SK3862003A3

SK3862003A3 - New oxabispidine compound useful in the treatment of cardiac arrhythmias

Info

Publication number: SK3862003A3
Application number: SK386-2003A
Authority: SK
Inventors: Magnus Bjorsne; David Cladingboel; Fritiof Ponten; Gert Strandlund
Original assignee: Astrazeneca Ab
Priority date: 2000-10-02
Filing date: 2001-10-01
Publication date: 2003-10-07
Also published as: AU2001292504B2; AU2001292503A1; CN1793146A; NZ524574A; KR20030032061A; US20040039199A1; MXPA03002759A; RU2003107668A; EP1330462A1; US6936712B1; CZ2003923A3; IL154802A0; KR20030032060A; CA2422810A1; HUP0302288A2; WO2002028863A1; EP1900741A1; IL154803A0; HUP0302288A3; AR030756A1

Description

#xabispiridínová zlúčenina využiteľná pri liečení srdcových arytmií

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka novej farmaceutický využiteľnej zlúčeniny, predovšetkým zlúčeniny, ktorá je využiteľná pri liečení srdcových arytmií.

Doterajší stav techniky

Srdcové arytmie sa môžu definovať ako abnormality, pokiaľ ide o rýchlosť, pravidelnosť alebo miesto vzniku srdcového impulzu, alebo sú definované ako poruchy vodivosti, ktorá spôsobuje abnormálnu postupnosť aktivácie. Arytmie sa môžu klasifikovať klinicky pomocou predpokladaného miesta vzniku (t.j. ako supraventrikulárne, vrátane atriálnych a atrioventrikulárnych arytmií, a ventrikulárne arytmie) a/alebo pomocou rýchlosti (t.j. bradyarytmie (pomalé) a tachyarytmie (rýchle)).

Pri liečení srdcových arytmií, negatívny výsledok v klinických pokusoch (pozri napríklad výsledok Cardiac Arrhythmia Suppression Trial (CAST), uvedené v: New England Journal of Medicíne, 321, 406 (1989)) s “tradičnými antiarytmickými liečivami, ktoré pôsobia primárne spomalením rýchlosti vodivosti (trieda I antiarytmických liečiv), podnietil vývoj liečiv smerom k zlúčeninám, ktoré selektívne spomaľujú repolarizáciu srdca a takto predlžujú QT interval. Trieda III antiarytmických liečiv sa môže definovať ako liečivá, ktoré predlžujú trvanie transmembránového akčného potenciálu (ktorý môže byť spôsobený blokovaním vonkajších K⁺ prúdov alebo zvýšením vnútorných prúdov iónov) a refraktérnej fázy, bez ovplyvnenia kondukcie srdca.

Jednou z kľúčových nevýhod dodnes známych liečiv, ktoré spomaľujú repolarizáciu (trieda III alebo iné) je to, že o všetkých je známe, že vykazujú osobitú formu proarytmie, známej ako torsades de pointes (otočenie bodov), ktoré môže byť niekedy fatálnym. Z hľadiska bezpečnosti, minimalizácia tohto fenoménu (pre ktorý sa tiež ukázalo, že je výsledkom podávania nekardiálnych liečiv, ako sú fenotiazíny, tricyklické antidepresíva, antihistamíny a antibiotiká) je kľúčovým problémom, ktorý je potrebné riešiť pri poskytnutí účinných antiarytmických liečiv.

-2Antiarytmické liečivá na báze bispidínov (3,7-diazabicyklo[3.3.1]nonánov), sú okrem iného známe z medzinárodných patentových prihlášok WO 91/07405, WO 99/31100, WO 00/76997, WO 00/76998, WO 00/76999 a WO 00/77000, z európskych patentových prihlášok EP 306 871, EP 308 843 a EP 655 228 a z amerických patentových dokumentov US 3,962,449, US 4,556,662, US 4,550,112, US 4,459,301 a US 5,468,858, ako aj z časopiseckých článkov, ktoré okrem iného zahrňujú J. Med. Chem. 39, 2559, (1996), Pharmacol. Res., 24, 149 (1991), Circulation, 90, 2032 (1994) a Anal. Sci. 9, 429, (1993). Oxabispidínové zlúčeniny nie sú opísané ani navrhnuté v žiadnom z týchto dokumentov.

Určité oxabispidínové zlúčeniny sú opísané ako chemická rarita v Chem. Ber., 96, 2827 (1963). To, že sa tieto zlúčeniny môžu použiť na liečenie arytmie nie je uvedené ani naznačené.

Prekvapujúco sme zistili, že príslušná zlúčenina na báze oxabispidínu vykazuje elektrofyziologickú aktivitu, predovšetkým elektrofyziologickú aktivitu triedy III, a teda sa očakáva, že bude využiteľná pri liečení srdcových arytmií.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka 4-({3-[7-(3,3-dimetyl-2-oxobutyl)-9-oxa-3,7diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl]propyl}amino)benzonitrilu, soli benzénesulfónovej kyseliny:

NC pričom táto zlúčenina sa v ďalšom označuje ako “zlúčenina A”.

Zlúčenina A je výhodne vo forme monohydrátu.

-3Príprava

Predložený vynález sa taktiež týka spôsobu prípravy zlúčeniny A, pričom tento spôsob zahrňuje:

(a) reakciu kyseliny benzénsulfónovej so 4-({3-[7-(3,3-dimetyl-2-oxobutyl)-9oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl]propyI}amino)benzonitrilom (t.j.

zlúčeniny voľnej zásady), napríklad pri laboratórnej teplote alebo pri teplote blízkej laboratórnej teplote, v prítomnosti vhodného organického rozpúšťadla (napríklad izopropylacetátu), alebo pridaním vodného roztoku kyseliny k etanolovému roztoku voľnej zásady;

(b) reakciu 3-(4-kyanoanilino)propylbenzénsulfonátu:

s 3,3-dimetyl-1-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)-2-butanónom:

napríklad pri teplote prostredia alebo pri vyššej teplote ako je teplota prostredia, ako pri teplote medzi laboratórnou teplotou a teplotou refluxu použitého rozpúšťadla (napríklad medzi 10 a100°C, v prítomnosti vhodného rozpúšťadlového systému (ako je napríklad DMF, A/-metylpyrolidinón alebo acetonitril) alebo výhodne hydroxylového rozpúšťadla, ako je napríklad nižší alkylalkohol (napríklad C^-alkohol, ako je etanol) a/alebo vody).

4-({3-[7-(3,3-Dimetyl-2-oxobutyl)-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3yl]propyl}-amino)benzonitril sa môže pripraviť:

-4(i) reakciou zlúčeniny vzorca I

NC

L kde L¹ predstavuje odstupujúcu skupinu, ako je halogén, alkánsulfonát (napríklad mezylát), perfluóralkánsulfonát alebo arénsulfonát (napríklad 2- alebo 4nitrobenzén-sulfonát alebo výhodne toluénsulfonát) s 3,3-dimetyl-1-(9-oxa-3,7diazabicyklo[3.3.1]-non-3-yl)-2-butanónom, napríklad pri zvýšenej teplote (napríklad pri teplote medzi 35 °C a teplotou refluxu) prípadne v prítomnosti vhodnej zásady (ako je napríklad trietylamín alebo uhličitan draselný) a vhodného organického rozpúšťadla (ako je napríklad acetonitril, dichlórmetán, chloroform, dimetylsulfoxid, /V,/V-dimetylformamid, nižší alkylalkohol (napríklad etanol), izopropylacetát alebo ich zmesi), s následným spracovaním pri vhodných reakčných podmienkach, za odstránenia protiiónov, ak je to potrebné; alebo (ii) reakciou 4-{[3-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)propyl]-amino}benzonitrilu:

NC ^N H so zlúčeninou vzorca II,

O

-5kde L² predstavuje odstupujúcu skupinu, ako je halogén (predovšetkým chlór), alkánsulfonát, perfluóralkánsulfonát, arénsulfonát, imidazol alebo R²³O- (kde R²³znamená napríklad Ci_io-alkylovú skupinu alebo arylovú skupinu, pričom tieto skupiny sú pripadne substituované jedným alebo viacerými halogénmi alebo nitroskupinami), napríklad pri teplote medzi laboratórnou teplotou a teplotou refluxu, v prítomnosti vhodnej zásady (ako je napríklad trietylamín, uhličitan draselný alebo hydrogenuhličitan, ako je hydrogenuhličitan sodný) a vhodného rozpúšťadla (ako je napríklad dichlórmetán, chloroform, acetonitril, N,Ndimetylformamid, THF, toluén, voda, nižší alkylalkohol (napríklad etanol) alebo ich zmesi).

