DD140046A5 - Verfahren zur herstellung einer biologischen substanz - Google Patents

Description

-Α Verfahren zur Gewinnung einer biologischen Substanz Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer biologischen Substanz, deren Grundstruktur die eines Depsipeptids ist und das in der Medizin als Stimulans der Abwehrreaktionen des Organismus eingesetzt werden kann·

Bekannte technische Lösungen ·

Es ist bekannt, daß Muramyldipeptid und Lipopolysaccharide von Escherichia CoIi eine aktivierende Wirkung aufweisen.

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, den Stand der Technik durch weitere biologische Substanzen entsprechender Wirkungsrichtung und mindestens gleicher Wirksamkeit zu bereichern.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, auf biochemischem Wege aus Pusariumkulturen eine Substanz mit einer Depsipeptid-Grundstruktur herzustellen.

Berlin, den 9·'3· 1979 AP-O. 07 C/209 387

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Erfindungsgemäß hergestellt wird eine Substanz der Peptidolart, die durch Myzelextraktion von Fiisarium equiseti gewonnen wird· Sie besteht aus einem Gemisch von Verbindungen mit stark benachbarter Struktur der Depsipeptidart, bei deren Hydrolyse in saurem Milieu eine einzige alkoholische Säure, die qi-Hydroxy-isovaleriansäure, und spezifische öl -Aminosäuren, N-Methyl-valin, H-Methyl-isoleuzin und N-Methyl-allo-isoleuzin, freigesetzt werden·

Der Anteil der verschiedenen Bestandteile, die mit A, B, C und D bezeichnet werden, wurde nach Trennung durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HP LO) in der Umkehrphase bestimmt und mit einem Integrator gemessen.

Die entsprechenden Anteile de-r verschiedenen Bestandteile wurden bezogen auf die Summe der Flächen der Peaks der vier Verbindungen in Abhängigkeit von ihrer Eestabsorption in UV von 254 nm bewertet.

Die entsprechenden Anteile der verschiedenen Peptidolbestandteile können fühlbar voneinander abweichen und liegen „zwischen

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Bestandteil Ά 2 - 5 %

Bestandteil B 10 - 16 %

Bestandteil C 32 - 39 %

Bestandteil D kU - kl %

Der Bestandteil A liefert bei partieller Hydrolyse im alkalischen Milieu 3 Moleküle eines Laktons, die sich aus dem Bruch der Esterbindungen und der erneuten Zyklisierung von oc-Hydroxy-isovaleroyl-N-methyl-valin zu Lakton ergeben. Bei vollständiger Hydrolyse im sauren Milieu erfolgt ein Bruch der Esterfunktionen und der Amidfunktionen. Daraus ergibt sich der Erhalt van 3 Molekülen l\!-Methyl-valin und 3 Molekülen oC-Hydraxyisovaleriansäure.

Die Verbindung B liefert bei partieller Hydrolyse im alkalischen Milieu 2 Moleküle Lakton, die sich aus der Zyklisierung von «^-Hydroxy-!sovaleroyl-IM-methyl-valin ergeben und 1 Molekül Lakton, das durch die Zyklisierung vonexi-Hydroxy-isovaleroyl-IM-methyl-isoleuzin oder allo-isoleuzin gebildet uird.

Bei vollständiger Hydrolyse der Verbindung B im sauren Milieu ergeben sich 3 Moleküle od-Hydroxy-isovaleriansäure, 2 Moleküle N-Methyl-valin und 1 Molekül IM-Methyl- » isoleuzin oder N-Methyl-allo-isoleuzin.

Der Bestandteil C liefert unter alkalischen Bedingungen 1 Molekül des durch Zyklisierung vonOC-Hydroxy-isovaleroyli\l-rnethyl-valin gebildeten Laktons und 2 Moleküle des durch Zyklisierung von «<-Hydroxy-isovaleroyl-IM-methylisoleuzin nder N-methyl-allo-isoleuzin gebildeten Laktons.

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Durch vollständige Hydrolyse in saurem Milieu ergeben sich 3 Moleküle oo-Hydraxy-isovaleriansäure, 1 Molekül N-Methyl-valin und 2 Moleküle IM-Methyl-isoleuzin oder · N-Methyl-allo-isoleuzin»

Der Bestandteil D liefert bei partieller Hydrolyse im alkalischen Milieu 3 Moleküle des durch Zyklisierung von °* -Hydroxy-isovaleroyl-IM-methyl-isoleuzin oder N-methylallo-isoleuzin gebildeten Laktons.

Bei vollständiger Hydrolyse in saurem Milieu liefert der Bestandteil D 3 Moleküle oc-Hydroxy-isavaleriansäure und 3 Moleküle N-Methyl-isoleuzin oder IM-methyl-alloisoleuzin.

Abschließend ergeben sich nach Gesamthydrolyse der biologischen Substanz, die Gegenstand der Erfindung ist, ©< -Hydroxy-isovaleriansäure, l\l-Methyl-valin, l\I-Methylisoleuzin (Eryth,ro-Form) und IM-Methyl-allo-isoleuzin (Threo-Form), IM-Methyl-allo-isoleuzin konnte noch keinem der Bestandteile im besonderen zugeordnet uerden.

Die Peptidolsubstanz, die Gegenstand der Erfindung ist, tdird durch ein Verfahren erhalten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Fusarium equiseti in einem Tieftank unter definierten Temperatur-, Rühr- und Zeitbedingungen einer aeroben Fermentierung unterzogen uird, das Myzel, am Schluß der Gärung gewonnen uird, vollständig mit einem chlorhaltigen Lösungsmittel abgenommen uird, die organische Phase, die zur Trockene gebracht uird, abgetrennt wird, der Rückstand mit einem flüssigen Kohlenuasserstoff versetzt, eine Extraktion der Kohlenuasserstoffphase im Gegenstrom mit einem, wässrigen Alkanal vorgenommen wird, dann die Alkanolphase abgetrennt und

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konzentriert wird, aus der die Peptidolsubstanz ausfällt, die mit üblichen physikalischen Methoden gereinigt uird.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann durch folgende, gegenwärtig bevorzugte Verfahrensweisen definiert werden: -Das für die Erzeugung der Peptidolsubstanz verantwortliche Fusarium equiseti ist der Stamm van Fusarium equiseti (Corda) SaccardD, der im Commonwealth Mycological Institute in Hew (Surrey) Großbritannien unter der Nummer 213 107 vorhanden ist.

- Die aerobe Gärung erfolgt in 3 Stufen mit einem pH-Wert zwischen 5 und 6 während einer Zeit, die für jedes Stadium zwischen 36 und kB Std. liegt.

- Die Extraktion des Myzels erfolgt mit Trichloräthylen.

- Der flüssige Kohlenwasserstoff ist Pentan oder Hexan.

- Das wässrige Alkanal ist ein Gemisch aus Methanol und

lilasser.

- Die Reinigung der Peptidolsubstanz erfolgt durch Säulenchromatographie mit Aluminiumoxid.

Die erfindungsgemäße Peptidolsubstanz verfügt über interessante pharmakologische Eigenschaften. Sie verfügt über bedeutende immuno-modulatorische Eigenschaften, die durch eine Reaktion auf die Hypersensibilität gegenüber k-Äthoxymethylen-2-phenyloxazol.on oder gegenüber den Lipopolysacchariden von Exherichia CoIi bezeugt werden. Die erfindungsgemäße Peptidolsubstanz bewirkt durch eine Veränderung der Enzymaktivitäten und des Gesamtproteingehalts der Zellen die Aktivierung der Makro-phagen. Sie besitzt außerdem eine antiexsudative Wirkung und eine antiödematöse Wirkung.

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Die Peptidolsubstanz iuurde im V/ergleich zum Muramyldipeptid und zu den Lipopolysacchariden von Escherichia CoIi untersucht. Ihre aktivierende Wirkung hat sich als mindestens gleichuertig derjenigen dieser beiden Bezugssubstanzen ergeben.

Sie kann also Anwendung in der Human- oder Veterinärtherapie als Stimulans der Abwehrreaktionen des Organismus insbesondere bei der Behandlung von Erkrenkungen der Atemiuege sowie als Antibiotikum oder Antivirus finden. · .

Zu diesem Zweck wird die erfindungsgemäße Peptidolsubstanz in Form pharmazeutischer Zusammensetzungen verwendet, die als Wirkstoff die genannte Substanz in Verbindung mit einem inerten, nicht toxischen, für den therapeutischen Gebrauch geeigneten Träger enthalten.

Von den pharmazeutischen Zusammensetzungen sind besonders diejenigen zu nennen, die für die parenterale, permuköse, perkutane oder rektale Verabreichung geeignet sind.

Von den ganz besonders bevorzugten pharmazeutischen Formen können die Injektionslösungen oder -suspensionen, die sublingualen Tabletten, die zur Verwendung auf den Schleimhäuten bestimmten Präparate, gepreßt oder ungepreßt, die Lösungen in einem polaren Lösungsmittel für perkutanen Gebrauch oder die Zäpfchen genannt werden.

Die Dosierung kann in Abhängigkeit von ..der therapeutischen Anwendung, dem Verabreichungsweg, dem Gewicht und dem Alter des Patienten innerhalb weiter Grenzen verändert werden.

Bevorzugt uiird eine Dosierung pro Verabreichung zwischen G,05 und 1 mg und eine Tagesdosierung zwischen 0,2 und 5 mg .

Es können auch wiederholte Verabreichungen (zwei bis vier nacheinander), auf die dann eine Pause von mehreren Wochen folgt, angewendet werden.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formen können außerdem weitere Wirkstoffe mit ähnlicher oder unterstützender Wirkung, Uerdünnungsmittel, Riechstoffe, aromatisierende Stoffe, grenzflächenaktive Stoffe oder Emulgatoren, Süßstoffe und Triebmittel enthalten.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden nach den in der Pharmakotechnik üblichen Verfahren gewonnen.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie jedoch zu begrenzen.

