SE442749B - Tvettkomposition med proteolytisk aktivitet och sett att framstella denna - Google Patents

Description

8104191-5 2 10 15 20 25 30 35 UD ter som bildar proteolytiska enzymer. Utbytena är högre än dem som exempelvis erhålles med en stam av Bacillus firmus, jämför amerikansk patentskrift 3 827 938. En annan oväntad fördel hos uppfinningen är att enzymet uppvisar en överraskande god tvättverkan i perborat- haltiga tvättkompositioner. En kultur av Bacillus-stammen PB 92 har deponerats i laboratoriet för mikrobiologi vid tekniska universitetet i Delft, Holland, och har där givits numret OR-60.

Det nya proteolytiska enzymet framställes enligt ett drag i uppfinningen genom odling av Bacillus PB 92 i ett näringsmedium som innehåller de normala källorna för kol, kväve och spårelement under aeroba betingelser, och isolering från odlingsvätskan av det bildade proteolytiska enzymet.

Egenskaper hos enzymet §§29esêe-@ellen_2ë-e2ë_et§i!à§e2 För bestämningen av beroendet mellan pH och aktivitet användes Ansons hemoglobinmetod [jfr J.Gen. Physiology, 22 (1939), 79-89] så Specifikationer som icke gives i ovanstående lit- (a) nära som möjligt. teraturställe angives i det följande: Substratberedning: Nöfihemoglobin, proteassubstrat enligt Anson, lyofiliserat rent, erhållet från SERVA, Heidelberg, Väst- Tyskland.

Substratlösning: SERVA hemoglobin blandades med vatten genom omrörning till en 22-procentig lösning (w/v). Från denna nyfram- ställda koncentrerade lösning framställdes en utspädd lösning, inne- hållande 8 ml lN Na0H, 72 ml vatten, 36 g karbamíd och l0 ml av den koncentrerade lösningen. Denna alkaliska lösning hölls under 60 mi- nuter vid 25°C för att denaturera hemoglobinet. I Buffertlösningar (se nedan), karbamid och mertiolat tillsattes, pH inställdes med användning av en Ingold HA-elektrod, och volymen inställdes till en hemoglobinhalt av 2,2 %. Referenslösningar för pH erhölls från Merck, Darmstadt, Väst-Tyskland (buffert-Titrisol 8,00, 9,00, 10,00, 11,00 och 12,00). En PHILIPS digital pH-meter (Pw 9408) användes.

För buffertsammansättningen hos substratlösningen med pH 8 följdes beskrivningen för trypsínbestämning. Sammansättningen hos de övriga buffertlösningarna togs från Dawson et al, jfr "Data for Biochemical Research", andra upplagan, (1969) Oxford, sid. H75 och följande. Komponenter sattes till substratlösningen, tills de nedan angivna sluthalterna erhölls: pH-område 8,3-10,3: glycin-NaOH 0,05 M 10 15 20 25 BO 35 H0 3 8104191-5 pH-område 10,8-11,3: Na2HP0u-NaOH 0,025 M pH-område 11,?-12,5: KC1-Na0H 0,05 M Enzymlösning: Lösningarna framställdes färska i vatten, och en utspädning gjordes, vars halt var 200 DU/ml. Beteckningen DU av- ser Delft-enheter, och hänför sig till en metod för bestämning av enzymaktivitet som beskrives i den brittiska patentskriften l 353 317.

Inkubering: Varje analys bestod av två bestämningar och ett nollprov. Substrat och enzymlösningar placerades i ett vattenbad vid 2500. Substratlösningarnas pH bestämdes medelst en Ingold HA- elektrod och även medelst en Ingold LOT-elektrod för pH-värden under 11,0. Till 2,5 ml substratlösning i ett centrifugrör sattes 0,5 ml av en enzym- lösning, och en god omblandning säkerställdes genom omedelbar omrör- Nollprovet utan pH-referenslösningar Titrisol användes hela tiden. ning med en glasstav, försedd med en utvidgning. enzym inkuberades även.