3,3-Dimetyl-1-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)-2-butanón sa môže pripraviť reakciou 9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]nonánu:

alebo jeho mono-chráneného (napríklad mono-benzylchráneného) derivátu, so zlúčeninou vzorca II, definovanou vyššie, napríklad pri podobných podmienkach, ako sú podmienky, opísané vyššie pre prípravu 4-({3-[7-(3,3-dimetyl-2-oxobutyl)-9oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl]propyl}amino)benzonitrilu (spôsob (ii)), s následným (ak je to vhodné) odstránením chrániacej skupiny vo výslednom medziprodukte pri štandardných podmienkach.

4-{[3-(9-Oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1 ]non-3-yl)propyl]amino}benzon itril sa môže pripraviť reakciou zlúčeniny vzorca I, definovanej vyššie, s 9-oxa-3,7diazabicyklo-[3.3.1]nonánom alebo s jeho mono-chráneným (napríklad mono-ŕercbutoxykarbonyl-chráneným) derivátom, napríklad pri podobných podmienkach, ako sú podmienky opísané vyššie pre prípravu 4-({3-[7-(3,3-dimetyl~2-oxobutyl)-9-oxa3,7-diazabicyklo-[3.3.1]non-3-yl]-propyl}amino)benzonitrilu (spôsob (i)), a/alebo zlúčeniny A, s následným (ak je to vhodné) odstránením chrániacej skupiny vo výslednom medziprodukte pri štandardných podmienkach.

-6Zlúčeniny vzorcov I a II, ako aj 3-(4-kyanoanilino)propylbenzénsulfonát a 9oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]nonán (a ich chránené deriváty) sa môžu pripraviť, ako je opísané v ďalšom.

Zlúčenina A a medziprodukty, opísané vyššie, sa môžu izolovať z reakčných zmesí s použitím konvenčných postupov. Okrem toho sa zlúčenina A môže následne prečistiť s použitím konvenčných postupov, ako je rekryštalizácia. Vhodné rozpúšťadlá na proces rekryštalizácie zahrňujú nižšie alkylalkoholy (napríklad C^-alkoholy, ako je etanol), vodu a ich zmesi. Výhodným rekryštalizačným rozpúšťadlom je zmes etanol/voda.

Odborníci v odbore si musia uvedomiť, že pri vyššie opísaných spôsoboch sa funkčné skupiny medziproduktových zlúčenín môžu, alebo sa musia, chrániť s použitím chrániacich skupín.

Funkčné skupiny, ktoré je potrebné chrániť, zahrňujú aminoskupinu. Vhodné chrániace skupiny pre aminoskupinu zahrňujú benzylovú skupinu, sulfónamidoskupinu (napríklad benzénsulfónamidoskupinu), tercbutyloxykarbonylovú skupinu, 9-fluórenyl-metoxykarbonylovú skupinu alebo benzyloxykarbonylovú skupinu.

Chránenie funkčných skupín a odstránenie chrániacich skupín z funkčných skupín sa môže uskutočňovať pred alebo po ktoromkoľvek z vyššie opísaných reakčných krokoch.

Chrániace skupiny sa môžu odstrániť s použitím postupov, ktoré sú dobre pre odborníkov skúsených v odbore dobre známe a sú opísané v ďalšom.

Použitie chrániacich skupín je komplexne opísané v: “Protective Groups in Organic Chemistry”, Edition. J. W. F. McOmie, Plénum Press (1973), a “Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd Edition, T. W. Greene & P. G. M. Wutz, WileyInterscience (1999).

Odborníci skúsení v odbore si budú vedomí toho, že aby sa zlúčenina A pripravila alternatívnym, a v niektorých prípadoch, jednoduchším spôsobom, jednotlivé kroky tu uvedeného spôsobu sa môžu uskutočňovať v odlišnom poradí, a/alebo jednotlivé reakcie sa môžu uskutočňovať v inom stupni celkového spôsobu

-Ί prípravy (t.j. môžu sa pridať substituenty a/alebo sa uskutočniť chemické transformácie na rôznych medziproduktoch okrem tých, ktoré sú vyššie priradené k príslušnej reakcii). Toto bude závisieť, okrem iného, na takých faktoroch, ako je povaha ďalších funkčných skupín, ktoré sú prítomné v príslušnom substráte, biologická dostupnosť kľúčových medziproduktov a stratégia chránenia skupín (ak sú), ktorá sa má prijať. Jednoznačne, typ použitého chemického zloženia bude ovplyvňovať výber reakčného činidla, ktoré sa použije pri uvedených krokoch syntézy, potrebu a typ chrániacich skupín, ktoré sa použijú a postupnosť uskutočnenia syntézy.

Medicínske a farmaceutické použitie

Zlúčenina A je prospešná, pretože vykazuje farmakologickú aktivitu. Je teda indikovaná ako farmaceutický prípravok.

Predložený vynález sa teda v ďalšom týka zlúčeniny A na použitie ako farmaceutického prípravku.

Zlúčenina A vykazuje predovšetkým myokardiálnu elektrofyziologickú aktivitu, ako je napríklad uvedené v nižšie opísaných testoch.

Očakáva sa teda, že zlúčenina A je využiteľná ako pri profylaxii, tak aj pri liečení arytmií, a to predovšetkým atriálnych a ventrikulárnych arytmií.

Zlúčenina A je teda indikovaná na liečenie alebo profylaxiu srdcových ochorení alebo pri indikáciách, ktoré sú súvisia so srdcovými ochoreniami, pri ktorých sa predpokladá, že arytmie hrajú hlavnú rolu, vrátane ischemickej choroby srdca, náhlej srdcovej príhody, infarktu myokardu, zlyhania srdca, chirurgického zákroku na srdci a tromboembolických prípadov.

Pri liečení arytmií sa zistilo, že zlúčenina A selektívne spomaľuje repolarizáciu srdca, pričom predlžuje QT interval, a predovšetkým vykazuje aktivitu triedy III. Hoci sa zistilo, že zlúčenina A vykazuje pri liečení arytmií predovšetkým aktivitu triedy III, jej režim (režimy) aktivity nie je /nie sú nevyhnutne obmedzené len na túto triedu.

-8Podľa ďalšieho aspektu sa predložený vynález týka spôsobu liečenia arytmie, pričom tento spôsob zahrňuje podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny A osobe, ktorá trpí takýmto stavom alebo je náchylná na takých stav.

Farmaceutické prípravky

Zlúčenina A sa bude bežne podávať orálne, subkutánne, intravenózne, intraarteriálne, transdermálne, intranazálne, inhaláciou alebo inou parenterálnou cestou, vo forme farmaceutického prípravku, ktorý obsahuje účinnú zložku vo farmaceutický prijateľnej dávkovej forme. V závislosti od ochorenia a pacienta, ktorý sa má liečiť, ako aj od spôsobu podávania, sa zlúčenina A môže podávať v rozličných dávkach.

Výhodné farmaceutické prípravky zahrňujú farmaceutické kompozície s modifikovaným uvoľňovaním, ktoré obsahujú zlúčeninu A a farmaceutický prijateľný nosič a/alebo ďalšie prostriedky, pričom nosič alebo prostriedky poskytujú modifikované uvoľňovanie účinnej zložky, a pričom táto zlúčenina je uspôsobená na orálne podávanie.

Vhodnými prípravkami sú také prípravky, v ktorých je zlúčenina A vložená v polymérnej matrici (napríklad vo forme želatínového matricového systému s modifikovaným uvoľňovaním, obsahujúcim hydrofilnú želatínovú zložku a účinnú zložku).

Vhodné hydrofilné želatínové zložky zahrňujú xantán, hydroxypropylcelulózu, maltodextrín, skleroglukán, karboxypolymetylén, poly(etylénoxid), hydroxyetylcelulózu a hydroxypropylmetylcelulózu. Takéto prípravky sa môžu pripraviť s použitím štandardných postupov.

Zlúčenina A sa môže tiež kombinovať s dalšími liečivami, ktoré sú využiteľné pri liečení arytmií a/alebo ďalších kardiovaskulárnych ochorení.

Podľa ďalšieho aspektu sa teda predložený vynález týka farmaceutického prípravku, ktorý obsahuje zlúčeninu A v zmesi s farmaceutický prijateľnou pomocnou látkou, riedidlom alebo nosičom.

-9Vhodné denné dávky zlúčeniny A pri terapeutickom liečení ľudí predstavujú približne 0,005 až 25,0 mg/kg telesnej hmotnosti pri orálnom podávaní a približne 0,005 až 10,0 mg/kg telesnej hmotnosti pri parenterálnom podávaní. Výhodné rozsahy denných dávok zlúčeniny A pri terapeutickom liečení ľudí predstavujú približne 0,005 až 10,0 mg/kg telesnej hmotnosti pri orálnom podávaní a približne 0,005 až 5,0 mg/kg telesnej hmotnosti pri parenterálnom podávaní.