Beispiel I

A) Wachweis des Stammes

Der für die Erzeugung der erfindungsgemäßen biologischen Substanz der Peptidolart zuständige Stamm wurde als Fusarium equiseti (Corda) Sacc, der im Commonwealth Mycologicyl Institut in Hew (Surrey) Großbritannien unter der IMr. 213 107 hinterlegt ist, nachgewiesen. - Nährböden und Myzelentwicklung

Zum Nachweis dieses Stammes mußten folgende Techniken angewendet werden: ³^ Fermentierungsboden IMr. 1^: - 25 g Saccharose

209 387.,_

- 25 g Preßglukose a.a.

- 10 g Ammoniumnitrat

- 2,5 g Magnesiumsulfat

- 5 g Monpkaliumphosphat

Der pH-Uert Lüird nach dEr Sterilisierung auf 5 eingestellt-,

Dieser Fermentierungsboden bringt ein sehr kompaktes, molliges Myzel hervor, das eine orange gefärbte Oberfläche hat. Auf der Rückseite der Kultur in der Petrischale weist der Thallus eine orangegelbe Färbung.auf, die besser unter der Bezeichnung Pfirsichfärbung bekannt ist und die bei den älteren Kulturen in Orangeocker übergeht.

Bei den Agar-Agarkulturen ist die Abgabe eines gelben Pigments zu bemerken.

b) Kultur mit zerstäubtem Maisuasser 2 %_} Agar-Agar Z % Das Myzel entwickelt sich unter Bildung eines verhältnismäßig flachen, molligen Thallus mit typischen konzentrischen Zonen.

Die Pigmentierung bleibt gering, die Rückseite nimmt mit dem Alter eine dunkelgelbe Färbung an.

^c) Kultur auf CMC (Cappelini-Peterson, 1965)

- 15 g Karboxymethylzellulose

- 1 g Ammoniumnitrat -Ig Mono'kaliumphosphat

- 0,5 g Magnesiumsulfat -1g Hefeextrakt

- 1 1 destilliertes Wasser

7 -9-

Dieser Baden kann durch Zugabe von Bruchstücken trok- _u kener Blätter von Phraqmites communis vervollständigt werden.

Das Myzel bleibt selten, sehr flach, fast nicht wahrnehmbar, ohne Pigmentierung.

-. Wirkung des Lichts auf die Sporenbildung des Pilzes: Von den drei vorgenannten Mährböden ist bei weißem Licht, das mit Glanzweiß-Luxus-Leuchtstoffröhren von etwa. 1ODD Lux in einem Rhythmus von 12 Stunden pro Ta,g erzeugt wird, die Bildung von Makrokonidien nur beim CMC-Boden und bei dem mit Phragmiten-Blättern ergänzten Boden festzustellen.

Bei Kulturen, die mit den gleichen Böden hergestellt, mit LJoodschem Licht (Uellenlänge maximal 360, 365/mu) beleuchtet und in einem Abstand von 33 cm-von der Lichtquelle in Petrischalen angeordnet werden, ergeben sich Makrokonidien in sehr großer Menge in einer Frist von bis 6 Tagen.

Die Pigmentierung der Böden nach der Züchtung in Lüoodschem Licht ist im Vergleich zu derjenigen, die bei Kulturen in weißem Licht erzielt wurden, leicht schwächer,

* Aussehen des Pilzes bei verschiedenen klassischen Böden: Fusarium equiseti IMr. 213 107 wurde ebenfalls mit den klassischen Böden gezüchtet, die für die Kultur der Art Fusarium verwendet werden. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:

- Boden mit 40 g/l Hafermehl;

- Boden auf Kartoffelgrundlage (50 g Kartoffelmasse, 10 g Glukose und 20 g Agar pro Liter Wasser);

- Malz-Agarboden 2 %, Agar 2 %. .

-AO-

Bei diesen Böden tritt die Konidienbildung nur sehr selten unter Erzeugung anomaler Konidien, die durch die Verwechslung verfahlter Makrokonidien mit Mikrokonidien in die Irre führen können, auf.

Es sind jedoch bestimmte typische Aspekte, insbesondere das Auftreten eines Pigments, das in konzentrischen Zonen verteilt ist, vor allem beim Kartoffelboden sowohl bei beleuchteten Kulturen als auch bei Kulturen, die im Dunkeln gezüchtet wurden, zu beobachten.

Die Haferkultur liefert kompakte, flache, h'eterogene, uenig pigmentierte Myzelthalle. Eine Konidienbildung ist praktisch nicht vorhanden.

Morphologische Merkmale des Fusariums

A. - Fehlen von Mikrokanidien

B - Vorhandensein von Makrokonidien mit 3 bis 7 Septen auf Verzweigten Makrokonidiophoren C - V_orhandensein von zuiischenständigen vereinzelten oder kettenförmigen Chlamydosporen.

- Merkmale der Makrokonidien: . Die Makrokonidien haben ein verhältnismäßig längliches sichelförmiges Aussehen. Die endständige Zelle hat die Form eines zugespitzten Schnabels, die zuischenständigen Zellen sind etwas breiter, die Basalzelle hat die Form eines Fußes. Die entsprechend den Kulturbedingungen . sehr veränderlichen Abmessungen liegen zwischen 25yU und SD,u Länge bei 3 bis 6,u Breite.

Die Färbung der Konidien ist glasklar, die Septen sind immer sichtbar.

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Bei jungen Kulturen sind die Septationen immer eindeutig, die häufigste Septation ist 4.

Die schwer sichtbaren Mikrokonidiophoren treten nur selten auf. Sie haben pinselartige Verzweigungen.

- Merkmale der Chlamydosporen:

Die vereinzelten oder kettenförmigen zuischenständigen Chlamydosporen sind kugelförmig mit verdickter Wand. Ihr Durchmesser beträgt 7 bis 9,u. Sie bilden sich bei Kulturen, die älter als 20 Tage sind.

Die Gesamtheit der morphologischen Merkmale der Makrokonidien, das Fehlen endständiger Chlamydosporen und das Vgphandensein zuischenständiger Chlamydosporen führt zur Identifizierung des Fusariums als Fusarium der Abteilung Gibbosum.

Von den drei in dieser Abteilung enthaltenen Arten entspricht nur die Art equiseti dieser Gesamtheit morphologischer Merkmale. Das Vorhandensein einer Pfirsichfärbung der Kultur und die längliche Form der fußförmigen Basalzelle bestätigen diese Identifizierung.

B) Herstellung der Ansätze

T) Schiefaqar ' ·

Der Inhalt einer Flasche mit gefriergetrocknetem Myzel uird mit 2 ml sterilem üJasser versetzt. Die erhaltene Suspension uird benutzt, um k Röhrchen mit 10 ml Schrägagarböden folgender Zusammensetzung zu impfen:

- Haferflocken 30 g

- Preßglukose 10 g

- Agar 2Dg

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- Destilliertes Wasser q.s.p. 1DOD ml

.- Sterilisation . 20 min bei 120° C

-•spontaner pH-Wert 6,6

- pH-Wert nach der Sterilisation 5,8

Es wird 6 bis 8 Tage im Trockenschrank, der auf 28° C eingestellt umrde, inkubiert, dann wird eine Woche lang im Labor bei gewöhnlicher Temperatur dem Sonnenlicht ausgesetzt.

2) Roux-Flasche

Das Luftmyzel aus einem Schrägagarröhrchen uiird mit 10 ml sterilem Wasser versetzt. Die erhaltene Suspension wird benutzt, um 5 Roux-Flaschen, die 200 ml Agarboden der gleichen Zusammensetzung wie oben beschrieben enthalten, zu impfen. Es wird 6 bis 8 Tage lang im Trockenschrank, der auf 28° C eingestellt wurde, inkubiert, dann wird eine Woche lang im Labor unter den gleichen Bedingungen dem Sonnenlicht ausgesetzt.

C) Herstellung der Inokulen

T) T. Stadium

Aus einer Roux-Flasche wird durch Abkratzen der gesamten Oberfläche eine Myzelsuspension in sterilem Wasser (100 ml) hergestellt. Diese Suspension wird verwendet, um einen Rundkolben, der k 1 des folgenden Mediums enthält, zu impfen:

- Saccharose 25,0 g/l

- Preßglukose 25,0 g/l

- Ammoniumnitrat 1D,0 g/l

- Monokaliumphosphat 5,0 g/l

- Magnesiumsulfat 2,5 g/l

- Leitungswasser q.s.p. 1,0 1 :

- Sterilisation 3D· bei 120° C

- spontaner pH-Wert 5,if5

- pH-Wert nach der Sterilisation Λ,75

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Die aerobe Inkubation erfolgt bei 28 C im Wärmeschrank unter Einblasung von steriler Luft, so daß mährend eines Minimums von ^8 Std. (Mittel 72 Std.) gerührt wird.

2) 2. Stadium ' ' Das Beimpfen (5,3 '%) dieses Fermentators erfolgt aus

einem Rundkolben von kl (1. Stadium) in 75 1 Medium folgender Zusammensetzung:

- Saccharose kU g/l

- Zelerose " 5 g/l

- Ammoniumnitrat 1D g/l

- Monokaliumphosphat 5 g/l

- Magnesiumsulfat 2,5 g/l

- Leitungswasser q.s.p. 1,0 1

- Sterilisation 30' bei 120° C

- ρH-Idert nach der Sterilisation 5,6 Fermetierungsbedingungen:

- Luftzufuhr 3,5 m³/Std.

- Rühren 70 U/min

- Temperatur 29° C +

- Dauer 36 Std.

Während der Fermentierung werden Sterilitätskontrollen, pH-UJertmessungen, mikroskopische Untersuchungen und quantitative Bestimmungen der ReduktiDnszucker an sterilen Probenahmen durchgeführt.

3) 3. Stadium Das Inokulum des 2. Stadiums wird verwendet, um 120D Medium gleicher Zusammensetzung wie oben (Bei/npfung 6,25 %) zu beimpfen. .

