SK170497A3 - Cytoplasmic modulators of integrin regulation/signaling - Google Patents

Description

Cytoplazmatické modulátory regulácie ti signalizácie integrínu

Oblasť techniky

Vynález as všeobecne týka proteínov, zahrnutých o integrít nových signalizačných dráhach. Vynález sa konkrétnejšie týka rodiny proteínov, tu označených ako proteíny integrínovej regulácie <1RP), ktoré regulujú účinnosť integrinu, a dvoch členov tejto proteínovej rodiny, označených ako IRP-1 a IRP-2.

D o t e r a i š i s t a v t e c h n i k y

Integríny sú heterodimérové povrchové molekuly, tvorené e a e. pod jednotkami spojenými nekovalentnou väzbou. Všetky integríny sú transmembránovými proteínini s protireceptorovou väzbovou účinnosťou, s umiestením v extracelulárnej doméne. Integríny takisto vykazujú relatívne krátke: cytoplazmatické oblastí, ktoré participujú pri transmembránových signalizačných javoch. Integríny sú schopné vzájomne reagovať s ďalšími protireceptormi naviazanými v bunke, zložkami extracelulárne j matrice: a rovnako tak aj s rozpustnými faktormi. Naviazanie: extracelulárnych ligandov vedie k zosieťovaniu a lokálnemu zhlukovaniu integrínov ENiyamoto a kol., Science, 267·. 833 <1995)1 a vytvoreniu lokálnych adhézií, v ktorých sú cytoplazmatické domény integrínových zhlukov spojené s cytoskeletovou zložkou, zahrnujúcou napríklad aktínové vlákna CPavalko a Otey, Proc, Soc. Exp. Biel. ľted., 205: 32787 <1994) a Gumbiner, Neurón, 11: 551 <1993)1. Aj keď sa väčšina výskumov, zaoberajúcich sa fyziologickou aktivitou integrínov, zameriava na identifikáciu špecifických extracelulárnych receptorov, o interakciách integrínov s cytoplazmatickými zložkami sa vie: len málo. Avšak štúdie: mutácií ukázali, že; na to, aby sa integríny spojili s fekálnymi kontaktmi, sú potrebné cytoplazmatické sekvencie CLaPlamme a kol., J. Celí. Biol., 117: 437 <1992)1.

Aj keď bolo identifikovaných mnoho integrínov, ukázalo sa, že: pre leukocyty sú unikátne určité podsúbory, pričom každý člen podsúboru má charakteristickú bunkovú špecifickú expresiu a väzbové vlastnosti protireceptora. Z integrínov, špecifických pre:

leukocyty, sú známe aspoň ’fri’ ··> ä'-á · ii'itfe'grlny, z ktorých každý' .je: zložený z unikátnej ď pod .jednotky v spojení s b_ä podjednotkou (označenou ako C.D18) ĽKishimoto a kol.. Celí, 48: 681-690 <1987)3. Prehľad doterajšieho Štävu tecilhiký jdré b₂ integríny je možné nájsť napríklad v Springerovej publikácií. Celí, 76; 301 až 314 <1994). CDlla/CD18, takisto známe: ako alebo LFA-1, je exprimovaný vo všetkých leukocytoch a ukázalo sa, že: sa viaže: na ICAľl-1, ICAľl-2 a ICAľl-3. CDllb/CD18, takisto známe; ako oí_Me,_s. alebo ľIAC-1, je exprimovaný v polymorfonukleárnych neutrof íloch, monocytoch a eoziriof Íloch a ukázalo sa, že: sa viaže: na ICAľl-1, * komplementárny faktor iC3b, faktor X a fibrinogén. CD'llc/CD18, takisto známy ako tťxBa: alebo P150/95, je: exprimovaný v monocytoch, polymorfonukleárnymi neutrof ilmi a eoziriof ilmi, a ukázalo sa, že: sa viaže: na komplementárny faktor iC3b a fibrinogén. Okrem toho bol nedávno identifikovaný štvrtý ľudský integríri, označený ako cr,iC_ľ.-. Ľ Man der Vieren a kol., Immunity,

3·. 683-690 <1995)3.

e,₇ integrínová pod jednotka je v spojení s au,. podjednotkou exprimovaná prevažne: na leukocytoch. Heterodimér bunkového povrchu rozpoznáva protireceptor nachádzajúci sa v čreve, označený ako molekula s a d h é z iou k muk ozoadresi.no vej bunke <ľladCAľl) a zdá sa, že hrá kľúčovú úlohu pri viazaní lyinfocytu na intes finálne: tkanivo EBerlin a kol., Celí 74⁵ 185-195 <1993)3.

Ukázalo sa, že oc+βχ sa viaže; na VCAľl Ľ Chán a kol., J. Biol. Chem. 267; 8366-8370 <1992)3. Spôsobom podobným s účinkom predtým spájaným len so selektínovými povrchovými molekulami sa ukázalo,

-. že οί^βχ participujú v selektínovo nezávislom pripojení, lymfocytov k zapáleným venuláin pri prietokových podmienkach EBerlin a kol.,

- Celí 80: 413-4 22 <1995)3. Zvieracie modely, používajúce protilátky imunošpecifické pre d^ pod jednotku, naznačujú, že: alebo d^ v spojení s β_χ integrínovou podjednotkou môžu hrať úlohu v mnohých chorobných stavoch, vrátane: experimentálnej alergickej encef alomyelitídy EYednock a kol., Náture 356 ·. 63-66 <1992); Barón a kol., Exp. Med. 177: 57—E! 8 <1993)3 ; kontaktnej hypersenzitivity ĽFerguson a Kupper, J. Immunol . 150: 1172-1182 <1993); Chisholm a kol.. Eur. J. Immunol. 23: 682-688 <1993)3; a neobéznej cukrovky EYang a kol., Proc. Naťl. Acad. Sci (.USA) 90 ·. 10494-10498 ( 1.993) ; Burkly a kol., Diabetes 43» 529_534 (1994); Barón a kol., J. Clin. Irn/osť . 93: 1700-1708 (1994)11.

Ukázalo sa, že integríny sú .jedným z hlavných typov proteínov

Leukocyty ostatnými zúčastňujúcich sa na doprave leukocytov cez telo. končtantne recirkulujú medzi lymfoidnými orgánmi a že prechádzajú z miazgy a krvi cez vaskulatúry a prenikajú cez tkanivo.

aspektov zápalových a a u t o im u n i t n ý c h Proti, zápalu v mono l< 1 o n á 1 n y ch tkanivami tým, endotelovú bunkovú vrstvu ležiace pod ňou. Jedným z chorôb Je prítok leukocytov do zapálených miest týchto miestach Je možné bojovát pomocou protilátok imunošpecifických pre integríny, ktoré blokujú alebo inhibujú funkciu leukocytov. Pre prehľad pozri napríklad Lobh a Hemler. J. Clin. Irvest . 94: 1722-1728 (1994). Modulácia integrínovej funkcie je .jedným zo spôsobov, ako je možné uskutočniť rozpustenie zápalu, avšak zatiaľ sa vie príliš málo o Špecifických cytoplazmatických zložkách regulácie a signalizácie integrínov.

Liu a Pohajdak, Biochimica eť Biophysica Acta, 1132: 75-78 (1992) popisuje ľudský cDNA kloň, označený ako B2-1, ktorý kóduje domény majúce proteín homologický s kvasinkovým SEC7 proteínom, olihňový kínežín, pleckstrin a dynamin. Uvedený článok uvádza, že pretože B2-1 je homológom len malej časti kvasinkového SEC7 proteínu, nie je .jednoznačne dokázané, že B2-1 je: ľudským homológom kvasinkového proteínu, ktorý nie je pravdepodobne daný rozdielmi mimo motív SEC7. Tento článok ďalej tvrdí, že B2-1 sa môže zúčastňovať na reorientácii g o Igi. h o/sek reč n ý ch granulkách N K buniek k cieľovým bunkám počas cytolýzy. Schiller a Kolanus ĽA dominánt negatíve effect of the human Sec7 PH domain on integrin mediated binding to ICAM-l Srd Adhesion Meeting of the Germán Immuriology Association, Regensburg, Gerinany, 14. až 15. marec 19951 popisujú ľudský proteín, majúci podobné motívy, ktoré vzájomne reagujú s cytoplazmatickou doménou (2.^. integrínov a uvádzajú, že preexprimovanie PH domény proteínu má za následok silne dominantný negatívny účinok na aktivačne závislú aviditu i- · ¹ : i ' ? t ₄ .

'4 integrínov v Jurkafeových butik ách i Avšak Scŕhiller a Kolanus n ©ukazujú: C i ) na g: x i s t e n c i u p r o t e í n o v. i n t e: g r' í n o v e j r g: g u 1 á e; :i.. e (IRP), ktoré výhodne; vzájomne reagujú s integrínmi a/alebo modulujú integrinovú účinnosť, (ii) IRP, ktoré, ak sa kotransfekovali s DNA kódujúcou integrín v COS bunkách, regulujú ote nov o e x p r e s i u k o t r a n s i e; kované h o i n t e g r í n u, a 1 e; b o C i i. i ) IRP, ktoré modulujú naviazanie a otáčanie JY buniek pri prúdových podmienkach.

Z vyššie uvedeného vyplýva, že v danej oblasti existuje potreba identifikovať molekuly, ktoré sa viažu na integriny a/alebo modulovať väzby, a/alebo signalizačné aktivity integrinov a vyvinúť metódy, ktoré by mohli tieto molekuly identifikovať. Tieto metódy, a molekuly identifikované pomocou týchto metód, poskytnú praktický prostriedok pre terapeutický zákrok v prípade integrínom sprostredkovanej imunitnej a zápalovej odpovede.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje; nové proteíny integrínovej regulácie; CIRP), ktoré predstavujú cytoplazmatické zložky a/alebo b₇ i n t e g r- í n o v ú r e g u 1 á e; i u a / a I. e b o s :i. g n a 1. i z a č n é c g; s t y .

Jedným predmetom vynálezu je; poskytnutie čistých a izolovaných polynukleotidov Cnapr. DNA a RNA, ako ich kódujúcich, tak aj n e; k ódu júcich reťazcov) kódujúcich IRP-1 a IRP-2. Uvažované polynukleotidy zahrnujú genómové DNA, RNA, cDNA kyseliny a úplne; alebo čiastočne; chemicky syntetizované DNA kyseliny. Medzi výhodné polynukleotidy podľa vynálezu je možné zaradiť TRP--1 DNA sekvenciu, tu uvedenú ako SEQ ID č.: 1, IRP-2 DNA, tu uvedenú ako SEQ ID č.; 2a DNA sekvencie, ktoré hybridizujú na ich nekódujúce reťazce; pri veľmi prísnych podmienkach, alebo ktoré by hybridizovali, ale z dôvodu nadbytočnosti genetického kódu. Príkladné, veľmi prísne hybridizačné podmienky, sú tieto: hybridizácia pri 42 °C v 5X SSPE, 45% formamide a premývanie pri 65 ^C,C v 0, 2X SSC, alebo pri 50 °C v IX SSC. Je; zrejmé, že; je možné použiť varianty týchto podmienok, ktoré budú zodpovedať danej dĺžke sekvencii a obsahu GC nukleotidovej bázy v týchto seku e n c i á c h, u r č e n ý c h p r e h y b r i. d i z á c i u. P r e s t a n o v e: ι j i e: v e ľni i prísnych hybridizačných podmienok existujú v . danom obore štandardné uzorce, pozri napríklad Sambrook a kol., 9.47-9.51 o ľtolecular Clorting, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York C1999).

Informácie o DNA sekvencii podľa vynálezu umožňujú identifikovať a izolovať DNA kódujúcu príslušné molekuly dobre: známymi technikami, napríklad vyššie popísanou DNA/DNA hybridizáciou, a polymerázovým reakčným klonovaním reťazca CPCR).

Znalosť sekvencie: umožňuje pomocou cDNA, kódujúcich IRP proteíny, napríklad

DNA/DNA hybridizácie: izolovať génové DNA sekvencie, kódujúce: TRP proteíny, a exprimovat riadiace: sekvencie regulátorov, napríklad očakávať, že DNA/DNA použití DNA sekvencii promótorov, operátorov a pod. Dá sa hybridizačné?: procesy sa uskutočňujú pri podľa vynálezu pri presne vymedzených podmienkach, ktoré?: umožňujú izoláciu DNA kódujúcich alelové varianty IRP proteínov; nehumánnych druhov proteínových homológov týchto IRP proteínov; a ďalších štruktúrne;: príbuzných proteínov, majúcich spoločnú aspoň jednu schopnosť vzájomne: reagovať s členmi alebo regulátormi c·;, a/alebo o?- integrínových regulačných dráh, v ktorých IRP proteíny participujú. Ak sa polynukleotidy podľa vynálezu detegovatelne označia, sú takisto použiteľné pri hybridizačných testoch, stanovujúcich kapacitu buniek pre; syntetizovanie: IRP proteínov. Informácia o DNA sekvencii. podľa vynálezu tak istej umožňuje vyvinúť pomocou rekombinácie: homológov alebo stratégie; knockout C pozri napríklad Capecchi, Science, 244: 1288-1292 ¢1989)] hlodavce, ktoré nie sú schopné exprimovat funkčné IRP proteíny, alebo ktoré exprimujú varianty IRP P r o t e i n o v . liet o h 1 ej d a v c e je: m o ž n e?: p o užiť a k o m o d e 1 y p r e: š t ú d i um aktivít IRP proteínov a IRP modulátorov in vivo. Polynukleotldy podľa vynálezu môžu takisto predstavovať základ diagnostických metód, používaných na identifikáciu genetických zmien v mieste IRP proteínu, ktoré podlieha chorobnému stavu alebo stavom. Vynález takisto poskytuje: antiinediátorové nukleotidy dôležité?: pre: reguláciu expresie IRP proteínov pomocou tých buniek, ktoré pôvodne exprimovali to isté.

Vynález takisto poskytuje autonómne replikačné rekombinantné konštrukcie, napríklad plazmid a vírusové DNA vektory, zábudlivá júce polynukleotidy podlá vynálezu, predovšetkým vektory, v ktorých sú polynukleotidy naviazané na endogénnu alebo heterológnu expresnú kontrolnú DNA sekvenciu a transkripčný terminátor.

Predmetom vynálezu je takisto stabilná transformácia alebo transfekcia hostiteľských buniek, predovšetkým jednobunkových hostiteľských buniek, napríklad prakaryetických a eukaryotiských buniek, DNA kyselinami podlá vynálezu, spôsobom umožňujúcim expresiu IRP proteínov v týchto bunkách. Hostiteľské bunky podľa vynálezu sú najmä použiteľné pri spôsoboch produkujúcich IRP proteíny vo väššej miere, v ktorom bunky rastú vo vhodnom kultúrnom médiu a požadované proteíny sa izolujú z buniek alebo z média, v ktorom tieto bunky rastú.

Do rozsahu vynálezu patria IRP polypeptidové produkty, obsahujúce časť aminokyselinovej sekvencie alebo celú sekvenciu, označenú ako SEQ ID č.: 2 (IRP-1) a SEQ ID č.: 4 CIRP-2). Očakáva sa, že použitie cicavčích hostiteľských buniek poskytne také posttranslačné modifikácie (napríklad merystoyláclu, glykozyláciu a skrátenie a tyrozínovú. seríriovú alebo treonínovú fosforyláciu), môžu byt potrebné pre udelenie optimálnej biologickej účinnosti rekombinantným expresným produktom podľa vynálezu. Predmetom vynálezu sú takisto fúzne polypeptidy, v ktorých sú IRP aminokyselinové sekvencie exprimované tesne vedia aminokyselinových sekvencii, odvodených od ďalších polypeptidov. Euzionované polypeptidy podlá vynálezu zahrnujú polypeptidy s modifikovanými biologickými, biochemickými a/alebo Imunologickými vlastnosťami, v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcim polypeptidom. Súčasťou vynálezu sú takisto multlmérové formy IRP proteínov. Polypeptidové produkty podľa vynálezu môžu mat polypeptidy po celej dĺžke alebo môžu obsahovať ich fragmenty, prípadne varianty. Varianty zahrnujú IRP proteíny, v ktorých je aspoň jedna špecifikovaná (to znamená prirodzene:

kódovaná) aminokyselina vynechaná alebo nahradená, alebo do ktorých Je aspoň Jedna nešpecifikovaná aminokyselina pridaná: Cl) bez straty schopnosti vzájomne reagovať s členmi alebo regulátormi a/alebo signalizačnej dráhy, alebo (2) neschopností vzájomne reagovať s členmi alebo regulátormi s·-, a/alebo e,signalizačnej dráhy. Proteíny, ktoré vzájomne reagujú s IRP proteínmi je možné identifikovať pomocou mnohých testov.

Prvým testom podlá vynálezu je test two--hybrid screen. Dvojhybridný systém sa vyvinul v kvasinkách CChien a kol., Proc. Hati. Acad. Sci í USA), 88: 9578-9582 C1991)] a Je založený na funkčnej in vivo rekonštitúcil transkripčného faktora, ktorý aktivuje reportérový gén. Konkrétne polynukleotid, kódujúci proteín, ktorý vzájomne reaguje s IRP proteínmi, sa izoluje transformáciou alebo transfekciou vhodných hostiteľských buniek pomocou DNA konštruktu, obsahujúceho reportérový gén pod kontrolou promótora, regulovaného transkripčným faktorom, majúcim DMA väzbovú doménu a aktivačnú doménu; exprimovaním prvej hybridnej DNA sekvencie, kódujúcej prvú fúziu časti alebo celého IRP proteínu a DNA väzbovej domény, alebo aktivačnej domény transkripčného faktora v bos t itel.sk ý c h bunkách; exprimovaním knižnice druhých hybridných DNA sekvencií, kódujúcich druhé fúzie časti alebo celých predpokladaných IRP väzbových proteínov a DMA väzbovej domény, alebo aktivačnej domény transkripčného faktora, ktorá nie je zabudovaná v prvej fúzii, v hostiteľských bunkách; delegovaním väzieb IRP interakčného proteínu na IRP proteíny v príslušnej hostiteľskej bunke vytvorením reporférového génového produktu v hostiteľskej bunke; a izolovaním druhých hybridných DNA sekvencií, kódujúcich interakčný proteín z príslušnej hostiteľskej bunky. Pre tento test sú výhodné pre riadenú

I expresiu lacZ reporférového génu GAL4 aktlvačná sekvencia proti smeru expresie génu, transkripčný faktor, obsahujúci GAL4 DMA väzbová doména a GAL4 transaktivačná doména a kvasinkové hostiteľské bunky.

Ďalšie testy, používané na identifikáciu proteínov, vzájomne reagujúcich s IRP proteínmi, môžu zahrnovať imobilizáciu IRP proteínov alebo testovaného proteínu, detegovatelné označenie neimobilizovaného väzbového partnera, vzájomnú inkubáciu väzbových partnerova stanovenie množstva označených väzieb. Označená väzba naznačuje, že testovaný proteín vzájomne reaguje s IRP proteínmí.

Ďalší typ testu, používaný na identifikáciu IRP interakčných proteínov, zahrnuje imobilizáciu IRP proteínov alebo ich fragmentov na pevnom nosiči, potiahnutom C alebo napustenom) fluorescenčným činidlom; označenie testovaného proteínu zlúčeninou schopnou excitovať fluorescenčné činidlá; uvedenie imobilizovaných IRP proteínov do kontaktu s označeným testovaným proteínom; detegovanie svetelnej emisie fluorescenčným činidlom;

proteínov ako testovaných emisie svetla fluorescenčným a identifikovanie interakcie proteínov, ktoré sú výsledkom činidlom. Alternatívne je možné iinobilizovať predpokladaný interakčný proteín a IRP proteíny označiť.

Predmetom vynálezu sú takisto protilátky a ďalšie väzbové proteíny (napríklad proteíny identifikované vo vyššie uvedených testoch), ktoré sú špecifické pre IRP proteíny podía vynálezu. Protilátky podlá vynálezu zahrnujú monoklonálne, polyklonálne, antiidiotypické a rekombinantná· (to znamená humanizované, chimerické atď.) protilátky a ich fragmenty. Do rozsahu vynálezu patria takisto bunkové línie (napríklad hybridémové bunkové 3. í n i e ) , ktoré p r o d u k u j ú p r o t i I á t k y p o d 1 a v y n á 3. e z u . ý ä z b o v é proteíny je možné vyvinúť pri použití izolovaných prírodných alebo rekombinantných IRP polypeptidových produktov. Tieto väzbové proteíny je možné zasa použiť na čistenie rekombinantných a prirodzene sa vyskytujúcich IRP polypeptidových produktov a na identifikáciu buniek, produkujúcich tieto produkty. Testy, detegujúce a kvantifikujúce proteíny v bunkách a tekutinách môžu zahrnovať jedinú protilátku alebo množinu protilátok v sendvlčovom formáte. Tieto väzbové proteíny sú takisto výhodne použiteľné pri modulácii (to znamená blokovanie, inbibovanie alebo stimuláciu) IRP interakci so zložkami e>₌ a/alebo integrínovej signalizačnej dráhy.

Špecifickými príkladmi monoklonáIných protilátok podľa vynálezu sú monoklonálne protilátky produkované hybridémovými bunkovými líniami 200A, 200B a 233G. Tieto bunkové línie sú uložené: v zbierke American Type Culture Collection C ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, ľlD, 20332, 2. apríla 1997. Depozitným číslom pre líniu 200A Je HB-12331, pre;líniu 200B 148-12332 a pre líniu 233C HB-12333.

