SK282305B6

SK282305B6 - Spôsob prípravy farmaceutického prostriedku

Info

Publication number: SK282305B6
Application number: SK329-96A
Authority: SK
Inventors: Josef Peter Guggenbichler; Peter Meissner; Johann Jurenitsch; Bettignies-Dutz Andreas De
Original assignee: Josef Peter Guggenbichler; Johann Jurenitsch; Bettignies-Dutz Andreas De
Priority date: 1993-09-10
Filing date: 1994-09-08
Publication date: 2002-01-07
Also published as: CA2171197A1; AU679262B2; AU7695694A; HUT74431A; CZ70896A3; EP0716605B1; WO1995007084A1; GR3029619T3; ES2127940T3; PL313393A1; JP3798425B2; US5683991A; RU96107098A; SK32996A3; HU9600602D0; EP0716605A1; DK0716605T3; DE4330773A1; JPH09502195A; ATE174222T1

Abstract

Spôsob prípravy farmaceutického prostriedku na inhibíciu adherencie zárodkov na bunky cicavcov, kde jeden alebo viaceré galakturonidy s polymerizačným stupňom >= 2 a esterifikačným stupňom < 20 %, prípadne spolu s farmaceuticky prijateľnými nosičmi, riediacimi, pomocnými a plniacimi látkami, sú vyrobené vo forme vhodnej na podanie.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka spôsobu výroby farmaceutického prostriedku na blokovanie adherencie zárodkov na bunky cicavcov.

Doterajší stav techniky

Galakturónové kyseliny majú široký rozsah použitia, ako je opísané napríklad v Hcinrichová a Šimon (Biológia, Vol. 46, s. 1081 až 1087, 1991). Známe použitia zahŕňajú napríklad použitie na kategorizáciu a klasifikovanie galakturonanáz a pektátlyáz alebo ako ligandy na selektívnu bioafinitnú chromatografiu. K známym účinkom patrí spúšťanie obranných mechanizmov vyšších rastlín a odstránenie toxických katiónov, ako napr. Cd²+,Cu²+ a Pb²+ v ľudskom gastrointestinálnom trakte. Roztoky výťažkov, ako aj šťavy z rôznych rastlinných produktov, sú v ľudovom liečiteľstve a v klinickom lekárstve známe svojimi účinkami proti ochoreniam v intestinálnom a urogenitálnom trakte, spôsobeným patogénnymi zárodkami. Farmaceutický účinok týchto prostriedkov v intestinálnom trakte bol doteraz vysvetľovaný reguláciou hospodárenia s vodou pomocou pektínov existujúcich v rastlinných produktoch.

Adherencia zárodkov, ako aj bakteriálnych mikroorganizmov na bunky je prvý krok pri vypuknutí každej infekcie. Až keď sa zárodky (napríklad baktérie a/alebo vírusy) naviažu na špecifické receptory na povrchu bunky a tým sa vyhnú telu vlastnej nešpecifickej obrane, ako je peristaltika, muciláma clearance, sekrečný tok, atď., môžu sa tu rozmnožiť, vniknúť do tela, rozvinúť toxické účinky a tým vytvoriť obraz choroby.

EP-A-0080442 objasňuje viacstupňový postup chemickej syntézy na výrobu oligosacharidov, ako aj oligogalaktozidov z pektínu, prípadne polygalakturónovej kyseliny. Z toho možno predvídať farmaceutické použitie oligosacharidov a acylovaných derivátov, vychádzajúc zo správ, ktoré naznačujú inhibičný účinok určitých galaktozidov, prípadne ich metyl- a p-nitrofenylderivátov, na adherenciu uropatogénnych Coli baktérií na určité červené krvinky.

Elegantným krokom antimikrobiálnej terapie by bolo, keby sa adherencia zárodkov ako podstatný mechanizmus virulencie oslabila a tým by sa telu umožnilo odplaviť zárodky z povrchu buniek, prípadne ich odtiaľ vytlačiť. Z toho vyplýva úloha predloženého vynálezu pripraviť prostriedok, ktorý blokuje adherenciu zárodkov na bunky cicavcov, najmä na epiteliálne bunky.

