JP4948162B2 - 新規アラビノガラクタン及び抗糖尿病薬 - Google Patents

Description

本発明は、新規なアラビノガラクタン及び抗糖尿病薬、具体的には抗糖尿病作用を有する新規なアラビノガラクタンに関するものである。

生活習慣病において、最も深刻な問題となっているのは糖尿病と言える。厚生労働省の「平成１４年糖尿病実態調査」によると、糖尿病患者及び糖尿病予備軍を合計するとその数は約１６２０万人にのぼると推計されており、増加の一途を辿っている。糖尿病を含め生活習慣病の増加は、食生活の変化が主な原因であると言われており、特に、脂肪摂取量の増加や食塩の過剰摂取が大きな原因として指摘されている。中でも、食物繊維の不足が深く関与していると考えられている。生活習慣病の予防や治療には食物繊維の十分な摂取が重要であり、１日当たり２０〜３０ｇの摂取が推奨されている。

食物繊維には、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、キチン等からなる不溶性食物繊維とコンニャクマンナン（グルコマンナン）、グアーガム（ガラクトマンナン）、アラビノキシラン、アラビノガラクタンなどからなる水溶性食物繊維がある。両者ともこれまで、人の消化酵素では分解されず栄養的な価値もなく、しかも栄養素の利用効率を阻害する物質とみなされ、食物の不要物として扱われてきた。しかし、腸内細菌叢の改善、消化管運動の活発化、糖質・脂質などの消化吸収を低下させるなど、その有用性が次第に明らかになり、注目されるようになった。そのメカニズムは未だ明らかにはされていないが、腸内細菌による発酵時に生じる短鎖脂肪酸などが体内のホルモン分泌調節をすることで、肝臓でのコレステロール合成や糖の代謝に影響を与えているのではないかと考えられている（J Am Diet Ass,103(1),86-96,2003、Diabetes care.,23(1),9-14,2000、Am J Gastroenterol.,85,549-553,1990）。この他にも、水溶性食物繊維は免疫活性、抗腫瘍活性など多くの生理機能を有することが明らかにされてきている（Carbohydr Polym.,25,269-276,1994、Phytochemistry,27(8),2511-2517,1988）。食物繊維の本質は多糖類であって、多糖類の中でも不溶性多糖類は高摂取量の必要性があると言われている。また、近年ではより低容量で効果が得られる水溶性多糖類に注目が注がれている。

これまでに、水溶性多糖類であるガラクトマンナン（Nutr. Res.,20(9),1301-1307,2000）やアラビノキシラン（Clin. Exper.Pharm.Phys.,27(1-2),41-45,2000）が抗糖尿病作用を有することが明らかにされている。しかし、同じく水溶性多糖類であるアラビノガラクタンについては、そのほとんどは免疫賦活作用を示す報告であって、わずかに、ガラクトース（Ｇａｌ）がβ１，３結合したガラクタンを主鎖に持ち、そのガラクタンの６位にβアラビノピラノース（Ａｒａｐ）とαアラビノフラノース（Ａｒａｆ）がα１，３結合したオリゴ糖やＡｒａｆとＧａｌがβ１，３結合したオリゴ糖、ＧａｌとＧａｌがβ１，６結合したオリゴ糖が側鎖として結合したアラビノガラクタン（ＡＧII）が、高脂血症患者に対し血糖値を低下させたとの報告があるに過ぎない（2001 IFT Annual Meeting）。

アラビノガラクタンは、細分化されているが大別すると２つの種類に分類される。すなわちペクチン性アラビノガラクタン（以下タイプＩ−ＡＧ）とアラビノ−３，６−ガラクタン（以下タイプII−ＡＧ）とに分類される。前者のタイプＩ−ＡＧは、ガラクトース（Ｇａｌ）がβ１，４結合したβ１，４−ガラクタンを主鎖に持ち、その構成成分であるＧａｌ残基の３位に２個のαアラビノフラノース（αＡｒａｆ）がα１，５結合したオリゴ糖（αＡｒａｆ（１→５）αＡｒａｆ（１→）が結合した構造を有する。一方タイプII−ＡＧは、主にカラマツやアカシアの樹液などから得られ、アラビノ−３，６−ガラクタン構造を主鎖に持ち、Ａｒａｆ及びＧａｌなどからなる側鎖が主鎖にβ１，３結合しているものが多い。また、Ａｒａ及びＧａｌの構成比率は植物種により大きく異なるが、一般的にはＧａｌが多く含まれている。また、アラビノガラクタンには、主要構成糖であるＡｒａ、Ｇａｌの他にフコース（Ｆｕｃ）、ラムノース（Ｒｈａ）、キシロース（Ｘｙｌ）、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）などを含むものもあり、その構造は非常に多岐にわたる。また、当帰中のＡＧIIａは、ガラクトースがβ１，６結合したβ１，６−ガラクタンを主鎖に持ち、その構成成分であるＧａｌ残基の３位に、αＡｒａｆや２個のαＡｒａｆがα１，５結合したオリゴ糖（αＡｒａｆ（１→５）αＡｒａｆ（１→）若しくはＧａｌやαＡｒａｆとＧａｌがα１，３結合したオリゴ糖（αＡｒａｆ（１→３）αＧａｌ（１→）が結合した構造を有している。

