DE2551742A1 - Protease, verfahren zu ihrer herstellung und waschmittel - Google Patents

Description

" Protease, Verfahren zu ihrer Herstellung und Waschmittel " Priorität: 19. November 1974, Großbritannien, Nr. 50 044/74

Proteolytisch v/irkende Enzyme mit hoher proteolytischer Aktivität im alkalischen Bereich sind bekannt. Von Vetter (vgl. Antonie van Leeuwenhoek, Bd. 1 (1934), Seiten 141 bis 147) wurde ein Mikroorganismus beschrieben, der als Bacillus alcalophilus bezeichnet wurde. Dieser Mikroorganismus kann Gelatine und Hämoglobin in stark alkalischem Medium abbauen. Diese Eigenschaft des Mikroorganismus wird, wie spätere Untersuchungen ergaben (vgl. GB-PS 1 205 403), der Wirkung eines Enzyms zugeschrieben. Enzyme mit hoher Aktivität in alkalischen Medien sind auch aus der GB-PS 1 243 784 und der NL-OS 72.07050 bekannt. Darin werden mehrere proteolytisch v/irkende Enzyme beschrieben, die von Mikroorganismen der Gattung Bacillus gebildet werden und in Waschmittein verwendet werden können, die normalerweise alkalisch sind, wenn sie in der Yfaschflüssigkeit aufgelöst werden.

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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein proteolytisch wirkendes Enzym (nachstehend kurz als Protease bezeichnet) mit hoher proteolytischer Aktivität in alkalischen Medien zu schaffen, das sich als Zusatz für Waschmittel eignet. Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Das Enzym kann in überraschend hohen Ausbeuten aus dem Mikroorganismus Bacillus nov. spec, mit der Bezeichnung PB 92, seinen nach üblichen Methoden hergestellten Mutanten oder Varianten erhalten werden. Die Ausbeuten sind höher als die, die beispielsweise mit dem in der NL-OS 72.07050 beschriebenen Stamm von Bacillus firmus erhalten werden. Ein weiterer unerwarteter Vorteil der Erfindung ist die überraschend gute Waschwirkung des Enzyms in perborathaltigen Waschmitteln. Eine Kultur des Mikroorganismenstammes Bacillus PB 92 ist im Laboratorium für Mikrobiologie der Technischen Universität DeIft, Niederlande, hinterlegt und hat dort die Bezeichnung OR-60 erhalten.

Die Protease der Erfindung wird durch Züchten von Bacillus PB 92 oder seiner Mutanten oder Varianten in einem Nährmedium, das übliche Kohlenstoff-, Stickstoff- und Spurenelementquellen enthält, unter aeroben Bedingungen und anschließendes Isolieren des erhaltenen, proteolytisch v/irkenden Enzyms aus der Kulturbrühe hergestellt.

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^Γ -3- 7551742"¹

Eigenschaften des Enzyms
(a) Beziehung pH-Wert/Aktivität

Zur Bestimmung der Beziehung pH-Wert/Aktivität wird die Hämoglobinmethode nach Anson (vgl. J. Gen. Physiology, Bd. 22 (1939)» Seiten 79 bis 89) so genau wie möglich angewandt. Anweisungen, die nicht in dem Artikel von Anson angegeben sind, sind nachstehend aufgeführt:

Substrat:

Rinderhämoglobulin, Proteasesubstrat gemäß Anson, rein lyophilisiert.

Subs tratlö suns·:

Das Hämoglobin wird unter Rühren mit V/asser zu einer 22prozentigen Lösung (Gewicht/Volumen) vermischt. 10 ml dieser frisch angesetzten, konzentrierten Lösung v/erden mit 8 ml 1 η Natronlauge, 72 ml Wasser und 36 g Harnstoff versetzt und verdünnt. Die alkalische Lösung wird 60 Minuten auf 25°C erwärmt, um das Hämoglobulin zu denaturieren.

Es werden die nachstehenden Pufferlösungen, Harnstoff und Natriumäthylmercurithiosalicylat (Thiomersal) zugegeben. Der pH-Wert wird mit einer Elektrode (Ingold HA) eingestellt. Das Volumen wird so eingestellt, daß eine 2,2prozentige Hämoglobinlösung erhalten wird.

