SK15942003A3 - Farmaceutická kompozícia s obsahom oxidu uhoľnatého zlepšujúca prežívanie alebo funkciu orgánov po transplantácii - Google Patents

Description

Farmaceutická kompozícia s obsahom oxidu uhoľnatého zlepšujúca prežívanie alebo funkciu orgánov po transplantácii

Tento vynález sa vytvoril s podporou Národných zdravotných ústavov (NIH) USA, a síce crantu č. HL 58688. Vláda má preto určité práva k romuto vynálezu.

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka oblasti zlepšovania prežívania buniek, konkrétne prežívania orgánov pri transplantácii.

Doterajší stav techniky

Oxid uhoľnatý (CO) je plyn, ktorý je vo vysokých koncentráciách jedovatý. Avšak nedávno sa objavila jeho funkcia ako dôležitej signalizačnej molekuly (Verma a kol., Science 259: 381-384, 1993). Tiež sa predpokladá, že oxid uhoľnatý pôsobí ako neurónová signálna molekula (posol) v mozgu a tiež ako neuroendokrinný modulátor v hypcoalame (Pozzoli a kol., Endocrinology 735: 2314-2317, 1994). Podobne ako napríklad oxid dusnatý (NO)' je aj oxid uhoľnatý relaxans hladkého svalstva (Uczet a kol., Biochem Pharmacol. 47: 195-201, 1991, Christodoulides a kol., Circulation 97: 2306-9, 1995) a inhibuje agregáciu doštičiek (Mansouri a kol., Thromb Haemost. 48: 286-8, 1982). Ukázalo sa, že inhalácie nízkych hladín CO majú protizápalové účinky u niektorých modelov.

Transplantácia buniek (Langerhansových) ostrovčekov je vhodná liečba na zlepšenie stavu pri ciabete typu I (Lacy a kol., Annu. Rev. Immunol., 2: 183-98, 1984, Weir a kol., J. Am. Optom. Assoc. 69: 727-32, 2000, Berney a kol., Langenbechs Árch. Surg. 385: 378-8, 2000, Shapiro a kol., N Engl. J. Med., 343: 230-8, 2000). Avšak, postupy klinickej transplantácie ostrovčekov sú obtiažne vzhľadom na mnohé faktory. Jedným z faktorov je primár2 nerunkčnosť (PNE) štepu. Ďalším faktorom je potreba vysokého počtu darcovských ostrovčekov, ktoré sú potreone na úspešné prekonanie diabetu 'Shapiro a kol., N Engl. J. Med., 343: 230-8, 2000). Obidve situácie reflektujú rovnakú patcfyzicióciu: ροαstatná strata buniek štepu v prvých týždňoch po transplantácii. Po transplantácii ostrovčekov trpia celým radom stresových faktorov, akc je napríklad hypoxia predtým, ako dôjde k sekunfl c ľ n e ’

9 9 6) vaskuiarizácii ÍCarlsson a kol., Drabetes 4/: 1027-32, :scoen iu pro-zápalových cytokínc rez volných radikálov uvoľňovaných z makrofágov v mikroprostredí transplantátu (Rabmovitch a kol. a kol., O Exp Med. 772:

Diabetes 48: 1223-9, 1999, Kaufman

291-302, 1990, Coroett a kol., Proc.

hati. Ac

Sci OSA 90: 1731-5, 1993) a makrofágov usadených v ostrovčekocn (Mandrup-Poulsen

4077-62, 198/,

1998) . Tcxrcré (Weir a kel., / n u o n a kol.,

3 9:

016-2 6 a kol., J. Immur.c C11n I n v e s c . 7 02:

účinky imunosupresívnych liekov a tiež rejekcie Diabetes 46: 1247-56, 1997) prispievajú tiež k strate ouniek z ostrovčekov. Existencia PNF po experimentálne: syngénnej transplantácii ostrovčekov (Nagata a kol., Transpiant Proc. 22: 855-6, 1990, Arita a kol., Transplantatrón 65:

1429-33, 1998) ukazuje, že nešpecifický zápal zohráva hlavnú úlohu v tomto scenári.

Rozumie sa, že prežitie transplantovaného orgánu je hlavne závislé od úspechu imunosupresie, v zmysle zablokovania imunitnej reakcie, ktorá vedie k rejekcii štepu. Avšax, už skôr sa ukázalo, že transplantcvané orgány sa môžu chrániť pred vaskulárnym poškodením vedúcim k rejekcii prostredníctvom, expresie protektívnych génov (pozri napr. Bach a kol., Náture Med. 3: 196-202, 1997, and Soares a kol., Náture Med. 4: 1073-1077,

998) . Jeden taký gén, hemoxygenáza-1 (HO-1) , premieňa hém na biiiverdín, voľné železo a CO (Tenhunen a kol., Proc. Natl Acad Sci USA 61: 743-755 , 1 968) .

Podstata vynálezu

Predložený vynález je zčasti založený na pozorovaní, že CC podporuje prežívanie a/alebo funkcie individuálnych transplantátov (šcepov), či sú to orgány, tkanivá alebo bunky.

V súlade s tým sa jeden aspekt predloženého vynálezu týka spôsobu, kedy sa podáva darcovi transplantátu farmaceutická kompozícia, ktorá obsahuje oxid uhoľnatý, získa sa orgán, tkanivo alebo bunky od darcu a orgán, tkanivo alebo bunky sa transplantujú príjemcovi, pričom množstvo oxidu uhoľnatého podané darcovi je dostatočné na to, aby zlepšilo prežitie alebo funkcie orgánu, tkaniva alebo buniek po transplantácii do príjemcu.

Farmaceutická kompozícia sa môže podávať živému darcovi, darcovi po klinickej smrti alebo darcovi pred a následne po klinickej smrti.

Voliteľne, orgán sa môže podrobiť pôsobeniu farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý in situ v darcovi a/alebo ex vivo (mimo darcu).

Spôsob podľa vynálezu môže tiež alebo alternatívne zahŕňať krok podávania príjemcovi druhej farmaceutickej kompozície, ktorá obsahuje oxid uhoľnatý, pred a/alebo v priebehu a/alebo po kroku transplantácie orgánu alebo tkaniva do príjemcu.

V oomto alebo ktoromkoľvek ďalšom spôsobe opísanom v predloženej prihláške orgán alebo tkanivo môžu byť ktorýkoľvek orgán alebo tkanivo, ktoré sa môžu transplantovať, ako sú napr. pečeň, oblička, srdce, slinivka, pľúca, tenké črevo, a/alebo koža, pričom darcom môže byť odlišný biologický druh ako príjemca alebo darca a príjemca môžu byť rovnakého biologického druhu. Darca a príjemca môžu byť obidvaja zvieratá s výnimkou ľudí alebo ľudia. Inak darcom môže byť napr. zviera s výnimkou človeka, ako napríklad ošípaná, a príjemca môže byť človek.

V ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob transDlar.técie orgáne, tkaniva alebc bunky, ktorý zahŕňa krčky poskytnutia orgánu, tkaniva alebo bunky darcu, podávanie sx vivo alebo in situ farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid unolnatý do orgánu, tkaniva alebo bunkám a transplantáciu orgánu, traniva alebo buniek do príjemcu, pričom množstvo· oxidu uhoľnatého je dostatočné na zlepšenie prežitia alebo funkcie orgánu, tkaniva ale;ríjemcovi. V jednom uskutočnení kompozícia podávaná tým, že sa perfunduje orgán ai( situ, pričom orgán alebo tkanivo je v darcovi.

tmaceut ická tkanív c in

Voliteľne, spôsob môže zahŕňať krok podávania príjemcovi druhej farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý predtým a/alebo v priebehu a/alebo po transplantácii orgánu alebo tkaniva do príjemcu.

V ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob transplantácie orgánu, tkaniva alebo ounie k, ktorý zahŕňa kroky, kedy sa poskytne orgán, tkanivo alebo bunky darcu, transplantuje sa orgán, tkanivo alebc bunky do príjemcu a predtým a/aleoo v priebehu a/alebo po kroku transplantácie orgánu, tkaniva alebo bunky do príjemcu, sa podáva príjemcovi množstvo farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý, dostatočné na zlepšenie prežitia a/alebo funkcie t ransplantovaného orgánu, tkaniva alebo buniek v príjemcovi.

V jednom uskutočnení farmaceutická kompozícia môže byť podávaná príjemcovi v priebehu 0 až 20 dní, napr. v priebehu 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18 alebo 20 dní po tom, ako sa orgán transplantoval do príjemcu. V ďalšom, uskutočnení je farmaceutická kompozícia podávaná príjemcovi aspoň raz, napr. viackrát alebo nepretržite, od okamihu, ktorý začína 21 oní po kroku transplantácie orgánu alebo tkaniva do príjemcu tak dlho, ako je to potrebné na zabezpečenie prežitia štepu, ľarmaceuticxá kompozícia sa môže podávať príjemcovi po zistení toho, že trans5 plantovaný orgán alebo tkanivo je odvrhovaný alebo sa chystá odvrhnutie (rejekcia), to znamená ide napr. o chronickú rejekciu alebo akútnu rejekciu.

Voliteľne môže spôsob ďalej zahŕňať krok podávania darcovi druhej farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý predtým, ako získa orgán, tkanivo alebo bunky od darcu. Druhá farmaceutická kompozícia môže byť podávaná živému darcovi alebo darcovi so stanovenou klinickou smrťou.

Spôsob môže zahŕňať krok podávania do orgánu druhej farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý in situ v darcovi a/alebo ex vivo.

V ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob zlepšenia prežitia a/alebo funkcie orgánu, tkaniva alebo buniek darcu, ktorý zahŕňa poskytnutie orgánu, tkaniva alebo buniek od medzného darcu a vystavenie orgánu, tkaniva alebo buniek pôsobeniu množstva farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý, dostatočného na zlepšenie prežitia a/alebo funkcie orgánu, tkaniva alebo buniek darcu.

V ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob uchovávania živočíšnych buniek in vitro, ktorý zahŕňa poskytnutie nádoby obsahujúcej tlakový plyn, ktorý obsahuje plynný oxid uholnatý, poskytnutie izolovaných buniek in vitro, kde bunka je primárna bunka alebo kmeňová bunka, uvoľňovanie tlakového plynu z nádoby, čím vzniká atmosféra, ktorá obsahuje oxid uhoľnatý, a uchovanie živočíšnych buniek in vitro v prítomnosti atmosféry, ktorá obsahuje oxid uhoľnatý.

Ak je to potrebné, bunky sa potom môžu transplantovať do príjemcu. Bunky sa môžu získať z darcu, ktorý nie je príjemcom, alebo sa môžu získať z príjemcu. A ďalej kompozícia obsahujúca oxid uhoľnatý sa môže podávať príjemcovi pred, a/alebo v priebehu, a/alebo po trar.splantačnom kroku. Táto kompozícia je typicky vo forme inhalovaného plynu.

V ďalšom uskutočnení vynálezu sú živočíšne bunky získané oc darcu spôsobom, ktorý zahŕňa podávanie kompozície obsahujúcej oxid uhoZnatý darcovi a získanie buniek alebo tkaniva z darcu.

Vynález poskytuje tiež spôsob in vitro uchovávania živočíšnych buniek, ktorý zahŕňa poskytnutie kultivačného média obsahu-

j úceho	účinné	mno ž s tvo oxidu	uholz	, a t é n o, naprikiao
0,0C01	g CC/100	g média, a uchovanie i z	olovanýon buniek v
Médium	môže obs	anovat napríklad	aspoň	0,0002, 0,0004,
0,0008,	0,0310,	0,0013, 0,0014,	'ý p n o ς Z - — — f	0,0016, 0,0018,
0,0021,	0,3022,	0,0024, 0,0026,	0,3028,	0,0030, 0,0032,
0,0037,	0,0030,	0,0042 alebo 0,00	44 g CC	:/100 g média.

a s p o n médiu.

0,0020,

0,0035,

Vynález ďalej poskytuje spôsob zlepšenia prežívania živočíšnych buniek po vybratí z tela darcu, ktorý zahŕňa krok, kedy sa podáva živému darcovi alebo darcovi s preukázanou klinickou smrťou farmaceutická kompozícia obsahujúca oxid uhoľnatý a krok získania izolovaných buniek z darcu. Farmaceutická kompozícia môže byť napríklad podávaná vo forme tlakového plynu vhodného na inhaláciu darcom.

Spôsob môže ďalej zahŕňať krok uchovávania buniek in vitro v prítomnosti druhej kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý.

Bunky sa môžu ín vitro uchovávať v kvapalnom médiu. V takom prípade krok, kedy sú bunky vystavené pôsobeniu druhej kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý, môže sa uskutočňovať rak, že sa poskytne zdroj tlakového plynného oxicu uhoľnatého a kvapalné médium sa privedie do kontakru s oxicor uhoľnatým, uvoľňovaným, zo zdroja. Kvapalné médium samotné môže byť tiež poskytnuté vo forme kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý, zo znamená média s oxidom uhoľnatým v ňom rozpusteným.

Ďalej vynález poskytuje spôsob transplantácie živočíšnych buniek, ktorý zahŕňa kroky podávania živému darcovi alebo darcc7 vi s preukázanou klinickou smrťou, farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý, získanie izolovaných buniek z darcu a rransplantovanie buniek do príjemcu. Živočíšne bunky sa môžu získať z darcu, ktorý nie je príjemcom, alebo sa môžu získať z príjemcu. Ak je to potrebné, kompozícia obsahujúca oxid uhoľnatý sa môže podávať príjemcovi pred a/alebo v priebehu a/alebo po kroku transplantácie.

Vynález tiež poskytuje spôsob zlepšenia prežitia alebo funkcie živočíšnej bunky transplantovanej do príjemcu, ktorý zahŕňa kroky transplantovania živočíšnej bunky do príjemcu a predtým, v priebehu, a/alebo po transplantácii krok, kedy sa prinúti príjemca, aby inhaloval množstvo plynného oxidu uhoľnatého, ktoré je dostatočné na zlepšenie prežitia alebo funkcie transplantovanej bunky v príjemcovi. Oxid uholnatý sa môže podávať vo forme nádoby obsahujúcej tlakový plyn, ktorý obsahuje oxid uholnatý. V jednom uskutočnení sú bunky uchovávané in vicro v atmosfére obsahujúcej oxid uholnatý pred transplantačným krokom. Napríklad živočíšne bunky sa môžu uchovávať v kvapalnom médiu, ktoré obsahuje aspoň 0,0001 g oxidu uhoľnatého/100 g média (napr. aspoň asi 0,0002, 0,0004, 0,0006, 0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020, 0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035, 0,0037, 0,0040, 0,0042 alebo C,0044 g CO/100 g média).

Spôsob môže voliteľne zahŕňať krok ex vivo vystavenia buniek pôsobeniu kompozície obsahujúcej oxid uholnatý, a to pred transplantačným krokom.

Oxid uholnatý sa môže podávať príjemcovi pred a/alebo v priebehu a/alebo po transplantačnom kroku. Živočíšne bunky sa môžu získať z darcu, ktorý nie je príjemcom, alebo sa môžu získať z príjemcu. Farmaceutická kompozícia obsahujúca oxid uhoľnatý sa môže podávať darcovi pred a/alebo v priebehu odobratia buniek z darcu.

Q

V ďalšom aspekte vynález posxyzuje spcsoo zlepšenia prelieza transplanecvanej bunky v príjemcovi, ktorý zahŕňa podávanie príjemcovi, a síce preč a/alebo v priebehu a/alebo po Transplantácii bunky príjemcovi, účinného množstva farmaceutickej kompozície obsahujúcej plynný oxid uhoľnatý.

V ktoromkoľvek skôr opísanom, spôsobe podlá vynálezu môže byť účinok na prežívanie zosilnený indukciou enzýmu hemoxygenázy-1 (HO-i) u darcu alebo príjemcu, napr. indukciou hernom, ťažkými kovmi, cvtokinmi, hormónmi, oxidom dusičným, endotcxínmi, JV žiarením alebo depletorrr.i glutatiónu, alebo prostredníctvom tepelného šoku. U darcu môže dôjsť k takej indukcii pred alebo v priebehu odstránenia orgánu, tkaniva alebo buniek. u prijemcu môže dôjsť k takej indukcii pred, v priebehu alebo následne pc transplantácii. Inak môže byť enzým, indukovaný v orgáne, tkanive alebo bunkách ex vivo, pred transplantáciou oo príjemcu.

Vynález ďalej poskytuje výrobok, ktorý obsahuje nádobu obsahujúcu tlakový plyn, ktorý obsahuje asi 1, 10, 50, 100, 150, 200, 250,

OCO, 100 000, 200 OCO, 300 000, do 1 000 000 ppm oxidu uhoľnatého označenie) opisujúce použitie plynu

aspoň 0,001 ρρ-m, napr. aspoň
3 0 Q , 5 0: 0 ,	1000, 2000, 5000,
400 000,	500 000 a viac, až
a štítok	(nálepku alebo iné

na zlepšenie prežívania izolovaných buniek, tkaniva alebo ostrovčekov pred, v prieoehu alebo po transplantácii buniek, txaniva alebo ostrovčekov do pacienta .

Do rozsahu vynálezu ďalej spadá sterilné médium pre bunky, ktoré obsahuje živiny vhodné na uchovávanie živočíšnych buniek

v kult	áre a aspoň asi	0,0001 g oxidu	uhoľnatého/100 g	média,
napr.	aspoň 0,0002, 0,	0004, 0,0006,	C,0008,	0,0010,	0,0013,
0,0014	, 0,0015, 0,0016,	U , u 0 í « , 0 , U o Z 0 ,	0,0021,	0,0022,	0,0024,
0,0026	, 0,0026, 0,0030,	0,0032 , 0 , u 0 3 5 ,	0,0 0 3 7 ,	0 , 004 0,	0,0042
alebo	0,0044 g CO/1C0 g	média. Mé d ium m	ô že tiež obsahová	ť 70 VO-

č í š n e o u n k v .

Vynález poskytuje tiež spôsob uchovávania živočíšnych buniek in vitro a ich následnej transplantácie. Spôsob zahŕňa kroky, kedy sa poskytne nádoba obsahujúca tlakový plyn obsahujúci oxid uholnatý, poskytnú sa izolované živočíšne bunky m vitro, pričom bunky sú umiestnené v médiu, ktoré obsahuje rozpustený oxid uholnatý, uvoľňovanie tlakového plynu z nádoby, čím vzniká atmosféra obsahujúca oxid uhoľnatý, udržiavanie buniek v prítomnosti tejto atmosféry a transplantcvanie buniek do príjemcu.

V ktoromkoľvek zo skôr opísaných aspektov alebo uskutočnení vynálezu bunky môžu byť akékoľvek bunky. Napríklad bunky môžu byť živočíšne bunky ako napríklad primárne alebo sekundárne bunky alebo bunky z bunkovej línie. Ďalším príkladom bunky môžu byť bunky tvoriace pankreatické ostrovčeky, napr. β-bunky. Bunky môžu tiež byť napr. pečeňové bunky, fibroblasty, bunky kostnej drene, nervové bunky, myocyty, lymfocyty alebo kmeňové bunky. V každom zo spôsobov ex vivo podlá vynálezu, tkanivo je výhodne iné tkanive ako krv a obsahuje len málo plnej krvi, ak vôbec nejakú a bunky sú výhodne mé bunky ako červené krvinky, a nie sú ani sprevádzané významným množstvom červených krviniek.

Ak nie je výslovne uvedené inak, potom všetky technické a vedecké termíny použité v tomto texte majú rovnaký význam, ako mu všeobecne rozumie priemerný odborník z oblasti, do ktorej predložený vynález spadá.

A] keď spôsoby a materiály podobné alebo ekvivalentné tým, ktoré sú opísané v predloženom texte, môžu sa použiť pri realizácii alebo testovaní predloženého vynálezu, výhodné spôsoby a materiály sú opísané ďalej. Všetky publikácie, patentové prihlášky, patenty a ďalšie literárne odkazy uvedené v tomto texte sú týmto v plnom znení zahrnuté formou odkazu. V prípade konfliktu je rozhodný predložený opis, vrátane definícií. Materiály, spôsoby a príklady sú len ilustratívne a rozsah vynálezu nijako neobmedzujú.

Ďalšie rysy a výhody vynálezu sú objasnené pomocou nasledujúceho podrobného opisu s pripojenými obrázkami a patentovými nárezmi.

Prehľad ooráz kov na výxresoch

Obr. 1A znázorňuje stĺpcový graf (histogram), ktorý ukazuje účinok pôsobenia zvyšujúcej sa koncentrácie TNF-α na βΤΌ3 bunky.

Obr. IB znázorňuje graf ilustrujúci FA.CScan analýzu fragme.ntácie DNA, v βΤ33 bunkách po ošetrení TNF-a.

Obr. IC znázorňuje stĺpcový graf, ktorý ukazuje účinok ko t r a u s f e kel e βΤΟ3 vektorom í pcDNA.3 Ζβ-ga 1) exprimuj úcim β-gal a kontrolným vektorom. (pcDNA3), a ošetrenie buď inhibítorom kaspázy-3 Z-DEVD-FMK (C3-i) alebo inhibítorom kaspšzy-8 IETDCHO (C8—i). Šedé stĺpce predstavujú neošetrené β-bunky, čierne stĺpce predstavujú β-bunky podrobené pôsobeniu TNF-α počas 24 hodín. Výslecky sú ukázané ako priemerná hodnota ± smerodajná odchýlka z hodnôt pre dve jamky vybraná z jedného z troch opakovaní experimencu.

Obr. 2A znázorňuje stĺpcový graf íhistogram) ukazujúci, že exogénny oxid uholnatý môže nahradiť HO-1 (hemoxygenázu-1), keď je HO-1 aktivita zablokovaná. Šedé stĺpiky predstavujú neošetrené bunky a čierne stĺpiky predstavujú β-bunky podrobené pôsobeniu TNF-α alebo etooozidu alebo podrobené sérovej deprivácii. Výsíedky sú ukázané ako priemerná nodnota r smerodajná odchýlka z hodnôt pre dve jamky vybrané z jedného z troch opakovaní experimentu.

Obr. 2B je grafickou reprezentáciou FAOSoan analýzy DNA.

íragmentácie v βΤ03 bunxách po 24 hodinách podávania oxidu uhoľnatého po ošetrení TNF-a.

Cbr. 2C znázorňuje stĺpcový graf ilustrujúci, že exogénny oxid uhoľnatý chráni β-bunky pred apoptózou v neprítomnosti HO-1. βΤΟ3 bunky sa transfekovali vektormi exprimujúcimi β-gal a vystavili sa pôsobeniu exogénneho oxidu uhoľnatého. Šedé stĺpce predstavujú neošetrené β-bunky a čierne stĺpce predstavujú β-bunky podrobené pôsobeniu TNF-α alebo etopozidu alebo podrobené sérovej deprivácii, ako je uvedené. Výsledky sú ukázané ako priemerná hodnota ± smerodajná odchýlka z hodnôt pre dve jamky vybraných z jedného z troch opakovaní experimentu.

Cbr. 3 znázorňuje FACScan analýzu DNA fragmentácie, ktorá ukazuje, že exogénny oxid uhoľnatý chráni myšie Langerhansove ostrovčeky od apoptózy. CHX = cykloheximid.

Obr. 4A antiapoptický sprostredkovaný guanylylcyklázy znázorňuje stĺpcový graf účinok exogénneho oxidu aktiváciou guanylátcyklázy.

ODQ.

ilustrujúci, že uhoľnatého je

ODQ = inhibítor

Obr. 4B znázorňuje stĺpcový graf ilustrujúci, že cGMP analóg môže nahradiť oxid uhoľnatý pri ochrane buniek pred apoptózou.'

8-Br-cGMP = cGMP analóg 8-Br-cGMP.

Obr. 4C znázorňuje stĺpcový graf ilustrujúci, že cGMP-závislá proteínkináza (cGK) sprostredkováva anti-apoptotický účinok oxidu uhoľnatého. βΤ03 bunky sa kotransfekovali vektorom exprimujúcim β-gal. Pre obr. 4A-C šedé stĺpce predstavujú neošetrené β-bunky a čierne stĺpce predstavujú β-bunky podrobené pôsobeniu TNF-α. Výsledky sú ukázané ako priemerná hodnota ± smerodajná odchýlka z hodnôt pre dve jamky vybraných z jedného z troch opakovaní experimentu. KT = inhibítor proteínkínázy G KT5823.

Obr. 5A znázorňuje stĺpcový graf ukazujúci, že expozícia oxidu uhoľnatému v dĺžke jednej hodiny je dostatočná na zabránenie apootózy.

Cbr. 5B znázorňuje stĺpcový graf ukazujúci, že ktorý oxic: uhoľnatý chráni β-bunky po indukcii apootózy.

Cer. 50 znázorňuje stĺpcový pral ukazujúci, že oremrubácia s oxidom uhoľnatým zabraňuje apopoóze β-buniek. Pre cbr. 5A-C šedé stĺpce predstavujú neošetrené β-buuxy a čierne stĺpce predstavujú β-bunky podrobené pôsobeniu ľNB-a. Výsledky sú ukázané ako priemerná hodnota ± smerodajná odchýlka z hodnôt pre dve jamky vybraných z jedného z troch opakovaní experimentu.

Cbr. 6Ά znázorňuje čiarový graf ukazujúci, že expozícia .myších La.ngerhansových ostrovčekov oxidu uhoľnatého zlepšuje prežitie a funkciu po transplantácii.

Cbr. 6B znázorňuje čiarový graf ukazujúci pravdepodobnosť zotavenia (glykémia nižšia ako 2 20 ng/'oi; u zvierat, ktoré costali Langerhansove ostrovčeky preexponované cxico uhoľnatému alebo dostali kontrolné ostrovčeky. = C,021 proti kontrole.