Testy, používané: na identifikáciu zlúčenín, ktoré: modulu j ú . interakciu TRP proteínov s ďalšími proteínmi alebo llpldmi, môžu zahrnovať transformovania alebo transfekcie vhodných , hostiteľských buniek DNA konštruktom obsahujúcim reportérový gén pod kontrolou promótora, regulovaného transkripčným faktorom, majúcim DNA.väzbovú doménu a aktivačnú doménu; expresiu prvej hybridnej DNA sekvencie, kódujúcej prvú fúziu časti alebo celého 1RP proteínu a DNA väzbovej domény, alebo aktivačnej domény transkripčného faktora, v hostiteľských bunkách; expresiu druhej hybridnej DNA sekvencie, kódujúcej druhú fúziu časti alebo celého TRP proteínu a DNA väzbovej domény, alebo aktivačnej domény transkripčného faktora, v hostiteľských) bunkách, ktorá nie je zabudovaná v prvej fúzii; vyhodnotenie vplyvu testovanej zlúčeniny na interakciu medzi IRP proteínom a Interakčným proteínom deLegovaním väzby interakčného proteínu na IRP proteíny v príslušnej hostiteľskej bunke meraním produkcie reportérového génového produktu v hostiteľskej bunke v prítomnosti testovanej zlúčeniny alebo pri jej absencii; a identifikovanie modulačných , zlúčenín ako tých testovacích zlúčenín, ktoré spôsobujú zmenu produkcie reportérového génového produktu, v porovnaní s . produkciou reportérového génového produktu v neprítomnosti modulačnéj zlúčeniny. V tomto teste je možné výhodne použit na riadenú expresiu lotcZ reportérový gén GAL4 aktivačnej sekvencie proti smeru expresie génu, transkripčný faktor, obsahujúci GAL4 DNA väzbovú doménu a GAL4 transaktivačnú doménu a kvasinkové hostiteľské bunky.

Ďalší, typ testu, používaný na identifikáciu zlúčenín, ktoré modulujú interakciu medzi TRP proteinmi a interakčným proteínom alebo llpidom, zahrnuje imobilizáciu TRP proteínov alebo d e t e g o v a t e T n é o z n a č e r d., e v z á j om n č i. n k u b o v a n i e testovanej zlúčeniny na prirodzeného TRP Interakčného proteínu. n e i m o b i 1 i z o v a r > é h o v ä z b o v é In o par t n e r a, väzbových partnerov a určenie vplyvu množstvo označených väzieb. pričom zníženie počtu označených väzieb v prítomnosti testovanej zlúčeniny, oproti počtu označených väzieb v neprítomnosti testovanej zlúčeniny naznačuje, že testované činidlo je inhibítorom TRP interakcie s daným proteínom. Naopak zvýšenie počtu označených väzieb v prítomnosti testovanej zlúčeniny oproti počtu označených väzieb v neprítomnosti testovanej zlúčeniny naznačuje, že predpokladaný modulátor je aktivátorom TRP interakcie s daným proteínom.

Ďalší spôsob podlá vynálezu na Identifikáciu zlúčenín, ktoré modulujú väzby medzi TRP proteinmi a interakčným proteínom alebo llpidom. zahrnuje imobilizáciu TRP proteínov alebo ich fragmentov na pevnom nosiči, potiahnutom C alebo napustenom) fluorescenčným činidlom; označenie Interakčného proteínu zlúčeninou, schopnou fluorescenčné činidlá; uvedenie imobilizovaných TRP s označeným Interakčným proteínom; emisie fluorescenčným činidlom; a identifikovanie modelujúcich zlúčenín ako tých testovaných zlúčenín, ktoré ovplyvňujú emisiu svetla fluorescenčným činidlom, v porovnaní, s emisiou svetla fluorescenčným činidlom v neprítomnosti testovanej zlúčeniny. Alternatívne je možné Imobilizovať, predpokladaný TRP interakčný proteín a IRp proteíny označiť..

excitovať. proteínov detegovanie do kontaktu svetelnej

Modulátory IRP proteínov môžu ovplyvňovať ARF, PI, β_χ, β₌,, β₃ a/alebo β₇ integrínovú regulačnú a signalizačnú aktivitu, lokalizáciu v bunke, a/alebo IRP interakciu s členmi ARF, PI, β i, β ₂, β ₃ a / a 1 e b o β x i o t e g r 1 n o v ý c h s i, g n a 1 i z a č n ý c: h d r á h .

komblnatorlckých knižníc peptidov a peptidových d e f 1 n o v a n ý c h c h e m i c k ý c h e n t í t, o 1, i g o n u k 1 e o 11. d o v prirodzených produktov, je možné pomocou testov vyššie uvedených testov) určiť, či sú aktívne ako

Z pohladu mimetík, a knižníc < napríklad modulátory. Selektívne modulátory môžu napríklad zahrnovať polypeptidy alebo peptidy, ktoré sa Špecificky viažu na TRP proteíny alebo TRP nukleovú kyselinu, oligonukleotidy, ktoré sa špecificky viažu na TRP nukleovú kyselinu a/alebo ďalšie nepeptidové zlúčeniny (napríklad izolované alebo syntetické organické molekuly), ktoré špecificky reagujú s TRP proteínmi alebo TRP nukleovou kyselinou. Do rozsahu vynálezu takisto patria mutantné formy TRP protelnov, ktoré ovplyvňujú väzbovú aktivitu alebo bunkovú lokalizáciu štandardných IRP protelnov. Modulátory ARF, PI, ©i. Bi. b₃ a/alebo βχ/IRP interakcie, identifikované spôsobmi podľa vynálezu, sa použi.....j ú in vitro alebo in vivo na o vplyv n e n j. e z á p a 1 o v ý e. h p r o c e s o v, k t o r ý c h s ú č a s t: o u s ú 1 e u k o c y t y. Okrem toho je možné modulačné zlúčeniny, ktoré sa viažu na ARF, PI, Bi, ň-., b₃ a/alebo b_z integrlny alebo IRP proteíny použiť pri monitorovaní ARF, PI, b_x, b-,, b₃ a/alebo v biologických vzorcoch, zahrnujúcich telové tekutiny alebo bioptioké tkanivo.

IRP modulátory môžu byť formulované v kompozíciách obsahujúcich farmaceutický prijateľné nosiče. Dávkové množstvá týchto modulátorov by mail byť dostatočné pre dosiahnutie modulácie IRP/b_x, b-., b₃ a/alebo b_z In t e g r í no vej signalizácie alebo regulácie in vivo.

Ďalšie ciele a výhody vynálezu sa stanú zrejmejšic po P r e š t u d o v a n 1. n a s 1 e d u .j ú c e h o p o d r o k j r i é h o p o p i s u .

Stručný popis obrázkov

Obr. 1 znázorňuje graf ukazujúci schopnosť JY buniek, exprimujúcich označené polypeptidy, viazať VCAIM-1;

Obr. 2 znázorňuje graf ukazujúci, schopnosť J Y buniek, exprimujúcich označené polypeptidy, viazať ICAľl-l;

Obr. 3 znázorňuje zoradenie amlnokyselinovýeh sekvencií IRP-1, IRP-2, 132-1 a C. Elegans homológa B2--1.

Príklady realizácie vynálezu

Vynález je ilustrovaný pomocou nasledujúcich príkladov, pričom príklad 1 popisuje izoláciu cDNA kyselín, kódujúcich TRP -1 a IRP-2 a príklad 2 popisuje analýzu doménevej štruktúry IRP-1 a TRP—2 proteínov, kódovaných pomocou cDNA kyselín. Rekombinantná expresné končtrukty, obsahujúce celú dĺžku 1RP oDNA kyselín a cDNA kyselín, kódujúcich TRP domény a TRP mutácie, sú popísané v príklade 3. Príklad 4 obsahuje výsledky testov, ktoré analyzujú vplyvy rekombinovanej expresie IRP proteínov na adhéziu hostiteľských buniek a ktoré hodnotia úlohu IRP proteínov v bunkovej adhézii, na ICAM-1 a VCAM-1, úlohu IRP proteínov v povrchovej expr e s íl integri.no v a suboelulárnu lokalizáciu IRP proteínov. Príklad 5 popisuje prípravu stabilne transformovanej JY bunkovej línie CJY-8), ktorá stabilne expri.mu.je IL-8 receptor, a jeho použitie pri. určovaní úlohy IRP proteínov v II...-8-z á visí e j ΡΙΊΑ-stimulovane j bunkovej adhézii na TCAM-l a VCAN-'l. Príklad 5 takisto popisuje prípravu expresných vektorov, kódujúcich TRP fúzne proteíny zeleného fluorescenčného proteínu CGFP). Príklad (5 popisuje adhéziu J Y buniek, transf okovaných IRP proteínmi. pri. prúdových podmienkach. Príprava a charakterizácia monoklonáIných protilátok IRP proteínov je popísaná v príklade 7. Úloha IRP proteínov pri. ohemotaxli. charakterizuje príklad 8. Príklad 9 popisuje experimenty ukazujúce distribúciu TRP proteínov v rôznych ľudských tkanivách. Testy, ktorých úlohou je identifikoval proteíny, ktoré vzájomne reagujú s IRP proteínmi, sú popísané v príklade 18, zatiaľ čo testy, ktorých úlohou je identifikovať modulátory IRP interakcií, sú popísané v príkladoch 11 a 12.

Príklad 1

Pomooou polymerázovej reťazcovej reakcie CPCR) a DNA/DNA hybridizácie sa izolovali dva ľudské IRP cDNA kleny.

Výskum BLAST identifikoval rôzne parciálne cDNA kyseliny, vykazujúce podobnosť. s 82-1 proteínom. Konvenčné sekvenčné oligonukleotidové pHiméry, zóäŕsovéda júce 5' a 3' koncu oblasti reprezentujúcich pleckstrlnové honiolúgové domény, ktoré sú označené na základe EST ako H02055, R82669, R43994, H39073, R45477, T07442 a T32215. Sekvencie primérov na 5' konci <Ts3.5) a 3' k o n c i C T S 3. 3) b o 1 i.:

TS3.5, ATATACGCGTACCTTCTTCAACCCGGACC CSEQ ID č.: 5);

TS3.3 ATATGTCGACTCAGGGCTGCTCCTGCTTC CSEQ ID č.: 6).

Tieto priméry sa použili v ΙΟΟμΙ PCR reakcii pri použití cDNA ľudskej sleziny ako matrice 2mg plazmatickej cDNA v pcDNA-1 Amp CInvitrogen, San Diego). Vzorky sa udržiavali b minút pri 94 °C a potom sa nechali prejsť cez tridsať cyklov, ktoré zahrnovali 1 minútu pri 94 °C, 1 minútu pri 50 °C a 2 minúty pri 72 °C. Výsledný PCR produkt približne 450 b p sa digeroval pomocou ľll ul a Sa.21. Vyčistený, digerovaný fragment sa naklonoval na vektor pCl-neo C Promega, ľladison, WI), ktorý mal sekvencie, kódujúce hernáglutinínový koniec na 5' konci, v mieste inzercie digerovaného PCR fragmentu. Sekvencia výsledného Inzertu sa overila a vektor sa označil ako 5'HA TS53/pCl#3.

ľflul/Saľl digerovaný PCR produkt sa označil a použil na sondovanie veľkosti cDNA knižnice ľudskej sleziny, s voľbou pre inzerty väčšie ako 3 kb Inzerty. Knižnica sleziny sa pripravila klonovanlm ollgo-dT prvotnej cDNA knižnice? na pc.DNA-1 Amp a veľkostne selekčný vektor/Inzertová DNA s veľkosťou väčšou približne ako 7,8 kb. Vektory knižnice sa transformovali do XI....1 Blue Ultracompetent buniek <Strátagene. L.a Jolla, CA) a umiestili sa na 15 základných platni s veľkosťou 150 mm², vybavených filtrami Hybond N¹, s hustotou približne:? 20 000 kolónii na platňu. Z každej základnej platne sa pripravili dve repliky, ktoré sa použili pri hybridizácii. Digerovaný PCR fragment <400 ng) sa označil 120 j..iCi^3SPdCTP a dTTP pomocou označovanej sady Boehringer ľlannheim Randon Primed Labeling Kit;, podľa výrobcom priloženého návodu. Nezabudované nukleotidy sa odstránili cez Centri-sep kolóny CPrinceton Separations, Adelphla, NJ). Táto sonda sa hybridlzovala v roztoku obsahujúcom 5X SSPE, 45% formamidu, 5X Denhardts, IX SDS cez noc pri 42 °C. Filtre sa premyli na 0, 2X SSC pri 65 °C a exponovali na film. Pozitívy na duplikátových filtroch sa vybrali, nariedlli a opát umiestili na filtre; Hybond N^-1· na LBI4 platne. Z každej tejto pôvodnej platne sa vytvorili dva duplikáty, ktoré sa rehybridizovali. hybridizačným roztokom získaným z primárneho sita. Sekundárne pozitívy sa vybrali, nechali rást a plazmidy sa izolovali a obidva konce inzertu sa sekvenovall.

Jeden identifikovaný kloň, tvorený celodížkovým génom, ktorý bol označený ako kloň S3, kódoval proteín, ktorý je; tu označený ako IRP-1. Nukleotid a odvodené aminokyselinové sekvencie klenu sú uvedené pod SEQ ID č.: 1 a 2. Tento kloň má optimálnu Kozákovu konvenčnú sekvenciu, obklopujúcu tento kloň, ktorá má začiatok v metionone a terminačný kodón v rámci 5' metionínu. Dĺžka klonu je približne 1, 6 kb a kloň má otvorený čítací, rámec 399 aminokyselín. Kloň S3 je najpodobnejší. EST R82724 a vykazuje vyššiu ako 93X homológiu na 496 nukleotidoch.

Ďalší, izolovaný kloň mal dĺžku približne 3,4 kb. Tento kloň, označený ako S12, ktorý kóduje proteín, tu označený ako IRP-2, vykazuje homológiu k IRP-1, ale je zrejme novým génom. Tento IRP-2 kloň nie je eelodlžkový, pretože zoradenie jeho 5’ konca s IRP-1 sekvenciou umiestilo približne 50 aminokyselín do kódovacej oblasti IRP-1 klonu.

S cieľom získania oelodlžkového C kompletného) IRP-2 klonu sa rovnaká knižnica cDNA sleziny C vyššie popísaná) opakovane skúmala pomocou dvoch IRP-2 sond a to nasledujúcim spôsobom. Zarovnaný (tupý) IRP-2 kloň sa digeroval oddelene pomocou Xbal a Xbol. 2 kb Xbal fragment a Xhol fragment sa potom označili vyššie popísaným spôsobom, pomocou označovacej sady Boehringer Mannheim Random Primed Labeling Kit, podľa výrobcom priloženého návodu. Nezabudované nukleotidy sa odstránili cez Centri-sep kolóny a sonda sa pridala do filtra vo vyššie popísanom hybridizačnom roztoku a hybridizovala cez noc pri 42 °C. Filtre sa vymyli pri 50 °C an IX SSC/O, IX SDS. Primárne pozitívy sa vybrali, nariedili a opäť umiestili na filtre Hybond M na L B 1*1 platne . Z každej z týchto základných vzoriek sa pripravili dva duplikáty, ktoré sa rehybridizovali vyššie popísaným hybridizačným pufrom. Pozitívy na duplikátových filtroch sa vybrali, nechali rásť. a ich plazmidy sa izolovali a inzerty sekvenovall. Dva klony, S12-41 a S12-47, rozšírili TRP-2 kódujúcu oblasť o 50 aminokyselín, v smere 5' . Na 5' konci klanov, ktorý zachováva približne rovnakú organizáciu aminokyselín ako TRP kloň, sa nachádza metionín a dobre sa hodí ku Kozákovej konvenčnej sekvencií, obklopujúcej tento metionín. S12—47 kloň bol sekvenovaný úplne a TRP-2 DNA a odvodené aminokyselinové sekvencie sú uvedené pod SEQ ID č.: 3 až 4 .

Príklad 2

Porovnaním TRP-1, TRP-2, B2-1 C L..iu a kol., supra) génov a odvodených aminokyselinových sekvencií. sa identifikovali tri spoločné domény: amino terminálna k inezi.no vá a myozínová doména, SEC7 doména a karboxylová terminálna pleskstrinová homolégová C PH) doména. Kinezín a myozín sú transportné proteíny, súvisiace s mikrotubulami. C N a bol e a kol., J. Biol. Chem. .117: 1263-2175 <1992)3. Kvasinkový proteín SEC7, popísaný v publikácii, ktorej autormi sú Alschul a kol., Bol. Biol.., 21.5: 403-410 ¢1990), je proteín obsahujúci 2 008 aminokyselín, ktorý, ako sa ukazuje, reguluje glykoproteínovú sekréciu z Golgiho aparátu. Aj keď presnejšia funkcia proteínu SEC7 v kvasinkách nebola určená, je známe, že SEC7 génová mutácia v Arahidopsi.se spôsobuje: moduláciu v ý v o j o v é h o b u n k o v é h o d e 1 e n i. a a bunkovej a d h é z i e: Iľ S h e v e: 11 a kol., Cel.1, 77: 1051-1062 ¢1994)3. PH domény sa nachádzajú vo veľkom množstve proteínov, ktoré sú súčasťou signálneho prenosu. V niektorých proteínoch táto doména umožňuje: naviazanie na G P r o t e í n e. τ p o d .j e d n o t i e k, i n o s i t o 11 r i f o s f á t < IP -₃ ) a 1 e b o fosfatidylinositoldifosfát <PTP_fi), pozri Ingley a Hemmings, J. Celí. Biochem., 55: 436-443 ¢1994). V aminokyselinových sekvenciách IRP-1 a TRP-2 dosahuje kiriezínová a myozínová doména približne od zvyšku 9 do zvyšku 60, SEC7 doména približne od zvyšku 73. do zvyšku 245 a PH doména približne od zvyšku 260 do karboxy konca. V B2-i sú kinezínová a myozínóvá, SEC7 a PH doména definované približne od zvyšku 10 do zvyšku 61, približne od zvyšku 72 do zvyšku 245, resp. približne od zvyšku 246 do karboxy zakončenia. Aminokyselinová identita medzi rôznymi doménami v IRP a B2-1 Je znázornená v nižšie uvedenej tabulke 1.

Tabuľka 1

B2-1

S1-.07 doména

PH doména

IRP-1

IRP-2 % 88 % 90 X % 79 % 72 X

Konzervácia klnezínovej a myozínovej, SEC7 a PH domény v týchto troch proteínoch ukazuje, že IRP-1 ei TRP-2 proteíny predstavujú členy rodiny Tudských proteínov, vzťahujúcich sa na B2-1. Obrázok 3 ukazuje zoradenie IRP-1, IRP-2 a B2-1 klonov so zdanlivým homológom C. Elegans CWilson a kol., Náture, 368'.· 32-38 01994)11. Napriek tomu, že percentná identita C Elegarte proteínu s ďalšími tromi ľudskými protelnmi nie Je príliš vysoká. Je zrejmé, že celá doménová štruktúra Je konzervovaná medzi štyrmi protelnmi.

Väčšina zvyškov, konzervovaných medzi tromi ľudskými protelnmi a proteínom C. Elegans, Je takisto konzervovaná v . proteíne Arabidopsis CShevell a kol., supral, ktorý obsahuje homológovú SEC7 oblasť a ďalej sú konzervované v kvasinkovom SEC7 proteíne. To ukazuje na dôležitosť týchto zvyškov, pokiaľ, ide o funkciu SEC7 domény. V skutočnosti Shevell a kol., supra uvádza, že v klone Arabidopeie <EI*1B3O) ovplyvňuje mutačná zmena .jedného z týchto zvyškov C zodpovedajúceho polohe 157 v radení na obrázku 3) bunkové delenie, predĺženie a adhéziu.

Konzervované zvyšky v IRP doménach môžu byt takisto funkčne dôležité. Tsukada a kol. Proc. Natl. Aoad. Sci. (.USA), 91:

1.7

11256-11260 (1994) uvádzajú, že mutácie argenínu (zodpovedajúceho polohe 269 na obrázku 3) konzervovaného v mnohých PH doménach na cysteín. ak je prítomný v PH doméne btk tyrozlnovej kinázy v myši. povedie k vzniku X-naviazaného imunodeficienčného fenotypu, napriek tomu, že si. enzým udrží úplnú btk kinázovú aktivitu. Toto tvrdenie autorov je Špekuláciou, pretože sa predpokladá, že sa uvedený zvyšok nachádza na povrchu molekuly a je teda nepravdepodobné, aby táto substitúcia mala štruktúrny dopad; skôr je pravdepodobné prerušenie špecifickej interakcie s ďalším proteínom. Tento zvyšok je takisto konzervovaný medzi ľudskými, TRP proteínmi a proteínom C. Elegans.

Napokon všetky tri, ľudské proteíny, rovnako ako aj proteín C, Eleqaoo, majú v svojich PH doménach medzi subdoménami 5 a 6 ďalších šestnásť, až osemnásť- zvyškov, ak sa porovnajú s ďalšími PH doménami. Pri zhodnotení, z pohľadu navrhnutia trojrozmernej Štruktúry PH domény, popísanej v publikácii, ktorej autormi., sú Maoias a kol,, Náture, 369: 675 (1994), mala by táto doména vytvoriť, slučku, vybiehajúcu z jadra domény a mohla by byť. teda dôležitá pre vzájomnú reakciu s ďalším proteínom alebo proteínmi. Týchto šestnásť, až osemnásť zvyškov vykazuje 73X identitu medzi, štyrmi proteínmi.

Príklad 3

Pre ciele štúdie úlohy TRP proteínov vo funkcii, integrínu sa v COS a JY bunkách exprimovali T.RP-1, I.RP-2 a 62-1 proteíny alebo ich PH domény spoločne s b₂ integrínovými podjednotkami CDlla a 6618. TRP a B2-1 expresné vektory sa skonštruovali, nasledujúcim spôsobom. Fxpresia proteínov, používajúcich tieto vektory je popísaná v príklade 4.

Komplementárna DNA kódujúca ľudský 62-1 proteín sa klonovala PCR amplifikáciou veľkostne zvolenej 2, 5 až 4 kb Ramosovej knižnice. Priméry na koncoch 5' a 3', kódujúce oblasti, sa označili na základe už publikovanej sekvencie (Liu a kol., eupra) , Primérové páry sa označili s cieľom uľahčenia inzercie

1.8 zosilnených sekvencii do príslušných vektorov. 82-1 cDNA sa najprv amplifikovala a klonovala do vektora pET 15b (Novagen, Madison, WT.) pri použití 5’ So7.Nde a 3' Sc7.Xho primárov:

Sc7.Nde ATATCATATGGAGGAGGACGACAGCTAC (SED ID č.: 7);

Sc7.Xho ATATCTCGAGTCAGTGTCGCTTCGTGGAG (SED ID č.: 8).

