JP2588009B2 - 新規リパーゼａｋｓ及び該リパーゼを有効成分として含有する洗浄剤組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔利用分野〕 本発明は、新規リパーゼAKS及び該リパーゼを有効成
分として含有する洗浄剤組成物に関するものである。

〔従来技術〕

繊維の黄ばみ原因の１つであるトリグリセライドの除
去は、汚垢成分中の脂質の中では特に洗浄しにくいもの
とされていた。そのためリパーゼを洗剤組成物として応
用し、洗浄力を増強しようとする試みは古くから行われ
ている。

例えば、リゾープス属、キャンディダ属、アスペルギ
ルス属、ムコール属及びパンクレアス由来の各リパーゼ
を応用する報告があるが、その活性が中性及び微アルカ
リ性でのみ発現し、さらには衣料用重質洗剤の主体であ
る陰イオン界面活性剤の存在下での安定性が悪い事より
十分な活性を示すことが出来ない。このことから、洗浄
力の増強はほとんど望めない〔ジャーナル・オブ・アプ
ライド・バイオケミストリー（J.Appl.Biochem.）,2巻,
218〜229頁（1980）〕。更には、アクロモバクター属、
キヤンデイダ属、ムコール属及びパンクレアスの各リパ
ーゼに対する陰イオン界面活性剤の影響を試験した結果
においても、全てのリパーゼが強くその活性を阻害され
ると報告されている〔油化学，第23巻,98〜104頁（197
4）〕。

又、リパーゼを配合した洗剤による洗浄力試験におい
ては、キヤンデイダ属、リゾープス属、シユードモナス
属、ムコール属及びパンクレアスの各リパーゼについて
報告されているが、pH7での効果に比べpH10での効果が
殆ど無い〔油化学，第35巻，第４号,61〜67頁（198
6）〕。

近年pH10においても有効な活性を示すリパーゼ及びそ
のリパーゼを配合した洗浄剤組成物に関する報告もされ
ている（特開昭63−39579,特開昭63−78000,特開昭63−
132998）が、有効な洗浄力を得るためには多量のリパー
ゼが必要であり、さらには他の洗剤成分と特定量で組み
合わせた組成でないと十分な洗浄力が発揮出来ない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来のリパーゼを洗浄剤へ適用することを困難として
いた上記に述べたような洗浄剤の主成分である陰イオン
界面活性剤によるリパーゼ活性の阻害、洗浄剤の使用条
件、例えばpH10以上における活性の不十分さ、又そのリ
パーゼの使用量が多いための不経済性等を解決すること
が望まれていた。本発明はこのような状況下で、洗浄剤
組成物によりその活性がほとんど阻害されず、洗浄条件
下でも十分活性を発現し、油脂汚れ等の分解除去するこ
とで洗浄力を増強出来るリパーゼ及び該リパーゼを有効
成分とする洗浄剤組成物を開発し、提供することを目的
とし、又該リパーゼの各種陰イオン界面活性剤による阻
害を受けにくい性質を利用することにより、界面活性剤
による実質的阻害を受けることのないトリグリセリドの
測定が可能であるので、該リパーゼは、臨床試薬用とし
ても好適である。

〔問題点を解決するための手段及びその作用〕

本発明者等は、洗剤及びその主成分である各種界面活
性剤やビルダーに対し安定で、かつアルカリ領域におい
ても活性を十分発揮するリパーゼを得るために、広く自
然界からリパーゼを産生する微生物を検索・分離し、そ
のリパーゼの界面活性剤、洗剤に対する性質を検討した
ところ、シュードモナス属に属する一菌株がその目的に
合う新規なリパーゼを産生することを見い出し、本酵素
を洗剤に適用することにより本発明を完成した。本発明
者等はこの新規なリパーゼをリパーゼAKSと命名した。

このリパーゼAKS生産菌は以下の如き菌学的性質を有
する。

（１）形態 （ａ）細胞の形：桿菌 （ｂ）細胞の大きさ：約0.5μ×1.0〜3.5μ （ｃ）多形性の有無：なし （ｄ）運動性：あり、極ベン毛 （ｅ）胞子：なし （ｆ）グラム染色性：陰性 （ｇ）抗酸性：陰性 （２）各培地における生育状態 （ａ）肉汁寒天平板培養： 円形、平滑、全縁、扁平状〜凸円状、不透明、湿光、ほ
ぼ白色〜黄味灰色 （ｂ）肉汁寒天斜面培養： 中程度生育、糸状、扁平、不透明、ほぼ白色〜黄味灰色 （ｃ）肉汁液体培養： 中程度生育、上部でよく生育し、もろい皮膜を形成す
る。