Obr. 7 znázorňuje stĺpcový graf, ktorý ukazuje expresiu BO-1 v myších srdciach transplantovaných do laboratórnym potkanov, ktorým, sa podal CVF plus CsA. Myšie srdcia sa transplantovali do laboratórnych potkanov podrobených pôsobeniu fa kt ora bobrieho jedu (CVEý v okamihu transolantácie a po transplantácii dennému podávaniu cyklosporínu A (CsA). Expresia mRNA BO-1 a β-aktínu sa cetegcvala pomocou RT-PCR. Symool -/- označuje RNA z BO-1 -/myšieho srdca použitú ako negatívna kontrola. Stĺpce predstavujú relatívne hladiny exprimované mRNA BO-1 normalizované vzhľadom k expresii mRNA β-aktínu.

Obr. 8 znázorňuje súbor stĺpcových grafov ilustrujúci, že

Sr.PPIX inhibuje in vivo enzymatickú aktivitu BO-1. Myšie srdcia sa transplantovali do neošetrených laboratórnych potkanov (II;

alebo do laboratórnych potkanov podrobených pôsobeniu CVF a CsA (III) plus FePPIX (IV) alebo SnPPIX (V). Celková HO aktivita srdca darcu a srdca príjemcu sa merala 2 dni po transplantácii a porovnala s bazálnou HO aktivitou srdca normálnej myši a laboratórneho potkana, v danom poradí (I) . Výsledky sú ukázané ako priemerná hodnota ± smerodajná odchýlka (SO) z troch zvierat analyzovaných pre každú liečbu. Štatistické rozbory sa uskutočnili s použitím nepárového Welshovho t-testu.

Obr. 9 znázorňuje súbor čiarových grafov ilusorujúci, že SnPPIX a FePPIX neinterferujú s vytváraním protilátok (Ab) proti štepu. Myšie srdce sa transplantovalo do laboratórneho potkana podrobeného pôsobeniu CVF a CsA, ako je opísané skôr. Sérové hladiny protištepových IgM Abs sa vyhodnotili ELISA testom s celými bunkami (bunková ELISA). Väzba zložky komplementu C3 laboratórneho potkana na myšie endotelové bunky sa vyhodnotila ELISA testom s bunkami. Hemolytická aktivita komplementu (CH50) sa vyhodnotila štandardným hemolytickým testom. Výsledky sú ukázané ako priemer ± S D (n = 3) .

Obr. 10A znázorňuje súbor stĺpcových grafov ilustrujúcich, že exogénny CO neovplyvňuje schopnosť SnPPIX potláčať enzymatickú aktivitu HO-1. Myšie srdcia sa transplantovali do laboratórnych potkanov podrobených pôsobeniu CVF a CsA so SnPPIX (II) alebo SnPPIX a CO(III). Celková HO aktivita sa merala v srdci darcu a príjemcu a tiež v pečeni príjemcu 2 dni po transplantácii. HO aktivita v rôznych vzorkách sa porovnala s bazálnou HO aktivitou v srdciach normálnych myší (I), srdciach (I) alebo pečeni (I) laboratórneho potkana, podlá toho, aká vzorka sa analyzovala. Výsledky sú uvedené ako priemer ± SD z troch zvierat analyzovaných pre každú liečbu. Štatistické rozbory sa uskutočnili s použitím nepárového Welshovho t-testu.

Obr . exogénny aktivitu.

10B znázorňuje stĺpcový graf, ktorý ukazuje, ze

CO neovplyvňuje schopnosť SnPPIX potláčať HO-1 Zvieratá použité v pokusoch na získanie dát na cbr.

10A sa analyzovali na obsah xarbcxyhenoglob transplantácii. Výsledky sú uvedené ako priemer m

Obr. 11 znázorňuje čiarový graf ilusirijúc:, inu 2 dni pc

S C (N = 3 j .

že uc-regulácia

bunkách	inhibaj e	axtiváciu doštičiex. Myš	ie
;nky sa	nechali	neošetrené )H T) a 1e b o	sa
CoPPlX	5 0 μΧ,	_ c f: 031 Ω Ω m. Ό — ľľΘ Q 31 — á C	i u
IX na )	potlačenie	HO-1 aktivity í 50 μΧ,	16
( 5 0 piôč,	12 hodín)	spolu s c SuPPiX í 50 μΜ,	d

F-23 endotelové bunky s podrooili pôsobeniu so

HO-1 aktivity, Sr hodiny) na kontrolu špecifity Co?PIX v up-reguiácii HO-1 aktivity. Krvné doštičky laboratórnych potkanov sa izolovali, prevrstvili cez myšie endotelové bunky na 5 minút a testovali na agregáciu po stimulácii 2 μΜ adenozindifosiátom ÍADP).

Obr. 12 znázorňuje stĺpcový graf ilustrujúci, že oxid uhoľnatý potláča apoptózu endotelcvých buniek. Šeoé stĺpce predstavujú bunky podrobené pôsobeniu AotD samotného, čierne stĺpiky predstavujú bunky podrobené pôsobeniu ActO spolu s TKF-α. Kde je to označené, endotelové bunky sa podrobili (50 líM 50í a exponovali exogénnemu CO pôsobeniu SnP?_X (10 00 0 ppm) .

Podrobný opis

Termín oxid uhoľnatý (alebo CC), akc sa v tomto texte používa, označuje molekulárny oxic. uhoľnatý v plynnom stave, oxic uhoľnatý stlačený do kvapalnej formy alebo rozpustený vo vodnom roztoku.

Termíny kompozícia obsahujúca oxid uhoľnatý a farmaceutická kompozícia obsahujúca oxid uhcinatý sú použité v tomto texte tak, že označujú plynnú, kvapalnú, tunú alebo polotuhú kompozíciu alebo prípravok obsahujúci oxid uhoľnatý, ktoré môžu byť podávané pscier.tovi-darcovi, kadaveru (mŕtvole) alebo zvieraťu, dc orgánu aieoo do časti orgánu, napr. traniva z orgánu alebo individuálnych buniek alebo bunky, ktoré tvoria orgán, ako sú napr. neuróny, hepatocyty, myocyty, celé ostrovčeky alebo bunky ostrovčekov ako napríklad pankreatické β-bunky. Odborník lahko rozpozná, ktorá forma farmaceutickej kompozície (prípravku) , napr. plynná, kvapalná alebo spolu plynná a rvapalná forma, je vhodná na podávanie pri konkrétnej aplikácii.

Termíny účinné množstvo a účinné na liečenie, ako sú použité v tomto texte, sa týkajú množstva alebo koncentrácie oxidu uhoľnatého, ktoré sa podáva po určitý čas (vrátane akútneho alebo chronického podávania a periodtckéno alebo kontinuálneho podávania), pričom je účinné v kontexte tohto podávania na spôsobenie zamýšľaného účinku alebo fyziologického výsledku. Účinné množstvo oxidu uhoľnatého na použitie podlá predloženého vynálezu zahŕňa napríklad také množstvá, ktoré sú účinné na zlepšenie prežitia a/alebo zlepšenie funkcie orgánov alebo buniet in vivo a/alebo in vitro.

V kontexte transplantácie individuálnych buniek alebo zhlukov buniek, napr. transplantačného darcu a/alebo príjemcu, účinné množstvo oxidu uhoľnatého je množstvo, ktoré sa podáva transplantačnému darcovi a/alebo príjemcovi a je dostatočné na zlepšenie prežitia buniek alebo zhlukov buniek, napr. tým, že znižuje straty buniek alebo zhlukov buniek a/alebo zlepšuje funkčné výkony transplantovanýcn buniek alebo zhlukov buniek. V kontexte ošetrovania buniek vo vnútri organizmu, napr. buniek ostrovčekov, ktoré sa majú kultivovať a/alebo použiť na transplantáciu, účinné množstvo oxidu uhoľnatého je množstvo, s ktorým sú bunky inkubované alebo uchovávané, aby sa zlepšila konzervácia buniek a/alebo znížili straty buniek, napr. straty spôsobené apoptózou, a/alebo zlepšili funkcie buniek. V kontexte transplantácie orgánov a tkanív, napr. transplantačného darcu a/alebo príjemcu, účinné množstvo oxidu uhclnatého je množstvo, ktoré sa podáva transplantačnému darcovi a/alebo príjemcovi a je dostatočné na zlepšenie prežitia orgánu, tkanív alebo buniek, i o napr. znížením strát buniek, z ktorých je orgán alebo txanivo zložené, a/alebo zlepšením funkčného výkonu orgánu. V kontexte ošetrenie orgánov, ikar.lv alebo buniek ex vivo, ktoré sa majú uchovať alebo použiť na transplantáciu, účinné množstvo oxidu uhoľnatého je množstvo dostatočné na zlepšenie prežitia a/alebo funkcie orgánu alebo tkanív.

Termín inhibícia, ako sa v tomto texte používa, zahŕňa oneskorenie nástupu alebo začiatku, redukciu, prevenciu aleoo zoslabenie biologického procesu, napr. apoptózy.

Pre plyny, účinné množstvo oxidu uho1n a t é n o ašeooecne snadá

do	rozsahu asi	0,OOC53C1% až asi 0,3%	(hmotn	. ) , na	pr. 0,	0001% až
0,	25% (hmotn.)	, výhodne aspoň asi Q,	0' 01%,	napr .	asOoň	0,005%,
0,	010%, G,02%,	0,525%, 0,03%, 0,04%, 0	,05%,	r, C £ v •j f v C o f	0, 08%	, 0,10%,

0, 15' >,20%, 0,22% alebo 0,24% (hmotn oxidu uhoľnatého.

0,

0,

C r

c,

Výhodný rozsah 24%, asi 0,005% a 011 až asi C, 3. % (r 005% až asi 0,24%, 2 C % a asi 0,025% a:

x o d u asi otn.

asi asi uhoľnatého 0,22%, asi ! . úalšte vy 0,01% až asi

0,1% (hmotn.) .

zahŕňa asi 0, 0,01% až asi hodné rozsahy . 0,22%, asi 0

01 % a z

U , <L· Ό 7. ä Z S Ω Γ Π ä j Ú ,015% až asi asi

ZS z asi

Pre kvapalné roztoky CO účinné množstvo všeobecne spadá do

rozsahu asi 0,0001 až	asi 0,0044	g CO/100 g	kvapaliny,	napr.
aspoň 0,0002, 0,0004, (	3, 0006, 0, u	C10 8, 0,0010,	0,0013,	0,0014,
0,0015, 0,0016, 0,0 0 i 3,	0,0020, C,	0021, 0,0022,	0,0024,	0,0026,
0,0028, 0,0030, 0,0032,	0,0035, 0	,0037, 0,0040 alebo 0	,0042 g

CO/100 g vodného roztoku. Výhodné rozsahy zahŕňajú napr. asi 0,0010 až asi 0,0030 g 00/100 g kvapaliny, asi 0,0015 až asi 0,0026 g CO/'ÍOO c kvapaliny, alebo asi 0,0018 až asi 0,0024 g CO/100 g kvapaliny. Odborníkovi je zrejmé, že aj množstvá okrem uvedených rozsahov sa môžu použiť, a síce v závislosti od aplikácie.

Termín pacient je použitý v predloženom opise na označenie zvieraťa s výnimkou človeka alebo človeka, na ktorého je aplikovaný prípravok podlá vynálezu, prípadne sú použité spôsoby podľa vynálezu. Veterinárske aplikácie sú jasne precvidané podlá predloženého vynálezu. Termín teda zahŕňa, avšak tento výpočet nie je obmedzujúci, vráky, plazy, obojživelníky a cicavce, napr. ľudí, ďalšie primáty, ošípané, hlodavce ako napríklad myši a laboratórne potkany, králiky, morčatá, škrečky, kravy, kone, mačky, psy, ovce a kozy.

Termín darca alebo pacient-darca, ako sa v tomto texte používa, sa týka živočícha (človeka alebo iného ako človeka), z ktorého sa môžu získať orgány, tkanivá alebo individuálne bunky na potreby uchovania a/alebc transplantácie do príjemcu (pacienta-príjemcu) . Termín príjemca alebo pacient-príjemca sa týka živočícha (človeka alebo iného ako človeka), do ktorého sa môže preniesť orgán, tkanivo aleoo zhluk buniek alebo individuálne bunky.

Termín diabetes je všeobecný termín označujúci diabetické chorobné stavy ako sú známe v odbore, napr. diabetes mellitus. Diabetes mellitas je charakterizovaný neschopnosťou regulovať hladinu glykémíe. Dva najbežnejšie cypy diaberu sú známe ako diabetes typu í a typu II. U diabetu typu I alebo diabetu závislého od inzulínu (IDDM), slinivka tvorí málo inzulínu alebo netvorí žiadny inzulín, pretože β-bunky tvoriace inzulín sa zničili. U typu II alebo diabetu nezávislom od inzulínu (NIDDM), slinivka tvorí inzulín, ale tento inzulín nie je účinný. Termín tiež zahŕňa celý rad sekundárnych chorobných stavov spôsobených diabetom, ako akútnych tak aj chronických, ako sú napr. diabetické komplikácie, napr. hypoglykémia a hyperglykémia, retinopatia, angiopatia, neuropatia a nefropatia.

Termín bunka alebo živočíšna bunka alebo bunka zvieraťa, ako sa v tomto rexte používajú, sa týkajú ktorýchkolvek typov živočíšnych buniek, vrátane živočíšnych buniek vhodných na transplantáciu. Bunky sú typicky primárne bunky získané od živočíšneho darcu, ale môžu to byt sekundárne bunky alebo ekvivalentné bunky zo stabilnej bunkovej línie. Bunky môžu byt prípadne transfekované ex vivo expresným vektorom, ktorý zmení ich funkciu istým spôsobom. Bunky zahŕňajú, bez toho aby tento výpočet bol obmedzujúci, napr. bunky ostrovčekov, napr. ounky, ktoré sú časťou pankreatických ostrovčekov, pečeňové bunky, fibroblasty, ounky kostnej drene, myccyty a kmeňové bunky a bunky (napr. neuróny? centrálneho nervového systému vrátane miechy. Termín bunky ostrovčekov je použitý v tomto texte ako všeobecný termín označujúci zhluky buniek v pankrease (siinivke; známe akc ostrovčeky, napr. Langerhansove ostrovčeky. Langerhansove ostrovčeky obsahujú niekolko typov buniek, napr. β-bunky (ktoré tvcrza inzulín), α-bunky (ktoré tvoria clukagóny·, γ-bunky (ktoré tvoria somatostatín;, F-bunky (ktoré tvoria pankreatický polypeptid; , enterochromafinné bunky (ktoré tvoria serotonín;, PF bunkv a Dl bunky. Termín kmeňová bunka je v ocbore známy ako termín, ktorý označuje bunky, ktoré majú schopnosť sa deliť po .nekonečný čas v kultúre, z ktorých potom vznikajú špecializované bunkv. Tento termín zahŕňa napríklad zotipotencné, plunpotentné, multiootentné a unipotentné kmeňové bunky, napr. nervové, pečeňové, svalové a hemopoetické kmeňové bunky.

Termín izolovaná bunka označuje bunku, ktorá sa odstránila z tkaniva alebo orgánu, kde sa bunka (alebo jej prechodca; prirodzene vyskytuje. Bunky môžu byť len čiastočne ourifikované zo svojho prírodného prostredia a byť pritom považované za izolované. Napríklad neporušený (intaktný) Langerhansov ostrovček sa považuje za ostrovček tvorený izolovanými bunkám:, akonáhle je raz Langerhansov ostrovček vybratý zo slinivky a môže byť fyzicky oddelený od ďalších ostrovčekov. Bunky neporušeného orgánu ako· napríklad obličky alebo srdca alebo časti orgánu, ako napriklad krvné konzerva, r.ie sú považované za izolované bunky posial sú stále časťami orgánov.

Termín orgán je použitý v tomto texte ako všeobecný oermín označujúci ktorúkoľvek anatomickú časť alebo element, ktorý má špecifickú funkciu v tele zvieraťa. Ďalej tento termín zahŕňa podstatné časti orgánov, napr. spcjivové tkanivá získané z orgánu. Také orgány zahŕňajú, bez toho aby bol výpočet obmedzujúci, oblečky, pečeň, srdce, črevo, napr. hrubé alebo ten<é črevo, slinivku a pľúca. Ďalej sú zahrnuté v tejto definícii kosti a krvné cievy, napr. aortálne transplantáty.

Termín transplantácia je použitý v predloženom opise akc všeobecný termín označujúci postup implantovania orgánu, tkaniva, zhluku buniek alebo individuálnych buniek do pacienta. Termín transplantácia je definovaný v odbore ako prenos živých tkanív alebo buniek od darcu do príjemcu, s cieľom udržať funkčnú integritu transoiantovaného tkaniva alebo buniek v príjemcovi (pozri napr. The Merck Manual, Berkow, Fletcher, and Beers, Eds., Merck Research Laboratories, Rahway, N.J., 1992). Termín bunková transplantácia je použitý v predloženom opise ako všeobecný termín označujúci postup prenesenia aspoň jednej bunky, napr. bunky ostrovčekov, pacientovi. Napríklad taká transplantácia môže byť uskutočnená tak, že sa vyberú β-bunky (alebo neporušené ostrovčeky) zo slinivky darcu a vložia sa do tela pacienta-príjemcu, ktorého slinivka nemôže produkovať dostatok inzulínu. Termíny zahŕňajú všetky kategórie transplantácií známe v odbore, okrem transfúzií. Transplantácie sú roztriedené podľa miesta a genetického vzťahu medzi darcom a príjemcom. Termín teda zahŕňa napr. autotransplantácie (odobratie a prenos buniek alebo tkaniva z jedného miesta do rovnakého alebo iného miesta toho istého pacienta), alotransplantácie (transplantácia medzi členmi rovnakého biologického druhu) a xenotransplantácie (transplantácia medzi členmi rôznych biologických druhov).

Termíny rejekcia orgánu alebo transplantačná rejekcia alebo len rejekcia, prípadne odvrhnutie alebo odvrhnutie orgánu a príslušné ekvivalenty sú v odbore známe a sú použité v predloženom opise ako všeobecný termín označujúci proces rejekcie/odvrhnutra orgánu, tkaniva alebo ranky u paoienta-príjemcu. Zahrnuté podľa definície sú napríklad trr hlavné typy rejekcie, ktoré sú obvykle identifikované v klinickej praxi: nvperakútna rejekcia, akútna rejekcia a chronické rejekcia (pozri napr., Oxford Textbook of Surgery, Morris and Mált, los., Oxford University Press, 1991).

Termíny marginálny darca a margmr hraničný darca a hraničný orgán sú použ organ ipnpaone v tomto texte ako všeobecný termín označujúci darcu alebo Ktoré icn využitie \⁷ transplantácii oroén s oroblémanr, pre osie

c κ ym c c	norením,	xtore moze
rpiaci	ciabetcm,	ΗΤΛ alebo
r í x 1 a o	( i) orgán.	z tak.éno-
Lebo ;2)	; orgán,	Ktorý c r e-
j rschéz	zlou, alebo (3) or-
t o u (n s	mr. malé	a vraopo-
ô ž e s k o	mol r ková t	vasrmicr-

,.<c optimálne.

Napríklad hraničný darca môže byť darca, ktorý je starší ako 50 rokov alebo ktorý je postihnutý chronickým ovplyvniť funkciu štepu, napr. darca trpiaci d: abúzora alkoholu. Hraničný orgán je napríklad to, to znamená skôr opísaného darcu alebo šiel dlhý čas tepelnou alebo chladovou rs gén, Ktorý trpí anatomickou abnormalitou četné cievy, napr. v obličke), ktorá môže ne anastoraózy (spojky), alebo orgán s výskytom ateroskleroti kých plátov v cievach.

Príprava plynných kompozícií

Kompozícia obsahujúca oxid uhoľnatý môže byt plynná kompozícia obsahujúca oxid uhoľnatý. Stlačený alebo tlakový plyn užitočný v spôsoboch podľa vynálezu môže sa získať z ktoréhokoľvek komerčného zdroja a v ktoromkoľvek type nácoby vhodnej na uchovávanie kompozície vo forme stlačeného plynu. Napríklad stlačené alebo tlakové (natíakované) plyny môžu byť získané z ktoréhokoľvek zcrcja, ktorý dodáva stlačené plyny, ako napríklad kyslík, ns lekárske použitie. Tlakový plyn vrátane oxidu uhoľnatého na použitie v spôsoboch podľa predloženého vynálezu môže byť poskytnutý tak, že všetky plyny požadované na dosiahnutie výslednej kompozície (napr. CO a O₂ a voliteľne N₂, He a/alebo CO₂) sú zmiešané v jednej spoločnej nádobe. Ak je to potrebné, spôsoby podlá predloženého vynálezu sa môžu uskutočňovať s použitím väčšieho' počtu nádob obsahujúcich jednotlivé plyny. Napríklad môže byť poskytnutá jedna nádoba, ktorá obsahuje oxid uholnatý, buď s ďalšími alebo bez ďalších plynov, ktorej obsah môže byť podľa potreby miešaný so vzduchom miestnosti alebo s obsahom ďalších nádob, napr. nádob, ktoré obsahujú kyslík, dusík, oxid uhličitý, stlačený vzduch alebo ktorýkoľvek ďalší vhodný plyn alebo ich zmesi.

Plynné kompozície podávané pacientovi podľa predloženého vynálezu typicky obsahujú 0% až asi 79% (hmotn.) dusíka, asi 21% až asi 100% (hmotn.) kyslíka a asi 0,0000001% až asi 0,3% (hmotn.) (čo zodpovedá asi 0,001 ppm (to znamená 1 ppb) až asi 3000 ppm) oxidu uhoľnatého. Výhodne, množstvo dusíka v plynnom prípravku je asi 79% (hmotn.), množstvo kyslíka je asi 21% (hmotn.) a množstvo oxidu uhoľnatého je asi 0,0001% až asi 0,25% (hmotn.). Množstvo oxidu uhoľnatého je výhodne aspoň asi 0,001%, napr. aspoň asi 0,005%, 0,01%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,08%, 0,10%, 0,15%, 0,20%, 0,22% alebo 0,24%· hmotnostných. Výhodné rozsahy oxidu uhoľnatého zahŕňajú asi 0,001% až asi 0,24%, asi 0,005% až asi 0,22%, asi 0,010% až asi 0,20% a asi 0,015% až asi 0,1% hmotnostných. Zistilo sa, že kompozície obsahujúce plynný oxid uholnatý, ktoré majú koncentráciu oxidu uhoľnatého vyššiu ako 0,3% (ako napríklad 1% alebo väčšiu) môžu sa použiť na krátky čas (ako je napr. jeden alebo niekoľko dychov), v závislosti od aplikácie. Sú najmä užitočné pre ex vivo aplikácie, kedy nie je riziko otravy oxidom uhoľnatým. Keď sa plyn používa na prípravu atmosféry na kultiváciu buniek in vitro, plyn môže obsahovať tiež oxid uhličitý, čo pomôže udržovať pH média. Oxid uhličitý môže byť prítomný napr. v množstve 1% až 10%, všeobecne 5% hmotnostných.

Plynná kompozícia obsahujúca oxid uholnatý sa môže použiť na vytvorenie atmosféry, ktorá obsahuje plynný oxid uholnatý. Atmosféra, ktorá obsahuje vhodnú hladinu plynného oxidu uhoľnatého môže byť vytvorená napríklad tak, že sa poskytne nádoba obsahujúca tlakový plyn obsahujúci plynný oxid uholnatý a uvoľňuje sa tlakový plyn z nádoby do komory alebo priestoru, a vo vnútri tejto komory alebo priestoru vzniká atmosféra, ktoré obsahuje plynný oxid uhoľnatý. Inak plyny môžu byť uvoľňované do zariadenia, ktoré ústo do respirátora aleoo dýchacej truoice, a ktoré vytvára v respirátore alebo dýchacej trubici ionosféru obsahujúcu plynný oxid uhoľnatý, čím je zaoezpečené, že len pacient je jediná osoba v miestnosti, ktorá je vystavená významne vyššej hladine oxidu uhoľnatého.

Hladiny oxidu uhoľnatého v atmosfére alebo vo ventilačnom (dýchacom) obvode sa môžu merať alebo sledovať s použitím akéhokoľvek spôsobu známeho v odbore. Také spôsoby zahŕňajú elektrochemickú detekciu, plynovú chromatografiu, čítanie pulzov rádioizotopov, infračervenú absorpciu, kolorimetrické a elektrochemické metódy založené na selektívnych membránach 'pozri napr. Sunderman a kol., Clu. Chem. 28: 2026-2032, 1982 , fngi a kol·., Neurón 16: 835-842, 1896) . Koncentrácie oxidu uhoľnatého nižšie ako rádu ppm (milióntiny) mcžu byť detegované napr. použitím plynovej chromatografie a detekcie rádioizotopov.

Ďalej je v odbore známe, že hladiny oxidu uhoľnatého nižšie ako v rozsahu ppm môžu byť merané v biologických tkanivách miniatúrnym infračerveným senzorom plynu (midinfrared gas sensor, pozri napr., Norimoto a kol., Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol 280: H482-H488, 2001). Senzory na detekciu plynného oxidu uhoľnatého a iné zariadenia na detekciu plynov sú bežne dostupné z mnohých komerčných zdrojov.

