DE2334463A1

DE2334463A1 - Verfahren zur gewinnung von proteolytischen enzymen, die so hergestellten proteolytischen enzyme und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2334463A1
Application number: DE19732334463
Authority: DE
Inventors: Karin Pinholt Vestberg; Karl Johan Stampe Villadsen
Original assignee: Grindstedvaerket AS
Current assignee: Grindstedvaerket AS
Priority date: 1972-07-07
Filing date: 1973-07-06
Publication date: 1974-01-24
Also published as: DE2334463B2; FR2192169B3; FR2192169A1; NL177421C; DE2334463C3; US3960665A; GB1405771A; DK138903B; DK138903C; NL7309526A

Description

DR. BERG DIPL. ING. STAPF DIPL.-ING. SCHWA3E DR. DR. SANDMAIR

PATENTANWÄLTE 23 3 A 46 3

8 MÜNCHEN 86, POSTFACH 86 02 45

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf, 8 München 86, P. O. Box 86 02 45

Anwaltsakte Nr. 24 086

Ihr Zeichen Unser Zeichen 8 MÜNCHEN 80 0· <-^:Uil Ij 73

Yourref. Ourref. 24 086 Mauerkircherstraße 45

Aktieselskabet Grindstedvae rket, Arhus / Dänemark

Verfahren zur Gewinnung von proteolytischen Enzymen, die so hergestellten proteolytischen Enzyme und ihre Verwendung.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von proteolytischen Enzymen mit Hilfe von Bakterien, die auf diese Weise hergestellten Enzyme und die Verwendung derartiger Enzyme in Detergenzzubereitungen und dergl..

Proteolytische Enzyme werden in .großem Umfange zur Verbesserung der Reinigungswirkung in DetergenzZubereitungen, insbesondere von Hochleistungsdetergenzzubereitungen, verwendet.

_bu/he 309884/1386 _₂_

(0811)98 82 72 Telegramme: BERGSTAPFPATENT München Banken: Bayerische Vereinsbank München 453 100

70 43 TELEX: 05 24 560 BERG d Hypo-Bank München 389 2623

33 10 Postscheck München 653 43 -808

233UG3

Infolge der stark alkalischen Bedingungen, die in den Lösungen der DetergenzZubereitungen vorherrschen, sollten die in solchen Zubereitungen verwendeten Enzyme sogar bei stark alkalischen pH-Werten stabil sein und die meisten der bisher verwendeten Enzyme bakteriellen Ursprungs werden daher mit Hilfe von Bakterien aewonnen, die aus alkalischer Umgebung isoliert wurden. Nach einer bekannten Methode werden daher proteolytische Enzyme zur Verwendung in DetergenzZubereitungen gewonnen, indem die Bakterien vom Geschlecht Bacillus, die sich bei einem pH von 9-11 vermehren bzw. wachsen, in einem geeigneten alkalischen Fermentationsmedium fermentiert werden und die so erzeugten proteolytischen Enzyme gewonnen werden.

Aber selbst die auf diese Weise gewonnenen proteolytischen Enzyme verlieren - obwohl sie in Waschlaugen bei einem pH bis zu 11 weitgehend stabil sind - schnell ihre Aktivität in Anwesenheit von Perboraten und PoIyphosphaten, die in den meisten DetergenzZubereitungen enthalten sind, und es besteht aus diesem Grurde ein Bedarf an proteolytischen Enzymen, die bei hohen alkalischen pH-Werten bei Anwesenheit von Perboraten und Polyphosphaten stabil sind.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß ein Mikroorganismus vom Geschlecht Bacillus, das in einer Seewasserprobe des ^pazifischen Ozeans gefun-

309884/1386 _ ₃ _

den wurde, imstande ist, ein proteolytisches Enzym oder Enzymgemisch zu erzeugen, das nicht nur bei hoher Alkalität, sondern auch bei Anwesenheit von Perboraten und Polyphosphates die gewöhnlich in Detergenzzubereitungen vorliegen, ziemlich aktiv ist. Dieser Mikroorganismus zeigt die folgenden charakteristischen Daten:

Stäbchen 0,7x2- 10 u. Gram-variabel bis Gram-positiv, gebogen, Enden abgerundet.
Beweglich mit lateralen Geissein.