Inkuberingen avslutades efter 10 minuter genom tillsats av 5 ml 0,3 N triklorättíksyra, och till nollprovet sattes 5 ml av tri- klorättiksyralösningen och 0,5 ml enzymlösning. Triklorättiksyra- lösningen tillsattes medelst en ZIPPETTE (Jencons, Hemel Hempstead, Hertfordshire). Blandníngen omrördes kraftigt medelst en glasstav med utvidgning som fortfarande befann sig i centrifugröret, och rö- ren placerades i ett vattenbad vid 200. pH-förskjutningen under inkuberingen observerades genom mät- ning av pH vid början och slutet av inkuberingen med användning av en LOT-elektrod för inkuberingsvärden vid pH under 11,0 och en HA- elektrod för pH-värden över 11,0. 0,1 pH enhet för inkuberingar av enzymlösningar som innehöll 50 eller färre DU/ml, och mindre än 0,15 pH-enheter för inkuberingar av enzym- lösningar som innehöll 200 eller 500 DU/ml. Medelvärden togs på grundval av värdena från Ingold HA-elektroden.

Centrifugering: Efter minst 30 minuter vid 2°C centrifugera- des rören vid en acceleration av 6000 g.

Färgframkallning: Färgframkallning genomfördes i ett vatten- bad vid 2500, varvid 5 ml av den överstående vätskefasen sattes till 10 ml 0,5 N NaOH och blandningen omedelbart omrördes med användning av en omrörare VORTEX-GENIE (Scient. Industr., USA). Efter exakt 2 minuter sattes 3 ml fenolreagens till blandningen medelst en ZIPPETTE och under kontinuerlig omrörning. des av Merck Folin-Ciocalteus Phenolreagenz, utspätt med 2 volymer pH-förskjutningen var mindre än Fenolreagenset utgjor- 8104191-5 4 10 15 20 25 30 35 vatten.

Färgen avlästes medelst en ZEISS MH QIII spektrofotometer med slitsautomatik vid 750 nm exakt 6 minuter efter tillsatsen av Folin- reagenset. Som referens för färgframkallningen användes en tyrosin- lösning, innehållande 8 x 10-7 ekvivalenter tyrosin i 5 ml 0,2 N HCl med 0,5 % (v/v) formaldehyd. Framkallningen av referensfärgen kon- trollerades med regelbundna mellanrum, men avvikelserna från medel- värdet översteg aldrig 1 % för en sats utspätt Folin-reagens.

Enzymet uppvisar en proteolytisk aktivitet enligt följande: EH 8_,_3_ gå _9_,_1¿ gå 10,3 10,8 11,3 11,7 12,5 :fiäïëäzet 85 w 91 88 ß? 911 91 99 ÉÉÉÉÉÉQÉQÉÉÉEÉEÉÉÉÉ Enzymets uppträdande kan vidare karakteriseras av zymogram- metoden, grundad på en kombination av skivelektrofores i polyakryl- amidgel och visuell observation av aktiviteten. Metoden finnes bedwr V@S.&V Zuidweg et al i Biotech. and Bioeng. lä (1972), 685-Ylü, En jämförelse 100 (b) och möjliggör en direkt jämförelse av beredningar. har gjorts mellan enzymet enligt uppfinningen (a),en proteas, erhål- len från en Bacillus-stam som deponerats i National Collection of Type Cultures i London under NCTC Ä553, jfr brittisk patentskrift l 205 H03 (b), ett kommersiellt tillgängligt proteolytiskt enzym MAXATASE (Gíst-Brocades N.V., Delft, Holland) (c), och ett kommer- siellt tillgängligt enzym ESPERASE (d), jfr figuren i medföljande Endast huvudkomponenterna angives. Som buffertsystem an- ritning. vändas vid den elektroforetiska separationen system E, innehållande tris (dvs 2-amino-2-hydroximetyl-1,5-propandiol) och borsyra, och den visuella observationen av aktiviteten âstadkoms genom immersions- -kontaktförfarandet, såsom beskrivas i artikeln av Zuidweg et al.