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Fermentati Dnsbedingung en:

- Luftzufuhr

- Rühren

- Temperatur

- Dauer

70 rn /Std. 50 U/min 29° C + 36 bis ifO Std,

Während der Fermentierung werden die gleichen Kontrollen wie im obigen Stadium vorgenommen.

D) Produktion

Die 1200 1 Inokulum des 3. Stadiums werden zur Beimpfung des Produktionsfermenters, der 7 m Medium folgender Zusammensetzung enthält, verwendet:

- Saccharose

- Zelerose

- Ammoniumnitrat

- Monokaliumphosphat

- Magnesiumsulfat - Zinksulfat

- Kalziumkarbonat

- Leitungswasser q.s.p.

- Sterilisation

- pH-Uert nach der Sterilisation

Fermentationsbedingungen:

- Luftzufuhr

- Rühren

. - Temperatur

- Dauer

50,0 g/l

5,0 g/l 10,0 g/l 5,0 g/l 2,5 g/l 0,0/f g/l 2,0 g/X

1,0 g/l 30* bei 120° C

6,5

m³/Std. 20 U/min 29° C + etwa kB Std.

Während der Fermentierung uerden die gleichen Kontrollen wie in den vorangegangenen Stadien vorgenommen.

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Der pH-ldert, der in der 2k. Stunde in der Nähe von 3 liegt, steigt langsam an und stabilisiert sich am Schluß der Fermentierung bei 5,3 - 5,5. .

Das Myzel wird von der Fermentationsmasse durch Filtration mit der Filterpresse abgetrennt, dann im belüfteten Trockenschrank getrocknet. Es ergeben sich im Mittel nach dem Mahlen 120 kg trockenes Myzel.

E,) Extraktion

ß) Extraktion des Rohprodukts

1. Bei 1DD kg Myzel

Das gemahlene Myzel wird mit ^DQ 1 Trichloräthylen versetzt. Es uird 2 Std. lang gerührt, dann geschleudert. Der Kuchen wird mit 1DD 1 Trichloräthylen gewaschen. Es uird eine 2. Extraktion mit 3DD 1 Trichlorethylen vorgenommen, ujobei 1 Std. lang gerührt uird, dann uird geschleudert. Der Kuchen uird mit 1DD 1 Trichlorethylen gewaschen. Die Extrakte werden vereinigt und bei reduziertem Druck solange konzentriert, bis sich eine dicke Paste ergibt.

2. Bei 1D kg unter A 1) erhaltener "Paste"

Es wird in 9D 1 Hexan aufgelöst. Durch Filtration wird abgeklärt. Die Hexanlösung wird mit wässrigem Methanol (Methanol 80 - Lüasser 2D (WoI.)) gegenextrahiert: 1. Extraktion mit 5D 1, 2. Extraktion mit 25 1., 3. Extraktion mit 12,5 1, h. Extraktion mit ID 1. Die Methanolextrakte werden vereinigt, und unter reduziertem Druck wird zur Trockene konzentriert.

B) Säulenchromatographie mit "saurem" Aluminiumoxid

1. Herstellung des Aluminiumoxids

1 kg Aluminiumoxid werden in 5 1 destilliertem LJasser in Suspension gebracht. Unter vorsichtigem Rühren wird

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konzentrierte Salzsäure in einer Menge zugesetzt, die ausreicht, den pH-Wert mindestens 2h Std. lang auf 4,G konstant zu halten. Es wird mit einem Nylantuch filtriert, dann ausgiebig mit destilliertem Wasser gewaschen. Um das Wasser zu beseitigen, wird mit Azeton gewaschen, dann wird das Aluminiumoxid.in einem Trockenschrank bei +2GD C eine Nacht lang getrocknet.

2· Chromatographie Bei 20 kg Methanolextrakt

Der Methanolextrakt wird in 80 1 Methylenchlorid aufgelöst. Die Lösung uird durch Filtration abgeklärt. Die Chlormethylenlösung uird mit 40 kg Aluminiumoxid unter Methylenchlorid in einer Glaskolonne (Höhe 0,8 m) chromatographiert, uobei ein Durchsatz von 15 1/Std. eingehalten uird. Das Aluminiumoxid uird ohne Veränderung des Durchsatzes pro Stunde mit 8D 1 Methylenchlorid getuaschen.

C) Isolierung des Wirkstoffs

Bei reduziertem Druck werden die Chlormathylenabgänge bis zur Pastenkonsistenz konzentriert. Die "Paste" wird in 200 1 Äthanol gelöst. Es wird abgefiltert. Die Äthyllösung wird auf +h C abgekühlt, dann werden unter langsamem Rühren innerhalb von 8 Stunden, wobei die Temperatur auf +h° C gehalten wird, UDQ 1 destilliertes Wasser zugegossen. Es wird 20 Stunden lang bei +k C weiter gerührt. Die Kristalle werden abgefiltert. Der Kuchen wird mit 20 1 Äthanol-Wassergemisch (1:2), das vorher abgekühlt wurde, dann mit 50 1 destilliertem Wasser gewaschen. Das kristallisierte Depsipeptid wird im Trockenschrank unter reduziertem Druck bei 40 C bis auf konstantes Gewicht kristallisiert.

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Das Depsipeptid hat die Form eines kristallinen uiei-Ben oder schwach gelben, praktisch geruchlosen Pulvers von bitterem Geschmack. Es ist sehr uenig löslich in Wasser, leicht löslich in Chloroform, Methanol und Äthanol bei 95 . ·

Sein mit dem Heiztischmikroskop am wasserfreien Erzeugnis bestimmter Schmelzpunkt liegt bei 121 + 5 , sein spezifisches Drehvermögen ist

20 "

= - 8D^D + 5 (C= 5 % Methanol)

Der Gesamtstickstoffgehalt beträgt 6,2 + 0,3.%.

Nachweis der Bestandteile durch Dünnschichtchromatoqraphie Herstellung des Trägers Bei 5 Chramatagraphieplatten von 20 cm χ 20 cm mit dem Mixer k g Zellulose Mn 300, 8 g Zellulose Mn 300 G und 65 ml Wasser homogenisieren. Die Suspension auf vollständig entfettete Glasplatten in Schichten von 0,25 mm Dicke aufstreichen. An der Luft, dann 2 Stunden bei 110 trocknen lassen. Nach dem Abkühlen die Platte vertikal bis etwa 2 cm vom Rand in ein Formamid-Azetongemisch (1:*O tauchen. Etua 1 Minute lang an der freien Luft trocknen lassen, um das Azeton zu beseitigen.

Laufmittel

Gesättigtes Formamidheptan .

Übersättigte Hammer.

Lösung:

Eine Lösung van 10 mg/ml Substanz in.Methanol ist herzustellen.

209 387 -"*--

Aufbringung:

In einem Strich van 1 cm sind 10.ul der Lösung auf den Teil der Platte aufzubringen, der nicht mit Formamid getränkt wurde. .

Entwicklung:

Wach Entuiicklung auf etwa 1D cm ist die Platte eine Stunde lang bei 100° zu trocknen und eine Jod-Chloroformlösung von 0,5 % zu zerstäuben. Es müssen k gelbe Flecke zu beobachten sein, davon zwei ausgeprägte mit R_ bei 0,55 und 0,45, ein weniger intensiver mit R„ bei 0,35 und ein sehr' schwacher mit R„ bei 0,3.

Trennung der Bestandteile des Depsipeptids durch Hochdruck-Flüssiqkeitschromatographie (HPLC) Die entsprechenden Anteile der Verbindungen A, B, C, D wurden an Proben unterschiedlicher Herstellung nach HPLC-Trennung in der Umkehrphase bestimmt und mit einem Integrator gemessen.

Die entsprechenden Anteile wurden im'Vergleich zur Summe der Flächen der Peaks der vier Verbindungen berechnet, wobei angenommen wurde, daß die Restabsorption in UV von mn für alle gleich ist. .

Verfahrensbedinqunaen

Träger:

Umkehrphase/U Bansapak C18 (Waters Associates) Länge 30 cm

Innendurchmesser 3,9 mm

Elutionsmittel:

Methanol 8 ν

Wasser 2 ν

Durchsatz: 1,5 ml/min

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Lösungen:

1D mg/ml in Methanol Injektion 10,ul

Nachweis:

UV von 254 nm

Empfindlichkeit: Do = 0,02 Vollskale

Messung der Flächen: Integrator ICAP 5

Ergebnisse:

Die Ergebnisse entsprechen dem Mittel der mit verschiedenen Proben der Depsipeptidsubstanz erhaltenen liierte. Verbindung A 3,9 % . Verbindung B 15,3 % Verbindung C 38,1 % Verbindung D 42,7 %

100

Das Produkt entspricht den nachstehenden IR-Spektren.

Chromatoqraphische Trennung der verschiedenen Bestandteile Eau = Wasser

IR-Spektrum des Depsipeptids Durchlässigkeit (%)

Beispiel II

Pharmazeutische Zusammensetzungen auf der Grundlage des erfindungsgemäßen Depsipeptids: '

a) Drucklösung in Isopropyl-myristat

- Aus Fusarium equiseti gewonnenes Depsipeptid 0,050 g

- Neroliöl ' 0,050

.8,7' -^a°-

- Eukalyptol D,05D

- Saccharin 0,0D125 g

- Isopropyl-myristat. q.s.p. 2,5 ml

- Flügen 12 7,5 ml

b) Wässrige Suspension

- Aus Fusarium equiseti gewonnenes -.'

Depsipeptid O,D5D g.

- Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleat im Handel unter dem Warenzeichen

"Tueen BO" . , 0,010 g

- Natriumchlorid 0,180 g

- Neroliöl 0,050 g . - Eukalyptol 0,050 g

- IMatriurnsaccharinat 0,010 g

- Destilliertes Wasser q.s.p. 20 ml

In beiden Fällen wird das Produkt mit einer Dosierpumpe, deren Fassungsvermögen 0,080 g pro Dosis, d. h. ,ug Wirkstoff pro freigesetzte Dosis beträgt, verteilt. . .

c) Drucklösung

- Aus Fusarium equiseti geuionnenes Depsipeptid . 0,015 g

- Riechstoff . 0,0075

- Isopropylmyristat q.s.p. 0,75 ml

- Freon 12 2,25 ml

Diese Flasche hat ein Uentil von 25/ul und enthält 3 ml

wässrige Lösung. Die bei jeder Zerstäubung abgegebene Depsipeptiddosis beträgt etua 125/ug.

