[go: up one dir, main page]

SE407571B - Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser - Google Patents

Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser

Info

Publication number
SE407571B
SE407571B SE7507974A SE7507974A SE407571B SE 407571 B SE407571 B SE 407571B SE 7507974 A SE7507974 A SE 7507974A SE 7507974 A SE7507974 A SE 7507974A SE 407571 B SE407571 B SE 407571B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
substrates
group
omm
reaction
pna
Prior art date
Application number
SE7507974A
Other languages
English (en)
Other versions
SE7507974L (sv
Inventor
L E Aurell
K G Claeson
B G Karlsson
S I Gustavsson
G A Olausson
Af Ekenstam B Thuresson
Original Assignee
Kabi Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabi Ab filed Critical Kabi Ab
Priority to SE7507974A priority Critical patent/SE407571B/sv
Priority to ZA763585A priority patent/ZA763585B/xx
Priority to IL49830A priority patent/IL49830A/xx
Priority to GB25411/76A priority patent/GB1510925A/en
Priority to AT464076A priority patent/AT349648B/de
Priority to AU15304/76A priority patent/AU497546B2/en
Priority to DE19762629067 priority patent/DE2629067A1/de
Priority to NLAANVRAGE7607433,A priority patent/NL187693C/xx
Priority to CS764543A priority patent/CS199631B2/cs
Priority to CH887176A priority patent/CH622285A5/de
Priority to NO762406A priority patent/NO142812C/no
Priority to CA256,705A priority patent/CA1081212A/en
Priority to DD193794A priority patent/DD127320A5/xx
Priority to ES449738A priority patent/ES449738A1/es
Priority to DK312776A priority patent/DK146937C/da
Priority to PL1976191067A priority patent/PL103098B1/pl
Priority to FI762009A priority patent/FI56524C/fi
Priority to IT50363/76A priority patent/IT1062604B/it
Priority to FR7621195A priority patent/FR2317278A1/fr
Priority to BE168773A priority patent/BE843969A/xx
Priority to SU762379653A priority patent/SU700060A3/ru
Priority to JP51082441A priority patent/JPS5224581A/ja
Publication of SE7507974L publication Critical patent/SE7507974L/sv
Priority to US05/888,586 priority patent/US4137225A/en
Priority to US05/955,441 priority patent/US4214049A/en
Publication of SE407571B publication Critical patent/SE407571B/sv

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/10—Anilides
    • C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