Podstata vynálezu

Táto úloha sa týka spôsobu prípravy farmaceutického prostriedku na inhibíciu adherencie zárodkov na bunky cicavcov, kde jeden alebo viaceré galakturonidy s polymerizačným stupňom ž 2 a esterifikačným stupňom < 20 %, prípadne spolu s farmaceutický prijateľnými nosičmi, riediacimi, pomocnými a plniacimi látkami, sú vyrobené vo forme vhodnej na podanie.

Prekvapujúco sa zistilo, že pomocou mrkvovej polievky klasicky pripravenej podľa MORa, pomocou urologického čaju (napríklad zmes prasličky roľnej, prvosienky jarnej, jahodových listov, islandského machu) pomocou kokosového mlieka, kaliny, atď., je možné (to znamená až do 90 %) redukovať adherenciu patogénnych zárodkov, ako napríklad E. coli, na bunky, najmä na epitelové bunky gastrointestinálneho a urogenitálneho traktu. Tento účinok sa dá odvodiť od pektínov, ktoré sú obsiahnuté v rastlinných produktoch, pri ktorých ide o určité reťazce 1,4-d-glykozidicky viazané galakturonidy, ktorých kyselinové skupiny sú od 20 do 80 % esterifikované metanolom a popri kyseline galakturónovej môžu v danom prípade obsahovať aj iné stavebné látky cukrov, napríklad glukózu, galaktózu, xylózu a arabinózu.

S prekvapením sa zistilo, že pektíny, prípadne galakturonidy, ktoré sa doteraz používali na tvorbu želatíny, ako zahusťovadlo alebo ako balastná látka, blokujú adherenciu zárodkov na bunky cicavcov a najmä na ľudské bunky.

Galakturonid účinný pri blokovaní adherencie zárodkov musí má určitý polymerizačný stupeň a najmä určitý esterifikačný stupeň. Pojem „polymerizačný stupeň” označuje v zmysle predloženého vynálezu počet jednotiek kyseliny galakturónovej, ktoré galakturonid obsahuje. Pojem „esterifikačný stupeň” označuje percentá (väčšinou metylom) esterifikovaných jednotiek kyseliny galakturónovej jedného galakturonidu vzťahujúc sa na celkový počet jednotiek galakturónovej kyseliny. Zistilo sa, že na blokovanie adherencie zárodkov na bunky cicavcov je potrebný polymerizačný stupeň > 2, to znamená, že monoméma kyselina galakturónová má, rovnako ako veľký počet iných sacharidov (napríklad neutrálne sacharidy, kyselina glukónová, arabinogalaktan, galaktóza-1-fosfát, glukóza-1-fosfát), žiadne blokovanie adherencie zárodkov. Vo výhodnom spôsobe výroby farmaceutického preparátu podľa vynálezu je esterifikačný stupeň galakturonidov < 20 %, obzvlášť výhodný < 10 % a ešte výhodnejší < 5 %. Najviac je výhodné, ak v podstate neexistujú žiadne ( < 2 % ) esterové skupiny. Galakturonidy s esterifikačným stupňom < 20 % sú získateľné z pektínov vyskytujúcich sa v prírode úplnou alebo čiastočnou demetylizáciou, napríklad zmydelnením s alkáliami. Polymerizačný stupeň galakturonidov vo vynájdenom preparáte je > 2, to znamená, že galakturonid má minimálne 2 jednotky kyseliny galakturónovej. Výhodný polymerizačný stupeň galakturonidu je 2 až 7, viac výhodný je 2 až 4, obzvlášť výhodný je 2 až 3 a najvýhodnejší je 2. To znamená, že digalakturonid, trigalakturonid, tetregalakturonid, pentagalakturonid, hexagalakturonid, heptagalakturonid a zmesi viacerých týchto substancií sú výhodnými galakturonidmi pre vynájdené prostriedky, pričom najvýhodnejší je digalakturonid, prípadne digalakturonová kyselina. V závislosti od spôsobu použitia sa môžu používať aj prostriedky, ktoré z hľadiska účinku neobsahujú najlepšie substancie, keď je táto substancia z farmaceuticko-technologických dôvodov menej výhodná na špeciálne aplikačné formy.

