SU700060A3 - Способ получени пептидов или их солей - Google Patents

Description

Дл  защиты о -аминогрупп примен ют карбобензокси или трвт,-бути-локсикарбонил или такие родственные им группы, как/ например, параметокси , паранитрб- или параметоксифенилаэокарбобензокси .

Дл  защиты (-гуанидиновой функции аргинильной группы используют протонизацию группы НО2Или паратолуолсульфонил; -аминогруппы в лизине защищаиот карбобензокси-, трет 1-бутилоксикарбонил- или пара-толуол сульфонильной группой; оС карбоксигруппу защищают метиловый этиловый или -бензиловый эфир,

В описании использованы следующие сокращени :

Аминокислоты {в левовращающей форма, кроме особо отмеченных случаев ) г Apr аргинин;Азо - 2-азе ,тидинкарбонова  кислота; Ала - алаНИН Гли - глицин Иле - изолейцин; Лей -- лейцин; Лиз - лизин; Фе - феНилаланин; Пип - пипеколинова  кислота; Про пролин; Вал - валик; АцОН - уксусна  кислота; Бз - бенЗоил; КБо - карбобензокси; ДЦКИ дицикло;е ексилкарбОдиимид; ДМФ димвтилформамид; ТЭА - триэтиламин; ЭА этилацетат; ГФХ - хроматографи  с фильтрованием через гель; ОБТ - Й-оксибензотриазол; Осу 4/-ОКСИСУ1СЦИНИМИД .; МеОН - метанол; ПЫФ - паранитрофенокси; ПНА - паранитроанилид; ТБК - трет.-бутилоксикарбонил; ТФУК - трифторуксусна  кислота ТСХ - хроматографи  в тонком слое

Типы реакций,, примен емых дл  синтеза,

Дл  синтеза пептидов (см, таблицу , № XXV - XLffl) разные стадии провод т одинаковым способом, поэтому дано описание реакций разных типов и в таблице указаны промежуточные и тсонечные продукты, методы, примененные ,тш  реакций разных типов , и некоторые физические данные. Реакци  типа I, Сочетание хромофорной груапк (R),

20 ммолей Nf N-защищенного аргинина или W-f м защищенного орнитина или: лизина или соответствующим образом за1у1ещенкого производного пептида измельчают, тщательно высушивают и раствор ют в 50 мл свежеперегнанной N,N,N,N,N,N -reCclмвтиJIфocфopнoй кислоты при комнатной гёглиоратуре. Затем при перемешивании в отсутствии влаги добавл ю 20 ммолей триртиламина и 30 ммолей амина, содержащего хромофорную группу в виде его изоцианатного производного . Смесь вьтдерживают сутки, реакционный раствор вливают в 0,5 л 2%-ного раствора бикарбоната натри  при перемешивании. Образовавшийс  осадок отфильтровывают и тщательно

промывают раствором бикарбоната, водой, 0,5 н„ сол ной кислотой и снова водой. Из осеуцка продукт извлекают метанолом, Метанольный экстракт упаривают, остаток пере кристаллизовывают или чист т с помой;ью хроматографии в тонком слое.

Реакци  типа 2. Отщепление карбобензокси защитной группы (КБО)

Q 10 ммолей тщательно высушенного производного карбобензокси (КВО) суспендируют в 25 мл уксусной кислоты и при комнатной температуре в отсутствии влаги добавл ют 15 мл 5,6 н.раствора НВГ в уксусной кис- лоте. Через 45-60 мин реакционный

раствор по капл м и при энергичном перемешивании вливают в 800 мл безводного эфира. Выпавший осадок отдел ют и промывают 2-3 раза эфиром

0 порци ми по 100 м/ Полученный бромгидрат N -деблокированного соединени  сушат над таблетками гидроокиси натри  в вакууме при 40°С в течение ч,

5 Реакци  типа 3, Отщепление трет,-бутилоксикарбонильной защитной группы (ТБК).

10 ммолей тщательно высущенного ТБК - производного раствор ют в

0 200 мл 25%-ного раствора трифторуксусной кислоты в , в отсутст зии влаги при комнатной температу-. ре. Спуст  20 мин раствор по капл м вливают в 500 мл безводно1О эфира. Выпавший осадок отфильтровывает и тщательно промывают эфиром. Полученный трифторацетат Н --деблокированного соединени  сушат над таблетками гидроокиси натри  з вакууме

0 при 30°С 2-3 ч.

Реакци типа 4 .Деблокирование с -аминогруппы .

При ацилировании производного,полученного при реакции типа 2 или 3,

5 должна,, присутствовать свободна  oi,-аминогруппа. Деблокирование этой группы осуществл ют разными пут глИ; например добавл ют один эквивалент- безводного третичного амина (триэ0 или К-зтилморфолина) к раствору производного НВг- или трифторуксусной кислоты в диметилформамиде , охлажденному до . При применении триэтиламина и НВгс производных,выпавший в осадок триэтиламин , гидр обр .E( удал ют фильтрованием .