75079714-9 2 återfinnas sådana som har bensoylerad Nïtêrminal ända'och'en”_ kromofor grupp kopplad till den C-terminala ändan, t ex: Bensoyl~Al-A2-A3-p-nitroanilid I där Ai, A2, A3 betecknar aminosyror.
Med specifika aminosyrasekvenser kan bland dessa substrat er- hållas sådana som har speciell känslighet för visst eller vissa enzym. Substraten ger vid enzymatisk hydrolys upphov till den kromofora produkten p-nitrdanilin, som lätt kan mätas spektro- fotometriskt. Dessa substrat har emellertid en begränsning i sin relativt låga löslighet (5- 1 mg/ml). låg löslighet gör att man, för att nå nöjaktig substratkoncentration, måste ar- beta mycket nära mättnadsgränsen för substraten. Vid enzym- bestämningar i olika biologiska system kan man därför råka ut för antingen utfällning av substratet enbart, eller en kombinerad protein/substrat-utfällning; Dessa utfällningar orsakar felaktiga spektrofotometeravläsningar och därmed felaktiga enzymbestämningar.
De bensoylerade enzymsubstraten enligt typ I blir avsevärt lättlösligare, om den N-terminala bensoylgruppen ersätts med H; Den nu fria protoniserade aminogruppen på aminosyran Al ökar lösligheten, men orsakar emellertid också att hastig- heten med vilken enzymet spjälkar substratet avtar (se ta- bell II). Dessutom kan substraten nu i en biologisk prov- lösning, på ett icke önskvärt sätt, nedbrytas från den N- terminala ändan av aminopeptidaser.
Vi har nu enligt föreliggande uppfinning oväntat funnit att om man i ett för ett visst enzym ur aktivitetssynpunkt till- fredsställande substrat enligt formel I byter ut bensoyl- gruppen mot H och samtidigt ersätter aminosyran Alzs hittills använda L-form (L-Al) med dess D-form (D-Al) så är det erhåll- na nya substratet som väntat mycket lättlösligt, men sub- stratets aktivitet mot enzymet minskar inte genom införandet av en D-aminosyra, utan är helt överraskande flera gånger bättre än motsvarande substrat med enbart L-aminosyror samt ofta t o m påtagligt bättre än det bensoylerade goda utgångssub- stratet enligt formel I. Den N-terminala fria D-aminosyran i det nya substratet hindrar även icke önskvärt angrepp av -..mb v, 3 7507974-9 aminopeptidaser, ty dessa är specifika för E-amïndsyrör.l* * De nya kromogena substraten enligt uppfinningen kännetecknas av följande allmänna formel: H - D-A1 - A2 - A3 - NH - R eller salter därav, där A1 och A2 kan vara utvalda bland aminosyrorna Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pip, Pro, Aze, A2 kan dessutom vara Phe, A3 kan vara utvald bland Arg, Lys och Orm R är nitrofenvl. (Anaående förkortninoar se sid 4.) \ 1 i É É u i Vid synteserna av de nya kromogena enzymsubstraten används konventionella, inom peptidkemin väl kända, skyddsgrupper och kopplingsmetoder.
Som a-aminoskyddsgrupp används med fördel karbobensoxy- eller t-butyloxykarbonylgruppen, eller någon med dessa besläktade som t ex p~metoxy-, p-nitro- eller p~metoxyfenylazo-karbo- bensoxygruppen.
Som skydd för arginylrestens Cf:guanidogrupp används med för- del protonisering, N02 - eller p-toluensulfonylgruppen.
Som skydd för-Öïaminogruppen i ornitin och för E}aminogruppen i lysin används framförallt grupperna karbobensoxy, t~butyloxy- karbonyl- eller p-toluensulfonyl.
Som avspjälkbar a-karboxylskyddsgrupp brukas lämpligen metyl- etyl- eller bensylester. _ Kopplingen mellan två aminosyror eller en dipeptid och en aminosyra åstadkommas genom aktivering av d-karboxylgruppen.
Det aktiverade derivatet kan antingen isoleras eller genereras in situ och kan vara t ex pçnitrofenylf, triklorfenyl-, penta- klorfenyl-, Nehydroxysuccinimid- eller Nèhydrondensotriazol- ester, symmetrisk eller osymmetrisk anhydrid eller syraazid. 7507974-9 4p Aktiveringen till ovan nämnda esterdërivat'âstadkommëš mèd“"'"' fördel genom närvaro av en karbodiimid, t ex N,N'-dicyklo- hexylkarbodiimid, som också kan tjäna som aktiverande kopp- lingsreagens direkt mellan karboxyl~ och aminkomponenterna.
Principen för substratsyntesen kan vara stegvis påbyggnad* av aminosyrorna på den C-terminala arginylresten, antingen från början försedd med påkopplad kromoför grupp som därvid tjänstgör som karboxylskyddsgrupp eller försedd med avspjälkh bar karboxylskyddsgrupp, och den kromofora gruppen kopplas då .11111 det skyddade tripeptia-aerivater, eller så kan man som princip välja att syntetisera det N-terminala dipeptidfrag- mentet för sig, som därefter kopplas till arginylresten med eller utan kromofor grupp enligt föregående resonemang.
Oberoende av vald princip är rening av mellan- och slutpro- dukter medelst gelfiltreringskromatografi lämplig, ty denna metodik möjliggör snabbt syntesarbete och ger maximala ut- byten.
Uppfinningen beskrivs mer i detalj i följande icke begränsande utföringsexempel.