Als pH-Vergleichslösungen v/erden Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 8,00, 9,00, 10,00, 11,00 und 12,00 eingesetzt. Es wird ein digitales pH-Meter verwendet.

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^Γ - 4 - 2 B 51 7 A 2 ^π

Die Zusammensetzung des Puffers für die Substratlösung mit einem pH-Wert von 8 folgt nach der Beschreibung für die Trypsinbestimmung. Die Zusammensetzung der übrigen Pufferlösungen sind aus Dawson et al., "Date for Biochemical Research", 2. Ausgabe (1969), Oxford, S. 475 ff. entnommen.

Die Komponenten werden zur Substratlösung gegeben, bis die nachstehenden Endkonzentrationen erhalten werden: pH-Bereich 8,3.- 10,3: Puffersystem Glycin - NaOH (0,05 M) pH-Bereich 10,8- 11,3: Puffersystem Ka₂HPO₄ - NaOH (0,025 M) pH-Bereich 11,7- 12,5: Puffersystem KCl - NaOH (0,05 M).

E_nzymlösung

Es v/erden frische Lösungen in Wasser hergestellt. Eine verdünnte Lösung hat eine Enzymkonzentration von 200 DE/ml. LIe Bezeichnung DE bezieht sich auf Delft-Einheiten, die sich wiederum auf eine Methode zur .Bestimmung der Enzymaktivität beziehen, die in der GB-PS 1 353 317 beschrieben ist.

Inkubation:

Jede Analyse besteht aus zv/ei Bestimmungen und einer Blindbestimmung. Die Substrat- und Enzymlösimgen v/erden in einem Wasserbad auf 25⁰C eingestellt. Der pH-Wert der Substratlösungen wird mit einer Elektrode (Ingold HA) bestimmt, wobei für pH-Werte unter 11,0 auch eine Elektrode (Ingold LOT) verwendet wird. Als pH-Vergleichslösungen werden Puffer-Vergleichslösungen verwendet. 2,5 ml der Substratlösung werden in einem Zentrifugenröhrchen mit 0,5 ml Enzymlösung versetzt und unmittelbar danach mit einem. Glasstab, der mit einem Griff versehen ist, durch Rühren _j

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vermischt. Die Blindlösung, die kein Enzym enthält, wird ebenfalls inkubiert.

Die Inkubation wird nach 10 Minuten durch Zugabe von 5 ml 0,3 η Trichloressigsäure beendet. Zur Blindlösung v/erden 5 ml der Trichloressigsäurelosung und 0,5 ml Enzymlösung zugegeben. Die Trichloressigsäurelosung wird mit einer ZIPPETTE zugegeben. Das Gemisch wird anschließend mit dem Glasstab, der mit einem Griff versehen ist, noch in dem Zentrifugenröhrchen stark gerührt. Anschließend werden die Zentrifugenröhrchen in ein Wasserbad von 2°C eingebracht.

Die Drift des pH-Wertes während der Inkubation wird zu Beginn und am Ende der Inkubation mit einer Elektrode (LOT-Elektrode für pH-Werte unterhalb 11,0 und HA-Elektrode für pH-Werte oberhalb 11,0) gemessen. Die Drift des pH-Wertes beträgt weniger als 0,1 pH-Einheiten bei der Inkubation von Enzymlösungen, die 50 oder weniger DE/ml enthalten und weniger als 0,15 pH-Einheiten bei der Inkubation von Enzymlösungen, die 200 bis 500 DE/ml enthalten. Als Grundlage dienen Mittelwerte, die mit der HA-Elektrode erhalten wurden.

Zentrifugation:

Nachdem die Inkubationslösungen mindestens 30 Minuten bei 2⁰C gehalten wurden, werden die Zentrifugenröhrchen bei 6000 g zentrifugiert.

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-ο,

Farbentwi cklunp;:

Die Farbentwicklung wird in einem Wasserbad bei 25^WC durchgeführt. 5 ml des Überstandes werden mit 10 ml 0,5 η Natronlauge versetzt. Das Gemisch wird anschließend sofort mit einer Vortex-Genie- Vorrichtung gerührt. Nach genau 2 Minuten wird das Gemisch mit 3 ml eines Phenolreagenzes mit einer ZIPPETTE unter fortwährendem Rühren versetzt. Als Phenolreagenz wird das Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz verwendet, das mit 2 Volumenteilen Wasser verdünnt wird.