387 -a*-

d) Drucklösung

- Aus Fusarium equiseti gewonnenes Depsipeptid ^/ D,D3D g

- Riechstoff D,D15

- Isopropylmyristat * Q,75G ml

- Freon 12 2,25 ml

Diese Rezeptur ermöglicht die Abgabe von 250,ug Depsipeptid pro Dosis und entspricht 120 Zerstäubungen.

e) Ölige Lösung

- Aus Fusarium equiseti geuonnenes Depsipeptid 0,05 g

- Saccharin 0,DG15

- Riechstoff 0,05

- Isapropylmyristat q.s.p. S ml

Die Flasche ist mit einer Pumpe versehen, die bei jedem Druck 30,ul abgibt.

f) Wässrige Suspension

- A'us Fusarium equiseti gewonnenes Depsipeptid 50 mg

- Folyoxyäthylen-sorbitan-monooleat 15 mg

- Natriumchlorid 120 mg

- Dinatriumphasphat '. 17,25 mg

- Dikaliumphosphat 3 mg

- Kaliumchlorid 1,5 mg

- Magnesiumchlorid 1,5 mg

- Merkurinatriumthioiat 0,0375 mg

- Wasser q.s.p. 15 ml

Diese Suspension ist in Flaschen von 15 ml verpackt, die mit einer Pumpe versehen sind, die bei jeder Zerstäubung 75,ul abgibt. Jede Zerstäubung entspricht also 250,ug Wirkstoff.

g) Wässrige Injektionslösung

- Depsipeptid aua Fusarium equiseti 1D0 mg

- Cremophor EL D,10 g

- Natriumchlorid 0,8 g

- Wasser q.s.p. 100 ml

Beispiel III

Pharmakologische Untersuchung des aus Fusarium equiseti gewonnenen Depsipeptids

a) Untersuchung der humoralen Immun.ostimulation bei der gegen rote Schafblutkörperchen sensibilieierten Maus Verfahrensprotokoll

Maus CD Swiss Q von etwa 20 g Gewicht

Immunisi erung

Oede Maus erhält intravenös eine immunisierende Schwellendosis von 10 Millionen roten Schafblutkörperchen. Das Schafsblut wird im voraus mit ftlsever¹ Lösung versetzt. Die roten Blutkörperchen werden 3 Mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, dann zur Impfung in diesem Medium in Suspension gebracht. Jede immunisierte Reihe umfaßt B Mäuse.

Behandlung der Tiere

Jedes Experiment umfaßt: .

- eine Reihe van Hontrolltieren,

- Reihen von behandelten Tieren.

Die Mäuse werden mit unterschiedlichen Zeiträumen von der Immunisierung intravenös oder intraperitoneal entsprechend dem Uersuchsprotokoll behandelt.

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Die flufschuemmung van Kulturen von Corynebacteriuni Parvum erfolgt in physiologischer Hochsalzlösung.

Das Depsipeptid wird in Propylenglykol im Verhältnis von B4 mg/ml aufgelöst, dann wird diese konzentrierte Lösung ihrerseits in physiologischer Hochsalzlösung gelöst (Verdünnung 1:20 bei Mäusen, die 50,ug Depsipeptid erhalten, und Verdünnung 1:100 bei denjenigen, die lOyug Depsipeptid erhalten).

Entnahme ·

Die Entnahme an den Mäusen erfolgt an den angegebenen Tagen durch retroorbitäre Punktion.

Die Seren werden bei -80 , nicht dekomplementiert gelagert. Für jede untersuchte Reihe werden die Seren einzeln getestet, so wie ein Serenpool.

Bestimmung der Antikörper

^a) Bestimmung des Härnagglutinationstiters

Platten-Mikrohämagqlutinationsverfahren

0,05 ml einer Suspension von roten Schafblutkörperchen

in Mayers Reagens mit einem Titer von 7.10 .ml («& 0 m,u = 0,700) werden 0,025 ml Serum, das jeweils verdoppelt im gleichen Reagens verdünnt wird, zugesetzt. Die Platten werden 2 Stunden bei Umgebungstemperatur gehalten, dann 1 Nacht bei + 4 . Die Hämagglutinationen werden mit einem Vergrößerungsspiegel abgelesen.

Der Hämagglutinationstiter wird mit der stärksten Verdünnung des Serums, die eine freie Hämagglutination ergibt, bestimmt.

Er wird durch den Exponenten Log 2 dieser Verdünnung (Verdünnung 1:64, Titer = 6) ausgedrückt.

209 387 -ac-

Die freien Hämagglutinationen werden erst vom Hämagglutinationstiter k an gezählt, da die niedrigeren liierte im allgemeinen schwer abzulesen sind.

b) Bestimmung des hämolytischen Tjters Platten-Mjkrohämolyseverfahren * 0,025 ml einer Suspension von roten Schafblutkörperchen in Mayers Reagens (10 /ml) werden 0,025 ml Merieux-Meerschweinchenkomplement, das im Verhältnis 1:100 in Mayers Reagens verdünnt wurde und 0,025 ml Serum, das jeweils verdoppelt verdünnt wurde, zugesetzt.

Die Platten werden 1 Stunde lang bei 37 im Trockenschrank, dann 2 Stunden bei +^⁰ gehalten. Die Ablesung erfolgt mit einer optischen Vorrichtung.

Der hämolytische Titer ergibt sich aus der stärksten .Serumverdünnung, die zu einer vollständigen Lyse des Bodensatzes der roten Schafblutkörperchen führt.

Er wird in der gleichen Weise wie der Härnagglutinationstiter ausgedrückt. .

Bestimmung der Ergebnisse

Das Mittel der Einzeltiter ( +Standardabweichung) sowie der Titer des Serumpools jeder Reihe werden zu den verschiedenen Entnahmezsiten bewertet. Bei j'eder behandelten Reihe wird die Veränderung in Abhängigkeit von der unbehandelten Reihe durch Bewertung der Differenz der mittleren Titer und derjenigen der Pooltiter festgelegt. Die Signifikanz wird mit dem zweiseitigen t-Test und dem

X -Test, wenn der obige nicht, anwendbar ist, ermittelt.

209 387

Ergebnisse

1. Untersuchung der Schwellenreaktion Mehrere Dosen roter Schafblutkörperchen wurden unter- sucht, um die Schwelle der humoralen Reaktion von Swiss-Mäusen zu bestimmen und um eine überschwellige Reaktion zu erzielen. So kann die mit 10 roten Blutkörperchen/Maus erhaltene maximale Reaktion durch Immunostimulanzien nicht verstärkt werden, ebenso ergeben 1D rote Blutkörperchen keinerlei humorale Reaktion, die unter unseren experimen-

teilen Bedingungen nachweisbar ist. 10 rote Blutkörperchen pro Maus ergaben eine in diesen Experimenten auswertbare Kinetik.

Schwellenänderungen wurden angetroffen, ohne daß man je_ doch weiß, ob sie den Tieren oder jahreszeitlichen Bedingungen zuzuordnen sind.

2. Kinetische Untersuchung der Reaktion der Hontrolltiere

Mehrere Reihen Kontrolltiere, die mit 10 roten Blutkörperchen/Maus immunisiert wurden, wurden bei diesen Experimenten untersucht und ermöglichen es, folgende Punkte abzuleiten:

^a) Hämagglutinationstiter

- Auftreten von Hämagglutinationsantikörpern bereits am k. Tag nach der Immunisierung bei einigen Reihen und erst am 7. Tag bei anderen;

- Ergebnisse, die am 4. Tag gestreut waren, zeigten vom 11. Tag an die Tendenz zur Verdichtung;

- Titer im allgemeinen unter k.

b ) Hämolytische Tit er

- Vor dem 7. Tag praktisch keine hämolytischen Antikörper nachweisbar; "

- Verdichtung der Ergebnisse in der Spätphase der Reaktion,

209 387 -*>-

3. Untersuchung einer immunostimulierenden Referenzsubstanz: Extrakt von Corynebacterium parvum Die Arbeiten von Biozzi und Mitarb, haben gezeigt, daß C. Parvum die Immunitätsreaktian bei Injektion 3 bis 6 Tage vor der Immunisierung stimuliert. Dieses Phänomen ergibt sich erneut beim Anteil der hämagglutinierenden und hämolytischen Antikörper und bei der Frühzeitigkeit ihres Auftretens.

Die Untersuchung der Frühphase der überschwelligen Reaktion (k. Tag) ermöglicht es, das Auftreten hämolytischer und hämagglutinierender Antikörper bei den stimulierten Tieren nachzuweisen. Die Erforschung der späteren Phase (14. Tag) bestätigt das Ergebnis. Ihre statistische Bedeutung ist größer. Durch die Heterogenität der verwendeten Swiss-Maus kann die Streuung der Ergebnisse erklärt werden. Biozzi und Mitarb, konnten ähnliche Ergebnisse vermerken und innerhalb dieses gleichen Stamms Stammlinien mit unterschiedlichem Reaktionsvermögen gegenüber den raten Blutkörperchen des Schafs heraustrennen (s. Abbildungen A und B).

k. Untersuchung der Aktivität des erfindungsgemäßen

Pep sip ept ids

Das 3 Tage lang zuischem dem 6. Tag und dem 3. Tag vor der Immunisierung verabreichte Depsipeptid führt zu einer Erhöhung des Anteils der hämagglutinierenden und hämolytischen Antikörper sowie zum Auftreten hämolytischer Antikörper bereits am k. Tag der Immunitätsreaktion - 10 und 50 /Ug/Tag Depsipeptid pro Maus führen zum gleichen Ergebnis. Das steht wahrscheinlich im Zusammenhang mit der schwierigen Löslichkeit des Produkts im wässrigen Milieu und/oder der Diffusion von der Injektipnsstelle aus."