Die Stäbchen treten einzeln oder in kurzen Ketten auf. Die Stäbchen färben sich gleichmäßig. Keine Vakuolen. Die Sporen sind oval-zylindrisch, zentral-subterminal. Die Sporen bauchen die Stäbchen nicht auf. Sie v/erden nur auf Sojabohnen-Substrat gebildet. Schattenformen ("entleerte Zellen") werden gebildet. Putterartige, wachsartige Kolonien, gewölbt, rund, glatt, weißlich, nicht pigmentiert. Agar Schrägkultur sanft, flach, opak.

Kolonien auf Sojabohnensubstrat sind leicht runzelig mit feingezackten Rändern. Kein Wachsen oder nur sehr schwaches Wachsen auf Glukose-Agar-Substrat. Gelatine-Stechkultur: Langsame Verflüssigung, von Stratiform auf Crateriform.
Celatine-Agar-Strichkultur: moderate Hydrolysezone (2 T'age) . MiIch-Agar-StrIchkultur: keine Hydrolyse.

309884/1386

- 4-

Lackmus-Milch unverändert.
Blut-Agar: keine Hämolyse.

Fleischbouillon: leichte Flockenbildung mit viskosem Bodensatz. Gutes Wachsen auf 5 % NaCl. Kartoffel: kein Wachsen. Indol wird nicht gebildet. Keine Säure- oder Gasbildung auf Glukose oder anderen Zuckerarten.

Ammonium-SaIze können nicht als alleinige Stickstoffquelle verwendet werden.

Die Stärke wird hydrolysiert. Acetyl-Methylcarbinol wird nicht gebildet.

Sehr schwaches Wachsen auf Glukose-Substrat. Zitrate werden schlecht ausgenutzt.

Nitrit wird gebildet und einzelne Blasen von N₂ werden in halbflüssigem Medium entwickelt. Urease wird nicht gebildet.

Aerob, Oxidase positiv.

Verglichen mit den Stämmen der Familie Bacillaceae, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7. Auflage, 1957,) beschrieben sind, ist der Stamm dem Bacillus firmus ähnlicher als irgendeiner anderen anerkannten Art, unterscheidet sich aber in Bezug auf Ausnutzung von Zitrat und Hydrolyse von Kasein. Der Stamm kann vielleicht als eine firmus-lentus-Zwischenform klassifiziert werden.
Die beiden Arten sind aber noch nicht sehr crenau be-

309884/1386

- 5.- 233A463

schrieben und voneinander abgegrenzt worden und Gruppen von Bazillen mit geringen biochemischen Aktivitäten erfordern ein weiteres Studium, bevor die Klassifizierung als endgültig abgeschlossen betrachtet werden kann.

Der Stamm wurde mit Bacillus firmus var. Arosia bezeichnet und eine Kultur wurde in der National Collection of Industrial Bacteriae in Aberdeen unter der Nr. 10 557 hinterlegt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von Bacillus firmus var. Arosia unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Medium fermentiert wird und daß die erhaltenen proteolytischen Enzyme aus der Fermentationslösung gewonnen werden. Die Fermentation und die bevorzugten Bedingungen und Medien werden im folgenden detaillierter und mit veranschaulichenden Beispielen beschrieben: Die Inkubation des Mikroorganismus kann auf einem Sojabohnen-Agar-Substrat, vorzugsweise bei pH 10 vorgenommen werden, obwohl auch ein höherer oder niedrigerer pH verwendet werden kann. Eine geeignete Inkubationszeit bei 37°C beträgt 24 Stunden.

Die weitere Vermehrung findet in einem großen Behälter auf übliche Weise durch aerobe submerse Fermentation in einem Medium statt, das Kohlehydrate enthält. Beispiele hierfür sind Laktose, Saccharose, Dextrin und

309884/1386 _ ₆ _

2 3 3 A 4 6 3

Stärke aus Kartoffeln und Gerste, Stickstoffverbindungen, wie beispielsweise Nitrate, Ammoniumsalze, Harnstoff, Sojaprotein und Kasein und Phosphate, wie beispielsweise Natrium- und Kaliumnhosphate, und Polyphosphate zusammen mit puffernden Substanzen, Spuren von brauchbaren schweren Metallverbindungen und anderen üblichen Hilfsstoffen.

Das folgende Beispiel veranschaulicht ein geeignetes wässriges Fermentationsmedium und die Vermehrungsbedingungen.

