroxy isovaléroyl N-méthyl isoleucine ou allo-isoleucine.

Par hydrolyse complète en milieu acide du composant B on obtient 3 molécules d'acide a -hydroxy isovaleri~ue, 2 molécules de N-méthyl valine et 1 molécule de N-méthyl isoleucine ou de N-méthyl ~ -allo-isoleucine.

Le composant C fournit dans des conditions alcalines 1 molecule de la lactone formee par cyclisation de la a-hydroxy iso-valeroyl N-méthyl valine et 2 molécules de la lactone formée par cyclisation de la a-hydroxy isovaléroyl N-méthyl isoleucine ou N-méthyl allo-isoleucine.

Par hydrolyse complète en milieu acide on obtient trois molécules d'acide a-hydroxy isovalérique, une molécule de N-méthyl valine et deux molécules de N-m~thyl isoleucine ou N-méthyl allo-isoleucine.

~ .

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:
' ' ' .. : . , Le composant D fournit par hydrolyse partielle en milieu alcalin 3 molécules de la lactone formée par cyclisation de a-hydroxy isovaleroyl N-méthyl isoleucine ou N-méthyl allo-isoleu-cine.

Par hydrolyse complète en milieu acide le composant D
fournit 3 molécules d'acide ~-hydroxy isovalérique et 3 molëcules de N-méthyl isoleucine ou de N-méthyl allo-isoleucine.

.En conclusion après hydrolyse totale de la substance biologique, ob~et de l'invention, on obtient de l'acide ~-hydroxy .isovalér-.que, de la N-méthyl valine, de la N-méthyl isoleucine (forme érythro) et de la N-methyl allo-isoleucine (forme thréo) la __ .
N-méthyl allo-isoleucine n'a pas encore pu être attribuée à l'un des composants en particulier.

La substance pepti.dolique,objet de l'invention, est obte- .
15 nue par un procédé caractérisé en ce que l'on soumet à une fermen- ~
tation aérobie un ~usarium equiseti en cuve profonde, dans des con- -ditions de temperature, d'agitation et de durée définies, recueille le mycélium en fin de fermentation, l'épuise par un solvant chloré, sépare la phase organique que l'on amène à sec, reprend le résidu par un hydrocarbure liquide, effectue une extraction de la phase hydrocarbonée à contre-courant par un alcanol aqueux, puis la phase alcanolique est séparée, concentrée,d'où la substance peptidolique précipite et on la purifie par les méthodes physiques usuelles.

Le procédé selon l'invention peut être defini par les modes opératoires suivants, actuellement preferes:

- le fusarium equiseti responsable de la production de la substance peptidolique est la souche de Fusarium equiseti ~Corda) ~ ,, - -'' '' ' , ~
. ' 1~7~

Saccardo, deposée au Commonwealth Mycological Institute a Kew (Surrey) Grande-Bretagne sous le n 213 107.
- la fermentation aérobie est effectuee en 3 etapes à un pH compris entre 5 et 6 et pendant une duree comprise entre 36 et 48 h pour chaque stade.
- llextraction du mycelium est e~fectuee par le trichlo-rethylène.
- l'hydrocarbure liquide est le pentane ou llhexane.
- llalcanol aqueux est un melange de methanol et dleau.
- la purification de la substance peptidolique est effec-tuee par chromatographie sur colonne dlalumine.

La substance peptidolique selon llinvention est douee de proprietés pharmacologiques interessantes. Elle est douee de pro-prietes immunomodulatrices importantes attestee par une reponse à
llhypersensibilite à la 4-ethoxymethylene 2-phenyloxazolone ou aux lipopolysaccharides dlEscherichia Coli. La substance peptidolique selon l'invention provoque l'activation des macrophages par une mo-dification des activites enzymatiques et du contenu proteique total des cellules. Elle possède en outre une action anti-exsudative et une action anti-oedematieuse.

La substance peptidolique a ete essayee en comparaison avec le muramyl dipeptide et les lipopolysaccharides d'Escherichia Coli - son activite activante slest averee au moins egale a celle de ces deux substances de réference.

Elle peut donc trouver un emploi en therapeutique humai-ne ou animale comme stimulant des defenses de l'organisme notamment pour le traitement des affections de l'arbre respiratoire, en tant ~.
., .

.

~ . . .

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~3l31 ~8~2 .

qu'agent anti-microbien ou anti-viral.

~ cette fin, la substance peptidolique selon l'invention sera employee sous forme de compositions pharmaceutiques renfermant comme principe actif ladite substance en association avec un exci-pient inerte, non toxique, adapt~ pour l'usage thérapeutique.

Parmi les compositions pharmaceutiques on citera plus particulièrement celles qui conviennent poux l'administration parenté-ral~, permuqueuse, percutanée ou rectale.

Parmi les formes pharmaceutiques plus particulièrement preferées, on pourra citer les solutés ou suspentions injectables, les comprimés sublinguaux, les préparations destinées à être appli- -quees sur les muqueuses, pressurisees ou non, les solutions dans un solvant polaire pour l'usage percutané ou les suppositoires.

La posologie peut varier dans des proportions importan-tes en fonction de l'indication therapeutique, de la voie d'adminis-tration, du poids et de l'âge du patient.

D'une maniere preferée la posologie unitaire s'echelon-nera entre 0,05 et 1 mg et la posologie journaliere entre 0,2 et 5 mg.

On pourra egalement avoir recours à des administrations repetees (deux a quatre consecutivement) suivies ensuite par un re-pos de plusieurs semaines.

Les formes pharmaceutiques selon l'invention pourront en outre renfermer d'autres principes actifs d'action similaire ou sy-nergistique, des agents diluants, des parfums, des pxoduits .~

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~i~'7B~Z
.

aromatisants, des agents tensioactifs ou émulsionnants, des ayents edulcorants et des agents propulsants.

Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont obtenues selon ].es procedés usuels de la pharmacotechnie.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans toute-fois la limiter.

EXEMPLE I

A) Identification de la souche . . . _ , La souche responsable de la production de la substance biologique de nature peptidolique selon l'invention a été identi-fiée comme etant un Fusarium equiseti (Corda) Sacc., déposée au Commonwealth Mycological Institute à Kew (Surrey) G.B., sous le n 213 107.

- Milieux de cultures et développement myc~lien Pour l'identification de cette souche, il a été néces-saire de recourir aux techniques suivantes:

a) mllieu de fermentation n 1 - 25 g de saccharose - 25 g de glucose massé a.a.
- 10 g de nitrate d'ammonium

- 2,5 g de sulfate de magnésium - 5 g de phosphate monopotassique.

Le pH est ajusté à 5 apres la stérilisation.

Ce milieu de fermentation donne naissanFe a un mycélium . ~ .. . .

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très compact, laineux, présentant en surface une coloration oran-gée. Au revers de la culture sur boîte de Petri, le thalle pre-sente une coloration jaune orangée r plus connue sous le nom de co-loration peche virant a l'ocre orangé dans les cultures agées.

On peut noter dans les cultures gelosées la diffusion ~'un pigment jaurle.

b) culture sur Corn-steep atomisé 2%, agarisé 2~

Le mycélium se développe en donnant un thalle relative-ment ras, laineux, présentant des zonations typiques concentriques.

La pigmentation reste faible, le revers prend avec l'age une coloration jaune sombre.

c) culture sur CMC (CAPPELLINI-PETERSON, 1965) - 15 g carboxyméthylcellulose - 1 g nitrate d'ammonium - 1 g phosphate monopotassique ~ -- 0,5 g sulfate de magnésium - 1 g extrait de levure - 1 1. eau distillée Ce milieu peut être complété par addition de fragments de feuilles sèches de phragmites com_unls.

Le mycélium reste rare, très ras, presque imperceptible, sans pigmentation.

- Action de la_lumière sur la sporulation du_champignon '~' Parmi les trois milieux précités, en lumière blanche ~ , -.

produite par des tubes fluorescents blanc brillant de luxe d'envi-ron 1000 lux, sous un rythme de 12 heures par jour, on constate la formation de macroconidies, uniquement sur le milieu à la base de CMC et sur milieu completé par des fellilles de phragmites.

S Pour des cultures realisées sur les m8mes milieux, eclai-r~es en lumière de Wood (longueur d'onde max. 360,365 m~), placees à
33 cm de la source lumineuse, en boites de Petri, on obtient des ma-croconidi.es en tres grande quantité dans un délai de ~ ~ 6 jours.