Galakturonidy s polymerizačným stupňom 2 až 4 možno z vyššie molekulárnych pektínov vyskytujúcich sa v prírode získať enzymatickou hydrolýzou s použitím pektín štiepiacich enzýmov (napríklad pektináza), ktoré sa priemyselne získavajú najmä z húb, ako napríklad Aspergillus alebo penicilínotvomých druhov. Na druhej strane môže byť hydrolýza vyššie molekulárnych pektínov prevedená aj kyslou hydrolýzou napríklad HC1. Vynájdené farmaceutické prostriedky môžu blokovať prichytávanie zárodkov, obzvlášť bakteriálnych zárodkov (napríklad E. coli, streptokoky, Haemophilis influenzae, pneumokoky, atď.) na bunky cicavcov, prípadne už naviazané zárodky vytlačiť. Obzvlášť sú prostriedky podľa vynálezu vhodné na liečbu infekcií gastrointestinálneho traktu (napríklad kolonizácia horných úsekov tenkého čreva pri hnačkovom ochorení), krvného systému (hemolytický uremický syndróm, zapríčinený E. coli 0157), dýchacích ciest (napríklad stúpajúce infekcie u pacientov v intenzívnej starostlivosti napojených na umelé dýchanie), urogenitálneho traktu (napríklad recidivujúce infekcie močového traktu) a/alebo nosohltanovej

SK 282305 Β6 dutiny (napríklad streptokokmi, H. influenzae, pneumokokmi).

Vynájdené farmaceutické prostriedky podľa vynálezu môžu byť podávané pri už existujúcej chorobe a rovnako aj profylaktický. Možno uvažovať o nasledovných možnostiach aplikácie:

a) perorálna aplikácia pri liečbe gastrointestinálneho traktu, močového traktu, ako prísada do rehydratačných roztokov, ako profylaktikum proti kolonizácii patogénov v žalúdočno-črevnom trakte, atď., u pacientov v intenzívnej starostlivosti s umelým dýchaním,

b) povrchová aplikácia na ošetrenie nosohltanovej dutiny, urogenitálneho traktu, atď. a

c) parenterálne podávanie.

Galakturonidy ako súčasti štruktúry polysacharidov sa vyskytujú vo veľkom množstve potravín a potravinových pomocných látok a sú takto prijímané perorálne, to znamená, že nie sú toxické a sú zvlášť vhodné na farmaceutické použitie. Získavanie galakturonidov používaných pri farmaceutických prostriedkoch podľa vynálezu možno dosiahnuť z polysacharidov vyskytujúcich sa v rastlinách, napríklad z mrkvy, citrusového ovocia, jabĺk, cukrovej repy, kokosového mlieka a iných rastlín alebo rastlinných produktov. Z dôvodov získania galakturonidov sa východiskové materiály najprv rozdrobia a extrahujú horúcou vodou. Extrakty sa môžu najprv lyofilizovať alebo ich možno ďalej priamo spracovať. Ďalšie spracovanie prebieha prevažne použitím chromatografických metód, ktorými je možné oddelenie galakturonidov od ostatných súčastí extraktu (napríklad iných sacharidov). Výhodnými deliacimi chromatografickými metódami sú gélová chromatografia (napríklad oddelovače BioGel^R, Sephacryl^R) a/alebo chromatografia na anexoch (napríklad DEAE-Sephacel^R- oddeľovacie látky). Získané pektíny môžu byť ďalej čiastočne alebo úplne zmydelnené, aby sa znížil esterifikačný stupeň a/alebo hydrolyzované prostredníctvom opracovania kyselinou, prípadne enzymaticky, aby sa znížil polymerizačný stupeň. Na objasnenie vynálezu slúžia ďalej nasledovné príklady.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Čerstvé mrkvy sa umyjú, olúpu a nastrúhajú. Extrakciou s vriacou vodou a následnou lyofilizáciou sa získajú vodné roztoky polysacharidov.

