RU2676317C1 - ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pCXCRs-Fc ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО СЛИТОГО БЕЛКА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИ-IL-8 АКТИВНОСТЬЮ - Google Patents
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pCXCRs-Fc ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО СЛИТОГО БЕЛКА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИ-IL-8 АКТИВНОСТЬЮ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2676317C1 RU2676317C1 RU2017130708A RU2017130708A RU2676317C1 RU 2676317 C1 RU2676317 C1 RU 2676317C1 RU 2017130708 A RU2017130708 A RU 2017130708A RU 2017130708 A RU2017130708 A RU 2017130708A RU 2676317 C1 RU2676317 C1 RU 2676317C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- sequence
- recombinant
- receptor
- fragment
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 78
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 title claims description 7
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims abstract description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 claims abstract description 7
- 108010038415 interleukin-8 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000010681 interleukin-8 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims abstract description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims abstract description 4
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 claims abstract 2
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 claims abstract 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 abstract description 33
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 abstract description 33
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 abstract description 33
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 abstract description 33
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 abstract 1
- 101001026574 Staphylococcus aureus Kanamycin nucleotidyltransferase Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 22
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 21
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 21
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 20
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 102100036166 C-X-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 description 11
- 101000947174 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 6
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 6
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 5
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 102100028989 C-X-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 108010018951 Interleukin-8B Receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101001055222 Homo sapiens Interleukin-8 Proteins 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000058084 Aegle marmelos Species 0.000 description 2
- 235000003930 Aegle marmelos Nutrition 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 2
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000012518 Poros HS 50 resin Substances 0.000 description 2
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010400 1-phosphatidylinositol-3-kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108091008928 CXC chemokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000054900 CXCR Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100026236 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108010018976 Interleukin-8A Receptors Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009189 diving Effects 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000010102 embolization Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 102000053523 human CXCR4 Human genes 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006296 mab medium Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003606 oligomerizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940075993 receptor modulator Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- AYRVGWHSXIMRAB-UHFFFAOYSA-M sodium acetate trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].CC([O-])=O AYRVGWHSXIMRAB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N spironolactone Chemical compound C([C@@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4C[C@H]([C@@H]13)SC(=O)C)C[C@@]21CCC(=O)O1 LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009044 synergistic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена генетическая конструкция pCXC8R-Fc, содержащая ранний промотор цитомегаловируса (CMV) человека, лидерную последовательность CD33, экстраклеточный домен рецептора интерлейкина 8, сайт узнавания фактора Ха, Fc фрагмент иммуноглобулина G1 человека, синтетический интрон IVS, участок внутренней посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита (IRES), Neo(R), сигнальную последовательность полиаденилирования вируса SV40, ориджин репликации ColE1, Amp(R). Данное изобретение может быть использовано для наработки белка, состоящего из экстраклеточного домена рецептора интерлейкина 8 и Fc-фрагмента иммуноглобулина G1 человека и обладающего свойствами блокировать активность интерлейкина-8 (IL-8). 4 ил., 6 табл., 6 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной генетики, молекулярной биологии, генетической инженерии, а именно - к созданию генно-инженерной генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного слитого (химерного) белка CXCRs-Fc, представляющего собой белковую конструкцию из т.н. «рецепторной» и «адапторной» частей. «Рецепторная» часть представляет собой CXCRs-содержащий пептид, специфически связывающийся с интерлейкином-8 (IL-8). «Адапторная» часть представлена Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека, который благодаря способности собираться в димерные структуры обеспечивает полимеризацию адресующей (рецепторной) части. Предложенное изобретение может быть использовано для наработки белка, обладающего свойствами блокировать активность интерлейкина-8 (IL-8), обладающего опухоль-стимулирующей активностью. Применение данного химерного белка в качестве основы для лекарственного препарата позволит блокировать рост и пролиферацию опухолевых клеток.
Уровень техники
Известно изобретение WO 2004045526 (А2). Настоящее изобретение представляет средство для ингибирования роста и метастазирование раковых клеток путем введения антител к хемокинам. Необходимо определить конкретные хемокины, которые чрезмерно выражены в опухоли с помощью способов по настоящему изобретению, и вводить антитела против тех хемокинов, у которых имеет место гиперэкспресия. Недостатком данного изобретения является трудоемкость определения мишеней и необходимость последующей наработки антител.