La pigmentation des milieux après culture en lumière de Wood est légèrement attënuée par rapport à celle obtenue sur les cultures effectuees en lumière blanche.

- Aspect du champignon sur divers milieux classi~ues Le fus ~ n 213 107 a éte également cultive sur les milieux classiques utilises pour la culture du genre fusarium. Les résultats suivants ont ete obtenus:

- sur milieu contenant 40 g/l de farine d'avoine;
- sur milieu à base de pomme de terre (50 g de pul-pe de pomme de terre, 10 g de glucose et 20 g de gelose par litre d'eau);
- sur milieu malt-agar 2%, agarisé à 2%.

Sur ces milieux, la conidiogénèse ne se produit que très .

rarement avec production de conidies anormales pouvant induire en erreur, par confusion de macroconidies avortées avec des microco-nidies.

On peut cependant noter certains aspects typigues, .

.

~7~

notamment 1'apparition d'un pigment reparti selon des zonations con-centriques, notamment sur le milieu à base de pomme de terre, aussi bien en cultures eclairees qu'en c~tures effectuees à l'obscurite.

La culture sur avoine fournit des thalles myceliens com-pacts, ras, hetérogènes, peu pigmentés. I.a conidiogenèse est prati-quement absente.

Cl~RACTERES MORP~IOLOGIQUES DU FUSARIUM

a) absence de microconidies;
b) presence de macroconidies presentant de 3 à
107 septa portes par des macroconidiophores rami-fies;
c) presence de chlamydospores intercalaires, iso-lees ou en cha~nes.

- Caractères des macroconidies 15Les macronidies presentent un aspect falciforme relati-vement allonge; la cellule terminale est en forme de bec effile, les cellules intermediaires sont un peu plus larges, la cellule basale est en forme de pied. Les dimensions très variables selon les conditions de culture, s'echelonnent entre 25 ~ et 60 ~ de lon-gueur sur 3 a 6 ~ de lar~eur.

La coloration des conidies est hyaline - les septa sont toujours visibles.

Sur des cultures jeunes les septations sont toujours nettes - la septation la plus fré~uente est de l'ordre de 4.

Les microconidiophores difficilement visibles, n'appa-ra ssent que rarement. Ils présentent des ramifications en forme de pinceau.

- Caractères _ _hlamydospores Les chlamydospores intercalaires solitaires ou en chaî-nes sont globuleuses avec une paroi épaissie. Leurs dimensions sont de 7 à 9 ~ de diamètre. Elles se forment dans les cultures agees, ayant plus de 20 jours.

Llensemble des caractères morphologiques des macroconi-dies, l'absence de chlamydospores terminales et la présence de chlamydospores intercalaixes conduit à llidentification du fusarlum comme un fusarium de la section gibbosum.

Parmi les trois espèces répertoriées dans cette section, seule llespèce equiseti répond à cet ensemble de caractères morpho-logiques. La présence dlune coloration peche de la culture et la forme allongée de la cellule basale en forme de pied confirment cette identification.

B) Préparation des pieds de cuve 1. Gélose inclinée ' On reprend le contenu d'une ampoule de myc~lium lyophi-lisé par 2 ml d'eau stérile. On utilise la suspension obtenue pour ensemencer 4 tubes contenant 10 ml de milieu gélosé incliné de com-position suivante:
Flocons d'avoine 30 g 25 Glucose massé 10 g ~ .

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.

~7~3~2 Agar 20 g Eau distillée Q.s.p. 1000 ml Stérilisation 20 mn à 120C
pH spontané 6,6 pH apres st~rilisation 5,8 On laisse incuber pendant 6 ~ 8 jours en etuve thermoré-gulee a 28C, puis on laisse en exposition a la lumière solaire pendant une semaine au laboratoire ~ temperature ordinaire.

2. Fiole de Roux On reprend le mycélium aérien d'un tube de gélose incli-née par 10 ml d'eau sterile~ On utilise la suspension obtenue pour ensemencer 5 fioles de Roux contenant 200 ml de milieu gélosé de composition identique a celle decrite ci-dessus. On laisse incuber pendant 6 a 8 jours en étuve thermorégulée a 28C, puis on laisse en exposition a la lumière solaire pendant une semaine au labora-toire dans les memes conditions.

C) Préparation des inoculums -1. ler stade A partir d'une fiole de Roux, on prépare une suspension du myc~lium dans l'eau sterile (100 ml), par grattage de toute la surface. On utilise cette suspension pour ensemencer un ballon contenant 4 1 du milieu suivant:
Saccharose 25,0 g/l Glucose masse 25,0 g/l Nitrate d'ammonium 10,0 g/l -., . ~ . . :
, . . ~
.
:' : . ': . -Phosphate monopotassique 5,0 g/l Sulfate de magnésium 2,5 g/l Eau de ville ~.s.p. l,0 l Sté.rilisation 30' ~ 120C
~ pH spontan~ 5,45 pEI apr~s st~rilisation 4,75 L'incubation aérobie se fait à 28C, en enceinte ther-morégulée sous barbotage d'air stérile, assurant l'agitation pen-dant un minimum de 48 h (moyenne: 72 h).

2. 2e stade L'ensemencement (5,3%) de ce fermenteur se fait à partir d'un ballon de 4 l (ler stade) sur 75 l de milieu de composition suivante:
Saccharose 40 g/l ~ Célérose 5 g/l Nitrate d'ammonium lO g/l Phosphate monopotassique 5 g/l Sulfate de magnésium 2,5 g/1 ~ ~ .

Eau de ville Q.s.p. l,0 l Stérilisation 30' à 120C .
pH apr~s stérilisation S,6 Conditions de fermentation:
~éxation 3,5 m3jh Agitation 70 t/mn Température 29C ~ 1 ~ Durée 36 h .

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~l~3;7i~

Pendant la fermentation, des contrôles de sterilite, me-sure de pH, examens microscopiques et dosages des sucres réducteurs sont effectues sur prelevements stériles.

3. 3e stade On utilise l'inoculum du 2e stade pour ensemencer 1200 1 cle milieu de meme composition que ci-dessus ~ensemencement: 6,25%).

Collditions de fermentation:
A~ration 70 m3/h Agitation 50 t/mn Temperature 29C ~ 1 Durée de 36 à 40 h Pendant la fermentation on procède aux memes controles que ceux effectués sur le stade précédent.

D) Production On transf~re les 1200 1 d'inoculum 3e stade pour ense- -mencer le fermenteur de production contenant 7 m3 de milieu de com-position suivante: .
Saccharose 50,0 g/1 Célerose 5,0 g/l Nitrate d'ammonium 10,0 g/l Phosphate monopotassique 5,0 g/l Sulfate de magnésium 2,5 g/l Sulfate de zinc 0,04 g/l Carbonate de calcium 2,0 g/l Eau de ville Q.s.p. 1~0 1 ' , ,, - :
.,: . . .

~ ~:17~

Sterilisation 30' à 120C
pH après sterilisation 6,5 Conditions de fermentation:
Aeration 250 m3/h Agitation 20 t/mn Temperature 29C ~ 1 Durée environ 40 h Pendant la fermentation on procède aux memes contrôles que ceux effectues sur les stades précédents.

Le pH,voisin 3 a la 24e heure, remonte lentement pour se stabiliser à 5,3 - 5,5 en fin de fermentation.

On sépare le mycélium du moût de fermentation par fil-tration sur ~iltre presse, puis on le s~che en étuve ventilee. On obtient en moyenne 120 kg de mycélium sec apras broyage.

E) Extraction 1. Extraction du produit brut a) Pour 100 kg de mycélium On reprend le mycélium broyé par 400 1 de trichloréthy-lène. On agite 2 h, on essore. On lave le gâteau par 100 1 de 20 trichloréthylène. On procède à une 2e extraction par 300 1 de tri-chloréthylène sous agitation pendant 1 h, puis on essore. On lave le gâteau par 100 1 de trichloréthylène~ On reunit les extraits et on concentre, sous pression reduite, jusqu'~ obtention d'une pâte epaisse.

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8~Z

b) Pour 10 kg de "pâte" obtenue en l.a) On dissout dans 90 1 d'hexane. On clarifie par filtra-tion. On contrextrait la solution hexanique par du méthanol aqueux: methanol: 80 - eau: 20 (V/V): le extrac-tion par 50 1, 2e extractioll par 25 1, 3e extraction par 12,51, 4e ex-traction par 10 1. On reunit les extralts methanoliques et sous pression rédui-te Oll concentre ~ siccit~.