Figuren visar att enzymet enligt uppfinningen består av ett flertal föreningar, vilkas sammansättning är olika från dem hos de andra enzympreparaten. <0) èrßinesxrasarmensäëësiss Aminosyrasammansättningen hos de två huvudkomponenterna A och B (se ritningen) bestämdes. Sammansättningen visas i följande tabell i jämförelse med aminosyrasammansättningarna hos ett flertal kända enzym, nämligen (l) subtilisin Carlsberg, jfr Delange och Smith, J. Biol. Chem. 2ü3 (1968) 2l3U; (2) enzymet från Bacillus sacchariticus, jfr amerikanska patentskriften 3 622 H58; (3) enzymet från Bacillus firmus, jfr amerikansk patentakrift 3 827 938; Och 10 5 81Û4191-5wñ (H) enzymet från B 221, jfr K. Horikoshi, Agr. Biol. Chem. 35 (1971) 11407.

Bestämningarna bör betraktas som behäftade med den vanliga felmarginalen av 1 10 % av de angivna värdena.

Tabellen visar vi- 5 dare molvíkterna hos enzymerna, liksom även de isoelektríska punk- terna' Enz m enl. u finnin en Aminosvra ill :gl íål Lfll Förenlng (A5 šörening IE) LYS 9 6 H 6 6 6 HIS 5 5 6 8 7 5 ARG Ä 3 6 8 9 8 ASP 23 20 23 29 27 28 THR 19 114 114 18 16 16 SER 32 37 22 23 30 30 GLU 12 12 lü 15 15 15 PRO 9 10 12 16 12 13 GLY 35 25 30 39 31 33 ALA 112 27 32 145 36 36 CYS O 0 O 0 0 0 VAL 31 20 21 27 22 22 MET 5 3 2 U 3 3 ILEU 10 12 7 9 8 9 LEU 16 12 16 22 18 18 TYR 13 9 6 7 7 6 PHE U 2 2 2 2 2 TRY l 3 - 3 3 Molvikt 27 300 22 700 26 000 30 000 25 500 25 500 Isoelek- trísk 9,3 9,3 11,0 9,U 10,5 10,5 punkt Taxonomi För den taxonomiska bestämníngen har använts Smith, Gordon och Clark, "Aerobic Sporeforming Bacteria", U.S. Dept. of Agr., Monograph Nr. 16 (1952). Sporulering av Bacillus PB 92 kan åstad- kommas genom odling av lyofilíserade kulturer av gamla TSB-agar- kulturer (65 dygn på TSB-agar (Tryptone Soya Broth, från Oxoid).

Morfologi (a) Vegetativa celler: (rör1iga)stavar, rundade ändar, i allmän- 15 het enstaka, men även i korta kedjor om två till åtta stavar. 8104191-5. 6 10 15 20 25 30 35 40 Ibland uppkommer mycket långa kedjor med en längd av 1000 Pm eller mera. (b) Sporangia: Ibland något uppsvällda. (c) Sporer: 0,6-0,8 gånger 1,0-1,3 pm, ellipsoidiska, tjock- väggiga, subterminala till paracentrala. (d) Skuggformer: Relativt många, även i mitten av en kedja av normala celler.

Ytterligare egenskaper: Maximal temperatur för tillväxt: 50°C Grampositiva, obligata aeroba.

Tillväxt på näringsagar vid pH 7,2: igångsättningen något långsammare än vid pH 9,U. Kanterna hos kolonierna vid pH 7,2 hela, men vid pH 9,ü hoprullade till trådiga.

Ingen bildning av pigment på tyrosinagar vid pH 9,5.

Svag stärkelsehydrolys på potatisstärkelse/näringsagar vid PH 9,5.

Stark sönderdelning av gelatin på gelatin/näringsagar vid pH 9,5.