209 387 -*?-

Die mit dem Depsipeptid unter diesen experimentellen Bedingungen erzielten Stimulationen sind vom kinetischen Gesichtspunkt aus analog denjenigen, die mit 500 ,ug/Tag/ Maus C. Parvum (IP) erzielt werden. Die sich in diesem Test ergebenden Wirkungen sind bei lilirkdosen vergleichbar, die bei Depsipeptid 1G bis 50 Mal'kleiner sind.

b) Lymphohlasti scher Transformationstest Überlegungen immunologischer und technologischer Art haben dazu geführt, den lymphoblastischen Transformationstest als quantitative Untersuchungsmethode der immünostimulierenden Aktivität des Depsipeptide anzunehmen.

Zur quantitativen Bestimmung des Depsipeptids beim lymphoblastischen TransformationstGst werden ähnliche Bedingungen gewählt, wie sie von R. P. Daniele und S. K. Holian Proceed. IMatl. Acad. Sei (USA) 73 (1976) 3599 beschrieben werden, mit optimaler Mitogenkonzentration, ujobei das zu testende Erzeugnis während der gesamten Transformation in Hontakt bleibt. Unter diesen Bedingungen ist die Inkorporierung des Präkursors sehr gut reproduzierbar und maximal. Die biologische Wirkung des Produkts äußert sich in einer Hemmung der Inkorporierung des markierten Präkursors.

Eichung des Systems

Die Bestimmung der optimalen Mitogendosis erfolgt nach den üJirkurig-Qosiskurven, wobei der Anfang des Uirkungsplateaus gewählt wird.

Die Mitogenkonzentrationen, die unter den Bedingungen des Tests eine optimale Stimulation ergeben, sind folgende: . PHA. ^ug/ml; LPS = S

209 387 -Oi-.

Es wird demnach angenommen, daß die durch PHA umgewandelten Lymphozyten im wesentlichen "T"-Zellen sind. LPS betrifft nur die "B"-Zellen.

Andererseits war es durch eine kinetische Untersuchung des Tests möglich, die maximale stimulierende Wirkung von PHA in der 66. Stunde und die von LPS in der 48. Stunde zu bestimmen.

PHA ist bei dieser Dosis das beste Mitogen, die Inkorporation, die es bewirkt, übersteigt zwei Mal- die von LPS. Die Ergebnisse, die damit erzielt werden können, sind reproduzierbarer.

Aus den Ergebnissen kann geschlußfolgert werden, daß das aus Fusarium equiseti gewonnene Depsipeptid keine mitogene Substanz ist und die Inkorporation von tritiummarkiertem Thymidin, die von mitogenen Substanzen erzeugt wird, hemmt.

(Die Abkürzung PH bedeutet Phytohämagglutinin in einer Lösung von 1OD )f/ml in physiologischer Kochsalzlösung.

LPS bedeutet Lipo-polysaccharid von Escherichia CoIi OppBp.QI Lösung von 1 mg/ml in physiologischer Hochsalzlösung.)

c) Untersuchung des Depsipeptide von Fusarium equiseti nach Immüriitätsreaktion

Die stimulierende oder bremsende Wirkung dieser Substanz wurde an der humoralen Reaktion einerseits und der Zellreaktion andererseits untersucht.

209 387 __a9-

Die humorale Reaktion wurde durch Verabreichung von LipDpolysaccharid (LPS) untersucht. So haben UUJAMOUIC (1973) und LE BQUTEILLER (1974) gezeigt, daß LPS die Anzahl der Zellen von medullärem Aussehen erhöht.

Die Zellreaktion wurde durch Verabreichung VDn Oxazolon getestet, da TURH (1967) und ANDERSDIM (1972) gezeigt hatten, daß die Reaktion auf dieses Produkt vorzugsweise die Zellen betrifft.

Der immunozytologische und ultrastrukturelle Charakter der betroffenen Zellen wurde nach J)EANNESSON (1975) untersucht.

A) Untersuchungen der antikörpererzeugenden Zellen Die Anzahl der antikörpererzeugenden Zellen in der lymphazytären Population wird quantitativ durch den Hämolysebereichstest in einem halbfesten Milieu, das die raten Zielblutkörperchen enthält, bestimmt. Der durchgeführte Versuch bezieht sich auf die direkten Hämolysebereiche (Methoden von JJERNE und NDRDIN, 1963), mit dem die IgM-erzeugenden Zellen nachgewiesen uuerden.

In eine Petrischale, die eine 3 %ige Agaroseschicht enthält, wird eine zweite D,6 %ige A.garoseschicht mit 1.10 Lymphozyten und 3D % gekoppelten Blutkörperchen gegossen. Das Ganze wird 1 Stunde lang bei 37 C inkubiert. Dann wird Meerschweinchenkomplement im Verhältnis 1:1D zugesetzt und erneut 1 Stunde bei 37° C belassen. Die Ablesung der Hämoiysebereiche erfolgt mit einer binokularen Lupe und ihre Anzahl wird ausgedrückt in 10 Lymphozyten und pro Organ. Die roten Zielblutkörperchen sind rote Schafblutkörperchen, die sowohl gegenüber OXAZDLON als auch gegenüber LPS empfindlich sind. Sie wurden nach den Verfahren aus der Literatur gekoppelt.

B) Immunozytochemische Untersuchung der Zellsuspensionen, Rosetten und antikärpererzeugenden Zellen 1. Untersuchung der lymphozytären Gesamtpopulation des

Lymphknotens oder der Milz

- Markierung der in Teilung befindlichen Lymphozyten: zur autoradiographischen Untersuchung werden die ZeIlsuspensianen bei 37° C mit tritiummarkiertem Thymidin in einer Menge von 20/uCi/ml 30 Minuten lang inkubiert, bevor sie für den Nachweis der Oberfläohenimmunoglobuline behandelt werden.

Die Zellen werden mit Glutaraldehyd fixiert,.mit Diaminobenzidin nach der Methode von GRAHAM und HARNDUSHY (1966) behandelt, um die Peroxydase zu entwickeln, mit Osmiumsäure nachfixiert und eingeschlossen.

Erg ebnisse

A-.) Untersuchung der Immunitätsreaktion auf Oxazolon

1. Untersuchung nach der Zellenanzahl

Am 5. Tag liegt die Zunahme der Zellenanzahl immer noch über:50 %, wobei die bedeutendsten Ergebnisse bei intraperitonealer Verabreichung beobachtet werden.

Am 9. Tag ist die Zunahme weniger bedeutsam und scheint sogar praktisch beendet zu sein.

Die Anzahl der Zellen, die das tritiummarkierte Thymidin eingebaut haben, ist bei den Hontrolltieren und den behandelten Tieren vergleichbar. Sie liegt bei k bis 6 %.

2. Untersuchung nach der antigenerkennenden Zellenanzahl Am 5. Tag ergibt sich die sehr starke Erhöhung des Anteils der das Antigen erkennenden Zellen (257 %) sowohl aus der Erhöhung der Zellenanzahl im Lymphknoten als auch aus der Erhöhung des auf 10° Zellen berechneten antigenerkennenden

209 387 _34-

Zellenanteils. Keine dieser Veränderungen ist mehr am 9. Tag anzutreffen.

3. Untersuchung nach der Hämalysebereiche bildenden Zellenanzahl

Die starke Erhöhung der am 5. Tag Hämolysebereiche bildenden Zellen ergibt sich aus der Erhöhung der Zellenanzahl, luähren.d es sich am 9. Tag um die Erhöhung der Anzahl der Hämolysebereiche bildenden Zellen pro 10 Zellen handelt.

h. Untersuchung nach dem Antikörperanteil Am 5. Tag bleiben die Antikörperanteile konstant, am 9. Tag nehmen die hämagglutinierenden und hämolysierenden Antikörperanteile, insbesondere bei den hämolysierenden Antikörpern, jedoch zu.

5. Untersuchung nach der Zellenanzahl· mit Dberflächen-Iq Die Zellen mit Dberflächen-Ig wurden anhand von halbfeinen Schnitten der anfänglichen Zellaufschuemmung bei den Hontrolltieren und den behandelten Tieren untersucht. Der Anteil beträgt 35 %.

6. Immunozytoloqische Untersuchung im Elektronenmikroskop Die Art der Rosetten und Bereiche bildenden Zellen ist bei den Kontrolltieren und den behandelten Tieren gleich. Es handelt sich bei den Rosetten um Lymphozyten mit Dberflächen-Ig und um T-Zellen, die ^O bis 50 % am 9. Tag erreichen. Bei den Hämolysebereichen handelt es sich vor allem um Plasmozyten.

B) Untersuchung der immunitären Reaktion auf LPS

1. Untersuchung nach der Zellenanzahl Die einzige uesentliche Erhöhung liegt am 9. Tag bei Depsipeptid.

209 387 -*»-;

2· Untersuchung nach der antigenerkennenden Zellenanzahl

Die Wirkung ist Mull ader drückt sich in einer Abnahme aus, unabhängig davon," ob die Ergebnisse in Anzahl pro 1D Zellen oder pro Organ ausgedrückt werden. Diese Abnahme ist besonders spürbar am 9. Tag.

3· Untersuchung nach der Hämolysebereiche bildenden

Zellenanzahl

Die Ergebnisse lassen es nicht zu, auf eine Wirkung in Richtung einer Zu- ader Abnahme zu schließen.

k» Untersuchung nach dem Antikörperanteil Es ist eine Tendenz zur Abnahme des Anteils der hämagglutinierenden Antikörper zu beobachten, während die Anteile der hämolysierenden Antikörper besonders am 5. Tag zunehmen·

5. Immunozytoloqisehe Untersuchung im Elektronenmikroskop

Die Rosetten und die Bereiche bildenden Zellen sind souohl bei den Kontrolltieren als auch bei den behandelten Tieren war allem Plasmozyten. In diesem Fall werden Rosetten, LymphDzyten mit Dberflächen-Ig beobachtet. Unter diesen Immunozyten befindet sich keine T-Zelle.