Príprava tekutých kompozícií

Kompozícia obsahujúca oxid uholnatý môže tiež byť kvapalná kompozícia obsahujúca oxid uholnatý. Kvapalina môže byť premene23 ná na kompozíciu obsahujúcu oxid uhoľnatý ktorýmkoľvek spôsobom známym v odbore preto, aby sa plyny rozpustili v kvapalinách. Tak napríklad kvapalina môže byť umiestnená v tzv. C0₂ inkubátore a vystavená kontinuálnemu priezoru oxidu uholr.azéhc až do toho času, kedy je dosiahnutá požadovaná koncentrácia oxidu uhoľnatého v kvapaline. Ďalším príkladom môže byť postup, kedy je plynný oxid uhoľnatý prebublávaný priamo kvapalinou až do toho času, kedy je dosiahnutá požadovaná koncenzrácia oxidu uhoľnatého v kvapaline. Množstvo oxidu uhoľnatého, ktoré môže byť rozpustené v danom vodnom roztoku sa zvyšuje s klesajúcou teplotou. Ešte ďalším príkladom je postup, kedy vhodná kvapalina prechádza rúrkami alebo hadičkami, ktoré umožňujú difúziu plynu, kedy rúrky alebo hadičky prechádzajú prostredím obsahujúcim oxid uhoľnatý (napr. pri použití zariadenia ako je napríklad mimotelové membránové okysličovacie zariadenie). Oxid uhoľnatý tak difunduje do kvapaliny a vytvára kvapalnú kompozíciu obsahujúcu oxid uhoľnatý.

Kvapalina môže byť akákolvek kvapalina odborníkom známa, ktorá je vhodná na podávanie pacientom (pozri napríklad Oxford Textbook of Surgery, Morris and Mált, Eds., Oxford University Press, 1994) alebo na uchovávanie orgánov, tkanív alebo buniek ex vivo. Všeobecne kvapalina je vodný roztok. K príkladom vhodných vodných roztokov patrí fyziologický roztok pufrovaný fosfátmi (PBS), roztok Celsior

TM roztok Perfadex

TM

Collinsov roztok, citrátový roztok a roztok podlá Wisconsinskej Univerzity (UW roztok) (Oxford Textbook of Surgery, Morris and Mált, Eds.,

Oxford University Press, 1994). Kvapalné kompozície môžu obsahovať oxid unolnatý v koncentrácii v rozsahu asi 0,0001 až asi 0,0044 g 00/100 g kvapaliny, napr. aspoň 0,0002, 0,0004, 0,0006,

0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020,

0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035,

0,0037, 0,0040 alebo 0,0042 g CO/100 g vodného roztoku. Výhodné rozsahy zahŕňajú napr. asi 0,0010 až asi 0,0030 g CO/100 g kvapaliny, asi 0,0015 až asi 0,0026 g CO/100 g kvapaliny alebo asi

0,0018 až asi 0,0024 g CO/IOO g kvapaliny. Pre voda pri 0°C je saturačná koncentrácia asi 0,0044 g CO/IOO g média.

Ktorákoľvek vhodná kvapalina môže byť saturovaná na nastavenú koncentráciu oxidu uhoľnatého prostredníctvom plynových difuzércv. Inak sa môžu použiť dopredu pripravené roztoky, ktoré prešli rcntrolou Kvality pokiaľ ide o nastavenú hladinu oxidu uhoľnatého. Presná kontrola dávky môže byt uskutočňovaná prostredníctvom merania pomocou membrány, ktorá je priepustná pre plyn a nepriepustná pre kvapalinu, a ktorá je pripojená k analyzátoru oxidu uhoľnatého. Roztoky môžu byť saturované až na požadované účinné koncentrácie a udržiavané na tejto· hladine. Ako u kvapalných tak aj piynnýcn kompozícií orimiešanie inertného plynu hélia môže zlepšiť podanie oxidu unolnatého dc tkanív/orgánu.

Liečenie pacientov pomocou kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý

Predložený vynález predpokladá použitie kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý na ošetrovanie darcov a príjemcov a na ošetrovanie orgánov, tkanív, zhlukov buniek a/alebo individuálnych buniek v ktoromkoľvek z krokov z celého postupu ocoberania, uchovávania a transplantovania. Orgán, tkanivo, z'nluk buniek alebo individuálne bunky môžu byt odobraté od darcu, podrobené ex vivo pôsobeniu Kompozície s oxidom uhoľnatým podlá predloženého vynálezu a transplantovaué do príjemcu. Alternatívne alebo okrem toho, orgán, tkanivo, zhluk buniek alebo individuálne bunky môžu byť podrobené takému pôsobeniu rn slzu, zatiaľ čo sú prítomné ešte v darcovi. Voliteľne kompozícia obsahujúca oxid uhoľnatý sa môže podávať príjemcovi pred, v priebehu a/alebo po chirurgickom výkone, napr. potom, ako je orgán reperfundovaný príjemcovou krvou. Kompozícia obsahujúca oxid uhoľnatý môže sa tiež podávať darcovi pred alebo v priebehu postupu odoberania orgánu, tkaniva, zhluku buniek alebo individuálnych buniek.

Orgány, ;ky buniek a / a lek izolované bunky sa môžu odobrať z darcu a transplantovať ktorýmikolvek metódami, ktoré sú odborníkom známe (pozri napríklad Oxford Textbook of Surgery, Morris and Mált, Eds., Oxford University Press, 1994) . Odborníkovi je jasné, že metódy odoberania a transplantácie môžu byť rôzne v závislosti od mnohých okolností, ako napríklad od typu orgánu, tkaniva alebo buniek a typu darcu.

Ďalej sa predpokladá, že spôsoby podľa predloženého vynálezu, ktoré sú opísané v tomto texte, sa môžu použiť pre orgány, tkanivá, zhluky buniek alebo izolované bunky ex vivo, napr. pre tzv. bioartificielne orgány, ako sú napríklad oioartificielna pečeň, oblička alebo slinivka (pozri napr. Sambanis a kol·., Cytotechnology 15:351-363, 1994) . Orgány, tkanivá alebo bunky (alebc zhluky buniek) sa môžu podrobiť pôsobeniu oxidu uholnatého buď predtým, ako sú vložené do zariadenia, alebo v priebehu používania v zariadení, alebo je možné použiť obidve uvedené možnosti. Alternatívne alebo okrem toho, darcovi sa môže podávať oxid uhoľnatý pred odszránením orgánu, tkaniva, zhluku buniek alebo individuálnych buniek na použitie v uvedenom: zariadení.

Alternatívne alebo okrem toho bunky môžu byť kultivované,, ako je ešte opísané ďalej a transplantované do príjemcu.

Pacient sa môže podrobiť pôsobeniu kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý ktorýmkoľvek spôsobom známym v odbore podávania plynov a/alebo kvapaliny pacientom. Predložený vynález predpokladá systémové podávanie kvapalných alebo plynných kompozícií obsahujúcich oxid uhoľnatý pacientom (napr. inhaláciou a/alebo prehítanim) a topické podávanie kompozícií in situ do pacientových orgánov alebo zkanív (napr. prehítanim, insufiáciou a/alebo zavedením do brušnej dutiny).

Systémová aplikácia oxidu uholnatého

Plynné kompozície obsahujúce oxid uhoľnatý sa môžu podávať syszémovo pacientovi, napr. pacientovi, ktorý práve podstupuje a/alebo potrebuje podstúpiť transplantáciu. Plynné kompozície obsahujúce oxid uhoľnatý sú typicky podávané inhaláciou cez hrdlo alebo nosnú dutinu do plúc, kde oxid uhoľnatý je ľahko absorbovaný do pacientovho krvného obehu. Koncentrácia účinnej zlúčeniny (to znamená CO) použitá v terapeutickéj plynnej kompozícii závisí od rýchlo s c i absorpcie, distribúcie, iaaktivácie a vylučovania (všeobecne prostredníctvom dýchania) oxidu uhoľnatého a tiež od ďalších faktorov, ktoré sú známe odoorníkom. Je potrebné ďalej rozumieť, že pre ktoréhokoľvek konkrétneho pacienta je pccrebné upraviť špecifickú dávkovaciu schému v priebehu liečenia podľa individuálnej potreby, na základe odborného názoru osoby podávajúcej prípravok alebo dohliadajúcej na podávanie prípravku, pričom rozsahy koncentrácií uvedené v predloženej prihláške sú uvedené len ako príklady a nijako neobmedzujú rozsah ani realizáciu predloženého vynálezu.

Predložený vynález počíta tiež s akútnym, subakútnym a chronickým podávaním oxidu uholnacého, v závislosti od závažnosti alebo vytrvalosti chorobného stavu u pacienta. Oxid uhoľnatý sa môže podávať pacientovi počas (vrátane neobmedzenénc času), ktorý je dostatočný na liečenie a dosiahnutie zamýšľaného farmakologického alebo biologického účinku.

Ďalej sú uvedené príklady niektorých metód a zariadení, které sa môžu použiť na podávanie plynných kompozícií obsahujúcich oxid uhoľnatý pacientom.

Venu i lačné zariadenie

Oxid uhoľnatý (koncentrácia sa môže meniť) môže byť zakúpený ako zmes so vzduchom alebo iným plynom obsahujúcim kyslík v štandardných nádobách pre stlačený plyn (napr. 21% O2, 75% iď). Je ne r e a k t í v.ny a koncentrácie, ktoré sú vyžadované pre spôsoby poola predloženého· vynálezu sú hodne pod limitom horľavosti (10% vo vzduchu). Pri nemocničnom usporiadaní, plyn bude pravdepodobne dopravený na miesto pri nemocničnom lôžku, kde bude pomocou zmiešavacieho zariadenia miešaný s kyslíkom aleoc vzduchom z miestnosti na požadovanú koncentráciu. Pacient bude inhalovať zmes plynov cez ventilačné zariadenie, ktoré bude nastavené tak, aby to zodpovedalo pacientovým, potrebám a splnili sa požiadavky primeraného komforcu. To je určené plúcnou grafikou (to znamená respiračnou rýchlosťou, respiračným objemom a podobne). Mechanizmy, zabezpečené proti zlyhaniu, ktoré zabezpečujú, aby pacient zbytočne nedostával väčšie ako požadované množstvo oxidu uhoľnatého, môžu byť zaradené do aplikačného systému. Hladina oxidu uhoľnatého pacienta môže byť monitorovaná tým, že sa sleduje (1) karboxvhemoglobín (COHb), ktorý sa môže merať v žilovej krvi a (2) vydychovaný oxid uhoľnatý odoberaný z vedľajšej vetvy vencilačného zariadenia. Expozícia pacienta oxidu uhoľnatému sa môže upraviť na základe pacientovho zdravotného stavu a na základe uvedených ukazovatelov. Ak je to potrebné, oxid uholnatý sa môže odstrániť z pacienta tým, že sa prepne na inhaláciu 100% O₂. Oxid uholnatý nie je metabolizovaný, takže akékoľvek množstvo sa inhalovalo, také bude nakoniec vydýchané, okrem velmi malého percenta, ktoré je premenené na CO₂. Oxid uholnatý sa môže tiež miešať s akýmkoľvek množstvom O₂ pre potreby terapeutického podávania oxidu uhoľnatého bez následného hypoxického stavu.

Tvárová maska a staň

Zmesi plynov obsahujúce oxid uhoľnatý sa pripravia rovnako, ako je uvedené skôr, aby sa umožnila inhalácia pacientom pri použití tvárovej masky alebo stanú. Inhalovaná koncentrácia môže byť menená a všetok oxid uhoľnatý môže byť odstránený tým, že sa len prejde na 1CO% O₂. Bolo by vhodné monitorovanie hladiny oxidu uhoľnatého priamo v maske a/alebo v blízkosti masky alebo stanú použitím spoľahlivého mechanizmu, ktorý by zabránil, aby sa nemhalovala velmi vysoká koncentrácia oxidu uhoľnatého.

Prenosný inhalátor

Stlačený oxid uhoľnatý sa môže tiež vložiť do prenosného inhalačného zariadenia (inhalátora) a inhalovať v oameranýcr dávkach, aby bolo možné napríklad prerušované podávanie príjemcovi, ktorý nie je hospitalizovaný v nemocničnom, zariaceni. Vc vhodných nádobách môžu byť poskytnuté rôzne koncentrácie oxidu uhoľnatého. Zariadenie môže byť tak jednoduché, ako napr. malá néoooa (napr. pod 5 kg) s primerane zriedeným CO a jednoduchým ventilom (typu otvorené/zatvcrenéi a rúrkcu/hadicou, z ktorej pacient vdýchne CO podlá štandardného režimu alebo podľa potreo y .

Intravenózne umelé pľúca

Umelé pľúca (zariadenie typu katétra na výmenu plynov v krvi; určené na pooévanie Cn a odstraňovanie C0₂ môžu byť použité na aplikáciu oxidu uhoľnatého. Katéter, keď je zavedený, je lokalizovaný v jednej z veľkých ciev a je schopný podávať oxid uhoľnatý v požadovanej koncentrácii buď pre systémovú aplikáciu alebo lokálnu aplikáciu na konkrétne miesto. Aplikácie môže teda byť lokálna aplikácia vysokej koncentrácie oxidu uhoľnatého po krátky čas na špecifické miesto (táto vysoká koncentrácia je potom rýchlo zriedená v krvnom obehu) alebo relatívne dlhšia systémová expozícia k nižšej koncentrácii oxidu uhoľnatého (potri napr. Hattler a kol·., Artif. Organs 18(11): 805-812, 1994 a C-olob a kel., Asaic J. 47(5):432-437, 2C01).

Normebarická komora

V určitých prípadoch je žiaduce vystaviť celkovo pacienta oxidu uhoľnatému. Pacient v takom prípade môže byť vo vnútri vzduchotesnej komory, ktorá je potom naplnená oxidom uhoľnatým (v koncentrácii, ktorá nepredstavuje pre pacienta žiadne cnrozenie alebo v koncentrácii, ktorá predstavuje pre pacienta prijateľne riziko, avšak bez rizika nežiaduce^-' exoozície nezúčastne29 ných osôb) . Po ukončení požadovanej expozície môže byť komora zaplnená vzduchom (napr. 21% 0₂, 79% N₂) a vzorky sa môžu analyzovať použitím analyzátorov oxidu uhoľnatého, aby sa zabezpečilo, že nepretrvávajú žiadne zvyšky oxidu uhoľnatého pred tým, ako je dovolené pacientovi vystúpiť zo zariadenia, koe sa exponoval .

Vodné roztoky

Predložený vynález ďalej predpokladá, že pre systémové aplikácie pacientovi môžu byť pripravené vodné roztoky obsahujúce oxid uhoľnatý, napr. pre perorálne aplikácie a/alebo aplikácie injekciou do organizmu, napr. intravenóznou, intraarteriálnou, intraperitoneálnou a/alebo subkutánnou injekciou.

Konzervačné pufry a kultivačné médiá môžu byť saturované na nastavenú koncentráciu oxidu uhoľnatého prostredníctvom zariadenia na difúziu plynov (difuzérov) alebo vopred pripravených zásobných roztokov, u ktorých kontrola kvality zabezpečuje, že obsahujú dané hladiny oxidu uhoľnatého. Presná kontrola dávky sa môže dosiahnuť meraním prostredníctvom membrány, ktorá je priepustná pre plyn a nepriepustná pre kvapalinu, a ktorá je pripojená k analyzátoru oxidu uhoľnatého. Pufry a roztoky môžu byť saturované na požadovanú účinnú koncentráciu a udržiavané na tejto hladine. Pre postupy, kedy je vyžadovaná perfúzia celého orgánu, tkaniva alebo bunkového preparátu, vopred pripravené saturované roztoky môžu byť lahko k dispozícii pre udržanie hladiny oxidu uhoľnatého. Ak hladina oxidu uhoľnatého poklesne, čerstvý roztok sa môže pridať, aby sa nahradil oxid uhoľnatý, o ktorý koncentrácia poklesla. Akonáhle je raz uskutočnená príprava orgánu, tkaniva alebo bunky, tiež môžu byť pre transport udržiavané v roztoku vo vzduchotesnom obale. Prítomnosť inertného plynu, hélia, spôsobuje účinnejší príjem oxidu uhoľnatého.

rcpicíe ošetrovanie m situ a ex vivo organov, tkanív a : nýon oamek oxidom uhoľnatým

Predložený vynález poskytuje spôsoby transplantácie tkanív a rolovanú alebo orgánov, tkaniva alebo tkanív, zhlukov buniek a/alebo izolovaných buniek. Spôsoby zahŕňajú krov., kedy sú pred transplantáciou orgány, tkanivá, zhluky buniek a/alebo izolované bunky exponované pôsobením kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý. Také expozície sa môžu uskutočniť in situ a/alebo ex vivo. Orgány, tkaniva a/alebo izolované bunky môžu byť exponované v atmosfére obsahujúcej plynný oxid uhoľnatý, alebo v tekutom prípravku obsahujúcom oxib uhoľnatý, ako je napr. tekutina na perfúziu, roztok na uchovávanie alebo roztok na preplacnovanre obsahujúci rozpustený oxid uhoľnatý, aí.ebo je možné použiť obidve možnosti.

Expozície orgánu aieoo tkaniva texutej kompozície obsahujúce oxid uholnatv sa môžu uskutočňovať ex vivo a/alebo in situ ktorýmkoľvek spcsooom známym v 'pozícii ibore. Tax napríklad sa môže uskutočňovať ex vivo v akejkoľvek komore alebo priestore, ktorý má dostatočný objem, aby mohli byť orgány alebo tkanivá, kompletne alebo čiastočne ponorené do kompozície/prípravku obsahujúceho oxid uhoľnatý. Ako ďalší príklad je možné uviesť, že orgán môže byť exponovaný prípravku obsahujúcemu oxid uhoľnatý tak, že sa orgán vloží do akejkoľvek vhodnej nádoby a príp vok obsahujúci oxid uhoľnatý sa nechá preplachovať nádobou s orgánom, takže orgán je vystavený kontinuálnemu prietoku pri pravku obsahujúceho oxid uhoľnatý.

Alternatívne orgán môže byť perfuncovaný príprav júcim cxrd uhoľnatý. Termín perfúzia a termíny c v odbore známe a uznávané a týkajú sa priechodu teku prípravku obsahujúceho oxid uhoľnatý, krvnými ciev alebo· tkaniva. Metódy pre per fundovanie orgánov ex situ sú v odbere dobre známe. Orgány môžu byť perfurm pravkom obsahujúcim oxid uhoľnatý ex vivo, napríkl xom obsahujdvodené sú tiny, napr. 'amí orgánu a i n dované príad pomocou zariadenia na kontinuálnu hypotermnú perfúziu (pozri Oxford Textbook of Surgery, Morris and Mált, Eds., Oxford University Press, 1994) . Voliteľne pri in situ alebc ex vivo perfúzii, orgány môžu byť perfundované premývacim roztokom, napr. UW roztokom bez oxidu uhoľnatého, pred perfúziou prípravkom obsahujúcim oxid uhoľnatý, aby sa odstránila darcova krv z orgánu. Taký postup by sa mohol použiť, aby sa zabránilo kompetícii o oxid uhoľnatý hemoglobínom darcu. Ďalšou voľbou môže prípadne byť použitie prípravku obsanujúceho oxid uhoľnatý ako prepiachovacieho roztoku. Vhodná kvapalina môže prechádzať rúrkami alebo hadičkami, ktoré umožňujú difúziu plynu, tieto rúrky alebo hadičky prechádzajú atmosférou obsahujúcou oxid uhoľnatý (napr. cez komoru, ako napríklad v prípade mimotelového membránového okysiičovacieho zariadenia) , aby sa vytvoril tekutý prípravok obsahujúci oxid uhoľnatý, ktorý sa potom môže podávať do orgánu (napr. perfundovať do orgánu tým, že sa rúrky alebo hadičky napoja na orgán).

Orgán aiebo tkanivo môžu byť umiestnené napr. tak, že sa ponoria do média alebo roztoku, ktorý neobsahuje oxid uhoľnatý, a takto; potom umiestnia do komory, kde je médium alebo roztok vystavený atmosfére obsahujúcej oxid uhoľnatý. Inak alebo okrem toho, oxid uhoľnatý môže prebublávať do média alebo roztoku. Expozície in situ môžu sa uskutočňovať akýmkoľvek spôsobom známym v odbore, napr. in situ zaplavením alebo perfundovaním orgánu tekutým prípravkom obsahujúcim oxid uhoľnatý (pozri Oxford Textbook of Surgery, Morris and Mált, Eds., Oxford University Press, 1994) .

Predložený vynález tiež predpokladá, že ktorákoľvek z metód alebo všetky skôr opísané metódy na vystavovanie orgánov alebo tkanív tekutému prípravku obsahujúcemu oxid uhoľnatý, ako je napr. premytie, ponorenie aiebo perfundovanie, sa môžu použiť v určitých transplantačných postupoch.

Predložený vynález ďalej počíta s tým, že môže byť pripravená aj ťahá alebo polotuhé kompozícia obsahujúca oxid u'nclnatý. Napríklad tekutina, ktorá je tekutou kompozíciou obsahujúcou oxid uhoľnatý, ako je opísané skôr, môže byt premenená na tuhú alebo polotuhú kompozíciu, ktorou potom orgán alebo tkanivo môžu byť pokryté alebc prevrstvené alebo do r.ej zaliate. Alternatívne polotuhá kompozícia obsahujúca oxid uhoľnatý môže byť vnesená do orgánu infúziou. Pevné alebo polotuhé kompozície môžu byť vytvorené napríklad pridaním stužujúceho činidla, ako je napríklad gelatinačné činidlo (napr. kolagén alebc alcinát;·, do tekutiny.

Tkanivové kultúry

Predložený vynález poskytuje tiež spôsob uchovávania alebo kultivácie živočíšnych buniex in vitro. Spôsob zahŕňa kroky, kedy sa poskytne .nádoba obsahujúca tlakový plyn obsahujúci plynný oxid uhoľnatý, poskytnú sa živočíšne bunky in vitro a tlakový plyn sa uvoľní do nádoby, kde vznikne atmosféra, ktorá obsahuje plynný oxid uhoľnatý. Živočíšne bunky sú potom kultivované alebo len udržiavané v prítomnosti atmosféry obsahujúcej plynný oxid unolnat ý.

Spôsob sa môže realizovať v akejkoľvek komore alebo v priestore vnodnom na vytvorenie atmosféry, ktorá obsahuje vhodné hladiny oxidu uhoľnatého. Také komory alebo priestory zahŕňajú napr. inkubátory, zmiešavacie nádoby a akékoľvek iné nádoby vhodné na kultiváciu alebo uchovávanie buniek, ako sú napríklad kultivačné flaše pre rotačné kultivačné zariadenie (rolery), ore tkanivové kultúry, ?etriho misky a skúmavxultivaone .ase ‘íklad sa môže použiť C0₂ inkubátor, kam je plynný oxid uhoľnatý dodávaný pri kontinuálnom prietoku z nádoby, xtorá obsahuje plyn. Ako ďalší príklad môže byť použitá kultivačná fľaša pre roľer, ktorá obsahuje atmosféru obsahujúcu oxid uhoľnatý vo vnútri fľaše.

Odborníkovi je zrejmé, že kultivačné podmienky, napr. teplota, sa môžu zvoliť a/alebo zmeniť v závislosti od typu buniek, ktoré majú byť kultivované (pozri napríklad Cells: A Laboratory Manual, Spector and Leinwand, Eds., Cold Spnng Harbcr Laboratory Press, Cold Spring Harbcr, New York, 1997). Napríklad myšia inzulinómová bunková línia βΤΟ3 (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) môže byť inkubované vo zvlhčovanej atmosfére 5% CCo/95% vzduch pri 37°C.

Živočíšne bunky môžu byť vnesené, napr. resuspendované alebo ponorené do tekutého média. Médium môže byť ktorékoľvek médium známe odborníkom, ktoré je vhodné na kultiváciu, konzerváciu alebo premytie požadovaných buniek (pozri napríklad Cells: A Laboratory Manual, Spector and Leinwand, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1997). K médiám takého typu patria, ale bez obmedzenia, rôzne pufry, Eagleovo minimálne esenciálne médium (MEM), Dulbeccom/Vogtom modifikované Eagleovo minimálne esenciálne médium (DMEM) alebo médium Roswell (Roswell Park Memoriál Inštitúte) inštitútu (RPMI). Také médiá môžu tiež obsahovať vhodné doplnky, napr. fetálne bovinné sérum (FBS), individuálne aminokyseliny, antibiotiká a/alebo vitamíny. Napríklad médium môže byť RPMI médium 1640 (Life Technologies, Grand Island, New York) doplnené 2 mM L-glutamínom, 100 U/ml penicilínu G, 100 U/ml streptomycínu a 10% fetáinym teľacím sérom (FCS) (Life Technologies). V takých uskutočneniach predloženého vynálezu, kde bunky sú v tekutom médiu, bunky môžu byť exponované kompozíciou obsahujúcou oxid uhoľnatý kontaktom tekutého média s tlakovým plynom obsahujúcim oxid uhoľnatý, napr. plynným oxidom uhoľnatým uvoľňovaným zo zdroja tlakového plynu spôsobom podlá vynálezu.

V ďalšom uskutočnení predloženého vynálezu je tekutým médiom samotná kompozícia obsahujúca oxid uhoľnatý, pripravená spôsobom, ako je tu opísané. Médium môže byť nasýtené oxidom uhoľnatým pred alebo po pridaní buniek do média.

J

Predložený vynález ďalej zahŕňa možnosť, že môže byť pripravené tuhé alebo polotuhé médium, kde toto tuhé alebo polotuhé médium je kompozíciou obsahujúcou oxid uhoľnatý. Napríklad tekuté médium, ktoré je kompozíciou obsahujúcou oxid uhoľnatý, ako je opísané skôr, môže byť premenené na tuhé aleoo polotuhé médium, ktorým môžu byť bunky pokryté alebo prevrstvené alebo ao neho zaliate. Taký postup môže byť uskutočnený napríklad tým, že sa do média pridá gelatinačné činidlo ako je napríklad kolagén, alginát alebo agar.