Klar upplösning av kasein på mjölkagar vid pH 8,4.

Ingen eller ingen väsentlig tillväxt på glukos- eller manni- tolagar med nitrat som enda kvävekälla.

Nitratreduktion positiv i nitratnäringslösning vid pH 9,5.

Isolering.

Den mikroorganism som bildar enzymet enligt uppfinningen isolerades ur ett jordprov från Zambia medelst en specifik isole- ringsprocess vid ett pH inom området från 8,0 till 9,5.

Fermentering.

Det enzym som bildas av Bacillus PB 92 erhålles genom odling av Bacillus-arten och utvinning av det bildade enzymet på vanligt sätt. För erhållande av höga enzymutbyten erfordras medier som in- nehåller lätt assímilerbara källor för kol och energi, såsom glukos, sackaros, dextriner och stärkelse, och en kvävekälla av organiskt Vidare tillsättes före- trädesvis vissa mängder av kalcium- och magnesiumsalter, och ett ursprung, såsom kasein, jäst och sojamjöl. flertal spårelement.

En god luftning är nödvändig under odlingen. Mediets pH hål- les lämpligen mellan 6,5 och 10, företrädesvis då mellan 7 och 9.

Odlingstemperaturen är lämpligen 3700.

När alla dessa åtgärder vidtagas, kan mycket höga utbyten er- hållas (uttryckt som proteasaktivitet per gram åtgången glukos). 10 15 20 25 30 35 40 7 81-04191-5 Utbytet är tillräckligt högt för en ekonomisk framställning av en- zymet. I Utvinning av enzymet Enzymet utvinnes från odlingslösningen på vanligt sätt. Lös- ningen filtreras för avlägsnande av mikroorganismer och olösligt material. För torra tvättkompositioner utfälles vanligen enzymet genom tillsats av vattenlösliga organiska lösningsmedel eller oor~ ganiska salter, såsom Na2SOu eller (NHu)2SOu till filtratet. För en ekomonisk framställning minskas filtratets volym först genom in- drivning innan lösningsmedlen eller salterna tillsättes. För vätske- formiga kompositioner kan den filtrerade odlingsvätskan eller det återupplösta enzymet användas.

Efter utfällning frånskiljes enzymet genom filtrering eller centrifugering, och den erhållna filterkakan torkas.

Komponering Enzymet kan införlivas i tvättkompositioner på vanligt sätt.

Tvättkompositioner som innehåller enzymet utgör en ytterligare del av uppfinningen. Den mängd enzym som skall införlivas svarar all- mänt mot den som ger den slutliga tvättkompositionen en proteolytisk aktivitet av cirka 100 till 5000 DU/g, lämpligen då 500 till 1000 DU/g. Bestämningen av den proteolytiska aktiviteten finnes beskri- ven i den brittiska patentskriften l 353 317.

De tvättkompositioner som innehåller enzymet enligt uppfin- ningen innehåller ytterligare åtminstone en detergent. Detergenter som är användbara i tvättkompositionerna utgöres av dem som vanligen användes i tvättkomposítioner med enzymatisk aktivitet. Allmänt kan nonjoniska och anjoniska, ytaktiva föreningar användas, såsom vattenlösliga tvålar, anjoniska, nonjoniska, amfotera och zwitter- joniska detergenter. Ett exempel på en vanligt använd detergent ut- göres av dodecylbensensulfonat. ka kan användas ensamma eller i blandning, närvarande i mängder om Vanligen finnes detergenterna, vil- cirka Ä till 20 % av tvättkompositionerna.