このような状況下において、糖尿病治療においては、長期にわたる自己管理を必要とすることから、食事療法によるのが最も負担が少なく優れている。また、副作用や摂取容易性を考慮すれば、好ましくは食品に由来し、または食品形態に近い抗糖尿病薬の開発が望まれるところである。

そこで、本出願人は、種々の食品から抗糖尿病作用物質を検索していたところ、白甘藷からの抽出物がヒトに対する抗糖尿病作用を有することを見出し、特願平８−２９３１３０（特許文献１：特開平１０−１２０５８４号）として出願している。この抽出物は、約２万程度の分子量を有し、その主成分は蛋白質であるとされている。そして、本願発明者らは、さらに効果のよい抗糖尿病作用物質を調査していたところ、上記従来のアラビノガラクタンとは全く構造が異なるアラビノガラクタンが抗糖尿病作用を有していることを見出し、本願発明を完成するに至った。
特開平１０−１２０５８４号公報

本発明は、食品中に存在する新たな抗糖尿病作用成分を見出し、より有効で安全に摂取可能な抗糖尿病薬若しくは抗糖尿病作用を有する機能性食品を提供することを目的としている。

本発明は、白甘藷の皮部分あるいは塊根部分の水系抽出液の透析内液に低級アルコール若しくは低級ケトンを加え、沈殿除去後に得られる上清部分を弱塩基性アニオン交換樹脂に吸着後、約２００〜４００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液が有するイオン強度の溶出液で溶出されるβ１，６結合したＧａｌ糖鎖がβ１，３結合により高度に枝分かれした骨格を有するアラビノガラクタンであって、
当該骨格を構成するＧａｌに側鎖として（１）αＡｒａｆがα１，３結合若しくは（２）αＡｒａｆ（１→５）αＡｒａｆがα１，３結合するとともに（３）αＲｈａ（１→４）βＧｌｃＵＡが前記骨格の末端Ｇａｌの一部若しくはその全部にβ１，６結合した平均分子量１０万〜２０万、ラムノース：グルクロン酸の構成比が概ね１：１、アラビノース：ガラクトースの構成比が概ね１：２、ラムノース：アラビノースの構成比が１：５〜６、フェノール硫酸による発色を示すが２８０ｎｍ付近に吸収をほとんど示さないアラビノガラクタンという新規な物質に係るものである。そして、本発明は、当該物質の抗糖尿病作用に着目したものである。

そして、本発明は、上記物質を有効成分として含有する抗糖尿病薬または血糖値を正常範囲に維持可能に含有せしめる食品の製造方法に及ぶ。

本発明のアラビノガラクタンの構造は、従来のアラビノガラクタンの構造と全く異なるものであり、抗糖尿病作用物質として利用することができる。このものは、主として白甘藷中に含まれるものであり、安全性に優れていると考えられる。また、本発明におけるアラビノガラクタンは、グリコマンナンやアラビノキシランと同様に水溶性食物繊維の一種であるために、抗糖尿病作用物質だけでなく排便促進など他の食物繊維と同じような作用も同時に期待できる。そして、水溶性であるために服用しやすく、しかも少量で効果を発揮するために、医薬品の形態はもちろんのこと種々の食品形態、例えばドリンクやゼリー状の食品、ふりかけのような粉末状の食品などとして提供することもできる。

本発明に係るアラビノガラクタンの基本骨格を示す図である。 本発明に係るアラビノガラクタンの基本骨格への側鎖の結合様式を例示する図である。 本発明に係るアラビノガラクタンの精製工程の概略を示す図である。 図３における粗抽出物のゲルろ過クロマトグラフィーの溶出パターンを示した図である。−■−はフェノール硫酸法による４９０ｎｍにおける吸収を、−◆−は２８０ｎｍにおける吸収を示す。また、図には分取したフラクション区分をＦ１〜Ｆ４で示した。 ろ過ゲルクロマトグラフィーにおけるＦ１フラクションのイオン交換クロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。−■−はフェノール硫酸法による４９０ｎｍにおける吸収を、−◆−は２８０ｎｍにおける吸収を示す。また、図には分取したフラクション区分を「２００ｍＭＮａＣｌ」及び「４００ｍＭＮａＣｌ」で示した。 イオン交換クロマトグラフィーにおける２００ｍＭＮａＣｌフラクションのＭＡＬＬＳ−ＳＥＣによる分析チャートである。図に示すドット状の線はアラビノガラクタンの分子量分布を示す。 イオン交換クロマトグラフィーにおける２００ｍＭＮａＣｌフラクションのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによる分析チャートである。 イオン交換クロマトグラフィーにおける２００ｍＭＮａＣｌフラクションのＧＳ−ＭＳによる分析チャートである。 本発明に係るアラビノガラクタンのＨＭＢＣ解析図である。 連続経口投与試験における血糖降下作用を示す図である。 糖負荷時における血糖値の経時変化を示す図である。