Použitie hemoxygenázy-i, zlúčeniny asociovanej s hemoxygenázou-i a ďalšej zlúčeniny pri Liečení

Predložený vynález ďalej zahŕňa indukciu alebo expresiu hemoxygenázy-i (HO-1) v spojení s podávaním oxidu uhoľnatého. HO-1 môže byť poskytnutá pacientovi prostredníctvom indukcie alebo expresie HC-1 u pacienta aleoo podávaním exogénnej HO-i priamo pacientovi. Termín indukovať, ako sa v tomto texte používa, znamená spôsobiť zvýšenú produkciu proteínu, napr. HO-1, v izolovaných bunkách alebo v bunkách tkaniva, orgánu alebo v živočíchovi, a síce s využitím bunke vlastného endogénneho (teca nie rekombinantného) génu, ktorý kóduje proteín.

HO-1 môže byť indukovaná n pacienta, napr. darcu a/alebo príjemcu, ktorýmkoľvek spôsobom, ktorý je známy v odbore. Napríklad produxcte HO-i môžu byť indukované hemínom, prctoporfyrínom a železom alebo kobaltom. Celý rad ďalších činidiel okrem nemu, ako sú napr. ťažké kovy, cytckír.y, hormóny, oxid dusr.atý, COCi₂, endotoxín a tepelný šok, sú tiež silnými induktormi HO-1 expre-

ste	Otteroeir. a	kol
27 9:	01029-	-L1037,	20
Biol .	15: S	+ 3 o - r	9 9 6
37:51	--551,	' C a 7 ,	• z
75:11	1-121,	1 97 0)
c i n i o	' s 1 ô	pcdmie	no k,

Am. J. Fnysiol. Lung

Ohol a kol., Am. J Mames, Annu. Rev.

Tenhunen a kol.,

Celí Mo

Respir.

Pharmacol

J. Lab.

. Physioi. Celí Rol.

Toxiool.

Clin. t/ed je tiež silne indukovaná celým radom ktoré spôsobujú oxidačný stres, vrátane napr. peroxidu vodíka, depletorov glutatiónu, UV žiarenia a hyperoxie (Ohol a kol., Am. J. Respir. Celí Mot. Biol. 15:

9-19, 1996; Naines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:517-554, 1997; a Keyse a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:99-103, 1989). Termín farmaceutický prípravok obsahujúci induktor HO-1 označuje podlá vynálezu farmaceuticky prípravok obsahujúci ktorékoľvek činidlo schopné indukovať HO-1 u pacienta, napr. ktorékoľvek z činidiel skôr opísaných, napr. hemi.n, protoporfyrín so železom a/alebo kobaltom.

Expresia HO-1 v bunke môže byť zvýšená prostredníctvom prenosu génu. Termín exprimovať, ako sa v tomto texte používa, znamená privodiť zvýšenie produkcie proteínu, napr. HO-1 alebo feritínu, v izolovaných bunkách alebo bunkách tkaniva, orgánu alebo zvieraťa tým, že sa využije exogénne dodaný gén (napr. rekombinantný gén). HO-1 alebo feritín je výhodne rovnakého biologického druhu (napr. človeka, myši, laboratórneho potkana a podobne) ako transplantačný príjemca, aby sa minimalizovala akákoľvek imunitná reakcia. Expresia môže byť riadená konštitutívnym promótorom (napr. promótorom z cytomegalovírusu) alebo tkanivovo špecifickým promótorom (napr. promótor génu pre mliečny proteín pre bunky prsnej žľazy alebo promótor génu pre albumín pre pečeňové bunky). Vhodný vektor na génovú terapiu (napr. retrcvírus, adenovírus, adenoasociovaný vírus (AAV) , poxvírus (vírus vakcínie), vírus humánnej imunodeficiencie (HIV), malý vírus myší, vírus hepatitídy B, chrípkový vírus, Herpes Simplex vírus 1 a lentivírusy) kódujúci HO-1 alebo feritín sa môže podávať pacientovi perorálne, inhaláciou alebo injekciou do vhodného miesta na liečenie rejekcie transplantátu. Najmä výhodné je lokálne podávanie priamo do darcovského orgánu, tkaniva alebo k bunkám, ktoré sa majú transplantovať, alebo do miesta transplantácie v príjemcovi. Podobne sa tiež môžu podávať plazmidové vektory kódujúce HO-1 alebo apo-feritín, napr. ako holá DNA alebo DNA v lioozómoch alebo v mikročasticiach.

ζ ϋ

Ďalej môže byť	exogénny	HO-1	protein	onamo poo	áivany
pacientovi akýmkoľvek	spôsobom	známym	v oobo	re. Cxogénuy	HO-1
môže byť priamo pocáva	ný okrem,	alebo	ako· alt	e r n a ť í v a , i n d	u to ie
alebo expresie .50-1 u	oacienta,	ako je	opísar	;é skôr. HC-1	pro-

teín môže byť podávaný pacientovi napríklad v lipozómoch a/aiebo ako rázny protein, napr. ako TAT-fúzny protein (pozri napr. Becker-Hapak a kol., Methods 24:247-256, 20001'.

Alternatívne alebo okrem toho, ktorýkoľvek z produktov metabolizmu HO—1, napr. bilirubín, biliverdín, železo a/alebo fert·tín, môže sa podávať pacientovi v spojitosti s oxidom, uhoľnatým alebo namiesto neho, aby sa zabránilo alebo sa liečil chorobný stav. Ďalej predložený vynález tiež predpokladá, že tiež molekuly viažuce železo iné ako feritín, napr. desferoxamín (DľO), dextrá.n železa a/alebo apoferitín, môžu sa podávať pacientovi. Ktorékoľvek zo skôr uvedených zlúčenín sa môžu pooávať pacientovi topicky a/alebo systémovo.

ľr e ž podlá p redlo ženého vynálezu pncnádza dc úvahy podávanie oxidu dusnatého (NO) pacientovi alebo do orgánov, tkanív a/alebo izolovaných buniek, v spojitosti s podávaním, oxidu uhoľnatého, HO-Í a/alebo zlúčenín asociovaných s HO-i. Tento postup zahŕňa poskytnutie NO darcovi, príjemcovi alebo organu, tkanivu alebo bunkám ex vivc, v spojitosti s podávaním HO-1 a/alebo ktoréhokolvek z produktov alebo všetkých produktov degradácie herni, napr. CO, biliverdínu, bilirubínu, železa a feritínu.

Termín oxid dusnatý (alebo NO), akc sa v tomto texte používa, označuje molexulárny oxid dusnatý v plynnom stave alebo rozpustený vo vodnom roztoku. Plynné kompozície/prípravxy oosahujúce NO sú typicky podávané inhaláciou hrtanom alebo nosom, do pľúc, kde NO môže uplatniť účinok priamo alebo je lahko absor-

bovan.y do	pacientovom	krvného obehu. Stlačený alebo	t lanový
plyn, napr.	NC (a/alebo	CO, ako je opísané podrobnejšie	s kôr i ,
použiteľný	v spôsoboch	podľa vynálezu, sa môže získať	z kto-

réhokolvek komerčného zdroja a v akomkoľvek type nádoby, ktorý je vhodný na uchovávanie stlačeného plynu. Ak je co potrebné, spôsoby podľa predloženého vynálezu môžu byť uskutočňované s použitím viacerých nádob obsahujúcich individuálne plyny. Alternatívne, CO a NO môžu byť zmiešané v jednej nádobe a zriedené, ak je to potrebné, inertným plynom.

NO na inhalačné podávanie je komerčne dostupný (napr. INOmax^Tty INO Therapeutics, Inc., Clinton, NJ) . Plyn sa môže získať od komerčného dodávateľa typicky ako zmes 203 až 800 ppm NO v čistom N₂. Zdrojom NO môže byť v podstate 100% NO alebo NO zriedený N₂ alebo ktorýmkoľvek iným inertným plynom (napr. hélium) na akúkoľvek požadovanú koncentráciu. Zásadné je, aby bol NO uchovávaný ako zmes bez akéhokoľvek kontaminujúceho 0₂ alebo vyšších oxidov dusíka, pretože tieto vyššie oxidy dusíka (ktoré môžu vznikať reakciou O₂ s NO) sú potenciálne škodlivé pre pľúcne tkanivá. Ak je to potrebné, čistota NO môže byť preukázaná chemiluminescenčnou analýzou, s použitím známej metódy, pred podávaním pacientovi. Chemilumínescenčné analyzátory pre NO-NO_X sú komerčne dostupné (napr. Model 14A, Thermo Environmental Instruments, Franklin, MA). Zmesi NO-N₂ sa môžu miešať s plynom, obsahujúcim O₂ (napr. 100% O₂ alebo vzduchom) tesne pred inhaláciou pacientom, s použitím napríklad kalibrovaného rctametra, ktorý sa predtým overil pomocou spirometra. Výsledná koncentrácia NO v zmesi na dýchanie môže byť overená chemickými alebc chemiluminescenčnými postupmi, ktoré sú odborníkom dobre známe (napr. Fontijin a kol., Anál Chem 42:575, 1970). Alternatívne koncentrácie NO a N0₂ môžu byť monitorované pomocou elektrochemických analyzátorov. Akékoľvek nečistoty, ako je napríklad NO₂, sa môžu odstrániť expozíciou k roztokom, NaOH alebo zmesi hydroxidu bárnatého a oxidu vápenatého alebo zmesi hydroxidu sodného a oxidu vápenatého. Ako výsledná kontrola zmesi plynov môže byť vyhodnocovaná aj koncentrácia FiO₂.

Farmaceutické kompozície/prípravky obsahujúce NO sa môžu podávať akýmkoľvek spôsobom, ktorý je odborníkom známy na podávanie plynov (plynných prípravkov) pacientom.. Bezpečné a účinné spôsoby podávania NO inhaláciou sú opísané napr. v patentoch úS č. 5 570 683 a č. 5 904 938 a publikácii Frcstell a kol., Circulation 83:2038-2047, 1991. Niektoré oríkiady spôsobov na podávanie plynov (ako napríklad CO) pacientom, sú ooŕsané podrobnejšie skôr a môžu sa použiť na podávanie NO. Príklady metód a zariadení, ktoré sa môžu použiť na podávanie plynných farmaceutických prípravkov obsahujúcich NO pacientom zahŕňajú dýchacie prístroje, tvárové masky a Stany, prenosné inhalátory, intravenózne umelé pľúca (pozri napr. Hattler a kol., Artif. Crgans 18(11): 806-812, 1934 a Golob a kol., A.SA.1O J., 47(5):432-437, 2001) a normobarické komory. A.však vlastnosti NO covolujú/vyžacuj ú niektoré modifikácie týchto metód. V nemocnici alebo núczovej poľnej situácii, podávanie plynného MC¹ môže byť uskutočnené napríklad tým, že sa pripojí nádrž stlačeného plynu obsahujúca NO v dusíkovej atmosfére a druhá nádrž obsahujúca kyslík alebo zmes kyslík/Nb (ako napríklad vzduch) k inhalátoru určenému na vytvárame zmesi plynov z dvocn zdrojov. Tým, že sa riadi prietok plynu z každého zdroja, môže byť koncentrácia NO inhalovaná pacientom udržiavaná na optimálnej hladine. NO sa môže tiež miešať so vzduchom z miestnosti, s použitím štandardných nízkoprietckových zmiešavacích zariadení (napr. 3ird Blender, Palm Scrings, CA) . NO sa môže tvoriť z N₂ a C₂ 'to znamená vzduchu) s použitím; elektrického generátora NO. Vhodný NO generátor je opísaný v patente US 5 396 882. Okrem toho NO sa môže prerušovane poskytovať z inhalátora vybaveného zdrojom NO, ako stlačený NO alebo elektrický generátor NO. Použitie inhalátorov môže byť zvlášť výhodné, ak je v spojení s NO podávaná, perorálne alebo inhaláciou, druhá zlúčenina (napr. inhibítor fosfodiesterázy, ako je opísané podrobnejšie ďalej).

Výhodne je vo farmaceutickej kompozícii obsahujúcej plynný NO koncentrácia NO v čase inhalácie asi 0, 1 ppm. až asi 300 ppm, napr. 0,5 ppm. až 250 ppm, 1,0 ppm až 28 0 ppm., opm až 250 ppm, ppm. až 200 ppm alebo 10 ppm až 100 ppm, vo vzduchu, v čistom kyslíxu alebo inom vhodnom plyne alebo zmesi plynov. Vhodná počianočná dávka pre NO podávané inhaláciou môže byť 20 ppm 'pozri napr. príbalcvú informáciu u prípravku INOmaxH a dávka sa mčše meniť napr. od 0,1 ppm do 100 ppm, v závislosti cd veku a stavu pacienta, ochorenia alebo chorobného stavu, ktoré sa majú liečiť, a ďalších faktorov, ktoré ošetrujúci lekár považuje za relevantné. Akútne, subakútne a chronické podávanie NO sú predpokladané podlá predloženého vynálezu. NO sa môže podávať paciencovi po nejaký čas (vrátane neobmedzeného) dostacočný na liečenie daného stavu a dosiahnutie zamýšľaného farmakologického alebc biologického účinku. Koncentrácia sa môže prechodne zvýšiť na krátky čas, napr. 5 minút, na 200 ppm NO. To sa môže uskutočniť keď je očakávaný okamžitý účinok. Výhodné časy expozície pacienca k NO zahŕňajú aspoň jednu hodinu, napr. aspoň šesť hodín, aspoň jeden deň, aspoň jeden týždeň, dva týždne, štyri týždne, šesť týždňov, osem týždňov, desať alebo dvanásť týždňov, aspoň jeden rok, aspoň dva roky a aspoň päť rokov. Pacient môže byť exponovaný k takej atmosfére nepretržite alebo prerušovane v priebehu takých časov. Podávanie farmaceutických kompozícií obsahujúcich NO (a/alebo CO) sa môže uskutočňovať prostredníctvom spontánnej alebo nútenej (mechanickej) ventilácie.

Keď je podávaný NO na inhaláciu, je potrebné, aby sa monitorovali účinky inhalácie NO. Takéto monitorovanie môže byť využité, najmä u konkrétneho jedinca, na overenie požadovaných účinkov a rozpoznanie nežiaducich vedlajších účinkov, ktoré by mohli nastať. Také monitorovanie je tiež užitočné na nastavenie vhodných dávok, času a frekvencie podávania inhaláciou NO danému j edincovi.

Plynný NO sa môže rozpustiť vo vodnom roztoku a použiť v tejco forme. Napríklad taký roztok sa môže použiť ako kúpeľ pre orgán, tkanivo alebo bunky ex vivo alebo sa môže použiť na perfundovanie orgánu alebo tkanív in situ. Roztok môže obsahovať ďalšie účinné látky ako napríklad ČO, HO-1, hem, biliverdm a/alebo bilíruoin.

Môže byť potrebné predĺžiť prospešné účinky inhalovania NO¹ u pacienta. Na určenie tcho, ako predĺžiť prospešné účinky inhalovania NO, je užitočné zvážiť, že jeden z účinkov NO m vivo je aktivácia rozpustnej guanylátcyklézy, čo stimuluje produkciu cGMP. Aspoň niektorý z prospešných účinkov NO môže byť výsledkom stimulácie biosyntézy cG.A'P. ľakže inhibítor fosfodiesterázy sa môže podávať v spojení s inhaláciou NO, aby inhiboval rozklad cGM? pôsobením endogénnej fosfodiesterázy.

Inhibítor fosfodiesterázy sa môže podať pacientovi akýmkoľvek vhodným spôsobom, vrátane cesty perorélnej, cez sliznicu, intramuskulárnej, subkutánnej alebc intraperitcneáinej. Alternatívne inhibítor môže byť tiež inhalovaný pacientom. Na inhaláciu je inhibítor fosfodiesterázy výhodne pripravený ako suchý prášok alebo ako roztok pre aerosól ale’im nebulizátor, ktorý má častice alebc kvapôčky veľkosti menšej 10 pm pre optimálne usadenie v alveoloch a prípadne sa môže inhalovať v plyne obsahuj úcom. NO.

Vhodným inhibítcrom fosfodiesterázy je napr. Zaprinast (M&B 2 2 948 , 2 - C'-propoxy f enyl - 8 - a zapur m - c- ón, Rhône - kou 1 e n c Rorer, Dager.ham Essex, UK) . Zaprinast selektívne inhibuje hydrolýzu cGMP s minimálnymi účinkami na rozkladanie z cyklického adenoz 1 nnr.onof os f átu v bunkách hladkého svalstva ciev (Trapani a kol., J Pharmacol Exp Ther 258:289, 1991; Harris a kol., J Pharmacol Exp Tner 249:394, 1989; bugnier a kol., Biocnem Pharmacol 35:1743, 1966; Souness a kol., Br J Pharmacol 98:725, 1989). Keď sa použije Zaprinast Zaprinast’) v súlade s predloženým vynálezom, výhodnou cestou je intravenózne aleoo perorálne podávanie. Rozsah vhodných dávok sa môže ľahko určiť odborníkom. Zásobný roztok Zaprinastu sa môže pripraviť v 8,05 N NaOH. Roztok sa potom. riedi Ringerovým laktátovým. roztokom na požadovanú výslednú koncentráciu Zaprinastu, tesne pred použitím.

Predložený vynález sa môže realizovať tiež použitím iných inhibítorov fosfodiesterázy. Rôzne inhibítory fosfodiesterázy sú v odbore známe, vrátane napr. Viagry® (citrát sildenafilu), dipyridamolu a teofylínu. Výhodný spôsob podávania a vhodné rozsahy dávok môžu byť určené odborníkom.

Podávanie NO s inhibítorom fosfodiesterázy sa môže uskutočňovať nasledujúcim spôsobom. NO je podávaný v koncentrácii 20 ppm vo vzduchu počas 45 minút. Na začiatku 45 minútového intervalu je podávaný 4 minúty intravenóznou infúziou Zaprinast, v dávke 1,0 mg na kg telesnej hmotnosti, po tej nasleduje kontinuálna infúzia 0,004 mg/kg/minúta po celý čas zostávajúci do 45 minút. Alternatívne je na začiatku 45 minútového intervalu podávaný 4 minúty dipyridamol, v dávke 0,15 mg na kg telesnej hmotnosti, a potom nasleduje kontinuálna infúzia 0,004 mg/kg/minúta po zvyšok 45 minútového intervalu. Zaprinast alebo dipyridamol je podávaný ako roztok vo fyziologickom roztoku.

V kontexte transplantácií predložený vynález ďalej predpokladá, že ďalšie postupy známe v odbore na zlepšenie prežívania/funkcie štepu sa môžu použiť spolu s postupmi opísanými v predloženej prihláške. K takým postupom patria, ale bez obmedzenia, imunosupresívna liečba a darcovsky špecifické transfúzie (DST) . Napríklad DST sa môžu podávať príjemcovi pred, v priebehu a/alebo po podávaní CO, HO-1, ďalších s hernom asociovaných produktov a/alebo NO príjemcovi. Také podávanie, napr. podávanie DST spolu s liečebným postupom opísaným v predloženej prihláške, môže sa uskutočňovať pred, v priebehu a/alebo po transplantácii.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Oxid uhoľnatý chráni oar.kreatické β-bunky pred apoptózou a zlepšuje funkcie/orežitie ostrovčekov po transplantácii u n k o v é kult ú r y

Myšia nesidiomová bunková línia βΤ03 (DSMZ, Sraunschweig, SPN) sa kultivovala v Dulbecovorr. modifikovanom uagleho médiu (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) doplnenom 2 mM L-glutamínom, 100 U/ml penicilínu G, 100 U/ml streptomycínu a 10% fetálneho teľacieho séra (FCS) (Life Technologies) a inkubovala vo zvlhčovanej zmesi 5% CO₂/95% vzduchu v 37°C. Táto myšia línia β-buniek, pochádzajúca z transgénnej myši nesúcej hybrid inzulín - promótor nádorového antigénu opičieho vírusu 40, je známa tým, že si zachováva vlastnosti diferencovaných β-buniek po asi 50 pasáž v kultúre. Bunky produkujú zrelý inzulín z proinzulinu I a II spôsobom porovnateľným s β-bunkami in vivo a sú indukcvatelné až na tridsaťnésobok glukózou (Efiat a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9037-41, 1983). V porovnaní s inou často používanou transformovanou líniou β-buniek, ako napríklad RIN-m5F alebo HIT, hladiny sekrétovaného inzulínu sú bližšie normálnym β-bunkám bunkovej línie pTC3. Takže tieto bunky sú užitočné pre výskum, regulácie a génovej expresie β-buniek (D'Ambra a kol., Endocrir.ology 726:2315-22, 1990).

Pankreacické Lar.cerhansove ostrovčeky myší C573L/6 sa dcdali z centrálneho laboratória na izoláciu ostrovčekov JosIinovho diabetoiogického centra.

Vitálne farbenie kryštálovou violetou βΤ€3 cunky sa vysiali v množstve 2 x 10³ buniek (Nunc, Marsh Products, Rochester, NY, USA) . Bunky sa premyli raz 500 μΐ PBS a zafarbili pomocou 200 μΐ 0,05% kryštálovej violeti v 20% etanolu počas 10 minút pri teplote miestnosti. Kryštálová violeta sa potom opláchla. K elúcii farbiva z buniek sa pridalo do každej jamky 100 μΐ 50% kyseliny octovej. 50 μΐ sa potom prenieslo do 96 jamkovej mikrotitračnej doštičky a vyhodnotilo na čítacom zariadení pre mikrotitračné doštičky (EL 340 Biokinetics Reader, Bio-Tek Instruments) na absorbanciu pri 562 nm.

Expresné plazmidy β-galaktozidázový expresný vektor (Clontech Laboratories, Palo Alto, Caiifornia) sa klonoval dc vektora pcDNA3 (Solo a kol., J. Irnmunol. 166:4185-4194, 2001) (Invitrogen, Carlsbad, Caiifornia). XhoI-HindlII fragment velkosti 1,0 kbp kódujúci kompletnú HO-1 cDNA laboratórneho potkana sa vyštepil z vektora prHO-1 (Shibahara a kol., J. Biochem. 113:214-218, 1993) a subklonoval do vektora pcDNA3.

Prechodná transfekcia

PTC3 sa vysiali v množstve 3 x 10⁵ buniek do 16 mm jamiek a transfekcvali počas 15 až 20 hodín s použitím činidla Lipofectamin Plus™ (Life Technoiogis) podľa inštrukcií výrobcu. Celková DNA sa udržiavala konštantná s použitím prázdneho vektora pcDNA3. Percento životaschopných buniek sa hodnotilo tak, že sa normalizovalo percento životaschopných buniek z každej DNA preparácie k počtu kor.zrolne transfekovaných buniek bez apoptotického podnetu (100% životaschopnosť) (Snares a kol., Náture Med. 4:1073-1077, 1998; Sato a kol., J. Irnmunol. 166:4185-4194, 2001) .

7-.

Prietoková cvtcmet:

(3TC3 bunky kultúry sa inkuboval.i s rekombinantným ľNF-ct (509 aiebo 10C0 b'/ni í R&D Systems) počas 24 hodí r. a kultúry ostrovčekov sa stimulovali ľNF-α (5000 U/ml (R&D Systems) a cyklchexarcidcm (CHX) (53 μο/ml! počas 48 hodín. βΤ03 bunky alebo ostrovčeky sa získali, disoeroovali, fixoval susoenoova_i v DNA :načiacom pufri (PBS, pH 7,4, obsanujúc

0,1 'ltC.O

X-1C3, 0,1 mM EDTA, 50 pg/ml propídiunjodid a 50 ^zml Rnasí

TACSCAN¹ softwarom Celí Quest^Trt (Bectcn Dickinson, Palo Alte, CA) . Bunky s normálnym obsahom DNA (2N) sa hodnotilo ako životaschopné, zatiaľ čo bunky s hypoplcidným DNA obsan (< 2N, označené Au) sa hodnotilo ako apoptotócké. Aby sa vyradil debris a apoptctické bezbunkové fragmenty, všetky signály s FL-2 profilom pod r.odnccou zodpovedajúcou jadrám. kuracích erytrocytov sa vylúčili z analýzy.

Ob s a n )NA

3 3Π3_νΖΟ\-^Γ3ί . T M na anaiyzí 'J V C ct V Θ Γ. O ľľ

Ošetrenie buniek a činidla

Myší rekombinantný TNľ-α (R&D Systems! sa rozpustil v PBS s 1% bovinným. sérevým albumínom a pridal ku kultivačnému médiu (17,5 ng/ml = 500 U) 24 hodín po transfekcii. Inhibítor kaspázy-3 2-DEVD-FMK a mhioítor kaspázy-8 IETD-CHO (Calbiocnem, San Diego, California) sa rozpustili v dimetylsulfoxide (DMSO, Sigma) a pridali ku kultivačnému médiu (10 μΜ a 1 μΜ v danom poradí) dve hodiny pred ošetrením s TNF-α. Protoporfyrín s cínom. (Sn.PPIX) (Porphyrin Products, Logan, Uoan) sa rozpustil (10 μΜ) v 100 nX NaOH a pridal 6 hodín po transfekcii ku kultivačnému médiu (50 μΜ) . inhibítor guanylylcyklázy 1H[1,2,4;oxadiazoi[4,3-ajcuinoxaiín-1 (ODQ, Calbiocnem) sa rozpustil v CMSC ku kultivačnému médiu (ICO μΜ) 6 hodín po transfekcii.

:πα;

.oo s-oromouanozin-o yklický monofosfát (3-Br-cCM?) (Sigma;

sa rozpustil vo vode a pridal ku kultivačnému médiu (10 μΜ) 30 minút pred indukciou apoptózy. Inhibítor proteínkmázy G KT5823 (Calbiochem) sa rozpustil v DMSO a pridal ku kultivačnému médiu (1,6 μΜ) 6 hodín po transfekcii.