Tvättkompositionerna enligt uppfinningen kan innehålla ytter- ligare beståndsdelar som vanligen användes i andra tvättkompositio- ner med proteolytisk aktivitet. De innehåller vanligen komplexa fosfater, exempelvis ett alkalimetalltripolyfosfat eller ett alkali- metallpyrofosfat, lämpligen i mängder av cirka 40 till 50 viktpro- cent av tvättkompositionen. Vidare eller alternativt kan sådana fö- reningar som alkalímetallcyanotriacetat och alkalimetallcitrat ingå, varvid deras verkan i tvättkompositioner är komplicerad, men deras 10 15 20 25 30 8104191~5. 8 viktigaste verkan är som mjukgörare för vatten. Andra föreningar som vanligen införlivas utgöres exempelvis av ett alkalimetallsili- kat, vanligen i mängder från l till 10 viktprocent, svagt alkaliska föreningar, såsom ett alkalimetallvätekarbonat, vanligen i mängder upp till 20 viktprocent, fyllmedel, exempelvis ett alkalimetallsul- fat, och andra föreningar, såsom karboximetylcellulosa, parfymer och optiska vitmedel. En annan vanligen ingående förening utgöres av ett alkalimetallperborat, speciellt då natriumperborat, och i sam- band med perborater är det att märka att enzymet enligt uppfinningen har en oväntat hög stabilitet i närvaro av dem.

Tvättkompositionerna kan framställas på vanligt sätt, såsom genom blandning tillsamans med komponenterna eller genom att en förblandning först framställes, vilken sedan blandas med de övriga beståndsdelarna. Lämpligen blandas enzymet med en eller flera av de övriga beståndsdelarna, till exempel fyllmedlet, för framställ- ning av ett koncentrat med en bestämd enzymatisk aktivitet, varvid koncentratet kan blandas med de övriga önskade beståndsdelarna. Upp- finningen åskådliggöres av de följande exemplen.

Exempel 1. Odling av Bacillus PB 92 Följande medium användes: Jäst (räknat på torrvikten) 22 g/l K2HPOu.3H2O 5 g/l MgS04.7H20 0305 g/1 CaCl2 0,05 g/1 FeS0u.7H20 0,005 g/1 mnsou.uH o 0,005 g/1 Mediets âestândsdelar löstes i 90 % av den slutliga vätske- volymen och steriliserades vid pH 7,0 och en temperatur av l20°C under l timme.

Inympningskulturen framställdes genom inympning med Bacillus PB 92 på 100 ml Trypticase Soya Broth (oxoid) till vilken efter sterilisering under 20 minuter vid l20°C sattes U ml lM natriumkar- bonat från ett snedkulturrör. Ympningsblandningen inkuberades vid 3o°c under zu timmar 1 en GALLENKAMP skaxapparat.

Mediet ympades vid 3700 och pH 8,0 med l volym av ympningskul- turen per l00 volymer medium. Huvudfermenteringen genomfördes vid 3700 i omrörda fermentorer, utrustade med regleranordning för pH och temperatur, en antiskumningsanordning och en anordning för kon- tinuerlig mätning av halten löst syre och upptagningshastigheten för syre. 17 timmar efter ympningen tillsattes en 30-procentig 10 15 20 25 30 35 HO 9 8104191-5 glukoslösning, steriliserad vid l20°C i en timme, till en slutlig halt av 30 gram glukos per liter medium.

De erhållna resultaten visar ett utbyte av det nya proteoly- tiska enzymet av cirka 8.105 DU per gram åtgången glukos.

I den amerikanska.paranfakriffan s sz? eee,- exempel 1» beskri- ves ett odlingsexperiment, i vilket erhålles ett slutligt utbyte av 11.10 DU71iter lösning (50 Anson-enheter är approximativt lika med 11.106 DU). Den använda mängden kolhydrat är ekvivalent med cirka 75 gram glukos per liter lösning. Utbytet av proteas per gram åt- gången glukos i exemplet i ansökningen 72.07050 uppgår till l,5xl05 DU. Sålunda är utbytet enligt uppfinningen cirka 5 gånger högre.