Claims (2)

1. Производные с КВг или трифторуксусной кислотой можно также растворить в растворе бикарбоната натри , из которого выдел емое производное экстрагируют, например этилацетатоМр а затем органическую фазу сушат и упаривают. Реакци  сочетани : , А. С производным Н-эащищенного эфира. К раствору 10 ммолей производного пептида или аминокислоты, вы деленного в 20-50 мл свежеперегна ного диметилформамида, добавл ют 11 ммолей ,№-защииенного паранитрофенил- или N-оксисукцинимидозфи производного аминокислоты при --lO Смесь выдерживают 1 ч при , затем добавл ют к ней в качестве буфера 5 ммолей третичного амина. Охлаждение убирают, температура реакционной массы самопроизвольно повышаетс  до комнатной. За ходом реакции наблюдают с помощью TCDC. В случае необходимости реакционную массу охлаждают вновь и добав л ют 5 ммолей основани . По окончании реакции раствор упаривают пр пониженном давлении, полученный маслообразный остаток смешивают с двум  порци ми воды и чист т перекристаллизацией или гельфильтрацией . При хроматографии фильтрованием через гель, примененной дл  очистки продукта, объем элюента полностью или частично совпадает с объемом производного активного эфира сочетаемой аминокислоты. По окончании реакции (перед выпариваниём ) неизрасходованное производное активного эфира замен ют в течение 30 мин при комнатной темпе ратуре избытком (3-5 ммолей) первичного , например бутиламина , Б. С N -защищенной аминокислотой или пептидом. Образование акти ного эфира по ходу реакции. К раствору 10 ммолей указанного производного пептида или аминокисл в 20-50 мл свежеперегнанного диметилформами а , 11 ммоле и М -защищенной аминокислоты или соответстЕую-иим образом защищенного произйодного пептида со свободной С-кон цевой карбоксильной группой добавл ют 11 ммолей N-оксибензотриазола или N -оксисукцинимида при В течение ,1-3 ч температуру реакционного раствора (-10°С) повышают до комнатной. За,ходом реакции след т с помощью хроматографии в jOHKOM слое. По окончании реакци раствор вливают при перемешивании в 100-300 мл 5%-ного водного раствора бикарбоната натри . Полученный осадок отфильтровывают и промывают водой. Затем чист т методом гель-фильтрации или перекристаллизацией. Реакци  типа 5. Отщепление всех защитных групп, очистка и ионный обмен. 0,2 - 1,0 ммоль защищенного производного пептида с хромофорной группой деблокируют обработкой 5-20 мл безводного HF- в присутствии 0,21 ,0 мл анизола в аппарате Сакакибара, в течение 60 мин при 0°С. После окончани  реакции и отгонки всего Нр,- сырой продукт раствор ют в 33%ном водном растворе уксусной кислоты и раствор чист т с помощью гель-фильтрации. Продукт сушат лиофилизацией , затем подвергают ионному обмену в колонке, содержащей слабо основную ионообменную смолу. Сефадекс (R)Q АЕ - 25 в виде хлорида выдерживают до набухани  в смеси метанола и воды (95:5), Дл  растворени  и элюировани  используют эту же смесь. Чистый продукт сушат при температуре ниже и пониженном давлении. Полученный продукт раствор ют в метаноле и раствор внос т в колонку подход щего размера (объем 0,5 - 7,5 л, длина 100 см), заполненную сефадексом (К)Н - 20, набухшем в метаноле. Дл  элюировани  используют этот же растворитель. Элюат раздел ют на фракции подход щих объемов и непрерывно определ ют их УФ-абсорбцию (254 нм.). Фракции, содержащие продукт, провер ют на чистоту методомТСХ, чистые фракции объедин ют и упаривают. Производные пептида, полученные после удалени  защитных групп с помощью HF (аналогично реакции типа 5), в виде 30%-ного раствора в водной уксуснойкислоте внос т в колонку (объем 0,5 - 2,0 л, длина 30см), заполненную сефадекром (R)G-15, набухшим предварительно в водной уксусной кислоте, продукт элюируют тем же растворителем. Фракции, содержащие продукт (контроль УФ абсорбци  при 254 нм), объедин ют, концентрируют в вакууме на роторном испарителе при 25°С, затем сушат при температуре ниже . Хроматографи  в тонком слое. Стекл нные пластинки покрывают тонким слоем кизельгел  F (Мерк).. Дл  про влени  используют следующие системы растворителей (объемное соотношение): А - бутанол-уксусна  кислота - вода (3:2:1) ; Р - хлороформ - метанол (9:1); P-j/a- хлороформ-метанол (19:1). По окончании хроматографии пластинку исследуют в УФ-свете (254 нм) и обрызгивают реактивом - хлорортотолуидином . ff--i J Tlxf Формула изобретени  Способ получени  цептидов об1Ц€1й формулы l ,-A,
2. 2. NHR, где А4 аланил-, валил-,.лейцил-, пропил-, пипеколинова  -кислота А аланил валил-, глицил-, лейцил-, изолейцил-, фенилаланил- , азетилинкарбонова  кислота; А - аргинил-, лизил; R - нитрофенил; или их солей, . f личающийс  тем, что соединение общей формулы , где R имеет указанные значени , псдверггиот взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетани  остальных аминокислот, причем R используют в качестве защитной группы дл  С-концевого карбоксила ,п первой аминокислоты. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе . Шредер Э., Любке К. Пептиды, ч« 1 - Москва; Мир, 1967, с. 116,