CC expozícia

Bunky a ostrovčeky sa vystavili 1% oxidu uhoľnatému v stlačenom vzduchu doplnenom 5% CO₂, ako je opísané inde (pozri napr. Otterbeia a kel·., Xature Med. 6:422-428, 2000). Ostrovčeky sa inkubovali v RPMI médiu presaturovanom oxidom uhoľnatými (4°C cez noc, 1% CO, 5% CO₂) počas 2 hodín v 37°C, zatiaľ čo pokračovalo ošetrenie 1% CO, 5% CO₂.

Myši a indukcia diabetu

Samci C573L/6 sa zakúpili od firmy Charles River Laboratories (Xilmingtcn, Massachusetts) a chovali v súlade so smernicami NIK. Experimenty sa schválili ústavnou etickou komisiou pre experimenty sc zvieratami (Institutional Animal Čare and Use Committee (IACĽO). Príjemcovské myši (8 týždňov staré) sa zmenili na diabetické jednou intraperitoneálnou injekciou (220 mg/kg) prípravku Streptozotocin™ (Sigma) rozpusteného v nitrátovom, pufri. Myši dostali transplantát, ak zc vzorky plnej krvi bez hladovania sa získali 2 po sebe idúce glykémie vyššie ako 350 mg/dl.

Izolácia ostrovčekov

Pankreatické Langerhansove ostrovčeky (C57BL/6 myši) sa dodali z centrálneho laboratória na izoláciu ostrovčekov JDRF centra pre transplantáciu ostrovčekov Harvard Medical School, ako je opísané skôr (Gotoh a kol., Transplantation 40:437-438, 1985) .

Transplantácia syngénnych ostrovčekov marginálnej hmoty

250 ostrovčekov 25C až 250 μη v priemere sa ročne ooobralo s použitím preparačného mikroskopu. Ostrovčeky sa transplantovali do obličkového puzdra, ako je opísané skôr (Kaufman a kol., J. Εχρ. Med. 172:291-302, 1990). Z každého preparátu ostrovčekov sa transplantoval rovnaký počet kontrolných a liečených zvierat.

Analýza funkcie štepu

Funkcia štepu sa definovala ako bod (okamih), kedy sa dosiahol prvý z troch po sebe nepretržite idúcich dní, kedy glykémia bez hladovania bola < 200 pg/dl. Primárny výsledok experimentu sa definoval ako čas na dosiahnutie normálne] giykémie.

Štatistická analýza

Glykemické dáta sa zhrnuli akc priemerná nodnota ± smerodajná odchýlka pre súbory myší dostávajúcich neošetrené alebo ošetrené ostrovčeky. Čas na obnovu funkcie ostrovčekov sa vypočítal s použitím Kaplan-Meierových tabuliek prežitia a rozdiely medzí skupinami sa testovali s použitím log-rank testu, kedy tri preparácie ostrovčekov sa považovali za jednu samostatnú vrstvu v analýze, a je uvedená hodnota mediánu času na obnovu s 95% intervalom spoľahlivostí.

TNE-α indukuje apoptózu v bunkách βΤΟ3

Skúmal sa účinok TNF-α na βΤΟ3 bunny. Nasledujúce postupy sa použili na získanie údajov uvedených na oor. 1A-C.

Obr. IA: Bunky βΤ03 sa podrobili pôsobeniu zvyšujúcej sa koncentrácie TNE-a. Životaschopné bunky sa zafarbili 24 hodín po aktivácii kryštálovou videtou. Extmkcia sa merala pri 562 nm a hodnota sa normalizovala vzhľadoví na neošetrené bunky.

Obr. IB: Bunky βΤΟ3 sa podrobili pôsobeniu TNF-α, zafarbila propídium.j odidcm o 24 hodín neskôr a analyzovali na f ragmentáciu DNA (FACScan™) .

Obr. IC: Bunky βΤΟ3 sa kotransfekovali vektorom exprimujúcim β-gal (pcDNA3/3-gal) plus kontrolným vektorom (pcDNAô; . Ako je ukázané, bunky sa podrobili pôsobeniu inhibítora kaspázy-3 Z-DEVD-FMK (C3 — i) alebo inhibítora kaspázy-8 IEfD-CEO (C8-i) . Šedé stĺpce predstavujú neošetrené bunky a čierne stĺpce predstavujú β-bunky podrobené pôsobeniu TNF-α počas 24 hodín. Výsledky sú ukázané ako priemerná hodnota ± smerodajná odchýlka z hodnôt pre dve jamky vybraná z jedného z troch opakovaní experimentu .

TNF-α indukoval vysokú mieru bunkovej smrti u nesidiómovej bunkovej línii βΤΟ3, a síce spôsobom závislým od dávky (Stefens a kol., Endocrinology 140:3219-3227, 1999) (pozri obr. IA) . Fragmentácia DNA, preukázaná pomocou propídiumj odicicvého (PI) značenia (pozri obr. IB), vedie k predpokladu, že TNF-α indukuje smrť β-buniek prostredníctvom apoptózy. TNF-α sprostredkovaná apoptóza bola prísne závislá od aktivácie kaspázy-8 a čiastočne závislá od aktivácii kaspázy-3, ako je ilustrované zistením, že blokáda kaspázy-8 špecifickým inhibítorom kaspázy-8 (IETD-CHO) zabránila apoptóze (96% inhibícia), zatiaľ čo blokáda kaspázy-3 špecifickým inhibítorom kaspázy-3 (Z-DEVD-FMK) zabránila apoptóze len čiastočne (53% inhibícia) (pozri obr. IC) .

Oxid uhoľnatý chráni bunky βΤΟ3

Skúmalo sa, čí exogénny oxid uholnatý môže ochraňovať β-bunky pred apoptózcu (obr. 2A-C). Na získanie dát uveoených na obr. 2A-C sa použili nasledujúce postupy.

Obr. 2A: ukazuje, že exogénny oxid uhoľnatý môže nahradiť HO-1 (hemoxygenázu-1), keď je HO-1 aktivita zablokovaná. Bunky

βΤΟ3	sa kotransfekovali vektorom exprimujúeim β-gai plus konzrol-
n ýrn	vektorom exprimujúeim HO-1 (Hrouard a kol., i. Ξχρ. Med.
192:.	-815-1026, 2000i. Keď je to uvedené, enzpmaoieká aktivita
HO-1	sa inhibovala Sn-protoporfyrínom SnPPi . A xde je oo uvece-
né,	β-bunky sa exponoval;, exogénnemu oxidu onolnaoému VI, , ako
je c g	písané skôr (Oiterbeia a kel., P'aoure Meo. 6:022-428, 2800i.
preo;	Šedé stĺpiky predstavujú nsošeirer.é β-bunky a čierne stĺpiky stavujú β-bunky podrobené pôsobeniu VHF-α. Výsledky sú ukš-
Zäfx	ako priemerná hodnota ± smerodajná odchýlka z hodnôt pre dve
j	j vybraná z jedného z troch opakovaní experimerzu.
e X 0Z t	Obr. 2B: Ukazuje pomocou CHA zragmer.začre j analýzy, že urny oxid uholnatý chráni β-bunxy ored apopuozon. bunky βΤΟ3

sa podrobili pôsobeniu TNF-α. Priamo po stimulácii sa βΡΟ3 exponovali exogénnemu oxidu uhoľnatému počas 24 ncdín. Kontrolné βΤΟ3 sa ošetrili rovnakým spôsobom, ale bez exponovania oxidu uholna-

oému .	Po 2 0 k o o i n. á c h s a b u n, k v z a f a r b i 1 o r o o i c i u mn o d i o om a s na -
lyzc·.	žali na fragmer.táciu ONA porr.cccu PAOScarh'V
preo	Obr. 20 ukazuje, že exogénny oxid uhoľnatý chráni β-bunky apoptózou v neprítomnosti HO-1. βΤΟ3 bunky sa transfekovali
veko c	;rmi exprimujúcimi β-gal a vystavilo sa pôsobeniu exogénneho
O X 1 G _	uhoľnatého (Stefens a kol., Frdocrznology 74 0:3219 — 27,
i 9 9 9;	. Šedé stĺpce predstavujú neošetrené β-bunky a čierne stĺpce

predstavujú β-bunky podrobené pôsobeniu TNF-α alebo elopozid

ed _ Θ O C	; vystavené nedostatku séra (sérovej deprivécii), ako je
n vec e	;né. Výsledky sú ukázané ako priemerná hodnota ± smerodajná
odchj	oka z nodnôv pre dve jamky vycrar.ycn z jedneno z trocr. opa
k O X7 íg ’’	:í experimentu.
3 pCU Z	Ha hodnotenie toho, či expresia HO-1 chráni β-bunky pred ózou sprostredkovanou PNF'-op sa ourxy βΡ03 orechodr.s trans-
z e kou	•a t i exoresnvir. vektorom HO-1 a testová’1 i na - oh schconcsť

prežiť, keď sú vystavené pôsobeniu TNF-α. Expresia (overexpresia) HO-1 chráni βΤΟ3 pred apoptózou sprostredkovanou TNF-a (Pilegci a kol., Diabetes 50:1983-1991, 2331) (87% prežitie proti 33%~v kontrolnej vzorke) (pozri obr. 2A). Keď sa KG-i axcivita blokovala protoporfyrínorr. IX s cínom (SnPPIX) (Kaooas a kol., Hepatolcgy 4:336-341, 1994), antiapoptotický účinok sa innibovai (pozri obr. 2Ά) , čo vedie k predpokladu, že vytvorenie pomocou HO-1 aspoň jedného z koncových produktov hemového kstabolizmu, tc> znamená železa, bilirubínu a/alebo CO, je vyžadované jej antiapoptotickou funkciou.

Na základe hypotézy, že antiapoptotický účinok HC-1 je sprostredkovaný oxidom uhoľnatým, sa skúmalo, či expozícia exogénnemu oxidu uholnatémz by mohla nahradiť HO-1 pri ochrane β-buniek pred apoptózou. Keď bola aktivita HO-1 inhibovaná SnPPDC, expozícia oxidu uhoľnatému inhibcvala TNF-α sprostredkovanú apoptózu v podobnom rozsahu ako HO-1 (pozri obr. 2A) . Expozícia exogénnemu oxidu uhoľnatému sama mala ochranný účinok (11,7% apoptotických buniek proti 20,3% v kontrole, knorá nebola exponovaná k CO) , ako sa preukázalo DNA fragmentačncu analýzou (pozri obr. 2B) . Podobne apoptóza β-buniek indukovaná etopozidom alebo deficitom séra sa inhibovala expozíciou oxidu uhoľnatému (pozri obr. 2C).

Indukcia HO-1 u darcov a príjemcov viedla k dlhšiemu prežívaniu štepov ostrovčekov

Skúmalo sa, či indukcia HO-1 v darcoch a príjemcoch ochraňuje bunky v štepoch ostrovčekov. Na získanie dát znázornených v tabulke 1 sa použili nasledujúce postupy.

Pre experimenty sa ako model použili myši. Darcovia buniek ostrovčekov sa podrobili pôsobeniu protoporfyrínu s kobaltom (CcP?) (20 mg/kg) raz za deň pred izoláciou buniek ostrovčekov.

Príjemcovia štepov ostrovčekov sa podrobili pôsobeniu CoPP (20 mg/kg) raz za deň v oňocs. 1, 3, 5, 3 alebo čoFP (10 mg/kg) raz za deň v dňoch 1, 3, 5, 7, 5, 13, 13, 13 a 17. Podávanie CoPP indukovalo expresiu nemcxygenázy-1 (HO-1 j .

Tabuľka 1

Indukcia KO-I u darcov a príjemcof vedie k dlhšiemu prežívaniu štepov ostroveo kov

LiGCcľiis	O S ’C £ C kov	zče-	Deň	re j	e x c i e	Priemer r SP	Rej ekcia/ celkom
CoPP 20 mg/kg x 5	350' -	400	A ' t > 5	33, 3x2,	33, 48,	44,85 1 17,81	4/7
CoPP 10 mg/kg xlC	3 5 0 -	z] z hl Ό J	J 'J /	3 0 ,	> 51x2	40,5 r 12,12	2/4
?(ontrola . 1	3 50 -	4 CO	° l 16,	8, 22,	15, 15,	15,1 c 6,65	7/7

cré c udaj deň rejekcie uvádza ; Napríklad hodnota > 51 x 2 známe prežívali ešte po tí ohccn. Prieme zaný vc štvrtom, štipci. Tieto d_; vedie k dlhšiemu orešivar.iu ostrov ny eocet o; ta ukazujú, e rov oo tra stromčeky prežili, šeky u 2 príjemcov i rejekcie je ukáže indukcia HO-1 s d i a n t á c i í .

Exogénny oxid uhoľnatý chráni myšie bunky ostrovčekov pred apoptó zou

Skúmalo sa tiež, či exogénny oxid uhoľnatý chráni myšie bunky ostrovčekov pred apoptózou (pozri cor. 3) . Na získanie údajov znázornených na obr. 3 sa ooužili tasleduiúce oostuov.

Apopfóza sa indukovala u čers čekov (C575L/6) tým, že sa stimu CHX) . Priame· po stimulácii sa s exogénneho oxidu uhoľnatého počas sa cšetriii rovnakým. spôsoDom, ale r.atému. Po 4S hodinách sa bunky a: fragmentácia DNA. Tento experímeu vo izolovaných myších ostrovovali TNF-α a cykloheximidom trc’/čeuy vystavili pôsobeniu i hodín. Kontrolné ostrovčeky neboli exponované oxidu uhol.lyžovali pomocou FACScan*''¹ na sa vykonal ovaxráo s celkom zhodnými výsledkami.

Expozícia k oxidu uhoľnatému počas 24 hodín chránila izolované myšie (C57/BD6) ostrovčexy pred apoptózcu sprostredkovanou TNF-α plus cykloheximidom (CHX) (11,7% apoptotických buniek proti 20,3% v kontrole bez expozície CO), ako sa zistilo pomocou DNA fragmentačnej analýzy (pozri obr. 3).

Antiapoptotický účinok exogénneho oxidu uhoľnatého je sprostredkovaný aktiváciou guanylátcyklázy a signálmi cez cGMP-závislej proteínkinázy (cGK)

Skúmalo sa, či antiapoptotický účinok oxidu uhoľnatého pôsobí prostredníctvom aktivácie rozpustnej guanylátcyklázy (sGC) a vytvárania cGM? (pozri obr. 4A-C). Na získanie dát znázornených na obr. 4A-C sa použili nasledujúce postupy.

Obr. 4A: Antiapoptotický účinok exogénneho oxidu uholnatého je sprostredkovaný aktiváciou guanylátcyklázy. Bunky βΤΟ3 sa transfekovali vektormi exprimujúcimi β-gal a exponovali k exogénnemu oxidu uhoľnatému (1%) . Kde je uvedené, βΊΌ3 sa podrobili pôsobeniu inhibítora cuanylylcykiázy ODQ.

Obr. 4B: Analóg cGMP môže nahradiť oxid uholnatý v chrániacej funkcii pred apcptózou. Bunxy βΤΟ3 sa transfekovali vektormi exprimujúcimi β-gal a exponovali k exogénnemu oxidu uholnatému. Kde je uvedené, βΤΟ3 sa podrobili pôsobeniu cGMP analógu

8-Br-cGMP, ale neboli vystavené pôsobeniu oxidu uholnatého.

Obr. 40: Proteínkinázy závislé od cGMP (cGK) sprostredkovávajú antiapoptotický účinok oxidu uhoľnatého. 3unky βΤ03 sa transfekovali vektorom, exprimujúcim β-gal a exponovali k exogénnemu oxidu uholnatému. Kde je to uvedené, bunky sa podrobili pôsobeniu inhibítora proteínkinázy G KT5823 (KT). Šedé stípčeky v grafe predstavujú neošetrené βΤ03 bunky a čierne stípčeky

predstavujú βΤΤ3 burzu	,· podrobené pôsobeniu TMF-α. Výsledky sú
ukázané ako priemerná	hodnota ± smerodajná odchýlka z hodnôt pre
ove jamky vybranýcr z '	;ednéno· z trocn opakovaní experimentu.
Skúmalo sa tiež,	či antiapoptotický účmcu oxidu uhoľnatého
o a scoí prostredníctvo	m aktivácie rozpustnej ouanyiátoyuíázy
a tvorby cGMP, akc je	opísané pre fibroblasty íPetrache a kol.,
Am. u. Physiol. Lung	Celí Mol. Physiol. 23 8: L3Í2-319, 2000; .
^nnioicia a xt r vi t v so	C u oxadiazolochinoxalínu ýOPQ) potlačila
ant íapoptoti c ký účrno 3	; CO, čo vedie u domierke, že rozpustná
cuanvlátcvkláza že hl	avnv mediátor ore oxid uhoľnatú v tomto

xDerimentáinom systéme (Dozri obr. 4A; . CGK aktivétor/anaióg

cGMP, 8-Br-cGMP, potia:	šil apoptózu β?23 buniek v rozsahu podobnom
tomu, aký sa pozoroval	_ ore oxid uhoľnatý mozri obr. 4B) · tiež
tohibícia cGMP-závisl:	tj oroteínkmázy špecifickým- inhibítorom
3.C58 2 3 potlačila antia	ooptctický účinok exogénneho oxidu uholná-
tého ípozri obr. 1G),	čo vedie k predstave, že antiapoptotický
účinok oxidu uhol na té	ho je sprostredkovaný aktiváciou jednej
alebo niekoľkých cGMP-:	závislých proteínkirtáz .
exogénny oxid unclnat	ý poskytuje antiapoptotícxú ochranu pri

č znych po s t ococh

Skúmala sa trež s

ichoonosť oxidu uhoľnatého chrániť β-bunky

o indukcii apoptózy (pozri obr. 5A-C). Na získanie údajov uveených na obr. 5A-C sa použili nasledujúce postupy.

	f ----- — J — — v- ----- - - - J .
Obr. SA: Jednohod.	mova expozícia oxidu uhoľnatému te dcsta-
točná na to, aby zabrš	•r.iia apoptóze. pTC3 sa uransfekovali vek-
turmi exprimujúcimi β-ς	jäl. Apoptóza β-buniek sa indukovala TNF-a.
ľnnec oo aktivácn TNF·	-a sa bunky exDoncvali 1% oxidu uhoľnatému
to rôzne dlhý čas (C	az zl h.ociíi i . Kontio_ué βΤύο sa podrobil—
tcvnakému ošetreniu,	ale neboli exponované oxidu uhoľnatému.
Prežívanie buniek sa ui	movalo 21 hodín po aplikácii TNF-α.

Cer. 53: Oxid uhoľnatý chráni β-bunky po indukcii apoptózy. βΤΟ3 sa transfekovali vektormi exprimujúcimi β-gal. Apoptóza β-buniek sa indukovala TNF-α. Po reznom čase (0,5 až 12 hodín, ako je ukázané) sa βΤΟ3 vystavili pôsobeniu 1% oxidu uhoľnatého (Otterbein a kol., Nat. Med. 6: 422-428, 2000). Kontrolné βΤ03 sa ošetrili rovnako, ale neboli exponované oxidu uhoľnatému. Prežívanie buniek sa určovalo 24 hodín po podaní TNF-oc.

Cor. 50: Preinkubácia s oxidom uhoľnatým zabraňuje apoptóze β-buniek. βΤ03 sa transfekovali vektormi exprimujúcimi β-gai. Apoptčza β-buniek sa indukovala TNF-α. βΤΟ3 sa preexponovali 1% oxidu uhoľnatému počas jednej hodiny. Kontrolné βΤΟ3 sa ošetrili rovnako, alebo nebcli vystavené pôsobeniu oxidu uhoľnatého. 1 až 6 hodín po ukončení preexpozície sa apoptóza indukovala aplikáciou TNF-α. Šedé stĺpce v grafe predstavujú neošetrené β-bunky a čierne stípčeky predstavujú β-bunky podrobené pôsobeniu TNF-a. Výsieoky sú ukázané ako priemerná hodnota ± smerodajná odchýlka z hodnôt pre dve jamky vybraných z jedného z troch opakovaní experimentu.

βΤΟ3 sa vystavili pôsobeniu oxidu uhoľnatého po rôzny čas (1 až 24 hodín) ihneď po pridaní TNF-cc a vyhodnocovali na apoptózu o 24 hodín neskôr. Jedna hodina expozície oxidu uhoľnatému bola dostatočná na to, aby zabránila apoptóze β-buniek (pozri obr. 5A) .

Na zistenie toho, či expozícia oxidu uhoľnatému môže blokovať prebiehajúcu apoptózu, sa β-bunky na jednu hodinu vystavili pôsobeniu CO, a to 0,5 až 12 hodín po indukcii apoptózy podaním TNF-α. Dokonca aj keď sa exponovali až dve hodiny po TNF-cc stimulácii, oxid uhoľnatý bol ešte schopný potlačiť apoptózu β-buniek (pozri obr. 5B).

Na zistenie echo, či preinkubácia s oxidom uhoľnatým chráni

J 4

-bunky pred apoptézou, sa ýTC3 vystavili pôsobeniu oxidu uhoľná

téhc počas (	3, o az u hodiny prea indukciou apoptczy.
Ceonohc	;dinová preinkubácia v prítomnosti oxidu uholnatéh
o o - a sc s t a t;	očné na prevenciu apoptczy β-buniek ‘dáta nie sú uká
zané( . Na v'	yhcdnotenie toho, ako dlho by tento účinok trval, ke
o y sa čas	meozí preir.kubácicu a apoptotickým cocnetom prsti
žoval, sa β·	-bunky oreexponovali jednu hodinu CC, a síce jednu a
Š β 5 TL T O 01 Π	pred indukciou apcptózy aplixáciou TNT-α (pozri obr
5C). jedna	hodina preinkubácie s oxidom: uhoľnatým inoinova3
apoptózu β-ί	šuniek stimulovanú TNF-α dokonca dve až tri hodiny p

ukončení j ecnohodinove j expozície oxidu uhoinatém

ľ i e t o	dáta ukazujú, že relatívne krátke ošetrenie oxido:
uhoľnatým	rôže pôsobiť antiapoptotickýir. spôsobom, a že tot =
anti apootot:	.oké pôsobenie bude pretrvávať dlhý tas.
Vystavenie r	rysích ostrovčekov pôsobeniu oxidu uhoľnatého zlepšu-
je prežívam	.e/funkciu ostrovčekov po transplantácii
.na z l s .	ženie, či by oxid uhoľnatý mohol tiež zlepšiť funkcii
štepov ostrc	svčekev m vivo, marginálna hmota 250 ručne vytriete-
ných ostrove	íekcv sa transplantovala do syngénneno systému, móde)
pre primám	nefunkčnosť (Berr.ey a kol., Transplantát ton 7 3.
125-32, 200Ž	Í, Kaufman a kol., Diabetes 43: 773-83, 1994). Trans-

plantécia marginálneho (napr. suboptimálneho) množstva ostrov

čekov C'ma r	ginálna hmota) do diabetického syngénneho prijeme;
spôsobí zdr:	žanie v návrate k normoglykémii, oez toho aby spôso-

bila rejekciu alebo vypuknutie autoimúnneho ochorenia.

určenie t o h c	aká by bola marginálna zimota ostrovčekov v syngén-
ΠΟΓΓ S V S ~ S ΓΓΪ A	C57/3L6, sa pozorovalo, že transplantácia 50C odob-
ratvo n ostrc	jvčekev do obličkového puzdra príjemcu viedla k rých-
lemu návratr	: k normoglykémii (1,5 n 0,5 dňa (n = 4) ) , zatial čc
transplantát	:ia 2 50’ ostrovčekov viedla k významnému oneskorení;

ako marginálna hmota. Použitie marginálnej hmoty týmto spôsobom nezahŕňa rejekoiu ani opakovanie autoimunitného ochorenia (Berneyet a kol·., Transpiantation 71: 125-132, 2000) .

Tiež sa skúmalo, či preinkubácia štepov ostrovčekov s oxidom uhoľnatým pred transplantáciou vedie k lepšej funkcii in vivo (pozri obr. 6A-B) . Na získanie dát znázornených na obr. 6A-B sa použila nasledujúce postupy.

Obr. 6A: 250 čerstvo izolovaných a vytriedených ostrovčekov z myší C573L/6 sa inkubovaio v médiu presaturovanom 1% oxidom unoľnstým počas 2 hodín pri 37°C. Kontrolné ostrovčeky sa ošetrili rovnako, ale sa neexponovali k oxidu uhoľnatému. Ostrovčeky sa transplantovali pod obličkové puzdro diabetických syngénnych príjemcov, ako je opísané skôr. Po transplantácii sa denne sledovala hladina krvnej glukózy. Celkovo sa transplantovalo 16 zvierat (8 s preexponovanými ostrovčekmi, 8 kontrolných). Jedno zviera, ktoré dostalo preexponované ostrovčeky uhynulo 3. deň bez expozície z technických dôvodov a zahrnulo sa v štatistickom rozbore ako zviera so skrátenou životnosťou. Primárnym koncovým bodom týcnto experimentov bol prvý deň normoglykémie. Dáta sú ukázané ako priemerná hodnota ± smerodajná odchýlka.

Obr. 6B ukazuje pravdepodobnosť zotavenia (glykémia nižšia 2G3 mg/'dl) pre zvieratá, ktoré dostali ostrovčeky preexponované oxidu uhoľnatému alebo kontrolné ostrovčeky. *? = 0,001 proti kontrole.