Typické denné dávky zlúčeniny sú v rozsahu od 10 do 2000 mg, ako napríklad 25, 30, až 1200 mg voľnej zásady (t.j. s vylúčením hmotnosti, ktorá je výsledkom prítomnosti opačne nabitého iónu), bez ohľadu na počet kompozícií (napríklad tabliet), ktoré sa podávajú v priebehu dňa. Vhodné denné dávky sú v rozsahu 50 až 1000 mg, ako napríklad 100 až 500 mg. Typické dávky v jednotlivých kompozíciách (napríklad tabletách) sú teda v rozsahu 15 až 500 mg, napríklad 40 až 400 mg.

Zlúčenina A je výhodná v tom, že je účinná proti srdcovým arytmiám.

Zlúčenina A môže byť tiež výhodná v tom, že môže byť efektívnejšia, menej toxická, mať širší rozsah aktivity (vrátane toho, že môže vykazovať akúkoľvek kombináciu aktivity triedy I, triedy II, triedy III a/alebo triedy IV (okrem aktivity triedy III navyše tiež predovšetkým aktivitu triedy I a/alebo triedy IV,)), môže byť účinnejšia, poskytovať dlhší účinok, poskytovať menej vedľajších účinkov (vrátane nižšieho výskytu proarytmií, ako je torsades de pointes), ľahšie sa absorbovať, alebo môže vykazovať ďalšie užitočné farmakologické vlastnosti, v porovnaní so zlúčeninami, ktoré sú známe z doterajšieho stavu techniky.

Biologické testy

Test A

Primárne elektrofyziologické účinky u anestetizovaných morčiat

Použili sa morčatá s hmotnosťou medzi 660 a 1100 g. Zvieratá sa ustajnili počas najmenej jedného týždňa pred experimentom a počas tohto obdobia mali voľný prístup k potrave a vode z vodovodu.

- 10Anestézia sa vyvolala intraperitoneálnou injekciou pentobarbitalu (40 až 50 mg/kg) a do jednej krčnej artérie (na zaznamenávanie krvného tlaku a odoberanie vzoriek krvi) a do jednej jugulárnej žily (na infúziu liečiva) sa zaviedli katétre. Ihlové elektródy sa umiestnili na končatiny na zaznamenávanie ECG (lead II). Termistor sa umiestnil do rekta a zviera sa uložilo na vyhriatu podložku, nastavenú na teplotu rekta medzi 37,5 a 38,5 °C.

Uskutočnila sa tracheotómia a zviera sa umelo ventilovalo, vzduchom v miestnosti, s použitím malého ventilátora pre zvieratá, tak aby sa krvné plyny udržiavali v normálnom rozsahu, vzhľadom na druh. Aby sa znížili autonómne vplyvy obidva vagi sa prerezali na šiji a intravenózne sa podalo 0,5 mg/kg propranololu, 15 minút pre začatím experimentu.

Ľavý ventrikulárny epikard sa odhalil ľavostrannou torakotómiou a prispôsobená odsávacia elektróda na zaznamenávanie monofázového akčného potenciálu (MAP) sa aplikovala do ľavej ventrikulárnej voľnej steny. Elektróda sa udržiavala v polohe tak dlho, pokým bolo možné zaznamenávať prijateľný signál, potom sa preložila do novej polohy. Bipolárna elektróda na stimuláciu srdca sa pripojila k ľavej predsieni. Stimulácia srdca (doba trvania 2 ms, dvojnásobok diastolického prahu) sa uskutočnila s prispôsobeným konštantným prúdovým stimulátorom. Srdce sa stimulovalo pri frekvencii tesne nad normálnym sínusovým obratom počas jednej minúty každých päť minút v priebehu štúdie.

Tlak krvi, MAP signál a zvod II ECG sa zaznamenávali na zapisovači Mingograph ink-jet (Siemens-Elema, Švédsko). Všetky signály sa sústredili (frekvencia snímania 1000 Hz) na PC počas posledných 10 sekúnd každej stimulačnej sekvencie a najmenej posledných 10 sekúnd nasledujúcej minúty sínusového rytmu. Signály sa spracovali s použitím zákazkového programu, ktorý bol vyvinutý na zber a analýzu fyziologických signálov meraných pri experimentálnych zvieratách (pozri Axenborg and Hirsch, Comput. Methods Programs Biomed. 41, 55 (1993)).

Testovacia metóda zahrňovala zaznamenanie dvoch základných kontrolných záznamov, s časovým rozdielom 5 minút, počas stimulácie a sínusového rytmu. Po druhom kontrolnom zázname sa infúzne podávala prvá dávka testovanej zlúčeniny

-11 v objeme 0,2 ml do katétra jugulárnej žily počas 30 sekúnd. O tri minúty neskôr sa začala stimulácia a urobil sa nový záznam. O päť minút po predošlej dávke sa podala ďalšia dávka testovanej zlúčeniny. Počas každého experimentu sa postupne podalo šesť až desať dávok.

Analytické údaje

Z početných premenných, ktoré sa merali pri tejto analýze, sa zvolili tri ako najdôležitejšie pre porovnanie a selekciu účinných zlúčenín. Týmito tromi zvolenými premennými boli trvanie MAP pri 75-percentnej repolarizácii počas stimulácie, čas atrio-ventrikulárneho (AV) vedenia (definovaný ako interval medzi atriálnym pulzom a začiatkom ventrikulárneho MAP) počas stimulácie, a srdcová frekvencia (definovaná ako RR interval počas sínusového rytmu). Meral sa systolický a diastolický tlak krvi, aby sa posúdil hemodynamický status anestetizovaných zvierat. Okrem toho sa kontrolovalo ECG na arytmie a/alebo na morfologické zmeny.

Priemer z dvoch kontrolných záznamov sa položil rovný nule a účinky zaznamenané po postupných, po sebe idúcich dávkach testovanej zlúčeniny sa vyjadrili ako percentuálne zmeny od tejto hodnoty. Grafickým zobrazením týchto percentuálnych hodnôt, oproti kumulatívnej dávke podávanej pred každým záznamom, je možné zostrojiť krivky závislé od dávok. Týmto spôsobom sa pre každý experiment vytvorili tri krivky závislé od dávok, jedna pre trvanie MAP, jedna pre čas AV-vedenia a jedna pre sínusovú frekvenciu (RR interval). Vypočítala sa priemerná krivka pre všetky experimenty uskutočnené s testovanou látkou a hodnoty účinnosti sa odvodili od priemernej krivky. Všetky od dávky závislé krivky sa v týchto experimentoch skonštruovali lineárnym spojením bodov získaných z údajov. Kumulatívna dávka predlžujúca trvanie MAP o 10 % od základnej línie sa použila ako index na vyhodnotenie triedy III elektrofyziologickej účinnosti skúmaného činidla (Dio)·

Test B

Glukokortikoidom ošetrené fibroblasty myší ako model na stanovenie blokátorov spomaleného usmerňovača K prúdu

-12IC₅o pre blokádu K kanálikov sa stanovilo s použitím skríningovej metódy na báze mikrotitračnej platne, založenej na zmenách membránového potenciálu glukokortikoidom ošetrených fibroblastov myší. Membránový potenciál glukokortikoidom ošetrených fibroblastov myší sa meral s použitím fluorescencie bisoxonolového farbiva DiBac₄(₃₎, ktoré sa dá spoľahlivo detegovať pomocou fluorescenčného laserového zobrazovacieho čítača platničiek (fluorescence laser imaging plate reader, FLIPR). Expresia spomaleného usmerňovača draslíkových kanálikov sa vyvolala vo fibroblastoch myší 24-hodinovou expozíciou dexametazónu glukokortikoidu (5 μΜ). Blokáda týchto draslíkových kanálikov depolarizovala fibroblasty, čo spôsobovalo zvýšenie fluorescencie DiBac^).

Itk fibroblasty myší (L-bunky) sa získali z Americkej zbierky typov kultúr (American Type Culture Collection, ATCC, Manassa, VA), a kultivovali sa v modifikovanom eagle médiu Dulbeccos, doplnenom s fetálnym teľacím sérom (5 % obj./obj.), penicilínom (500 jednotiek/ml), streptomycínom (500 pg/ml) a lalanín-L-glutamínom (0,862 mg/ml). Bunky sa pasážovali každé 3 až 4 dni s použitím trypsínu (0,5 mg/ml vo fosfátovom pufrovanom fyziologickom roztoku bez obsahu vápnika, Gibco BRL). Tri dni pred experimentmi sa suspenzia buniek napipetovala do čiernych 96-jamkových platničiek z umelej hmoty s priehľadným dnom (Čostar) pri 25 000 buniek/jamku.