Beispiel 1

Dextrin

entfettetes Sojamehl Saccharose Natriumcarbonat Natriumhydrogencarbonat Trinatriumpolyphosphat Temperatur

Zeit
Belüftung

2,5 % 5,5 % 3,0 % 0,9 % 0,3 % 0,3 %

28-5O°C, vorzugsweise 35-4O°C

40-100 Std., vorzugsweise 50-70 Std.

1/4 1 VoI: Luft/Vol. Flüssig-' keit, vorzugsweise 1/2 Vol. Luft/Vol. Flüssigkeit pro Minute.

Die Hauptfermentation findet in einem wässrigen Fermentationsmedium statt, das die gleichen Bestandteile wie

309884/1386

das Vermehrungsmedium mit einem möglichen Zusatz eines Antischaummittels enthält.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Bestandteil-Medien und die Fermentationsbedinaungen bei der Hauptfermentation.

Beispiel 2

Das wässriae Fermentationsmedium enthält 100 m :

Getreide 3 500 kg

entfettetes Sojamehl 5 500 kg

Saccharose 3 000 kg

Natriumcarbonat 900 ka

Fatriumhydrogencarbbnat 300 kg TrinatriumpoIyphosphat 185 kg Die puffernden Salze werden separat sterilisiert und unter sterilen Bedinaungen nach der Sterilisation des Hauptanteiles zugegeben. Die Fermentationsbedingungen sind folaende:

Temperatur 37°C

Zeit 65 Std.

pH etwa 7,5 -

Belüftuna 0,5 Vol. Luft/Vol. Flüssig

keit/ Minute

Die Fermentation besteht in einer Fnzymerzeugung von etwa 250 Anson-Einheiten pro Liter fermentiertes Medium, wenn sie bei 55 C und pH 9 bestimmt wurde.

309884/1386 " ⁸ "

Anstatt puffernde Salze zur Kontrolle des pH-Wertes zu verwenden, kann dieserauch mit Hilfe von zugesetzten Säuren oder - falls erforderlich - alkalischen Substanzen kontrolliert werden.

Beispiel 3

Nach einer weiteren Ausfuhrungsform der oben in Bei-, spiel 2 beschriebenen Hauptfermentation werden 5000 kg Dextrin in 25 m Wasser während der Fermentationsdauer zugesetzt, um die Enzymproduktion zu fördern und die Produktionsdauer zu verlängern.

Dies wird zu einer entsprechend größeren Enzymausbeute, da das fermentierte Medium auch in diesem Fall etwa 250 Anson-Einheiten pro Liter enthält.

Das erzeugte Enzym muß dann gewonnen werden. Der erste Schritt bei diesem Verfahren besteht in der Filtration des fermentierten Mediums, um den Mikroorganismus abzutrennen. Falls gewünscht, kann das Filtrat anschließend auf ein kleineres Volumen konzentriert werden, beispielsweise auf ein Viertel des ursprünglichen Volumens, bevor die nächste Stufe, die in der Ausfällung des Enzyms besteht, durchgeführt wird.

Vor der Ausfällung kann die Flüssigkeit steril gefiltert werden, um Sporen oder Keime zu entfernen oder es kann - falls erwünscht - die Sterilisation durch Bestrahlung des Enzym-Endproduktes durchgeführt worden.

309884/1386 _ _q _

Die Ausfällung wird durchgeführt, indem entweder ein Wasser-mischbares organisches Lösungsmittel oder ein anorganisches Salz, wie Natriumsulfat oder Ammoniumsulfat, dem Filtrat zugesetzt wird. Die Ausfällung wird als Aufschlämmung abgetrennt, zentrifugiert und anschließend die feste Masse auf konventionelle Weise getrocknet, beispielsweise durch Flash-Trocknen, Sprühtrocknen, Fließbetttrocknen oder einer Kombination der üblicherweise angewandten Trocknung smethoden .

Die Filtrationsstufe wird leichter durchgeführt, indem das Fermentationsmedium vorher einer Flokkulation unterworfen wird.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Flokkulationsmittel für diesen Zweck.

Beispiel 4

Zu 1000 Litern Fermentationsmedium werden 20 kg Aluminiumsulfat zugesetzt, die in 100 Litern Wasser gelöst werden, und anschließend werden 10 kg gebrannter Kalk, der in 100 Litern Wasser suspendiert ist, zugegeben. Anstelle von gebranntem Kalk kann eine äquivalente Menge an Natriumhydroxyd zugegeben werden.