Nasleduje prvý deliaci stupeň gélovou chromatografiou na stĺpci s BioGelom P2 a destilovanou vodou ako eluentom. Substancie, ktoré eluujú vo vylučovacom objeme tohto stĺpca sa spoja a druhýkrát sa oddelia gélovou chromatografiou. Ako deliaca látka slúži Sephacryl S-3000 HR a ako eluent opäť destilovaná voda. Z dvoch substančných píkov, ktoré sa teraz objavia, sa zozbiera ten, ktorý eluuje neskôr. Tretím krokom úpravy je chromatografia na ionexoch DEAE - Sephacel s pufrovým gradientom ako eluentom (0,011 M až 1 M fosfátového pufra, pH 6,4). Frakcia, ktorá eluuje pri vyššej molarite (SF II), sa spojí a ďalej spracováva. Potom nasleduje hydrolýza s HC1 (pH 1,00,37 C, 45 minút) a spätné získavanie sacharidov alkoholovým zrážaním. Hydrolyzát sa pomocou gélovej chromatografie (Sephacryl S-2000HR, eluent: destilovaná voda) rozdelí do troch skupín látok, pričom sa pozbierajú uhľohydráty s najmenšou molekulovou hmotnosťou (SF 2/3). Antiadhezívna aktivita frakcií, s ktorými sa ďalej pracuje, prevyšuje aktivitu prípadných vedľajších produktov. Inhibíčna intenzita jednotlivých substancií stúpa v priebehu spracovania z 50 % v 0,7 %-nom roztoku (pri SF A) nad 86,4 % v 0,005 %-nom roztoku (pri SF II) až po úplnú inhibíciu rovnako v 0,005 %-nom roztoku (pri SF 2/3). Z tohto vyplýva, že so zvyšujúcou sa čistotou, je koncentrácia potrebná na určitý účinok značne menšia. Toto je v protiklade s pektínmi dostupnými komerčne, ktoré musia byť použité vo veľmi vysokej koncentrácii, aby sa dosiahli podobné účinky.

Príklad 2

Zmydelnenie

11,3 g citruspektínu, Fa Grindstedt (Substancia AJ sa rozpustí v 1200 ml destilovanej vody, zmieša sa s 480 ml 0,5 N NaOH a 15 min. sa pri izbovej teplote zmydelňuje. Roztok sa upraví kyselinou mravčou na pH 4,0. Zmydelnený pektín sa vyzráža s dvojitým množstvom metanolu, rozpustí sa v 200 ml vody a zrážanie sa ešte dvakrát rovnakým spôsobom opakuje. Naposledy získaná zrazenina sa vysuší pri 50 “C (Substancia AJ. Navážka: 7,15 g.

Enzymatická hydrolýza

Usušená zrazenina sa rozpustí v 100 ml 0,1 M roztoku nátriumhydrogenkarbonátu, kyselinou mravenčou (IM) sa upraví pH na 4,5, zmieša sa s 21 mg pektinázy 5S z Aspergillus niger (SERVA) a počas 60 minút sa pri teplote 60 °C inkubuje. Usadenina sa krátko ohreje na 80 °C kvôli aktivácii enzýmov, ochladí sa a opísaným postupom sa vyzráža s metanolom. Centrifugovaním (20 minút, 4000 otáčok/min.) sa získa zrazenina a vysuší sa. Navážka: 5g (substancia A₂). Tenkovrstvovou chromatografickou kontrolou sa otestuje, či hydrolýza vytvorila dostatočné množstvá požadovaných oligogalakturonidov.

Podmienky tenkovrstvovej chromatografie

Stacionárna fáza : DC - hotové platne Silikagél 60 (MERCK), 10 cm x 20 cm

Rozpúšťadlo: etanol/roztok kyseliny octovej 25 mM 1:1

Vyvíjanie: pri 35 °C

Činidlo na detekciu: 200 mg naftalín-l,3-diolu v 50 ml metanolu plus 50 ml H₂SO₄ (20 % g/g)

Chromatografia

1,5 g produktu hydrolýzy sa rozpustí v 15 ml destilovanej vody a podrob! sa chromatografickej frakcionácii.