Schluß ·

Die Wirkung des Depsipeptids kann so zusammengefaßt uerden: - Die Reaktion aiuf Oxazolon scheint stimuliert zu sein. Der Zustrom der Zellen im Bereich des Lymphknotens ist groß und maximal am 5. Tag. (50 bis BO %) Die Anzahl der Zellen, die das Antigen erkennen, ist immer erhöht, entweder als Folge der hohen Zellenanzahl ader durch Erhöhung des absoluten Wertes, während die Zunahme der Anzahl der Zellen, die Bereiche bilden, nur den Zustrom der Zellen im Bereich des Lymphknotens widerspiegelt. Der Antikörperanteil ist immer leicht erhöht und nur am 9. Tag»

7 -

- Die Reaktion auf LPS scheint eher gebremst zu sein. Es gibt keinen Zellenzustrom im Bereich der Milz; die Anzahl der Zellen, die das Antigen erkennen, ist unverändert oder reduziert. Die Veränderungen des Anteils von Zellen, die Bereiche bilden, sind zu unsicher als daß sie berücksichtigt werden könnten, und-die Antikörperan-.teile sind insgesamt reduziert (hämagglutinierende Antikörper) oder unverändert (hämalysierende Antikörper).

d) Lüirkung des Depsipeptlds auf die immunitäre Reaktion: I) Potentialisierende Wirkung auf die humorale Immunität: 1) Material ,

a) Das erfindungsgemäße Depsipeptid wird im Verhältnis 100,ug in 50 ml physiologische Kochsalzlösung bei den Experimenten in Lösung gebracht, bei denen die gewünschte maximale Konzentration 2/Ug/ml beträgt. Bei höheren Konzentrationen wurden Suspensionen,'die 3 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt wurden, verwendet.

b) Tiere:

Humorale Immunität: Maus C 57 B 6 männlich Lvmphoblastische Transformation: Maus CBA. männlich Aktivierung der Makrophagen: Ratten FISCHER/Ico weiblich

^c) Antigen: Rinderserumal.bumin (ΒΞΑ) gereinigt (V-Anteil nach Cohn) von ARMOUR PHARMACEUTICAL COMPANY (Chicago). Jede Maus erhält 300,ug dieses Antigens in die hinteren Sohlenkissen. . .

d) Adjuvans: Referenzadjuvans (DIFCO):

- Vollständiges Freund-Adjuvans

- Unvollständiges Freund-Adjuvans

Depsipeptid im Verhältnis 10,ug pro Maus bei den humaralen Immunitätstests am.Tag 0 und 5,ug pro Maus zur Auffrischung der Immunisierung.

209 387

2. Methoden

a) Immunisierung

Tag 0: Immunisierung von 20 Mäusen 10,ug/Maus Depsipeptid. Jede Maus erhält 0,2 ml eines Gemischs aus 2 Bestandteilen Phosphatpuffer mit BSA. und Depsipeptid und 3 Bestandteilen unvollständigem Freund-Adjuvans. 10 Kantrollmäuse erhalten das gleiche Gemisch, jedOch ohne Depsipeptid und 10 Mäuse erhalten das Antigen mit vollständigem Freund-Adjuvans.

Tag 21: Die Hälfte der Mäuse jeder Reihe wird zur Messung des Anti-BSA-Antikörperanteils durch passive Hämagglutinatian geopfert. Die zweite Hälfte erhält eine Injektion zur Auffrischung mit der Hälfte der Anfangsdosis (0,1 ml statt 0,2 ml).

ZäS—ULi Opferung der Mäuse und passiver Härnagglutinationstest zur Ermittlung des Gehalts an spezifischen Antikörpern der BSA.. .

b ) Zelluläre Tests:

1) Mitogenes Vermögen des Depsipeptide: 0,5 χ 10 MiIzlymphozyten der Maus CBA in 0,1 ml RPMI uierden 3 Tage lang bei 37 C unter 5 % CG_ mit verschiedenen Depsipeptidkonzentrationen gezüchtet. Die Kontrollposten erhalten PHA, das 1:200 verdünnt uurde, ConA, von i0,ug/ml und LPS zu lOO^ug/ml. . '

4 Stunden vor Beendigung der Inkubation uerden jeder Kultur T,uCi tritiummarkiertes Thymidin zugesetzt. Am Ende der· Inkubationsphase uerden die Zellen mit Ulhatman-GF/C-Filter filtriert und zueimal mit 10 ml physiologischer Hochsalzlösung geuaschen.

367 -se-

Das in der DIMS fixierte tritiummarkierte Thymidin, das vom Filter zurückbehalten wird, uird in einem Beta-Zähler gezählt. Die Transformationszahl wird als das Verhältnis des in Anwesenheit der untersuchten Substanz inkorporierten Thymidins zu dem durch die Lymphozyten ohne Mitogen inkorporierten Thymidin ausgedrückt.

2 ) Makrophag en stimulation :

In vitro: Die peritonealen Makrophagen von nicht stimulierten Fischer-Ratten, die durch Peritonäalspülung entnommen und auf Kunststoffnährbodenunterlage (NUIMCLOlM) isoliert wurden, wurden eine !Macht lang mit Depsipeptiddosen zwischen 1 Pikogramm und 1 IManogramm pro ml gezüchtet. Dann wurden der Proteingehalt, der Gehalt an lysomaler ß-Glukuronidase und zytoplasmischer Leuzinaminopeptidase an den mit Triton X-1DD lysierten Zellen (0,05 %) bewertet. LPS von Escherichia und Muramyldipeptid stellten die Kontrollsubstanzen dar.

II) Potentialisierende Wirkung auf die nicht spezifische zelluläre Immunität:

a) L.ymphozy ten: Mitogenes Vermögen

Während bei Milzlymphozyten der Maus das Phytohämagglutinin (PHA) bei der üblichen Verdünnung von 1:200 und das Concanavalin A (ConA) bei 10 ,ug/ml beide einen Transformationsfaktor in der Nähe von 50 und LPS von E. coli bei 100.ug/ml einen Faktor von 1^,8 ergeben, wies das Depsipeptid eine Hemmung der Inkorporation von tritiummarkiertem Thymidin (Faktor kleiner als 1,0) bei allen getesteten Konzentrationen (von 0,1 Pikogramm bis 100,ug/ml) auf.

Mitogenvermögen von Depsipeptid im Vergleich zu den klassischen Mitogenen bei Maus-Milzlymphozyten: Inkorporationsfaktor VOn₁₁ tritiummarki ert em Thymidin

209 387-3« -

0,1 pg/ml = 0,41 (+ 0,1) ρ = 0,0047

1 pg/ml = 0,62 (+ 0,07) ρ = 0,044

5 pg/ml = 0,84 C+ 0,06) nicht signifikant

10 pg/ml = 0,90 (+ 0,06) nicht signifikant

110 pg/ml = 0,32 (+ D,12) ρ = 0,0078

1 ng/ml = 0,40 (+ 0,10) ρ =0,0082

10 ng/ml = 0,56 (+ 0,08) ' nicht signifikant

100 ng/ml = 0,62 (+ 0,07) nicht signifikant ρ = 0,054

t ,ug/ml = 0,36 C+ 0,1) ρ = 0,0044

10 ,ug/ml = 0,63 (+ 0,07) ρ = 0,028

10D,ug/ml = 0,80 (+0,06) nicht signifikant

PHA 1/200 = 51,15 C+ 0,006) ρ = 0,0028

CanA 1O.ug = 50,30 (ί 0,006) ρ = 0,0025

LPS tOO_/Ug = 14,81 (+ 0,012) ρ = 0,0028

Diese iMukleinstaffujechselhemmung bei sehr niedrigen Depsipeptiddosen ist das Zeichen für eine sehr starke Aktivität dieses Produkts aufgrund eines Mechanismus, bei dem suppressive Zellen ader eine Veränderung des Stoffuechsels und der zellulären Permeabilität eine Rolle spielen können. Depsipeptid als solches ist nicht mi tag en, uas jedoch nichts aussagt über ein eventuelles Stimulationsvermögens bei Lymphozyten gegenüber klassischen Mitogenen. . ' .

b) Aktivierung der Makrophaqen In vitro:

Quantitative Enzymbestimmunq: Depsipeptid führt zu einer signifikanten Erhöhung der Makrdphagenhydrolasen zwischen 1 pg und 10 ng/ml. Der Proteingehalt ist signifikant bei 10 und 100 pg/ml angestiegen. Ab 100 ng/ml erweist sich Depsipeptid als toxisch, uie der Abfall des intrazellulären Protein- und Enzymgehalts der Makrophagen zeigt, die Dosen gleich oder größer dieser Konzentration ausgesetzt ujaren.

387 -»»-

In vivo:

Depsipeptid stimuliert also stark den Stoffuechsel der Makrophagen·

In vivo: G Tage vor der Peritonäalspüluing erhalten die Tiere eine intraperitoneale Injektion von 1 oder 100 ,ug Depsipeptid auf ein Volumen von einem Milliliter physiologischer Hochsalzlösung. LPS, MDP und LJSA dienen als Hontrollsubstanzen. Die bei der Peritanäalspülung erhaltenen Zellen werden 2 Stunden inkubiert, um die nicht haftenden Zellen zu beseitigen. Die haftende Population, die zu 90 % aus Makrophagen besteht, wird k weitere Stunden gezüchtet. Die Zellen werden dann lysiert und der Protein- und Enzymgehalt wie oben bei den Tests in vitro quantitativ bestimmt.