Prlméry sa použili, v IOjjI PCR reakcii.. Vzorky sa udrži avali. 5 minút. pri 94 ^<:,C a potom sa nechalo prebehnúť. 30' cyklov: 30 sekúnd pri 94 °C, 30 sekúnd pri. 55 °C a 1 minútu pri. 72 ^C'C. Výsledný PCR produkt sa gélovo čistil, digeroval pomocou Nd&T a Xdol a klonoval na pET 1.5b. Klony sa sek venovali a klony Sc7/pET #5 a So7/pET #G obsahovali Inzer t majúci, sekvenciu identickú s publikovanou 82-1 sekvenciou.

HA zakončenie sa pridalo na koniec 5' 82-1 cDNA pomocou PCR a takto zakončený gán sa potom naklonoval do pCl—neo. Vyššie popísaný 3' Sc7.Xho pri már sa použi l, spolu s 5’ So7. HAS primárom:

Sc7.HAS ATAT6CTAGCCACCATGGGGTACCCATACGATGTTCCTGACTATGCG ACGCGTATGGAGGAGGACGACAGC (SED ID č.: 9).

Podčiarknuté nukleotidy v tomto primére kódujú HA zakončenie. Tieto prlméry sa požili v IOjjI. PCR reakcii s Sc7/pET #6 DNA ako matrice pri nasledujúcich podmienkach. Vzorky sa udržiavali 5 minút pri 94 °C a potom sa nechalo prebehnúť 39 cyklov: 1. minúta pri 94 °C, 1. minúta pri 55 °C a 2 minúty pri 72 °C. Výsledný PCR produkt sa gélovo čistil, digeroval. pomocou NdeL a XhoT a klonoval na pCl-neo vektor, digerovaný pomocou NdeT/XhoT. Výsledný kloň sa označil, ako 5' HASc7/pCl #29. Jeho Inzer t kódoval HA fúzny proteín, tu označený ako 5'HA 82-1.

HA zakončenie sa pridalo na koniec 3' 82-1. cDNA pomocou PCR a takto zakončená cDNA sa potom naklonovala do pCl-neo. Použitými primármi boli. Sc7 . HA3 a T7:

Sc7.HA3 ATATGTCGACTCACGCATAGTACAGGAACATCGTATGGGTACATACG

1.9

CGTGTGTCGCTTCGTGGAGGA (SED TC č.= 10);

T7 TAATACGACTCACTATAGGG C SED ID č.; 11).

Tieto priméry sa použili, v 10j.il PCR reakcii, so SEC7/pCI #9 DNA ako matrice pri. nasledujúcich podmienkach. Vzorky sa udržiavali. 5 minút pri 94 °C a potom sa nechalo prebehnúť. 90 cyklov: 1. minúta pri 94 °C, 1 minúta pri 55 °C a 2 minúty pri. 72 ^C’C. Výsledný PCR produkt sa gólovo čistil·, digerowal pomocou Xhol a Sa.7.1 a ligoval do pCl-neo, dopredu rozpojil pomocou Xhol a Sali. Konštrukt sa označil ako 3'HA B2—1/pCl #29 a nim kódovaný proteín sa označil ako 3'HA B2-1.

B2-1. PH doména sa subklonovala pomocou PCR a pri použití 5' Tsc7.S a 3’ Sc7-Xba primárov:

Tcs7.5 ATATACGCGTACTTTCTTCAATCCAGACCG C SED ID č.: 12);

Sc7.Xba ATATTCTAGATCAGTGTCGCTTCGTGGAG (SED TD č.: 1.3).

Priméry sa použili inOlambda PCR reakcie sn SEC7/pET #5 DNA ako matrice, pri nasledujúcich podmienkach. Vzorky sa udržiavali 5 minút pri. 94 ^<:>C a potom sa nechalo prebehnúť 39 cyklov: 1. minúta pri 94 °C, 1. minúta pri. 59 °C a 2 minúty pri 72 °C. Výsledný PCR produkt sa gólovo čistil, dlgeroval pomocou 1*11.u 1 a Xbal. a klonoval do 5'HA pCl-neo, ktorý sa dopredu rozpojil pomocou ľllul/Xbal (pripravený rozrezaním 5'HA B2-l/pCl #29 kl enu, pomocou ľllul/Xbal') . Inzer t výsledného k lonu kódoval. Ι-IA fúzny proteín, tu označený ako 5'HA B2-1. PH.

IRP—1. cDNA sa s u h k I o n o val. o do 5'HA pCl vektora, najprv použitím PCR na pridanie l*llu miesta na 5' koniec cDNA a Sali. miesta na 3' koniec klonu. Použitými primérmi boli: '

S3.5'HA ATATACGCGTATGGAGGACGGCGTCTATG (SED ID č.: 1.4);

TS3.3 (SED ID č.: G)

Priméry sa použili IDOjjI. PCR reakcie s S3.3 DNA ako matricou pri nasledujúcich podmienkach. Vzorky sa udržiavali 5 minút pri °C a potom sa nechalo prebehnúť. 9(1 cyklov: 45 sekúnd pri 94 °C, 45 sekúnd pri 50 °C a 1. minútu pri 72 °C, Výsledný PCR produkt sa gélovo čistil, dlgeroval pomocou ľllu a Sali a ligová! do 5'HA pCl, ktorý sa dopredu rozpojil pomocou ľllu a Sali. Výsledný kloň sa označil. ako 5' HA TRP—1/pCl. #15 a proteín, kódovaný týmto k lonom, sa označil, ako 5'HA IRP—1.

Kloň 5'HA TS9/pCI. #9 (príklad 1) sa použil na exprimovaníe IRP-1 PH domény.

TRP-2 sa najprv klonoval na pCl-neo, používajúci PCR bez 1-IA zakončenia. Použitými primérmi. boli:

S12/SR1 ATATGAATTCCACCATGGACCTGTGCCACCCAG (SEQ ID č.: 15); TS12.3 ATATGTCGACTCACTGCTTGCTGGCAATC (SEQ ID č.: 16).

Tieto priméry sa použili v 100j.il PCR v 30 cykloch s klonom 5' HAS1.2( pCl. ako membránou pri týchto podmienkach: 1 minútu pri 94 °C, í minútu pri 50 °C a 1 minútu pri 72 °C. Výsledný amplifikovaný produkt sa čistil, dlgeroval. pomocou EcoL a Sali a ligoval na pCl-neo vektor, dopredu dlgerovaný rovnakými dvoma enzýmami. Výsledný kloň #1.1 sa úplne sekvenoval a ukázalo sa, že je identický s pôvodným klonom.

Okrem toho sa IRP—2 a IRP—2 na pCl-neo s 5'HA zakončením pri (SEQ ID Č.: 17), TS12.3 (SEQ ID č.

P H d o m é na k 1. o n o v a 1 i sa m o s t a t n e použití PCR a primárov TS12.5

18), S12.5 (SEQ ID č. 19).

TS1.2.5

ST12.3 S12.5

AIATACGCGTACCTTCTTCAATCCAGAC (SEQ ID č.: 17); ATATGTCGACTCACTGCTTGCTGGCAATC (SEQ ID č.: 18); ATATACGCGTATGGACCTGTGCCACCCAG (SEQ ID č.: 19).

DNA matricou pre ampliflkačné reakcie bol. kloň S12. Vzorky sa držali 4 minúty pri 94 °C a potom sa podrobili t30 cyklom: 94 °C počas jednej minúty, 52 °C počas dvoch minút a 72 °C počas dvoch minút. Každý z dvoch výsledných amplifikačných produktov sa digeroval pomocou Λ/ΤοΤ a .Sali, čistil a samostatne ligoval do pCl-neo HA vektora, dopredu digerovaného pomocou fllul a Sali. Kleny pCl-neo HA IRP-2 #8 a pCl-neo IRP-2 PH 45 sa sekvenovali a ukázalo sa, že sú identické s príslušnými sekvenciami v m a t r i co v om k1one.

Príklad 4

V tomto príklade sa určili účinky preexpriniovaných IRP proteínov na dependentnú bunkovú adhéziu (merané naviazaním transfekovaných COS alebo J Y buniek na ICAm-1) a na dependentnú bunkovú adhéziu (merané naviazaním transfekovaných JY buniek na VCAM-1).

CHS bunky sa kotransfekovali pomocou vektorov, kódujúcich CDlla/CD18 a vektorov (príklad 3), majúcich inzerty kódujúce 5'1-IA B2-1, 5'HA B2-1, 5ΉΑ B2-1 PH, 5ΉΑ IRP-1, 5ΉΑ IRP-1 PH, 5ΉΑ IRP-2, 5’HA IRP-2 PH, alebo pCl-neo vektorovej kontroly. CHS bunky s rozdelili tak, že 24 hodín pred transfekciou predstavovali 1,2 x 10^ώ buniek na 10 cm² platňu. Nasledujúci deň sa pre každú platňu pripravila transfekčná zmes, obsahujúca 5 ml DMEľl, 2 ul chlorochlnu (0,25 M), 3D jul DEAE Dextranu (50 mg/ml v CMF-PBS) a 10 j..ig každého vektora DNA, ktorý sa transfekuje do buniek. Rastové médium sa odstránilo z približne 80 % zliatyoh platní CHS buniek a pridala sa transfekčná zmes. Platne sa Inkubovali 2,5 hodiny pri 37 °C. Transfekčná zmes sa odstránila odsávaním a počas jednej minúty sa pridal. 102 roztok DMSH v DMEM (pri izbovej teplote). Po uplynutí jednej minúty sa DMSH odstránil odsávaním a pridalo sa 10 ml kompletného média.

Expresia LFA-1 a IRP proteínov transf okovanými CHS bunkami, sa potvrdila použitím rôznych protilátok. Všetky transfektanty sa zafarbili pozitívne na CD18. IRP transfektanty sa zafarbili pozitívne na HA epitop pri. použití 1-IA zakončenej špecifickej monklonálnej protilátky 150B HR 12CAS5.

Transfekované bunky sa testovali s cielom zistenia ich schopnosti viazať ICAM-1 pri 48 a 72 hodinách po transfekcii. S cieľom prípravy buniek pre adhézny test sa rastové médium odstránilo odsávaním a na platňu sa počas troch minút pridalo 5 ml komplevonu II a potom sa bunky izolovali. Pridalo sa 5 ml kompletného DMEM a bunková suspenzia sa miešala pri rýchlosti 1 000 o t/m i. n počas 5 minút. Bunky sa resuspendovali. v kompletnom

DMEM spočítali sa. Adhézne testy rôzne transfekovanými bunkami sa uskutočňovali nižšie popísaným spôsobom.

cez noc pri 4 °C. Tieto platne blokovali 150 ul/jamku 1% BSA

Jednotlivé 96-jamkové platne (Corning, Cambridge, MA) sa najprv potiahli buď ICAM-l/Fc alebo VCAM-l/Fc v uhličitanovom pufri, pH 9, 6, pri 50 ul/jamku 5 ug/ml proteínov a inkubovali sa sa premyli 2 x 150 ul/jamku PBS a v PBS počas jednej hodiny pri izbovej teplote. Po blokačnom činidle sa do každej jamky pridalo pri izbovej teplote 100 ul ad b éz n eh o pufra (RPMI médium s 10% plodovým bovinným sérom) spolu so '100 ul. transfokovaných JY buniek, suspendovaných v adhéznom pufri. Transfekované bunky sa pripravili nasledujúcim spôsobom.

Deň pred testom sa transfekované bunky nariedili. na hustotu 3 x 10⁵ buniek/ml v RPMI médiu doplnenom penicilínom/streptomycínom, L-glutamínom, pyruvátom sodným a 10% plodovým lýtkovým sérom. Bunky sa nechali zdvojiť, pričom k tomuto zdvojeniu došlo približne 24 hodín po inkubácii. Po zdvojení sa bunky zozbierali a resuspendovali na hustotu '1 x 10*“ buniek/ml. v adhéznom pufri. Približne 1 x 10^s buniek v '100 ul sa pridalo do každej jamky a platne sa inkubovali 30 minút pri izbovej teplote v zakrytom stave.

Po inkubácii sa bunky fixovali pridaním 50 ul/jamku 14% glutaraldehydu v CMF-PBS a inkubovali sa 30 minút pri izbovej teplote. Po inkubácii sa .jamky trikrát premyli deionizovanou vodou. Po poslednom preplachu sa voda odstránila odsávaním, 50 ul škvrna obsahujúca približne 0,125% Kryštálovú fialovú (pripravenú ako zásobný roztok 1% v '10% etanolu a 90% deionizovanej vody, nariedený na 0, 125 % deionizovanou vodou a prefiltrovaný cez 0, 22 mikrometrový filter) a platne sa Inkubovali počas dvoch minút. Po skončení inkubácie sa platne: trikrát premyli deionizovanou vodou vyššie popísaným spôsobom a pridalo sa 200 ul/jamku etanolového roztoku (dva diely 95% etanolu a jeden diel deionizovanej vody). Po jednohodinovej inkubácii sa platne prečítali na čítacom y

prístroji ELISA, pri rozsahu vlnových dĺžok 570 až 590 nm.

hodín po pretnúti 02-1 PH doménevé transfekčné činidlá demonštrovali mierne zníženie LFA-l dependentnej adhézie, v porovnaní s vektorovými kontrolnými transfekačnými činidlami. Bolo tu zaznamenané zníženie vážnosti IRP-2 PH doménevých transfekačných činidiel, zatiaľ čo plnodlžkové IRP kleny nevykazovali podstatnejšiu zmenu adhézie vzhľadom na pCl—neo vektorovú kontrolu. 72 hodín po pretnutí štyri trnasfekčné činidlá (3ΉΑ B2-1, 5'HA B2-1, B2-1 PH a IRP-1 PH) demonštrovali 50% zníženie Ι0ΑΙΊ-1 adhézie, v porovnaní s vektorovou kontrolou.

JY bunky, ktoré exprimujú endogénovú a LFA-l, sa jednotlivo transfokovali vektormi kódujúcimi buď IRP-1, IRP-2, B2-1, IRP-1 PH, IRP-2 PH alebo B2-1 PH. Bunky sa transfekovall e 1 e k t r o p o r á c i o u p r i p o u ž i t í š t a n d a r d n é h o p o s t u r> u . P r e k a ž d ú informáciu sa odstredilo 10⁷ JY buniek a uchovávala sa na ľade. Bunky sa premyli pri použití DPBS a opát odstredili. Bunky sa resuspendovali v 0, 5 ml DPBS a transfekovall na elektroporačnú kyvetu. Do každej transformačnej zmesi sa pridalo tridsať mikrogramov DNA (1 mg/ml DPBS). Transformačná zmes sa mierne miešala a inkubovala 10 minút na Tade. Bunky sa elektroporovali pri použití pulzéra BioRad Gene Pulser a nasledujúcich parametrov: kapacitančný nadstavec spustený, napätie 250 V a kapacitancia na 950 uf. Po realizácii elektroporácie sa transfekčná zmes inkubovala desať minút na lade. Bunky sa umiestili do 125 banky obsahujúcej 5 ml kompletného RPMI média. Tri dni po pretnutí sa do média pridal hygromycín v koncentrácii 0,5 mg/ml. Adhézne testy sa uskutočňovali 14 dní po pretnutí.

JY bunky transfekované IRP proteínmi takisto demonštrovali zníženie LFA-l dependentnej adhézie k ICAM-1 a adhézie k

VCAM-1, 1FA-1 a medzi transfekčnými činidlami nebol, podstatnejší takže to nevysvetľuje zníženie rozdiel pokiaľ ide o hladiny, adhézie.

Takže sa zdá, že IRP proteíny demonštrujú určitú špecifickosť pri modulácii alebo e.₇ in t egr í nove j dependentnej adhézie. Zdá sa, že IRP-1 exprimouané o JY bunkách preferenčne znižujú b_s. dependentnú adhéziu, zatiaľ čo IRP-·2 regulujú smerom dole a₇ dependentnú adhéziu. B2—1 transfekčné činidlá demonštrujú ako zníženie c.-., tak aj zníženie adhézie. Zdá sa, že expresia skrátení obsahujúcich PH doménu IRP—1, IRP—2 alebo B2—1 všeobecne znižuje ako tak aj dependentnú adhéziu. Pozri nižšie uvedená tabulka 2, o ktorej ”+·” reprezentuje zvýšenie adhézie, označuje zníženie adhézie a NS označuje-; prípad, kedy došlo k podstatnejšej zmene adhézie.

Tabulka 2

Ho s t i t eIs k á bunka

JY CCS

E x p r im o v a n ý p r o t e i n	b2	β7	e. 2
5'HA IRP-1	-	NS/-·-
5'HA IRP-2	NS	-	N S
5ΉΑ B2-1	-	NS/-'-	-
5ΉΑ IRP-1 PH	...	NS/-	...
5'HA IRP-1 PH	....	NS/-	N S

Tieto výsledky by zodpovedali amínovej terminálnej časti IRP proteínov vzájomne reagujúcich, priamo alebo nepriamo, s e._Ľ alebo Integrínmi s rôznymi afinitami rezultujúcimi v preferenčnej r e g u 1 á c i i j e d n é h o a 1 e b o d r u h é h o t y p u i n t e g r í. n u . F u n k c i a a interakcia PH domén, môže byť na druhej strane spoločným signálnym elementom v dráhach regulujúcich rôzne integríny. Týmto prvkom môže byť heterotrimérový GTP viažúci proteíny (napr. GaifabetagamaiPIPn, proteĺnkináza CCPKP) alebo nejaký ešte nedefinovaný ligand PH domén. Predpokladá sa, že antagonizujúce činidla, ktoré preruší TRP PH doménu s väzbou na tento spoločný signalizačný prvok, by malo široko regulovať adhéziu a pravdepodobne ďalších integrínov, napríklad β_χ a p,_:3 integrínov. Na druhej strane je možné predpokladať,, že antagonizu júce: činidlo, ktoré preruší amínovú terminačnú interakciu IRP proteínov s integrínom, reguluje integrínovú dependentnú adhéziu konkrétnejším spôsobom.

Leukocyty a luekocytové bunkové línie, ktoré nie sú maximálne aktivované pre integrínovú dependentnú bunkovú adhéziu je možné aktivovať PKC agonizujúcimi činidlami, napríklad forbolesterom PMA. Mechanizmus, ktorým PKC aktivita indukuje bunkovú adhéziu nie je dobre definovaná; PKC môže mať určitý vplyv na afinitu alebo zvýšenie avidity a rovnako tak aj an cytoskeletovú reorganizáciu potrebnú pre·: bunkové rozšírenie. Avšak ak PKC pôsobí v smere alebo proti smeru expresie IRP, potom sa môže indikovať vplyv PKC aktivity na IRP zníženie: integríriovej dependentnej adhézie. Forbolová stimulácia vyššie popísaných JY transf ekačných činidiel často neobnovuje: LFA--1 alebo dependentnú adhéziu v k vektorovým kontrolným hladinám. Takže huď regulačný PKC substrát môže: pôsobiť proti smeru dráhy regulovanej IRP proteínmi alebo PKC reguluje: diferenčnú dráhu alebo aspekt integríriovej dependentnej adhézie . Alternatívne: IRP proteíny môžu regulovať viac aspektov integríriovej dependentnej adhézie: a PKC stimulácia môže: ovplyvňovať len jeden z týchto aspektov. IRP proteíny môžu regulovať integrínovú dependentnú adhéziu , ovplyvnením integríriovej afinity, avidity C zhlukovania) (príklad 4) alebo membránovou recyklizáciou. Predpokladá sa, že úlohou . recyklizácle: je zníženie LFA-1 hladín na COS bunkách exprimujúcich IRP proteíny, ale nie: na CCS bunkách exprimujúcich IRP PH domény.

Aby sa určilo, či IRP proteíny vyvíjajú vplyv na bunkovú povrchovú expresiu integrínov, COS bunky sa kotransfekovali s DNA kyselinami kódujúcimi buď kompletný IRP--1, IRP-2 alebo B2-1 (alebo s kontrolným DNA vektorom pCl-neo alebo DNA kódujúcou

14-3-39) spolu s DNA kódujúcou buď οί!β₂. αί^,α,^ alebo TCAM--2. Bunky sa zafarbili pre povrchovú expresiu C fluorescenčnú intenzitu a percento pozitívnych buniek) pomocou monoklonálnych protilátok ICA4, 1 Cimunošpecifickej pre oc»). TS1/22 Cimunošpecifickej pre: o:_:l) 3S3 C imunošpecif icke j pre: β_χ) alebo 92C12F' C imunošpecif icke: j pre I6Alj~2) . Bi je: endogénne: exprimovaná v CDS bunkách a pre transfekciu nie je: potrebná žiadna i?>_:L kódujúca DNA.

Výsledky zhrnuté v nižšie uvedenej tabulke 3 naznačujú, že IRP-1 znižuje: bunkovú povrchovú expresiu 0:,,12.-. integrínu pravdepodobne: znižovaním de novo biosyntézy alebo reoyklačného procesu, ktorý odstraňuje: a nahradzuje integrín na celom bunkovom povrchu.

Tabuľka 3

IRP vplyv na bunkovú povrchovú integrínovú expresiu

		Bi	tó-q. β 1	ICAľl-2	Bi
pCI-neo		760t	396	317	309	509	363
		59% K	62%	30%	74%	59%	72%
IRP-1		533	364	266	405	469	361
		51%	66%	32%	74%	59%	77%
IRP-2		711	367	294	384	522	359
		60%	69%	38%	75%	55%	76%
B2-1		666	375	304	418	489	329
		59%	70%	36%	72%	54%	73%
14-3-39		690	361	336	368	543	386
		60%	72%	43%	74%	60%	75%

Stredná fluorescenčná intenzita ^M percento pozitívne;

Ako už bolo diskutované vyššie, rôzne: rodinné členy môžu mat opačné účinky na integrínovú dependentnú adhéziu. Tieto opačné účinky zodpovedajú TRP proteínom vzájomne: reagujúcim s rôznymi efektormi alebo signalizačnými dráhami, ktoré regulujú naviazanie integrínu (nižšie diskutované). Redundancia v týchto dráhach môže čiastočne vysvetľovať, prečo nadexpresla , IRP proteínov vedie len k čiastočnej blokácii IL-8 indukovateľnej adhézie. Okrem toho zníženie adhézie pomocou IRP-1 nadexpresie môže byt spôsobené IRP-1 antagonizujúceho proadhezívnu účinnosť ďalšieho IRP. Proadhezívna účinnosť B2-1 (cytohesin-1.) nie je smerovaná len na JY-8 (príklad 5) a bola takisto pozorovaná v súvislosti s nadexpreslou v Jurkatových T-lymfoidných bunkách ĽKolanus a kol.. Celí, 35: 233-242 (1996)3. Avšak na rozdiel od JY-8 buniek, expresia v Jurkatových bunkách indukovala ο'₁β_Ώ naviazanie. Takže 82-1 môže indukovať pre bunkový typ špecifickým spôsobom naviazanie oUBx alebo ota:.·· Nie je prekvapením, že väzbové vlastnosti špecifického integrínu sa môžu s typom bunky meniť C Chán a kol., J. Celí. Biol., 120: 537-543 (1993), Kassner a kol., J. Exp. ľled., 173: 649-660 (1993)3.