（ｄ）肉汁ゼラチン穿刺培養： ゼラチンを液化する。

（ｅ）リトマスミルク： アルカリ性、ペプトン化する。

（３）生理学的性質 （ａ）硝酸塩還元性：陽性 （ｂ）脱窒反応：陰性 （ｃ）MRテスト：陰性 （ｄ）VPテスト：陰性 （ｅ）インドールの生成：陰性 （ｆ）硫化水素の生成：陰性 （ｇ）デンプンの加水分解：陰性 （ｈ）クエン酸塩の利用:Koserの培地とChristensenの
培地で陽性。

（ｉ）無機窒素源の利用：硫酸アンモニウムと硝酸ナト
リウムを利用する。

（ｊ）色素の生成:King A培地で色素生成なし。King B
培地で弱く明るい茶色の水溶性色素を生成する。

（ｋ）ウレアーゼ：陰性 （ｌ）オキシダーゼ：陽性 （ｍ）カタラーゼ：陽性 （ｎ）生育の範囲:pH4〜８で生育する。37℃で生育する
が４℃,42℃では生育しない。

（ｏ）酸素に対する態度：好気性 （ｐ）Ｏ−Ｆテスト：好気条件下でグルコースから酸を
生成する。

（ｑ）糖類からの酸及びガスの生成： アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、
フラクトース、ガラクトース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、
トレハロース、ソルビット、マンニット、イノシット、
グリセリンから酸を生成するが、ガスは生成しない。デ
ンプンからは酸もガスも生成しない。

以上の性質を〔Buchanan,R.E.and Gibbons,N.E.:Berg
ey's Manual of Determinative Bacteriology,8th.ed.,
Williams ＆ Wilkins Co.,（1974）〕、〔坂崎利一訳：
医学細菌同定の手びき（２版）、近代出版、（1974）〕
等を参考にして検索するとグラム陰性、桿菌、好
気性、極ベン毛による運動性、カタラーゼ陽性、
オキシダーゼ陽性、好気的条件下で酸を生成すること
からシュードモナス属に分類される。従って本生産菌株
をシュードモナス・エスピーNo.AK102（Pseudomonas s
p.No.AK102）と命名した。

本菌株は微生物工業技術研究所に寄託されその寄託番
号は微工研菌寄第10382号である。

本菌株を培養し、リパーゼAKSを生産するに際し使用
する培地として、まず炭素源としては可溶性澱粉等の多
糖類、デキストリン，マルトース等の二糖類、グルコー
ス等の単糖類が上げられ、窒素源としてはコーンスティ
ープリカー，ペプトン，肉エキス，カゼイン，アミノ
酸，酵母エキス等が上げられる。無機塩及び微量栄養源
としてはリン酸，マグネシウム，カリウム，鉄，カルシ
ウム，亜鉛等の塩類の他、ビタミン，非イオン界面活性
剤，消泡剤等の菌の生育やリパーゼAKSの生産を促進す
るものであれば必要に応じて使用出来る。培養は好気的
条件で、培養温度は菌が発育しリパーゼAKSを産生する
範囲であれば良く、好ましくは25〜40℃である。培養時
間は条件により異なるがリパーゼAKSが最も産生される
時間まで培養すれば良いが通常１〜３日程度である。リ
パーゼAKS培養終了後培養液より菌体及び固形分を分離
し、培養ろ液を採取する。

培養ろ液よりリパーゼAKSを得るには通常酵素精製に
用いられるあらゆる方法が使用出来る。

例えばエタノール，アセトン，イソプロピルアルコー
ル等の有機溶媒による処理、硫安，食塩等による塩析、
透析，限外ろ過法、イオン交換クロマトグラフィー等に
よる各種精製法を行うことが出来る。以下に本発明の具
体例を示す。尚、活性測定はリパーゼAKSの酵素化学的
性質の項で述べる方法を使用した。

リパーゼAKSの製造 ぶどう糖２％、コーンスティープリカー２％、尿素0.
3％、リン酸二カリウム0.5％及び大豆油２％を含む液体
培地500mlを２容坂口フラスコに取り、121℃、20分間
滅菌した後、シユードモナス・エスピーNo.AK102を１白
金耳接種し、30℃に24時間、振巾5cm毎分130回の往復振
盪培養機で培養した。

この培養液を、0.3％のアデカノールLG126を加えて殺
菌した同培地500を含む800容培養器に接種し、30℃
で通気量200／分、攪拌240rpmの条件下で48時間通気
培養した。