Beispiel 5

Zu 1000 Litern des fermentierten Mediums werden 25 kg

3 0 9884/1386 -io-

Calciumchlorid, die in 25 Litern Wasser gelöst sind, zugesetzt und anschließend werden 3,5 kg gebrannter Kalk in 15 Litern Wasser zugegeben.

Das flokkulierte Medium wird anschließend filtriert und/oder zentrifugiert, um die ausgeflockte Masse zu entfernen.

Beispiel 6

Um das Enzym auszufällen, werden 3500 Liter Äthanol pro 1000 Liter filtriertes Fermentationsmedium zugesetzt und die Ausfällung abfiltriert oder abzentrifugiert und getrocknet.

Beispiel 7

Anstelle Äthanol zur Ausfällung zu verwenden, werden 300 kg Natrium- oder Ammoniumsulfat pro 1003 Liter filtriertes Fermentationsmedium verwendet. Wenn gebrannter Kalk für die Flokkulation, wie in den Beispielen 5 und 6 - verwendet wurde, kann es wünschenswert sein, einen Überschuß an Calcium vor der Ausfällung des Enzyms zu entfernen. Dies kann in der Weise geschehen, daß eine 5-10%ige v.'ässrige Lösung in einer Menge, die der Menge an anwesenden Calciumionen äquivalent ist, zugesetzt wird und das ausgefällte Calciumsulfat durch Filtration entfernt wird. Die enzymatische Aktivität der erfindungsgemäß herge-

309884/1386 __n_

stellten Enzyme ist bestimmt worden, um die bei einer pH-Wert-Änderung auftretenden Veränderungen zu ermitteln. Die Bestimmungen, die aus der folgenden Tabelle I ersichtlich sind, wurden in Lösungen durchgeführt, die 0,5 % Kasein, das auf den gewünschten pH-Wert mit Hilfe von Natriumborat gepuffert wurde, enthielten, zu denen Enzyme bis ai einer Stärke von 0,04 Anson-Einheiten pro Liter zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde anschließend 15 Minuten bei 50°C inkubiert, anschließend wurde die Umsetzung in einem siedenden Wasserbad gestoppt.

Die Aktivität wurde anschließend bestimmt, indem bei 420 mn die Menge an Aminosäuren, die durch Kupplung mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure freigesetzt wurde, bestimmt wurde.

Tabelle I Relative Aktivität

Die Stabilität der erfindungsgemäßen enzymatischen ■Präparationen wurde wie folgt bestimmt:

309884/1386 "¹²~

t in %	bei verschie	den
	Aktivität	%
58,5	92,5	83
100	158	142
63,2	100	90
70,6	111	100
58,5	92,5	83
53,5	84	76

Enzymatische Lösungen wurden mit einer Stärke von 1,5 Anson-Einheiten pro Liter hergestellt und der pE wurde mit Hilfe von 0,2M Boratpuffer "eingestellt. Nach 30-minütigem Stehenlassen bei 50 C wurde der pH jeder Lösung wieder auf 9,4 eingestellt und die verbliebene Aktivität wurde wie oben bestimmt. Tabelle II unten zeigt diese verbliebene Aktivität in % der ursprünglichen Aktivität.

Tabelle II p_H % verbliebene Aktivität

7 92

8 99

9 96

10 9O

11 90

12 67

Zunächst wurde die Stabilität der Enzyme in Lösungen bestimmt, die die Enzyme zusammen mit den folgenden Salzen einzeln oder in Kombination - wie folgt - enthielten:
Enzym 0,075 Anson-Einheiten pro Liter (A/l)

Tripolyphosphat
(TPP) 2,5g pro Liter (g/l)

Natriumperborat
(NaPE) 1,25 g pro Liter

Natriummetasilikat (NaMS) 0,4 5 g pro Liter

- 13 -

309884/1386

Die restliche Aktivität wurde in Lösungen, die 0,5 % Kasein enthielten, bei pH 10 bestimmt und die Lösungen wurden 20 Minuten bei 50°C stehengelassen. Die Ergebnisse sind aus Tabelle III ersichtlich.