Na základe pozorovania, že účinky pôsobené oxidu uhoľnatého pretrvávajú po dlhý čas (pozri obr. 5A a B) a že relatívne krátka preexpozícia oxidu uhoľnatému (pred tým, ako je aplikovaný apoptotický podnet) má antiapoptotický účinok (pozri obr. 50), sa vyhodnocovalo, či preexpozícia ostrovčekov pôsobené oxidu uholnatého môže zlepšiť prežitie a/alebo funkciu ostrovčekov po transplantácii. Marginálna hmota ostrovčekov sa transplantovala pod obličkové puzdro diabetických syngénnych príjem-

0 0

cov. Čas potrebný na	dosiahnutie r.ormocľykémie sa skrátil vysoko
významným spôsobom í t	' = 0,0011), keď sa ostrovčeky premKubovali
počas dvocn hodín	7 médiu presaturovenom oxidom uhoľnatým (7
dní, 95% interval s	n oľahltvost i: 6-S oní;, v nerovnaní s kon-
trol.oými ostrovčekmi!,	ktoré sa nepreexoonovair oxidu urcinatému
í 14 dní, 95% interva	1 spoľahlivosti 12-18 dní) (pozri obr. 6; .
Celkovo sa použili	tri rôzne preparáty ostrovčekov pre tieto
experimenty. Nebol ;	riadny štatisticky významný rozdiel v čase
dosiahnutia ncrmcgl	rkémie pre tieto tro rôzne preparáty

P > 0,25

Expozícia oxidu uholn	atému
Na experimenty :	s tkanivovými kultúrami sa použil 5% CO2 r.a
pufrovanie. CO v 1%	koncentrácii (tc znamená áOOOO ppm) v st]a-
čenerr, vzduchu sa pre	a aplikáciou do expozičnej komory miešal so
stlačeným vzduchom	end s alebo bez CCp v zmiešavacej nádobe
z nerezovej ocele.	Prietok dc komory pre zvieratá s objemom
0,10a mJ (3, 7C kockor	•ej stopy) z plexiskla sa udržiaval na hod-
note 12 1/minútu a c	io komory pre tkanivové kultúry s objemom
0, 0 34 m/ í 1,2 kockové	- stopy) na prietoku 2 1/minútu. Komora pre
tkanivové kultúry sa	zvlhčovala a udržiavala na teplote 37°C. CO
analyzátor ŕlnterscar	Chatsvrorth, CA) sa použm na Kontinuálne
meranie CO hladiny v	komorách. Vzorky plynu sa odoberali analy-
zátorom otvorom vo '	reku romory rýchlosťou 1 1/mrnúta a analy-

zovali elektrochemickým detektorom s citlivosťou 10-500 ppm

Koncentrácie sa merí	iii •edenkrát za hodinu. Akc.náhle sa raz
komory ekvilibrcvali	(asi za 5 minút) , neboli už žiadne
fluktuácie v koncentr	a o i a c .n o C .
Zvieratá sa vysz	navili zmesi obsahujúcej > 98% O2 aiebo 98%
O-. - CO pri prietoku	; rýchlosťou 12 1/mrnúta v Komore s objemom
0,03 4 mč (1,2 kockové	stony) z plexiskla. Zvieratám sa podavšia
p O 3 3 3 V 3 3 VOda V p 3	rebeku expozície. CO v 1% koncentrácii
(10000 ppm) v stlačer.	om vzduchu sa miešal s > 93% C? v zmiešava-

cej r.ácobe z nerezovej ocele pred tým, ako vstúpil do' expozičnej komory. Koncentrácie dodávané do expozičnej komory sa riadene regulovali tým, že sa menila prietokové rýchlosť CO do zmiešavacej nádoby. Pretože prietoková rýchlosť sa primárne určila prietokom. 0₂, len prietok CO sa menil, aby sa pripravili rôzne koncentrácie podávané do expozičnej komory. Koncentrácia 0₂ v komore sa merala pomocou plynového spektrometra.

Postup izolácie buniek

Nasledujúci príklad ukazuje postup/protokoi použitý na izoláciu buniek ostrovčekov z laboratórnych potkanov alebo myší. Jedna liekovka prípravku Liberase™ z laboratórneho potkana (od firmy Boehringer Manheim/Roche, katalógové č. 1815032) sa rozpustila v 4 ml sterilného HBSS, ochladila na ľade počas 30 minút, rozdelila do alikvótov po 0,5 ml a uložila do -20°C. Ku každému 0,5 ml alikvótu sa potom pridalo 33 ml média, napr. M199, HBSS alebo RPMI 1640 bez teľacieho séra.

Laboratórne potkany sa predávkovali anestetikom (Nembutol i.p., 0,1 plus 0,1 ml/100 g telesnej hmotnosti) . Pre myši sa pripravili 3 ml injekčné striekačky s 2 ml roztoku Liberase s ihlou veľkosti 27 ohnutou v uhle 90°. Pre chirurgický výkon sa použilo 2 nožníc, jedny veľké na nastrihnutie brucha a jedny malé na odstrihnutie žlčovodu. Dve pinzety sa použili na excíziu slinivky. Jeden hemostat sa použil na zasvorkovanie žlčovodu.

Brušná dutina sa otvorila a slinívka sa maximálne exponovala tým, že sa vykonal zospodu brucha rez tvaru V. Vývod slinivky sa zasvorkoval (hemostatom u laboratórneho potkana alebo malou bulldog svorkou u myší) v mieste vyústenia do dvanástom! ka, s ohladom na to, aby sa nepoškodilo okolité pankreatické tkanivo. Žlčovod sa izoloval na proximálnom konci. Tuk sa odsrránil pred tým, ako sa vsunula kanyla, opatrne tak, aby nedošlo k prepichnutiu vrátnice (portálnej žily) . Vývod sa nastnnol malými nožnicami v jednej tretine naprieč a kanyla sa vložila do vývo-

du. Kanyla sa pridržiavala vo vývode 1,	ankým stlačením pinzetou.
Roztok Lioerase sa inmikovai rýchlo. :	S1inivna vyzerala, že je

nafúknuté a plne rozšírená po mjikcvaní 6 m.L tekutiny. ^rJ myší sa do vývodu vsunula ihla ako najviac to bolo možné proximáine k pečeni, a roztok Lioerase sa injikoval. Laboratórne potkany

alebo myši sa potom utratili tak, že	sa im prestrihla bránica
a srdce alebo aorta.

?o infiltrácii Lioerase sa sliní'/	5<a odstránila, začínajúc
oddelením, od čriev, potom, žalúdka a n	.akoniec sleziny. Keď sa
siinivka spojila len žlčovodom, odrezal	.a sa a vybrala z labora-

tórr.eho potkana. Siinivka sa potom vložila do 50 ml kónickej skúmavky a umiestnila do vodného kúpeľa s 31⁰C na čas 30 minút.

Po inkubácii sa do každej skúmavky pr:	.dalo 20 ml média + NOS.
Zvyšok izolácie sa dokončil na ľade. S«	'únavný sa treoaii ručne,
dôkladne počas 5 až 10 sekúnd, aby	došlo k rozpadu tkanív.
Ostrovčeky sa niekoľkokrát premyli, ab;	y sa oostráuila Liberase
v klinickej centrifúge pri 8 00 rpm. (a	si í 80 x g) počas 12 0
sekúnc. aiebo pri 1200 rpm (asi 200 x g;	počas 9 0 sekúnd, aby sa
odstránila Liberase. Suoernatant sa zi:	.al oreó a on dalo sa 2 5

až 35 ml média a jemne pretrepalo ua vortexe (asi 1/2 maxima

Krok oentnfugácie sa opakoval, nasiec	levaný premytím, 2 až 3
krát. Tkanivo sa resuspendovalo v 20	m 1 m e dia a suspenzia sa
filtrovala cez drôtenú sieťku s pri	.em.eron 4 00 pm. (Thomass
Scientific, rn.esh 3 5, katalógové č. 8 32 1	-M22;, aby sa odstránilo
zvyšné nerczvclnené tkanivo, tuk a lýmf	a. Ďalších 5 až 10 ml sa
oridalo do skúmavxy r.a odmvtie akýchkcl'	zek zostávajúcich ostrov-
čekov a vykonalo· sa filtrovanie sieťkou.

Bunky sa peletovali cer. trif ugáci	.ou pri 1200 rpm počas
90 sekúnd. Supernatant sa odstránil, pi	:itom sa nechalo len tak
málo média, akc to coio možné.

Ka prípravu pradienta sa pelet res	uspencoval v 10 až 15 mi
Kistcpaque lOTlO^' f Sigma, katalógové 1	í. K IOU) a vortexe val,

pokiaľ sa dosiahla homogénna suspenzia hovmko ako pri oplachovaní) . 10 ml média sa prevrstvilo, cez NCS, ale opatrne, aby sa zachovalo ostré rozhranie medzi Histopaque a médiom. Médium sa pridávalo pomalým pipetovaním po stene skúmavky. Gradient sa stočil počas 20 minút pri 2400 rpm (900 g) v 10°C, s velmi pomalým zrýchlením a žiadnym; brzdením.

Po centrifugácii sa vrstva ostrovčekov odobrala z rozhrania 10 ml sérologickou pipetou (Falcon) na jedno použitie a preniesla do 50 ml kónických skúmaviek. Ostrovčeky sa premyli niekoľkokrát pridaním 25 až 35 ml média + NCS, aby sa odstránil Histopaque. Začiatočná centrifugácia sa uskutočňovala pri 1200 rpm počas 2 minút, ale ďalšia centrifugácia sa uskutočňovala počas 90 sekúnd. Po 3 premytiach sa ostrovčeky resuspendovali pomocou pipetcvania hore a dole. 7 až 10 ml z každej vzorky sa nanieslo na 60 mm sterilné kultivačné misky, aby sa mohol uskutočniť výber. Výber ostrovčekov sa uskutočňoval pomocou 100 μΐ sterilnej pipety pod mikroskopom. Každý ostrovček sa vybral individuálne a venovala sa starostlivosť tomu, aby sa pritom vyhlo akémukoľvek ďalšiemu tranivu. Vybrali sa len tie ostrovčeky, ktoré mali priemer v rozsahu 50 a 225 pm a mali hladký guľatý alebo oválny tvar.

Príklad 2

Oxid uholnatý inhibuje rejekciu pri transplantáciách srdca z myší do potkana

Zvieratá

Srdcia myší BALB/C sa použili ako darcovské orgány na transplantáciu do inbreoných dospelých samcov laboratórneho potkana

Lewis (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN). Zvieratá sa chovali podľa smernice Americkej asociácie pre starostlivosť o laboratórne zvieratá a všetky výskumné protokoly sa schválili výbormi p:

starostu vost o zvierí

ZV1Í

Israel Deaconess Medical Center

Chirurgickú vodí

Zvieratám sa pc .a anestézia kombinác fiuránu (sitman-Moore, Mundeiair., IL ) a i.o. (Aboott, Sever Cbicago, IL) v dávke 30 až 50 mg, všetkých postupov. Heterotcpické srdcové transpian ako je opísané skôr (Berk a kel., Ph 001, Petrova a kol., tocnovai:

S 9 5 -10 3 0,

Bic dtem.

a^acie metoxyoentcoaroita1; -'kg v priebeh; tácie sa tsku ysioi Rev. S c76; /9327936,

2001) . Prežívanie štepu sa hodnotilo denne palpáciou. Rejekcia sa diagnostikovala zastavením komorových sťahov a toiogickým vyšetrením.

Experimentálne činidlá

Faktor kobrieho jedu (CVF, ktorý blokuje aktiváciu korrplementu) (Quidei, San Ciego, CA) sa podával i.o. v deň -) (60 U/kg) a v ceň 0 /20 U/kg) vzhladom ku dáv (deň C) . Cyklosporín A (CsA, Novartis, Basilej ktorý blokuje aktiváciu T lymfocytov, sa podáva) ; r a n s p i a n t a c i e

Švajčiarsko), .m. 15 mg/kg) .nachom 0 a ootom denne až do konca každého exoerimen* s rot ορo r1 y r i n s ci nom ( C o PPIX) a pro topor ŕy r í r. duet s, Loga n, CJT) sa zriedi (SnPPIX), protoporfyrín s kobaltom so železom (EePPlX) (Porphyrin Prov 10C mM NaOH na ou mm zasocny roztok a až do použitia uchovávali pri -7C^,OC. Expozícii svetlu sa čo možno najlepšie zabránilo. Ako SnPPIX tak EePPIX sa podával i.o. (30 μΜ/kg) v PBS. FePPIX a SnPPIX sa podali darcovi v dni -2 a -i (30 μΜ/kg) a príjemcovi v deň transplantácie (deň 0) a potom denne (30 μΜ/κα).

expozícia

Stručne, CO v II koncentrácii (10000 ppm) v stlačenom vzdu61 chu sa miešal s vyváženým vzduchom (21% kyslíka) v zmiešavacej nádobe z nerezovej ocele pred tým, ako sa priviedol do expozičnej komory. Koncentrácie CO sa riadili meniacim sa prietokom CO v zmiešavacom vaici pred aplikáciou do komory. Pretože prietoková rýchlosť je primárne určená prietokom 0₂, menil sa len prietok CO, aby sa pripravila výsledná koncentrácia CO dodávaná dc expozičnej komory. CO analyzátor (InterScan Corporation, Chatsvorth, CA) sa použil na kontinuálne meranie CO hladiny v komore. Darcovia štepu sa umiestnili v CO expozičnej komore 2 dni pred transplantáciou. Príjemcovia štepu sa umiestnili v expozičnej komore ihneď po transplantácii a udržiavali sa v expozičnej komore počas 14 (n = 3) alebo 16 (n = 3) dní. CO koncentrácia sa udržiavala na 250 až 400 ppm pre všetky zvierará. Zvieratá sa denne vyberali z komory, aby bolo možné zhodnotiť prežitie štepu a podávať CsA, SnPPIX alebo FePPIX, ako je opísané skôr.

Enzymatická aktivita HO

Enzymatická aktivita HO sa merala ako tvorba bilirubínu v mikrozómoch srdca a pečene. Zvieratá sa utratili a pečeň a srdce sa prepláchli ladovc chladným PBS a zmrazili v -70°C až do času, ako sa použili. Orgány sa homogenizovali v štyroch objemoch sacharózovéhc (250 mM) Tris-HCl (10 mM/Ι) pufra (pH 7,4) na lade a stočili (28000 rpm 3 x, 20 minút, 4°C). Supernatant sa stočil (105000 rpm 3 x 60 minút, 4°C) a mikrozomálny pelet sa resuspendoval v pufri MgCl₂ (2 mM) - fosforečnan draselný (ICO mM) (pH 7,4) a sonikoval na lade. Vzorky (1 mg proteínu) sa pridali do reakčnej zmesi (400 μΐ) obsahujúcej cytcsol pečene laboratórneho potkana (2 mg proteínu), hemín (50 μΜ) , glukózo-5-fosfát (2 mM) , giukózo-6-fosfátdehydrogenázu (0,25 U) a XADP.H (0,3 mM) počas 60 minút pri 37 ° C v tme. Vytvorený biíirubín sa extrahoval chloroformom a merala sa optická denzita, OD, pri 4 64 až 530 nm (extinkčný koeficient, 40 mM/cm pre bili6 ubín) . Enzýnr.cvá aktivita je vyjadrené v pikcróioch vzniknutého iiirubínu vytvoreného na i miligram proteinu za 60 minút prr.ol/mg/h) . Koncentrácia proteinu sa určila pomocou oroteínovéo testu s bicíncncnínovou kyselinou (Pierce, Gectgecevn, . Ea-

:áir.a hodnota (pozadie) beda asi 5 pmol/mg/)	h. Vsemy činidlá
:oužité v tomto teste sa kúpili od firmy Sigm;	a (St . úotis, MC) ,
.k nie je uvedené mak. Karboxyhemogiobín s	a meral 2 en po
ran.scdantácri s použitím analyzátora krvných	cdynov Corning 865
Clinical Chemistry, iassacnusetts General	Eospital, Boston,

.istomorzometrocka analýza
Štepy sa odobrali 3 dní po transplantácii	, vložili oo para-
ínu, fixovali vc formalíne a sériovo narezali	(5 μη) m toto od
pexu k báze. Desať rezov sa umiestnilo n.a jed	n.o s klí čko, ce 1 kom

si 20 až 25 sklíčok. Každé piate sklíčko sa zafarbilo hem.atoxyínomi a eczínom (H & F,) pre hi stomorfometrickú analýzu. Dva

bra z ky pre každé sklíčko sa urobili s použití:	n mikroskopu Nikon
elipse Ε6000ΓΚ (Nikon, Melville, NY) spe	jeného· s farebnou
itachr 3-CCD kamerou (model HV-C23, Brtacn	11, i o .< y 0 / c 3päo ,!
počítačom Power Mecintosh™ 7300/20C (Apple	Computer, Cuper-
ino, CA') vybaveným soŕtwarcm IFLA3 Spectrum t	;re digitálne zob-
azovanie (Signál Analytics Corporation, Viennm	i, VA) . Asi ä·Q ob-
azov sa urobilo pre každé transplantované	srdce z dvoch až
roch zvierat z každej skupiny. Obrazy sa a	fi -3 J_ '7 2 O V3 J_ 1 3 '3 Č Π O U
egmentácicu, vyhľadávaním infarktových a r.ein:	farktových oblastí
pravej a ľavej komore na každom reze. Oblé	stí zodpovedajúce
níaratcvému a neinfarktovérau tkanivu sa vyno	dnctíli scftwarcm
re digitálne zobrazovanie ako počet pixelov z;	odpovedajúci týmto
blsstism. Infarktové a nemfarktové oblasti s	a potom vyjadrili
k o o e i c e r: t o o e i k o v e j o td a s 11. Σ. u cene o a t a o	re aaždú skuoiou,
yjadrené ako oblasť v pixeloch alebo ako· pere	;ento ir.far k t ového
ksriva (infarktu), sa anaivzovaír s coužitim	x.^- — - -d-i m r j j ’ ľi λ c. :__S__,< 7 oi l 'J o v ri .

Výsledky získané týmto spôsobom boli podobné, či už s použitím Pixelov alebo percenta infarktu a preto sú ukázané len výsledky používajúce percento infarktu (pozri tabulka 11) . Výsledky sú vyjadrené ako priemerná hodnota + smerodajná odchýlka (SD).

ľm.unoh istológia

Štepy sa odobrali 3 dni po transplantácii, bleskovo zmrazili v kvapalnom dusíku a uložili v -80°C. Rezy získané na kryostate sa fixovali a zafarbili, ako je opísané skôr (Soares a kol., Náture Med. 4: 1073, 1998). Populácie leukocytov laboratórneho potkana sa analyzovali s použitím anti-pctkaních monoklonálnych protilátok (mAb) proti všeobecnému leukocytárnemu antigénu (Ag) (LCA, CD45, OX-1), PTCR (TCRP-reťazce, R73), B lymfocvtom (CD4SRB, OX-33), NR bunkám (NKR-P1, 3.2.3) a makrofágom (CD68, ED-lj (všetky od firmy Serotec, Harlan Bioproducts for Science, Indianapolis, IN) . Detekcia fibrínu/fibrinogénu sa uskutočňovala pomocou králičej anti-humánnej fibrín/fibrinogén polyklonálnej protilátky (Dáko, Carpinteria, CA) . Aktivácia komplementu v štepe sa detegovala s použitím anti-potkanej Clq (The Binding Site, Birmigham, U.R.), C3 (EDli, Serotec) alebo C5b-9 mAb (Dáko). IgM laboratórneho potkana sa detegoval s použitím myšej anti-potkan.ej IgM mAb MARM-4 (láskavý dar od Dr. H. Bazina, University of Douvam, Brussels, Belgicko). Izotopovo zhodná mAb alebo purifikovaný Ig a tiež kontrola pre reziduálnu endogénnu peroxidázovú aktivitu sa zahrnuli vždy v každom experimente. Detekcia apoptózy sa uskutočňovala tak, že sa používala detekčná súprava pre in situ detekciu apoptózy ApopTag™ (Oncor, Gaithersburg, MD) podľa inštrukcie výrobcu.

Hemolytický test komplementu (CH50)

Jednotky CH50 sa definovali ako riedenie séra laboratórneho potkana potrebné na dosiahnutie 50% maximálnej lýzy protilátkou senzibilizovaných (Ab-senzibilizovaných) ovčích erytrocytov.

Stručne, Ab-senzibilizovar.é ovčie erytrocyt	y (1 x 1ÓC buniek,
Sigma) sa inkuboval! (33 minút, 37“C; so	sérom laooratčrnenc
potkana v želatínovom; veronalovom, pufri (GV3	**, Siumat . Bunky sa
potom centrifugovali a uvoľnený gemoglobín	sa meral ' 1 I =
550 nm) . Bazálna hodnota (šum) meraná v n	ecríccmncsti ovčích
erytrocytov alebo bez prítomnosti séra sa	3 3 Č í 3 ä 1 ä u v š e t k ý c b

merarycn vzoriek

Bunková ELISA
Sérové hladiny an11-myš ích orc11látok u	laboratórneho potka-

r.ô sa merali metódou nepriameho testu ELISA založeného na bunka c n .

Myšia enaotelová bunková línia 2E-2B (SR	D - 2 1 c 3 , Am.e r i c a n T y -
pe Culture Collection (ATCC), Manassas, i	/ c d p 3 3 Ž 3 .L 3 ä K O
artícénny ciel. Stručne zhrnuté, 2F-23 bu	n ky sa kultivovali
v médiu DMEM (Life Technologies, Rcckvill	.e, MD) , 10% FCS,
ICO U/mi penicilínu s 103 pg/m_ streptomyci	mi 'Life Tecnr.olo-
gies, Rockvilie). Giutaraldehydcm fixované 2	E-23 ounxy sa mku-
bovali (1 hocma, 37CD) v prítomnosti séra ii	sooratórneho potkana
sériovo zriedeného v P3S, 0,05% Tween 20	(Sigma) a potkanie
anti-myšie protilátky sa detegovaii s použití	..m myšieho anti-pot-
kanieho IgM (MARM-4), IgGi (MARGi-2), IgG2e	s (MARG2a-l), igG2b
(MARGb-8) alebo icG2c (MARG2c-5) (láskavé	daru oc Prof. H.
Bazina, University of Louvain, Brussels,	Belgicko). Myšie
anti-potkanie Ab sa detegovaii pomocou HR	?-znaóeného kozieho
anti-myšieho Eab' zbaveného anti-potkanej Ig ;	skríženej reaktivity
(0,1 gg/ml, 1 hodina, teplota miestnosti, Pie	mce, Rockforc, IL) .
HRP sa detegovala pomocou ortofenyldiamínu (S	igma a H2O2 (0,03%)
v citrátovom pufri (pH 4., 9) . Absorbancia	sa merala pri I
190 nm. Relatívne množstvo protilátok prot	1 štepu prítomných
v sére sa vyjadrilo 5Í;o CD (I = 490) získané	z jedného sériového
riedenia v lineárnom rozsahu testu (1:32 až i	:102- .

l'äzba potkanieho C3 na myšie er.ootelové bunky sa merala modifikovaným bunkovým testom ELISA s myšími 2F-25 endotelovýmo bunkami ako antigénnym cielom (Míyazake a kol., J. Imunol. 160: 4114, 1998). Stručne, nefixované 2E-2B endotelové c^unky sa inkubovali v prítomnosti séra laboratórneho pcokana sériovo zriedeného v GVB⁺’ pufri (1 hodina, 37°C). Bunky sa fixovali v PBS, 0,05% glutaraidehydu a depozit C3 laboratórneho potkana sa detegoval s použitím myšej monoklonálnej prcoiiáuky proti potkaniemu C3 (myší anti-potkaní C3 mAb) (Serorec).

Test agregácie doštičiek

Myšie 2F-2B endotelové bunky sa kultivovali na 0,2% želacínou (Sigma) potiahnutých šesťjamkových došcičkách v 88% DMEM (Life Technologies), 10% FCS (FCS), 100 u/ml penicilínu a 100 pg/ml streptomycínu (Life Technologies). Konfluentné endotelové bunky sa buď nechali neošetrené alebo sa podrobili pôsobeniu s HO-indukujúceho agens CoPPIX (50 μΜ, 18 hodín), HO inhibítora SraPPIX (50 μΜ, 18 hodín) alebo ako CoPPIX (50 μΜ, 15 hodín) tak SnPPIX (50 μΜ, 3 hodiny) . Plazma bohatá na doštičky sa získala centrifugáciou (290 g, 12 minút, 19°C) plazmy normálneho laboratórneho potkana v 3,8% citráre sodnom. Krvné doštičky laboratórneho potkana (3 x 10³ buniek/ml) sa resuspendovali v H T pufri (8,9 mM NaHCCb, 0,8 mM KH₂PO₄, 5,6 mM dextróza, 2,8 mM KCl, 0,8 m.M MgCl₂, 129 mM NaCl, 10 mM HEPES). Doštičky sa prevrstvili (5 minút, 37°C) na myšie endotelové bunky a rest agregácie došcičiek sa uskutočnil, ako je opísané skôr (Kaczmarek a kol., J. Biol. Chem. 271: 33116, 1996) s použitím agregcmetra (Chrono-Log, Harestown, PA) a ADP (0,5 až 4 μΜ) ako agoniscu.