Förkortningar Aminosyror (om ej annat angives avses dess L-form): Arg = Arginin Aze = 2-Azetidin karboxylsyra Ala = Alanin Gly = Glycin.
Ile = Isoleucin Leu = Leucin Lys = Lysin Phe = Fenylalanin Pip = Pipekolinsyra - Pro = Prolin Val = Valin Vid svnteserna använda reaktionstvper . 7507974-9 övrigt AcOH = Ättiksyra Bz = Bensoyl Cbo- = Karbobensoxy- DCCI = Dicyklahexylkarbodiimid DMF = Dimetylformamid Et3N = Trietylamin Et0Ac = Etylacetat GPC 5 Gelfiltreringskromatografi HBT } N-Hydroxybensotriazol_ HMPTA a N,N,N',N',N",N" - hexametylfosforsyratriamiá HONSu = Nëflydroxysuccinimid MSÛH = Melia-ROI -0pNP = p-nitrofenoxy -pNa l = p-nitroanilid tBoc = t-Butyloxykarbonyl TFA = :rrifiuørättiksyra TLG = Tunnskiktskromatografi Sephadex Gelen Sephadefš) G-15 som används för gelfiltrering är en tvärbunden dextrangel.
Gelen Sephadexša LH-20 är en hydroxipropylerad tvärbunden dextrangel.
Jonbytargelen Sephadefâ) QAE-25 är en tvärbunden dextrangel med dietyl-(2-hydroxipropyl)aminoetyl som funktionell grupp.
Dessa geler är från Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige.
Vid synteserna av de i tabell II upptagna exemplen på nya enzymsubstrat utförs de olika reaktionsstegen i stort sett lika oavsett vilket substrat det gäller. Därför lämnas här först en generell beskrivning av olika reaktionstyper och därefter, i tabell I, en redovisning av mellan- och slut- produkter, använda reaktionstyper upparbetningsteknik samt vissa fysikaliska data. 7ö0797h-9 Reaktionstyp 1 Koppling av kromofor grupp (R) mmol N°“, NG-skyaaaa arginin eller N“, NW -skyaaaa ornitin _ eller lysin eller på motsvarande sätt lämpligt skyddat peptid- derivat, mortlad och väl torkat löses i 50 ml torr nydestillerat HMPTA vid rumstemperatur, varefter 20 mmol Et3N och 50 mmol av den kromofora aminen i form av dess isocyanatderivat tillsätts fuktfritt under omrörning. Efter ett dygns reaktionstid hälles reaktionslösningen ner i 0.5 l 2 %§natritmbikarbonatlösning under omrörning. Erhållen fällning frånfiltreras och tvättas väl med bikarbonatlösning, vatten, 0.5 N saltsyra och vatten igen. Från Éällningen extraheras önskad produkt med t ex i metanol, varvid vissa biprodukter ej går i lösning. Metanol- extraktet kan efter indunstning fås att kristallisera ur lämpligt medium eller kan det renas genom GPC.
Reaktionstyp 2 _ Avspjälkning av karbobensoxyskyddsgrupp (Cbo-) mmol av det väl torkade Cbo-derivatet slammas i 25 ml torr Ac0H vartill sättes 15 ml 5.6 N HBr i AcOH under fuktfria betingelser vid rumstemperatur. Efter 45-60 min reaktionstid neddroppas lösningen i 300 ml torr eter under livlig omrörning.
Eterfasen sugs av erhållen fällning, som tvättas med 2-3 por- tioner à 100 ml eter. Sålunda erhållen hydrobromid av Na-de- blockerad förening torkas över NaOH-tabletter i vakuum vid 4o°o i 3 - 16 tim.
Reaktionstyp 5 Avspjälkning av t-butyloxykarbonylskyddsgrupp (tBoc-) mmol av det väl torkade tBoc-derivatet löses i 200 ml 25 % TFA i CH¿0l2 under fuktfria betingelser vid rumstemperatur.
.Efter 20 min reaktionstid neddroppas lösningen i 500 ml torr eter. Efter filtrering av erhållen fällning tvättas den riks ligt med eter. Sålunda erhållet trifluoracetat av Na-deblockerad förening torkas över Neon-tabletter i vaxuum via 3o°c 2-3 tim.
Reaktionstyp 4 Kopplingsreaktioner Frisättning av a-aminogruppen 7507974-9 För att kunna acylera de i reaktionstyp 2 eller 3 erhållna derivaten måste a-aminogruppen föreligga som fri bas. Frisätt- I ningen kan utföras på många olika sätt. Bl a kan en ekvivalent mängd tertiär amin (t ex Et3N eller Nëetylmorfolin) tillsättas en till -1o°c kyia DMF-lasning av Her- eller TFA-aerivatet. I fall med Et3N och HBr-derivat filtreras utfälld Et3N-Hßr av, Eller så kan HBr- eller TFA-derivatet lösas i 5 % natrium- bikarbonatlösning varifrån det frisatta derivatet extraheras över i t ex EtQAe eller butanol, varefter organfasen torkas och indunstas.al ' e) med N“-ekyaaåt aktiv eeterderivat. i à 5 Till en lösning av 10 mmol enligt ovan frisatt peptid- eller amino- gsyraaerivet 1 20-so m1 nyaestillerea DMF satte via -1o°c 11 mmol Na-skyddat p-nitrofenyl- eller Nëhydroxysuccinimid-esterderivat av den aminosyra som skall kopplas på. Efter 1 tim reaktionstid vid -lO°C buffras lösningen med 5 mmol tertiär amin, och får därefter långsamt antaga rumstemperatur. Reaktionsförloppet följes lämpligen med TLC-analyser. Om så fordras tillsätts ytterligare 5 mmol bas efter ny nedkylning. Efter avslutad reaktion indunstas lösningen på rotavapor till oljig återstod, som omröres med ett par portioner vatten. Äterstoden renas genom GPC eller omkristallisation. I de fall GPU används för rening av kopplingsprodukten och denna har en elueringsvolym som helt eller delvis sammanfaller med den för det aktiva ester-derivatet