Potom sa v JY-8 (príklad 5) transfekčných činidlách schopných adhézie k ICAM-1 určila subcelulárna oblasť IRP/GFP fúznych proteínov. Sklenené podložné sklíčka sa 18 hodín pri 4 °C potiahla ICAľl-l/Fc (1 ug/ml.) v 50 mľl hydrogenuhličitanovom pufri., pH 9,6 a potom sa opláchli. RPMI médiom obsahujúcim 10% FBS. JY-8 transfektanty exprimujúce GFP/IRP fúzne proteíny sa nechali prilipnúť k skleneným podložným sklíčkam potiahnutým ICAM-1.

S cieľom stanovenia subcelulárnej distribúcie IRP/GFP fúznych proteínov a identifikovania oblastí IRP-1, ktoré sa môžu nachádzať v intracelulárnej oblasti sa skúmali pomocou fluorescenčnej konfokálnej mikroskopie JY-8 transfektanty. IRP-1, IRP-2 a B2-1 nachádzajúce sa prevažne na vadiacej hrane kortikálnej oblasti bunkovej kostry kraulujúcich na ICAM-1 (pozri príklad 8). PH doména IRP-1, sa nachádzala v oblasti plazmovej membrány, zatiaľ čo Sec7 doména demonštrovala väčšiu difúziu eytoplazmatickej oblasti. Transfektanty, exprimujúce GFP, demonštrovali difúziu eytoplazmatickej fluorescencie. Tieto výs3.edky naznačova3.i, že pH doména, ktorá nesie oblasť plazmatickej membrány, spôsobuje s ďalšími doménami lokalizáciu štandardného typu IRP proteíríbU ŕía vodiacej hrane.

S cieľom stanovenia distribúcie IRP proteínov počas tvorby lamiel sa analyzovali časovo odstupňované obrazy JY--8 IRP-2/GFP transfektantov kraulu júcich na ICAň-'l. JY-8 bunky nadexprimujúce IRP-2 sa zvolil tak, aby určil lokalizáciu v bunkách schopných migrovať v odpovede: na IL—8, pretože IRP—2 fúzne transfektanty demonštrujú vyššiu úroveň ehemotaktickej migrácie vzhľadom na IRP-1 alebo B2-1 transfekačné činidlá. IRP-2 sa nachádza koncentrovaný pozdĺž jednej hrany JY—8 buniek na mieste: lamelovej formácie: a pred touto formáciou. Časovo odstupňované obrazy ukazujú, že: konkomisie súčasne so svojim vývojom IRP-2 relokalizoval do lamely. Takže IRP-2 je prítomný veľmi skoro a v celom rozsahu extenzie: lamelipodia.

IRP proteíny pravdepodobne hrajú úlohu in t egr í no v e: j funkcie: vo vodiacej hrane: migrujúcich buniek. Zdá sa, že: táto lokalizácia je: závislá ako od Sec7, tak aj od PH doménových interakcií, pretože Sec7 doména sa lokalizuje difúzne a PH doména sa rovnomerne rozmiesti na membráne, ak sú exprimované nezávisle. Interakcie PH domén môžu podporiť funkčnú membránovú lokalizáciu komplexu obsahujúceho TRP a ADP ribozylačný faktor (ARF). V tomto mieste s môžu ARF stať aktívne, pretože aktivita ARNO (proteín popísaný po prioritnom dátume tejto prihlášky) GTP zmenového faktora (GEF) je: stimulovaná fosfaticyllnositolovým naviazaním na PH doménu LChardin a kol.. Náture, 384: 481-484 (1996) ]. Úloha ARF faktorov pri membránovom transporte: naznačuje, že: by mohli sprostredkovať lokalizáciu Integrínu na vodiacu hranu migrujúcich buniek a z tejto hrany, čo by mohlo zodpovedať poznámke, že polarizovaná exocytóza na vodiacej hrane môže: hrať úlohu pri bunkovom pohybe CBretscher, Celí, 87: 691-606 (1996) J.

pri nesení

Okrem toho inhibítor ARF GTP zmeny, Brefeldin A, inhibuje lamelipodiovú formáciu a migráciu fibroblastov v modele: hojenia rany CBershadsky a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 5686-5689 (1994)]. Bolo uvedené, že: B2-1 sa viaže: priamo na cytoplazma t±cl<Ľí doménu e.₂ C Kolanus a kol.. Celí, 86: 293-242 (1996)1. IRP proteíny môžu teda priamo na seba viazať integríny a aktivovať členy RAS nadrodiny, ktorá môže pôsobiť v jednom alebo n i e k o 1 k ý c h k r o k o c h c h em o t a x i e .

IJloba pri integrínovej avidite je takisto navrhnutá. ARF a ďalší člen ras nadrodiny, RhoA, pôsobí synergisticky na aktiváciu fosfolipázy Dĺžka (PLD) C Kuribara a kol., J. Biol. Chem., 270: 25667-25671 (1995)1. P L. D je v rôznych bunkových typoch aktivovaná rôznymi agonizujúcimi činidlami a štiepi fosfatidylcholín za vzniku cholínu a kyseliny fosfatídovej CBoman a kol., trende Bio. Chem. Sci., 20147—150 (1995)1, Fosfatidová kyselina a žiadne . ďalšie negatívne zmenené lipidy demonštrujú zvýšenie väzbovosti vyčisteného integrínu Gpllbllla na fibrinogén CSmyth a kol., J. Biol. Chem., 267: 15568—15577 (1992)1. IRP proteíny môžu pôsobiť ako regulátory v signalizačných dráhach, ktoré menia umiestenie integrínovej membrány alebo aviditu. Nedávno bolo publikované, že

ARNO indukuje GDP/GTP zámenu a tak aktivuje člen ras nadrodiny, ARF-1 CChadrin a kol., Náture, 384: 481-484 (1996)1. Je známych šesť ARF faktorov a ďalšie štyri ARF podobné proteíny, ktoré majú spoločnú 45 až 60% aminokysellnovú identitu CBoman a kol., Trende in Bio. Chem. Sci., 20: 147-150 (1995)1. ARF faktory sa nachádzajú na golgi., vezikulách a plazmovej membráne a zúčastňujú sa na membránovom transporte , endocytóze: a exocytéze: [D’Souza-Cchorey a kol., Science, 267: 1175-1178 (1995), Peters a kol., J. Celí Biol., 128: 1003-1017 (1995), Boman a kol.. Trende in Biol. Sci., 20: 1.47-150 (1995)1. IRP proteíny môžu teda . regulovať lokalizované zvýšenie fosfatídovej kyseliny, ktoré bude zasa zvyšovať integrínové naviazanie, priamo alebo nepriame, cez . konverziu na PKO agonizujúci. diacylglycerol (DAG).

Príklad 5

Bola vyvinutá JY bunková línia, ktorá stabilne exprimuje funkčný receptor pre: IL-8 vykazujúci N-terminálny mAb epitopový koniec. Táto bunková línia je tu označená ako JY-8. S cieľom stanovenia úlohy pri áiĎa deperidentne j adhézii, sa v JY-8 bunkové; j línii nadexprimovali IRP proteíny. JY-8 bunky zvyčajne; expr1mujú jeden e·^ integrín, q:iď₂. a jeden oo.,. integrín, ο^ι.ε>₇ C Cban a kol., J. Biol. Chem., 267: 8366-8370 í1992>1. IRP expresné končtrukty sa generovali použitím zeleného f 1 u o r e s o e: n č n é h o p r o t e í n u CGFP) f u z i o n o v a n é (ί o n a a m í n o v ý k o n i e o IRP-1, IRP-2 a B2-1 štandardných sekvencií, ktoré sú popísané v nasledujúcom odstavci. ,

E x p r e s 1 e k o n č t r u k t o v p r e: zelený f 1 u o r e s o e n č n ý p r o t e: í n C G D P ) IRP fúznych proteínov sa pripravili nasledujúcim spôsobom. Expresný vektor pCEP4 CInvitrogen, San Diego, CA) sa digeroval pomocou Nhel a BamHI. Nhel a BamHT digerovaný DNA fragment kódujúci GFP z pEGFP CClonteoh, Palo Alto, CA) sa ligoval. na NhelPBamHI digerovaný pCEP4. Výsledný plazmid, pCEP4/GFP, sa použil na prípravu IRP fúznych konštruktov.

Pre: subk lemovanie: IRP DNA fragmentmi do pCEP4/GFP sa použili PCR reakcie, ktoré dodali na konce uvedených fragmentov Xhol a Hind III reštrikčné miesta potrebné pre: následnú rámcovú ligáciu.

Pre PCR sa použili tieto priinérové páry:

S3 . GFPXho . 5, S3. GFP-H3.3,

ATATCTCGAGCTATGGAGGACGGCGTCTAT CSEQ ID č.: 20) a ATATAAGC ľ'TGCGGCCGCTCAGGGCTGCTC CTGCTTC C SEQ ID č.= S7. GFP . Xho . 5,

21) pre fúziu IRP-1 GFp;

ATATCTCGAGCTATGGAGGAGGACTACAGCTAC (SEQ ID č.: 22) a S7.GFP.H3.3, AT AT A AGCTTGCGGLCGLTC AGTGTCGCT I CGTGGAGG C SEQ ID č. : 23) pre: fúziu B2-1 GFP , S12. GFP . Xho. 5, ATATCTCGAGCTATGGACCTGTGCCACCCAG C SEQ ID č.: 24) a S12.GFP.H3.3, ATATAAGCTTGCGGCCGCTCACTGCTTGCT GGCAATCTTC C SEQ ID č.: 25) pre: fúziu IRP-2 GFP; S3.GFP.5.X,

ATA ľC TCGAGC TATGAGCGAGGl GGAGGGGCTG, C SEQ ID č. : 2Ei)

ATATAAGCTTGCGGCCGCTCAGAAGGTGTG GGTCAGGTC C SEQ ID fúziu IRP-1 doménu GFp_;

ATATCTCGAGCTATGACCTTCTTCAACCCGG CSEQ ID č.= 28) a S3.GFP.H3.3 pre fúziu IRP-1 PH doménu GFP.

S3.GFP.5.H3 č.: 2'7) pre:

S3GFP.P.X.,

Okrem toho aminokyselinové substitučrié mutanty sa generovali pomoco insert vitro mutagenézne j súpravy l*luta-Gene Phagemid C verzia 2, BioRad, Hercules, CA) s oligoriukleotidmi j S3.E156A, GTCAATTTTCTGGGCCGCTCCGGGTAGGCGAAA CSEQ ID č.: 29) pre prípravu E156A a S3.R279A, TGTGAGGATAAACCAGGCCCGCTTCCACGTCTTC C SEQ ID č.: 39) pre prípravu R279A. Pre prípravu vhodných reštrikčných miest pre GFP fúziu sa použila PCR amplifikácia mutantnej cDNA využívajúcej priméry S3.GFP.Xho5 S3.GFP.H3.3. ¹

Výsledné PCR produkty sa ligovali na Xho I a Hind III miesta PCEP4/GFP. Klony izolované z E. coli XLI modrých transformačných činidiel sa potvrdili sekvenovaním. Všetky expresné vektory boli navrhnuté tak, aby kódovali IRP/GFP fúzrie proteíny s GFP v mieste amínového zakončenia fuzneho proteínu. JY-8 bunky sa transfekovalí elektroporáciou s expresnými konštruktmi a transfekčné činidlá sa zvolili pri použití, hygromycinu B CO, 5 mg/ml, Calbiochem, San Diego, CA).

Okrem toho sa pripravili IRP-1 GFP fúzne proteíny majúce v Sec7 alebo PH doménach aminokyselinové substitúcie. Substitúcia z volila n a z á l< 1 a d e

alanínu za glutaman	v	polohe 156	, E156/A	sa
účinkov tejto mutác	i e	na bunkovú	adhéziu	V Si
Arah idop.si.su, E 1*1 B 30	CSt	nevell a kol.	., Celí,	77:
P o d o b n e s u b s t ?i. t ú c i a	v	PH doméne,	R279/A,	sa :

77: 1051-1062 ¢1994)3. ilila na základe mutácie identifikovanej v PH doméne BTK, ktorá má za následok X-viazanú agemagloblinémiu CXLA) CYao a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 9175-7179 ¢1994)3 a môže byť dôležitá v PKC CYao a kol., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91:

naviazaní inositol 1,3,4,5-tetrakisfosfátu Chem., 271: 30303-30306 C 1996)3.

9175-9179 ¢1994)) a CÍP.*) CFukuda a kol., Takisto sa generovali

J. Biol. skrátenia obsahujúce buď Sec7 doménu alebo PH doménu IRP-1 fuzionovanú na GFP.

Imunologický prenos na membránu ukázal, že sa IRP/GFP fúzne proteíny exprimoval?! vo všetkých JY—8 transfektantov v podobných koncentráciách. Ma potvrdenie expresie fúznych proteínov sa detergenčné lyzáty JY-8 transfektantov imunologický zafarbili pomocou protilátok špecifických pre IRP—1, B2—1, IRP PH domén a

GFP. Migrácia všetkých GFP fúznych proteínov, v SDS-PAGE, zodpovedala ich predpokladaným veľkostiam. Okrem toho fúzne proteíny viazali príslušnú mAb špecifickú pre IRP-1, B2-1 alebo PH doménu a rovnako tak aj GFP protilátky. Endogénne IRP-1 a B2-1 sa takisto detegovali v JY lyzátoch. Odhady z niekoľkých škvŕn naznačili, že sa sedem fúznych proteínov expriniovalo v úrovniach aspoň desaťkrát vyšších ako endogénne IRP-1 a B2-1.

Integrínovo dependentná bunková adhézia je indukovateľná rôznymi stimulmi C Diamond a Springer, Curr. Opiri. Biol. 4: 506-517, ¢1394)3. Známe stimuly pre indukovanie adhézie zahrnujú agonlzujúce činidlá pre G-proteín spojené chemokínovými receptormi, napríklad IL-8 alebo agonizujúce činidlá pre PKC, napríklad PMA. Tieto stimuly aktivujú signalizačné dráhy, ktoré môžu regulovať organizáciu bunkovej kostry a zhlukovanie spôsobom, ktorý zvyšuje alebo stabilizuje integrínovú dependentnú adhéziu. Chemokíny a agonizujúce činidlá, napríklad PMA sa používajú bežne na zvýšenie adhézie alebo určenie maximálnych úrovní adhézie pri insert vitro testoch.

Adhézne testy merajúce naviazanie IRP/GFP fúznych proteínov na ICAM-1 alebo V C AM-J. sa uskutočňovali v 96-jamkový ch platniach Easy Nash (Corning) pri použití modifikovaného postupu Moria a kol., Náture, 367: 193-196 (1994). Každá jamkei sa potiahla 50 ul ICAM-l/Fc (5 j-ig/ml) alebo VCAM-l/Fc (2 ng/ml) v 50 inM hydrogenuhličitanovom pufri (pH 9,6). Niektoré jamky sa potiahli CD18 inAb (22F12C, ICOSCorporation) s cieľom kvantifikovania 100% vážnosti zavedených buniek alebo BSA blokom s cieľom stanovenia vážnosti pozadia. Platne sa blokovali 1% BSA v PBS počas jednej hodiny pri izbovej teplote. Jamky sa potom prepláchli a pridalo sa 200 ul adhézneho pufra (5% FBS, 5 mM KOI, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl_s., 1 mM CaCl₂, 20 mM HEPESm 10 mM D-glukózy) s alebo bez PMA (20 ng/ml) alebo IL-8 (25 ng/ml). Do každej jamky sa potom pridali JY-8 bunky (100 ul 5χ10^ώ/πι1) a platne sa inkubovali pri 37 ^C’C v 5% C0₂ počas piatich alebo tridsiatich minút. Bunky schopné adhézie sa fixovali pridaním 50 ul 10% glutaraldehydového roztoku a zafarbili sa 0, 5% roztokom kryštálovej fialovej C SIGMA). Po premytí a pridaní 70% etanolu sa bunky schopné adhézie kvantifikovali na základe stanovenia absorbancie pri 570 nm pri použití spektrofotometrického systému Spectramax 250 ľlicroplate (ľlolecular Devices). Percento buniek schopných adhézie sa určilo pomocou tohoto vzorca:

Aszo (vážnosť na ICAM-1 alebo VCAM-1) -- A_S7-_O (vážnosť na BSA) x 100

Aszo (väznost na CD18 mAb)

Adhézia JY-8 na imobilizované ICAM-1 alebo VCAM-1 sa určila pri statických podmienkach bez stimulácie (základná úroveň vážnosti) a rovnako tak aj pri stimulácii IL-8 alebo PMA. V porovnaní so základnou úrovňou vážnosti, JY-8 bunky exprimujúce: len GFP ukázali troj až štvornásobné zvýšenie: vážnosti na ICAM-1 a dvojnásobné zvýšenie vážnosti na VCAM-1 v prítomnosti IL-8. IL-8 iodukovatelná adhézia na VCAM-1 bola zrejmá po piatich minútach, avšak zvýšenie úrovne vážnosti medzi piatimi až tridsiatimi minútami znižuje rozdiel medzi stimulovanou a nestimulovaňou vážnosťou. Následné testy sa uskutočňovali tridsať minút. PMA ošetrenie viedlo k štvornásobnému alebo vyššiemu zvýšeniu adhézie: k ICAM-1 a VCAM-1. JY-8 transfektanty nadexprimujúce IRP-1 vykazovali 40 až 50% zníženie: vážnosti na ICAM-1 vzhľadom na kontrolné transf ektanty činidlá exprimujúce: ekvivalentné alebo vyššie: úrovne GFP. Toto zníženie bolo zrejmé pre základnú a IL-8 stimulovanú adhéziu, ale: nie pre: PMA indukovanú adhéziu. Väzbovosť IRP-1 nadexprimujúcich JY-8 transfektantov k VCAM-1 sa takisto znížila približne o 40% pri podmienkach IL-8 stimulácie, ale nie pri základných alebo PMA stimulovaných podmienkach. Tieto výsledky ukazujú, že sa IRP-1 výhodne ovplyvňuje? chemokínom, ale: nie: PMA stimulovanou adhéziou a že IRP-1 nadexprimovanie všeobecne: neudeľuje: bunkám adhézivnu nedostatočnosť.

S cieľom určenia príspevku rôznych IRP—1. domén k inhibovaniu adhézie, sa testovali JY-8 bunky exprimujúcej aminokyselinovú substitúciu a deléciu mutantov. Substitúcie: aminokyselín v odstránených Sec7 s PH doménach ovplyvňujú IRP—1 nadexpresiu na adhéziu. Transfektanty exprimujúce IRP-1 Sec7 doménovú mutáciu E158/A a PH doménovú mutáciu R279/A, vykazujú úrovne väzbovosti l< ICAM-1 a VCAM-1 zhodné s väzbovosťou GFP epxrimujúceho JY-8. Okrem toho nezávislá expresia IRP-1 Sec7 alebo PH domén nezvyšuje väzbovost na ICAM-1 alebo VCAM-1 tak účinne ako štandardný typ IRP-1.. Takže ako Sec7, tak aj PH domény pôsobia, spoločne tak, že regulujú IL-61 stimulovanú adhéziu na ICAM-1 a VCAM-1.

Ďalej sa stanovili účinky IRP-2 a B2-1 nadexpresie na JY-8 adhéziu. JY-8 transfekačné činidlá nadexprImujúce IRP-2 vykazujú slabšie zníženie, približne o 20%, v základnej úrovni vážnosti k ICAM-1 alebo IL-8 indukovanej vážnosti l< ICAM-1 a VCAM-1 v porovnaní s GFP transfektantmi. Na druhú stranu transfektanty nadexprimujúce B2-1 vykazujú kontrolné úrovne IL-8 stimulovanej vážnosti k ICAM-1, ale zodpovedajúce: zvýšenie: väzbovosti k VCAM-1, približne o 50%. Takže; vplyv na B2-1 nadexpresiu v IL-8 stimulovanej adhézii k VCAM-1 je opačný v porovnaní s T.RP-1 a IRP-2 a selektívny pre oub₇/VCAM-1 interakciu.

Modulácia JY-8 adhézie k ICAM-1 a VCAM-1 s nadexprimovaním IRP proteínov nemôže prispieval k zmenám úrovní. alebo oí₄b₇ bunkového povrchu. V miere expresie: oíi.b₂ alebo na rôznych

JY-8 transfektantoch nadexprimujúcich IRP proteíny je: relatívne malý rozdiel v porovnaní s transfektantmi nadexprimujúcimi GFP proteíny. JY-8 bunky nadexprimu júce: IRP-1 Sec7 vykazujú mierne zníženie expresie d^e,^, avšak tieto bunky nevykazujú zníženie adhézie k

VCAM-1.

Príklad G

Integrín d^e,^ môže sprostredkúval prichytenie a narolovanie Iymfocytov k endotelovým bunkovým ligandom VCAM-1 a MadCAM-1 pri prúdových podmienkach C Berlín a kol., Supra (1995)]. S cieľom stanovenia toho, či IRP expresia ovplyvňuje sprostredkované bunkové naviazanie a narolovanie, sa kvantifikovala väznosl JY transfektantov pri nekludových podmienkach Ľ Berlín a kol., supra

C1995)]. Okrem toho. po stanovení bunkovej vážnosti pri prúdových podmienkach sa zisťovala statická adhézia s cieľom stanoviť možné zmeny v oí^e,^ avidite, ku ktorým by mohlo dôjst v dôsledku IRP expresie.