2. Chromatographie sur colonne d'alumine "acide"

a) Pre~aration de l'alumine __ :
On met en suspension 1 kg d'alumine dans 5 1 d'eau dis-tillée. Sous agitation douce on ajoute de l'acide chlorhydrique concentré, en quantité suffisante, pour maintenir le pH a 4,0 cons-tant pendant au moins 24 h. On filtre sur toile de nylon puis on lave abondamment a l'eau distillée. On lave a l'acétone pour éli-miner l'eau puis on s8che l'alimine dans une étuve a + 200C pen-dant une nuit.

b~ Chromat graphie Pour 20 kg d'extrait méthanolique _ _ . . _ . . _ . _ On dissout l'extrait methanolique dans 80 1 de chlorure de methylène. On clarifie la solution par filtration. On chroma-tographie la solution chloromethylenique sur 40 kg d'alumine char-gee sous chlorure de methylene en colonne de verre (H: 0,8 m) en respectant un debit horaire de 15 1. On lave l'alumine, sans modi-fication du debit horaire, par 80 1 de chlorure de methylène.

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z 3. solément du princi e actif Sous pression reduite on concentre les effluents chloro-methyleniques jusqu'à consistance pâteuse. On dissout la "pâ-te"
dans 200 1 d'ethanol. On c:larifie par filtration. On refroidit la solution ethylique à t 4C puis on~coule~ sous agitation lente, en 8 h, en maintenant la temp~rature à ~ 4C, 400 1 d'eau distillee.
On maintient 50US a~itation, pendant 20 h, a ~ 4C. On isole les cristaux par filtration. On :Lave le gâteau par 20 1 du melange ethanol: 1 - eau: 2, prealablement refroidi puis par 50 1 d'eau distillee. On seche le depsipeptide cristallise en etuve, sous pression reduite, ~ 40C jusqu'à poids constant.

Le depsipeptide se presente sous forme d'une poudre cristalline blanche ou très faiblement jaune pratiquement sans odeur et de saveur amère. Elle est très peu soluble dans l'eau, facilement soluble dans le chloroforme, le methanol et l'ethanol à
95o~

Son point de fusion determine au banc Kofler sur le pro-duit anhydre est de 121 + 5, son pouvoir rotatoire specifique est de [a~ = -80 + 5 (C = 5% methanol) La teneur en azote total est de 6,2 + 0,3%.

Identifi_ation des composants par_chromatographie sur couche mince - Préparation du_support Pour 5 plaques de chromatographie de 20 cm x 20 cm, ~', ,~

, :

- ', homogenéiser au ~ixer 4 g de cel]ulose Mn 300, 8 g de cellulose Mn 300 G et 65 ml d'eau. Etaler la suspension sur des plaques de ver-re parfaitement dégraissees en couches de 0,25 mm d'épaisseur.
~Laisser secher à l'air puis 2 h à 110. Après refroidissement, plonger verticalement la plaque dans Ull melange ~ormamide-acetone (1~4) jusqu'~ environ 2 cm d~l bord. Laisser secher a l'air libre pelldant ulle minute environ pour ~liminer l'acétone.

- 5Olvant de migration Heptane sature de formamide.
Cuve sursaturée.

- Solution Preparer une solution à 10 mg/ml de substa~ce dans le methanol.

- Depôt Deposer en un trait de 1 cm, 10 ~1 de la solution~ sur la partie de la plaque qui n'a pas éte impregnée de formamide.

- Rev _ation Après développement sur environ 10 cm, secher la plaque a 100 pendant 1 h, pulvériser une solution chloroformique d'iode a 0,5%. On doit observer quatre taches jaunes dont deux importantes de Rf voisin de 0,55 e-t 0,45, une moins intense de Rf voisin de 0,35 et une tres faible de Rf voisin de 0,3.

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8~

Séparat.ion des composants du depsipeptide_en chromato-graphie en phase liquide haute pression (HPLC) Les pourcentages respectifs des composés A, B, C, D ont été déterminés sur des echantillons de fabrication différente, 5 apres séparation en HPLC, en phase inverse, et mesurés au moyen d'un intégrateur.

Les pourcentages respectifs ont été calculés par rapport à la somme des surfaces des pics des quatre composés, en supposant que, l'absorption résiduelle en V.V. à 254 nm était la meme pour t 10 tous.

- Conditions operatoir_ Support:
Phase inverse ~ Bonsapak C18 (Waters Associates) Longueur 30 cm Diametre interne 3,9 mm Solvant d'élution:
Méthanol 8 v Eau 2 v Débit:
1,5 ml/mn Solutions:
10 mg/ml dans le méthanol Injection 10 ~1 Détection:
U.V. à 254 nm ~!

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' ' ' ' ~ : : ' ` ' ~ ' ' " ' ' :: " ' ~7~2 , .

Sensibilite:
Do = 0,02 pleine échelle Mesure des surfaces:
Intégrateur ICAP 5 ~ Resultats Les résultats correspondent a la moyenne des valeurs ob- -tenues sur différents échantillons de la substance depsipeptidique.
Composé A 3,9%
Composé B 15,3~
Composé C 38,1%
Composé D 42,7%
100%

Le produit est conforme aux spectres infra-rouges illus-trés dans les figures 1 et 2.

EXEMPLE II

Compositions pharmaceutiques à base de depsipeptide se-lon l'invention: :

a) Solution pressurisée dans le myristate d'isopropyle.
Depsipeptide extrait de 20fusarium equiseti 0,OS0 g Essence de néroli 0,050 g Eucalyptol 0,050 g:
Saccharine 0,00125 g ~ Myristate d'isopropyle qsp 2,5 ml 25~ Flugène 12 7,5 ml -'.

, ~ ~. . I ' ' .' ' ~L7P~8Z
, . . .

b) Suspension aqueuse Depsipeptide extrait de fusarium equiseti 0,050 g ~ Monooléate de poly-oxyethylane sorbitane vendu sous la mar-que "Tween 80" 0,010 g Chlorure de sodium 0,180 g Essence de néroli 0,050 g ~ Eucalyptol 0,050 g ~ Saccharinate de sodium 0,010 g ~ Eau distillee Q.s.p. 20 ml Dans les deux cas le produit est distribue à l'aide d'une pompe doseuse dont la capacite est de 0,080 g par dose soit 200 ~g de principe actif par dose liberee.

c) Solution pressurisee Depsipeptide extrait de fusarium equiseti 0,015 g Agent aromatisant 0,0075 g Myristate d'isopropyle qsp 0,75 ml Fréon 12 2,25 ml Ce flacon est muni d'une valve de 25 ~1 et contient 3 ml de solute. La dose de depsipeptide delivree a chaque pulverisation est de 125 ~g environ.

d) Solution pressurisee Depsipeptide extrait de fusarium equiseti 0,030 g ~, ~
.

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.

~ ~7~3~32 Agent aromatisant 0,015 g Myristate d'isopropyle 0,750 ml Fréon 12 2,25 ml Cette ~ormule permet de délivrer 250 ~g de depsipeptide par dose et correspond ~ 120 pulv~risations.

e) Solution huileuse . Depsipeptide extrait de fusarium equiseti 0,05 g Saccharine 0,0015 g Agent aromatisant 0,05 g Myristate d'isopropyle qsp 6 ml Le flacon est pourvu d'une pompe delivrant 30 ~1 à cha-que pression.

. f) Suspension aqueuse Depsipeptide extrait de fusarium equiseti 50 mg ~ . .
Monooléate de poly-oxyéthylène sorbitane 15 mg Chlorure de sodium 120 mg Phosphate disodique 17,25 mg Phosphate dipotassique 3 mg Chlorure de calcium 1,5 mg :~
Chlorure de magnésium 1,5 mg Mercuri thiolate sodique 0,0375 mg Eau qsp 15 ml -' ~ 21 - ~
~,.

. , . . , .. . . ~ .
. , , , ', . . . ' - . : : . ~

~1'788;2 , Cette suspension est conditionnée en flacon de 15 ml muni d'une pompe délivrant 75 ~1 à chaque pulvérisation.

Chaque pulverisation correspond donc à 250 ~g de princi-pe actif.

g) Solution aqueuse injectable Depsipeptide de fusarium equiseti lO0 mg Crémophor EL 0,10 g Chlorure de sodium 0,8 y Eau qsp 100 ml EXEMPLE III

Etude pharmacologique du depsipeptide extrait de fusa-rium equiseti.