Die Farbentwicklung wird mit einem Spektrometer mit automatischem Spalt bei 750 nm genau 6 Minuten nach der Phenol-Reagenz-Zugabe gemessen. Als Vergleichslösung zur Bestimmung der Farbentwicklung wird eine Tyrosinlösung verwendet, die 8 χ 10 Tyrosinäquivalente in 5 ml 0,2 η Salzsäure mit 0,5 Volumenprozent Formaldehyd enthält. Die Farbentwicklung der Vergleichslösung wird in gleichmäßigen Abständen überprüft. Die Abweichungen vom Mittelwert liegen dabei unter 1 % bei einem Ansatz eines verdünnten Phenolreagenzes,

Das Enzym weist folgende proteolytische Aktivität auf:

pH-Werte	85	Of O	91	9.8	10.3 87	10 j 8 94	11.3	11,7	12,5
.relative. Aktivität	87	83	91	99	100

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(b) Elektrophoreseuntersuchung

Das Verhalten des Enzyms kann weiterhin durch die Zyciogramm-Methode gekennzeichnet werden, die auf einer Kombination der Discelektrophorose in Polyacrylamidgel und einer visuellen Beobachtung der Aktivität beruht. Die Methode ist von Zuidweg et al. in Biotech, and Bioeng., Bd. 14 (1972) Seiten 685 bis beschrieben und gestattet einen direkten Vergleich der Enzympräparate. Der Vergleich wird

(a) mit dem Enzym der Erfindung

(b) einer Protease, die von einem Stamm der Gattung Bacillus erhalten wurde, der bei der National Collection of Type Cultures in London unter der Bezeichnung NCTC 4553 hinterlegt wurde (vgl. GB-PS 1 205 403),

(c) einem im Handel erhältlichen, proteolytisch wirkendem Enzym MAXATASE und

(d) einem im Handel erhältlichen Enzym ESPERASE durchgeführt und ist in der Figur gezeigt. Die Figur weist nur die Hauptkomponenten der Präparate auf (als Puffersystem wird in der elektrophoreti sehen Trennung das System E verwendet, das 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol und Borsäure enthält ).

Die visuelle Beobachtung der Aktivität wird nach der Immersion-Kontakt-Technik (vgl. die Beschreibung von Zuidweg et al., a.a.O.) durchgeführt.

Die Figur zeigt, daß das Enzym der Erfindung aus mehreren Verbindungen besteht, wobei sich die Zusammensetzung des Enzyms von den Zusammensetzungen der übrigen Enzym-Präparate unterscheidet.

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Amj.nosäure2usammeiisetzung des Enzyms der Erfindung
Die Aminosäurezusammensetzung der zwei Hauptkoraponenten A und B (vgl. Figur) wird "bestimmt und ist in Tabelle I im Vergleich zu den Aminosäurezusammensetzungen mehrerer bekannter Enzyme

1. Subtilisin Carlsberg (vgl. Delange und Smith, J. Biol# Chem.

Bd. 243 (1968) S. 2134)

2. Enzym von Bacillus Sacchariticus (vgl. US-PS 3 622 458)

3. Enzym von Bacillus firraus (vgl. I¹JL-OS 72.07050) und

4. Enzym von B 221 (vgl. K. Horikoshi, Agr. Biol. Chera., Bd. 35 (1971), S. 1407) gezeigt.

Der Fehler dieser Bestimmungen liegt bei +, 10 %.

Die Tabelle zeigt weiterhin die Molekulargev/ichte der Enzyme
und ihre isoelektrischen Punkte.