本発明の有効成分であるアラビノガラクタンは、主に白甘藷の皮から抽出、分離されて得られるものである。白甘藷は、その学名をIpomoea Batatas spといい、さつま芋（ヒルガオ科の草本Ipomoea Batatas Poiret）の一種であり、別名「シモン芋」「カイアポ芋」「白サツマイモ」などと称される場合もある。本発明においては、白甘藷の塊茎、特にその皮から得られたものが好ましく用いられる。しかし、以下の構造を有するものであれば、白甘藷及びその近縁植物から得られたものに限られるものではない。

このアラビノガラクタンは、ガラクトースがβ１，６結合した糖鎖からなり、β１，３結合によって高度に枝分かれした図１に示す基本骨格を有する。すなわち、ガラクトースがβ１，６結合した主鎖に対して、ガラクトースがβ１，６結合したオリゴ糖若しくはガラクトグリカンがβ１，３結合した側鎖を多数有し、またこの側鎖に対してガラクトースがβ１，６結合したオリゴ糖若しくはガラクトグリカンがβ１，３結合した側鎖を有するというように、ガラクトースがβ１，６結合した糖鎖がβ１，３結合によって複雑に分岐した骨格を有している。その結果、比較的かさ高な構造を有するものとなり、この点においてガラクトースよりなる直線状の糖鎖を主鎖とする従来のアラビノガラクタンとは著しく異なる特徴を有している。

そして、本発明のアラビノガラクタンは、図１に示すような基本骨格に対して、図２（Ａ）（Ｂ）に示すように３種の側鎖（１）（２）（３）が結合している。側鎖（１）は末端αＡｒａｆ、側鎖（２）は２個のアラビノフラノースがα１，５結合したオリゴ糖（αＡｒａｆ（１→５）αＡｒａ（１→）、側鎖（３）はラムノースがグルクロン酸にα１，４結合したオリゴ糖（αＲｈａ（１→４）βＧｌｃＵＡ（１→）であって、側鎖（１）（２）はそれぞれ上記骨格を構成するガラクトースに対してβ１，３結合し、側鎖（３）はグルクロン酸が上記骨格を構成するガラクトースに対してβ１，６結合している。

側鎖（１）（２）（３）の結合位置やガラクトース糖鎖の分岐位置は不詳であるが、上記骨格を構成するＧａｌの約６５〜７５％に側鎖（１）または側鎖（２）が結合し、上記骨格を構成するガラクトースの５〜１０％に側鎖（３）が結合したものが抗糖尿病作用を有する。なお、側鎖（１）（２）（３）のＧａｌへの結合比率はこの範囲から外れるものも考えられる。つまり、その結合比率は目安であって、得られたアラビノガラクタンの結合比率がこの範囲を外れたとしても、上記基本骨格及び上記側鎖（１）（２）（３）並びに平均分子量を有してさえいれば、本発明のアラビノガラクタンと同一の物質であると言える。

以上説明したように、本発明にかかる新規アラビノガラクタンは、図１に示すようにガラクトースがβ１，６結合した糖鎖に対して、ガラクトースがβ１，６結合した糖鎖が随所でβ１，３結合によって分岐するとともに、β１，６結合したガラクトース糖鎖に対して図２（Ａ）（Ｂ）に示すように側鎖（１）または（２）が随所で前記糖鎖のガラクトースにβ１，３結合するとともに図２（Ｂ）に示すごとくガラクトースの糖鎖末端の一部若しくはその全てに側鎖（３）がβ１，６結合した構造を有している。

本発明におけるアラビノガラクタンの平均分子量は約１０万〜２０万であって、図６に示すようにその分子量分布の幅は他の多糖類に比べて極めて幅が狭いこともその特徴である。なお、ここにいう平均分子量とは実施例において述べる方法で求めた値を意味し、本発明におけるアラビノガラクタンはこの値が１０万〜２０万の間に存在するものである。従って、下記ＭＡＬＬＳ−ＳＥＣ法によって分子量を測定した場合に、単一ピーク内において分子量が１０万〜２０万の範囲を外れるものが多少混ざっていても差し支えない。

このアラビノガラクタンの構成糖比は、実測によるとラムノース：アラビノース：ガラクトース：グルクロン酸＝１.２：６.７：１４.１：１.０であって、おおよそラムノース：グルクロン酸＝１：１、アラビノース：ガラクトース＝１：２、ラムノース：アラビノース＝１：５〜６である。

本発明のアラビノガラクタンは、例えば図３に示す方法により得ることができる。まず、白甘藷、いわゆるカイアポイモの皮の乾燥物を破砕若しくは粉末にし、水を加える。アラビノガラクタンは主として塊茎の皮に多く存在していると考えられているので、収率の観点から原料には主として塊茎の皮が好ましく用いられる。もちろんイモ全体を原料として用いても差し支えなく、また、地上茎や全草を用いても差し支えない。他の植物等から抽出する場合も同様に、高い収率が見込まれる部分が好ましく用いられる。