Stĺpec: Sklenený stĺpec Bio-Rad (2,5/40 cm) obsah lôžka 150 ml

Eluent: Mravčan sodný ako pufer pH 4,7, stupňový gradient každých 182 ml 0,2,0,3,0,4, 0,5,0,6,0,7 M Stacionárna fáza: Bio-Rad AGMP 1 anexová živica (rovnovážne s eluentom)

Prietoková rýchlosť: 3ml/minutu Objem frakcie: 22 ml

Jednotlivé frakcie sa hodnotia na svoje zloženie pomocou DC (podmienky pozri hore). Frakcie rovnakého zloženia sa spoja a vyzrážajú sa s dvojitým objemom acetónu. Týmto spôsobom a za týchto podmienok sa oligogalakturonidy získajú centrifúgáciou (4000 otáčky/minútu) a pridajú sa do 20 ml destilovanej vody.

Do roztoku sa primieša Bio-Rad AG 50 W X-8 katex (H+), aby sa galakturonidy previedli do formy voľnej kyseliny. Po odstránení živice a po lyofilizácii filtrátu sa získa vločkovitý biely prášok. Výsledky inhibicie sú uvedené v tabuľke 1.

SK 282305 Β6

Tabuľka 1

Označenie substancie	Charakteristika	Koncentrácia v %	Inhibícia v%
Ao	Pektín USP¹'	0,7	15,3
Aj	zmydelnený pektín	0,2	10,0
Az	čiastočne hydrolyz. A¹	0,05	30,2
Fl	neutrálny Di- a Trisacharid	0,005	0,0
F?	neutrálny trisacharid	0,005	0,0
F,	neutrálny tetrasacharid	0,005	0,0
f₄	trigalakturonid	0,005	84,6
f₅	tetragalakturonid so stopami trigalakturonidu	0,005	58,6
f₆	tetragalakturonid	0,005	52,7
f₇	penta-hexagalakturonid	0,005	23,9

''citruspektín (Grindstedt)

Metódy na skúšanie účinnosti inhibície

Test adhézie

1) Hemaglutinácia ľudských 0+ erytrocytov

Po zlúčení erytrocytov so zárodkami dochádza pri silne hemaglutinujúcich kmeňov do 20-tich sekúnd k aglutinácii erytrocytov, ktorá zodpovedá, čo do intenzity neznášanlivosti krvných skupín.

Koncentrácia erytrocytov: 1 až 1,5 % Suspenzia zárodkov: kalná suspenzia OD 1 pri 462 nm=10⁹zárodkov/ml.

Pri hodnotení inhibície aglutinácie sa zárodky pred pridaním k erytrocytom inkubujú 2 hodiny s uhľohydrátovými roztokmi želanej koncentrácie a potom sa hemaglutinácia semikvantitatívne hodnotí okom.

2) Adherencia na ľudské uroepitélie

Uroepitélie z ranného moču sa izolujú centrifúgáciou. Suspenzie zárodkov sa spoja s epitelovými bunkami a inkubujú, potom sa prefiltrujú cez 8 μ polykarbonátový filter a viackrát sa premyjú. Filtre sa odstránia, dajú sa do fyziologického roztoku NaCl a epitelové bunky sa pretrepávajú. Suspenzia NaCl sa opäť centrifuguje a sediment sa nanesie na podložné sklíčko, zafarbí sa podľa May Griinwalda a Giemsu a priľnuté zárodky sa spočítajú na 50 epitelových buniek. Kontroly: epitelové bunky bez kontaktu so zárodkami. Inhibícia adherencie: rovnaká metóda, len zárodky sa pred pridaním do suspenzie epiteliálnych buniek na 1 až 3 hodiny vložia do roztoku (0,5 0,1 0,05 0,001 %) rôznych uhľohydrátov. Použité zárodky: 4 E. coli- kmene divokého typu, ktoré sa izolujú od pacientov, a 2 komerčné kmene sa použijú v rovnakých množstvách.

Výsledky

V rámci mikrobiologických sledovaní sa popri taxatívne vytváraných kyslých oligo- a polysacharidov použijú aj neutrálne sacharidy, ktoré nemajú žiadne inhibičné účinky na adherenciu (napríklad fruktány ako inulín, disacharidy ako laktóza a laktulóza, atď.)