Fluorescenčná skúška DiBac₄₍3) (DiBac Molecular probes) sa použila na meranie membránového potenciálu. DiBac₄(₃₎ maximálne absorbuje pri 488 nM a emituje pri 513 nM. DiBac₄₍3) je bisoxonol, a teda má negatívny náboj pri hodnote pH 7. Z dôvodu jeho negatívneho náboja, distribúcia DiBac₄(₃) cez membránu závisí od transmembránového potenciálu: ak sa bunka depolarizuje (t.j. vnútrajšok bunky sa stáva menej negatívnym v porovnaní s vonkajšou časťou bunky), koncentrácia DiBac₄₍3) vo vnútri bunky sa zvyšuje, vplyvom elektrostatických síl. Ak sa už raz molekuly DiBac₄₍3) dostanú do bunky, môžu sa viazať k lipidom a proteínom, ktoré spôsobujú zvýšenie fluorescenčnej emisie. Depolarizácia sa bude teda prejavovať zvýšením DiBac₄₍₃₎ fluorescencie. Zmena v DiBac₄₍₃) fluorescencii sa detegovala pomocou FLIPR.

Pred každým experimentom sa bunky štyrikrát premyli vo fosfátovom tlmivom fyziologickom roztoku (phosphate-buffered saline, PBS), aby sa odstránili

-13všetky kultivačné médiá. Bunky sa potom spracovali s 5 μΜ DiBac₄₍₃₎ (v 180 μΙ PBS) pri teplote 35 °C. Po dosiahnutí stabilnej fluorescencie (zvyčajne po 10 minútach) sa pridalo 20 μΙ testovanej zlúčeniny, s použitím FLIPR-vnútorného 96-jamkového pipetovacieho systému. Merania fluorescencie sa potom uskutočňovali každých 20 sekúnd, počas ďalších 10 minút. Všetky experimenty sa uskutočňovali pri teplote 35 °C, z dôvodu citlivosti, a to jednak vodivosti spomaleného usmerňovača draslíkových kanálikov ako aj citlivosti DiBac₄₍₃) fluorescencie, voči vysokým teplotám. Testované látky sa pripravili v druhej 96jamkovej platničke, v PBS obsahujúcom 5 μΜ DiBac₄₍₃). Koncentrácia pripravenej látky predstavovala 10-násobok koncentrácie požadovanej v experimente, pretože sa počas pridávania látky v priebehu experimentu uskutočňovalo ďalšie riedenie v pomere 1:10. Dofetilid (10 μΜ) sa použil ako pozitívna kontrola, t.j. na stanovenie maximálneho zvýšenia fluorescencie.

Zakreslenie krivky, použité na stanovenie hodnôt IC₅₀, sa uskutočnilo s použitím programu Graphpad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego, CA).

Test C

Metabolická stabilita testovanej zlúčeniny

Na stanovenie metabolickej stability zlúčeniny A sa navrhol in vitro skríning.

Použila sa hepatická S-9 frakcia zo psa, človeka, králika a potkana, s NADPH ako ko-faktorom. Podmienky skúšky boli nasledujúce: S-9 (3 mg/ml), NADPH (0,83 mM), Tris-HCl pufer (50 mM) pri hodnote pH 7,4 a 10 μΜ testovanej zlúčeniny.

Reakcia sa naštartovala pridaním testovanej zlúčeniny a ukončila sa po 0, 1, 5, 15 a 30 minútach, zvýšením pH vo vzorke nad hodnotu 10 (NaOH; 1 mM). Po extrakcii rozpúšťadlom sa koncentrácia testovanej zlúčeniny merala oproti vnútornému štandardu pomocou LC (fluorescencia/UV detekcia).

Vypočítalo sa percento testovanej zlúčeniny, ktoré zostalo po 30 minútach (a tým teda tv₂) a použilo sa ako stupeň pre metabolickú stabilitu.

Vynález je v ďalšom ilustrovaný pomocou nasledujúcich príkladov uskutočnenia.

-14Priklady uskutočnenia vynálezu

Všeobecné experimentálne postupy

Hmotnostné spektrá sa zaznamenávali na jednom z nasledujúcich zariadení: na jednoduchom kvadrupólovom zariadení Waters ZMD s elektro-rozprašovaním (S/N mc350); na spektrometri Perkin-Elmer SciX API 150ex; na troj-kvadrupólovom zariadení VG Quattro II; na jednoduchom kvadrupólovom zariadení VG Platform II; alebo na jednoduchom kvadrupólovom hmotnostnom spektrometri Micromass Platform LCZ (pričom posledné tri menované zariadenia sa vybavili s pneumaticky podporovaným elektro-rozprašovacím fázovým rozhraním (LC-MS)). ¹H NMR a ¹³C NMR merania sa uskutočnili na spektrometroch BRUKER ACP 300 a Varian 300, 400 a 500, operujúcich pri príslušných ¹H frekvenciách 300, 400 a 500 MHz a pri príslušných ¹³C frekvenciách 75,5, 100,6 a 125,7 MHz. Alternatívne sa ¹³C NMR merania uskutočnili na spektrometri BRUKER ACE 200 pri frekvencii 50,3 MHz.

Rotaméry sa môžu alebo sa nemusia zaznamenať v spektre, v závislosti od jednoduchosti interpretácie spektra. Pokiaľ nie je uvedené inak, chemické posuny sú uvedené v ppm, s rozpúšťadlom ako vnútorným štandardom.

Príklad 1 (i) 4-[(3-Hydroxypropyl)amino]benzonitril

Alternatíva 1

Zmes 4-fluórbenzonitrilu (12,0 g, 99,1 mmol) a 3-amino-1-propanolu (59,6 g, 793 mmol) sa miešala pri teplote 80 °C pod inertnou atmosférou počas 3 hodín pred pridaním vody (150 ml). Zmes sa nechala ochladiť na laboratórnu teplotu a potom sa extrahovala s dietyléterom. Organická vrstva sa oddelila, vysušila (Na2SO₄), prefiltrovala a zahustila vo vákuu, pričom sa získalo 17 g (97%) zlúčeniny uvedenej v podnázve, vo forme oleja, ktorý státím vykryštalizoval.

Alternatíva 2

4-Fluórbenzonitril (24,6 g, 0,203 mol, Aldrich 99 %) sa pridal k 3-amino-1propanolu (122,0 g, 1,625 mol, 8 ekv., Aldrich 99 %) a zmes sa zahrievala pri

-15teplote 80 °C počas 5 hodín pod dusíkom. Roztok sa nechal ochladiť na teplotu 22 °C a pridala sa voda (300 ml). Zakalený roztok sa extrahoval dvakrát s metylénchloridom (300 ml a 200 ml) a spojené metylénchloridové extrakty sa premyli s vodou (300 ml; analýza organickej vrstvy pomocou plynovej chromatografie poskytla približne 1,0 % plochy zostatkového aminopropanolu).

Alternatíva 3

K 4-fluórbenzonitrilu (30,29 g, 247,7 mmol, 1,0 ekv.), sa pridal 3-amino-1propanol (150 ml, 148,8 g, 1981,5 mmol, 8,0 ekv.). Zmes sa miešala pod dusíkom pri laboratórnej teplote (27 °C), až pokým sa pevná látka nerozpustila. Roztok sa zahrial (olejový kúpeľ) na teplotu 77°C a udržiaval sa pri tejto teplote počas 7 hodín, potom sa miešal pri teplote prostredia cez noc (14 hodín). Pridala sa voda (365 ml) a výsledný zakalený roztok extrahoval s dichlórmetánom (365 ml, potom 245 ml). Spojené organické vrstvy sa premyli s vodou (365 ml). DCM roztok produktu sa vysušil oddestilovaním: rozpúšťadlo (200 ml) sa odstránilo a nahradilo sa s čerstvým DCM (200 ml). Odstránilo sa ďalšie množstvo rozpúšťadla (250 ml), čim sa celkový objem rozpúšťadla upravil na 365 ml.