アラビノガラクタンは、水溶性多糖の一種であるため、他の水溶性多糖類の抽出と同様にまず最初に水系の抽出溶媒が用いられる。抽出溶媒には水が最も好ましく、エタノールなどの低級アルコール（Ｃ１〜Ｃ４）、アセトンなどの親水性溶媒や水にこのような親水性溶媒を加えた混合物でもよい。また、抽出時には適宜、加温加熱してもよい。抽出方法も特に限定されるものではない。例えば、ジューサーやミキサ等にかけて破砕・搾汁し、その後遠心分離法やろ過等により不溶物を除去する。また、一度抽出した残渣に再度抽出溶媒を加えて、先の抽出液に加えてもよい。これらは、多糖類の一般的な抽出方法である。

次に、得られた抽出液を脱イオン交換水にて透析する。脱イオン交換水にて透析することによって、不純物である抽出液中の塩類や単糖類などの低分子物質が除去される。使用する透析膜は排斥分子量が１２０００〜１５０００Ｄａ程度以上のものが好適である。これよりも小さな排斥（限界）分子量のものでも十分目的を達成できるが透析時間が長くなるので不利となる。また、１２０００〜１５０００Ｄａ程度の透析膜には透析効率のよい透析膜、すなわちメンブレン当たりの透析孔の数が多いものが市販されており（たとえば、フナコシ社製スペクトラバイオテックメンブレン／ポア２.１）、効率性が望まれるため、上記範囲のものが好適とされる。また、透析によって沈殿物が生じる場合があるので、適宜遠心分離などにより生じた沈殿物を取り除く。こうして、１００００Ｄａ程度以下の低分子量である夾雑物を除去する。この工程は必須の工程ではないが、この工程を行うことにより以下の工程であるゲルろ過クロマトグラフィーにおける作業効率を著しく高めることができる。そして、得られた透析内液を用いてさらに精製を進める。このとき、透析内液中の濃度は十分に高いものとは言えないので必要に応じて濃縮を行うのがよい。濃縮はエバポレータなどを用いて減圧下、好ましくは４０℃程度の低い温度で行う。

そして、得られた透析内液（若しくはそれを濃縮した液）に低級アルコール若しくは低級ケトンを加えて静置し、さらに目的物質以外の不純物を沈殿除去する。この低級アルコールとしてはエタノール若しくはメタノールが、低級ケトンとしてはアセトンが好適である。この操作は繰り返されることが好まれる。この操作を繰り返す際には、アルコール等（エタノールやメタノール、アセトン）の濃度を次第に高めていくのが好ましい。すなわち、まず低い濃度でアルコール等を加えて沈殿物を生じさせ、これを除去する。そして、沈殿物を除去した液にさらにアルコール等を加えてアルコール等の濃度を高め、さらに沈殿物を生じさせる。そうして、アルコール等を加えた際に沈殿が生じなくなるまで繰り返される。しかしながら、アルコール濃度が約６０v/v％を超えないように注意する必要がある。アルコール濃度が約６０v/v％を超えてしまうと目的とする物質が沈殿されてしまうおそれがあるので、アルコール濃度に留意しながら添加する。また、アルコール濃度を少なくとも２０v/v％以上の高濃度にして沈殿物を生じさせるのがよい。そして、遠心分離等によって分取された上澄液を、濃縮して粗抽出物を得る。なお、本発明のアラビノガラクタンは、構成糖としてラムノースを含んでいるので、アルコール等の濃度を６０v/v％程度にまで高めても沈殿を生じにくいが、低温下における操作では、その濃度が低い場合でも目的物質が沈殿する場合（例えば、液温４℃では６０v/v％エタノールで沈殿されてしまう。）もある。そこで、操作環境には十分な注意が必要である。また、放置時間も長時間、例えば４８時間程度放置すれば目的物が沈殿する場合があるので、好ましくは２４時間程度の静置に留めるのが好ましい。この精製手法は多糖類を精製するための一般的な手法である。また、ラムノース含有量の多さに鑑みると、本発明のアラビノガラクタンが沈殿しない程度の高濃度にアルコール等を一度に加えて不純物をほぼ沈殿除去した上で、さらもアルコール等を高濃度（少なくとも６０v/v％以上）に添加して目的物を沈殿させ、粗抽出物を得ることもできる。

そして、次にこの粗抽出物をさらに分画して、目的であるアラビノガラクタンを得る。分画は、ゲルろ過クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせにより行われる。

ゲルろ過クロマトグラフィーによる分画において、充填剤として、商品名トヨパールＨＷ−６５Ｓ（限界分子量デキストラン７０〜１３０万、東ソー株式会社）や商品名Sephacryl Ｓ−４００ＨＲ（限界分子量デキストラン１〜２００万、球状タンパク２〜８００万、アマシャムバイオサイエンス株式会社）が例示される。また、溶離液は、用いる充填剤によっても異なるが、好ましくは水である。そして、溶出液について波長２８０ｎｍ及びフェノール硫酸による発色後波長４９０ｎｍにおける各吸光度を測定し、波長２８０ｎｍの紫外領域に吸収がなく４９０ｎｍに吸収を示す、分子量約１０〜２０万Ｄａに相当するピークを分取する。