Natívne, to znamená extrakciou získané pektíny účinok inhibujúci adherenciu, ktorý však môže byť ďalším spracovaním, napríklad zmydelnením a hydrolýzou zvýšený.

Tak v uvedenej testovacej vzorke mal pektín získaný vodnou extrakciou z mrkiev 46 % inhibíciu v 1 % roztoku testovanej vzorky, inhibícia purifikovaných produktov z tej istej vzorky pri koncentrácii 0,1 % bola 80 %.

V nasledovnej tabuľke 2 sú zhrnuté ďalšie výsledky mikrobiologických sledovaní.

Inhibícia bakteriálnej adhézie na epiteliálne bunky zvolenými substanciami v %:

Tabuľka 2

Označenie substancie	Koncentrácia v%	Inhibícia v %
vodný extrakt z mrkvy'¹	1	46,0
SF A (pozri príklad 1)	0,7	50,0
SF II (pozri príklad 1)	0,005	86,4
SF 2/3 (pozri príklad 1)	0,005	113,5
Kys. polygalakturónová z pomarančov	0,2	99,0
Kys. polygalakturónová z pomarančov	0,05	72,0
Kyselina monogalakturónová	1	žiadna inhib.
Kyselina digalakturónová	0,005	91,7
Trigalakturonid²'	0,005	84,6
Tetragalakturonid²'	0,005	52,7
Penta-hexagalakturonid	0,005	23,9
Arabinogalaktan	0,005	žiadna inhib.
Jablčný pektín	0,05	20,5
Pektínová kyselina z jabĺk	0,05	64,8
Galaktóza-1 -fosfát	0,005	3,4
Glukóza-1-fosfát	0,005	žiadna inhib.
Kyselina glukorónová	0,005	žiadna inhib.

''podobne ako príklad 1 ²⁾získaný podobne ako v príklade 2

Ako je viditeľné z tabuľky 2, zvýšenie účinku sa dá odvodiť v závislosti od esterifikačného stupňa a od veľkosti molekúl (polymerizačného stupňa). Výhodné výsledky sa získajú pri polymerizačnom stupni 2 až 7.

Zmydelnením (to znamená odstránením esterových skupín) sa rovnako zistilo zlepšenie inhibície.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob prípravy farmaceutického prostriedku na inhibíciu adherencie zárodkov na bunky cicavcov, vyznačujúci sa tým, že jeden alebo viaceré galakturonidy s polymerizačným stupňom > 2 a esterifikačným stupňom < 20 %, prípadne spolu s farmaceutický prijateľnými nosičmi, riediacimi, pomocnými a plniacimi látkami sú spracované do formy vhodnej na podanie.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že esterifikačný stupeň galakturonidu je < 10 %.
3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa t ý m , že esterifikačný stupeň galakturonidu je < 5 %.
4. Spôsob podľa jedného z nárokov laž 3, vyznačujúci sa tým, že polymerizačný stupeň galakturonidu je 2 až 7.
5. Spôsob podľa jedného z nárokov laž 4, vyznačujúci sa tým, že polymerizačný stupeň galakturonidu je 2 až 6.
6. Spôsob podľa jedného z nárokov laž 5, vyznačujúci sa tým, že polymerizačný stupeň galakturonidu je 2 až 5.

SK 282305 Β6
7. Spôsob podľa jedného z nárokov laž 6, vyznačujúci sa tým,žepolymerizačnýstupeňgalakturoniduje 2 až 4.
8. Spôsob podľa jedného z nárokov laž 7, vyznačujúci sa tým,žepolymerizačnýstupeňgalakturonidu je 2 až 3.
9. Spôsob podľa jedného z nárokov laž 8, vyznačujúci sa tým,žepolymerizačnýstupeňgalaktuTonidu je 2.
10. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 9 na výrobu farmaceutického prostriedku na liečbu infekcií gastrointestinálneho traktu, krvného systému, dýchacích ciest, urogenitálneho traktu a/alebo nosohltanovej dutiny.