Tabelle III

Enzym	A/l	0	,075	0	,075	o,	07
TPP	g/i	2	,5	2	,5	2,	5
NaPB	g/i	0		r-l	,25	1,	25
NaMvS	g/i	0		0		0,	45

restliche Aktivität

(nach 30 Minuten/45°C/

pH 10) 92 % 85 % 76 %

Die Aktivität, wie sie. durch Waschtests an einem Standardtyp von verschmutztem Gewebe, das mit Empa bezeichnet wurde, bestimmt wurde, wurde an einer Waschlauge, die 0,075 Anson-Einheiten des Enzyms (bei 37°C und pH 9), 2,5 g TPP, 0,25 g äthoxylierten Fettalkohol (Nonipol CS 50) und 1,25 g Natriumperborat enthielt, ermittelt. Bei pH 10 und nach 30-minütigem Waschen, bei dem die Temperaturen von 30 - 65°C schwankten, wurden die Aktivitätsprozente in der folgenden Tabelle IV durch Reflektionsmessungen bestimmt, und der Maximalwert bei 55°C willkürlich auf 100 % festgelegt.

- 14 -

309884/1386

	Tabelle IV
	% Aktivität des Maximums
°c	% Aktivität
30	50,2
40	63,2
50	86,5
55	100,0
60	87,0
65	50,8

Auf die gleiche Weise wurde die Aktivität bei verschiedenen pH-x^erten bestimmt, nie Ergebnisse sind aus der folgenden Tabelle V ersichtlich. Die Aktivität bei pH 9 wurde willkürlich auf 100 % festgelegt.

Tabelle V

pjH % Aktivität

8,0 88,0

9,0 100,0

10,0 97,1

10.3 88,0 11,0 77,1

11.4 59,4

Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung von enzymatischen Präparationen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, hergestellt in Detergenzzubereitungen verwendet wurden.

- 15 -

309884/1386

Die folgenden Beispiele veranschaulichen eine derartige Verwendung.

Die Zahlen bedeuten Gew.-%.

Beispiele 8-11

	Natriummetasilikat	8	9	10	11
Anionisches Tensid	Trinatriumpolyphosphat	8,0	10,0
nicht-ionisches Tensid	Natriumsulfat	4,0	2,0	3,0	5,0
Seife	Natriumperborat	3,0	2,0
ftthylendiamintetraacetat	Natriumhexametaphosphat	O,5
Carboxymethylcellulose	Natriumcarbonat	1,0	1,0
optischer Aufheller	Wasser	0,3	0,3
Natriumsilikat (Na₃OtSiO₂)	Insgesamt
(1:2) '	6,0	8,0
		20,0	3O,O
40,0	35,0	40,0	50,0
4,2	33,7	7,0	5,0
25,0		10,0
		20,0
			10,0
8,0	8,0
100,0	100,0	100,0	100,0

Zu jeder dieser Zubereitungen wird die Enzympräparation der Erfindung in einer Menge, die 1-12 Anson-Einheiten pro kg entspricht, möglicherweise zusammen mit an-

3Ü988A/1386 "¹⁶~

deren Enzymen gegeben.

Beispiel 8 zeirrt eine typische Detergenzzubereitung für hohe Beanspruchungen, Beispiel 9 auch für hohe Beanspruchungen, aber ohne Perborat. Beispiel 10 ist eine typische Zubereitung für Geschirr-Reinigungszwecke und Beispiel 11 ist eine geeignete Zubereitung für hohe Reinigungsbeanspruchungen.

Beispiele von anionischen Tensiden sind Alkylarylsulfonate und als anionische Tenside sind beispielsweise äthoxylierte Fettalkohole geeignet.

- 17 309884/1386

Claims

Patentansprüche

(Ii Verfahren zur Gewinnung von proteolytischen Enzymen durch aerobe Fermentation von Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Fermentation einen Stamm vom Bacillus primus var. Arosia verwendet und die erhaltenen Enzyme aus dem Fermentationsmedium gewinnt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei einer Temperatur zwischen

28 und 50°C 48 - 72 Stunden durchgeführt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentationsflüssigkeit vor der Gewinnung der Enzyme einer Flokkulation unterworfen wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Flokkulation durchgeführt wird, indem ein anorganisches Salz der fermentierten Flüssigkeit zugesetzt wird.
5. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Flokkulationsflüssigkeit filtriert und das
Fnzym durch einen Aussalzvorgang ausgefällt wird.

- 18 -

309884/1386
6. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die flokkulierte Flüssigkeit abfiltriert wird und das Enzym ausgefällt wird, indem ein Wasser-mischbares organisches Lösungsmittel mit dem Filtrat gemischt wird.
7. Proteolytische Fnzyme, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1.
8. Eine ein Perborat und Polyphosphat enthaltende De-.". tergenzzubereitung, die nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellte Enzyme umfaßt.

309884/1386