JY bunky, ktoré exprimujú endogénny sa transfekovali buď kompletnými IRP-1(JY_irp_i), IRP-2 (JYxr_P-₂) alebo B2-1 CJYas.-!) kódujúcimi sekvenciami alebo vektorovou kontrolnou DMA (JY^e-k) a do prúdovej systémovej slučky obsahujúcej imobilizovaný VCAM-l/imunoglobulínový <VACľl-l/Ig) chimerický proteín CVonderheide a kol., J. Celí. Biol. 125: 215--222 ¢1994)]. Začiatočný prietok, ktorý bol 3 dyn/cm^a, sa udržiaval počas jednej minúty. Po nasledujúcich piatich minútach, kedy sa prietok znížil na 1,5 dyn/cm², JYvek transfektanty a menšou mierou aj JYea- i transf ektanty vykazovali schopnosť naviazať sa a narolovat sa (obrázok 2). Bunky transfekované buď IRP-1 alebo IRP-2, JY_IRF._! a JY_IF!F._-., sa nenaviazali alebo sa naviazali len veľmi zriedkavo.

V nasledujúcej minúte sa transfekované bunky inkubovali v prítomnosti imobilizovaného ligandu v kľudovom stave a táto doba bola nedostatočná na to, aby sa vytvorili väzby J Y χ _RF._ j / VCAN-1 alebo JYiRF-a/VCAH-1. Po tejto perióde statického naviazania sa prietok počas nasledujúcej štyri a pol minúty zvyšoval z 1, 5 na 9 dyn/cm². Väzbovost JYe2-i a JYvek sa znižovala až do okamihu, kedy prietok dosiahol 3 dyn/cm²' t obrázok 2). Podobné znižovanie početnosti väzieb pre tieto dva proteíny naznačuje podobnú väzbovú aviditu pre IRP-3 a VEK.

Výsledky testu naznačili, že IRP-1 IRP-2 expresie rušia schopnosť o;4B7 naviazať sa na VCAľl-l ako pri prúdových, tak aj pri krátkodobých statických podmienkach. Avšak ukazuje sa, že expresia B2-1 znižuje len schopnosť naviazať sa a narolovat sa.

S cieľom stanovenia vplyvu IRP-1 a IRP-2 expresie na väzbovost endogénnej LFA-1 na ICAM-1 sa JY bunky transfekované vyššie popísaným spôsobom použili pri podobnom teste, ktorý sa líšil v tom, že imobilizovaným protireceptorom bol ICAľl-'l. Všetky transfekované JY bunky, s výnimkou JY_B2-i buniek, sa naviazali a narolovali na 16ΑΙΊ-1 pri prietoku 1,5 dyn/cm⁵². Schopnosť naviazať sa bola však v porovnaní s ouex/VCAM-l vážnosťou znížená <obrázok 3). Adhézia na ICAľl-1 po jednej minúte statického viazania podstatne vzrástla v prípade všetkých transfektantov s výnimkou JYi_RP-i buniek, pre ktoré yäznost síce vzrástla, ale· k nižšiemu maximu. Pri zvyšovaní prietoku nasledujúce statické viazanie, ICAľl-1 viazanie JY_IRP_i, JYb₂-i a JYvek buniek sa znižuje. Avšak zdá sa, že JYi_RP-₂ väznost je najodolnejšia voči zvyšovaniu prietoku, pretože väznost bola detegovaná dokonca pri prietoku 7,5 dyn/cm². Tieto výsledky naznačujú, že B2-1 expresia ruší LFA-1 pripojenie na ICAľl-1 pri prúdových podmienkach IRP-1 expresia znižuje LFA-l/ICAľl-1 väzbovost pri statických podmienkach; a IRP-2 expresia podporuje vyššiu aviditu väzbovosti medzi LFA -1 a ICAľl-1.

Príklad 7

S delom m o n o k 1 o n á 1 n y c h IRP-1 a 132-1 oblasti IRP-1 Madison, WI) zakončenie tak

N-terminálnym generovania IRP-1 a B2-1 špecifických protilátok, sa myši imunizovali His-zakončenými exprimovanými a čistenými z £. coli. Kódujúce a B2--1 boli llgované v rámci pET15b < Novagen, C-terminálu do sekvencií kódujúcich histínové , že sa IRP-1 a B2-1 proteíny exprlmovali ako histidíriom zakončené proteíny v kmeni E. coli

BL211ysS. Rekombinantné proteíny sa čistili štandardnými postupmi COiagen, Chatsworth, CA).

Hybridómy sa publikácii, ktorej 270: 25461-25487 piatich šest deň a myši produkovaným adjuvans. Po generovali spôsobom všeobecne popísaným v autormi sú Tjoelker a kol., J. Biol. Chem., <1995). Pre hybridómové série 200 sa každej z až dvanásttýždenných myši Balb/c odobrala krv 0. sa potom imunizovali subkutánne 67 ng E. coli HisB2-l, emulgovaným v kompletnom Freundovom 21 dňoch sa každá myš injektovala 25 u g HisB2-l v kompletnom Freundovom adjuvans. Skúšobné odbery sa uskutočnili 34 deň a testovali Westernovým prenosom. 100 ng HisB2-l proteínu z 10% redukujúceho SDS-PAGE sa transferovalo na PVDF, ktorý sa potom nastrihla na prúžky. Prenos sa blokoval jednu hodinu pri izbovej teplote 3% BSA, 0,2% Tueenom 20 v CMF-PBS. Predimunné a imunné séra sa nariedili v pomere 1.500 v blokovacont pufri a inkubovali uvedenými prúžkami pri Izbovej teplote. Prúžky sa trikrát premyli 2% Tueenom 20 v OľlP-PBS a potom jednu hodinu inkubovali kozím antimysacíni CFc)-HRP. Po štvornásobnom premytí sa prúžky vyvolávali pomocou chemiluminescenčných rontgénov Renaissance <NEN). Ijyši #2413 sa podala posledná intraperitoneálna injekcia 25 u g HisB2-l proteínu v CMF-PBS 45 deň a o štyri dni neskôr sa jej odobrala slezina.

Pre hybridémové série 233 sa každej z piatich šesť- až dvanásť,týždenných myši Balb/c nultý deň uskutočnil odber krvi a všetky sa imunizovali subkutánne 30 ug HislRP-1 produkovaného E. coli a eniulgovariého v kompletnom Freundovom adjuvans. Dvadsiaty druhý deň sa každej myši injektovalo 10 ug Hi.sIRP-1 a štyridsiaty piaty deň 5 ug HisIRP-1 v kompletnom Freundovom adjuvasn. Päťdesiaty piaty deň sa uskutočnili skúšobné odbery či tie sa testovali Westernovým prenosom proti HisIRP-1 a HisIRP-2- l^vlyš #2520 sa injektovala intraperitoneálne 50 ug HisIRP-1 v CMF-PBS 133. a 134. deň a 137. deň sa im sterilné odobrala slezina.

Fúzie sa uskutočnili nižšie popísaným spôsobom. Jednobunková suspenzia sa uskutočnila drvením sleziny medzi zmrazenými koncami dvoch mikroskopických podložných sklíčok ponorenými v sér e; neobsahujúcom RPMI 1640, doplnenom 2 mM L-glutamínu, 1 mM piruvátu sodného, 100 jednotkami/ml penicilínu a 100 ug/ml streptomycínu (RPMI) CGibco, Canadal. Bunková suspenzia sa filtrovala cez sterilný 70-meshový bunkový filter Niter CBecton Dickinson, Parsippany, Neu Jersey) a dvakrát premyl päťminútovým odstreďovaním pri 200 g a resuspendovaním peliet v 20 ml séru neobsahujúcom RPMI. Tymocyty odobrané z troch myší Balb/c, na ktorých doteraz neboli uskutočňované žiadne pokusy, sa pripravili podobným spôsobom.

NS-1 myelómové bunky udržiavané v log fáze v RPMI pomocou 11% séra FetalClone (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logari, IJtah) sa tri dni pred fúziou odstrecľovali päť minút pri 200 g a pelety sa dvakrát premyli spôsobom popísaným v predchádzajúcom odstavci. Po premytí, sa každá bunková suspenzia previedla na konečných 10 ml v sére neobsahujúcom RPMI a spočítala sa.

Slezinové bunky sa kombinovali s NS-1 bunkami v pomere 5:1, odstrecľovali sa a supernatant sa odsal. Vytlačila sa bunková peleta, pri stálom miešaní sa počas .jednej minúty pridali 2 ml 37 °C PEG 1500 (50% v 75 mM Hepes, pH 8,0) (Boehringer Mannheim) a potom nasledovalo pridanie 14 ml séra neobsahujúceho RPMI, ktoré sa uskutočnilo počas siedmich minút. Potom sa pridalo ďalších 16 ml RPMI a bunky sa odstreďovali pri 200 g desať minút. Po odčerpaní supernatantu sa peleta resuspendovala v 200 ml RPMI obsahujúcom 15% FBS, 100 uM hypoxantínu sodného, 0,4 uM aminopterínu, 16 uM tymldínu (HAT) (Gibco), 25 jednotiek/mlk IL--6 (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 10* tymocytov/ml. Suspenzia sa naliala do 96-jamkových platní tkanivovej kultúry s jamkami s plochým dnom (Corning United Kingdom), pričom do každej jamky sa nalialo 2013 ul. Bunky na platniach sa živili trikrát až päťkrát pred screeningom odsatím približne 11313 ul z každej jamky pomocou ihly 18 G (Becton Dickinson) a pridaním 1(3(3 ul/jamku vyššie popísaného média s tou obmenou, že obsahovalo 1(3 jednotiek/ml TL-6 a neobsahovalo tymocyty.

Supernatanty z fúzie 2(3(3 sa sereenovalí najprv pomocou testu ELISA na imunogén a delegovali pomocou kozieho protimyšacieho IgG(Fc) konského reďkovkového peroxidázového konjugátu. Supernatanty z tridsiatich .jamiek, ktoré poskytli najvyšší, signál, sa opakovane: testovali pomocou Westernovej analýzy na imunogéne. Ma základe: výsledkov testu sa pre ďalšie klonovanie: zvolilo deväť fúznych jamiek. Týchto deväť jamiek sa označilo ako 200A až 2001.

Supernatanty z fúzie 233 sa najprv testovali pomocou testu ELISA na HisiRP-1 a H±sB2-l potiahnutými platňami. Fúzie: z jamiek reagujúcich klonovanie.

s HisIRP-1 a nie s HisB2-l sa zvolili pre ďalšie

Tieto fúzne bunky sa subklonovali postupne pomocou RPľlI, 15% FBS, 100 j_iM hypoxantinu sodného, 16 j..iM tymidínu a 10 jednotiek/ml IL-G. Subklonovanie sa uskutočňovalo buď dvojitým neriedením alebo limitujúcim nariedením a naočkovaním 96-jamkových platní pri koncentrácii 0,5 až 1,0 buniek/jamku. Jamky subklonálnych platní sa hodnotili vizuálne a členy kolónií v najmenej hustých jamkách sa zaznamenali. Zvolené jamky každého klonovania sa testovali pomocou testu ELISA alebo popísaného Westernovho prenosu na reaktivitu pozorovanú v pôvodnej fúznej jamky.

Klonovanie bolo dokončené pre bunkové línie 200A,

200B, 200F, prenosy sa a 233K.

uskutočňovali pomocou reakčných protilátok z ôsmich hybridómových línií pomocou IRP-1, IRP-2 a B2-1. Pre monoklonálne protilátky z ôsmich hybridómových bunkových línii sa pri použití sady Isostrip (Boehringer Mannheim) alebo produktu ELISA a pri použití izotypových špecifických reakčných činidiel (Zymed Laboratories, South San Francisco, 0A) stanovili izotopy. Všetky protilátky sú IfG'l s výnimkou 2000, ktorý je izotop IgG2a.

200H,

2000,

233E,

2330

Westernove

Hybridómové bunkové línie 200A, 200B a 2330 boli uložené v zbierke American Type Culture Collection.

233 série mAbs sa ďalej testovali pri použití hybridómových supernatantov a screenovali vo Westernových prenosoch. JY-8 bunky transfekované buď GFP/IRP-1 alebo OFP/IRP-2 alebo GFP/B2-1 (pozri príklad 5) sa lyžovali v 1% pufri CHAPS. Bunky sa lyžovali 30 minút na lade a potom odstreďovali desať minút rýchlosťou 12 000 ot/min. Do supernatantov sa pridal vzorkový pufer a vzorky sa štyri hodiny varili. Vzorky prešli cez 8% gél Movex a transfekovali sa na PVDF membránu. Táto membrána sa blokovala jednu hodinu v TST (25 mM Tris pH 8, 0, 150 mM NaCl, 0, 2% Tuieen-20) obsahujúcom 3% BSA. Blokovací roztok sa odstránil a nahradil 1:20 nariedením hybridómového supernatantu vo väzbovom pufri (3% BSA v TST) a inkuboval sa jednu hodinu pri izbovej teplote. Membrána sa extenzívne premyla TS ľ a potom tridsať minút inkubovala pomocou HRP konjugovariým kozím protimyšacím IgG Fc •fragmentom (Jackson ImmunoResearch) pri izbovej teplote. Po premytí pomocou TST sa na Renaissance (NEN) a membrána sa Supernatanty z 233A, 233D, 233G, označené príslušne velkým '77 kDa GFP-IRP-2 alebo GFB-B2-1 lyzátc najsilnejší.

ECL detegovanie použila sada exponovala na Hyperfilm (Kodak).

233K a 233L všetky špecificky pásom v GFPtIRP-1 lyzáte a nie v ch. Si g n á 1 p o u ž í v a j ú c: i 233G b o 1

Zopakovaním vyššie popísaného postupu sa takisto skúmala schopnosť detegovať GFP-IRP fúzne proteíny z lyzátov JY-8 transfektantov pomocou Westernovho prenosu pre vyčistené 200A a 20BB mAbs. Obidve mAbs sa pri Westernovom prenose použili v koncentrácii 1 ug/ml. mAb 200A označili GFP-Irp-1, GFP-IRP-2 a GFP-B2-1 rovnako dobre, zatiaľ čo 200B preferenčne označila GFP-B2-1 a vykazovala slabé rozpoznanie (menšie ako 10% úrovne ktorá bola videná pre B2-1- Na ďalšom Western obsahujúcim lyzáte JY-8 transfektantu exprlmujúceho GFP zakončenú PH doménu IRP-1,

200A detegovala pás s skrátenie naznačujúce, homolégových PH doménach vhodnou veľkosťou pre GFP-IRP-1 PH že 200A rozpoznáva spoločný epitori v IRP-1, IRP-2 a B2-1.

Pre hybridómové supernatanty sa screenovala špecifická reaktivita k rekombinantným proteínom pomocou ELISA. Okrem toho sa špecifickosť určila pomocou reaktivity na Westernové prenosy obsahujúce IRP-1, IRP-2 a B2-1 E. coli exprimované proteíny. mAb 200A (reagujúca s IRP-1, IRP—2 a B2-1 PH doménami), 233G (reagujúca s IRP-1) a 200B (reagujúca s B2-1) sa použili na stanovenie expresných úrovní a veľkostí GFP—IRP fúznych proteínov v JY—8 IRP transfektantoch.

S cieľom stanovenia in tegri.no vých expresných úrovní, na JY-8 transf ektantoch sa bunky zafarbili mAb špecifickou pre oíiB₂, TS1/22 (ATCC) a o:,_v, IC/A4.1 (ICOS Corporation) štandardnou nepriamou imunofluorescenciou. Fluorescencia bola kvantitatívne stanovená prúdovou cytofluorometriou pri použití, skenu FACS.

Príklad 8

Chemotaxia nevyžaduje len začiatočnú adhéziu na substrát a eyklizáeiu integrínu fázami viazania a uvoľňovania v polyrizovaných bunkách, ale takisto vyžaduje recyklizáciu integrínu odtokovej z odtokovej na vodiacu hranu. S cieľom stanovenia vplyvu IRP proteínov na ďalšie integrínové funkcie, okrem statickej adhézie, sa pomocou migračného testu ehemotaktických buniek stanovila úloha IRP na chemotaxiu. V tomto teste JY-8 bunky migrovali smerom k zdroju IL-8 integrínovým a CAM dependentným spôsobom.

pre bunkovú migráciu kcil., frnmunol., 88: platne (Falcon) sa

Tento test použil modifikáciu postupu pod agarózou, ako to popísal Schreiner a 89-96 C1980). Stručne uvedené, šesťjamkové potiahli buď ICAM-l/Fc (25 ug/ml) alebo VCAM-l/Fc (10 ng/ml) (ICOS Corporation) v hydrogenuhličitanovom pufri (pl-l 9,6). Po prekrytí 1% agarózou v RPľlI, s obsahom 0,5% BSA (Intergen), sa platne inkubovali 30 minút pri 4 °C. Bunky sa premyli RPMI a resuspendovali pri koncentrácii. 5 x lO^/ml v RPMI 0,5% BSA. Bunky sa tvorili v agaróze použitím 2,5mm gélovej raznice (Pharmacia) a bezprostredne potom sa naplnili ( P e p r o T e e h ) a 1 e b o b u n k o v o u ul IL.-8 (2,5 ug/ml) suspenziou. Platne sa inkubovali 8 5% C0_s.. Bunky sa potom fixovali pridaním 2% roztoku. Po odstránení agarózy sa jamky Kvantifikovanie bunkovej migrácie sa hodín pri 37 °C v g 1 u t a r a 1 d e h y d o v é h o prepláchli dH_aO a vysušili.

uskutočnilo pri použití videomikroskopickej pracovnej stanice, ktorá je zložená z CCD-72 videokamery Michigan City, IN) zobrazovacieho zdravia IJSA mikroskopu a DSP2000 a pri

Diaphot (Nikon, Tokio, Japan), d i g i. t á 1 n e h o p r o c e s o r u ( D a g e, použití. Macintosh MIH Image n á r o dnom i n š t i t ú t e: anonymnými FTP zo programu (vyvinutého pri dostupného z internetu zippy.nimh.nih.gov alebo na floppy disku spoločnosti National. Technical Information Service, Springfleld, Virginia, číslo PB95-500195GEI) .

Chemotaxia JY-8 buniek, exprimujúcich GFP/IRP fúzne proteíny, sa stanovila vyššie popísaným spôsobom. IRP-1, IRP-2 a B2-1 nadexpresia v JY-8 bunkách znižuje chemotaxiu na ICAM-1 alebo VCAM-1, v porovnaní s GFP exprimu .júcimi. transfekačné Činidlá. Expresia IRP-1 PH doménového substitučného mutantu R279/A takisto znižuje: chemotaxiu. Avšak expresia R279/A znižuje chemotaxiu oveľa účinnejšie ako expresia štandardnej IRP-1. Expresia IRP-1 PH domény takisto znižuje: chemotaxiu na ICAM-1 a VCAM-1. Tieto výsledky naznačujú, že: IRP-1 PH doména hrá úlohu pri IRP-1 sprostredkovanom znížení chemotaxie. Substitúcia E156/A v IRP-1 Sec7 doméne: takisto rezultuje v znížení chemotaxie, ale v menšom znížení ako v prípade: štandardnej IRP-1 nadexpresle. Nadexpresia IRP-1 Sec7 domény rezultuje: v zvýšenej chemotaxii na ICAM-1, ale v chemotaxii na VCAM-1 neboli pozorované: žiadne: zmeny. Tieto výsledky naznačujú, že: Sec7 doména môže: takisto prispieval k chemotaxii. Takže ako IRP-1 Sec7 doména, tak aj PH doména spôsobujú a οί,β;. dependentnú c h em o t a x i c k ú m i g r á e: i. u .

A k o b o 1 o u v e; d e: n é v y š š i e: i n h i b i č n ý ú č i n o k IRP—1 n a d e x p r e s i e: na chemotaxiu sa znížil substitúciami v Sec7 (E156/A) a PH (R279/A) doménach, čo naznačuje, že obidve: domény prispievajú spoločne; s adhéziou takisto k IRP-1 regulácii chemotaxie. Zvýšená chemotaxická migrácia JY-8 transfektantov, exprimujúcich IRP-1 R2.79/A, porovnaní so štandardom a takmer kompletná blokácia s expresiou IRP-1 PH domény naznačujú, že: PH domény hrajú hlavnú úlohu v chemotaxii. Takže: sa zdá, že interakcia medzi IRP-1 PH doménou a f osf atidyliriositolmi CHarlan a kol., Biochemietry, 34: 9859-9864 (1995), Pitcher a kol., J. Biol. Chem., 270:

11707-1171.0 (1995)1 alebo heterotrimérovými G proteínovými ďt podjednotkami CMahadeven a kol., Biochemietry, 34: 9111-917 (1995), Touhara a kol., J. Biol. Chem., 269: 10217-10220 (1994),

Pitcher kol

J. Biol. Chem., 270: 11707-11710 (1995)] sú rozhodujúce pre: úlohu IRP proteínov v chemotaxii..

Príklad 9

Distribúcia TRP proteínov v tkanive:-: sa stanovila pomocou monoklonálnych protilátok 200B preferenčrié rozpoznáva B2-1 a rozpoznáva IRP-1.

a 233(3. protilátka

Protilátka 200B 233G špecificky

Obidve klonálne protilátky sa použili v koncentrácii 10 ug/ml pre imunocytochemickú analýzu zmrazených· ľudských mandlí, sleziny a časti lymfatických uzlín. Diely s hrúbkou 6 mikrometrov sa položili na podložné sklíčka Superfrost Plus Slides (VWR) a uložili pri -70 °C. Pred použitím sa podložné sklíčka vybrali a umiestili na päť minút pri teplote 55 °C. Diely sa potom fixovali dva minúty v studenom 4% paraformaldehyde a potom 5 minút v studenom acetóne a vysušili sa. Časti sa blokovali 30 minút pri izbovej teplote v roztoku obsahujúcom IX BSA, 30X normálneho ľudského séra a 5X normálneo potkanieho séra. Protilátky 200B alebo 233G sa aplikovali na jednotlivé diely jednu hodinu pri izbovej teplote. Nenaviazaná protilátka sa odstránila trojnásobným obmytím podložných sklíčok v TBS pufri, pričom jedno obmytie trvalo päť minút. Potom sa na každú časť aplikovala potkaním-protlmyšacím-biotínom konjugovariá protilátka v rovnakom IBS pufri a diely sa inkubovali tridsať minút pri izbovej teplote. Na delegovanie ABC-elite (Vector Labs) sa použila druhá protilátka a aplikovala sa 30 minút pri izbovej teplote na každý diel. Aplikoval sa DAB substrát (Vector Labs) a farebný vývoj sa zastavil ponorením do vody. Farba sa zosilnila približne päť až desaťsekundovou aplikáciou IX kyseliny osmiovej. Zosilňovanie sa zastavilo umiestením podložných sklíčok do vody. Diely sa opačne dofarbili pred dehydratáciou v Hematoxylíne Gill's č. 2 a opláchli sa vo vode, okyslenom alkohole, uhličitane lítnom a spojili s Permountom (VWR). 200B a 233G zafarbenia sa detegovali v mandliach, slezine a lymfatických uzlinách, ale nie s kontrolnou IgGl protilátkou.