av den påkopplade aminosyran, så kan konta- minering av kopplingsprodukten undvikas om efter avslutad reaktion, men före indunstningen, oförbrukat aktiv esterderivat omsätta med ett överskott (3-5 mmol) av en primär amin t ex n-butylamin under min vid rumstemperatur. Därefter upparbetning enligt ovan, b) med Na-skyddad aminosyra eller peptid och generering av aktiv ester in situ. i Till en lösning av 10 mmol enligt ovan frisatt peptid- eller aminosyraderivat i 20-50 ml nydestillerad DMF sätts vid -lO°C 1 ll mmol Na-skyddad aminosyra eller på motsvarande sätt skyddat peptidderivat med C-terminalt fri karboxylgrupp, ll mmol HT eller 7507974-9 ¿Erhållen fällning tvät _ grupp avskyddas genom reaktion med 5- 8 HONSu samt ll mmol DCCI. Efter l-3 tim vid -l0° ningen antaga rumstemperatur. Reaktionsförloppet följs lämpligen med TLC-analyser. Efter avslutad reaktion hälls lösningen under. omrörning ned i 100-300 ml 5% NaHCO3 (aq). 0 får reaktionslös- tas med vatten efter fifitrering eller ae-e Ékantering. Äterstoden renas genom GPC eller omkristallisation.
¿ Reaktionstyp 5 _ iAvspjälkning av samtliga skyddsgrupper samt rening och jonbyte. 0.2-1.0 mmol av det skyddade peptidderivatet med önskad kromofor ml torr HF i närvaro av 0.2-1.0 ml anisolzi en för detta avsedd apparat enligt Sakakibara under 60 min vid 0°C. Efter avslutad reaktion och det att all HF . destillerats av löses råprodukten i 33 % genom GPC. Produkten isoleras genom frystorkning ur utspädd Ac0H och jonbyts på en kolonn med en svagt basisk jonbytare SEPHADEX QAE%25 i kloridform, svälld i Me0H:vatten 95:5 med samma medium som lösnings- och elueringsmedium. Ren produkt frystorkas ur vatten.
AcOH i vatten och renas Gelfiltreringskromatografi Genom GPC av skyddade peptid- eller aminosyra» eller indunstade moderlutar efter kristallisation erhålles en förenklad upparbetningsprocedur och optimala utbyten. Substansen löses därvid i Me0H och överförs till en kolonn av lämplig storlek (volym 0.5-7.5 l, längd 100 cm) packad med SEPHADEX LHL20 svälld i Me0H och eluerad med samma lösningsmedel. Eluatet fraktioneras i lämpliga delvolymer och dess UV-absorption (254 nm) mäts kontinuer- ligt. Produktinnehållande delfraktioner renhetskontrolleras med TLO och de rena förs samman och indunstas. derivat, râprodukter För rening av peptidderivat efter avskyddning med HF enligt 5 överförs den 30% Ac0H (aq)-lösningen av råprodukten till en kolonn av lämpli storlek (volym 0.5-2.0 l, längd 60 cm) packad med SEPHADEšíêG-IS svälld i 30 % .AcOH (aq) och eluerad med samma lös- ningsmedel. Efter förfarande enligt ovan frystorkas produktinne- hållande rena delfraktioner ev efter delvis indunstning på rota- vapor vid 25°0. nu l f 7507974-9 Tunnskiktskromatografi Vid TLC-analys används färdigprparerade glasplattor med Kiselgel F254 (Merck) som absorptionsmedel. Använda lösningsmedássystem är (volymförhål1anden): - A: n-butanol: AQOH: vatten (3:2:l) fl: Kloroform: raèofl :- (9=1) På Kloroform: Me0H (l9:l) Efter avslutad kromatografering studeraslplattan i UV-ljus (254 nm) och framkallas_därefter med klor/0-toluidinreagens enligt gängse förfarande. Angivna Rf-värden är resultat frånlenstaka kremato- graferingar.
Bestämning av serinnroteaser medelst kromogena substrat De enligt exemplen framställda substraten användes för bestämning av olika enzymer enligt följande, Principen för bestämning är baserad på att den vid enzymatisk hydrolys bildade spjälkningsprodukten uppvisar ett från substratet i huvudsak skilt Uvßspektrum. Sålunda har t ex alla p-nitroanilid- substrat enligt uppfinningen absorptionsmaxima omkring 310 nm med den molära extinktionskoefficienten ungefär 12000. Vid 405 nm har dessa substrats absorption nästan helt upphört. p-Nitroanilin som avspaltas från substraten under den enzymatiska hydrolysen, har ett absorptionsmaximum vid 380 nm med en molär ektinktionskoefficient 13200, som vid 405 nm endast har avtagit till 9620. Genom att spektro- fotometriskt mäta vid 405 nm kan man därför lätt följa mängden bildad p-nitroanilin, som är proportionell mot graden av den enzymatiska hydrolysen, som i sin tur bestäms av den aktiva mängden enzym. Tabell Il visar en jämförelse av relativa reaktionshastigheter mellan tidi- gare kända substrat enligt formel I, deras icke bensoylerade former samt substrat enligt uppfinningen. Av denna tabell framgår klart överlägsenheten av substraten enligt uppfinningen.