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„ a _

Tabelle I

? .S R1 7 A

Amino	O)	(2)	(3)	(4)	Enzym der Erf in-Ί dun,? !	Kompiü)
säure	9	6	4	6	Komp.(λ)	6
LYS	5	VJi	6	8	6	6
HIS	4	3	6	ε	7	8
ARG	28	20	23	29	9 ' -	28
ASP	19	14	14	18	27	16
THR	32	37	22	23	16	30
SER	12	12	14	16	30	15
GLU	9	10	12	16	15	13
PKO	36	25	30	39	12	33
GLY	42	27	32	45	31	36
ALA	O	0	0	0	36	0
OYS	31	20	21	27	0	22
VAL	VJl	3	2	4	22	3
MS?	10	12	7	"9	3	9
ILEU	16	12	16	22	8	18
LEU	13 ■	9	6	7	18	6
TYH	4	2	2	2	7	2
PHIi	1	3	-	5	2	3
TRY	27,300	22,700	26,000	30,000	3	25,500
HoI.- Gewicht	9,3	9,3	11jO		25,500	10,5
Isoelek- trischer Punkt	10;5

Taxonomi e

Die taxonome Bestimmung wurde gemäß Smith, Gordon und Clark, "Aerobic Sporeforming Bacteria", U.S. Dept. of Agr., Monographie Nr. 16 (1952), durchgeführt. Die Sporulierung des Mikroorganismus Bacillus PB 92 kann durch Kultivieren

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lyophilisierter Kulturen von 65 Tage alten TSB-Agarkulturen (TSB : Trypton-Soya-Brühe aus Oxoid) auf TSB-Agar induziert werden.

Morphologie

(a) Vegetative Zellen: (bewegliche) Stäbchen, abgerundete Enden, im allgemeinen vereinzelt, aber auch in kurzen Ketten von 2 bis 8 Stäbchen; manchmal sehr lange Ketten mit einer Länge von mindestens 100Ou.

(b) Sporangien: Manchmal etwas verdickt

(c) Sporen: 0,6 - 0,8 sowie 1,0 - 1,3 u; ellipsoid, dickwandig;subterminal bis parazentral.

(d) Schattenformen: ziemlich viele; auch in der Mitte einer Kette von normalen Zellen.

Weitere Eigenschaften

Maximale Wachstumstemperatur: 5O⁰C

Gram-positiv; nur aerob

Wachstum auf Nähragar bei pH-Viert von 7,2: etwas langsamerer Wachstumsbeginn als bei einem pH-Wert von 9,k. Die Kanten der Kolonien sind bei dem pH-Wert von 7,2 glattrandig, bei einem pH-Wert von 9,4 aber gewellt bis faserförmig.

Keine Pigmentbildung auf Tyrosinagar bei einem pH-Wert von 9,5· Schwache Stärkehydrolyse auf Kartoffelstärke/Nähragar bei einem

pH-Wert von 9,5, . .

Starke Verflüssigung von Gelatine auf Gelatine/Nähragar bei einem pH-Wert von 9,5.

Deutlicher Caseinabbau auf Milchagar bei einem -pH-Wert von 8,4·.

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- ·Μ - ?551742

Kein oder kein wesentliches Wachstum auf Glucose- oder Monn.itagar mit Nitrat als einziger Stickstoffquelle. Positive Nitratreduktion in einer Nitrat/Nährbrühe bei einem pH-Wert von 9,5·

Isolierung

Der Mikroorganismus, der das Enzym der Erfindung produziert, wurde aus einer Bodenprobe in Sambia mit einer spezifischen Isolationsmethode bei einem pH-¥ert von 8,0 bis 9,5 isoliert.

Züchtung

Das von dem Mikroorganismus Bacillus PB 92 produzierte Enzym wird durch Züchten des Mikroorganismus und anschließendes Abtrennen des produzierten Enzyms in üblicher Weise erhalten. Zur Erzielung hoher Ausbeuten des Enzyms ist ein Medium nötig, das gut assimilierbare Kohlenstoff- und Energiequellen, wie Glucose, Sucrose, Dextrine oder Stärke, und Stickstoffquellen organischen Ursprungs enthält, wie Casein, Hefe oder Sojamehl. Weiterhin werden vorzugsweise bestimmte Mengen von Calcium- und Magnesiumsalzen sowie mehrere Spurenelemente zugegeben.

Während der Züchtung ist eine gute Belüftung notwendig. Der pH-Wert des Mediums wird bei 6,5 bis 10, vorzugsweise bei 7 bis 9, gehalten. Die Züchtungstemperatur liegt bei 57⁰C.