A) Etude de l'immunostimulation humorale chez la souris lS sen~slbilisee contre les globules rouges de mouton (GRM) Protocole opératoi_e Animaux , Souris CD Swiss ~ pesant 20 g environ.

Immunisation Chaque souris re,coit une dose seuil immunisante de 10 millions de globules rouges de mouton par voie intraveineuse. Le sang de mouton est au préalable recueilli sur solution d'Alsever.
Les globules rouges sont laves 3 fois avec du serum physiologique, puis mis en suspension dans ce milieu pour l'inoculation. Chaque : ~

. . , .

:

série immunisee comporte 8 souris.

Traitement des animaux Chaque expérience comporte:
- une s~rie d'animaux témoins, - des séries d'animaux trait~s.

Les souris sont trait~es à des intervalles de temps va-riables précedant l'immunisation et par voie I.V. ou I.P., selon le protocole de l'expérimentation.

La suspension de cultures de corynebactérium parvum est réalisée dans du sérum physiologique.

Le depsipeptide est dissout dans le propylène glycol a raison de 84 mg/ml puis cette solution concentrée est elle-même di-luée en serum physiologique (dilution au 1/20 pour les souris rece-vant 50 ~g de depsipeptide et dilution au 1/100 pour celles rece-vant 10 ~g de depsipeptide).

Prélevement Les souris sont prélevees, aux jours indiqués, par ponc-tion rétro-orbitaire. ~ -Les sérums sont stockés à -80, non decomplémentés.
Pour chaque série étudiée, les sérums sont testés individuellement, ainsi qu'un pool de sérums. ~ ~
:
Dosage des anticorps ~ -a) Determination du titre h~magglutinant Technique des microhémagglutinations sur plaque:

:. ' . ; '. ~

:

~7~Z

0,05 ml d'une suspension de globules rouges de mouton en tampon de Mayer titrant 7.107 ml (~0 540 m~ _ 0,700) sont ajou-tés à 0,025 ml de sérum dilué de 2 en 2 dans ce même tampon. Les plaques sont placées 2 heures ~ température ambiante, puis une nuit à ~ 4. Les hemagglutinations sont lues a l'aide d'un miroir gros-sissant.

Le titre hémagglutinant est déterminé par la plus forte dilution du sérum donnant une hémagglutinatlon franche. Il est ex-primé par l'exposant Log 2 de cette dilution (dilution l/64, ti-tre = 6).

Les hémagglutinations franches ne sont comptées qu'a partir du titre 4, les valeurs inférieures etant généralement de lecture plus difficile.

b) Détermination du titre hémolytique Technique de microhémolyse sur plaque:

0,025 ml d'une suspension de globules rouges de mouton en tampon de Mayer (108/ml) sont ajoutés à 0,025 ml de complément de cobaye Mérieux dilué au 1/100 dans le tampon de Mayer et à 0,025 ml de sérum dilué de 2 en 2.

Les plaques sont deposées 1 h a l'étuve a 37, puis 2 h a ~4. On effectue la lecture au dispositif optique.
`
Le titre hémolytique est donné par la plus forte dilu-tion de sérum entraînant la lyse complete du culot de globules rou-ges de mouton.

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.

Il est exprimé de la même fa~on que le titre hémagglu-tinant.

Expression des rés~lltats La ~noyenne des titres individuels (+ écart-type), ainsi que le titre du pool de serums de chaque série,sont evalues aux diff~rents temps de pr~lèvement. Pour chaque serie traitee, la va-riation en fonction de la serie non traitee est etablie en évaluant la difference des titres moyens et celle des titres des pools. La signification est recherch~e par le test "t" de Student bilatéral et le test de x2 lorsque le precedent n'etait pas applicable.

Resultats 1. Etude de la reponse seuil Plusieurs doses de globules rouges de mouton ont ete es- :
sayees afin de situer le seuil de la reponse humorale des souris Swiss et d'obtenir une réponse supraliminaire. En e~fet, la repon-se maximale obtenue avec 108 globules rouges/souris n'est pas am-plifiable par les immunostimulants, de meme 106 globules rouges ne determinent aucune reponse humorale decelable dans nos conditions :~
experimentales. 107 de globules xouges par souris a donne une ci- -netique exploitable dans ces experiences.

Des varia~ions de seuil ont eté rencontrees sans que l'on sache s'il faut les imputer ~ la maintenance des animaux ou aux conditions saisonnières.

. - 25 ~. . . , ,, -.
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7~

2. Etude cinéti~ue de la reponse des animaux temoins Plusieurs series témoins immunisees par 107 globules rouges/souris ont ete etudiees dans cette expérimentation et nous permettent de d~gager les points suivants:

S a) Titres hema~lutinants -- Apparition d'anticorps hemagglutinants dès le 4e jour suivant l'immunisation ~our certaines series et seulement au 7e jour pour d'autres;

- Résultats disperses au 4e jour, tendant a se tasser à
partir du lle jour;

- Titres en genéral inférieurs à 4.

b) Titres hémolytiques . .

- Pas d'anticorps hémolytiques pratiquement decelables avant le 7e jour;

- Tassement des resultats dans la phase tardive de la re-ponse.

3. Etude d'une substance immunostimulante de reference-1'extrait dë corynebacterium parvum .

Les travaux de Biozzi et Coll ont montre que le c. pa ~ m stimule la réponse immunitairer etant injecté 3 à 6 jours avant l'immunisation. Ce phenomène se retrouve sur le taux des anticorps hemagglutinants et hemolytiques et la precocité de leur apparition.

L'etude de la phase precoce de la réponse supraliminair~ -, . .. .
, .

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~7~3~2 . .

(4e jour) permet de déceler l'induction d'anticorps hémolytiques et hemagglutinants chez les animaux stimulés. L'exploration de la phase plus tardive (14 j) confirme le résultat; sa signification statistique est sup~rieure. L'hétérog~néité de la souche Swiss utilisee pe~lt expliquer la dlspersion des résultats; Biozzi et Coll ont pu noteL~ des r~sultats analogues et isoler à l'intérieur de ce-~te même souche des lignees de réactivité differente vis-à-vis des globules rouges de mouton.

4. E ude de l'activité du depsipeptide selon l'invention Le depsipeptide administré 3 jours, entre le 6e et le ~-3e jour précédant l'immunisation, entraine une élévation du taux des anticorps hémagglutinants et hémolytiques, ainsi que l'induc-tion d'anticorps hémolytiques des le 4e jour de la réponse immuni-taire - 10 et 50 ~g/j. par souris de depsipeptide font apparaltre un résultat ~nalogue. Cela est vraisemblablement en rapport avec la solubilisation difficile du produit en milieu aqueux et/ou la diffusion à partir du point d'injection. Les stimulations obtenues avec le depsipeptide dans ces conditions ~xpérimentales sont analo-gues à celles obtPnues avec 500 ~g/j/souris de c. parvum (IP) d'un point de vue cinétique. Les effets résultant dans ce test sont comparables pour des doses actives 10 à 50 fois inférieures pour le depsipeptide.

B) Test de transformation lymphoblastique Des considérations d'ordre immunolo~ique et technologique ont amené à adopter le test de transformation lymphoblastique comme ~X

méthode d'étude quantitative de l'activité immonostimulante du depsipeptide.

Pour le dosage par TTL du depsipeptide on se place dans des conditions analoques ~ celles décrites par ~.P. Danicle et

5 S.K. Holian Proc~ed. Natl~ ~cad. Sci. tU-S-A-) 73 (1976) 3599, à
concentration opt,imale de mitog~ne, le produit à tester restant en contact durant toute la transformation; dans ces conditions l'in-corporation du précurseur est très reproductible et maximale, l'ef-fet biologique du produit se manifeste par une inhibition de l'in-corporation du précurseur marqué, ETALONNAGE_DU SYSTEME

La détermination de la dose optimale de mitogène est faite sur les courbes effet-dose en prenant le début du plateau d'activité.

~es concentrations de mitoge~ne donnant une stimulation optimale dans les conditions du test sont les suivantes: P.H.A.
1 ~g/ml; L.P.S. = 5 ~g/ml.

On considère alors les lymphocytes transformés par la P.H.A. sont essentiellement des cellules "T". Le LoP.S, ne concer-nerait que les cellules "B".

D'autre part, une étude cinétique du test a permis de déterminer l'activité stimulante maximale de la P.H.A. à la 6~e heure et celle du L.P.S. a la 48e heure.