Sålunda är substrat enligt uppfinningen flera gånger bättre än motsvarande substrat med Nëterminal L-aminosyra, samt dessutom minst lika bra som de tidigare som bästa substrat ansedda bensoyle~ rade substraten enligt formel I. Vidare är de nya substratens mycket större löslighet (ca 20-300 ggr) en mycket stor tillgång vid enzym- bestämningar framför allt i biologiska system, där tidigare substrats svårlöslighet utgjorde svårbemästrade problem, dels på grund av att substratmättnad inte kan uppnås och dels på grund av risk för oönska- de utfällningar. 7507974-9 ^H.NHv>.HH ^@«.ov« ^.Hw| OHN N» m ^H°as wN.ov HH H>H Ham N.|H|m ^N.HHVN.NH ^w«.ov< ^ >H Ham N. zH|wH<|smH|@HH1H|m HN.NHv>.HH ^o«.ov< ^ >HH HømN.1H1m ^@.NHvH.NH ^wm.ov< ^HH| Umm NN W ^H°aa w«.Hv >H HHHH How N.|H|m ^mofHv . ^w@.@~¶w ^HvH~>H+ »mHHH cm NN .H HzHo|H@>|H|°no .H HHH |n|°po H ...Hwwww .^o>.ovHH ^sVH.>N| + UHN »N Q* .m mo|wHH|H|U°m« .H HH ^Nw.øvwH .^nV>.«| NHN «> NN .M HzHo|s»H|°°m@ .HH H ^N«.oVHH ^Hv>.H+ ñmwmww Hm NN .N HzHo|HN>|n|°pu .HH> HH |n|opo o ^wn.ovHH ^=Mm.N« omv Nm HH .N mo|NHH|n|o°mp.HH> HHH> 1 . H esïm? . . N _ Hmm OV H Hav» n+ ».oHN mm NH N mzHo|s@H|onø H HH> ^o«.ovHH ^nvo.«N| omw HN NN .N HzHo|Hm>1n|opo .> H> |°pu ^om.ovHH ^nvN.wN| UHN NN NH .N Hz@o|HHH|°@o .H > ^wm.ovHH ^nvN.@N+ omm mß NN .N HzHo|Hm>|H|°po .HHH >H |n|°pø. ^wN.oVHH ^Hvo.mH| omm mm NH .N HHHo|°HH|°no .H HHH .n Qmøå _ .mämæoomwflæfiwmlwozlßw ^N>.oV H Hzvmwwf HWHHH HN H a ..., vmflmæoowwflænwulwozlm ^Hm.ovHw ^Hvm«øN+ omm HN H _ mo|^NozVNH<|°po H . . som”. m.. N. .pfiwmmww Howw Hfvwmfiöv npwpfiwmwm @pHwww HnwHw@wmmm HNHH«»NewN:NwPw .Hz Hxøflosw .H H Aflmmmía 7507974-9 l .l 33 møå *om läáowslav .Énußv “Håwswwaämwfl åånmó nu Jwcov ä wnšwmmp v? Ca Amdämdfl 36.84.. Éäçb.. vä »w m Soasswdv HN H55 Sw wàzfiïwhn|smnafiw>|nam ¶ Édäoáfi ñïïoï. A456? ¶ PE ä. m Ûøaa 3.8 HM äm mèzmuwannsmn|mflwnnnm .Howp w Mëšw ^ mv n mnfls G3 ma» Åman .Zwäào vä Qiäcå :ubfisägb minä dä wwficmw Hmflfimawwšwps. .Hz ßäzšnm. .d H Hflmmäfi muïuom f-./~f~ínfê nFIRLITY 75Û797lv9 MO 02 HNHšHNH ÉöH NN .HH .N HHošHnHATBo .HHunoH HEOOH HHHHH-ânovmšàpmèkïnàno HHoHšH HNNÉHH HNHHVH å NH. .N nHzmoöHHnHöom .HH HHUUOH :NáHflH omv HN NH. .N .HzHHoLaHAHAño .H5 HHHOHN .SHHINozvNHH.r.a.H|=QHAH-°no HNNHVVHHH omm 5 NH. .N mzHHoåHHnHávoå .NHNN ä HNZÉNozäH<$H~HAHH~H-n-.:Ho .NNÉHHH omm HH. å .N moåkHAHfåø .HHHHHN Moon HHz.H\HNozvN.H<&H_~H-2:H-NH.Bo HNNåHHH :HE°H_.N| omo 3 NH. .N nHzmoèfiHàno .H NHÜH HHZHHANOZVNNHHINHHHHÉHQ HmïâHflH ofiHo 2. NH. .N .HznoHëïnèno .HHEUH HHHHCUH HNHxeHnH omm 2 NH. .N nHzNoàåèpo .H HHšoH HHZHHANOHHYNHTNNHHFSHU n GNåHAH omm 2. NH. .N .Hzmoàëfnéfi .EUH Sve» .ÉHINOZVNHHHRHNNTHëHAHóHHU H _ moHšH N Hâš m HEONJ... .æå Hæ NH. .N .NzHHoHNïÉo .H BR Nzï ozvN..<-H..>¿.Ho HNQQHHH ofiHø HN NH. .N .HznoàunàHàno .HHHHQH HHHHOH <2:NozäNHHåHH¿ö_H-n-°HHo SNáHHH HHH.°N.N+. _ oNHø _. 2. NH. .N mzHoàHHèno .H HHHxv.
NNäHH omm NN NH. .N ...HzHHoàqHáHèno .HHOH HHHHN H HHomšH N NHá m :à ...år Éå NN äxN “Hzaoäøàßo .H HHoH .NHHHI czšN<|>Ho-°.Hu O HH onHø ä NH. .N nHzHo¿H<-n..°.Ho.HHuH HcH H _ HHoHšH _ _ N :Nä nH AHHVQÉN + .HNÉH 3 ä. .N nHzfiHoßNëènu .H HEH _ 02 _ msonrøw . CE _ .wHHHHHHmn ...ß Qåáwwp _ _ HHHwwLHO .ÜAB ~ . E :HHNHHHHD ...HÉHHF :Eu muHEHm HHHHHoHHHHHHmwHHmmHD .HZ fiHHHwoHnH Q? *m _ _ .N H HHAHmGB wQHOM 7507974-9 n 122.2 Ammaï må omm- omm mm m :QEE må Emmmmm Edm mona .mmzmmnmmmfmmmémmàmm 233.3 .mmaï míoïä- omm ä. m mmmëimïà 50mm mdm ämm . mäïïmm Ammar» šoïmm' . omm mm. m :mšfimaommmm mfim Bmw . mJQmam Ammar» mama: - omm S m 308.: ïâmmmmm dm Bmw . mšmšám Ammxmä. šemmm- omm E. m mnšfi mmämmmñmm mmummom 6.3 .mmzmïmmmåmmfmmmïmmmm ñmmëäm näs? šoïmm- omm mm m :OBH mmšmåmm EBmmom Umm ..=m.m-mm-m _ mfišám mms? Éoomtmm- omm mm m 2088 mmåšmmm Ecmoom ämm .lmzmïmåfmmmlnmqàmmm ñmmšñmm mmaxm ävdmäm» omm mm m :oëfimao Emm Ecom Emm . mmmšmmm mmmšm. šmïä- omm mm m :mšëmao omm .ñmom Hmmm .êzmmfimlmäàmmïnmm ä :öm .v _ H .Hflmmmfi murnOwm O Ro //~P/ /0 uuAUTY 0 75Û797h~9' M Substra-x; Löslighet Rel 'reåkt fiastigfieteri u n" _ mg/ml '13 Try Kal UK _ buffert ä ' Bz-Val-Pro-Arg-pNa 'O . 3 6 60 15 HëVa1-Pro-Arg-pNÅ 40 6 55 15 H-D-Val-Pro-Arg-pNa (XIII) 100 80 100 95 Bz-Val-Pip-Arg-IJNA 4 4.5 30 Hi-vai-Pip-Arg-PNA l 4 35 45 H-D-val-Pip-Arg-PNA (XIV) 100 70 100 Bz-Val-Leu-Arg-PNA “ 0 . 2 100 H-Val-.Leu-Arg-PNA ' .i- ¶ 50 H-n-val-Leu-Arg-PNA (m) soo 5 1oo Bz-Val-Leu-Lys-pNA O . 5 100 Hëval-Leu-Lys-pNA 25 HFD-Val-Leu-Lys-pNÅ (XVIII)J>l00 100 Bz-Ile-Leu-Arg-pNA 0.2 55 100 HLIle-Leu-Arg~pNA' 10 20 H-n-ne-Leu-Arg-PNA (XV) 4 75 1oo Bz-Ile-Leu-Igs-pNA l 130 fl-lle-Leu-ïays-pNA 35 H-b-ïle-ll-eu-Lys-pNA (XVII) 20 100 I tabellen ovan angives de olika substratens relativa. reaktions- hastighet i förhållande till ett för varje enzym valt referenssubstrat Beteckningar, samt referenssubstrat och deras känslighet för respek- tive enzym enligt följande: í Enzym (beteckning) Känslighet (angiven mängd Ref substr nr' ' enzym ger aktiviteten 0.1 nlcat (ADD/min = Q.0254) Trømbin m) ÅkIv 0.06 Im Trypsin Tr ') XIII 0.03 pg (Novo) Plasmin Plš XVIII 0.01 GU Kallikvein (Kal) XVI 0.2 BE Urokinas (UK) XIV 40 Ploug E ä! = 802, i wafnn.