Exempel 2. Tvättverkan Tvättprovningar genomfördes på följande sätt: (1) Provstycken av tyg, EMPA-116 (fläckade med blod; mjölk och tusch), erhållna från Eídgenössische Material Prüfungs - och Versuchsanstalt für Industrie, Bauwesen und Gewerbe, Szt Gallen, Schweiz. Provstyckena förvaras i mörker och lufttätt. För ett tvättprov klippes de erforderliga styckena om 5x5 cm från en visu- ellt homogen del av tyget. (2) Tvättvätska: U g/1 av ett perborathaltigt, kommersiellt tillgängligt tvättmedel med uteslutet enzym per liter "syntetiskt vattenledningsvatten" (STW), med en tysk hårdhetsgrad av l5°DH, framställt enligt följande: 10 ml av en 2-procentig lösning av CaCl2 (pro analysi) i des- tillerat vatten sättes till 10 ml av en lösning av 0,656 % MgCl2 i destillerat vatten i 1000 ml mätkolv. Innehållet blandas noggrant.

Därefter tillsättes 10 ml av en 2,1-procentig lösning av NaHCO3 (pro analysi), och innehållet omblandas åter, samt uppfylles med destillerat vatten till 1000 ml. (3) Provning: I var och en av att tillräckligt antal 300 m1 Erlenmeyer-kolvar satsas 250 ml av tvättvätskan. Enzymmängder, sva- rande mot 0, 250, 500 och 1000 DU/g tvättkomposition tillsättes (i duplikatprov). Erlenmeyer-kolvarna placeras i en skaktermostat vid U5°C, där de får värmas under omblandning. Därefter placeras ett tygstycke i var och en av Erlenmeyer-kolvarna, och det hela omskakas i exakt 1 timme vid 4500.

Efter tvättningen avdekanteras tvättvätskorna och 250 ml STW tillsättes. Kolvarna tillslutes med gummiproppar och skakas kraf- tigt under exakt 1 minut.

Tygstyckena uppsamlas i en bägare, i vilken de sköljes i lång- 10 8104191-5- 10 samt rinnande vattenledningsvatten. Efter tillsats av det sista tygstycket fortsättes sköljningen i cirka 10 minuter. Därefter får tygstyckena torka i luft i mörker, invikta i en vit, ren handduk.

Efter torkning bestämmas remissionen i en ZEISS ELREPHO remis- sionsmeter med filter nr l på båda sidor med användning av MgO som referens. Medelvärdena beräknas med hänvisning till ett helt ren- tvättat tygstycke med en remission av 65,8 % mot MgO.

Jämförelse av enzymet enligt uppfinningen med I/IAXATASE ® och ESPERASE än Tvättprovningarna genomfördes på ovan angivet sätt vid pH 9,7.

Följande resultat erhölls: ,, . .

DU/g Eñzym enl. ušpïrnlnirsxëä: I I A I A o 20 - - - - - 250 lll 21 30 10 31 ll 500 146 26 33 13 36 16 1000 52 32 36 16 39 19 Av tabellen framgår, att under provningsbetingelserna har en- zymet enligt uppfinningen en bättre tvättverkan äë de kommersiellt tillgängliga produkterna MAXATASE ® och ESPERASE .

Claims (3)

N 8104191-5 Patentkrav

1. Tvättkomposition med proteolytisk aktivitet, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innehåller en verksam mängd av ett enzym, framställt genom odling av den nya Bacillus- arten PB 92 deponerad vid laboratoriet för mikrobiologi vid tek- niska universitetet i Delft, Holland under depositíonsnumret OR-60 eller dess mutanter som bildar proteolytiskt enzym och har väsentligen samma egenskaper.

2. Tvättkomposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den innehåller enzymet tillsammans med en detergent, ett mjukgöringsmedel för vatten, ett alkalimetall- silikat, ett svagt alkaliskt vätekarbonat, och eventuellt ett alkalimetallperborat.

3. Sätt att framställa en tvättkomposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att ett proteolytiskt enzym, framställt genom odling av den nya Bacillus-arten PB 92 eller dess mutanter med väsentligen samma egenskaper, blandas med de tvättmedelskomponenter som avses för kompositionen.