In vivo:

Puantitative Enzymbestimmungen: Bei der Dosis von 1/Ug weist das Depsipeptid eine Inflation der lysomalen (getestet mit B-Glukuronidase: + 35 %) und zytoplasmischen (wie Leuzin-aminopeptidase: + 35 %) Enzyme wie auch des Proteingehalts auf (+ 24 %), so daß das Produkt hinsichtlich der Stärke der Stimulation an die Stelle hinter LPS und UJSA. rückt. So weist USA. bei dieser Dosis eine Erhöhung der Hydrolasen um 39 % und LPS eine Zunahme der Leuzin-aminopeptidase um 42 % und der Proteine um 35 % auf. . ·

Dagegen führt Depsipeptid bei der Dosis von 100,ug zur stärksten Inflation der Proteine (+ 32 %) und der zytoplasmatischen Enzyme (+ 59 %) der 4 getesteten Immunostimulanzien. Es liegt hinter LJSA bei den Hydrolydasen (+ 37 %).

2Ό9'387"_3,-

Depsipeptid uiurde ebenfalls bei der Dosis von 1 ng getestet, die anderen Stimulanzien wurden bei dieser Konzentration jedoch nicht angewendet. Die Stimulation ist geringer (Proteine: + 11 %, ß-Glukuronidase: + 23 %, Leuzin-amino-peptidase: + 16 %)

Tabelle I · '

Prozentuale Erhöhung des Protein- und Enzymqehalts in peritonealen Makrophagen, die 6 Tage in vivo stimuliert wurden

	Proteine	1/Uq	P	100,Uq	P
Depsi	ß-Glukuronidase LAP	+ 24 %	=0,0125	+ 32 %	0,005
peptid	(Leuzin-amino-	+ 35 %	0,025	+ 37 %	0,025
	peptidase)	+35,5 %	0,025	+ 59 %	0,0025
	Proteine
	ß-Glukuronidase LAP	+ 35 %	0,01	+ 14 %	0,025
LPS		-14 %	0,025	-ζ ΰ/ ~ -/ /O	W, S.
	Proteine	+ 42 %	0,001	+ 2 %	IM.S.
	ß-Glukuronidase LAP	+7,5 %	IM. S.	+ 2 %	IM.S.
MDP		+ 27 %'	0,01	+ 5 %	ΙΜ.Ξ.
	Proteine	+ 24 %	0,025	+ 5 %	IM. S.
ÜISA-	ß-Glukuronidase LftP	+ 3,6 %	IM.S.	« A O/ τ I/o	IM.S.
(water soluble		+ 39 %	0,001 :	+ 46 %	=0,001!
adju		-10,5 %	=0,025	- 7 %	IM.S.
vant)

(IM.S. = nicht signifikant)

Tabelle IL

Intra-makrophaqer Enzym- und Proteingehalt nach 16 Std. Inkubation mit verschiedenen Immunostimulanzien. Die Proteine uerden ausgedrückt in /-uq/IO Zellen und die Glukuronidase in nM Hydrolysesubstrat/10 Zellen/Stunde,

387 -33-

Depsipeptide

Lipopolysaccharid

Muramyldipeptid

Physiologische Kochsalz- _lösung

Proteine

B-Glukuroni·

dase

45,7+0, 29,5+0,

46,0+1,1 29; 1 + 2,2

46,0+1,1 29,1+2,2

1: ρ g/ml

Proteine

B-Glukuroni·

dase

44,9+4, 35,8+1,

IMS 9^C

55,1+2,2 39,

2±1,5^b

46, 36,

1 + 2,2NS 5+0,1^b

pg/ml

Proteine

B-Glukuroni·

dase

53,3+4, 35,4+4,-

,7+2,2NS ~ ,a

37, 1 + 5,8

44, 36,

8+0,7IMS 3+6,4ΝΞ

_Λππ /ι Proteine pg/ml _ß__Glukuroni.

dase

50,1+4, 33,0+2,

52,

38,

2+6,3NS 7+9,9NS

44, 41,

6+1,9IMS 0+2,9^b

t ng

Proteine

B-Glukuroni·

dase

,3IMS

45,0+0,4NS

48,2+4,

34,2+3,7" 21,0+0,5"

44, 34,

0+1,8NS 0+5,3NS

ng/ml

Proteine

B-Glukuroni·

dase

45,	9+1,	4ΝΞ	47,	1 + 0,	4NS
32,	8+5,	6b	25,	2+6,	6ΙΜΞ

4+1,8NS a

39,6+6,

/mn / ι Proteine ng/ml _B._Glukurani.

dase

44,3+4,

29,8+8,

ONS |52,3+O,4 8NS J34,9 + 3,4^!

40, 23,

5+0,7^U

9+6,2NS

T ng/ml

Proteine

B-Glukuroni·

dase

44,2+5,9NS J46,5+1,3NS 27,1+0,3° J26,0+2,tNS

-j.

45, 30,

1+0,9NS 6+3,8NS I

I + I , O Iu ΪΖ3

2+3,0NS

ng/ml

Proteine

B-Glukuroni-

dase

41,9+7, 25,2+9,

43, 23,

7+2,5NS 4+i;7^C

48, 32,

-inn r, / ι Proteine 1:00 ng/ml _ß__Glukuroni.

dase

36,6+5, 7,5+3,

2+3,8 !55, c

41, 11,6+2,4

3 + 3, r 39,0+i:,6^c

(NS = nicht signifikant)

Siqnifikanzgrade a_p < 0,05

0,025

^D'^DD1

20t

-¹JO-

III) Zunahme der Chromaussalzung bei den Larven von Schistosoma mansoni durch verschiedene Makrophaqen-Immunostimulanzien im Vergleich zu nicht stimulierten Makrophaqen

Zytotoxische Fähigkeit: Depsipeptid wurde auf seine Wirk-^un9 in vivo auf die bei peritonealen Rattenmakrophagen induzierte Zytotoxizität. gegenüber Larven von Schistosoma mansoni untersucht.

Die in vitro oder in vivo stimulierten Zellen werden Larven von Schistosoma mansoni ausgesetzt, die mit Chrom 51 markiert wurden, um eine mögliche zytotoxische Fähigkeit nachzuweisen, die durch die in einem Nährmedium ausgesalzene Chrommenge, demzufolge Zellschädigungen an der Oberfläche der Schistosomuli, gemessen wird. Die im Medium freigesetzte Radioaktivität wird in Prozent der in den Schistosomuli am Beginn des Experiments enthaltenen Gesamtradioaktivität ausgedrückt.

Erg ebnisse Tabelle III

Substanzen	1 ng	•	1 /ug	1OD ^ug
Depsipeptid.	+ 0,5 % N.S.		+ 13 % N. S.	"+ 10 % IM. S.
LPS	-	+ 2h % P < 0,025	+ 50 % ρ < 0,005
MDP	+ 6 % M.S.	+ 1Π % IM.S.
USA	+ 23 % ρ <D, 025	+ 30 % ρ < 0,025 , : i

(N.S. =.nicht signifikant)

209 387

Depsipeptid führt zu einer NICHT SIGNIFIKANTEN Zunahme der Aussalzung von Chrom 51, das zur radioaktiven Markierung der Schistosomuli verwendet wird, wi e auch MDP, mährend LPS und IJSft die Makrophagen bei den Larven signifikant toxischer machen als es die Makrophagen von Tieren sind, die nur physiologische Kochsalzlösung erhalten haben.

Depsipeptid hat also in vivo keine Wirkung auf die Makrophagen, nenn sie bei Schistosomuli untersucht uierden, die mit Chrom 51 markiert wurden.

Zvtotoxische Fähigkeit: Depsipeptid führt jedoch JLn vitro nicht stärker als LPS von E. coil zu einer signifikanten Erhöhung der Zytotoxizität der Makrophagen bei Schistosomuli, dia mit Chrom 51 markiert wurden. Die "stimulierenden" Dosen von Depsipeptid führen zu einem leichten Rückgang der Aussalzung des radioaktiven Markierers,

Prozentsatz des Gessmtchroms, das durch 16 Std. lang inkubierte Schistosomuli ausg.esalzen wurde, bei Normalmakrophagen,. die 24 Stunden lang mit.verschiedenen Depsipeptiddosen stimuliert wurden

Tabelle IV

Physi Kochs	alogische alzlösunq	100	pq/ml	1	nq/ml	TD	nq/ml	100	nq/ml
24, + 2	03 % ,4	19, + 3	67 % ,1	16 +	,21 % 3,9	21 +	,71 % 3,5	23, £ 2	46 % ,7

209 387' -ha-

e) Untersuchung der Wirkung von Zyklodpesipeptid auf

die Überlebenszeit von Mäusen mit Leukämie L1210 Das erfindungsgemäße Zyklodepsipeptid verhält sich wie ein Immunostimulans "in vivo" und wirkt im Bereich der Makrophagen wie BCG. Es schien interessant zu.sein, diese beiden Substanzen vergleichend zu untersuchen. Als Modell wurde die Maus mit der Leukämie L1210 verwendet, die mit Zyklophosphamid vorbehandelt wurde, um die Wirkung dieser beiden Produkte auf die Restkrankheit einschätzen zu können.

Material und Methoden: .

Die verwendeten Tiere sind BDF-Mäuse im Alter von etwa 7 bis B Wochen (CSEAL-Orleans).

Die Tiere wurden nach dem von MATHE und Mitarb, beschriebenen Protokoll "Aktive Immunotherapie der Karzinome 1976" (ESF-Paris) behandelt.

Am Tag D erhalten alle Tiere eine Injektion IU von 1a lebenden Leukämie-L1210-Zellen. Am Tag 1 uierden die Tiere auf h Posten von 10 Tieren mit homogenem Gewicht aufgeteilt. Die Mäuse aus einem "Kantrall"-Posten erhalten eine i.p. Injektion physiologischer Hochsalzlösung, während die 3 anderen Posten eine i.p. Injektion Zyklophosp.hamid in der suboptimalen Dosis von 8D mg/kg erhalten. Diese mit Zyklophosphamid injizierten Tiere werden anschließend folgendermaßen behandelt:

Am Tag +6 erhalten die Tiere eines Zyklophospharnidpostens eine Injektion IV von 0,1 ml physiologischer Hochsalzlösung. Sie dienen zur Messung des Überlebens der mit Zyklophosphamid behandelten Mäuse. Die Tiere eines "BCG"-Postens erhalten eine Injektion IW von 1 mg/Maus BCG des

209 387 -«β-

Pasteur-Instituts mit einem Volumen von 0,1 ml. Sie dienen zur Kontrolle der aktiven Immunotherapie nach der Zyklophosphamid-Verabreichung, wobei sich das BCG als wirksam unter diesen Bedingungen erwiesen hat.