培養後、連続遠心機にて菌体を除去し、更にろ過によ
り清澄なリパーゼ液450を得た。この液のリパーゼ活
性は1300u/mlであった。

更に限外ろ過膜により45に濃縮液５℃に冷却した。
このリパーゼ濃縮液の活性は6340u/mlであった。

−15℃に冷却したエチルアルコール150を徐々に添
加し生じた沈澱をろ別し、冷アセトンで脱水後、減圧下
に乾燥してリパーゼAKS粉末480gを得た。このリパーゼA
KS粉末のリパーゼ活性は260000u/gであった。

酵素化学的性質 （１）作用pH: pH8付近に至適pHを有し、pH3〜11に至る広いpHで60％以
上の活性を示す（第１図に示す）。

（２）作用温度： 60℃付近に至適温度を有し、80℃でも60％以上の活性を
示す（第２図に示す）。

（３）安定pHの範囲： pH4以上で90％以上の安定性を示す（第３図に示す）。

（４）熱安定性： 20〜70℃の範囲でほとんど失活しない（第４図に示
す）。

（５）金属塩の影響： 1.2mMの各種金属塩中でほとんど活性に影響しない（第
１表に示す）。

（６）活性測定法： 0.2Mのトリス・塩酸緩衝液（pH8）4mlをオリーブ油エマ
ルジョン5mlに加え、更に酵素溶液1mlを加えて37℃で30
分間反応させ、アセトン・エタノール混液（1:1）10ml
を加えて反応を停止する。さらにアセトン・エタノール
混液（1:1）10ml、0.05Nの水酸化ナトリウム溶液15mlを
加えたのち、0.05Nの塩酸で滴定する。活性表示法は、
上記条件下１分間当り１μmoleに相当する脂肪酸を遊離
する酵素量を１単位とした。

（７）界面活性剤に対する性質： 各種陰イオン界面活性剤（0.05％濃度）のうち、直鎖ア
ルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムによってほとんど
影響を受けず、且つ他の陰イオン界面活性剤により活性
が増大する傾向がある（第５図及び第６図に示す）。

（８）洗剤に対する性質： 洗剤中においてリパーゼAKSは十分な活性を示す（第７
図に示す）。さらには各種洗剤の標準使用濃度付近で
は、活性が増大する（第８図に示す）。

（９）各種ビルダーに対する性質： 標準使用量の３倍濃度においても全く活性は影響されな
い（第９図に示す）。

（10）リパーゼ活性に及ぼすプロテアーゼの影響： 市販洗剤中には、その標準使用洗剤濃度で0.08〜0.16単
位のプロテアーゼが配合されている場合があるが、その
濃度以上のプロテアーゼによってもリパーゼ活性は影響
されない（第10図及び第11図に示す）。

尚、プロテアーゼの活性は下記の方法に従った。

ミルクカゼイン溶液（1.5gのミルクカゼインに0.1Nの
水酸化ナトリウム溶液を加えて加熱溶解後、0.1Nの塩酸
でpH10に調製したのち更に0.1Mのホウ酸緩衝液20mlを加
え、その後水で100mlとする。）1mlに酵素液1mlを加
え、37℃で１時間反応する。0.4Mのトリクロロ酢酸溶液
2mlを加えて反応を停止し、ろ過する。ろ液1mlに0.4M炭
酸ナトリウム溶液2mlを加え、更にうすめたフオリン溶
液（１→５）1mlを加えて37℃で20分放置後、波長660nm
の吸光度を測定する。１分間に１μmolのチロジンに相
当する吸光度を増加させる酵素量を１単位とする。

次いで本発明を実施例により更に詳細に説明する。
尚、洗浄力評価方法は下記に記載する方法に従った。

（１）トリオレイン汚染布の調製 脱脂した綿布（5cm×5cm）に、クロロホルムに溶解し
たトリオレイン（以下、TOと言う）15mgを浸ませ、20℃
にて減圧乾燥した。

（２）洗浄方法 トリオレイン汚染布５枚を、標準使用濃度の５倍の市
販洗剤液200mlに加え、30℃に60分間静置、予浸する。

その後、60mgのCaCl₂を含む800mlの水を加え、Terg−
０−Tometerを使用し、10分間,100rpmで洗浄する。この
時の洗剤濃度は各種洗剤の標準使用濃度となる。

洗浄後、１の水で２回、30℃,5分間すすぎを行った
のち、20℃で風乾した。

（３）洗浄力の評価方法 洗浄前後のTO量をTLC−FIDにより定量し、以下の計算
式により洗浄力を表す。

実施例１ 上記に述べた洗浄力評価方法に従い、各種市販洗剤を
用いリパーゼによる洗浄試験を実施した。市販洗剤とし
てトップ（商品名、ライオン製）、Hi−トップ（商品
名、ライオン製）、アタック（商品名、花王製）を使用
し、トップにリパーゼAKSを配合した洗剤、更にトップ
に特開昭63−39579のリパーゼAMLを配合した洗剤も同時
に試験した。リパーゼAKS及びリパーゼAMLの配合量はい
ずれも4000単位とした。この結果を第12図に示す。第12
図からも明らかなようにリパーゼAKSを配合した洗剤は
他の市販洗剤のみの洗浄力やリパーゼAMLを配合した洗
剤よりも洗浄力が高いことが判る。