(ii) 3-(4-Kyanoanilino)propyl 4-metylbenzénsulfonát

Alternatíva I

Ochladený roztok (0 °C) 4-[(3-hydroxypropyl)amino]benzonitrilu (z kroku (i) (Alternatíva 1) vyššie; 17 g, 96,5 mmol) v suchom MeCN (195 ml) sa nechal reagovať s trietylamínom (9,8 g, 96,5 mmol) a potom s p-toluénsulfonylchloridom (20,2 g, 106 mmol). Zmes sa miešala pri teplote 0 °C počas 90 minút a potom sa zahustila vo vákuu. K zvyšku sa pridala voda (200 ml) a vodný roztok sa extrahoval s DCM. Organická fáza sa vysušila (Na2SO₄), prefiltrovala a zahustila vo vákuu. Výsledný zvyšok sa prečistil kryštalizáciou z izopropanolu, pričom sa získalo 24,6 g (77 %) zlúčeniny uvedenej v názve.

Alternatíva II

Roztok surového 4-[(3-hydroxypropyl)amino]benzonitrilu (z kroku (i) (Alternatíva 2) vyššie) sa zahustil na objem 300 ml destiláciou a pridalo sa ďalších

200 ml metylénchloridu a roztok sa znova oddestiloval na 300 ml (voda v roztoku

-16podľa Karl-Fischera 0,07 %). Pridal sa trietylamín (20,55 g, 0,203 mol) a následne sa pridal 4-(/V,/\/-dimetylamino)pyridín (248 mg, 2,0 mmol) a roztok sa ochladil na teplotu 0 °C. Pridal sa roztok tozylchloridu (38,70 g, 0,203 mol) v metylénchloride (150 ml), v priebehu približne 30 minút za chladenia a intenzívneho miešania, pričom sa teplota nechala vystúpiť na 5 °C. Reakčná zmes sa potom miešala počas 23 hodín pri teplote v rozsahu 3 až 5 °C pod dusíkom. (Po 5 hodinách nastalo vyzrážanie trietylamin-hydrochloridu. TLC ukázala len veľmi malú konverziu zvyškového kyanoalkoholu po 20 až 23 hodinách.) Potom sa pridala voda (300 ml) a vrstvy sa intenzívne premiešavali počas 15 minút. Organický roztok sa zahustil destiláciou pri teplote 35 až 40 °C na objem približne 60 až 70 ml. V priebehu 5 minút sa pridal izopropanol (100 ml). (V tomto stupni sa pred pridaním izopropanolu prejavovala určitá granulárna precipitácia produktu. Kryštalizácia nastala rýchle po pridaní izopropanolu.) V destilácii sa pokračovalo pri použití vákua, aby sa odstránili posledné zvyšky metylénchloridu. (Odstránilo sa ďalších približne 30 ml a destilát sa analyzoval pomocou plynovej chromatografie na neprítomnosť metylénchloridu.) Suspenzia kryštálov sa ochladila na teplotu 0 až 5 °C v priebehu približne jednej hodiny, pri pomalom miešaní a udržiavala sa počas jednej hodiny pri teplote 0 až 5 °C. Kryštály sa odfiltrovali na stredný sinter a zhutnený vlhký filtračný koláč sa opatrne premyl s chladným (0 °C) izopropanolom (80 ml). Filtračný koláč sa sušil cez noc pod vákuom a v prúde dusíka. Výťažok: 52,6 g, 78,4 molárnych percent; HPLC: 99,64 % plochy.

Mikroanalýzy: nájdené (teória): % C: 61,60 (61,67); % H: 5,41 (5,49); % N:

8,44 (8,47); % S: 9,71 (9,70).

(iii) A/,/\/-Bis(2-oxiranylmetyl)benzénsulfónamid

Voda (2,5 I, 10 obj.) a následne epichlórhydrín (500 ml, 4 ekv.) sa pridali k benzénsulfónamidu (250 g, 1 ekv.). Reaktanty sa zahrievali pri teplote 40 °C. Pridal sa vodný hydroxid sodný (130 g v 275 ml vody) tak, aby sa teplota reakčnej zmesi sa udržiavala medzi 40 °C a 43 °C. Toto trvalo približne 2 hodiny. (Je potrebné, aby rýchlosť pridávania hydroxidu sodného bola na začiatku pridávania pomalšia ako na konci, aby sa teplota reakčnej zmesi udržiavala v rámci uvedeného rozsahu.) Po ukončení pridávania hydroxidu sodného sa reakčná zmes miešala pri teplote 40 °C počas 2 hodín a následne pri laboratórnej teplote cez noc.

-17Nadbytok epichlórhydrínu sa odstránil ako azeotrop s vodou, pomocou vákuovej destilácie (tlak približne 40 mbar, vnútorná teplota 30 °C), až pokým sa v destiláte už viac nenachádzal epichlórhydrín. Pridal sa dichlórmetán (1 liter) a zmes sa intenzívne miešala počas 15 minút. Fázy sa nechali oddeliť (toto trvalo 10 minút, hoci sa po státí cez noc získali úplne číre fázy). Fázy sa oddelili a dichlórmetánový roztok sa použil v nasledujúcom kroku, ako je uvedené y ďalšom.

¹H NMR (400 MHz, CDCI₃): δ 2,55 - 2,65 (2H, m), 2,79 (2H, t, J 4,4), 3,10 3,22 (4H, m), 3,58 - 3,73 (2H, m), 7,50 - 7,56 (2H, m), 7,58 - 7,63 (1 H, m), 7,83 7,87 (2H, m).

(iv) 5-Benzyl-3,7-dihydroxy-1-fenylsulfonyl-1,5-diazacyklooktán

IMS (2,5 I, 10 obj.) sa pridal k dichlórmetánovému roztoku z kroku (iii), ktorý je uvedený vyššie. Roztok sa destiloval, pokým sa nedosiahla vnútorná teplota 70 °C. Zachytilo sa približne 1250 ml rozpúšťadla. Pridal sa další IMS (2,5 I, 10 obj.) a následne sa pridal benzylamín (120 ml, 0,7 ekv.) vjednom podiele (nepozorovala sa exotermná reakcia) a reakčná zmes sa zahrievala pod refluxom počas 6 hodín (pri odoberaní vzoriek sa nepozorovala žiadna zmena od 2. hodiny). Pridalo sa ďalšie množstvo benzylamínu (15 ml) a roztok sa zahrieval počas dalších 2 hodín. IMS sa oddestiloval (približne 3,25 I) a pridal sa toluén (2,5 I). Oddestilovalo sa ďalšie množstvo rozpúšťadla (približne 2,4 I) a potom sa pridal ďalší toluén (1 I). Teplota na hlave teraz predstavovala 110 °C. Zachytilo sa ďalších 250 ml rozpúšťadla pri teplote 110 °C. Teoreticky, takto sa získal produkt v približne 2,4 litra toluénu pri teplote 110 °C. Tento roztok sa použil v nasledujúcom kroku.

¹H NMR (400 MHz, CDCI₃): δ 7,83 - 7,80 (4H, m, ArH), 7,63 - 7,51 (6H, m, ArH), 7,30 - 7,21 (10H, ArH), 3,89 - 3,80 (4H, m, CH(a) +CH(b)), 3,73 (2H, s, CH₂Ph(a)), 3,70 (2H, s, CH₂Ph(b)), 3,59 (2H, dd, CHHNSO₂Ar(a)), 3,54 (2H, dd, CHHNSO₂Ar(b)), 3,40 (2H, dd, CHHNSO₂Ar(b)), 3,23 (2H, dd, CHHNSO₂Ar(a)), 3,09 - 2,97 (4H, m, CHHNBn(a) + CHHNBn(b)), 2,83 (2H, dd, CHHNBn(b)), 2,71 (2H, dd, CHHNBn(a)).