Bunkové extrakty a analýza Mestern biet

Endotelové bunky sa premyli v PBS (pH 7,2), odobrali zoškrabaním. a lyžovali v Laemmliho pufri. Elektroforéza sa uskutočnila v der.aturačných podmienkach na 10% pclyakrylamidcvom géli. Proc o

teíny sa preniesli na	. polyvinyloif iuoridínovú membránu (Immobi-
len P, Mi 1lioore, Bed	ford, MA) pomocou clektrobiotovacieho aoa-

rátu a detegovaii králičou cólyxlonálnou protilátkou

ľí U Π! á ľ 1Π tt rí C ~ - ä Z 3 U U	.. -J Z. ( S í. Γ c S o c 3 „ i f b i C „ 'J Γ 1 d f t_. ci. i c. 3 ä ' 5x60 Q
α-tubuiinu (Boehringe:	5 zläΠΓ.3:S ΖΓΖ z \ ZľUSC KO ) . rľOcSiny 33 VlZĽäj.1
zovali použitím HRP-	konjugovanéhc oslieho ar.ti-králičieho IgG
alebo kozieho anti-my	š lebo IgG (Fierce) a následného ECL test u
(Amersham Lite Scieno	e, Arlmgton Heignts, IL; použitého podľa

inštrukcie výrobcu

Prechociná transŕekcia	z: _ Θ S _ 33 5 C 0 C t O Z
Myšia eocotelové	bunková línia zľ-23 (ATCG) sa prechodne

transfekovala, ako je opísané inde (Scares a kol., Náture Med

4: 1072, 1992, Brouai	-d a kol., J. Exp. Meo. 192: 1015, 2000;.
Všetky excerimenty sa	uskutočňovali 24 až 43 hodín po transfek-
cii. Bunky transíekcv	ané β-gaíaktezidázou sa tíetegovali ako je
opísané inde Posres	a kol·., Náture Ked. 4: ?Q~/3, 1993, Brouaro
a kol. , G. Exp . Med .	192: 1015, 2000). Percento životaschopných
buniek sa hoono111c t;	vm, že sa určil počet buniek exprimejúcich
β-gaiaxtczidázu, ktoré	: si zachovali normálnu morfológiu, ako sa
už opísalo (Scares a	kol., Náture Med. 4: 1072, 1993, Brouaro
a kol., u. Exp. Med.	192: 1015, 2000). Počet náhodných polí,
ktoré sa počítali, sa	určil tax, aby bolo najmenej 200 života-
schopných transfekovar	uúch buniek na -iednu Kontrolnú *amku. Ber-

cento životaschopných buniek sa normalizovalo pre každú DNA preparáciu podľa počtu transfekovaných buniek počítaných bez výskytu apoptózu indukujúceho agens (1001 životaschopnosť). Všetky

experimenty sa uskute:	žňovali aspoň trikrát v duplikáte. Aktino-
myci.n D (AcsG, Sigma)	sa rozpustil· v PES a oridal do kultivačné-
ho média 410 ug/ml) 2	4 hodín po transfercn. SnPPIX (Porohyrm
Products) sa rozpustil	(10 μΜ) v 100 mb NaOH a uchoval pri -2C°C
do času, ako sa použi	2. SnPPIX sa pridal do kultivačného média
(50 μ?·ύ 6 hodín po tra	r.sčekcii. Humánny rekombinantný ΪΝΒ-α (R &

(W

D Systems, Kinneapolis, MN) sa rozpustil v PBS, 1% BSA a pridal do kultivačného média (10-100 ng/mí) 24 hodín po transfekcii.

Vystavenie kultivovaných endotelových buniek pôsobeniu CO

Bunky sa exponovali pôsobením stlačeného vzduchu alebo rôznych koncentrácií CO (250 a 10000 ppm), ako je opísané už skôr (Otterbein a kol·., Náture Med. 6: 422, 2000, a Brouard a kol., J. Exp. Med. 192: 1015, 2000).

Model transplantácie aorty

Model transplantácie aorty sa realizoval, ako je opísané inde (Plissonnier a kol., Transplantation 60: 414-424, 1935). Krátko, aorta a dolná dutá žila sa narezali, aby sa po heparinizácii odkrvili. Po dooatočnej ľavej torakotómii tri alebo štyri páry interkostálnych tepien sa ligovali stehmi z nylonu 7-0 (Keisei Medical Industrial Co., LTD, Tcxyo, Japonsko) a potom sa získali 2 cm zostupnej aorty. Tento štep sa potom vložil medzi obličkové tepny a vetvenie aorty štandardnou mikrochirurgickou technikou s použitím šitia nylonom 9-0 (Ethilon TM, Ethicon, Inc, Somerville, New Jersey). Natívna brušná aorta sa ponechala potom, ako obidva konce sa ligovali.

CO v 1% koncentrácii (10000 ppm.) v stlačenom vzduchu sa miešal s vyváženým vzduchom (21% kyslíka), ako je opísané skôr (Otterbein a kol., Am. J. Physiol 27 6 (4 Ptl) : L688-L694, 1999) . Pre transplantačný model sa darcovia štepu umiestnili v CO komore dva dni pred transplantáciou. Príjemcovia sa umiestnili do komory ihneď po transplantácii a udržiavali sa tam počas 56 dní. CO koncentrácia bola po celý čas ucržiavaná na 250 ppm.

Dospelí samci (250 až 350 g) hnedých laboratórnych potkanov

RT1 sa použili ako darcovia aortálneho štepu a dospelí samci (250 až 350 g) laboratórneho potkana (RT1) kmeňa Lewis ako príjemcovia (Charles River Lab. uilmmgton, MA). Samci

C5t	51/6,p21' a p53’/ nulovej myši sa kúpili od. Jackson labora-
to r;	.· (3sr Harbor, ΜΕ) . MKK3'7”' nulovej myši sa vytvorili ako je
opi;	= ané skôr (Lua a kol. , ΞΜ30. J. 18: 1845-1851, 1393). Myši sa
nec:	sali aklimatizovať jeden týždeň s potravou pre hlodavce a vo-
oou	3 C ' ' ,0 2 ~ J’ .

RT - T

	RT-RCR (reverzná transkripcia s následnou polymerázovou re-
akc:	lou', sa uskutočňovala po izolácii RNA z t ransciantovaných
s ŕo:	; s použitím súpravy na izoláciu RNA pódia irštmcii výrobcu
(Qt:	aoer., Cnatsoorth, CA) . Priméry použité pre myší β-aktin sú
na s(	Zadujúce:
s e ľ	-.se í5'-3'5 : OCTGACCGAGCGTGGCTACAGC (SEQ1 IC NC: 1),
a n;	Lisen.se (3'-l) : AGCGT'CCAGGGCATCGGAC (SEQ ID NO: 2)
a o:	'e ir.yší HO-1:
p	;se (1-51: TCCCAGAGACCGCTCCTCCAG (SEQ 10 NC: 3)
aru	usense (3'-5Q: GGATGTGGGGCTGCTGGTTTC (SEQ 10 NO: 4).
En j.	-matička aktivita je rozhodujúca na potlačenie axutnej vasku—
lárs	:ej rejexcie
pot 1	Myšie srdcia transplantované do neošetrených laboratórnych canov trpeli akútnou vaskulárnou rejekoiou 2 až 3 dni po
t. r a i	-.spúantacii, čo sa pozorovalo v súlade s predchádzajúcimi
sprs	•vami (Soares a kol., Náture Med. 4: 1073, 1998, a Koyamada
a ,< i	ú., Transplantatica 65: 1219, 1998;. Pri liečení faktorom
kobi	--ieho jedu ,CVF) plus cykiosporínom A (CsA, myšie srdcové
štec	j- prežívali dlhodobo (pozri tabuľka II, ďalej), čo je ziste-
n i e,	xtcré je tiež v súlade so skoršími publikáciami. Pri
liet	ent CVE plus CsA je prežívanie štepov asociované s uo-regu-
lác i	ou HO-1 expresie v endotelových bunkách a bunkách hladkého

svalstva štepu a tiež v srdcových myocytoch (pozri obr. 7). Expresia HO-1 mRNA sa detegovala pomocou RT-PCR 12 až 24 hodín po transplantácii a HO-1 proteín 24 až 72 hodín po transplantácii 'pozri obr. 7). Dlhodobé prežitie štepu nenastalo, ak sa darcovi a pctcm. príjemcovi podával HO inhibítor SnPPIX, aj cez liečbu CVF pius CsA. Za týchto podmienok všetky štepy sa odvrhli v priebet.u 3 až 7 dní (pozri tabulka II) . Kontrolná liečba FePPIX, protoporfyrínom, ktorý neinhibuje HO aktivitu, neviedla k odvrhnutiu štepu (pozri tabuľka II).

Tabuľka II

Inhibícia HO-1 aktivity SnPPIX urýchľuje rejekciu štepu

Liečenie	Čas prežitia
CVF + CsA	>50 (n = S)
CVF - CsA + FePPIX	>50 (n = 4)
CVF -r Cs.A + SnPPIX	3, 4, 5 (n = 2), 6 (n = 4) , 7 (n = 2)

Na získanie údajov v tabuľke II sa myšie srdcia transplantovali do laboratórnych potkanov ošetrených CVF plus CsA. Príjemcovia štepu sa podrobili pôsobeniu FePPIX alebo SnPPIX. Podanie SnPPIX indukovalo rejekciu štepu 3 až 7 dní po transplantácii (p < C,OCO1 v porovnaní s potkanmi, ktorým sa podal CVF plus CsA alebo CVF plus Csa plus FePPIX) . Štatistické vyhodnotenie sa uskutočnilo pomocou Fisherovho presného testu.

Aby bolo možné demonštrovať, že SnPPIX, ale nie FePPIX, blokuje HO-i funkciu in vivo, celková HO enzymatické aktivita sa kvantrfí kovala v srdci transplantačného darcu a príjemcu 2 dni po transplantácii (pozri obr. 8) . Srdce naivných myší tvorilo 35,54 pmcl bilirubínu na miligram celkového proteínu za hodinu (pmci/mg/h, pozri obr. 8). HO aktivita sa významne zvýšila v myších srdciach transplantovaných do neošetrených (98 ±

21 pmct	./mg/h, p = 0,001), ošetrených CIA plus CsA (93,3 ±
1,23 pmo 2	./mg/n) alebo ošetrených CVľ plus CsA plus FePPIX
' z 3 X	:,51 pmoi/mg/'h, p = 0,0009) laecrazcrnycn pczaacov v po-
rovnaní	s naivnými srncami Ipozr: cer. Ír . FC aroromta sa
-i v- 1~, - ’ τ —, ___ih..»oo> V d-	.3 na bazálnej hladine, aká sa vyskytuje v naivných
srdciach,	u myších sŕdc zransplantovanýsh cc potkanov, ktorým sa
nedal CV	F plus CsA plus SnPPIX (32, 31 ± 1,22 p.m.ci Atg/h, . To
reprezent	:ovalc veľmi významnú 'nhib^cma v porovnaní s myšiam
. b úľ □ C S ľľi 1	rransolantovanýmm do neošetrenveh (c = 1,0039), ošetre-

nýcn CVF plus CsA (p =· 0,0309) alebo ošetrených CVF plus CsA

plus F e P i	?IX (p = C,0318, obr. 8) potkanov. HO aztivits v pečeni
pri j em.cor	sa tiež zvýšila (up-regulevané) pc transplantácii
spôsooom,	Ktorý sa podobal transplantcvaným srdciam (dáta nie sú
urážané).	Avšak, neplatilo to pre príjemcovo vlastné srdce,
v ktorom	HO aktivita nebola po transplantácii zvýšená í pozri
c o r . 3 )	V šteoocn transplantovanýoh co 1aboratórnyoh potkanov

ošetrených SnPPIX sa prejavil progresívny infarkt myokardu, kro-

r j’ sa ma:	tifestoval už po 2 dňoch pc transplantácii (dáta nie sú
ukázané).	ť štepov t ra implantovaných cc kontrolných laboratór-

ch potkanov, ktorým sa podal FePPIX, sa toto nepozorovalo

m a s s nie	su uKazanej .
Akc^	sa sKôr ukázalo, že laboratórny potkan, ktorý prijal
myší srde	rovy štep pod vplyvom CVF plus CsA liečenia, vytváral
ar.t i -myš 1	e protilátky, ktoré sú výlučne izotypu IgM (Koyamada
a kcí . ,	Franspiantatieň 65: 1210, 1998) . Fodatočné ošetrenie
SnPPIX a.	lebo FePPIX túto protilátková reakciu už neovplyvnilo
(pozri ob	m. 9) . Vytvorenie protilátok proti štepu bolo v korelá-
cti s akt	.iváciou komplementu, ako je preukázané depozitom C3 na
m j-š í ch er	.dotelových bunkách (pozri obr. S) . Ani liečenie SnPPIX
ani FePPl	X neovplyvňovalo depozit C3 na myších enc.oteiových bun-
kach Obr	• 9) .

Exogénny CO plne nahradí HO-1 enzymatickú aktivitu pri potlačení akútnej vaskulárnej rejekcie

Všetky myšre srdcia transplanrované do laboratórnych potkanov, ktorým sa podal SnPPIX a podrobili sa pôsobeniu CO (400 ppm, 0,04%) dlhodobo prežívali (pozri tabulka III, ďalej). Použitá dávka CO (400 až 500 ppm) zodpovedá asi jednej dvadsatine smrteľnej oávky (dáta nie sú ukázané). Laboratórne potkany a myši vystavené CO neprejavujú neobvyklé reakcie. CO expozícia sa prerušila 14 (n = 3) alebo 16 (n = 3) dní po transplantácii, bez toho aby to ovplyvnilo prežitie štepu, to znamená štepy boli funkčné viac ako 50 dní (pozri tabulka III).

Tabuľaa III

Exogénny CO celkom nahradí HO-1 pri potlačení akútnej vaskulárnej rejekcie

Liečenie	Čas prežívania (dni)
CVF + CsA +	SnPPIX	3, 4, 5 (n = 2)	, 6 (n = 4)	7 (n = 2)
CVF + CsA +	SnPPIX + CO	>50 (n = 6)

Na získanie údajov uvedených v tabuľke III sa myšie srdcia transplantovali do laboratórnych potkanov, ktorým sa podal CVF plus CsA. Kde je to uvedené, príjemcovi štepu sa podal SnPPIX súčasne s expozíciou alebo bez expozície k CO. Rejekcia štepu pozorovaná u patkanov, ktorým sa podal SnPPIX, sa potlačila vystavením pôsobeniu exogénneho CO (p < 0,0001 v porovnaní s príjemcami, ktorí dostali CVF plus CsA plus SnPPIX). Štatistické vyhodnotenie sa uskutočnilo pomocou Fisherovho presného testu.

Na zistenie toho, či exogénny CO brzdí inhibíciu HO-I enzymatickej aktivity spôsobenú SnPPIX, čo by mohlo byť príčinou schopnosti CO potlačiť rejekciu štepu, sa skúmalo, či CO ovplyvňuje HO enzymatickú aktivitu v srdciach transplantova.ných do

lacoratť	ťrnyoh potkanov, ktorým sa podal Sn.PPľX. Ako je ukázané
na obr.	10, nie je tomu tak. Celková HO enzymatická aktivita
v srdci;	•ch transp1antovaných za súčasného ošetrenia SnPPIX
(32,37	m 7,23 pmoi/mg/ní nebola významne odlošná oo amtivioy
v srdci;	ich transpiantovaných do· potkanov ošetrených SnPPIX
a súčas;	;e podrobených pôsobeniu CC (43,6 c 7, j m pmoi/mg/h, p =
0,1095,	oor. 10) . Podobné výsledky sa získali pre pečeň a srcce
v pri jen	“covi (oor. 10}.
Ex;	:génny CO je schopný nahradiť HO-1 aktivitu v orever.cii
rejekcie	; štepu. To by mohlo účinkovať prostredníctvom mecnaniz-
mu, ktc	rý zahŕňa naloženie exocér.r.chc CO pomocou vdychovania
na červ:	sné krvinky a potom prostredníctvom obetu predania adek-

vátr.ej koncentrácie do štepu. Podľa tejto teórie, keď endogénna

HO-1 a í-	ctivita je inhibovaná SnPPIX, exogénny CO by mohol
napodobí	revať účinok endogénneho CO, ktorý je tvorený, keď HO-1
enzymati	.oká aktivita nie je inhibovaná. Expozícia trar.spiantač-
neho pr:	ijemon k 400 ppm. exogénneho CC zvýšila karboxyhemoglobín
z C, 5 c	: 1,3% na 32,1 ± 6,9% (oozri oor. 10: . Suutočnosť, žc

transplantcvané srdcia prežívali vo zvíeratácn exponovaných CC,

dokonca	za onnibičnýcn podmienok v prítomnosti SnPPIX, ukazuje,
že táto	hladina CO bola dostatočná na to, aby sa červené krvinky
nabili	CO, preniesli CO do štepu a tak sa potlačila rejekcia
štepu (;	sozri obr. 10} . Alternatívne, oxid uhoľnatý by sa mon.ol·

dávať do štepu a do všetkých tkanív organizmu ako· rozpustený v plazme.

Tiež sa skúmalo, či exogénny CO potláča rozvoj infarktu myokardu, ktorý charakterizuje rejekciu štepu laboratórnych potkanov, ktorí sa ošetrili SnPPIX. Štepy sa. odobrali 3 oni po transplantácii a kvántifi kovali z hľadiska percenta oblasti poš-

rodenej	infarktom (infarktová oblastí . Srdcia transpiantované do
neosetre	tých potkanov ukázalo takmer kompletný transmurálny

infarkt pravej komory (37,1 ± 4,9% plochy pravej komory} s roz73 siahlym infarktom endomyokardu a transmurálnym infarktom ľavej komory (32,0 ± 6,7% plochy ľavej komory, dáta nie sú ukázané).

Infarkty vykazovali neživý eozinofilný myokard s chýbajúcimi jadrami a s intersticiálnou hemoragiou, edémom a neutrcfilmi. Infarkty ľavej komory boli vždy infarktami endomyokardu s transmurálnou extenziou v závislosti od miery infarktu, a infarkty pravej komory boli čo do pôvodu oveľa difúznejšie. Percento infarktom postihnutej oblasti v obidvoch komorách sa všeobecne zvyšovalo od vrcholu k báze srdca. Srdcia transplantované do laboratórnych potkanov ošetrených CVF plus CsA vykazovali len malé, difúzne, nontransmurálne oblasti infarktu v pravej komore (4,5 ± 4,9%), ale nie v ľavej (0,72 ± 2,1%) komore (pozri tabulka IV, ďalej). Srdcia transplantované do laboratórnych potkanov ošetrených CVF plus CsA plus FePPIX vykazovali malé difúzne oblasti infarktu v pravej komore (12,2 ± 9,5%) ale nie v ľavej komore (0,7 ± 1,3%) (pozri tabulka IV). Tieto srdcia nebolo možné odlíšiť od tých, ktoré sa transplantovali do potkanov ošetrených CVF plus CsA bez ošetrenia FePPIX (dáta nie sú ukázané) . Srdcia transplantované do laboratórnych potkanov ošetrených CVF plus CsA plus SnPPlX vykazovali významný transmurálny infarkt pravej komory (26,1 ± 12,7%) s rozsiahlym endomyokardiálnym a transmurálnym infarktom ľavej komory (37,6 ± 15,5%) (tabuľka IV), a síce s takým profilom, ktorý bol na nerozoznanie od sŕdc, ktoré sa transplantovali do neošetrených laboratórnych potkanov (dáta nie sú ukázané). Tieto lézie boli špecifické pre transplantované srdcia. Natívne srdcia príjemcov boli celkom bez známok akéhokoľvek infarktu. Percento oblasti poškodenej infarktom, v srdciach transplantovaných do potkanov ošetrených SnPPIX bolo významne vyššie (p < 0,001) ako u sŕdc transplantovaných do potkanov ošetrených CVF plus CsA, buď s alebo bez FePPIX (pozri tabulka IV) . Srdcia transplantované do potkanov ošetrených SnPPIX podrobených pôsobeniu exogénneho CO vykazovali velmi málo infarktov pravej (8,4 ± 5,3%) a ľavej (1,8 ± 3,4%) komory (pozri tabuľka IV) , s profilom veľmi podobným srdciam trar.soiantovanýrr. do potkanov ošetrených CVF plus CsA, a to s alebo bez FePPIX (dáta nie sú ukázané)- Percento oblasti pcšxccenej infarktom v srdciach transpiantovaných laboratórnych pccxancv ošetrených

SnPPIX,	ktorí sa	pcdr	obili pôsobeniu exogénnom	o _ 3, sa	významne
nelíšilo	O CÍ r C	entá	u sŕdc transpiantovaných	dc poctar	iov ošet-
r e n ý c h C	P i p< u s	_ p k_ id	alebo bez FePPIX. Avšak,	ýj ~ -r η '·~· r r	j i n f a r x -

tom poškodenej oblasti v týchto srdciach bolo významne odlišné (p < 0,001) od percenta u sŕdc c ranspiantovaných. pri rovnanom ošetrení, ale bez expozície exogénnemu CO.

Tabulka IV

Morfometrická analýza

Liečba	Pravá komora	davá komora
CVF + C s A	4,5 ± 4,9	0, ' ± 2,1
CVF + CsA + FePPIX	12,2 ± 9,5	0 , ± 1,3
CVF + CsA + S r. P PIX	2 6,1 ± 12,7^	37,6 ± 15,5*
CVF + CsA + SnPPIX + CO	R 4 + - d	1 í + 3 ĺ
Xa získanie dác uv	edených v tasalxe IV	T C.' / š i Θ s r d C x 3 S 3
transplantovali dC' (n =	3 pre skupinu) labe	raritných potkanov
ošetrených CVF plus CsA.	Ako je to uveoené, oríjemcovia štepu sa
ošetrili FePPIX alebo SnPPIX a podrobili pesc	eemu CO. Výsledky
sú ukázané ako percento	infarktovej oblasti, ó	Štatistické analýzy
sa uskutočnili s použití	m ANOVA testu. Hviezdička uxazuje výz-
namný rozdiel pri porevna	ni proti všetkým, osom	iným. iiečbam.
Exogénny CO potláča vaskulárnu trombózu a i	nfiltráciu mcnocy-
tov/makroŕágov, ktorá cha	rakterizuje akútnu vaskulárnu rejekciu
Myšie srdcia sa transplanecval c dc lacc	raritných potkanov
ošetrených CVF plus CsA.	SnPPIX aleoo xePPIX sa podali a príjem-
covia štepu sa exponoval	i CO (250 až 400 opc	C . Štepy sa perom
odobrali 3 dm pc transp_	.antácm (n = 3 pre sxzupmu) a imuuohis-

tochemicky zafarbili na potkaní IgM, potkaní a myší komplement Clo, potkaní a myší P-selektín, potkaní a myší fibrín/fibrinogén a potkaní CD45 exprimujúci leukocyty. Myšie srdcia rransplantované do potkanov ošetrených CVF plus CsA s alebo bez FePPIX vykazovali rozsiahle intravas kulárr.e depozity potkanieho IgM a Cic (dáta nie sú ukázané), ale nebol detegovatelný žiadny IgG, C3 alebo C5b-9 (dáta nie sú ukázané). HO-2, HO-1 a ferrtín sa delegovali v bunkách endotelia a hladkého svalstva štepu a tiež v myocytoch srdca (dáta nie sú ukázané). Objavila sa malá, avšak deregovateľná vaskulárna trombóza alebo infiltrácia hostiteľskými leukocytmi obvykle spojená s fokálnym výskytom infarktových oblastí (dáta nie sú ukázané). Vo vaskulárnom encoteli sa prejavila nízka ale detegovateľná expresia P-selektínu (dáta nie sú ukázané). Srdcia transplantované do laboratórnych potkanov ošetrených CVF plus CsA pri súčasnej inhrbícii HO-1 aktivity podaním SnPPIX, vykazovali podobné hladiny intravaskulárneno depozitu IgM a Clq ako kontrolné potkany ošetrené FePPIX a IgG, C3 alebo C5b-9 neboli detegovateľná (dáta nie sú ukázané;. Takmer všade sa vyskytla vaskulárna trombóza velkých koronárnych ciev asociovaná s agregátmi krvných doštičiek exprimujúcich P-selektín a intravaskulárnym fibrínom. Tromby sa tiež konzistentne pozorovali vo velkých koronárnych cievach u bázy srdca. V mikrovaskularúre neboli detegovateľná žiadne agregáty doštičiek exprimujúcich P-selektín v mikrovaskulatúre (dáta nie sú ukázané). Prejavila sa rozsiahla infiltrácia štepu hostiteľskými neutrofilmi a tiež CD45 leukocytmi exprimujúcimi monocyt/makrofágový marker CD68/EO-1 a antigénmi MHC triedy II (dáta nie sú ukázané). Infiltrujúce monocyty/makroŕágy sa zistili v blízkosti arteriol a rozptýlené v myokarde, asociované s oblasťami infarktu.

Srdcia transplanrované do laboratórnych potkanov ošerrených

SnPPIX, ktoré sa vystavili pôsobeniu CO, soli v podstate nerozpoznatelné od sŕdc transplantovaných do potkanov ošetrených

CVF plus CsA s alebo bez FePPIX (dáta nie sú ukázané) . Tieto srdcia vykazovali podobné hladiny vaskulárnych depozitov IgM

cí CiCj s, k o	srdcia tra	nsplantcvané do	crí jemcov	ošetrených SnPPIX
ale neexpo	ncvaných k	CC (dáta nie sú	ukázané}	. V po-dmienkacn CO
expozície	sa nevysky	tli žiadne zr.émk	v a s x u i d	rnej trombózy, ako
sa u ka z a a c	a b s e n o i o u	o e t e g o v a t e 1 u ý c h	a g r e g á a o ’	v doštičie )< e x o r .i. -

mujúcich P-selektín alebo iccravaskularneho fibrínu. P-selektín sa detegoval na vaskuiárncm enooteiiu štepu. Určitá hladina infiltrácie monccytcv/makrofágov sa asociovala s malými fekálnymi oblasťami infarktu (dáta nie sú ukázané).