実施例２ 実施例１と同様にして、市販洗剤としてトップを用
い、リパーゼAKSの添加量を変化させて洗浄力評価を行
った。その結果を第２表に示す。

実施例３ 第３表に示す洗浄剤組成物を調製し、洗浄力を評価し
た。尚、各々の濃度は各洗浄液中の濃度で示す。

〔発明の効果〕 本発明のリパーゼAKSは、界面活性剤、洗剤中でも安
定に十分活性を発揮し、又界面活性剤の種類によっては
その活性が増大する性質をもち、更に洗剤成分の配合量
による影響を受けないため、洗浄剤組成物配合用リパー
ゼとして有用であり、又該リパーゼの各種陰イオン界面
活性剤による阻害を受けにくい性質を利用することによ
り、界面活性剤による実質的阻害を受けることのないト
リグリセリドの測定が可能であるので、該リパーゼは、
臨床試薬用としても好適である。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図及び第４図はそれぞれリパーゼ
AKSの至適pH曲線、至適温度曲線、pH安定曲線及び温度
安定曲線を示すものである。第５図は、リパーゼAKSの
活性に及ぼす陰イオン界面活性剤の影響を示す図であ
り、第６図は、リパーゼの種類による陰イオン界面活性
剤の影響の差を示す図である。第５図及び第６図におい
てＡはAOS（α−オレフィンスルホン酸ナトリウムの略
である。）、ＢはLAS（直鎖アルキルベンゼンスルホン
酸ナトリウムの略である。）、ＣはDBS（ドデシルベン
ゼンスルホン酸ナトリウム、ハード型の略である。）Ｄ
はSDS（ドデシル硫酸ナトリウムの略である。）Ｅはポ
リオキシエチレンアルキルフエニルエーテル硫酸ナトリ
ウム、Ｆはタウロコール酸ナトリウム、Ｇはラウリルト
リメチルアンモニウムクロライド、Ｈはラウリルベタイ
ン、ＩはトリトンＸ−100、Ｊはスパン60、Ｋはポリオ
キシエチレン高級アルコールエーテル、Ｌはポリオキシ
エチレンノニルフエニルエーテルである。第７図はリパ
ーゼの種類による各種洗剤の影響の差を示す図である。
第８図はリパーゼAKSの活性に及ぼす各種洗剤の濃度の
差による影響を示す図であり、ａは米国洗剤の場合を示
し標準使用濃度は0.2％で、ｂは日本洗剤の場合を示し
標準使用濃度は0.133％である。第９図はリパーゼAKSの
活性に及ぼす各種ビルダーの濃度の差による影響を示す
図であり、ａはメタケイ酸ナトリウムの場合を示し標準
使用濃度は0.0135％で、ｂは炭酸ナトリウムの場合を示
し標準使用濃度は0.0135％で、ｃは硫酸ナトリウムの場
合を示し標準使用濃度は0.0405％で、ｄはカルボキシメ
チルセルロースナトリウムの場合を示し標準使用濃度は
0.00135％で、ｅはゼオライトの場合で標準使用濃度は
0.026％である。尚、第８図及び第９図においての各洗
剤及びビルダーの標準使用量を↓で示す。第10図及び第
11図はリパーゼAKSの活性に及ぼすプロテアーゼの影響
を示すものであり、第10図は洗剤を含有しない場合を示
し、第11図は洗剤を0.133％含有する場合を示す。第12
図は実施例１の結果を示す。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】陰イオン界面活性剤の直鎖アルキルベンゼ
   ンスルホン酸ナトリウムによってほとんど失活せず、且
   つ下記の酵素化学的性質を有することを特徴とするシュ
   ードモナス属由来の新規リパーゼAKS。 （１）作用pH:pH8付近に至適pHを有し、pH3〜11に至る
   広いpHで60％以上の活性を示す。 （２）作用温度:60℃付近に至適温度を有し、80℃でも6
   0％以上の活性を示す。 （３）安定pHの範囲:pH4以上で90％以上の安定性を示
   す。 （４）熱安定性:20〜70℃の範囲でほとんど失活しな
   い。 （５）金属塩の影響：各種金属塩によってほとんど失活
   しない。
2. 【請求項２】新規リパーゼAKSを有効成分として含有す
   る洗浄剤組成物。