次にこの分取された物質を、イオン交換樹脂によりさらに分画して目的となるほぼ単一な物質であるアラビノガラクタンを得る。このとき、用いられるイオン交換樹脂は、例えばＤＥＡＥ-セファデックスＡ５０（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）やアンバーライトＩＲＡ９６ＳＢ，ＩＲＡ６７などに代表される弱塩基性イオン交換樹脂である。そして、イオン交換樹脂に捕捉された抗糖尿病作用物質は、強イオン電解液で溶出される。この強イオン電解液には塩化ナトリウム水溶液が好ましく用いられ、そのときのイオン強度は、１００〜４００ｍＭ、好ましくは約２００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液のイオン強度に匹敵するものが好適である。４００ｍＭを超えると目的物質以外の、例えばタンパク質のような塩基性物質までもが一緒に溶出される可能性がある。また、この分画に際しても、溶出液の波長２８０ｎｍ及びフェノール硫酸による発色後の波長４９０ｎｍにおける吸光度が指標として用いられ、ほぼ単一のピークを示す画分が分取される。

そして、分取された溶出液を例えば減圧濃縮後、凍結乾燥することにより、粉末状をしたほぼ単一な物質としてのアラビノガラクタンが得られる。得られたアラビノガラクタンの比旋光度は、［α］_Ｄ ^２０＝−３７°±１°（ｃ＝０.０８，水）であって、ＤＥＰＴ分析によるβ−１，６−ガラクタンを示す顕著なスペクトルと、ＨＭＢＣ分析によるαＲｈａ（１→４）βＧｌｃＵＡ（１→の存在を示す本発明のアラビノガラクタンに非常に特異的なピークが示される。また、この糖の構成比は、上記述べたような比率である。なお、抗糖尿病作用物質として実際に使用するためには、ゲルろ過クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによる両分画工程は必須ではなく、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーの少なくとも一方でも差し支えなく、より好ましくはゲルろ過クロマトグラフィーにより分画され、タンパクがほぼ除去されたそのほとんどが多糖成分である抽出物を用いても差し支えない。もちろん、両分画工程を用いて精製するのが純度的に高いものが得られる。

このアラビノガラクタンは、以下に説明するように経口投与または静脈投与によって、血糖値を低下させ、あるいは血糖値を一定の範囲内に維持する作用を有する。このものは常温で粉末状であって水に溶けやすい。したがって、このアラビノガラクタンにデンプンや乳糖などの賦形剤を加え、散剤や錠剤、カプセル剤などの固形製剤とできるのはもちろん、生理食塩水に溶解して注射剤として提供することもできる。また、水に溶かして内服液剤としても提供されうる。

また、医薬品に限られず、錠剤やカプセル剤などの形態をしたいわゆる健康食品として、清涼飲料水に添加したり低カロリー食に添加したりするなどあらゆる形態の食品としても提供される。

このように、本発明のアラビノガラクタンは、抗糖尿病作用物質としてヒトあるいは動物用の医薬品に使用されるだけでなく、その形態を問わず、血糖値の維持、低下を図ることを目的とし、その旨を標榜、表示したいわゆる健康食品や特定保健用食品（機能性食品とも称される）、さらにはこれを添加した一般食品、動物用の餌などとして提供される。

その投与量は、投与対象や症状などによっても適宜増減されるが、概ね１日当たり当該物質０.１〜１００ｍｇ／体重ｋｇであり、血糖値を正常範囲に維持可能な量の上記物質が添加される。

以下、次の実施例に基づき本発明についてさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

アラビノガラクタンは図３に準じた精製工程を経ることにより得られた。まず、白甘藷の皮乾燥粉末（皮破砕物）１ｋｇに対し水１０Ｌを加え、４時間室温にて攪拌抽出した。得られた混合液を遠心分離（７５００rpm／３０分間）して残渣を濾別した。次に得られた抽出液を脱イオン水を用いて３日間室温にて透析を行った。透析は、商品名ダイアライシスメンブランSize３６（ポアサイズ２４Å、限界分子量１２０００〜１４０００Ｄａ、和光純薬工業株式会社製）の透析用チューブに前記抽出液を入れ、抽出液１Ｌに対し脱イオン水５〜６Ｌを用い、１日３回脱イオン水を交換することにより行った。そして、透析内液に生じた不溶部分は遠心分離（７５００rpm／３０分間）により除去した。

上記沈殿除去した透析内液をエバポレータにて４０℃程度で加温濃縮し、次いで約２０v/v％の濃度となるようにエタノールを適量加え、４℃にて一晩静置した。生じた沈殿を遠心分離（７５００rpm／３０分間）により除去した。更に、その上清にエタノールを加えてアルコール濃度を約４０v/v％とし上記と同様に静置して生じた沈殿を除去した。そして、再びエタノールを加えてアルコール濃度を約６０v/v％にした上で１昼夜静置後（４℃下）、その上清液を分取して濃縮後凍結乾燥して粗多糖抽出物（３.８ｇ）を得た。