Le P.H.A. pour ce dosage est le meilleur mitogene, l'in-corporation qu'il induit est deux fois supérieure à celle du L.P.S., :, - : , .:, :
:. - : : .

~7~3~2 " . i les resultats qu'il permet d T obtenir sont plus reproductibles.

On peut conclure des resultats que le depsipeptide ex-trait de fusarium equiseti n'est pas un agent mitogène et inhibe l'incorporation de thymidine tritiée induite par les agents mito-gènes.

(L'abréviation PH signifie phytohémagglutinine en solu-tion a 100 Y/ml dans le sérum physiologique. LPS signifie lipo-polysaccharide d'Escherichia Coli 026B6W solution à 1 mg/ml dans le serum physiologique.) C) Etude du depsipeptide de fusarium_equiseti sur la répon- ~ -se immunitaire ~
.

L'action stimulatriceou fre~atrice de cette substance a été étudiée sur la reponse humorale d'une part et la réponse cellu-laire d'autre part.

La réponse humorale a été testée par administration de lipopolysaccharide (LPS). VUJANOVIC (1973) et LE BOUTEILLER ~1974) ont en effet montré que le LPS augmentait le nombre de cellules d'aspect médullaire.

La réponse cellulaire a été testée par administration d'oxazolone, TURK (1967) et ANDERSON (1972) ayant montré que la ré-ponse à ce produit concernait préférentiellement les cellules.

Les caracteres immunocytologiques et ultrastructuraux des cellules concernées ont été étudiés selon JEANNESSON (1975).

:

a) Etudes des cellules productrices d'anticorps Le nombre des cellules productrices d'anticorps dans la population lymphocytaire est d~termine quantitativement par le test des plages d'hémolyse dans un milieu semi-solide contenant les glo-bules rouges cibles. L'essai réalisé concerne les plages d'hémoly-se directes (méthodes de JER~E et NORDIN, 1963) détectant les cel-lules produisant les IgM.

Dans une boîte de Pétri contenant une couche d'agarose à
3~ est versée une seconde couche d'agarose à 0,6% contenant 1. 106 l~nphocytes et des globules ~ 30~ couplés. Le tout est incube 1 h a 37C. On ajoute ensuite du complément de cobaye au 1/10 et on laisse a nouveau 1 h à 37C. La lecture des plages d'hémolyse est faite sous la loupe binoculaire et leur nombre est exprimé par 106 lymphocytes et par organe. Les globules rouges cibles sont des globules rouges de mouton sensibles à la fois pour l'OXAZOLONE et le LPS. Ils ont été couplés selon les techniques de ]a littérature. ~-b) Etude immunocytochimique des suspensions cellulai-res, des rosettes et des cellules produ rices d antlcorps 1. Etude de la population lymphocytaire totale du ganglion ou de la rate ~~~

- mar~uage des_~ymphocytes en voie de division en vue de l'étude auto-radiographique, les suspensions cellulaires sont incubées a 37C avec de la thymidine tritiée fi la dose de 20~ Ci~ml pend~nt 30 minutes avant d'etre traitées pour la détection des im-munoglobulines de surface.
Les cellules sont fixées à la glutaraldéhyde, traitées -.

~7~

a la diaminobenzidine selon la methode de GRAHAM et KARNOVSKY,(1966) pour revéler la peroxydase, post-fixees à l'acide osmique et incluses dans l'E.P.O.N.

~ESULTATS

a) Etude de la réponse immunitaire a l'oxazolone . . _ .

1. Etude sur le_nombre de cel~ules Au 5e jour, l'augmentation du nombre de cellules est toujours superieur a 50 pour cent, les resultats les plus impor-tants etant observes par administration I.P.

Au 9e jour, l'augmentation est moins importante et meme semble pratiquement terminee.

Le nombre des cellules ayant incorporé la thymidine tri-tiée es-t comparable chez les temoins et les animaux traités. Il est de l'ordre de 4 à 6 p. 100.

2. Etude sur le nombre de cellules reconnaissant 1 antigène Au 5e jour, la tres forte élevation du taux des cellules reconnaissant l'antigene (257 p. 1003 resulte a la fois de l'aug~

mentation du nombre de cellules dans le ganglion et de l'augmenta-tion du taux de cellules reconnaissant l'antigène calculé pour 106 cellules. Aucune de ces modifications ne se retrouve au ge ~our.

3. Etude sur le nombre de cellules formant plages dlhe~molyse L'importante augmentation des cellules formant plages , . T ' ~

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~1~7~Z
`:

dlhemolyse au 5e jour resulte de l'augmentation du nombre de cel-lules tandis qu'au 9e jour,il s'ag.it de l'elevation du taux des cellules formant plages d'hemolyse pour 106 cellules.

~. Etude sur le taux d'anticorps , ~

~u 5e jour, les taux d'anticorps restent constants mais AU 9e jour le~ taux d'anticorps hemagglutinants et hymolysants aug-mentent, surtout pour les anticorps hemolysants.

5. Etude sur 1e nombre de cellules à I~ de surface Les cellules à Ig de surface ont ete comptées sur les coupes semi fines en provenance de la suspension cellulaire initia-le. Chez les temoins et les traites le pourcentage est de 35 p. 100.

6. Etude immunocytologique au microscope electronl-que La nature des cellules faisant rosettes et faisant pla- -ges est la meme chez les temoins et les traites. Il s'agi-t pour les rosettes de lymphocytes à Ig de surface et de cellules T qui atteignent 40 a 50 p. 100 au 9e jour. Pour les plages d'hemolyse il s'agit surtout de plasmocytes.

b) Etude de la reponse immunitaire au LPS
~.:
1. Etude sur le nombre de cellules La seule augmentation sensible se situe au 9e jour pour le depsipeptide.

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~7~3~2 ,. . .

2. Etude sur le nombre de~_cellules reconnalssant L'action est nulle ou se traduit par une diminution que les résultats soient exprimes en nombre par 106 cellules ou par organe. Cette climinution est surtout sensible au 9e jour.

3. Etude sur le nom~bre de cellules_formant plages d'hemolyse ~~ ~ ~ ~~

Les résultats ne permettent pas de conclure à une action dans un sens d'elévation ou de diminution.

4. Etude _ur le taux d'anticorps On observe une tendance à la diminution du taux des an-ticorps hémagglutinants tandis que les taux des anticorps hemoly-sants sont en augmentation notable au Se jour.

5. Et de immunocytologl~ue au micros~ope electro-Les cellules formant rosettes et celles formant plages, aussi bien pour les animaux temoins que pour les traités,sont sur- -tout des plasmocytes. Dans le cas des rosettes, des lymphocytes à
Ig de surface sont observés. Parmi ces immunocytes, aucune cellule T n'est rencontrée.

Conclusion L'action du depsipeptide peut se resumer ainsi:

~ La reponse a l'oxazolone apparait stimulée. L'afflux des cellules au niveau du glanglion est important et maximum au 5e jour (50 à 80 p. 100). Le nombre des cellules reconnaissant ,, ' ~7~

l'antigene est toujours augmenté, soit comme consequence du nombre élevé de cellules, soit par augmentation de la valeur absolue tan-dis que l'augmentation du nombre des cellules faisant plages ne re-flete que l'afflux des cellules au n.iveau du ganglion; le tau~
d'anticorps est toujours faiblement augmenté et seulement au 9e ur .

- La réponse au L~S semhle plutot freinee. Il n'y a pas d'afflux cellulaire au niveau de la rate; le nombre des cellules reconnaissant l'antigene n'est pas modifié ou bien il est diminue;
les variations du taux de cellules faisant plages sont trop alea-toires pour être consid~rees et les taux d'anticorps sont dans l'ensemble reduits (anticorps h~magglutinants) ou non modifies (anticorps hemolysants).
D) Action du depsipeptide sur_la réponse immunitaire I - Action potentialisante sur l'immunit~ humorale~
1. Matériel a) le depsipeptide selon l'invention est mis en solution à raison de 100 ~g dans 50 ml d'eau physiologique pour les ~ .
experiences où la concentration maximum demandee est de 2 ~g/ml.
Pour les concentrations supérieures,des suspensions, agitées pen-dant 3 h a temperature ambiante, ont ete utilisees.

b) Animaux immunite humorale: souris C 57 B 6 mâles transformation lymphoblast~ souris CBA mâles activation des macrophaqes: rats FISCHER/Ico femelles ~` ' ` ': ' ~ ~
::
:

7~

c) A ~ ene: sérumalbumine bovine (BSA) puri-fiée (fraction V de Cohn) de l'ARMOUR PHARMACEUTICAL COMPANY (Chi-cago). Chaque souris reçoit 300 ~g de cet antigène dans les cous-sinets plantaires post~rieurs.

d) ~ s:
Adjuvants de référence (DIFC0):
- adjuvant complet de Freund - adjuvant incomplet de Freund Dipeptide à raison de lO ~g par souris pour les tests d'immunité humorale au jour 0 et 5 ~g par souris pour le rappel d'immunisation.