-18(Údaje dosiahnuté s prečisteným materiálom preukázali zmes 1 : 1 transdiolu (a), a c/s-diolu (b).) (v) 3-Benzyl-7-(fenylsulfonyl)-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1 ]nonán

Toluénový roztok z predchádzajúceho kroku (iv), uvedeného vyššie, sa

I ochladil na teplotu 50 °C. Pridala sa bezvodá kyselina metansulfónová (0,2 I). Toto spôsobilo zvýšenie teploty z 50 °C na 64 °C. Po 10 minútach sa pridala kyselina metansulfónová (1 I) a reakčná zmes sa zahrievala pri teplote 110 °C počas 5 hodín. Toluén sa potom z reakčnej zmesi oddestiloval; zachytilo sa 1,23 litra. (Je potrebné si uvedomiť, že vnútorná teplota by sa v ktoromkoľvek stupni nemala nechať vystúpiť vyššie ako na 110 °C, inak sa výťažok zníži.) Reakčná zmes sa potom ochladila na teplotu 50 °C a zvyšok toluénu sa odstránil vo vákuu. Zahrievaním pri teplote 110 °C a tlaku 650 mbar sa odstránilo ďalších 0,53 litra rozpúšťadla. (Ak sa toluén môže odstrániť pri nižšej teplote a tlaku, potom je to výhodným.) Reakčná zmes sa potom nechala ochladiť na teplotu 30 °C a pridala sa deionizovaná voda (250 ml). Toto spôsobilo, že teplota sa zvýšila z 30 °C na 45 °C. Pridalo sa ďalšie množstvo vody (2,15 I) v priebehu celkovej doby 30 minút, tak aby teplota bola nižšia ako 54 °C. Roztok sa ochladil na 30 °C a potom sa pridal dichlórmetán (2 I). Pri vonkajšom chladení a intenzívnom miešaní sa reakčná zmes zalkalizovala pridávaním vodného roztoku hydroxidu sodného (10 M, 2 I), takou rýchlosťou, aby sa vnútorná teplota udržiavala pod 38 °C. Toto trvalo 80 minút. Miešanie sa zastavilo a fázy sa oddelili v priebehu 3 minút. Vrstvy sa rozdelili. K dichlórmetánovému roztoku sa pridal IMS (2 I) a začala sa destilácia. Zachytilo sa rozpúšťadlo (2,441), pokým teplota na hlave dosiahla 70 °C. Teoreticky, takto sa získal produkt v 1,56 litra IMS. Roztok sa potom nechal cez noc ochladiť na teplotu prostredia, za pomalého miešania. Pevný produkt, ktorý sa vyzrážal, sa odfiltroval a premyl sa s IMS (0,5 I), pričom sa získal žltohnedo sfarbený produkt, ktorý po vysušení vo vákuu pri teplote 50 °C poskytol výťažok 50,8 g (8,9 % cez 3 kroky). Časť toho produktu 20,0 g, sa rozpustilo v acetonitrile (100 ml) pod refluxom, pričom sa získal bledožltý roztok. Po ochladení na teplotu prostredia sa vytvorené kryštály zachytili filtráciou a premyli sa s acetonitrilom (100 ml). Produkt sa vysušil vo vákuu pri teplote 40 °C v priebehu jednej hodiny, pričom sa získalo 17,5 g (87 %) zlúčeniny uvedenej v názve.

-19¹H NMR (400 MHz, CDCI₃): δ 7,18 - 7,23 (10H, m), 3,86 - 3,84 (2H, m), 3,67 (2H, d), 3,46 (2H, s), 2,91 (2H, d), 2,85 (2H, dd), 2,56 (2H, dd).

(vi) 3-Benzyl-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]nonán x 2 HCI

Koncentrovaná kyselina bromovodíková (1,2 1, 3 relat. obj.) sa pridala k pevnému 3-benzyl-7-(fenylsulfonyl)-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]nonánu (400 g, pozri krok (v) uvedený vyššie) a zmes sa zahrievala na reflux pod dusíkovou atmosférou. Pevná látka sa rozpustila v kyseline pri teplote 95 °C. Po zahrievaní reakčnej zmesi počas 8 hodín HPLC analýza ukázala, že reakcia je ukončená. Obsahy sa ochladili na laboratórnu teplotu. Pridal sa toluén (1,2 I, 3 relat. obj.) a zmes sa intenzívne miešala počas 15 minút. Miešanie sa zastavilo a fázy sa rozdelili. Toluénová fáza sa zlikvidovala spolu s malým množstvom medzifázového materiálu. Kyslá fáza sa vrátila do pôvodnej reakčnej nádoby a v jednom podiele sa pridal hydroxid sodný (10 M, 1,41, 3,5 relat. obj.). Vnútorná teplota sa vzrástla z 30 °C na 80 °C. Overila sa hodnota pH, aby sa zabezpečilo, že predstavuje >14. Pridal sa toluén (1,6 I, 4 relat. obj.) a teplota poklesla z80°C na 60 °C. Po intenzívnom miešaní počas 30 minút sa fázy rozdelili. Vodná vrstva sa zlikvidovala spolu s malým množstvom medzifázového materiálu. Toluénová fáza sa vrátila do pôvodnej reakčnej nádoby a pridal sa 2-propanol (4 I, 10 relat. obj.). Teplota sa nastavila na hodnotu medzi 40 °C a 45 °C. V priebehu 45 minút sa pridala koncentrovaná kyselina chlorovodíková (200 ml) tak, aby sa teplota udržala v rozsahu 40 °C až 45 °C. Vytvorila sa biela zrazenina. Zmes sa miešala počas 30 minút a potom sa ochladila na teplotu 7 °C. Produkt sa zachytil filtráciou, premyl sa s 2-propanolom (0,8 I, 2 relat. obj.), vysušil sa odsatím a potom sa ďalej sušil vo vákuovej sušiarni pri teplote 40 °C. Výťažok: 297 g (91 %).

¹H NMR (CD3OD + 4 kvapky D₂O): δ 2,70 (br d, 2H), 3,09 (d, 2H), 3,47 (br s, 4H), 3,60 (s, 2H), 4,12 (br s, 2H), 7,30 - 7,45 (m, 5H).

API MS: m/z = 219 [C₁₃H₁₈N₂O+Hf.

(vii) 3,3-Dimetyl-1-[9-oxa-7-(fenylmetyl)-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl]-2-butanón

Voda (500 ml, 5 obj.) a následne 1-chlórpinakolon (45,8 ml, 1 ekv.) sa pridali k hydrogénuhličitanu sodnému (114,2 g, 4 ekv.). Pomaly sa pridával roztok 3-20benzyl-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]nonánu x 2 HCI (100,0 g; pozri krok (vi) uvedený vyššie) vo vode (300 ml, 3 obj.), tak aby sa reguloval vývoj oxid uhličitého (20 minút.). Reakčná zmes sa zahrievala pri teplote 65 °C až 70 °C počas 4 hodín. Po ochladení na teplotu prostredia sa pridal dichlórmetán (400 ml, 4 obj.) a, po miešaní počas 15 minút, sa fázy oddelili. Vodná fáza sa premyla s dichlórmetánom (400 ml, 4 obj.) a organické extrakty sa spojili. Roztok sa destiloval a rozpúšťadlo sa zachytilo (550 ml). Pridal sa etanol (1 liter) a v destilácii sa pokračovalo. Zachytilo sa ďalšie rozpúšťadlo (600 ml). Pridal sa etanol (1 liter) a v destilácii sa pokračovalo. Zachytilo sa ďalšie rozpúšťadlo (500 ml) (teplota na hlave teraz predstavovala 77 °C). Tento roztok (ktorý teoreticky obsahoval 1150 ml etanolu) sa priamo použil v nasledujúcom kroku.

¹H NMR (400 MHz, CDCI₃): δ 1,21 (9H, s), 2,01 - 2,59 (2H, m), 2,61 - 2,65 (2H, m), 2,87 - 2,98 (4H, m), 3,30 (2H, s), 3,52 (2H, s), 3,87 (2H, br s), 7,26 (2H, d, J 7,6), 7,33 (1H, dd, J 7,6, 7,6), 7.47 (2H, d, J 7,6).

(viii) 3,3-Dimetyl-1-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)-2-butanón

Paládium na aktívnom uhlí (44 g, 0,4 hmôt. ekv. 61 % vlhkého katalyzátora, typ katalyzátora: Johnson Matthey Type 440L) sa pridalo k etanolovému roztoku z predchádzajúceho kroku (vii), ktorý je uvedený vyššie. Zmes sa hydrogenovala pri tlaku 4 bar. Reakcia sa považovala za ukončenú po 5 hodinách. Katalyzátor sa odstránil filtráciou a premyl sa s etanolom (200 ml). Spojené etanolové filtráty sa použili v kroku (ix), uvedenom nižšie. Skúška roztoku poskytla 61,8 g produktu uvedeného v názve v etanole (teoreticky 1,35 litra; merané 1,65 litra). Časť produktu sa izolovala a prečistila. Analýza sa uskutočnila s prečisteným produktom.

¹H NMR (300 MHz, CDCI₃): δ 1,17 (9H, s), 2,69 (2H, dt, J 11,4, 2,4), 2.93 (2H, d, J 10,8), 3,02 (2H, d, J 13,8), 3,26 (2H, s), 3,32 (2H, dt, J 14,1), 3,61 (2H, br s)·

Táto reakcia sa môže tiež uskutočniť s použitím nižšieho hmotnostného pomeru katalyzátora ku benzylovanému východiskovému materiálu. Toto sa môže dosiahnuť niekoľkými rozličnými spôsobmi, napríklad použitím rozličných katalyzátorov (ako je Pd/C s kovom odlišným od typu katalyzátora Type 440L, ktorý sa použil vyššie, alebo Rh/C) a/alebo zlepšením vlastností prenosu hmoty reakčnej

-21 zmesi (odborník skúsený v odbore si bude vedomý toho, že zlepšený prenos hmoty sa môže dosiahnuť napríklad tak, že hydrogenácia sa uskutoční v širšom merítku, než ako je opísané pri vyššie uvedenej reakcii). Pri použití takýchto postupov sa hmotnostný pomer katalyzátora ku východiskovému materiálu môže znížiť pod 4:10 (napríklad medzi 4 : 10 a 1 : 20.).