Up-regulácia H0-; v endctelcvých bunkách inhibuje agregáciu doštičiek

Vzhľadom na neprítomnosť agregácie doštičiek v štepoch transplantovanýcn do laboratórnych potkanov vystavených pôsobeniu CO, sa tiež skúmalo, či expresia HO-1 v endotelovýcn bunkách inhibuje agregáciu doštičiek in vitrc. Myšie endotelové bunky sa ošetrili CoPPIX alebo SnPPIX, aby sa indukovala alebo potlačila HO aktivita v týchto- bunkách, v danom poradí. Krvné doštičky sa prevrstvili na encotelové bunky a testovali na schopnosť agregovať sa po stimulácii A? P (2 μΜ) . Krvné doštičky prevrstvené na neošetrené endotelové bunky normálne agregujú, keď sú stimulované OOP ípozri obr. 11) . Keď sa krvné došti čky vystavili pôsobeniu enooteiovýcn buniek, ktoré sa vopred ošetrili SnPPIX, agregácia doštičiek sa zosilnila v porovnaní s krvnými doštičkami vystavenými neošetreným endotelcvým bunkám (obr. 11). Toto pozorovanie ukazuje, že neošetrené endotelové bunky majú základnú hladinu HO aktivity, pravdepodobne v dôsledku konštitutívnej, expresie HO-2 v týchto bunkách (obr. 11) . Keď sa krvné doštičky vystavili pôsobeniu endc-telových buniek, ktoré sa vopred ošetrili. CoPPIX, agregácia doštičiek sa významne in.hibovala v porovnaní s krvnými doštičkami vystavenými neošetreným alebo SnPPIX ošetreným endotelovým bunkám (obr. ii) . Tento inhibičný účinok sa potlačil, ked sa krvné doštičky vystavili pôsobeniu endotelových buniek, ktoré sa ošetrili axo CoPPIX tak SnPPIX (obr. 11) . CoPPIX a SnPPIX spoločne viedli k up-regulácii expresie HO-1 v kultivovaných endotelových bunkách (dáta nie sú ukázané). Rozdielne účinky týchto· orctoporfyrínov by sa mohli pričítať schopnosti SnPPIX pôsobiť ako silnú inhibítor HO-1 enzymatickej aktivity.

HO-1 generuje CO, ktorý potláča apopcózu endotelových buniek nevyskytuje u myších potkana ošetreného

Jeden z hlavných rysov, ktorý charakterizuje rejekciu myšieho srdca oransplantovaného do laboratórneho potkana ošetreného SnPPIX je velmi rozsiahla apoptóza endotelových buniek a srdcových myocytov (obr. 12). Apoptóza sa sŕdc transplantovaných do laboratórneho

FePPIX (pozri obr. 12). Vzhľadom na schopnosť HO-1 potlačiť apoptózu endotelových buniek in vitro (Soares a kol., Náture Med. 4, 1073-1077, 1598, a Brouaro a kol., J. Exp. Med. 192: 1015, 2000) sa skúmalo, či tento cyfoprotektívny účinok je sprostredkovávaný CO, ktorý sa vytvára. Apoptóza sa nevyskytovala u myších sŕdc transplantovaných do laboratórnych potkanov ošetrených SnPPIX a vystavených pôsobeniu CO, čo vedie k domienke, že by to práve mohlo byť toto vysvetlenie (pozri cbr. 12). Skúmalo sa tiež in vitro, či v podmienkach inhibície HO-1 aktivity SnPPIX exogénny CO môže zabrániť endotelovým bunkám, aby nepodstupovali apoptózu sprostredkovanú TNF-α. Dáta znázornené na obr. 6 svedčia pre to, že táto predstava platí. Nadmerná expresia HO-1 potláča TNF-α sprostredkovanú apoptózu endotelových buniek, ako k tomu dochádza napríklad v prítomnosti aktinomycínu D (pozri obr. 12). Antiapoptotický účinok HO-1 je sprostredkovaný teda jej anzymatickou aktivitou, pretože ošetrenie endotelových buniek SnPPIX blokovalo antiapoptotický účinok HO-1 (obr. 12). V podmienkach inhibície HO-1 aktivity SnPPIX, exogénny CO (10000 ppm) potlačil TNF-α sprostredkovanú apoptózu, takže je možné navrhnúť, že HO-1 potláča apoptózu endotelových buniek prostredníctvom tvorby CO (pozri obr. 12).

Oxid uhol	natý potláča rozvoj artériosklerózy asociovanej
s transplar	.tatom
Ao r ľ y	z hnedýcn Laboratórnych potkanov (Brown Norway) sa
t2ľ<äľlSpJ_<3.nuC.	viali do hnedých laboratórnych potkanov ''syngénnych),
neošetreným	čo laboratórnych potkanov kemeňa Lewis \aiogénnychí
aleoo Ό O 0 K ž	mov kmeňa Lewis vystavených pôsobeniu oxidu uholnaté-
ho (250 ppm	alcgénny s oxidom uhoľnatým). Vzorky sa odobrali 56

dní po transplantácii a zafarbili modifikovaným Massonovým

chromatický	m farbením pružných tkanív alebo eozmcm-hematoxyií-
nom. Segme:	rty aorty z hnedých laboratórnych potkanov transplan-
tované do )	.aboratórnycn potkanov kmeňa Lewis vyvolávali arterio-
sklerotické	> lézie, ktoré sú zhodné s léziami asociovanými
s chronické	zu rejekciou štepu (dáta nie sú ukázané). Tieto lézie
sa začali c	objavovať 2C až 30 dní po transplantácii a boli výraz-
ne zreteľne	7šie za 50' až 60 dní (dáta nie sú ukázané) . Z tohto

dôvodu sa všetky analýzy uskutočňovali 56 dní po transplantácii.

Lézie sa charakterizovali hyperpíáziou mtimy, stratou buniek hladkého svalstva medie (SMC) a akumuláciou leukocytov

v advent íci	i (vonkajšej obalovej vrstve), a nepozorova 1.) sa
v aortách	transplantačných príjemcov (dáta nie sú ukázané).
Žiadne znáz	zry týchto lézií sa nepozorovali, keď segmenty aorty
laboratórne	ho potkana sa transplantovali do syngénnych príjem-
cov. Aby s.	= mohlo testovať, či CO potláča rozvoj týchto lézií,
aortálne št	eoy sa transplantovali do aiogénnych príjemcov, ktorí
sa potom vy	.'stavili pôsobeniu CO (250 ppm) ihneď po transpiantá-

cii a počas nasledujúcich 56 dní. Hyperolázia intimy sa zahlbovala u aortálnych štepov transplsntovaných do príjemcov výstave-

ných pôsob:	eniu CO v porovnaní so štepmi transplantovanými do
príjemcov -	.•'/stavených len vzduchu, rovnako tak ako akumulácia
leukocytov	v adventícii (dáta nie sú ukázané) . CO nemal žiadny
významný č č	mok ua stratu SMC média v porovnaní so štepmi trans-
plánt ova ným.	i do neošetrených príjemcov (dáta nie sú ukázané!-

Príklad 3

Postupy r.a ošetrovanie orgánov a tkanív, darcov a príjemcov, pri transplantácii

Nasledujúci príklad ukazuje postupy (protokoly) na použitie pri ošetrovaní darcu, orgánu a príjemcu aplikáciou oxidu uhoľnatého v priebehu transplantačného výkonu. Ktorýkoľvek jeden alebo viac z nasledujúcich postupov sa môže použiť v transplantačnom výkor.e .

Ošetrovanie darcu

Pred tým, ako sa odoberú orgány alebo tkanivá, darca sa môže podrobiť pôsobeniu inhalovaného oxidu uhoľnatého (250 ppm) jednu hodinu. Podávané dávky môžu kolísať v rozsahu od 10 ppm do 1000 ppm počas jednej až šiestich hodín alebo po celý čas od okamihu, od kedy je možné ošetrovať darcu, u ktorého sa stanovila klinická smrť (kadaver) až do odobratia orgánu alebo tkaniva. Ošetrenie by sa malo zahájiť čo najskôr ako je tc možné, akonáhle je stanovená klinická smrť. Pri niektorých aplikáciách môže byť užitočné zahájiť ošetrovanie už pred klinickou smrťou.

U zvierat, s výnimkou človeka (napr. ošípaných), ktoré slúžia ako darcovia xenotranspiantátov, môže sa ešte živé zviera podrobiť pôsobeniu relatívne vysokej hladiny inhalovaného oxidu uhoľnatého, podľa potreby tak dlho, aby vytvorený karboxyhemoglobin nenarušil životaschopnosť a funkciu orgánu, ktorý sa má transplantovať. Napríklad sa môžu použiť hladiny vyššie ako 500 ppm (napr. 1000 ppm alebo vyššie, až do 10000 ppm, najmä pre krátku expozíciu!.

Ošetrovanie orgánu in situ

Pred tým., ako je orgán odobratý od darcu, môže sa preplác’nnuť roztokom, napr. pufrom alebo médiom, bez červených krviniek, zatiaľ čc je stále ešte v tele darcu. Zámerom je preplachovať orgán roztokom saturovaným oxidom uhoľnatým a udržiavať atmosféru oxidu uhoľnatého, aby obsah oxidu uhoľnatého zostal na saturačnej hladine, ľreplachovanie môže prebiehať pcčas aspoň ' 0 .ornát, r.apr. 1 hodinu, niekolko hodín alebo dlhší čas. Roztok by mal v ideálnom prípade k bunkám orgánu dodať čo možno najvyššiu koncentráciu oxidu uhoľnatého.

Ošetrovanie orgánov alebo txar.ív

Crgár.v alebo tkanivá sa môžu uchovávať/konzervovať v médiu, ktoré obsahuje oxid uholnatý, a to oo okamihu vybratia z tela darcu do okamihu transplantácie do tela príjemcu, loco sa môže uskutočniť tak, že sa udržiava orgán alebo tkanivo v médiu obsahujúcom CO, alebo tak, že sa orgán/t kamvo perfur.duje takým médiom. Pretože táto situácia nastáva ex vivo skôr ako vo zvierati, môžu sa použiť aj velmi vysoké koncentrácie plynného CO (napr. 1GC00 ppm udrží médium saturované CO) .

Ošetrovanie príjemcu

Pri j emca	sa môže '	vystaviť pôsobeniu oxidu	ur.olr.	atého.	Ošet-
vanie môže	začať	deň transplantácie aspc	: ň 3 0	minút	prec
hájením, chi	r u r g i c k é h	o výkonu. Alternatívne	m. ô1 ž e	Z O Č O t	aspoň
minút pred	reper fúz:	iou orgánu v príjemcovi.	Môže	potom p	okra-

čovať aspoň 30 minút, napr. 1 hodinu. Dávky oxidu uhoľnatého· v rozsahu IC ppm a 300C ppm. sa môžu podávať po rôzne dlhý čas, napr. minúty alebo hodiny, a môžu sa podávať v deň transplantácie a v nasledujúcich dňoch. Napríklad príjemca môže inhalovať koncentráciu oxidu uhoľnatého, napr. 3000 ppm, v troch po sebe idúcich zadržiavaných vdychoch trvajúcich 10 sekúnd. Alternatívne, príjemca môže inhalovať napr. 200 ppm po dlhší čas, napríklad počas 20 dní. Koncentrácia karboxyhemoglobír.u sa môže použiť ako· voaitko na vhodné podávanie oxidu uhoľnatého pacientovi. Obvykle bv ošetrovanie príjemcov nemalo viest k zvýšeniu hladiny karboxyhemoglobír.u nad hladinu, ktorá je považova81 ná za prijatelné riziko pre pacienta, ktorý potrebuje transplantáciu.

Ďalšie uskutočnenie vynálezu

Je potrebné rozumieť, že zatiaľ čo vynález je opísaný v predchádzajúcom texte velmi podrobne a tiež formou príkladov uskutočnenia, tento opis je: myslený len na ilustráciu a nijako neobmedzuje rozsah vynálezu, ktorý je definovaný pripojenými nárokmi. Ďalšie aspekty, výhody a modifikácie sú v rozsahu nasledujúcich patentových nárokov.

Claims (53)

1. Použitie oxidu uhoľnatého na prípravu farmaceutickej kompozície na zlepšenie prežitia alebo funkcie orgánu co transplantácii do príjemcu, pričom

a) farmaceutická kompozícia je podávané darcovi, bi od darcu je získaný orgán vybraný zo skupiny, ktorú tvorí: oblička, pečeň, srdce, koža, tenké črevo a slir.ivka, a

c) orgán je trar.splantovaný príjemcovi.

2. Použitie podlá nároku i, kde farmaceutická kompozícia je podávaná živému darcovi alebo darcovi, u ktorého sa stanovila klinická smrť.

3. Použitie podľa nároku i, kde farmaceutická kompozícia obsahujúca oxid uhoľnatý je podávaná darcovi ored a po Klinickej smrti .

4. Použitie podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 3, kde farmaceutická kompozícia je prvá farmaceutická Kompozícia a použitie ďalej zahŕňa in situ ošetrenie orgánu darca druhou farmaceutickou kompozíciou obsahujúcou oxid uhoľnatý.

5. Použitie podľa ktoréhokolvek z nárokov i až 4, ktoré ďalej zahŕňa pred transplantačnýro krokom ex vivo ošetrenie orgánu druhou farmaceutickou kompozíciou obsahujúcou oxid uhoľnatý.

6. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov ľ až 5, kde farmaceutická kompozícia je prvá farmaceutická kompozícia a použitie ďalej zahŕňa krok podania príjemcovi druhej farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý pred kroKom (c), v priebehu Kroku (c), ρο kroku pred a v priebehu xrcku íc), pred a po kroku (c) alebo pred, v priebehu a po kroku (c).

7. Použitie ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde orgánom je pečeň, oblička, srdce, siinivka, tenké črevo alebo koža.

8. Použitie podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, kde darca a príjemca patria k rovnakému alebo odlišnému biologickému druhu.

9. Použitie podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, kde ako darca tak príjemca sú ľudia alebo zvieratá s výnimkou človeka, alebo kde darca je zviera s výnimkou človeka a príjemca je človek.

10. Použitie oxidu uhoľnatého na prípravu farmaceutickej kompozície na zlepšenie prežitia alebo funkcie orgánu po transplantácii príjemcovi, pričom

a) je poskytnutý orgán od darcu, b; farmaceutická kompozícia je podávaná orgánu a

c) orgán je transplantovaný príjemcovi.

11. Použitie podľa nároku 10, kde krok (b) je uskutočňovaný tak, že sa orgán in situ perfunduje, pričom, je orgán v darcovi.

12. Použitie podlá nároku 10, kedy krok (b) je uskutočňovaný ex vi vc.

13. Použitie podľa nároku 12, ďalej zahŕňajúce kroky pred krokom (b), kedy je podávaná darcovi druhá farmaceutická kompozícia obsahujúca oxid uhoľnatý, a orgán sa odoberie z darcu.

14. Použitie podlá nároku 13, kedy druhá farmaceutická kompozícia je podávaná živému darcovi alebo darcovi, u ktorého sa stanovila klinické smrť.

_ 5 . - o u ž r r r e ρ o d 1 a nároku i u , k e d v o r u n a n 5 rma c e u u i c k á kompozícia ₂e podávaná darcovi pred a po stanovení klinickej smrti.

16. Použitie podlá ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 15, ďalej zahŕňajúce krok podávania príjemcovi druhej farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý pred krokov; (c), v priebehu korku (c), po kroku (c), pred a v priebehu kroku (c), pred a po kroku (c) alebo pred, v priebehu a po kroku (c).

17. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 16, kedy orgánom je pečeň, oblička, sroce, slinivka, plúca, tenké črevo alebo koža .

18. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10' až 17, kedy patrí k .rovnakému alebo odlišnému biologickému druhu.

19. Použitie oxidu uhoľnatého na prípravu farmaceutickej kompozície na zlepšenie prežitia transplantovanéno orgánu v príjemcovi, pričom a} orgán je poskytnutý od darcu,

b) orgán je trar.splantovaný do príjemcu a

c) farmaceutická kompozícia je podávaná príjemcovi pred krokom (b) , v priebehu krčku (b) , po kroku íb) , pred a v priebehu kroku (b) , pred a po kroku (b) alebo pred, v priebehu a po xroku (b).

20. Použitie podľa nároku 19, kedy farmaceutická kompozícia je podávaná príjemcovi v priebehu 1 až 20 dní po (b), aspoň raz v čase, ktorý začína 2í dní pc (b), alebo viackrát tržite v priebehu času, ktorý začína 21 dní co (b).

alebo nepre85

21. Použitie podía nároku 19 alebo 20, kedy farmaceutický prípravok je podávaný príjemcovi po zistení, že transplantovaný orgán podstupuje alebo začína proces chronickej rejekcie alebo po zistení, že transplantovaný orgán podstupuje alebo začína proces akútnej rejekcie.

22. Použitie podlá ktoréhokolvek z nárokov 19 až 21, ďalej zahŕňajúce krok, pred tým, ako je odobratý orgán od darcu, podávanie darcovi druhej farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid uholnatý.

23. Použitie podlá nároku 22, kedy druhá farmaceutická kompozícia je podávaná živému darcovi alebo darcovi, u ktorého sa stanovila klinická smrť.

24. Použitie podía nároku 19, ďalej zahŕňajúce pred krokom (b) podávanie do orgánu druhej farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid uholnatý.

25. Použitie podía nároku 24, kedy druhé farmaceutická' kompozícia je podávaná do orgánu in situ v darcovi a/alebo ex vivo.

26. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 19 až 25, kde orgánom je pečeň, oblička, srdce, slinivka, pľúca, tenké črevo alebo koža.

27. Použitie ktoréhokolvek z nárokov 19 až 26, kde darca a príjemca patria k rovnakému alebo odlišnému biologickému druhu.

28. Použitie oxidu uhoľnatého na prípravu farmaceutickej kompozície na zlepšenie funkcie darcovského orgánu, pričom (a) orgán marginálneho darcu je poskytnutý a « Ό (b) orgán je vystavený pôsobeniu faraaceutickej kompozície.

29. Spôsob uchovávania živočíšnych buniek m viLrc, v y z r. a čujúci sa r ý n, že zahŕňa kroky:

a} posrytne sa naoccď ocsahujuca stlačený p±yr. cosahujuci o_ynn ý oxio u h c1n a t ý,

b) poskytnú sa izolované bunky in vitro, tieto bunky sú primárne bunky alebo kmeňové bunky,

c) uvoľňuje sa stlačený plyn z nádoby, čím sa vytvára atmosféra obsahujúca plynný oxid uhoľnatý, a

d) zvieracie bunky sa uchovávajú in vitro v prítomnosti atmosféry obsahujúcej plynný oxid uhoľnatý.

20. Spôsob uchovávania živočíšnych buniek m vitro, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že zahŕňa kroky:

a) poskytne sa kultivačné médium obsahujúce aspoň 0,0001 g CP/100 g média, a

b) izolované bunny sa uchovávajú v .médiu.

31. Použitie oxidu unolnatého na prípravu kultivačného média na uchovávanie živočíšnych buniek pred tým, ako sú transpiantovar.é príjemcovi, kedy sa bunky uchovávajú spôsobom podľa nároku 30.

32. Použitie podľa nároku 31, kedy sú živočíšne bunky získané z príjemcu alebo z darcu, ktorý nie je príjemcom.

33. Použitie podľa náreku 31 alebo 32, ďalej zahŕňajúce podávanie kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý príjemcovi pred transplantáciou, v priebehu transplantácie, po transplantácii, preo a po transplantácii alebo pred, v priebehu a po transplantácii.

34. Použitie podľa nároku 31, kedy živočíšne bunky sú získané od darcu spôsobom zahŕňajúcim:

a) podávanie kompozície obsahujúcej oxid uholnatý darcovi, a

b) získanie buniek z tkaniva darcu.

35. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 29 až 34, kedy živočíš-

na bunka je súčasť pankreatických ostrovčekov, pečeňová bunka, pankreatická β-bunka, fibrcblast, bunka kostnej drene, nervová bunka, myocyt alebo kmeňová bunka. 36. Použitie oxidu uhoľnatého na prípravu farmaceutickej kompo-

zície na zlepšenie prežitia živočíšnych buniek po odobratí od darcu, pričom

a) farmaceutická kompozícia je podávaná živému darcovi alebo darcovi, u ktorého sa stanovila klinická smrť,

b) izolovaná bunka je získaná od darcu.

37. Použitie podľa nároku 36, kedy farmaceutická kompozícia je stlačený plyn.

38. Použitie podľa nároku 36 alebo 37, ďalej zahŕňajúce: (c) uchovávanie buniek in vitro v prítomnosti druhej farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý.

39. Použitie podľa nároku 38, kedy bunky z kroku (c) sú uložené v tekutom médiu.

40. Použitie podľa nároku 39, kedy krok (c) je uskutočňovaný tak, že je poskytnutý zdroj stlačeného plynného oxidu uholnarého a tekuté médium sa privedie do kontaxtu s plynným oxidom uhoľnatým uvoľňovaným zo zdroja srlačer.ého plynného oxidu uholnarého.

41. Použitie pódia nároku 39, kedy tekuté necrum obsahuje oxi uholnatý.

4 7 . uouzitie pooia xtorenoxorvex z nárokov ie uz a_, ueoy oonxa -¹ O m- asť pankreatických ostrovčekov, pečeňová cur.ka, pankreatické

β-bunka, fioroblast, bunka kostnej drene, neurón, myooyt alebo kmeňová bunka.

43. Použitie oxidu uhoľnatého na príoravu farmaceutickej komoozície na zlepšenie prežitia buniek po· odobraní z darcu, pričom

farmaceutická kompozícia je podávaná živému darcovi alebo darcovi, u kteréne sa stanovila klinická smrť, / izolované bunky sú odobraté oď čarou, a bur.ky sú transplantované príjemcovi. 44 . Použitie podľa nároku 43, kedy darca nie je príjemcom alebo d a r C; s a príjemca sú rovnakým zvieraťom.

45. Použitie podlá nároku 43 alebc 44, ďalej zahŕňajúce krok

podá' ’ania druhej farmaceutickej kompozície obsahujúcej oxid uhoľ r ;atý príjemcovi pred krokom, transplantácie, v priebehu kroku t r aru splantácie, pc kroku transplantácie, pred a po kroku tran.s- plam dácie alebo pred, v priebehu a po kroku transplantácie. 46. Použitie ktoréhokolvek z nárokov 43 až 46, kedy bunka je C a S t C )u pankreatických ostrovčekov, pečeňová bunka, pankreatické β-bur .ka, fibroblast, bunka Kostnej drene, neurón, myooyt alebo kmeň: ?vá bur.xa. Použitie plynného oxidu uhoľnatého na prípravu farmaceutic-

kej Kompozície na zlepšenie prežiera alebc funkcie živočíšnych buniek transolantovaných príjemcovi, pričom a; živočíšne bunky sú transplantcvané príjemcovi, a

b) príjemca je privedený k tomu, aby inhaloval farmaceutickú kompozíciu pred, v priebehu a/alebo po kroku transplantácie.

48. Použitie podľa nároku 47, kedy plynný oxid uhoľnatý je dodávaný vo forme nádoby obsahujúcej stlačený plyn obsahujúci oxid uhoľnatý.

49. Použitie podľa nároku 47, ďalej zahŕňajúce krok, kedy sa bunky pred krokom transplantácie vystavia ex vivo pôsobeniu kompozície obsahujúcej oxid uhoľnatý.

50. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 47 až 49, kedy pred krokom, transplantácie sú živočíšne bunky uchovávané v tekutom médiu, ktoré obsahuje aspoň 0,0001 g oxidu uhoľnatého v 100 g média .

51. Použitie podľa nároku 47, kedy pred krokom transplantácie sú bunky uchovávané in vitro v atmosfére obsahujúcej oxid uhoľnatý.

52. Použitie podľa ktoréhokolvek z nárokov 47 až 51, kedy bunky sú odobraté z príjemcu alebo z darcu, ktorý nie je príjemcom.

53. Použitie podľa ktoréhokolvek z nárokov 47 až 52, kedy bunky sú odobraté od darcu pred tým, ako sú transplantované príjemcovi, a farmaceutická kompozícia obsahujúca oxid uhoľnaoý je podávaná darcovi pred a/alebo v priebehu odoberania buniek od darcu.

54. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 47 až 53, kedy bunka je častou pankreatických ostrovčekov, pečeňová bunka, pankreatická β-bunka, fibroblast, bunka kostnej drene, neurón, myocyt alebo kmeňová bunka.

55. Použitie plynného oxidu uhoľnatého na prípravu -armaoeuttckej kompozície na zlepšenie prežitia zrarsplaroovaných ouctet v príjemcovi po transplantácii, pritom farmaceutická Kompozícia je podávaná príjemcovi pred, v priebehu alebo pt transplantácii buniek do príjemcu.

56. Výrobok, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje nádobu obsahujúcu stlačený plyn obsahujúci najmenej C,001 ppm oxidu uhoľnatého a označenie opisujúce použitie plyne na zlepšenie prežitia izolovaných živočíšnych buniek cred, v priebehu alebo po transplantácii buniek pacientcvzi.

57. Sterilné že obsahuje: v oultúre a bunkové médium, v y z n a (a) živiny vhodné na uchove íb) aspoň asi 0, 0 001 g oxic van e s a t ý m, č í š n y c h b u n i e k z O' v 100 g méGia .

58. Spôsob in vitro uchovávania izolovaných živočíšnych buniek vhodných na transplantáciu, vyznačujúci sa t ý m, že zahŕňa kroky:

poskytne sa nádoba obsahujúca stlačený plyn obsahujúci plynný oxid uhoľnatý, b; poskytnú sa izolované živočíšne bunky m vitro, ktoré sú uložené v médiu obsahujúcom rozpustený oxid uhoľnatý,

c) uvoľňuje sa stlačený plyn z nádoby, čím. sa pripravuje atmosféra obsahujúca plynný oxid uhoľnatý, a

d) bunky sa uchovávajú v prítomnosti tejto atmosféry.

59. Použitie plynného oxidu uhoľn uchcvvanie živočíšnych buniek preč príjemcovi, pričom bunky sa uchováva téhc na príoravu média na tým., ako sú rrar.spiantované ú scôsobcm cedia nároku 58.

63. Použitie živočíšnych buniek uchovávaných spôsobe. podľa ná roku 30, na prípravu farmaceutickej kompozície na nransplantá ciu.

61. Použitie živočíšnych buniek uchovávaných spôsobom podľa ná roku 58, na prípravu farmaceutickej kompozície na nransplantá eru.