Bei Beachtung dieser Maßnahmen können sehr hohe Ausbeuten (Proteaseaktivität pro g umgesetzte Glucose) erhalten werden. Die Ausbeute ist hinreichend hoch für eine wirtschaftliche Herstel-

lung des Enzyms. _j

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Abtrennung des Enzyms

Das Enzym wird aus der Kulturbrühe in üblicher Weise abgetrennt. Die Brühe wird filtriert, um die Mikroorganismen und unlösliches Material abzutrennen. Zur Herstellung wasserfreier Waschmittel wird das Enzym im allgemeinen durch Zugabe wassermischbarer organischer Lösungsmittel oder anorganischer Salze, wie Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat, zum Filtrat ausgefällt. Für eine wirtschaftliche Herstellung wird das Filtratvolumen zuerst durch Verdampfen eingeengt, bevor die Lösungsmittel oder die Salze zugegeben werden. Für flüssige Waschmittel können die filtrierte Brühe oder das wieder aufgelöste Enzym verwendet . werden.

Nach dem Ausfällen wird das Enzym durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Anschließend wird der erhaltene Filterrückstand getrocknet.

Formulierung

Das Enzym kann in üblicher Weise Waschmitteln einverleibt werden. Die Menge des verwendeten Enzyms entspricht im allgemeinen der Menge, bei der das gesamte Waschmittel eine proteolytische Aktivität von ungefähr 100 bis 5000 DE/g, vorzugsweise 500 bis 1000 DE/g_#besitzt. Die Bestimmung der proteolytischen Aktivität ist in der GB-PS 1 553 317 beschrieben.

Die Waschmittel mit dem Enzym der Erfindung· enthalten weiterhin mindestens ein Tensid. Als Tenside in Waschmittein werden diejenigen Tenside eingesetzt, die allgemein in Waschmitteln mit en-

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zyma"bischer Aktivität verwendet v/erden. Im allgemeinen können nicht-ionische und anionische oberflächenaktive Verbindungen, wie wasserlösliche Seifen, anionische, nicht-ionische, ampholytische oder zwitterionische Tenside, verwendet werden. Ein Beispiel eines allgemein verwendeten Tensids ist Dodecylbenzolsulfonat. Üblicherweise liegen die Tenside, die allein oder im Gemisoh verwendet werden können, in einer Menge von ungefähr 4 bis 20 % des Waschmittels vor.

Die Waschmittel der Erfindung können weitere zusätzliche Verbindungen enthalten, die allgemein in Waschmitteln mit proteolytischer Aktivität verwendet werden. Sie enthalten üblicherweise komplexe Phosphate, beispielsweise ein Alkalimetalltripolyphosphat oder ein Alkalimetallpyrophosphst, vorzugsweise in Mengen von etwa 40 bis 50 Gewichtsprozent, bezogen auf das Waschmittel. Weiterhin oder alternativ können Verbindungen, wie ein Alkalimetallcyanotriacetat oder ein Alkalimetallcitrat, verv/endet werden. Ihre Wirkung in Waschmitteln ist komplex, wobei • aber ihre Wirkung als Wasserweichmacher die größte Bedeutung hat. Weitere Verbindungen, die üblicherweise zur Herstellung von Waschmitteln verwendet werden, sind beispielsweise Alkalimetallsilikate, im allgemeinen in Mengen von 1 bis 10 Gewichtsprozent, schwach alkalische Verbindungen, wie Alkalimetallbicarbonate, im allgemeinen in Mengen von höchstens 20 Gewichtsprozent, Füllstoffe, 'beispielsweise Alkalimetallsulfate, und v/eitere Verbindungen, wie Carboxymethylcellulose, Duftstoffe und optische Aufheller. Eine weitere üblich verwendete Verbindung ist ein Alkalimetallperborat, insbesondere Natriumperborat. In

L -J

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Verbindung mit den Perboraten zeigt das Enzym der Erfindung eine unerwartet hohe Stabilität.