2. Méthodes a) munisation J 0: immunisation de 20 souris 10 ~g/souris de depsipep-tide. Chaque souris reçoit 0,2 ml d'un mélange de 2 volumes de tampon phosphate contenant la BSA et le depsipeptide et de 3 volu-mes d'adjuvant incomplet de Freund. Dix souris temoins reçoivent le même mélange mais sans depsipeptide, et dix souris recoivent l'antigène avec de l'adjuvant complet de Freund.
J 21: la moitié des souris de chaque série est sacrifiee , pour la mesure du taux d'anticorps anti-B.S.A. par hémagglutination passive. La deuxieme moitie reçoit une injection de rappel avec la moitié de la dose initiale (0,1 ml au lieu de 0,2 ml).
J 35: sacrifice des souris et test d'hémagglutination passive pour le taux en anticorps spécifiques de la B.S.A.

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:. . .

~7~
., b) Tests cellulaires - pouvoir mitoqène du de~sipeptide: 0,5 x 106 lymphocy-tes spléniques de souris CBA dans 0,1 ml de ~PMI sont mis en cul-ture a 37C pendant 3 jours sous 5% de CO2 avec diverses concen-trations de clepsipeptide. Les lots témoins rec,oivent de la PHA di-lu~e au 1/200, de la ConA ~ 10 ~g/ml et du L.P.S. à 100 ~g/ml.

4 heures avant Ja ~in de l'incubation, on ajoute a chaque culture 1 ~Ci de th~midine tritiee. ~ la fin de la phase d'incubation, les cellules sont ~iltrees sur filtre Whatman GF/C et lav~es deux fois avec 10 ml d'eau physiologique. La thymidine tri-tiee fixee dans l'A.D.N. et retenue sur le filtre est comptée dans un compteur béta. L'indice de transfromation est exprimé comme le rapport de la thymidine incorporee en presence de la substance etu-diee sur la thymidine incorporee par les lymphocytes sans aucun mi-togène.

- stimulation macrophagique . in vitro: les macrophages péritoneaux de rats Fischer non stimules, preleves par lavage péritonéal et isolément sur support de culture en plastique (NUNCLON), ont été cultives ~0 pendant une nuit avec des doses de depsipeptide allant de 1 pico-gramme a 1 nanogramme par ml. Puis le contenu proteique les taux en ~-glucuronidase lysosomale et leucineaminopeptidase cytoplasmi~
que ont ete evalues sur les cellules lysees au triton X-100 (0,0S%). Le L.P.S. d'Escherichia et le muramyl dipeptide ont cons-2S titue les substances-temoins.

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' ' , ' , .

8~

II - Action potentialisatrice sur l'immunite cellulaire non-speclfiq--ue-1. Lymphoc~ pouvoir mitogène Alors que sur de~ lymphocytes spleniques de souris, la phytoh~magglutinine (PHA), ~ la dilution usuelle au 1/200, et laconcanavaline A (Con~) ~ 10 ~g/ml donnent toutes deux un indice de transformation voisin de 50, et le L.P.S. d'E. Coli à 100 ~g/ml un indice de 14,8; le depsipeptide a present~ une inhibi~'on de l'in-corporat.ion de la thymidine tritriée (indice inferieur de 1,0) pour toutes .I.es concentxations testées (depuis 0,1 picogramme jusqu'à
100 ~g/ml).

Pouvoir mitogène de depsipeptide par rapport aux _itogènes classi~
ques su.r des lymphocytes spl niaues de souris: indice d'incorvora-tion de la thymidine tritriee .
0,1 pg/ml = 0,41 (+0,1) p = 0,0047 1pg/ml = 0,62 (+0,07) p = 0,044 5pg/ml = 0,84 (+0,06) Non s.ignificatif 10pg/ml = 0,90 (+0,06) Non significatif 110pg/ml = 0,32 (+0,12) p = 0,0078 1ng/ml = 0,40 (+0,10) p = 0,0082 ::
10ng/ml - 0,56 (+0,08) Non significatif 100ng/ml = 0,62 (+0,07) Non signification p = 0,054 1~g/ml _ 0,36 (+0,1) p = 0,0044 10~g/ml = 0,63 (+0,07) p = 0,028 100~g/ml = 0,80 ('0,06) Non significatif PHA1/200 51,15 (+0,006) p = 0,0028 ConA10 ~g = 50,30 (+0,006) p = 0,0025 LPS100 ~g = 14,81 (+0,012) p = 0,0028 . .

.

, Cette inhibition de métabolisme nucléique à des doses tres faibles de depsipep-tide est le signe d'une très forte activite de ce produit par un mécanisme ou pourraient intervenir des cellu-les suppressives ou bien une modification du métabolisme et de la perméabilite cellulaire. Le depsipeptide en tant que tel n'est pas mitogene, ce qui ne prejuge en rien d'un éventuel pouvoir stimulant pour les lymphocytes vis-à-vis des mitogènes classiques.

2. Activation des macrophages ~ ln vltro dosages enzymatiques: le depsipeptide entralne une aug-mentation significative des hydrolases macrophagiques entre 1 pg et 10 ng/ml. Le taux protéique est significativement accru avec 10 et 100 pg/ml. A partir de 100 ng/ml, le depsipeptide se revèle toxi-que, comme le montre la chute des taux proteique et enzymatique in-tracellulaires des macrophages exposes au~ doses égales ou supé-rieures à cette concentration.

in vivo le depsipeptide stimule donc fortement le metabolisme des macrophages.

in v_vo: 6 jours avant le lavage peritonéal, les animaux re~oivent une injection intrapéritonéale de 1 ou 100 ~g de depsi-peptide, sous un volume d'un ml d'eau physiologique. Le L.P.S., le M.D.P. et le W.S.A. servent de substances témoins. Les cellules recupérées à l'occasion du lavage peritoneal sont incubées 2 heures pour l'élimination des cellules non-adhérentes, et la population adhérente, constituée a 90% de macrophages, es-t cultivée 4 heures .
.

.

supplémentaixes. Les cellules sont alors lysees et les taux pro-téique et enzymatique, dosés comme ci-dessus pour les tests in vitro.

in vlvo dosa~es_ellzymatiques: à la dose de 1 ~g, le depsipeptide pr~sente une inflation des enzymes lysosomales (testées par la ~ -glucuronidase ~ 35%) et cytoplasmique (telle que la leucine aminopeptidase: ~ 35~) aussi bien que du taux en proteines (+ 24~), plaçant ce produit pour l'lntensité de la stimulation, derrière le L.P.S. et le W.S.A. En effet, ~ cette dose le W.S.A. présente une augmentation de 39% des hydrolases, et le L.P.S. un accroissement de 42% de la leucine aminopeptidase et de 35~ des protéines.

En revanche, à la dose de 100 ~g, le depsipeptide en-traîne la plus forte inflation des protéines (+ 32%) et des enzymes cytoplasmiques (+ 59%) des 4 immunostimulants testes. Il vient derrière le W.S.A. pour les hydrolydases (~ 37~).

Le depsipeptide a egalement eté testé à la dose de 1 ng, mais les autres stimulants n'ont pas éte utilisés à cette concen-tration. La stimulation est plus réduite (protéines: ~ 11%;
~-glucuronidase: ~ 23% leucine aminopeptidase ~ 16~).

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~ ~7~

Pourcentaqe d'auqmentation des taux protei ue et enzYmati ue dans TABLEAU I
I . _ .. _ ....
1 ~g p 100 llg P
.... _ ~ ~ . .. _ ._ Proteines ~ 24% 0,0125 + 32% 0,005 D~psipeptid~ ~-glucuronidase ~ 35% O,025 ~ 37% O,025 L.A.P. t 35,5% 0,025 + 59% 0,0025 tleucine amino-peptidase) _ _ _ Protéines + 35% 0,01 + 14% 0,025 L.P.S. ~-glucuronidase - 14% 0,025 - 3% N.S.
_ _ _ L.A.P. ~ 42% 0,001 ~ 2~ N.S.