Die Tiere eines mit Depsipeptid behandelten Postens erhalten eine i.p. Injektion von 50 ,ug/Maus Depsipeptid in-einem Volumen von D,5 ml. Sie dienen zur Messung der Uberlebensdauer der mit dem Testprodukt behandelten Mäuse,

In jedem Fall und bei jedem Posten wird die Überlebensdauer kü Tage lang jeden Tag beobachtet. Der Einfluß des Produkts auf die Überlebensdauer wird statistisch nach dem t-Test heuertet, wobei jeder behandelte Pasten mit seinem Hontrollposten und evt. die behandelten Posten untereinander verglichen werden.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse sind in Tabelle U enthalten. Zyklophasphamid in suboptimaler Dosis verlängert signifikant die Liberlebensdauer der Tiere, wenn diese mit der Überlebensdauer der nicht behandelten Hontrolltiere verglichen wird. Die Verbindung Zyklophosphamid-BCG verbessert die Überlebensdauer der Tiere statistisch nur auf nicht signifikante Weise, während die Verbindung Zyklophosphamid-Depsipeptid eine statistisch signifikante Verbesserung der Überlebenszeit der behandelten Tiere bewirkt. Zwischen den beiden therapeutischen Verbihdungsarten Zyklophosphamid-BCG und Zyklophosphamid-Depsipeptid kann jedoch kein signifikanter Unterschied veranschaulicht werden.

209 387

Schluß:

Dieses Experiment zeigt, daß das erfindungsgemäße Depsipeptid die Überlebensdauer der Mäuse, die vorher 10 lebende L121D-Zellen erhalten haben und mit Zyklophasphamid behandelt uurden, verlängert..

Die erhaltenen Ergebnisse liegen in der gleichen Größenordnung wie die mit BCE erzielten, es muß jedoch bemerkt uerden, daß die Untersuchung mit Posten von nur 10 Tieren erfolgte. Das ermöglicht es nicht, eine wirklich signifikante Differenzierung auf der Ebene der statistischen Analyse vorzunehmen.

Tabelle V

Posten	Behandlung	Anzahl der Ti ere	Überlebenszeit in Tagen (Mittel + Standardabüj.)
A.	Kontrolle L1210	10	12,50 + D,IS
B	Zyklophosphamid	10	19,50 + .2,58
C	Zyklophosphamid BCG	10	24,90 +3,58
D	Zyklophosphamid + Depsipeptid	10	29,70 + 3,77

Die Bedeutung der Differenz zuischen den verschiedenen Posten tdird mit dem t-Test untersucht:

Posten A - Posten B=P 0,02 Pasten B - Posten C = nicht signifikant Posten B - Posten D = P 0,05 .

Posten C - Posten D = nicht signifikant

209 387 -ns·-

f) LJirkunq des DEpsipeptitis auf die Vermehrung der

Lymphozyten und Makrophaqen

Es wird die von J. LJ. Hadden and Cowork beschriebene Methode angewendet, um durch ϊπ-vitra-Versuche die Vermehrung der Lymphozytsn unter dem EinfluB von T-Mitagenen, die durch das Lymphokin induzierte Vermehrung der Makrophagen und die Aktivierung der MakrQphagen in ihrer Fähigkeit, die Zellen von Listeria monocytogenes zu zerstören, zu veranschaulichen.

In diesem Test werden menschliche LymphDzyten, die aus dem peripheren Blut gewonnen wurden, verwendet. Die Vermehrung der Lymphozyten unter dem Einfluß von Phytohämagglutin wird durch Messung der Inkorporation von tritiümmarkiertem Thymidin bestimmt. Das Depsipeptid von Fusarium equiseti wurde in Anwesenheit von suboptimalen, optimalen und supraoptimalen Mengen Phytohäraagglutin, d. h. 0,001, 0,01 bzw. 0,1 Einheiten/ml getestet.

Die durch das Lymphokin (MMF) induzierte Vermehrung der Lymphozyten wurde durch Messung der Inkorporation von tritiummarkiertem Thymidin nach 3 und 5 Tagen Züchtung bestimmt.

Die Aktivierung der Fähigkeit der Makrophagen, die Zellen von Listeria zu lysieren, die durch das.Lymphokin-(M AF-) nach 5 Tagen Züchtung bei vorhandenem MAF oder bei fehlendem MAF induziert wird, wurde während einer Hontaktzeit von 6 Stunden veranschaulicht (Hadden Immunopharmacology Ξ. 279 - 313 (1977)).

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Der Phagozytosegrad wird nach einem Hantakt von 20 min mit Zellen von Listeria manocytogenes mengenmäßig bestimmt. Es werden die Makrophagen ausgezählt, die Bakterien enthalten und die Bakterienanzahl pro Makrophagenzelle·

Die bakterizide Wirkung der Makrophagen wird heuertet, indem die Anzahl von Zellen, die Bakterien enthalten, und die Anzahl von Bakterien pro Zelle 6 Stunden nach dem 2o minütigen Kontakt bestimmt werden.

Das erfindungsgemäße Depsipeptid wurde experimentell

-h bei Dosen zwischen 5.10 und 5/ug erprobt. Es ist fest-

~k zustellen, daß Depsipeptid in dem Bereich zwischen 5.10 und 0,5*ug die Inkorporation von tritiummarkiertem Thymidin in die Leukozyten, die entweder mit einer optimalen Dosis Phytomägglutinin Dder mit einer suboptimalen Dosis Phytohämagglutinin stimuliert wurden, erhöht.

Die höheren Dosen dagegen verringern sehr bedeutsam die Inkorporation von tritiummarkiertem Thymidin und veranschaulichen so die zytostatisehe Wirkung des Produkts.

Eine ähnliche Wirkung ergibt sich bei menschlichen Isukämischen Zellen und bei Makrophagen, die mit einer optimalen Dosis MMF aktiviert wurden.

g) Bestimmung der akuten Toxizität Die mittlere letale Dosis des erfindungsgemäßen Depsipeptids wurde an Posten von 10 heterogenen Mäusen aus dem CD-Stamm oder an Posten von Ratten.aus dem Uiistar-Stamm bestimmt, die das zu.testende Erzeugnis entweder in Suspension in einem wässrigen Lösungsmittel oder in Lösung in Isopropylmyristat erhielten.

Claims (2)

1. 209 387

   Das Produkt uiird entueder bukkal, intraperitoneal ader intravenös in zunehmenden Dosen verabreicht. Die Tiere werden 8 Tage unter Beobachtung gehalten und die toten Tiere, sofern vorhanden, ausgezählt.

   Die mittlere letale Dosis wird graphisch nach der Methode von Lichtfield und Ldilcoxon bestimmt.

   Folgende Ergebnisse wurden erzielt:

   a) Wässrige Suspension · · · Bei der Maus per os DL₅.-. = 5000 mg/kg intraperitoneal DL__Q = 67 mg/kg intravenös DL₅₀ = 17 mg/kg

   Bei der Ratte per DsDL₅₀ = 5000 mg/kg intraperitoneal DL^_n = 67 mg/kg intravenös DL.' _Q = 11 mg/kg

   b) In Lösung in Isoprapylmyristat Bei der Maus intraperitoneal männliche Maus ^'-sn ⁼ 169 mg/kg weibliche Maus ⁰L_5n = 182 mg/kg intravenös

   männliche Maus ^cn ⁼ ^ mg/kg ueibliche Maus DL₅^ = i*1 mg/kg

   Die sich aus der intraperitonealen oder intravenösen Verabreichung ergebenden toxischen Phänomene scheinen zum großen Teil auf den physikalischen Zustand der im wässrigen Träger aufgeschwemmten Teilchen zurückzuführen zu sein. In Lösung in Isopropylmyristat weist Zyklodepsipeptid eine wesentlich gemilderte Toxizität auf. '

   Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Herstellung einer biologischen Substanz und gegebenenfalls deren pharmazeutischer Verabreichungsform, wobei die G-r und struktur die eines Depsipeptide ist das durch Hydrolyse in saurem Medium H-Methylvalin, N-Methylisoleuzin und N-Methyl-allo-isoleuzin freisetzt, und deren ökonomisch geführte Hydrolyse das Lakton von OS-Hydroxy-isovaleroyl-N-methylvalin, das Lakton von ©G-Hydroxy-iso-valeroyl-N-Methyl-isöleuzin und das Lakton von oC -Hydroxy-isovaleroyl-N-methyl-allo-isoleuzin ergibt, gekennzeichnet dadurch, daß eine Kultur von Pusarium equiseti einer aeroben Gärung im Tieftank ausgesetzt wird, das Myzel am Ende der -Gärung gesammelt wird und durch ein organisches chlorhaltiges Lösungsmittel ausgeschöpft wird, die organische Lösung separiert wird, die zum Trocknen gebracht wird, der Rückstand durch ein Kohlenwasserstofflösungsmittel wiederaufgenommen wird, die Kohlenwasserstofflösung durch ein wäßriges Alkanol extrahiert wird und . der Alkenolextrakt nach den üblichen Verfahren der Biochemie separiert und gereinigt wird sowie gegebenenfalls die so gewonnene Verbindung in ein Auflösungs- oder ein inertes nichttoxisches pharmazeutisch annehmbares Bindemittel eingemischt wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Fusarium-equisete-Kultur eine Kultur Pusarium equiseti (Corda) saccardo ist, die im "Commonwealth Miological Institut" unter der Nummer 213*107 hinterlegt ist.