この粗多糖抽出物についてゲルろ過クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを行い、さらに精製を行った。上記粗多糖抽出物の１w／v％水溶液（１g／１００mL）を調整し、遠心分離（１５０００rpm／２０分間）を行い、水溶性部分を分取した。これをゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、４つのフラクション（以下Ｆ１〜Ｆ４と称す）に分画した。分画は、担体にトヨパールＨＷ−６５Ｓ（東ソー株式会社製：８８０ｍＬを４.５×７００ｃｍカラムに充填）を、溶出液に流速０.５ｍＬ／minの水を用いて、１５ｍＬ／１チューブで行った。各チューブごとにフェノール硫酸法（波長４９０ｎｍ）及びＵＶ吸収（２８０ｎｍ）による検出を実施し、Ｆ１〜Ｆ４の４つのフラクションに分けた。その結果を図４に示す。得られたＦ１〜Ｆ４フラクションはそれぞれ、Ｆ１フラクション：チューブＮｏ.１９−２４／濃縮質量２４６.５ｍｇ、Ｆ２フラクション：チューブＮｏ.２５−３０／濃縮質量１６７.５ｍｇ、Ｆ３フラクション：チューブＮｏ３１−３６／濃縮質量１５０.５ｍｇ、Ｆ４フラクション：チューブＮｏ３７−４３／濃縮質量１４６.５ｍｇであった。

次に予試験として、得られたフラクションＦ１〜Ｆ４の抽出物について血糖降下作用を調べた。７週齢のｄｂ／ｄｂ雄マウス各群５匹に、Ｆ１〜Ｆ４の各抽出濃縮物１００mg／kgを２週間連続経口投与した後、血糖値を測定したところ、Ｆ１及びＦ２投与群に血糖値の低下が見られた。また、Ｆ２の抽出物に比べてＦ１の抽出物に優れた効果があったので、以下の分析にはフラクションＦ１の抽出物を用いることにした。

次に上記フラクションＦ１の抽出物について、イオン交換クロマトグラフィーを行いさらに精製を加えた。イオン交換樹脂にＤＥＡＥSephadexＡ−５０（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に上記抽出物を負荷した後、脱イオン水及び２００ｍＭ、４００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液をステップワイズで溶出させた。溶出は流速０.５ｍＬで行い、１５ｍＬ／１チューブで溶出液を分取した。最初の１０チューブは脱イオン水、次の１０チューブは２００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液で、それ以降は４００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液で溶出した。溶出液は各チューブごとにフェノール硫酸法（波長４９０ｎｍ）及びＵＶ吸収（２８０ｎｍ）による検出が行われた。その結果を図５に示す。その結果、水画分には活性成分とみられる物質は存在せず、４００ｍＭ画分には多糖及びタンパク質の存在が見られた。一方２００ｍＭ画分にはタンパク質がほとんどなく、多糖のみの存在であった。この結果とゲルろ過クロマトグラフィーによる結果とから、２００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液による溶出画分が血糖降下作用を有する成分に該当するものと思われた。なお、２００ｍＭ画分から得られた抽出物の白甘藷皮乾燥物に対する収率は、約０.０９％であった。

次に上記成分について、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて分子量及び分子サイズを明らかにした。測定条件は次の通りである。使用したカラムはＯＨ−ｐａｋ ＳＢ−８０６ＭＨＱ（昭和電工株式会社製）、検出器は多角度光散乱検出器ＤＡＷＮ・Ｅ（Ｗｙａｔｔ社製）及び示差屈折率検出器ＲＩ−８０２０（東ソー株式会社製）、カラム温度は室温（２５℃）、移動相は２００ｍＭＮａＣｌ水溶液、サンプル濃度は１ｍｇ／ｍＬ（移動相で溶解したもの）、流速は０.５ｍＬ／min、注入量は１００μＬである。なお、サンプルには上記２００ｍＭ溶出画分を用い、注入時はシリンジにシリンジフィルター（ポアサイズ０.２μｍ）を装着、ろ過しながら注入した。その結果を図６に示す。図６から理解されるように、この物質の保持時間は約１９分であって、ほぼ単一のピークであった。また、このものの分子量は小さいところでは約１０万程度、大きなところでは約２０万程度であって、その平均分子量は約１３万程度であった。その分子量分布の幅は約１０万程度と狭く、ほぼ単一のピークを示す高純度で比較的均質なものである。なお、ここにいう平均分子量は、上記測定装置を用いて測定して得られた当該物質を示す単一ピークにおける重量平均分子量を言う。