Obidve protilátky vykazovali veľmi silné označenie na mukozálnom epitele na mandliach. Zdá sa, že obidve látky označujú podsúbor zvrstveného šupinatého epitelu. Rozdielom medzi 200B a 233G väzbovosťou v mandliach je označenie zrejmé v prípade 233G vnútri sekundárnych vakov. Toto označenie nie je zrejmé v prípade 20CJB. V slezine sa javia obidve protilátky podobne, pokiaľ ide o ich väznosť, a označujú jednotlivé bunky v oblastiach červenej drene. V lymfatickej uzline bola väznosť pozorovaná na jednotlivých bunkách v hlbokej kôre v prípade 200B a v hlbokej kôre: a dreňovej kôre: v prípade: 233G. Vzor označenia, viditeľný v prípade 200B, bol značne bodkovaný. Tento vzor bol takisto zrejmý v prípade 233G, ale oveľa jemnejšie.

Príklad 10

PH domény sú prítomné vo viac; ako sedemdesiatich funkčne: diverzných proteínoch, zahrnujúcich kinázy a spojkové proteíny. Ako už bolo uvedené, PH domény poskytujú schopnosť viazať sa na G proteínové bt pod jednotky, PIP-. a PKG. SEC7 motív v IRP proteínoch sa takisto vyskytuje v ďalších proteínoch, nemajúcich homológiu okrem tohto motívu intramolekulárnych interakcií.

a .je; pravdepodobne nositeľom Okrem toho, kinezinová/myozínová aminová terminálna homológia IRP proteínov by mohla, ako sa dá predpokladať, prinášať interakciu s ďalšími proteínmi. Proteíny, ktoré vzájomne: reagujú s IRP proteínmi je: možné identifikovať rôznymi testmi, medzi ktoré patria aj nižšie: popísané testy.

Prvým testom, použitým v rámci vynálezu, je dvojhybridný screenovací test tuo-hybrid screen. Dvojhybridný systém bol vyvinutý v droždí CChien a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. (.USA), 88: 9578-9532 ¢1991)] a zakladá sa na funkčnej in vivo rekonštitúcil transkripčného faktora, ktorý aktivuje reportérový gén. Konkrétne sa polynukleotid, kódujúci proteín, ktorý vzájomne reaguje s IRP proteínmi, izoluje: transformáciou alebo transfekciou príslušných hostiteľských buniek pomocou DNA konštruktu obsahujúceho gén pri kontrole: promótora regulovaného transkripčným faktorom, majúcim DNA väzbovú doménu a aktivačnú doménu; exprimovaním prvej hybridnej sekvencie, kódujúcej prvú fúziu časti alebo všetkých IRP proteínov, a DNA väzbovej domény alebo aktivačnej domény transkripčného faktora v hostiteľských bunkách; exprimovaním knižnice druhých hybridných sekvencií kódujúcich druhé fúzie časti alebo všetkých pravdepodobných IRP proteínov viažúcich proteíny a DNA väzbovej domény alebo aktivačnej domény transkripčného faktora, ktoré sa nezabudovali pri prvej fúzii, v hostiteľských bunkách; detegovaním naviazanosti IRP interakčného proteínu na IRP proteíny v P r í s 1 u š n ej h o s t i t e; ľ s k e j b u n k e d e t e g o v a n í m p r o d u k c i e r ep o r t é r o v é h o génového produktu v hostiteľskej bunke; a izolovaním druhých hybridných DMA sekvencii, kódujúcich interakčný proteín, z príslušnej hostiteľskej bunky. V súčasnosti je výhodné v tomto teste použiť lexA promótor pre riadenú expresiu reportérového génu, lacZ reportérový gén, transkripčný faktor obsahujúci l&xA DNA väzbovú doménu a GAL4 transaktivačnú doménu a kvasnicové hostiteľské bunky.

Ďalšie testy navrhnuté na identifikáciu proteínov, ktoré vzájomne reagujú s IRP proteinmi, môžu byť z oblasti imobilizácie; IRP proteínov alebo testovanej domény, detegovatelného označenia neimobilizovaného väzbového partnera, vzájomného inkubovania väzbových partnerov a určenia množstva označených väzieb. Označené väzby naznačujú, že testovaný proteín vzájomne reaguje; s IPR proteinmi.

Ďalší typ testu na identifikáciu IRP interakčných proteínov zahrnuje; imobilizáciu IRP proteínu alebo ich fragmentu na pevnom nosiči, potiahnutom C alebo napustenom) fluorescenčným činidlom; označenie testovaného proteínu zlúčeninou schopnou excitovať fluorescenčné činidlo; uvedenie imobilizovaných IRP proteínov do kontaktu s označeným testovaným proteínom; detegovanie: svetelnej emisie; fluorescenčným činidlom; a identifikovanie: interakčných proteínov ako testovaných proteínov, čo má za následok emisiu svetla fluorescenčným činidlom. Alternatívne; je; možné imobilizovať predpokladaný interakčný proteín a IRP proteíny pre: tento test označiť.

Príklad 11

Modulátory IRP interakcii, ktoré sa používajú v rámci

E!

vynálezu, sú použiteľné pri znižovaní integrínovej, predovšetkým e.-, a/alebo e>₇ integrínovej, adhézie k celulárnym alebo extracelulárnym matričným ligandom, čo má za následok zníženie: funkcií spojených so začlenením integrínu, predovšetkým bunkového rastu, stimulácie a lokalizácie v zápalových procesoch. Konkrétne: je; možné očakávať, že: modulátory majú terapeutickú hodnotu pri liečení zápalových alebo autoimunitnýoh chorôb tým, že: znížia vtok buniek, napríklad neutrofilov, eozinofilov, lymfocytov, monocytov alebo NK buniek, do zápalového miesta a takisto znížia cytotoxioké aktivity buniek, ktoré sa už nachádzajú v tomto mieste. Modulátory môžu byť schopné ako znižovať integrínovo dependentnú adhéziu, tak tiež môžu antagonlzovať stimulačné a ko-stimulačné: aktivity integrínov. Modulátory IRP proteínov môžu mať určitú výhodu proti zlúčeninám, ktoré interferujú s integrínom viažúcini sa na extracelulárne Ugandy C to znamená blrjkačným protilátkam alebo extracelulárnym ligandovým antagonizujúcim činidlám), pretože začlenenie: integrínu môže: mať aktivačné: účinky a môže; byť prozápalové. Modulá tor y IRP vážnosti môžu priamo alebo nepriamo prerušiť Integrínové signalizačné dr áhy. Vzhľadom na to, že: sa nezdá, že nadexpresia karboxylovej terminálnej PH domény IRP proteínov viedla k špecifickému zníženiu bunkovej adhézie: integrínu, môže: byť špecifickosť funkciou amínových terminálnych sekvencií, ktoré: poskytujú kinezínové alebo SEC7 homolúgie. Takže: modulátory, ktoré sa naviažu na tieto amínové terminálne: sekvencie, môžu ovplyvniť celulárnu adhéziu integrínovo špecifickým spôsobom. Príklady testov navrhnutých na identifikáciu zlúčenín, ktoré modulujú interakciu IRP proteínov s ďalšími proteínmi, sú popísané nižšie.

Prvý test zahrnuje: transformovanie , alebo transfekcie vhodných hostiteľských buniek DNA konštruktom, obsahujúcim reportérový gén pod kontrolou promótora, regulovaného transkripčným faktorom, majúcim DNA’ väzbovú doménu a aktivačnú doménu; expresiu prvej hybridnej DNA sekvencie, kódujúcej prvú fúziu časti alebo celého IRP proteínu a DNA väzbovej domény, alebo aktivačnéj domény transkrípčného faktora, v hostiteľských bunkách; expresiu druhej hybridnej DNA sekvencie, kódujúcej druhú fúziu časti alebo celého IRP proteínu a DNA väzbovej domény, alebo aktivačnej domény transkripčného faktora, v hostiteľských bunkách, ktorá nie je zabudovaná v prvej fúzii; vyhodnotenie vplyvu testovanej zlúčeniny na interakciu medzi IRP proteínom a interakčným proteínom detegovaním väzby interakčného proteínu na IRP proteíny v príslušnej hostiteľskej bunke meraním produkcie reportérového génového produktu v hostiteľskej bunke v prítomnosti. testovanej zlúčeniny alebo pri jej absencii; a identifikovanie modulačných zlúčenín ako tých testovacích zlúčenín, ktoré spôsobujú zmenu produkcie reportérového génového produktu, v porovnaní s produkciou reportérového génového produktu v neprítomnosti modulačnej zlúčeniny. V tomto teste je možné výhodne použiť promótor na poháňanie expresie reportérového génu, la.cZ reportérový gén, transkripčný faktor, obsahujúci 7ex/l DNA väzbovú doménu a GAL4 transaktivačnú doménu a kvasinkové hostiteľské bunky.

Ďalší typ testu, používaný na identifikáciu zlúčenín, ktoré modulujú interakciu medzi IRP proteínmi a interakčným proteínom, zahrnuje im o bil i. z á clu IRP proteínov alebo prirodzeného IRP i n t e r a k č n é h o p r o t e í n u, d e t e g o v a t e I n é o z n a č e n i e n e im o b i 1 i z o v a n é h o väzbového partnera, spoločné inkubovanie väzbových partnerov a určenie vplyvu testovanej zlúčeniny na množstvo označených väzieb, pričom zníženie počtu označených väzieb v prítomnosti testovanej zlúčeniny oproti počtu označených väzieb v neprítomnosti testovanej zlúčeniny naznačuje, že testované činidlo je inhibítorom IRP interakcie s daným proteínom. Naopak zvýšenie počtu označených väzieb v prítomnosti testovanej zlúčeniny oproti počtu označených väzieb v neprítomnosti testovanej zlúčeniny naznačuje, že predpokladaný modulátor je aktivátorom IRP interakcie s daným proteínom.

Konkrétne sá IRP proteíny exprímova11 ako His-zakončené alebo His-kemptide-zakončené rekombinantné proteíny a čistili sa cez kov chelatujúce chromatografické živice z pETI15b-transformovaných E. coli lyzátov.

Dobre-; známym prostriedkom na rádioznačenie rekombinantných proteínov je zakončenie peptidu keptidovým zakončením. Keptidovým zakončením je polypeptidový fragment siedmich aminokyselín, ktorý obsahuje proteínkinázové A (PKA) fosforylačné miesto. Keptidovo zakončený rekombinantný proteín môže byt rádioaktívne označený na keptidovom konci pôsobením PKA EMobanraj a kol., Proteín Expr. Purif. 8(2): 175-182 (1996)3.

IRP proteíny (bez keptidového zakončenia) sa rádioaktívne označili pomocou voľného buď metódou lodobead (Pierce) alebo p o u ž i t im m o d i f i k o v a n e j 1 a l< t o p e r o x 1 d a z o / p e r o x i d v o d i k o v e „j metódy popísanej v Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harloui and Lane, Edltors, kapitola 9, str. 319-358 (1988). Rádioaktívne označené proteíny sa odsolili a skladovali vo väzbovom pufri, ktorým bol buď 20 ml*l HEPES alebo 20 mM fosfát sodný pH 7,5 pufer so 150 mM alebo 300 mM NaCl, prípadne s 0, 05% detergentom (NP--4Q alebo Tritonom-X-100) a 2 mM azidu ako konzervačného činidla. Konečná špecifická rádioaktivita sa pohybovala medzi 3 až 10 j_iCi C ¹ '^SI3 /nmol IRP.

integrínové cytoplazmidové koncové proteíny (C-koniec) sa exprimovali a čistili ako rekombinantné His3E9~zakončené proteíny z pETUSb-transformovaných E. coli alebo z transformovaného Saccharomyces sp., alebo sa získali, ako nezakončené, syntetické peptidové preparáty (Anaspec, Inc. Sa n Jose, CA, Macromolecular Resources, Fort Collincs, 00).

Integrínové

C-konce sa zmobilizovali na mikrotitračných platniach Scintistrip (Wallac) pri koncentráciách 1 až 100 ug/ml v objemoch 50 až 100 u3. uhľovodíka (pH 9,6) na jamku a inkubovali sa pri 4 °C cez noc. Platne séi sušili a blokovali. v 350 ul/jamku sterilné filtrovaného 1-2% albumínu bovinného séra (BSA), rozpusteného vo väzbovom testovacom pufri a inkubovali sa 3. až 2 hodiny pri izbovej teplote. Jamky sa trikrát premyli vo väzbovom testovacom pufri. a sušili bezprostredne pred pridaním IRP proteínov.

Väzbovým testovacím formátom bol buď konkurenčne inhibičný väzbový test alebo saturačný väzbový test. Pri konkurenčnom väzbovom teste sa rádioaktívne označené IRP proteíny nariedili na 25 až 100 nM vo väzbovom testovacom pufri jedným potenciálnym modulátorom vážnosti (neoznačené IRP proteíny, C-konce alebo nešpecifické kontrolné polypeptidy, napríklad BSA). Test sa inicioval pridaním 100 jfl roztoku označených IRP proteínov a potenciálneho modulátora do blokovaných jamiek Scintistrip (50 000 až 200 000 cpm/jamka), ktoré sa potom inkubovali jednu hodinu pri izbovej teplote (22 až 24 °C) a test sa potom zastavil, rýchlym troj- až päťnásobným, premytím vo väzbovom testovacom pufri. Saturačné väzbové testy sa uskutočnili podobne, s tou výnimkou, že sa použil konštantný 1:20 pomer rádioaktívne označených k neoznačeným IRP proteínom v celkovom koncentračnom rozmedzí O, 01 až 30 j_tM. Platne sa vysušili a scintilácia sa po kalibrovaní detektorov zmerala na kvapalnom scintilačnom čítači Wallac Model 1450. Interjamkový crosstalk bol korigovaný pri použití testovacej platne Scintistrip obsahujúcej v 011 100 jjl 25 nM radiačné značeného IRP Imobillzovaného až 100 monoklonálnou protilátkou 200A, nanesenou v hydrogenuhličitanovom puf rl. Inkubačné časy testované platne väzbového testu.

anti-IRP jamke: v 20 ug/rnl a podmienky pre: vyššie: popísaného sa identifikovali pomocou

VäzbovosĽ sa merala ako počet rádioaktívne označených IRP nachádzajúcich sa v C-koncom potiahnutých jamkách, presahujúci počet, nachádzajúci sa v BSA potiahnutých jamkách. Špecifická väznosť sa stanovila ako počet nachádzajúci sa v C-koncom potiahnutých jamkách, ktorý sa znížil pridanými neoznačenými IRP proteínml alebo rozpustenými C-koncami.

Konkurenčný väzbový test, používajúci jódovaný IRP-1, ukázal, že: potenciálne: modulátory IRP-1, IRP-1 Sec7 domény, B2-1, inhibovali naviazanie medzi jódovaným IRP-1 a imobilizovanými

C-koncami s H±s3E9-zakončenim. IRP-1, IRP-1 Sec7 doména, B2-1, ak sú prítomné koncentráciách D, 01 až 4 jjM, znižujú vážnosť jódovaného IRP-1 na C-koniec približne o 75 %. Pridanie:

kontrolného peptidu CBSA) neznižuje IRP-1 väznost k imobilizovariého C/koncu. Takže druhá kontrola, v ktorej sa na BSA blokované mikrotitrové platne neimobilizoval žiadny C-koniec, vykazovala len úrovne vážnosti rádioaktívne: označeného IRP-1 zodpovedajúce: pozadiu.

Väzbové testy je: možné modifikovať použitím IRP proteínov a C-koncov ďalších integrínov, napríklad vr átane a_:l, a . IRP proteíny alebo C-päty je možné označiť pomocou C-bórhydridu sodného, C^12SI]-Bolton-Kunterovho reakčného činidla,

C ^3SS1 -metabolického označenia, proteírikinázového C ^-’pj -označenia alebo ďalšou vhodnou rádioaktívne značiacou zosieťujúcou metódou. Proteíny a peptidy je: možné imobilizovať na mikrotitračných platniach C Nunc Covaklink, Pierce Reactibind, Costar Labcoat, atď.) alebo na telieskach (SPA alebo iných). Väzbové testy je: možné odborníkom v danom obore modifikovať nastavením inkubačných časov a modifikácií pufrovacích podmienok. Okrem toho môžu polypeptidy, použite?: v tomto teste, zahrnovať iné syntetic:ké peptidové fragmenty a je možné ich pripraviť rôznymi, v danej oblasti známymi, spôsobmi, vrátane expresie cDNA konštruktov, izolácie: z prirodzených zdrojov a chemickej syntéz. Stanovenie:

toho, či je testovaná zlúčenina modulátorom, sa uskutočňuje: pridaním testovanej zlúčeniny do väzbového testu. Ako už bolo diskutované vyššie, zvýšenie: alebo zníženie: vážnosti naznačuje, že: testovaná zlúčenina je modulátorom IRP proteínov.

Ďalšie; väzbové testy, ktoré sa zameriavajú na identifikáciu modulátorov IRP aktivity, zahrnujú testy, ktoré určujú väzbovosť IRP proteínov k väzbovému partnerovi (ARF faktory, fosfatidylinositoly alebo ďalšie: príbuzné zlúčeniny) . Pri týchto testoch sa TRP alebo jeho väzbový partner imobilizuje na mikrotitračných platniach alebo telieskach. Množstvo väzieb, detegovatelne označených IRP alebo väzbového partnera, sa určí pri vhodných podmienkach v prítomnosti a v neprítomnosti testovanej zlúčeniny. Modulátor IRP aktivity je: zlúčenina, ktorá znižuje alebo zvyšuje väzbovosť IRP k väzbovému partnerovi.

S cieľom stanovenia väzbovosti IRP k fosfatidylinositolu sa His-zakoričená IRP-1 PH doména C5'HA IRP-1 PH) zmobilizovala na mikrotitračnéj platni približne šestnásťhodinovou inkubáciou 100 jjI 20 ug/ml 5’HA IRP-1 PH v uhľovodíkovom pufri CpH 9, 6) pri teplote 4 °C. Mikrotitračné platňa sa potom dekantovala a približne jednu hodinu blokovala 1 až 2% ľudským IgG približne pri 22 °C. Tieto platne sa trikrát premyli v testovacom pufri C 25 j.iM NaCl, 0, 25% NP-40, 0, 1% deoxycholátu

DTT). Desať nanomolov mľl Tris pH 7, 4, 100 sodného, 3. m 1*1 NgCl_s, 0, 5% ³H-inositolfosfátov C IPn) CDu Pont hodín pri teplote 22 °C v 100 j.il.

umol studeného IPn. Mikrotitračné platne sa pridala sa scintilačná látka. Vážnosť sa naviazanej rádioaktivity v scintilačnom

NEN) sá pridalo počas dvoch testovacom pufri s 0 až 1.00 štyrikrát premyli, a stan ovila meraním počítači. Výsledky naznačili, že naviazanosť His-zakončenej IRP-1 PH domény na inositol (1, 3, 4, 5)P₄ a kontrol, n ý c h p r í k 1 a d o c h .

inositolfosfátmi je možné

ΙΡ_ώ bola desaťkrát vyššia ako pri. Modulátor väzbovosti medzi IRP a stanoviť pridaním testovanej zlúčeniny do tohoto testu a určením rozdielov vážnosti, v prítomnosti, a neprítomnosti testovanej zlúčeniny.

Ešte ďalší, spôsob podlá vynálezu na identifikáciu zlúčenín, ktoré modulujú väzby medzi IRP proteínmi a interakčným proteínom, zahrnuje imobilizáciu IRP proteínov alebo ich fragmentov na pevnom nosiči, potiahnutom (alebo napustenom) fluorescenčným činidlom; označenie interakčného proteínu zlúčeninou, schopnou fluorescenčné činidlá, uvedenie imobilizovaných IRP s označeným interakčným proteínom; emisie fluorescenčným činidlom; a identifikáciu modulujúcich zlúčenín ako tých testovaných zlúčenín, ktoré ovplyvňujú emisiu svetla fluorescenčným činidlom, svetla fluorescenčným činidlom v zlúčeniny. Alternatívne je možné imobilizovať predpokladaný IRP Interakčný proteín a IRP proteíny označiť.

excitovať proteínov detegovanie do kontaktu svetelnej emisiou testovanej v porovnaní n e p r í t om n o s t j.

Pre kombinátorické knižnice, peptidy a peptidové mimetiká, definované chemické entity, oligonukleotidy a knižnice prirodzene sa vyskytujúcich produktov je možné skúmať ich účinnosť ako modulátory v takých testoch, ktoré boli. popísané vyššie.

Príklad 12

Identifikácia modulátorov IRP interakcií sa uľahčí jasným definovaním časti proteínov, ktoré: sú nevyhnutné pre vážnosť. Ma identifikáciu väzbových oblastí proteínov sa môže použiť a m i n o k y s e 1 i n o v á s u b s t i t ú o i a u s k u t o č ň o v a n ti p r o s t r e d n í c t v om štandardných mutagenézovýoh techník. Analýza deléoie, pri ktorej sa generujú skrátené formy proteínov, napríklad PCR, sa môže takisto použiť na identifikáciu väzbových oblastí, ak delécia neroztrhne terciárnu alebo kvartérnu štruktúru proteínu do tej miery, že už nie je rozpoznaná svojim špecifickým receptorom.