Claims (1)

1. 750797ß-9 zmfrßwmmv 15 Nya diagnostiskt verksamma, kromogena substrat med god löslighet och hög specificitet till serinproteaser, k ä n n e t e c k n a d e av den allmänna formeln: H-D-Al-:Az-Añ-NH-R eíller salter därav, där _ 2 Al och A2 kan vara utvald bland aminosyrorna Gly, Ala, Val, Den, Ile, Pip", Pro, Aze, och A2 dessutom kan vara Phe, A3 kan vara utvald bland aminosyrorna Arg, Lys och Orn samt R är nitrofenyl. _ ' '- i ANFoRoA PUBLIKATIONER: ___._____________
SE7507974A 1975-07-11 1975-07-11 Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser SE407571B (sv)

Priority Applications (24)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE7507974A SE407571B (sv) 1975-07-11 1975-07-11 Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
ZA763585A ZA763585B (en) 1975-07-11 1976-06-16 Novel chromogenic enzyme substrates
IL49830A IL49830A (en) 1975-07-11 1976-06-17 Chromogenic enzyme substrates
GB25411/76A GB1510925A (en) 1975-07-11 1976-06-18 Chromogenic enzyme substrates
AT464076A AT349648B (de) 1975-07-11 1976-06-25 Verfahren zur bestimmung von enzymen des typus serinproteasen, bei dem aminosaeurereste ent- haltende chromogene substrate durch diese enzyme gespalten werden
AU15304/76A AU497546B2 (en) 1975-07-11 1976-06-25 Chromogenic enzyme substrate
DE19762629067 DE2629067A1 (de) 1975-07-11 1976-06-29 Chromogene enzymsubstrate
NLAANVRAGE7607433,A NL187693C (nl) 1975-07-11 1976-07-06 Werkwijze ter bereiding van een diagnostisch actief chromogeen substraat.
CS764543A CS199631B2 (en) 1975-07-11 1976-07-08 Method of producing new chromogen enzyme substrate
CA256,705A CA1081212A (en) 1975-07-11 1976-07-09 Chromogenic enzyme substrates
FR7621195A FR2317278A1 (fr) 1975-07-11 1976-07-09 Nouveaux substrats enzymatiques chromogenes
CH887176A CH622285A5 (sv) 1975-07-11 1976-07-09
DD193794A DD127320A5 (sv) 1975-07-11 1976-07-09
ES449738A ES449738A1 (es) 1975-07-11 1976-07-09 Procedimiento de obtencion de nuevos sustratos de enzimas cromogenicas.
DK312776A DK146937C (da) 1975-07-11 1976-07-09 Tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat for serinproteaser
PL1976191067A PL103098B1 (pl) 1975-07-11 1976-07-09 Sposob wytwarzania nowych chromogennych odczynnikow diagnostycznych do oznaczania enzymow
FI762009A FI56524C (fi) 1975-07-11 1976-07-09 Nya komogena substrat foer serinproteaser
IT50363/76A IT1062604B (it) 1975-07-11 1976-07-09 Substrato enzimatico cromogeno
NO762406A NO142812C (no) 1975-07-11 1976-07-09 Nye diagnostisk aktive kromogene enzymsubstrater
BE168773A BE843969A (fr) 1975-07-11 1976-07-09 Nouveaux substrats chromogenes d'enzymes
SU762379653A SU700060A3 (ru) 1975-07-11 1976-07-09 Способ получени пептидов или их солей
JP51082441A JPS5224581A (en) 1975-07-11 1976-07-10 Novel colorrproducing enzymatic substrate
US05/888,586 US4137225A (en) 1975-07-11 1978-03-20 Novel chromogenic enzyme substrates
US05/955,441 US4214049A (en) 1975-07-11 1978-10-27 Assay of serine proteases using novel chromogenic enzyme substrates