(ix) Zlúčenina A

Uhličitan draselný (56,6 g, 1,5 ekv.) a 3-(4-kyanoanilino)propyl-4metylbenzén-sulfonát (pozri krok (ii) uvedený vyššie, 90,3 g, 1 ekv,) sa pridali k etanolovému roztoku 3,3-dimetyl-1-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)-2butanónu (pozri krok (viii) uvedený vyššie; 61,8 g zo vzorky v 1,65 I). Reakčná zmes sa zahrievala pri teplote 80 °C počas 4 hodín. Skúška ukázala, že časť reakčného činidla zostala nezreagovaná (8,3 g), preto sa pridalo ďalšie množstvo

3-(4-kyanoanilino)propyl-4-metylbenzénsulfonátu (12,2 g) a výsledná zmes sa zahrievala pri teplote 80 °C počas 4 hodín. Rozpúšťadlo (1,35 I) sa oddestilovalo, potom sa pridal izopropylacetát (2,5 I). Rozpúšťadlo (2,51 I) sa odstránilo. Pridal sa izopropylacetát (2,5 I). Rozpúšťadlo (0,725 I) sa odstránilo. Vnútorná teplota sa teraz predstavovala 88 °C. Rozpúšťadlo (0,825 I) sa odstránilo, pričom sa získal produkt vo forme izopropylacetátového roztoku (teoreticky v 2,04 I). Po ochladení na teplotu 34 °C sa pridala voda (0,51). Vytvorila sa čierna suspenzia, pravdepodobne paládia, v zmesi. Hodnota pH vodnej fázy bola 11. Pridával sa hydroxid sodný (1 M, 0,31 I) tak, aby sa teplota udržiavala na menej ako 25 °C, a zmes sa intenzívne miešala počas 5 minút. Hodnota pH vodnej fázy predstavovala 12. Fázy sa oddelili a vodná fáza sa zlikvidovala. Pridalo sa ďalšie množstvo vody (0,5 I) a fázy sa oddelili. Vodná fáza sa zlikvidovala. Zostávajúci roztok esteru sa prefiltroval, aby sa odstránili suspendované častice, a filtrát sa potom doplnil do objemu presne 2 litrov. Roztok sa potom rozdelil na časti 2x1 liter.

(Aby sa zabránilo produkcii produktu uvedeného v podnázve, obsahujúceho vysoký obsah paládia, môže sa uskutočniť nasledujúce spracovanie: K roztoku voľnej zásady (1 I) sa pridala živica Deloxan® (12,5 g, 25 % hmôt.) a zmes sa zahrievala pod refluxom za intenzívneho miešania počas 5 hodín. Roztok sa potom

-22ochladil na laboratórnu teplotu a miešal sa počas dvoch dní. Živica sa odstránila filtráciou.)

Uskutočnila sa skúška, na vypočítanie požadovaného množstva kyseliny benzénsulfónovej, na prípravu benzénsulfonátovej soli.

Roztok kyseliny benzénsulfónovej (20,04 g, 1 ekv., pri predpoklade, že kyselina je čistým monohydrátom) v izopropylacetáte (200 ml) sa pridal v priebehu 5 minút (vhodnejšie je pomalšie pridávanie, ako je to možné) za intenzívneho miešania k roztoku voľnej zásady (1 I), pričom sa vytvorila bledožltá zrazenina. Teplota vzrástla z 18 °C na 22 °C. Po 10 minútach sa zmes ochladila na 10 °C a produkt sa zachytil filtráciou. Produkt sa premyl s izopropylacetátom (250 ml), odsal sa do sucha na filtri a potom sa sušil vo vákuu pri teplote 40 °C počas dvoch dní, pričom sa získalo 59,0 g (61 % z 3-benzyl-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]nonánu x 2 HCl).

(Surová benzénsulfonátová soľ sa alternatívne pripravila pridaním 70 % (hmot./hmot.) vodného roztoku kyseliny benzénsulfónovej k etanolovému roztoku voľnej zásady.)

Surový produkt uvedený v podnázve sa izoloval vo forme monohydrátu.

Etanol (500 ml) a voda (250 ml) sa pridali k surovej zlúčenine uvedenej v podnázve (50,0 g). Roztok sa zahrial na teplotu 75 °C. Všetok materiál sa rozpustil pri teplote 55 °C. Roztok sa udržiavala pri teplote 75 °C počas 5 minút, potom sa v priebehu jednej hodiny ochladil na 5 °C. Vyzrážanie sa začalo pri 18 °C. Chladný roztok sa prefiltroval a filtrát sa premyl so zmesou etanol: voda (v pomere 2:1; 150 ml), odsal sa do sucha na filtri a potom sa vysušil vo vákuu pri teplote 40 °C, pričom sa získal produkt uvedený v podnázve (41,2 g, 82 %).

(Táto rekryštalizácia sa môže uskutočňovať s väčšími objemami rozpúšťadla, ak je to potrebné napríklad na naplnenie reakčných nádob:

EtOH : voda 2 : 1,45 obj. (poskytlo výťažok 62 %)

EtOH : voda 6 : 1, 35 obj. (poskytlo výťažok 70 %).)

-23Produkt uvedený v podnázve sa izoloval ako monohydrát po rekryštalizácii (ako sa stanovilo pomocou róntgenovej difrakcie monokryštálu).

Príklad 2 (i) 3-(4-Kyanoanilino)propylbenzénsulfonát

K roztoku 4-[(3-hydroxypropyl)amino]benzonitrilu (z príkladu 1(i), Alternatíva 3, uvedená vyššie, predpokladané 43,65 g, 247,7 mmol, 1,0 ekv.) v dichlórmetáne (360 ml celkový objem roztoku) sa postupne pridal trietylamín (5 ml, 37,60 g, 371,55 mmol, 1,5 ekv.) a trimetylamínhydrochlorid (11,89 g, 123,85 mmol, 0,5 ekv.) v jednom podiele. Žltý roztok sa ochladil na teplotu -20 °C (s použitím kúpeľa acetón/suchý ľad alebo chladnej platne) a nechal sa reagovať s roztokom benzénsulfonylchloridu (32 ml, 43,74 g, 247,7 mmol, 1,0 ekv.) v dichlórmetáne (220 ml, 5 obj., vztiahnuté na kyánalkohol) s použitím prikvapkávacieho lievika na vyrovnávanie tlaku. Roztok sa pridával po častiach tak, aby vnútorná teplota neprevýšila -14 °C. Pridávanie bolo ukončené po 25 minútach. Zmes sa potom miešala počas 35 minút pri teplote medzi -15 a -10 °C. Pridala sa voda (365 ml), pričom sa teplota zvýšila na 10 °C. Zmes sa znova ochladila na 0 °C a intenzívne sa miešala počas 15 minút. Organická vrstva (objem 570 ml) sa zachytila a predestilovala sa pri atmosférickom tlaku, aby sa odstránil DCM (450 ml, teplota zmesi 40 až 42 °C, teplota na hlave destilačného prístroja 38 až 39 °C). Pridal sa etanol (250 ml) a roztok sa nechal ochladiť na teplotu pod 30 °C a potom sa znova dal pod vákuum. Odstránilo sa ďalšie množstvo rozpúšťadla (zachytilo sa 40 ml, tlak 5,2 kPa (52 mbar), teplota zmesi a teplota na hlave destilačného prístroja predstavovali 21 až 23 °C) a produkt postupne vypadával z roztoku. Destilácia sa zastavila na tomto bode a pridalo sa ďalšie množstvo etanolu (50 ml). Zmes sa zahriala (horúci vodný kúpeľ s teplotou 50 °C) na 40 °C, aby sa rozpustila celá pevná látka a cez prikvapkávací lievik sa pomaly pridala voda (90 ml). Roztok sa cez noc pomaly miešal pri laboratórnej teplote (20 °C) (15 hodín), pričom za tento čas produkt vykryštalizoval. Zmes sa ochladila na teplotu -5 °C (kúpeľ ľad/metanol) a miešala sa pri tejto teplote počas 20 minút a potom sa bledožltá pevná látky zachytila filtráciou. Pevná látka sa premyla so zmesou etanol/voda (42 ml EtOH, 8 ml H2O) a odsala sa do sucha v priebehu 30 minút a potom sa vysušila do konštantnej hmotnosti vo vákuovej sušiarni (40 °C, 72 hodín). Hmotnosť získaného