Die Waschmittel können in üblicher Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Vermischen der Komponenten oder durch Her stellen eines Teilgemisches, das anschließend mit den üblichen Komponenten vermischt wird. Vorzugsweise wird das Enzym mit einem oder mehreren der üblichen Verbindungen, beispielsweise dem Füllstoff, vermischt, um ein Konzentrat mit einer zuvor bestimmten enzymatisehen Aktivität herzustellen, das wiederum mit den anderen Komponenten vermischt v/erden kann.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Züchtung des Mikroorganismus Bacillus P3 92. Es wird folgendes Medium verwendet: e/h't r

Hefe (bezogen auf das Trockengewicht) 22 K₂HPO₄.3H₂O 5

MgSO₄.7H₂O 0,05

CaCl₂ 0,05

FeSO₄.7H₂O 0,005

MnSO₄.4H₂O 0,005

Die Komponenten des Mediums v/erden in 90 % des Endvolumens gelöst. Anschließend wird die Lösung 1 Stunde bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 12O⁰C sterilisiert.

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7 42

Die Impfkultür wird durch Impfen von 100 ml Trypticase—Soja-Brühe (0xoid)_f zu der nach 20minütigem Sterilisieren bei 120⁰C 4 ml 1 M Natriumcarbonatlösung aus einem Schrägröhrchen zugegeben wurde, mit dem Mikroorganismus Bacillus PB 92 erhalten. Die Impfkultur wird 24 Stunden bei 30⁰C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert.

Das Medium wird bei 37⁰C und einem pH-Wert von 8,0 mit 1 Volumenteil der Impfkultur pro 100 Volumenteile Medium beimpft. Die Hauptzüchtung wird bei 37⁰C in Rührfermentern durchgeführt, die mit einer pH-Regelvorrichtung, einer Temperaturregelvorrichtung, einer Antischaumvorrichtung und einer Vorrichtung für das kontinuierliche Messen der Konzentration des gelösten Sauerstoffs und der Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit ausgerüstet ist. 17 Stunden nach dem Impfen wird eine 30prozentige Glucoselösung, die 1 Stunde bei 120⁰C sterilisiert wurde, bis zu einer Endkonzentration von 30 g Glucose pro Liter Medium zugegeben.

Die erhaltenen Ergebnisse v/eisen auf eine Ausbeute des proteolytisch wirkenden Enzyms von etv/a 8 χ 10 DE/g verbrauchte Glucose hin.

In Beispiel 1 der NL-OS 72.07050 ist ein Züchtungsversuch beschrieben, bei dem eine Endausbeute von 11 χ-10 DE/Liter Kulturbrühe erhalten wird (50 Anson-Einheiten entsprechen etv/a 11 χ 10 DE). Die Menge der verwendeten Kohlenhydrate entspricht etwa 75 g Glucose/Liter Kulturbrühe. Die Ausbeute an

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- ie .-■■ 7 5 51 7 Λ 2

Protease/g verbrauchte Glucose im Beispiel der NL-OS 72.07050 entspricht 1,5 x 10 DE. Das bedeutet, daß die Ausbeute des Enzyms der Erfindung etwa 5 mal größer ist.

Beispiel 2
Waschwirkunfi
Die Waschuntersuchungen werden auf folgende Weise ausgeführt:

(a) zu untersuchende Kleidungstückproben: EMPA-116 (verschmutzt mit Blut, Milch und chinesischer Tinte) von der Eidgenössischen Materialprüfungs- und Versuchsanstalt für Industrie, Bauwesen und Gewerbe, St. Gallen, Schweiz. Die zu untersuchenden Kleidungsstückproben werden im Dunkeln und luftdicht aufbewahrt. Zur Waschuntersuchung werden Stücke von 5 x 5 cm aus einem visuell homogenen Teil des Kleidungsstücks ausgeschnitten.