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE7507974A SE407571B (sv) 1975-07-11 1975-07-11 Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SE7507974L SE7507974L (sv) 1977-01-12
SE407571B true SE407571B (sv) 1979-04-02

Family

ID=20325115

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE7507974A SE407571B (sv) 1975-07-11 1975-07-11 Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser

Country Status (23)

Country Link
US (1) US4214049A (sv)
JP (1) JPS5224581A (sv)
AT (1) AT349648B (sv)
AU (1) AU497546B2 (sv)
BE (1) BE843969A (sv)
CA (1) CA1081212A (sv)
CH (1) CH622285A5 (sv)
CS (1) CS199631B2 (sv)
DD (1) DD127320A5 (sv)
DE (1) DE2629067A1 (sv)
DK (1) DK146937C (sv)
ES (1) ES449738A1 (sv)
FI (1) FI56524C (sv)
FR (1) FR2317278A1 (sv)
GB (1) GB1510925A (sv)
IL (1) IL49830A (sv)
IT (1) IT1062604B (sv)
NL (1) NL187693C (sv)
NO (1) NO142812C (sv)
PL (1) PL103098B1 (sv)
SE (1) SE407571B (sv)
SU (1) SU700060A3 (sv)
ZA (1) ZA763585B (sv)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1980000252A1 (en) * 1978-07-18 1980-02-21 Kabi Ab Bradykinin-inhibiting tripeptide derivatives

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH634662A5 (de) * 1976-05-28 1983-02-15 Pentapharm Ag Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren.
SE7801373L (sv) * 1978-02-07 1979-08-08 Kabi Ab Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser
US4275153A (en) * 1978-08-03 1981-06-23 American Hospital Supply Corporation Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
JPS5537120A (en) * 1978-09-06 1980-03-15 Kanji Tsuchiya Method and device for preparation of food from oilseed
JPS5559149A (en) * 1978-10-30 1980-05-02 Torii Yakuhin Kk Aminoacid derivative
JPS59499B2 (ja) * 1978-11-02 1984-01-07 味の素株式会社 ペプチド誘導体
US4327178A (en) 1979-05-01 1982-04-27 University Of Miami Urinary kallikrein assay: specific substrates and assay method
CA1161431A (en) * 1979-05-11 1984-01-31 Lars G. Svendsen Tripeptide derivatives
DE2936543A1 (de) * 1979-09-10 1981-04-09 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen
CA1161432A (en) * 1980-02-12 1984-01-31 Lars G. Svendsen Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
DE3108322A1 (de) 1980-03-18 1981-12-24 Immuno Aktiengesellschaft für chemisch-medizinische Produkte, 1220 Wien Chromogenes enzymsubstrat
DK155051C (da) * 1980-05-06 1989-07-03 Pentapharm Ag Tripeptidderivater samt fremgangsmaade til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer under anvendelse deraf
US4568636A (en) * 1981-03-25 1986-02-04 Pentapharm Ag Tripeptide derivatives
JPS57177985U (sv) * 1981-04-30 1982-11-11
US4406832A (en) * 1981-09-03 1983-09-27 Mallinckrodt, Inc. Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
US4510241A (en) * 1981-09-03 1985-04-09 Mallinckrodt, Inc. Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
JPS5863399A (ja) * 1981-10-14 1983-04-15 Nitto Boseki Co Ltd 新規なプラスミン測定用基質
US4448715A (en) * 1981-11-02 1984-05-15 University Of Miami Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein
ATE17262T1 (de) * 1981-11-02 1986-01-15 Pentapharm Ag Verfahren zur quantitativen bestimmung von blutgerinnungsfaktor xii in humanplasma.
NL8201987A (nl) * 1982-05-13 1983-12-01 Tno Werkwijze voor het bepalen van de activiteit van plasminogeenactivator van het weefseltype, alsmede voor gebruik bij deze werkwijze geschikte combinatie van het "kit"-type.
DE3244030A1 (de) * 1982-11-27 1984-05-30 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DK201084A (da) * 1983-04-28 1984-10-29 Kimberly Clark Co Fremgangsmaade til bestemmelse af cathepsin b i naervaerelse af andre proteolytiske enzymer, og forbindelser til anvendelse ved fremgangsmaaden
EP0182929A1 (de) * 1984-11-26 1986-06-04 American Hospital Supply Corporation Koaktivator zur Aktivierung von Protein C
DE3536903A1 (de) * 1985-10-16 1987-04-16 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur photometrischen bestimmung von protein c
JPS62126196A (ja) * 1985-11-26 1987-06-08 Nitto Boseki Co Ltd 新規なα１−アンチトリプシン測定用化合物
DE3710937A1 (de) * 1987-04-01 1988-10-13 Boehringer Mannheim Gmbh Chromogene verbindungen, ihre herstellung und verwendung als enzymsubstrate
JPH01112157A (ja) * 1987-07-10 1989-04-28 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd 組織プラスミノーゲンアクチベーター活性の測定法，測定具及び測定用キット
JPH0383093U (sv) * 1989-12-09 1991-08-23
GB9110298D0 (en) * 1991-05-13 1991-07-03 Fujisawa Pharmaceutical Co New peptide compound and a process for the preparation thereof
US6207399B1 (en) 1995-01-10 2001-03-27 Hendrik Coenraad Hemker Methods of determining endogenous thrombin potential (ETP) and thrombin substrates for use in said methods
CN114341154B (zh) * 2019-09-05 2024-07-30 国立大学法人东京农工大学 类胰蛋白酶活性测定用底物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE380257B (sv) * 1972-05-02 1975-11-03 Bofors Ab Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser
IL42124A (en) * 1972-05-02 1977-02-28 Kabi Ab Substrate for the determination of proteolytic enzymes
DE2527932C2 (de) * 1974-07-02 1983-04-21 Pentapharm AG, 4052 Basel Säureadditionssalze von Tripeptidderivaten und deren Verwendung als Substrate zur Bestimmung von Plasmakallikrein
SE407058B (sv) * 1974-12-05 1979-03-12 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
CH622286A5 (sv) * 1975-06-23 1981-03-31 Pentapharm Ag