本発明のアラビノガラクタンの構造は次のようにして決定された。まず、最初に構成糖の組成比を検討した。イオン交換クロマトグラフィーによる２００ｍＭ溶出画分を、ギ酸及びトリフルオロ酢酸による完全加水分解した後、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法により糖組成を明らかにした。測定条件は次のとおりである。使用カラムはCarboPac PA-1（４×２５０ｍｍ：日本ダイオネクス株式会社製）、溶出は０.２ＭＮａＯＨ（０→５分）の後リニアグラジエント０→０.４５Ｍ酢酸ナトリウム（ｉｎ０.２Ｎ ＮａＯＨ／５→３５分）、流速は１.０ｍＬ／min、検出器はパルスドアンペロメトリ検出器である。その結果を図７及び表１に示した。その結果、このアラビノガラクタンは、Ｒｈａ、Ａｒａ、Ｇａｌ及びＧｌｃＵＡが、１.２：６.７：１４.１：１.０の比率で構成されていることが判明した。

次に、２００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液による溶出画分について、部分メチル化分析を行った。分析は、ガスマス分析計（ＧＣ−１７Ａ、ＧＣＭＳ−ＱＰ５０００：株式会社島津製作所製）、ＤＢ−２２５ＧＣ用カラム（Ｊ&Ｗ Scientific社製：０.２５μｍ×３０ｍ×０.２５μｍ）、１７０℃５分、１７０→２１０℃（昇温速度２℃／min）のカラム昇温プログラム下、気化室温度２３０℃、検出器温度２３０℃の条件下で行った。その結果を図８及び表２に示す。

図８及び表２から理解されるように、本発明のアラビノガラクタンは、末端αＡｒａｆ若しくは末端Ｒｈａ（ピーク１）及び末端Ｇａｌ（ピーク３）、１，５結合を有するαＡｒａｆ（ピーク２）、１，３結合を有するＧａｌ（ピーク５）、１，６結合を有するＧａｌ（ピーク７）、１，３，６結合を有するＧａｌ（ピーク８）並びに１，３，５結合を有するＧａｌ（ピーク４）の８種類の結合様式を有することが明らかになった。なお、Ｒｈａ由来のピークが検出されていないが、末端Ａｒａｆとの保持時間が非常に近接し、両者が十分に分離されずに同位置に検出されたものと考えられる。

次に、各糖の連結を明らかにするため各種ＮＭＲスペクトル（^１Ｈ、^１３Ｃ−ＮＭＲ、^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹ、ＨＯＨＡＨＡ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ）の解析を行った。まず、各糖のケミカルシフトを明らかにした。その結果を表３に示す。更に、この結果を元にＨＭＢＣ解析（図９参照）を行い、図２に示す部分構造及び糖鎖の連結を明らかにした。即ち、Ｇａｌがβ１，６結合をしたガラクトース鎖にβ１，３結合で枝分かれしたガラクトース鎖を有し、その６５〜７５％のガラストースに（１）末端αＡｒａｆあるいは（２）２個のαアラビノフラノースがα１，５結合したオリゴ糖（２単糖）がβ１，３結合し、そして（３）ラムノースがグルクロン酸にα１，４結合したオリゴ糖（２単糖）がその５〜１０％のガラクトースにβ１，６結合している。

〔血糖降下作用の確認〕
５週齢のｄｂ／ｄｂマウス（雄性）を用いて血糖降下作用試験を実施した。飼育環境は、明暗周期を７：００−１９：００照明ＯＮの１２時間周期とし、温度２３〜２４℃、湿度６０〜７０％ＲＨ条件下で試験前１週間予備飼育を行った後、血糖値に群間有意差が出ないように２群（各群６匹）に分けた。投与群は無投与群（生理食塩水）と上記実施例で得たアラビノガラクタン投与群（２０ｍｇ／ｋｇ）とにした。投与は一日１回ゾンデによる５週間連続経口投与とした。試験期間中、飼料及び飲料水はともに自由摂取とした。投与前及び投与開始後１週間ごとにマウス尾静脈より採血を行い、得られた血清を用いて血糖降下作用の確認を行った。その測定結果を表４及び図１０に示す。

〔耐糖能改善作用の確認〕
血糖降下作用の確認試験終了後、各群にグルコースを２ｇ／ｋｇで経口投与し、０（糖負荷前）、６０分後及び１２０分後と経時的にマウス尾静脈より採血を行い、血糖値の経時変化を調べた。その結果を表５及び図１１に示す。なお、この試験は血糖降下作用試験終了後１２時間絶食後に行った。

次に、液体クロマトグフラフィにおける２００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液による溶出画分（濃縮、凍結乾燥品）を用いて、次の処方（１錠あたり）に従って常法により本発明の健康食品である錠剤（１０００錠）を作製した。
本発明によるアラビノガラクタン １４０ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル ４ｍｇ
炭酸カルシウム ４ｍｇ
還元麦芽糖水あめ １０ｍｇ
無水乳酸 ２２ｍｇ
結晶セルロース １０ｍｇ
ミルクカルシウム １０ｍｇ