-24surového produktu predstavovala 47,42 g (149,9 mmol, 60%). K surovému produktu (20,00 g, 63,22 mmol, 1,0 ekv.) sa pridal etanol (160 ml, 8 obj ). Zmes sa miešala pod dusíkom a zahriala sa na teplotu 40 °C s použitím horúceho vodného kúpeľa. Po dosiahnutí tejto teploty sa celé množstvo pevnej látky rozpustilo, pričom sa získal číry žltý roztok. Po kvapkách sa v priebehu 10 minút pridala voda (60 ml, 3 obj.), pričom vnútorná teplota sa udržiavala v rozsahu 38 až 41 °C. Vodný kúpeľ sa odložil a roztok sa nechal ochladiť v priebehu 40 minút na teplotu 25 °C, pričom následne sa začala kryštalizácia. Zmes sa v priebehu 10 minút ochladila na teplotu -5 °C, potom sa udržiavala pri tejto teplote počas ďalších 10 minút. Filtráciou sa zachytila bledožltá pevná látka, ktorá sa odsatím sušila počas 10 minút, potom sa vysušila do konštantnej hmotnosti vo vákuovej sušiarni (teplota 40 °C, 15 hodín). Hmotnosť získanej zlúčeniny, uvedenej v názve, predstavovala 18,51 g (58,51 mmol, 93 % (zo surového produktu)).

(ii) Zlúčenina A

K etanolovému roztoku (celkový objem 770 ml, približne 20 obj. vztiahnuté na amín) 3,3-dimetyl-1-(9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)-2-butanónu (predpoklad 34,97 g (overené skúškou), 154,5 mmol, 1,0 ekv.; pozri príklad 1(viii) uvedený vyššie) sa v jednom podiele pridal 3-(4-kyanoanilino)propylbenzénsulfonát (49,05 g, 154,52 mmol, 1,0 ekv.; pozri krok (i) uvedený vyššie). Výsledná zmes sa zahrievala pri teplote 74 °C počas 6 hodín, potom sa miešala pri laboratórnej teplote (20 °C) počas 65 hodín (cez víkend; odborník skúsený v odbore si bude vedomý toho, že reakcia sa môže úspešne uskutočňovať bez tohto predĺženého miešania pri laboratórnej teplote). Etanol (370 ml) sa odstránil a pridala sa voda (200 ml) (takto sa získal zmes 2 :1 EtOH : H₂O, celkový objem 600 ml). Po pridaní vody teplota zmesi poklesla z 80 °C na 61 °C. Roztok sa znova zahrial na 70 °C, potom sa nechal cez noc prirodzene ochladzovať na teplotu prostredia (19 hodin), pričom sa pomaly miešal. V tomto stupni sa pozorovala pevná látka. Zmes sa ochladila na teplotu 0 °C a potom sa miešala pri tejto teplote počas 15 minút a následne sa zachytila nie celkom biela pevná látka filtráciou. Pevná látka sa premyla s ochladenou zmesou etanol: voda v pomere 2:1 (150 ml), odsatím sa vysušila počas 1,25 hodin a potom sa sušila v sušičke (teplota 40 °C, 20 hodín).

-25Hmotnosť získaného surového produktu predstavovala 57,91 g (103,3 mmol, 60 %)·

Čistota surového produktu bola 98,47 % (ako sa stanovilo pomocou HPLC analýzy) a tento sa rekryštalizoval (s použitím postupu, ktorý je podrobne opísaný v ďalšom), pričom sa získala zlúčenina uvedená v názve, s čistotou 99,75 % (výťažok 84 %).

Postup rekryštalizácie:

Etanol (562 ml) a voda (281 ml) sa pridali k vyššie získanému surovému produktu (56,2 g). Roztok sa zahrial na teplotu 75 °C. Všetok materiál sa rozpustil pri teplote 55 °C. Roztok sa udržiaval na 75 °C počas 5 minút, potom sa v priebehu

1,5 hodiny ochladil na teplotu 5 °C. Vyzrážanie sa začalo pri teplote 35 °C. Ochladený roztok sa prefiltroval a zachytená zrazenina sa premyla so zmesou etanol: voda (v pomere 2:1, 168 ml). Pevný materiál sa odsal do sucha na filtri, potom sa vysušil vo vákuu pri teplote 40 °C, čím sa získal produkt (47,1 g, 84 %). (Tento postup rekryštalizácie sa môže tiež uskutočňovať s polovičným množstvom rozpúšťadla, pričom sa dosiahne zvýšenie výťažku produktu z 84 % na 94 %.) ¹H-NMR (400 MHz, CDCI₃) δ 1,06 (9H, s), 2,2 - 2,3 (2H, m), 2,89 (2H, d),

3,11 (2H, dd), 3,27 (2H, t), 3,3 - 3,4 (4H, m), 3,70 (2H, s), 4,1-4,15 (4H, m), 6,36 (1H, t), 6,44 (2H, d), 7,25 - 7,3 (2H, m), 7,33 - 7,4 (3H, m), 7,8 - 7,9 (2H, m).

Zlúčenina A sa testovala v teste A uvedenom vyššie, a zistilo sa, že vykazuje D₁₀ hodnotu 6,7.

Skratky

API = ionizácia atmosférického tlaku (vo vzťahu k MS) br = široký (vo vzťahu k NMR) d = dublet (vo vzťahu k NMR)

DCM = dichlórmetán dd = dublet dubletov (vo vzťahu k NMR)

DMF	= /V,/V-dimetylformamid
ekv.	=	ekvivalenty
Et	=	etyl
EtOAc=	etylacetát
EtOH	=	etanol
HCI	-	kyselina chlorovodíková
HPLC	=	vysokoúčinná kvapalinová chromatografia
IMS	=	priemyselne metylované liehy
m	=	multiplet (vo vzťahu k NMR)
Me	=	metyl
MeCN	=	acetonitril
MS	=	hmotnostná spektroskopia
NADPH	=	nikotínamidadeníndinukleotidfosfát, redukovaná forma
Oac	=	acetát
Pd/C	=	paládium na uhlíku
q	=	kvartet (vo vzťahu k NMR)
s	=	singlet (vo vzťahu k NMR)
t	=	triplet (vo vzťahu k NMR)
THF	=	tetrahydrofurán
TLC	=	chromatografia na tenkej vrstve

Predpony η-, s-, /-, t- a terc- majú svoje zvyčajné významy: normálny, sekundárny, izo, a terciárny.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. 4-({3-[7-(3,3-Dimetyl-2-oxobutyl)-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl]propyl}amino)benzonitril, soľ kyseliny benzénsulfónovej.
2. 4-({3-[7-(3,3-Dimetyl-2-oxobutyl)-9-oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]-non-3-yl]propyl}amino)benzonitril, monohydrát soli kyseliny benzénsulfónovej.
3. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu definovanú v nároku 1 alebo v nároku 2, v zmesi s farmaceutický prijateľnou pomocnou látkou, riedidlom alebo nosičom.
4. Farmaceutický prípravok na použitie pri profylaxii alebo pri liečení arytmie, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu definovanú v nároku 1 alebo v nároku 2.
5. Zlúčenina definovaná v nároku 1 alebo v nároku 2, na použitie ako liečivo.
6. Zlúčenina definovaná v nároku 1 alebo v nároku 2, na použitie pri profylaxii alebo pri liečení arytmie.
7. Použitie zlúčeniny definovanej v nároku 1 alebo v nároku 2, ako účinnej zložky na výrobu liečiva na použitie pri profylaxii alebo liečení arytmie.
8. Použitie podľa nároku 7, pričom arytmiou je atriálna alebo ventrikulárna arytmia.
9. Spôsob profylaxie alebo liečenia arytmie, vyznačujúci sa tým, že tento spôsob zahrňuje podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny definovanej v nároku 1 alebo v nároku 2, osobe trpiacej alebo náchylnej na takýto stav.
10. Spôsob prípravy zlúčeniny definovanej v nároku 1 alebo v nároku 2, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje (a) reakciu kyseliny benzénsulfónovej so 4-({3-[7-(3,3-dimetyl-2-oxobutyl)-9oxa-3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-l]propyl}amino)benzonitrilom; alebo (b) reakciu 3-(4-kyanoanilino)propylbenzénsulfonátu s 3,3-dimetyl-1-(9-oxa3,7-diazabicyklo[3.3.1]non-3-yl)-2-butanónom.