Proteines + 7,5% N.S. + 2% N.S.
M.D.P. ~-glucuronidase ~ 27% 0,01 * 5% N.S.
L.A.P. + 24% 0,025 t 5% N.S.
.__ .. _ ... . _.
W.S.A. Protéines ~ 3,6% N.S. ~ 1% N.S.
(Water soluble ~-glucuronidase ~ 39% O,001 ~ 46% O,001 adjuvent) L.A.P. - 10,5% 0,025 - 7% N.S.
.. . ___ . _ ' ' ~ ", '' , , ' , ' ' , :
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. .

Taux en~natique et proteique intra-macrophage apres 16 h d'incu-bation avec divers immunostimulants. Les proteines sont expri-mees en ~/106 cellules et la glucuronidase en nm de substrat hy-~ e/106 cellules/heure TABLEAU II
. . Lipopoly- Mhlramyl-Depslpeptlde saccharide dipeptlde _ .. ~ .. ___ _ ~phy- Prot.eines 45,7 ~ 0,1 46,0 + 1,1 46,0 + 1,1 siologic~ue ~_glUcuroni~ase 29,5 1 0,1 29,1 ~ 2,2 29,1 + 2,2 ~ _ Protéines 44t9--~ 4,2 NS 55,1 + 2,2b 46,1 i 2,2 NS
1 pg/ml ~-glucuronidase 35,8 + l,gc 39,2 + 1,5b 36,5 ~ 0,1b . _ _ _____ . . . . .. __ ... __ 10 pg~l Proteines 53,3 + 4,3b 47,7 + 2,2 NS 44,8 + 0,7 NS
~-glucuronidase 35,4 + 4~gc 37,1 ~ 5,8a 36,3 + 6,4 NS
~ . ..... . __ 10~ pg/ml Proteines 50,1 + 4,2b 52,2 + 6,3 NS 44,S + 1,9 NS~ gluc~ronidase 33,0 + 2,4c 38,7 + 9,9 NS 41,0 + 2,9b . . _-- .__ 151 na/~l Proteines 48,2 + 4,3 NS 45,0 + 0,4 NS 44,0 + 1,8 NS t ~-glucuronidase 34,2 + 3,7c 21,0 ~ 0,5a 34,0 + 5,3 NS
.
10 ng/ml Prote.ines 45,9 + 1,4 NS 47,1 + 0,4 NS 43,4 + 1,8 NS
~-glucuronidase 32,8 + 5,6b 25,2 + 6,6 NS 39,6 + 6,1a . . ...................... . _ 100 ng/ml Proteines 44,3 + 4,0 NS 52,3 _ 0,4b 40,5 _ 0,7b ~-glucuronidase 29,8 - 8,8 NS 34,9 _ 3,4a 23,9 _ 6,2 NS
_. _ ...... __ _ _ 1 ng/ml Proteines 44,2 - 5,9 NS 46,5 + 1,3 NS 45,1 _ 0,9 NS
~-glucuronidase 27,1 _ 0,3c 26,0 _ 2,1 NS 30,6 _ 3,8 NS
. . . __ __ _ ....... .. _ . . ._ 10 ng/ml Prot~ines 41,9 - 7,Qb 43,7 _ 2,5 NS 48,1 + 1,8 NS
~-glucuronidase 25,2 - 9,3~ 23,4 _ 1,7c 32,2 + 3,0 NS
25100 ng/ml Proteines 36,6 _ 5,6c 41,2 _ 3,8b 55,3 _ 3,1b ~-glucuronidase 7,5 _ 3~sc 11,6 _ 2,4c 39,0 _ 1,6c Degré de sign _icativite a p < 0,05 c p ~ 0,001 b p < 0,025 NS = Non significatif ~ . .
.:
:

~ ugmentation du relarqaqe de chrome induit chez _ _ _ _ des larves de schlstosoma mansoni ~ar divers immu-nostimulants de macro~_~ges par rapport a des ma-_ophages non stlmul~s Pouvolr _~y~ _ OXlq~: le depsipeptide a été étudié pour son action in vivo sur la cytotoxicite induite chez des macrophages péritonéaux de rat a l'egard de larves de schistosoma mansoni.

Les cellules stimulées in vitro ou ln vivo sont mises en présence de larves de schistosoma~m~nsonl, marquées au chrome 51 pour réveler un éventuel pouvoir cytotoxique, mesuré par la quan-tite de chrome relargué dans un milieu de culture, en conséquence de lesions cellulairas a la surface des schistosomules~ La radio-activite libéree dans le milieu est exprimée en pourcentage de la radioactivita totale présente dans les schistosomules au début de l'expérience.

Rësultats __ _ TABLEAU III
. .. . . :~:
Substances 1 ng 1 ~g 100 ~g . _ _ _ .

Depsipeptide ~ 0,5% NS ~ 13% NS ~ 10% NS
. _ __ . ... _ _ _ . ~
L.P.S. _ ~ 24% p < 0,025 ~ 50% p < 0,005 . . ._ . . __ M.D.P. _ ~ 6% NS ~ 10% NS ~ ~
.. ___~ _ . .. ~ _ W.S.A. _ _ _ _ 23~o p < 0,025 30~o P ~ 0,025 ,:. . . . , . - . . ..
.. - . - ~ ., ~ ~ . - .. . - .: -~ . :

, ~ : ' ' ' . '. :

Le depsipeptide entraîne une augmentation NON SIGNIFI-CATIVE du relarguage du chrome 51, radiomarqueur des schistosomu-les au même titre que le M.D.P., alors que le L.P.S. et le W.S.A.
rendent les macrophages significativement plus toxiques pour les :Larves que ne le sont les macrophages d'animaux ne recevant que de l'eau physiologique.

Le depsipeptide n'a donc pas d'action in vivo sur les macrophages, lorsqu'on les essaye vis-à-vis des schistosomules ~ u chrome 51.

Pouvoir cytotoxiq~e: cependant, pas plus le depsipep-tide que le L.P.S. d'E.Coli n'induisent in vitro d'augmentation significative de la cytotoxicité des macrophages à l'égard des schistosomules marqués au chrome 51. Les doses "stimulantes" de depsipeptide entraînent une légère baisse du relargage du marqueur radioactif.

Pourcentage du chrome total, relargué par des schistosomules incu-bés pendant 16 heures, avec des macrophages normaux stimulés pen-dans 24 heures avec diverses doses de depsipeptide TABLEAU IV

~ Eau physiologique j 100 ~ 1 ng/ml ~ 10 ng/ml ~ 100 ng/ml 24,03% 19,67% 18,21% 21,71% 23,46%
+ 2,4 i 3,1 _ ' + 3,5 + 2,7 ' , .
.. , ' ~ ' ' . '.

.

7~

E) Etude de l'action du cyclodepsipeptide sur le temps de survie de souris poxtant la leucemie L1210 Le cyclodepsipeptide selon l'invention se comporte comme un ~ostimulant "in vivo" et agit au niveau des macrophages, comme fait le BCG. I1 a paru intéressant d'étudier comparativement ces deux substances. On a utilise comme modele la souris portan-t la leuc~mie L1210, et prétraitee par la cyclophosphamide afin de pou-voir apprécier l'action de ces deux produits sur la maladie rési-duelle.

Matériel et méthodes ..... . . _ _ Les animaux utilises sont des souris BDF, âgées d'envi-ron 7 a 8 semaines (CSEAL-Orléans).

Les animaux sont traités selon le protocole décrit par MATHE et coll. Immunothérapie active des cancers 1976 (ESF-Paris).

Au jour 0, tous les animaux reçoivent une injection IV
de 103 cellules leucémiques L1210 vivantes. Au jour 1, les animaux sont répartis en 4 lots de 10 animaux de poids homogène. Les sou-ris d'un lot "contrôle" reçoivent une injection IP de sérum physio-logique, alors que les 3 autres lots reçoivent une injection IP de cyclophosphamide à la dose suboptimale de 80 mg/kg. Ces animaux, injectés par le cyclophosphamide, seront ensuite traités de la ma-niere suivante.

Au jour ~ 6, les animaux d'un lot cyclophosphamide re-- çoivent une injection IV de 0,1 ml de sérum physiologique. Ils serviront à la mesure de la survie des souris traitées par cyclo-phosphamide. Les animaux d'un lot "BCG" reçoivent une injection IV

' ~ ` ' ` . ,' ', ~': ' , ' ' ' . ~ , , '- . '' :.