Identifikácia pre väzbovosť významných proteínových oblastí umožní presnejšie a účinnejšie preskúmanie väzbovej aktivity predpokladaných modulátorov. Vynález takisto zahrnuje vysoko výkonný screenovací test na analyzovanie: schopnosti modulová ť interakcie e.-., ia₇, e>i a/alebo integrínov s IRP proteínmi a takisto schopnosti modulovať interakcie: IRP proteínov s ďalšími interakčnými proteínmi veľkých knižníc malých molekúl alebo peptidov a takisto protilátok imunošpeoifických pre: .jeden alebo obidvoch väzbových partnerov. Aj keď nie; sú dva tu popísané screenovacie, scintilačné proxiniitné testy C SPA) a imunosorpčné testy C ELISA) samé o sebe: HTS metódami, umožňujú určovať schopnosť modulovať väzbovosť pre: mnohé uvedené zlúčeniny. SPA a ELISA sú velmi vhodné pre tento identifikačný proces a je: možné ich identifikovať tak, aby umožňovali vysokovýkonné screenovať popísané testované zlúčeniny.

Na záver je potrebné uviesť, že vyššie: uvedené príkladné realizácie: majú len ilustratívny charakter a v žiadnom ohľade neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je: jednoznačne: vymedzený priloženými patentovými nárokmi.

Cl) Informácie pre SEQ ID č.= 1=

Cl) Vlastnosti sekvencie:

C A) Dlžka= 1700 bázických párov C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia? lineárna

Cii) Typ molekuly: DNA

Cix) Znaky:

C A) Názov/klúč: CDS C B) Oblasť: 283..1482

AGGGCGGTGÄ	GGACGACAGC	60
CCTACTGAAG	GGGCGGTTGG	120
CTGAGGAGGC	GGCGGTGGCT	180
ACGCGGATCC	AGGCCCGACT	240
CC ATG GAG Met Glu 1	GAC GGC Asp Gly	294

342

GTC

TAT

GAA

CCC

CCA

GAC

CTG

ACT

CCG

GAG

GAG

CGG

ATG

GAG

CTG

GAG

Val

Tyr

Glu

Pro

Pro

Asp

Leu

Thr

Pro

Glu

Glu

Arg

Met

Glu

Leu

Glu

5

10

15

20

AAC

ATC

CGG

CGG

CGG

AAG

CAG

GAG

CTG

CTG

GTG

GAG

ATT

CAG

CGC

CTG

Asn

íle

Arg Arg Arg

Lys

Gin

Glu

Leu

Leu

Val

Glu

íle

Gin

Arg

Leu

25

30

35

CGG

GAG

GAG

CTC

AGT

GAA

GCC

ATG

AGC

GAG

GTG

GAG

GGG

CTG

GAG

GCC

Arg

Glu

Glu

Leu

Ser

Glu

Ala

Met

Ser

Glu

Val

Glu

Gly

Leu

Glu

Ma

40

45

50

AAT

GAG

GGC

AGT

AAG ACC

TTG

CAA

CGG AAC

CGG

AAG

ATG

GCA

ATG

GGC

Asn

Glu

Gly

Ser

Lys

Thr

Leu

Gin

Arg Asn Arg Lys

Met

Ala

Met

Gly

55

60

65

AGG AAG

AAG

TTC

AAC

ATG

GAC

CCC

AAG AAG

GGG ATC

CAG

TTC

TTG

GTG

Arg Lys

Lys

Phe

Asn

Met

Asp

Pro

Lys Lys Gly íle

Gin

Phe

Leu

Val

390

438

486

534

GAG AAT GAA

CTG CTG CAG AAC

ACA CCC GAG GAG ATC GCC CGC TTC CTG

582

Glu 85

Asn

Glu

Leu

Leu Gin 90

Asn

Thr

Pro Glu

Glu 95

íle

Ala

Arg Phe

Leu 100

TAC

AAG

GGC

GAG

GGG CTG

AAC

AAG

ACA GCC

ATC

GGG

GAC

TAC CTG

GGG

630

Tyr

Lys

Gly

Glu

Gly Leu 105

Asn

Lys

Thr Ala 110

íle

Gly Asp

Tyr Leu 115

Gly

GAG

AGG

GAA

GAA

CTG AAC

CTG

GCA

GTG CTC

CAT

GCT

TTT

GTG GAT

CTG

678

Glu

Arg

Glu

Glu 120

Leu Asn

Leu

Ala

Val Leu 125

His

Ala

Phe

Val Asp 130

Leu

CAT

GAG

TTC

ACC

GAC CTC

AAT

CTG

GTG CAG

GCC

CTC

AGG

C?\G TTT

CTA

726

His

Glu

Phe 135

Thr

Asp Leu

Asn

Leu 140

Val Gin

Ala

Leu

Arg 145

Gin Phe

Leu

TGG

AGC

TTT

CGC

CTA CCC

GGA

GAG

GCC CAG

AAA

ATT

GAC

CGG ATG

ATG

774

Trp

Ser 150

Phe

Arg

Leu Pro

Gly 155

Glu

Ala Gin

Lys

íle 160

Asp Arg Met

Met

GAG

GCC

TTC

GCC

CAG CGA

TAC

TGC

CTG TGC

AAC

CCT

GGG

GTT TTC

CAG

822

Glu 165

Ala

Phe

Ala

Gin Arg 170

Tyr

Cys

Leu Cys

Asn 175

Pro

Gly

Val Phe

Gin 180

TCC

ACA

GAC

ACG

TGC TAT

GTG

CTG

TCC TTC

GCC

GTC

ATC

ATG CTC

AAC

870

Ser

Thr

Asp

Thr

Cys Tyr 185

Val

Leu

Ser Phe 190

Ala

Val

íle

Mét Leu 195

Asn

ACC

AGT

CTC

CAC

AAT CCC

AAT

GTC

CGG GAC

AAG

CCG

GGC

CTG GAG

CGC

918

Thr

Ser

Leu

His 200

Asn Pro

Asn

Val

Arg Asp Lys 205

Pro

Gly

Leu Glu 210

Arg

TTT

GTG

GCC

ATG

AAC CGG

GGC

ATC

AAC GAG

GGC

GGG

GAC

CTG CCT

GAG

966

Phe

Val

Ala 215

Met

Asn Arg

Gly

íle 220

Asn Glu

Gly Gly Asp 225

Leu Pro

Glu

GAG

CTG

CTC

AGG

AAC CTG

TAC

GAC

AGC ATC

CGA

AAT

GAG

CCC TTC

AAG

1014

Glu

Leu 230

Leu

Arg

Asn Leu

Tyr Asp 235

Ser íle

Arg

Asn 240

Glu

Pro Phe

Lys

ATT

CCT

GAG

GAT

GAC GGG

AAT

GAC

CTG ACC

CAC

ACC

TTC

TTC AAC

CCG

1062

íle 245

Pro

Glu

Asp Asp Gly 250

Asn

Asp

Leu Thr

His 255

Thr

Phe

Phe Asn

Pro 260

GAC

CGG

GAG

GGC TGG CTC

CTG

AAG

CTG GGG

GGC

CGG

GTG

AAG ACG

TGG

1110

Asp Arg

Glu

Gly Trp Leu 265

Leu

Lys

Leu Gly 270

Gly Arg

Val

Lys Thr 275

Trp

AAG CGG CGC TGG	TTT ATC	CTC ACA GAC AAC TGC CTC TAC TAC TTT GAG	1158
Lys	Arg Arg	Trp 280	Phe	íle	Leu Thr Asp 285	Asn	Cys	Leu Tyr Tyr 290	Phe Glu
TAC	ACC ACG	GAC	AAG	GAG	CCC CGA GGA'	ATC	ATC	CCC CTG GAG	AAT CTG	1206
Tyr	Thr Thr	Asp	Lys	Glu	Pro Arg Gly	íle	íle	Pro Leu Glu	Asn Leu
	295				300			305
AGC	ATC CGA	GAG	GTG	GAC	GAC CCC CGG	AAA	CCG	AAC TGC TTT	GAA CTT	1254
Ser	íle Arg	Glu	Val	Asp Asp Pro Arg	Lys	Pro	Asn Cys Phe	Glu Leu
	310.				315			320
TAC	ATC CCC	AAC	AAC	AAG	GGG CAG CTC	ATC	AAA	GCC TGC A7\A ACT GAG	1302
Tyr	íle Pro	Asn	Asn	Lys	Gly Gin Leu	íle	Lys	Ala Cys Lys	Thr Glu
325				330			335		340
GCG	GAC GGC	CGA	GTG	GTG	GAG GGA AAC	CAC	ATG	GTG TAC CGG	ATC TCG	1350
Ala	Asp Gly Arg	Val	Val	Glu Gly Asn	His	Met	Val Tyr Arg	íle Ser
			345			350			355
GCC	CCC ACG	CAG	GAG	GAG	AAG GAC GAG	TGG	ATC	AAG TCC ATC	CAG GCG	1398
Ala	Pro Thr	Gin	Glu	Glu	Lys Asp Glu	Trp	íle	Lys Ser íle	Gin Ala
		360			365			370
GCT	GTG AGT	GTG	GAC	CCC	TTC TAT GAG	ATG	CTG	GCA GCG AGA AAG AAG	1446
Ala	Val Ser	Val	Asp	Pro	Phe Tyr Glu	Met	Leu	Ala Ala Arg Lys Lys
	375				380			385
CGG	ATT TCA	GTC	AAG	AAG	AAG CAG GAG	CAG	CCC	TGA CCCCCTGCCC	1492
Arg	íle Ser	Val	Lys	Lys	Lys Gin Glu	Gin	Pro
	390				395

CCAACTCCAT TATTTATTAC GGAGCTGCCC CGCCTGGGTG GCCGGACCCC TGGGCCTTGG 1552

GGCTGTGGAT CCTGGTTCCC TGTTTGGAAA ATTCACCACC TCTAGCTCCT CACTGTTCTT 1612

TGTAATTAAC ACGCTGTTGG TAACTTTAGA GCACACTGGC GCCCGTTACT AGTGGATCCG 1672

AGCTCGGTAC CAAGCGTGGT CTCCCTAT 1700 (1) Informácie pre SEQ ID č.: 2:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 399 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológias lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 2;

5G

Met

Glu

Asp

Gly

Val

Tyr

Glu

Pro

Pro

Asp

Leu

Thr

Pro

Glu

Glu

Arg

1

5

10

15

Met

Glu

Leu

Glu

Asn

íle

Arg

Arg

Arg

Lys

Gin

Glu

Leu

Leu

Val

Glu

20

25

30

íle

Gin

Arg

Leu

Arg

Glu

Glu

Leu

Ser

Glu

Ala

Met

Ser

Glu

Val

Glu

35

40

45

Gly

Leu

Glu

Ala

Asn

Glu

Gly

Ser

Lys

Thr

Leu

Gin

Arg

Asn

Arg

Lys

50

55

60

Met

Ala

Met

Gly

Arg

Lys

Lys

Phe

Asn

Met

Asp

Pro

Lys

Lys

Gly

íle

65

70

75

80

Gin

Phe

Leu

Val

Glu

Asn

Glu

Leu

Leu

Gin

Asn

Thr

Pro

Glu

Glu

íle

85

90

95

Ala

Arg

Phe

Leu

Tyr

Lys

Gly

Glu

Gly

Leu

Asn

Lys

Thr

Ala

íle

Gly

100

105

110

Asp

Tyr

Leu

Gly

Glu

Arg

Glu

Glu

Leu

Asn

Leu

Ala

Val

Leu

His

Ala

115

120

125

Phe

Val

Asp

Leu

His

Glu

Phe

Thr

Asp

Leu

Asn

Leu

Val

Gin

Ala

Leu

130

135

140

Arg

Gin

Phe

Leu

Trp

Ser

Phe

Arg

Leu

Pro

Gly

Glu

Ala

Gin

Lys

íle

145

150

155

160

Asp

Arg

Met

Met

Glu

Ala

Phe

Ala

Gin

Arg

Tyr

Cys

Leu

Cys

Asn

Pro

165

170

175

Gly

Val

Phe

Gin

Ser

Thr

Asp

Thr

Cys

Tyr

Val

Leu

Ser

Phe

Ala

Val

180

185

190

íle

Met

Leu

Asn

Thr

Ser

Leu

His

Asn

Pro

Asn

Val

Arg

Asp

Lys

Pro

195

200

205

Gly

Leu

Glu

Arg

Phe

Val

Ala

Met

Asn

Arg

Gly

íle

Asn

Glu

dy

Gly

210

215

220

Asp

Leu

Pro

Glu

Glu

Leu

Leu

Arg

Asn

Leu

, Tyr

Asp

Ser

íle

Arg

Asn

225

230

235

240

Glu

Pro

Phe

Lys

íle

Pro

Glu

Asp

Asp

Gly

Asn

Asp

Leu

Thr

His

Thr

245

250

255

Phe

Phe

Asn

Pro

Asp

Arg

Glu

Gly

Trp

Leu

Leu

Lys

Leu

Gly

Gly

Arg

260

265

270

Val

Lys

Thr

Trp

Lys

Arg

Arg

Trp

Phe

íle

Leu

Thr

Asp

Asn

Cys

Leu

275

280

285

Tyr

Tyr

Phe

Glu

Tyr

Thr

Thr

Asp

Lys

Glu

Pro

Arg

Gly

íle

íle

Pro

290

295

300

Leu

Glu

Asn

Leu

Ser

íle

Arg

Glu

Val

Asp

Asp

Pro

Arg

Lys

Pro

Asn

305

310

315

320

Cys

Phe

Glu

Leu

Tyr

íle

Pro

Asn

Asn

Lys

Gly

Gin

Leu

íle

Lys

Ala

325

330

335

Cys

Lys

Thr

Glu

Ala

Asp

Gly

Arg

Val

Val

Glu

Gly

Asn

His

Met

Val

340

345

350

Tyr

Arg

íle

Ser

Ala

Pro

Thr

Gin

Glu

Glu

Lys

Asp

Glu

Τη?

íle

Lys

355

360

365

Ser

íle

Gin

Ala

Ala

Val

Ser

Val

Asp

Pro

Phe

Tyr

Glu

Met

Leu

Ala

370

375

380

Ala

Arg

Lys

Lys

Arg

íle

Ser

Val

Lys

Lys

Lys

Gin

Glu

Gin

Pro

385 390 395

Cl) Informácie: pre: SEQ ID č.: 3;

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 1260 bázických párov (B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DMA (ix) Znaky:

(A) Názov/klóč: CDS (B) Oblasť: 70..1254 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č. : 3:

CGGCCGCCAG TGTGCTCTAA AGCAGCAAGC GACAGGAGCA CGGGTCATCT TTTCCCCAGA 60

GGCGTCGGA ATG GAC CTG TGC CAC CCA GAG CCC GCG GAG CTG AGC AGC 108

Met Asp Leu Cys His Pro Glu Pro Ala Glu Leu Ser Ser

405 410

GGG GAG ACG GAA

GAG TTA

CAG AGG ATC AAG TGG CAC CGA AAG CAG CTC

156

Gly Glu Thr 415

Glu

Glu

Leu

Gin 420

Arg íle

Lys

Trp His 425

Arg

Lys

Gin

Leu

CTG GAG GAC

ATC

CAG

AAG

CTG

AAG GAT

GAG

ATT GCA

GAT

GTG

TTT

GCC

204

Leu Glu Asp

íle

Gin

Lys

Leu

Lys Asp

Glu

íle Ala

Asp

Val

Phe

Ala

430

435

440

445

CAA ATC GAC

TGC

TTC

GAG

AGT

GCG GAG

GAG

AGC CGG

ATG

GCC

CAG

AAG

252

Gin íle Asp

Cys

Phe

Glu

Ser

Ala Glu

Glu

Ser Arg

Met

Ala

Gin

Lys

450

455

460

GAG AAG GAG

CTG

TGT

ATT

GGG

CGC AAG

AAG

TTC AAC

ATG

GAC

CCC

GCC

300

Glu Lys Glu

Leu

Cys

íle

Gly Arg Lys

Lys

Phe Asn

Met

Asp Pro

Ala

465

470

475

AAG GGT ATC

CAG

TAT

TTC

ATT

GAG CAC

AAG

CTG CTG

TCC

CCT

GAC

GTC

348

Lys Gly íle

Gin

Tyr

Phe

íle

Glu His

Lys

Leu Leu

Ser

Pro

Asp

Val

480

485

490

CAG GAC ATT

GCA

CGG

TTC

CTG

TAT AAA

GGC

GAG GGC

CTC

AAC

AAG

ACA

396

Gin Asp íle

Ala

Arg

Phe

Leu

Tyr Lys

Gly

Glu Gly

Leu

Asn

Lys

Thr

495

500

505

GCC ATT GGT

ACC

TAC

CTG

GGG

GAG AGG

GAT

CCC ATC

AAC

CTG

CAG

GTC

444

Ala íle Gly

Thr

Tyr

Leu

Gly

Glu Arg Asp

Pro íle

Asn

Leu

Gin

Val

510

515

520

525

CTC CAG GCC

TTC

GTG

GAC

TGC

CAC GAG

TTC

GCC AAC

CTC

AAC

CTC

GTC

492

Leu Gin Ala

Phe

Val

Asp

Cys

His Glu

Phe

Ala Asn

Leu

Asn

Leu

Val

530

535

540

1

CAG GCC CTC

AGG

CAG

TTC

CTG

TGG AGC

TTC

CGG CTG

CCG

GGC

GAG

GCC

540

Gin Ala Leu

Arg

Gin

Phe

Leu

Trp Ser

Phe

Arg Leu

Pro

Gly

Glu

Ala

545

550

555

CAG AAG ATA

GAC

CGG

ATG

ATG

GAG GCC

TTT

GCC ACT

CGA

TAC

TGC

CTC

588

Gin Lys íle

Asp Arg

Met

Met

Glu Ala

Phe

Ala Thr

Arg

Tyr Cys

Leu

560

565

570

TGC AAC CCA

GGC

GTC

TTC

CAG

TCC ACA

GAC

ACC TGC

TAC

GTG TTG

TCC

636

Cys Asn Pro

Gly Val

Phe

Gin

Ser Thr

Asp

Thr Cys

Tyr

Val

Leu

Ser

575 580 585

TTC

TCC

ATC

ATC

ATG

CTC

AAC

ACC

AGC

CTC

CAC

AAT

CCC

AAC

GTC

CGG

684

Phe

Ser

íle

íle

Met

Leu

Asn

Thr

Ser

Leu

His

Asn

Pro

Asn

Val

Arg

590

595

600

605

GAC

AGG

CCG

CCT

TTT

GAG

CGC

TTT

GTG

TCC

ATG

AAC

CGC

GGC

ATC

AAC

732

Asp

Arg

Pro

Pro

Phe

Glu

Arg

Phe

Val

Ser

Met

Asn

Arg

Gly

íle

Asn

610

615

620

AAT

GGT

AGC

GAC

CTG

CCC

GAG

GAC

CAG

CTG

CGG

AAC

CTC

TTC

GAC

AGC

780

Asn

Gly

Ser

Asp

Leu

Pro

Glu

Asp

Gin

Leu

Arg

Asn

Leu

Phe

Asp

Ser

625

630

635

ATC

AAG

AGT

GAG

CCA

TTC

TCC

ATC

CCT

GAG

GAC

GAC

GGC

AAT

GAC

CTC

828

íle

Lys

Ser

Glu

Pro

Phe

Ser

íle

Pro

Glu

Asp Asp Gly

Asn

Asp

Leu

640

645

650

ACT

CAC

ACC

TTC

TTC

AAT

CCA

GAC

CGG

GAG

GGT

TGG

CTG

CTC

AAG

CTA

876

Thr

His

Thr

Phe

Phe

Asn

Pro

Asp Arg

Glu

Gly Trp

Leu

Leu

Lys

Leu

655

660

665

GGG

GGC

CGC

GTG

AAG

ACG

TGG

AAA CGG

CGC

TGG

TTC

ATC

CTG

ACC

GAC

924

Gly

Gly Arg

Val

Lys

Thr

Trp

Lys Arg Arg

Trp

Phe

íle

Leu

Thr

Asp

670

675

680

685

AAC

TGC

CTC

TAC

TAC

TTC

GAG

TTC

ACC

ACT

GAC

AAG

GAG

CCA

CGG

GGA

972

Asn

Cys

Leu

Tyr Tyr

Phe

Glu

Phe

Thr

Thr

Asp Lys

Glu

Pro

Arg

Gly

690

695

700

ATT

ATA

CCT

CTT

GAG

AAC

CTC

TCG

GTG

CAG

AAG

GTG

GAT

GAC

CCC

AAG

1020

íle

íle

Pro

Leu

Glu

Asn

Leu

Ser

Val

Gin

Lys

Val

Asp Asp

Pro

Lys

705

710

715

AAG

CCA

TTC

TGC

CTG

GAG

CTC

TAC

AAC

CCT

AGC

TGC

CGA

GGC

CAG

AAA

1068

Lys

Pro

Phe

Cys

Leu

Glu

Leu

Tyr

Asn

Pro

Ser

Cys Arg

Gly

Gin

Lys

720

725

730

ATC

AAG

GCC

TGC

AAG

ACC

GAT

GGC

GAC

GGC

AGG

GTG

GTG

GAG

GGC

AAG

1116

íle

Lys

Ala

Cys

Lys

Thr

Asp Gly Asp Gly Arg

Val

Val

Glu

Gly Lys

735

740

745

CAC

GAA

TCG

TAC

CGC

ATC

TCA

GCC

ACC

AGT GCC

GAG

GAA

CGT

GAC

CAG

1164

His

Glu

Ser

Tyr Arg

íle

Ser

Ala

Thr

Ser Ala

Glu

Glu

Arg Asp

Gin

750

755

760

765

TGG

ATC

GAG

TCC ATC

CGA

GCC

AGC

ATC

ACC

CGT

GTC

CCC

TTC

TAC

: GAC

1212

Trp

íle

Glu

Ser

íle

Arg

Ala

Ser

íle

Thr

Arg

Val

Pro

Phe Tyr Asp

770

775

780

SO

CTG GTC TCT ACT CGG AAG AAG AAG ATT GCC AGC AAG CAG TGA Leu Val Ser Thr Arg Lys Lys Lys íle Ala Ser Lys Gin

785 790

GATTCC

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 4:

C i) Vlastnosti sekvencie:

C A) Dĺžka: 394 aminokyselín C B) Typ: aminokyselina CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: proteín

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 4:

1254

1260

Met

Asp

Leu

Cys

His

Pro

Glu

Pro

Ala

Glu

Leu

Ser

Ser

dy

Glu

Thr

1

5

10

15

Glu

Glu

Leu

Gin

Arg

íle

Lys

Trp

His

Arg

Lys

Gin

Leu

Leu

Glu

Asp

20

25

30

íle

Gin

Lys

Leu

Lys

Asp

Glu

íle

Ala

Asp

Val

Phe

Ala

Gin

íle

Asp

35

40

45

Cys

Phe

Glu

Ser

Ala

Glu

Glu

Ser

Arg

Met

Ala

Gin

Lys

Glu

Lys

Glu

50

55

60

Leu

Cys

íle

Gly

Arg

Lys

Lys

Phe

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Lys

Gly

íle

65

70

75

80

Gin

Tyr

Phe

íle

Glu

His

Lys

Leu

Leu

Ser

Pro

Asp

Val

Gin

Asp

íle

85

90

95

Ala

Arg

Phe

Leu

Tyr

Lys

Gly

Glu

Gly

Leu

Asn

Lys

Thr

Ala

íle

Gly

100

105

110

Thr

Tyr

Leu

Gly

Glu

Arg

Asp

Pro

íle

Asn

Leu

Gin

Val

Leu

Gin

Ala

115

120

125

Phe

Val

Asp

Cys

His

Glu

Phe

Ala

Asn

Leu

Asn

Leu

Val

Gin

Ala

Leu

130

135

140

Arg Gin Phe Leu Trp Ser Phe Arg Leu Pro Gly Glu Ala Gin Lys íle 145 150 155 160

Asp Arg Met Met Glu Ala Phe Ala	Thr Arg Tyr Cys Leu Cys Asn Pro
	165	170	175
Gly Val Phe	Gin Ser Thr Asp Thr	Cys Tyr Val Leu	Ser Phe Ser íle
	180	185	190
íle Met Leu	Asn Thr Ser Leu His	Asn Pro Asn Val	Arg Asp Arg Pro
195	200		205
Pro Phe Glu	Arg Phe Val Ser Met	Asn Arg Gly íle	Asn Asn Gly Ser
210	215	220
Asp Leu Pro	Glu Asp Gin Leu Arg	Asn Leu Phe Asp	Ser íle Lys Ser
225	230	235	240
Glu Pro Phe	Ser íle Pro Glu Asp Asp Gly Asn Asp	Leu Thr His Thr
	245	250	255
Phe Phe Asn	Pro Asp Arg Glu Gly Trp Leu Leu Lys	Leu Gly Gly Arg
	260	265	270
Val Lys Thr	Trp Lys Arg Arg Trp Phe íle Leu Thr	Asp Asn Cys Leu
275	280		285
Tyr Tyr Phe Glu Phe Thr Thr Asp Lys Glu Pro Arg Gly íle íle Pro
290	295	300
Leu Glu Asn	Leu Ser Val Gin Lys	Val Asp Asp Pro Lys Lys Pro Phe
305	310	315	320
Cys Leu Glu	Leu Tyr Asn Pro Ser	Cys Arg Gly Gin Lys íle Lys Ala
	325	330	335
Cys Lys Thr	Asp Gly Asp Gly Arg	Val Val Glu Gly Lys His Glu Ser
	340	345	350
Tyr Arg íle	Ser Ala Thr Ser Ala	Glu Glu Arg Asp Gin Trp íle Glu
355	360		365
Ser íle Arg	Ala Ser íle Thr Arg	Val Pro Phe Tyr Asp Leu Val Ser
370	375	380
Thr Arg Lys Lys Lys íle Ala Ser	Lys Gin

385 390 (1) Informácie pre SEQ ID č.: 5;

či) Vlastnosti sekvencie:

č A) Dĺžka: 29 bázických párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: DMA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 5:

ATATACGCGT ACCTTCTTCA ACCCGGACC 29

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 6:

C i) Vlastnosti sekvencie:

C A) Dĺžka: 29 bázických párov C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna Cii) Typ molekuly: DNA

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 6:

ATATGTCGAC TCAGGGCTGC TCCTGCTTC 29

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 7:

C i) Vlastnosti sekvencie:

C A) Dĺžka: 28 bázických párov

CB) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna Cii) Typ molekuly: DNA

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 7:

ATATCATATG GAGGAGGACG ACAGCTAC 28

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 8:

C i) Vlastnosti sekvencie:

C A) DÍžka: 29 bázických párov

CB) Typ: nukleová kyselina ¹ CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: DNA

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 8:

ATATCTCGAG TCAGTGTCGC TTCGTGGAG 29

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 9i (i) Vlastnosti sekvencie:

C A) DÍžka: 71 bázických párov

CB) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov·. jeden

CD) Topológia: lineárna Cii) Typ molekuly: DNA

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 9:

ATATGCTAGC CACCATGGGG TACCCATACG ATGTTCCTGA CTATGCGACG CGTATGGAGG 60

AGGACGACAG C 71

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 10 x

C i) Vlastnosti, sekvencie:

C A) Dĺžka: 68 bázických párov C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna Cii) Typ molekuly: DNA

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 10:

ATATGTCGAC TCACGCATAG TACAGGAACA TCGTATGGGT ACATACGCGT GTGTCGCTTC 60

GTGGAGGA 68

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 11:

C i) Vlastnosti sekvencie:

C A) DÍžka: 20 bázických párov C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna Cii) Typ molekuly: DNA

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.·. 11:

TAATACGACT CACTATAGGG 20

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 12:

I

C i) Vlastnosti sekvencie:

C A) DÍžka: 30 bázických párov C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna Cii) Typ molekuly: DNA

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č. x 12:

ATATACGCGT ACTTTCTTCA ATCCAGACCG

4

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 13:

C i) Vlastnosti sekvencie:

C A) DÍžka: 29 bázických párov C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna Cii) Typ molekuly: DNA

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 13:

ATATTCTAGA TCAGTGTCGC TTCGTGGAG 29

Cl) Informácie pre SEQ ID č.; 14:

C i) Vlastnosti sekvencie:

C A) Dĺžka: 29 bázických párov C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna Cii) Typ molekuly: DNA

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 14:

ATATACGCGT ATGGAGGACG GCGTCTATG 29

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 15:

C i) Vlastnosti sekvencie:

C A) Dĺžka: 33 bázických párov C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna Cii) Typ molekuly: DNA

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 15:

ATATGAATTC CACCATGGAC CTGTGCCACC CAG 33

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 18:

I

C i) Vlastnosti sekvencie:

C A) Dĺžka: 29 bázických párov C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna Cii) Typ molekuly: DNA

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 16:

ATATGTCGAC TCACTGCTTG CTGGCAATC

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 1.7:

(i ) Via s t n o s 11. s e k v e n c 1. e:

C A) Dĺžka: 28 bázických párov (B) Typ: nukleová kyselina ( C ) P o č e t r e ť. a z c o v : jeden ( D ) T o p o 1 ó gla: I. i n e á r n a (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č.» 17:

ATATACGCGT ACCTTCTTCA ATCCAGAC (1) Informácie pre SEQ ID č.: 18» (i ) V1 a s t n o s t i s e k v e n c i e ·.

(A) Dĺžka: 29 bázických párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet, reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ TD č.: 18:

ATATGTCGAC TCACTGCTTG CTGGCAATC (1) Informácie pre SEQ T.D č.: 19» (!) Vlastnosti, sekvencie:

(A) Dĺžka: 29 bázických párov (B) Typ: nukleová kyselina ( C ) Po č e t r e ť. a z c o v: jeden ( D ) T o p o 1. ó g i a : 1 i n e á r n a (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 19:

ATATACGCGT ATGGACCTGT GCCACCCAG (1) Informácie pre SEQ ID č.: 20:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 30 bázických párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet, reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia nukleová kyselina (A) Popis: /pop. - primár (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 20:

ATATCTCGAG CTATGGAGGA CGGCGTCTAT (1) Informácie pre SED ID č.: 2Ís (i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka: 37 bázických párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primér (xi) Popis sekvencie·. SED ID č.: 21:

ATATAAGCTT GCGGCCGCTC AGGGCTGCTC CTGCTTC 37 (1) Informácie pre SED ID č.: 22:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 33 bázických párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primér (xi) Popis sekvencie: SED ID č.: 22:

ATATCTCGAG CTATGGAGGA GGACGACAGC TAC 33 (1) Informácie pre SED ID č.: 23:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka: 38 bázických párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primér (xi) Popis sekvencie: SED ID č.: 23:

ATATAAGCTT GCGGCCGCTC AGTGTCGCTT CGTGGAGG 38 (1) Informácie pre SED ID č.: 24:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 31 bázických párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia nukleová kyselina

C A) Popis s /pop. = primár (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 24:

ATATCTCGAG CTATGGACCT GTGCCACCCA G 31 (1) Informácie pre SEQ ID č.: 2b:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 40 bázických párov (B) Typ-· nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primár (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 25:

ATATAAGCTT. GCGGCCGCTC ACTGCTTGCT GGCAATCTTC 40 (1) Informácie pre SEQ ID č.: 26:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 33 bázických párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazoov: j eden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primár (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 26:

ATATCTCGAG CTATGAGCGA GGTGGAGGGG CTG 33 (1) Informácie pre SEQ ID č.: 27:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 39 bázických párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet reťazcov: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: ďalšia nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primár (xi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 27:

ATATAAGCTT GCGGCCGCTC AGAAGGTGTG GGTCAGGTC

G 8 ¢1) Informácie pre SEQ ID č.s 28=

C i) Vlastnosti sekvencie:

C A) DÍžka: 31 bázických párov C B) Typ= nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: ďalšia nukleová kyselina C A) Popis: /pop. = primér

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 28:

ATATCTCGAG CTATGACCTT CTTCAACCCG G 31

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 29:

C i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka: 33 bázických párov C B) Typ: nukleová kyselina

CC) P o č e t r e ť a z o o v: jeden

CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: ďalšia nukleová kyselina C A) Popis: /pop. - primér

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 29=

GTCAATTTTC TGGGCCGCTC CGGGTAGGCG AAA 33

Cl) Informácie pre SEQ ID č.: 30:

C i) Vlastnosti sekvencie:

C A) DÍžka: 34 bázických párov C B) Typ: nukleová kyselina

CC) Počet reťazcov: jeden

CD) Topológia: lineárna

Cii) Typ molekuly: ďalšia nukleová kyselina C A) Popis: /pop. = primér

Cxi) Popis sekvencie: SEQ ID č.: 30:

TGTGAGGATA AACCAGGCCC GCTTCCACGT CTTC

Claims (27)

1. PATENT Q V É N Á R Q K Y

   1. Vyčistený a izolovaný polynukleotid kódujúci ľudskú IRP-1 aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená pod SEQ ID č.: 2,
2. 2. Vyčistený a izolovaný polynukleotid kódujúci ľudskú IRP-2 aminokyselinovú sekvenciu, ktorá ,je uvedená pod SEQ ID č.= 4.
3. 3, Polynukleotid podľa nároku 1 alebo 2, vyzná č u j ú c i s a tým, že je molekulou DNA,
4. 4, DNA podlá nároku 3, v y z n a č u j ú c a sa t ý m, že sa zvolí zo skupín zahrnujúcich cDNA, genómovú DNA, čiastočne syntetizovanú DNA a úplne syntetizovanú DNA,

   b. DNA molekula obsahujúca ľudským IRP- 1 p o 1 y p e p t i d o m kódujúcu oblastnú sekvenciu, ktorá je uvedená pod SEQ ID č,? 1. b. DNA molekula obsahujúca ľudským IRP- 2 polypeptidom kódujúcu oblastnú sekvenciu, ktorá je uvedená pod SEQ ID č,? 3. 7, DNA molekula kódujúca IRP polypeptid, kde ^; výber je možný

   zo skupiny zahrnu júce j a) ľudskú IRP-1 DNA uvedené pod SEQ ID č._? 1;

   h) ľudskú IRP-2 DNA uvedené pod SEQ ID č.= 3;

   c) DNA molekulu, ktorá hybridizuje pri veľmi prísnych podmienkach na nekódujúci reťazec proteínovej kódujúcej časti ľudskej IRP-1 DNA, uvedenej pod SEQ ID č.? 1; a d? DNA molekulu, ktorá hybridizuje pri veľmi prísnych podmienkach na nekódujúci reťazec proteínovej kódujúcej časti ľudskej IRP-2 DNA, uvedenej pod SEQ ID č, 3,
5. 8, DNA expresný končtrukt obsahujúci DNA podlá nároku 1, 2 alebo 7,
6. 9, Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfskovaná DNA podľa nároku 1, 2 alebo 7.
7. 10. Spôsob prípravy IRP polypeptidu, vyznač u j ú c i sa tým, že zahrnuje rast hostiteľskej bunky podía nároku 9 vo vhodnom prostredí a Izoláciu IRP polypeptidu z hostiteľskej bunky alebo z jej rastového prostredia.
8. 11. Vyčistený a izolovaný polypeptid obsahujúci IRP-1 aminokyselinovú sekvenciu uvedenú pod SEQ ID č.: 2.
9. 12. Vyčistený a izolovaný polypeptid obsahujúci IRP-2 aminokyselinovú sekvenciu uvedenú pod SEQ ID č.: 4.
10. 13. Protilátka, ktorá špecificky viaže IRP-1.
11. 14. Protilátka, ktorá špecificky viaže IRP-2.
12. 15. Protilátka podía nároku 13 alebo 14, vyznač u j ú c a sa t ý m, že je monoklonálnou protilátkou.

    1(5. Antiidlotypická protilátka, ktorá Špecificky viaže monoklonálnu protilátku podľa nároku 13 alebo 14.
13. 17. Hybridómová bunková línia produkujúca monoklonálnu protilátku podľa nároku '13 alebo 14.
14. 18. Hybridómová bunková línia 200A (ATCC HB-12331).
15. 19. ľlonoklonálna protilátka produkovaná hybridúmovou bunkovou líniou podľa nároku 18.
16. 20. Hybridómová bunková línia 200B (ATCC HB-12332).
17. 21. Monoklonálna protilátka produkovaná hybridúmovou bunkovou líniou podľa nároku 20.
18. 22. Hybridómová bunková línia 2330 (ATCC HB-12333).
19. 23. Monoklonálria protilátka produkovaná hybridómovou bunkovou líniou podlá nároku 22.
20. 24. Spôsob identifikácie zlúčeniny, ktorá moduluje väzbovosť medzi IRP-1 a e integrínovou podjednotkou, v y z n a č u j ú o i sa t ý τη, že zahrnuje:

    a) uvedenie IRP-1 alebo jeho fragmentu do kontaktu s β integrínovou podjednotkou alebo jej fragmentom;

    b) meranie väzbovosti medzi IRP-1 alebo jeho fragmentom a β integrínovou podjednotkou alebo jej fragmentom;

    c) meranie väzbovosti medzi IRP-1 alebo jeho fragmentom a β integrínovou podjednotkou alebo jej fragmentom v prítomnosti testovanej zlúčeniny a

    d) porovnanie merania z kroku (b) a merania z kroku (c), pričom zníženie vážnosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná zlúčenina je inhibítorom väzbovosti a zvýšenie väzbovosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná zlúčenina je aktivátorom väzbovosti.
21. 25. Spôsob identifikácie zlúčeniny, ktorá moduluje väzbovosť medzi IRP-2 a β integrínovou podjednotkou, v y z n a č u j ú e 1 s a tým, že zahrnuje:

    a) uvedenie IRP-2 alebo jeho fragmentu do kontaktu s β integrínovou podjednotkou alebo jej fragmentom;

    b) meranie väzbovosti medzi IRP-2 alebo jeho fragmentom a β integrínovou podjednotkou alebo jej fragmentom;

    c) meranie väzbovosti medzi IRP-2 alebo jeho fragmentom a β integrínovou podjednotkou alebo jej fragmentom v prítomnosti testovanej zlúčeniny a

    d) porovnanie merania z kroku (b) a merania z kroku (c), pričom zníženie vážnosti v kroku Cc) naznačuje, že testovaná zlúčenina je inhibítorom väzbovosti a zvýšenie väzbovosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná zlúčenina je aktivátorom väzbovosti.
22. 26. Spôsob identifikácie zlúčeniny, ktorá modifikuje

    Ί2 väzbovost medzi IRP-1 a ADP ribozylačným faktorom (ARF), v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že zahrnuje:

    a) uvedenie IRP-1 alebo jeho fragmentu do kontaktu s ARF alebo jeho fragmentom;

    b) meranie väzbovosti medzi IRP-1 alebo jeho fragmentom a ARF alebo jeho fragmentom;

    c) meranie väzbovosti medzi IRP-1 alebo jeho fragmentom a ARF alebo jeho fragmentom v prítomnosti testovanej zlúčeniny a

    d) porovnanie merania z kroku (b) a merania z kroku (c), pričom zníženie vážnosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná zlúčenina je inhibítorom väzbovosti či zvýšenie väzbovosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná zlúčenína je aktlvátorom väzbovosti.
23. 27. Spôsob identifikácie zlúčeniny, ktorá modifikuje väzbovost medzi IRP-2 a ADP ribozylačným faktorom (ARF), v y z n a č u j ú o i s a t ý m, že zahrnuje:

    a) uvedenie IRP-2 alebo jeho fragmentu do kontaktu s ARF alebo jeho fragmentom;

    b) meranie väzbovosti medzi IRP—2 alebo jeho fragmentom a ARF alebo jeho fragmentom;

    c) meranie väzbovosti medzi IRP-2 alebo jeho fragmentom a ARF alebo jeho fragmentom v prítomnosti testovanej zlúčeniny a

    d) porovnanie merania z kroku (b) a merania z kroku (c), pričom zníženie vážnosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná zlúčenina je Inhibítorom väzbovosti a zvýšenie väzbovosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná zlúčenina je aktlvátorom väzbovosti.
24. 28. Spôsob identifikácie zlúčeniny, ktorá modifikuje väzbovost medzi IRP-1 a fosfatidylinositolom (PI), v y z n a č uj ú c i sa tým, že zahrnuje:

    a) uvedenie IRP-1 alebo jeho fragmentu do kontaktu s PI;

    b) meranie väzbovostí medzi IRP-1 alebo jeho fragmentom a PI;

    o) meranie väzbovostí medzi IRP-1. alebo jeho fragmentom a PI v prítomnosti testovanej zlúčeniny a

    d) porovnanie merania z kroku (b) a merania z kroku (c), pričom zníženie vážnosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná zlúčenina je inhibítorom väzbovostí a zvýšenie väzbovostí v kroku (c) naznačuje, že testovaná zlúčenina je aktlvátorom väzbovostí.
25. 29. Spôsob identifikácie zlúčeniny, ktorá modifikuje väzbovost medzi IRP-2 a fosfatidylinositolom (PI), v y z n a č uj ú c i sa t ý m, že zahrnuje:

    a) uvedenie IRP-2 alebo jeho fragmentu do kontaktu s PI;

    b) meranie väzbovostí medzi IRP-2 alebo jeho fragmentom a PI;

    c) meranie väzbovostí medzi IRP-2 alebo .jeho fragmentom a PI v prítomnosti testovanej zlúčeniny a

    d) porovnanie merania z kroku C b) a merania z kroku (c), pričom zníženie väzriosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná zlúčenina je inhibítorom väzbovostí a zvýšenie väzbovostí v kroku (c) naznačuje, že testovaná zlúčenina je aktlvátorom väzbovostí.
26. 30. Spôsob izolovania polynukleotidu kódujúceho proteín, ktorý sa viaže na IRP-1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že zahrnuje:

    a) transformáclu alebo transfekciu vhodných hostiteľských buniek DNA konštruktom, obsahujúcim reportérový gén pod kontrolou promótora regulovaného transkripčným faktorom, majúcim DNA väzbovú doménu a aktivačnú doménu;

    b) exprimovanie prvej hybridnej DNA sekvencie kódujúcej prvú fúziu časti alebo celého IRP-1 proteínu a DNA kódujúcej domény alebo aktivačnej domény uvedeného transkripčného faktora v hostiteľských bunkách;

    c) exprimovanie knižnice druhých hybridných sekvencií kódujúcich druhé fúzie časti alebo celého pravdepodobného IRP-1 proteínu viažúcich proteíny a DNA väzbovej domény alebo aktivačnej domény transkripčného faktora, ktoré sa nezabudovali pri prvej fúzii v hostiteľských bunkách;

    d) detegovanie naviazanosti IRP-1 vlažúceho proteínu na IRP-1 v príslušnej hostiteľskej bunke delegovaním produkcie reportérového génového produktu v hostiteľskej bunke; a

    e) izolovanie druhých hybridných DNA sekvencií kódujúcich IRP-1 vlažúci proteín z príslušnej hostiteľskej bunky.
27. 31. Spôsob izolovania polynukleotldu kódujúceho proteín, ktorý sa viaže na IRP-2, vyznačuj ú c i s a tým, že zahrnuje:

    a) transformáciu alebo transfekoíu vhodných hostiteľských buniek DNA konštruktom, obsahujúcim reportérový gén pod kontrolou promótora regulovaného transkripčným faktorom, majúcim DNA väzbovú doménu a aktivačnú doménu;

    b) exprimovanie prvej hybridnej DNA sekvencie kódujúcej prvú fúziu časti alebo celého IRP-2 proteínu a DNA kódujúcej domény alebo aktivačnej domény uvedeného transkripčného faktora v hostiteľských bunkách;

    c) exprimovanie knižnice druhých hybridných sekvencií kódujúcich druhé fúzie časti alebo celého pravdepodobného IRP-1 proteínu viažúcich proteíny a DNA väzbovej domény alebo aktivačnej domény transkripčného faktora, ktoré sa nezabudovali pri. prvej fúzii v hostiteľských bunkách;

    d) detegovanie naviazanosti IRP-2 vlažúceho proteínu na

    IRP-2 v príslušnej hostiteľskej bunke detegovaním produkcie reportérového génového produktu v hostiteľskej bunke; a

    e) izolovanie druhých hybridných DNA sekvencií kódujúcich IRP-2 viažúci proteín z príslušnej hostiteľskej bunky.