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1980000252A1 (en) * 1978-07-18 1980-02-21 Kabi Ab Bradykinin-inhibiting tripeptide derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
NL7607433A (nl) 1977-01-13
NO142812C (no) 1980-10-22
IT1062604B (it) 1984-10-20
DK312776A (da) 1977-01-12
JPS5224581A (en) 1977-02-24
FI762009A7 (sv) 1977-01-12
CS199631B2 (en) 1980-07-31
DK146937C (da) 1984-07-30
DE2629067C2 (sv) 1989-08-03
AU497546B2 (en) 1978-12-14
ZA763585B (en) 1977-05-25
PL103098B1 (pl) 1979-05-31
IL49830A (en) 1978-12-17
FI56524B (fi) 1979-10-31
NO142812B (no) 1980-07-14
JPS5615238B2 (sv) 1981-04-09
CA1081212A (en) 1980-07-08
SU700060A3 (ru) 1979-11-25
NO762406L (sv) 1977-01-12
US4214049A (en) 1980-07-22
GB1510925A (en) 1978-05-17
BE843969A (fr) 1976-11-03
DE2629067A1 (de) 1977-01-13
AU1530476A (en) 1978-01-05
FI56524C (fi) 1980-02-11
ATA464076A (de) 1978-09-15
DK146937B (da) 1984-02-20
FR2317278B1 (sv) 1981-01-30
NL187693B (nl) 1991-07-16
AT349648B (de) 1979-04-10
IL49830A0 (en) 1976-08-31
FR2317278A1 (fr) 1977-02-04
NL187693C (nl) 1991-12-16
ES449738A1 (es) 1977-12-16
SE7507974L (sv) 1977-01-12
DD127320A5 (sv) 1977-09-14
CH622285A5 (sv) 1981-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SE407571B (sv) Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
US4137225A (en) Novel chromogenic enzyme substrates
CA1136124A (en) Easily split substrates for the quantification of proteases
Kusumoto et al. Chemical synthesis of N-acetylmuramyl peptides with partial structures of bacterial cell wall and their analogs in relation to immunoadjuvant activities.
Hofmann et al. Studies on polypeptides. XXXIV. Enzymic properties of partially synthetic De (16-20)-and De (15-20)-ribonucleases S'1-3
SU957762A3 (ru) Способ получени пептидов или их солей
Barlos et al. Efficient" one-pot" synthesis of N-tritylamino acids
US4061625A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
CS199673B2 (en) Method of producing polypeptides
IE56344B1 (en) Chromogenic compounds,a process for their preparation and their use
US4247454A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
US4169015A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
Camble et al. Amino-acids and peptides. Part XXX. Facilitation of peptide synthesis by the use of 4-picolyl esters for carboxy-group protection
AU602527B2 (en) Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use
ELST et al. Synthesis and conformational study of a cyclic hexapeptide analogue of somatostatin: cyclo (Phe‐D‐Trp‐Lys‐Thr‐o‐AMPA)
US4629695A (en) Peptide derivatives and use thereof as substrates for quantitatively assaying enzymes
US3749704A (en) N-(omega-amino lower alkyl)-amides of 1,17-modified acth peptides
JPS59499B2 (ja) ペプチド誘導体
EP0505428B1 (en) Chromogenic substrate
Sofuku Synthesis of a Gramicidin S Analog Containing δ-Aminovaleric Acid,[4–5-δ-Aminovaleric Acid]-Gramicidin S
KITAGAWA et al. Synthesis and activity of a newly isolated analgesic pentapeptide, neo-kyotorphin
US3304296A (en) Para-arylazophenylmethyloxycarbonyl groups as amino protecting groups in peptide synthesis
SHINAGAWA et al. Synthesis of a Highly Potent Analog of Luteinizing Hormone Releasing Hormone (LH-RH):[Des-Gly-NH210, Pro-NH-Et9]-LH-RH
Fedorova et al. Synthesis of the hexapeptides glycyl-L-valyl-L-seryl-L-prolyl-L-lysyl-L-leucine
US4596675A (en) Novel thiopeptolide substrates for vertebrate collagenase

Legal Events

Date Code Title Description
NUG Patent has lapsed

Ref document number: 7507974-9

Effective date: 19950210

Format of ref document f/p: F

NUG Patent has lapsed

Ref document number: 7507974-9

Format of ref document f/p: F