~7~
,, de 1 mg/souris de BCG de l'Institut Pasteur sous un volume de 0,1 ml. Ils serviront de contrôle de l'immunotherapie active après l'administration cyclophosphamide, le BCG s'étant révëlé actif dans ces conditions.

Les animaux d'un lot traite par le depsipeptide re~oi-vent une injection IP de 50 ~g/souris de depsipeptide sous un volu-me de 0,5 mlO Xls serviront a la mesure de la survie des souris traitées par le produit à tester.

Dans chaque cas, et pour chaque lot, on observe la sur-vie chaque jour pendant 40 jours. L'influence du produit sur la survie est estimée statistiquement par le test de "T" de Student en comparant chaque lot traité à son contrôle, et éventuellement, les lots traités entre eux.

Résultats Les résultats sont présentés sur le tableau V. Le cyclophosphamide, à dose suboptimale, prolonge de maniere signifi~
cative la survie des animaux lorsqu'on la compare ~ la survie des lots contrôles non traités. La combinaison cyclophosphamide-BCG
n'améliore la survie des animaux que de manière non significative statistiquement, alors que la combinaison cyclophosphamide-depsipeptide provoque une amélioration statistiquement significa-tive du temps de survie des animaux traités. Cependant, aucune différence significative ne peut être mise en évidence entre les deux types de combinaisons thérapeutiques cyclophosphamide-BCG et cyclophosphamide-depsipeptide.

- ~5 -.
.

, S~Z

Conclusion Cette expérience montre que le depsipeptide selon l'in-vention augmente la survie des souris ayant reçu au préalable 103 cellules L1210 vivantes et ayant ete traitees par le cyclophospha-mide. Les resultats ohtenus sont du même ordre que ceux obtenusavec le BCG, cependant, il faut remarquer que l'étude a été effec-tuée sur des lots de 10 animaux seulement, ce qui ne permet pas d'~tablir une différenciation reellement significative sur le plan de l'analyse statistique.

T EAU
_ . ___ .. . _ Lots Tr~tement Nombre~s de survie en jours d anlmaux(moyenne ~ E.S.) : .. __ . __ . ~ ._ ___ _ :;

A Controle L1210 10 12,50 + 0,16 ... _ _ ... _ B Cyclophosphamide 10 19,50 + 2,58 _ _ _ ___ ~ __ ~ 15 C Cyclophosphamide 10 24,90 + 3,58 . . _ _.. __ ~ ~ ~ .~ 10 29,70 + 3,77 La signification de la difference entre les différents lots est étudiée par le test de "t" de Student:
Lot A - Lot b = p ~ 0,02 Lot B - Lot C = NS

Lot B - Lot D ~ p < 0,05 Lot C - Lot D ~ NS

..

' :, , 1. ' ,, ~.: , ' ~ -' ' ' F) F.ffet du depsipeptide sur la proliferation des lymphocytes e des macropha~es On utilise la méthode décrite par J.W. Hadden and Cowork pour mettre en evidence par des essais in vitro la prolifération des lymphocytes sous l'in~luence de mitog~nes T, la proliferation des macrophages induite par la lymphokine et l'activation des ma-crophages dans leur capacite de detruire les cellules de listeria monoc~togènes.

Dans ce test, on utilise des lymphocytes humains retires du sang peripherique. On determine la proliferation des lymphocy-tes sous l'influence de la phytohemagglutinine par la mesure de l'incorporation de la thymidine tritiee. Le depsipeptide de fusa-rium equiseti a ete etudie en presence de quantités suboptimales, optimales et supraoptimales de phytohemagglutinine, soit 0,001, 0,01 et 0,1 unites/ml respectivement.

La proliferation des lymphocytes induite parla lympho-kine-(MMF) a ete determinee par mesure de l'incorporation de thy-midine tritiée après 3 et 5 jours de culture.

L'activation de l'aptitude des macrophages a lyser les cellules de listéria, induite par la lymphokine-(~AF) apres 5 jours de culture en presence de MAF ou en 1'absence de MAF a été mise en évidence pendant une période de contact de 6 heures (Hadden Immu-nopharmacology p. 279-313 (1977)).

Le degre de pha~ocytose est ~uantifie apr8s mise en con-tact de 20 mn avec des cellules de listeria monocytogenes. On de-nombre les macrophages contenant des bacteries et le nombre de .

,' ~7`~2 bactéries par cellule de macrophage.

L'activite bactericide des macrophages est évaluee en determinant le nombre de cellules ren~ermant des bactéries et le nombre de bactéries par cellule 6 heures après la mise en contact de 20 mn.

Le depsipeptide selon l'invention a été expérimenté à
des doses s'echelonnant de 5,10-~ à 5 ~g. On constate que pour la plage s'échelonnant de 5,10 4 a 0,5 ~g le depsipeptide augmente l'incorporation de thymidine tritiée dans les leucocytes stimules, soit par une dose optimale de phytohemagglutinine, soit par une dose suboptimale de phytohémagglutinine.

Les doses plus elevées au contraire diminuent d'une ma-nière très importante l'incorporation de thymidine tritiée mettant en évidence l'action cytostatique du produit.

Un effet similaire se manifeste avec des cellules leu-cemiques humaines et avec les macrophages actives par une dose optimale de MMF.

G) Determination de la toxicite aiguë
, ~ ' La dose léthale moyenne du depsipeptide selon l'inven-tion a éte determinee sur des lots de lO souris de souche CD hete-roxeniques ou sur des lots de rats de souche Wistar recevant le produit à essayer soit en suspension dans un solvant aqueux soit en solution dans le myristate d'isopropyle.

Le produit est administré soit par voie buccale, soit par voie intraperitoneale, soi~ par voie intraveineuse à doses croissantes. Les animaux sont gardés en observation pendant 8 jours et les morts, s'il y en a, sont dénombrés.

La dose léthale moyenne est déterminée graphiquement par la méthode de LichtEield et Wilcoxon.

S Les résultats suivants ont été obtenus:

a) Suspension aqueuse chez la souris per os DL50 = 5000 mg/kg par voie intrapériton ale DL50 = 67 mg/kg par voie intraveineuse DL50 = 17 mg/kg 10 chez le rat per os DL50 =5000 mg/kg par voie intrapéritonéale DL50 = 67 mg/kg par voie intraveineuse DLso = 11 mg/kg b) En solution dans le m~ristrate d'isopropyle . _ Chez la souris par voie intrapéritonéale:
- souris mâle DL50 = = 169 mg/k~
- souris femelle DL50 = = 182 mg/kg ; par voie intraveineuse:

- souris mâle DL50 = 41 mg/kg - souris femelle DL50 = 41 mg/kg Les phenomènes toxiques résultant de liadministration intrapéritoneale ou intraveineuse semblent dus en grande partie à
l'etat physique des particules en suspension dans le vehicule ; aqueux. En solution dans le myristate d'isopropyle, le cyclodepsi-peptide manifeste une toxicite sensiblement atténuée.

~, .
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Claims (3)

Les réalisations de l'invention pour lesquelles un droit exclusif de propriété ou de privilége est revendiqué, sont définis comme suit:

1. Un procédé de préparation d'une substance biologique de nature peptidolique libérant par hydrolyse acide de la N - méthyl valine, de la N-méthyl isoleucine et de la N-méthyl allo isoleucine, caracterisé en ce qu'on soumet une culture de Fusarium equiseti à une fermentation aérobie en cuve profonde, recueille le. mycelium en fin de fermentation, l'épuise par un solvant chloré organique, sépare la solution organique que l'on amène à sec, reprend le résidu par un solvant hydrocarboné, extrait la solution hydrocarbonée par un alcanol aqueux puis sépare et purifie l'extrait alcanolique par les méthodes usuelles de la biochimie.

2. Un procédé selon la revendication 1 caracterisé en ce que la souche soumise à la fermentation est le Fusarium equiseti (Corda) saccardo, déposé au Commonwealth Mycological Institut sous le N° 213.107.

3. Une substance biologique formée d'un mélange de quatres composants peptidoliques dont les proportions varient de 2 à 5%
pour le composant A, de 10 à 16% pour le composant B, de 32 à 39%
pour le composant C et de 40 à 47% pour le composant D, chaque fois qu'elle est obtenue par les procédés des revendications 1 ou 2 ou par un procédé équivalent