(b) Waschlaugen: 4 g eines perborathaltigen, handelsüblichen Waschmittels ohne Enzym pro Liter synthetisches Leitungswasser mit einer Härte von 15°d (deutscher Härtegrad). Das synthetische Wasser wird auf folgende Weise hergestellt: 10 ml einer Lösung von 0,656 % MgCIg in destilliertem Wasser werden mit 10 ml einer Lösung von 2 % CaCl₂ (pA) in destilliertem Wasser in einem 1000 ml Meßkolben versetzt und kräftig vermischt. Die erhaltene Lösung wird anschließend unter Rühren mit 10 ml einer Lösung von 2', 1 % NaHCO, vermischt und mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

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— 1 / —

? 5 5 1 7 4 2 ^π

(c) Waschuntersuchung: 250 ml Waschlauge werden jeweils in einer ausreichenden Zahl von 300 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben. Das Enzym wird anschließend in einer Menge von 0, 250, 500 und 1000 DE/g Waschmittel jeweils in einem doppelten Ansatz zugegeben. Die Erlenmeyerkolben werden in einem Schüttelthermostaten bei 45⁰C gehalten, in dem sie unter Schütteln aufgewärmt werden. Anschließend wird jeweils eine Kleidungsstückprobe in den Erlenmeyerkolben zugegeben, die genau 1 Stunde bei A-5°C geschüttelt v/erden. Nach dem Waschen wird die Waschlauge dekantiert. Es werden 250 ml synthetisches Leitungswasser zu den Erlenmeyer-Kolben zugegeben. Die Kolben v/erden mit Gummistopfen verschlossen und genau 1 Minute kräftig geschüttelt. Die Kleidungstückprobsn werden in einem Becherglas gesammelt, in dem sie mit langsam fließenden Leitungswasser gespült werden. Nach Zugabe der letzten Kleidungsstückprobeil wird das Spülen etwa 10 Minuten fortgesetzt. Anschließend läßt man die Kleidungstückproben, die in einem weißen sauberen Handtuch zusammengefaltet sind, an der Luft im Dunkeln trocknen.

Nach dem Trocknen wird die Remission in einem Rernissionsmeßgerät beidseitig bestimmt, v/obei MgO als Referenz substanz verwendet wird. Die Mittelwerte werden hinsichtlich einer vollständig rein gewaschen Kleidungsstückprobe berechnet, die eine Remission von 65,8 % bezogen auf MgO besitzt.

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Vergleich des Enzyms der Erfindung mit MAXATASE und ESPBRASE Die Waschuntersuchungen werden gemäß der vorstehenden Weise bei einem pH-Viert von 9>7 durchgeführt. In Tabelle II sind die Ergebnisse zusammengefaßt.

Tabelle II

DE/g	% Remission	Δ	VÄXA	■v~	Δ	-	V\S 2	Δ
	Enzym der Erfindung	~		TASS		31	-
O		21	_	.10	36	11
250	20	26	30	13	39	16
500	41 ·	32	33	16		19
1000	46		36
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Die Tabelle zeigt, daß unter den Untersuchungsbedingungen das Enzym der Erfindung eine bessere Waschwirkung als die handelsüblichen Enzyme Maxatase und Esperase auf v/eist.

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Claims (4)

- 19 Patentansprüche

1. Protease, hergestellt durch Züchten von Bacillus nov. spec. PB 92 (OR-βθ), oder seinen nach üblichen Methoden hergestellten Mutanten oder Varianten unter, aeroben Bedingungen in einem üblichen Nährmedium und Isolieren der entstandenen Protease aus der Kulturbrühe.

2. Verfahren zur Herstellung der Protease nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus nov. spec. PB 92 (OR-60), oder seine nach üblichen Methoden hergestellten Mutanten oder Varianten unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das übliche Kohlenstoff-, Energie- und Stickstoffquellen, Calcium- und Magnesiumsalze sowie Spurenelemente enthält, züchtet und die entstandene Protease aus der Kulturbriihe isoliert.

Ji. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Protease durch Filtrieren der Kulturbrühe, Fällen des Enzyms im Filtrat mit wassermischbaren organischen Lösungsmitteln oder anorganischen Salzen, Abfiltrieren oder Abzentrifugieren sowie anschließendes Trocknen des Niederschlags isoliert.

4. Waschmittel, bestehend aus der Protease nach Anspruch 1 sowie einem Tensid, einem Wasserweichmacher, einem Alkalimetallsilikat, einem schwach alkalischem Bicarbonat, gegebenenfalls einem Alkalimetallperborat und/oder üblichen Hilfsstoffen.

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