アラビノガラクタン（ＡＧ）は、セリ科トウキAngelica acutiloba KITAGAWA（Carbohydr Res,193,173-192,1989）、ヤドリギ科ヤドリギViscum album L.（Phytochemistry,27(8),2511-2517,1988）、マメ科アラビアゴムノキAcacia senegal gum（Carbohydr Res,2,104,1966）、オオバコ科オオバコPlantago major L.（Carbohydr Res,35,145-153,1998）、キク科エキナセアEchinacea purpurea（Carbohydr Res,327,497-504,2000）など多くの植物より分離されており、白甘藷由来アラビノガラクタンに見られるＡｒａからなる部分構造（側鎖）を有するＡＧは多々存在している。しかしながら、本発明のアラビノガラクタンはそれらとは基本骨格あるいは側鎖が異なり、分子内で→６）βＧａｌ（１→から構成された糖鎖が３位で高度に分岐した基本骨格を有しており、その側鎖としてαＲｈａ（１→４）βＧｌｃＵＡ（１→が基本骨格末端でβ１，６結合した構造を有する多糖はこれまでに報告例が無く、本発明に係る白甘藷由来のアラビノガラクタンは全く新規なものであると結論づけられた。そして、このアラビノガラクタンは血糖降下作用を示すものであり、抗糖尿病作用物質として多いに利用価値の有するものである。

Claims (5)

1. 白甘藷の皮部分あるいは塊根部分の水系抽出液の透析内液に低級アルコール若しくは低級ケトンを加え、沈殿除去後に得られる上清部分を弱塩基性アニオン交換樹脂に吸着後、約２００〜４００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液が有するイオン強度の溶出液で溶出されるβ１，６結合したＧａｌ糖鎖がβ１，３結合により高度に枝分かれした骨格を有するアラビノガラクタンであって、
   当該骨格を構成するＧａｌに側鎖として（１）αＡｒａｆがα１，３結合若しくは（２）αＡｒａｆ（１→５）αＡｒａｆがα１，３結合するとともに（３）αＲｈａ（１→４）βＧｌｃＵＡが前記骨格の末端Ｇａｌの一部若しくはその全部にβ１，６結合した平均分子量１０万〜２０万、ラムノース：グルクロン酸の構成比が概ね１：１、アラビノース：ガラクトースの構成比が概ね１：２、ラムノース：アラビノースの構成比が１：５〜６、フェノール硫酸による発色を示すが２８０ｎｍ付近に吸収をほとんど示さないアラビノガラクタン。
2. 請求項１に記載のアラビノガラクタンを有効成分とする抗糖尿病薬。
3. 白甘藷の皮部分あるいは塊根部分の水系抽出液の透析内液に低級アルコール若しくは低級ケトンを加え、沈殿除去後に得られる上清部分を弱塩基性アニオン交換樹脂に吸着後、約２００〜４００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液が有するイオン強度の溶出液で溶出されるβ１，６結合したＧａｌ糖鎖がβ１，３結合により高度に枝分かれした骨格を有するアラビノガラクタンであって、当該骨格を構成するＧａｌに側鎖として（１）αＡｒａｆがα１，３結合若しくは（２）αＡｒａｆ（１→５）αＡｒａｆがα１，３結合するとともに（３）αＲｈａ（１→４）βＧｌｃＵＡが前記骨格の末端Ｇａｌの一部若しくはその全部にβ１，６結合した平均分子量１０万〜２０万、ラムノース：グルクロン酸の構成比が概ね１：１、アラビノース：ガラクトースの構成比が概ね１：２、ラムノース：アラビノースの構成比が１：５〜６、フェノール硫酸による発色を示すが２８０ｎｍ付近に吸収をほとんど示さないアラビノガラクタン又は前記溶出液で溶出された抽出物を含有せしめる抗糖尿病薬の製造方法。
4. 白甘藷の皮部分あるいは塊根部分の水系抽出液の透析内液に低級アルコール若しくは低級ケトンを加え、沈殿除去後に得られる上清部分を弱塩基性アニオン交換樹脂に吸着後、約２００〜４００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液が有するイオン強度の溶出液で溶出されるβ１，６結合したＧａｌ糖鎖がβ１，３結合により高度に枝分かれした骨格を有するアラビノガラクタンであって、当該骨格を構成するＧａｌに側鎖として（１）αＡｒａｆがα１，３結合若しくは（２）αＡｒａｆ（１→５）αＡｒａｆがα１，３結合するとともに（３）αＲｈａ（１→４）βＧｌｃＵＡが前記骨格の末端Ｇａｌの一部若しくはその全部にβ１，６結合した平均分子量１０万〜２０万、ラムノース：グルクロン酸の構成比が概ね１：１、アラビノース：ガラクトースの構成比が概ね１：２、ラムノース：アラビノースの構成比が１：５〜６、フェノール硫酸による発色を示すが２８０ｎｍ付近に吸収をほとんど示さないアラビノガラクタン又は前記溶出液で溶出された抽出物を含有せしめる食品の製造方法。
5. 血糖値を正常範囲に維持可能な量の前記アラビノガラクタン及び／又はアラビノガラクタンを含む抽出物を含有せしめる食品の製造方法。