Известен способ лечения различных видов злокачественных опухолей путем введения комбинации антагониста SDF-1, который специфически связывается с человеческим CXCR4, и другого химиотерапевтического агента или лучевой терапии в ходе эмболизации терапии (Патент WO 2015123818). Такие комбинированные препараты предполагают синергетические эффекты по сравнению с использованием каждого препарата в отдельности. Способ лечения предназначен для больных онкологическими заболеваниями, которые имеют низкую толерантность к побочным эффектам, вызванным высокими дозами, которые применяются для лечения химиопрепаратами в отдельности. Недостатком данного изобретения является относительная избирательность активности.
Известно изобретение, относящееся к способу лечения рака молочной железы, характеризующееся активацией гетеродимера HER2/HER3 и включающее стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества модулятора интерлейкина-8 (IL-8) и/или его рецепторов хемокинов (СХС-мотив) рецептора 1 (CXCR1) (US2015266961). Недостатком изобретения является узкая направленность лекарственного средства.
Таким образом, на сегодняшний день отсутствует генно-инженерная конструкция, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимой части рецептора IL-8 и Fc-фрагмента иммуноглобулина G. Анализ соответствующих информационных источников не обнаружил генетической конструкции, которая могла бы быть прототипом объекта изобретения. В информационных источниках также не обнаружено сведений о том, что где-либо существует целевой продукт указанной генетической конструкции, т.е. слитый белок, состоящий из указанных частей (внеклеточная часть растворимого рецептора к IL-8, слитая с Fc-фрагментом иммуноглобулина G).
С другой стороны, имеется лишь небольшое количество изобретений, которые можно назвать лишь условными аналогами настоящей разработки. Они аналогичны предлагаемому изобретению не по самому объекту изобретения, а лишь по целевому назначению - блокирование интерлейкина-8. Это реализуется либо за счет инактивации самого лиганда, либо за счет блокирования его взаимодействия с рецептором и предотвращению, таким образом, сигнального каскада. Указанные эффекты достигаются в большинстве своем за счет применения антител либо к самому интерлейкину-8, либо к внеклеточной части его рецептора, либо их модуляторов, приводящих к ингибированию опосредованного IL-8 сигнального каскада.
Таким образом, технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, из уровня техники не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».
Основание осуществления изобретения
Интерлейкин-8 (IL-8) относится к группе хемокинов, основное назначение которых - обеспечивать хемотаксис в зону воспаления различных типов клеток: нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов, Т-клеток. В большинстве злокачественных опухолей, включая рак молочной железы, рак печени, желудка, толстого кишечника и рак предстательной железы, обнаруживается высокий уровень IL-8, этот факт связывают с процессом метастазирования. IL-8 - провоспалительный многофункциональный хемокин, активирующий внутриклеточные сигналы путем связывания с рецепторами на поверхности клеток, - CXCR1 и CXCR2. Указанные рецепторы сопряжены с G-белком и опосредуют множество сигнальных каскадов, в частности PI3K/АКТ, PLC/PKC, Ras/Raf/ERK1/2, FAK, Rho и Rac. Установлено также, что IL-8 способствует самоподдержанию стволовых опухолевых клеток за счет экспрессии последними высокого уровня рецептора CXCR1. В 2013 г. впервые было установлено, что передача CXCR1/2-зависимого сигнала сопровождается трансактивацией молекулы HER2 в стволовых опухолевых клетках, вызывающих рецидивирование опухоли и ее устойчивость к радио- и химиотерапии. В связи с этим в настоящее время именно IL-8 и его рецепторы рассматриваются в качестве одной из ключевых «мишеней», особенно в случае резистентности опухоли к различным видам противоопухолевой терапии.
Задача анти-IL-8 терапии - инактивировать данный ростовой фактор и вывести его из метастатического каскада. Это препятствует пролиферации и миграции эндотелиальных и опухолевых клеток, что, в свою очередь, будет подавлять неоангиогенез и развитие метастазов. Кроме того, такая терапия должна оказывать существенное влияние на устойчивость опухолевых клеток к радио- и химиотерапии, предотвращая возобновление роста опухоли после терапевтического или операционного лечения.
Для решения данной проблемы заявителями разработана генетическая конструкция для получения противоопухолевого рекомбинантного химерного белка, состоящего из растворимой части рецептора IL-8 и Fc-фрагмента иммуноглобулина G. Заявленное средство действует как конкурентный ингибитор IL-8. Рецепторная часть позволяет эффективно связывать IL-8 (биомишень), блокируя его опухоль-индуцирующие свойства, а вторая часть химерного белка обеспечивает удобную очистку его в процессе производства. Кроме того, она способствует усилению биологической активности препарата за счет олигомеризации химерного белка и утилизации комплекса «лиганд-рецептор».
Природные рецепторы интерлейкина-8 (CXCR1 и CXCR2) состоят из семи трансмембранных спиралей и способны связывать хемокин с аффинностью наномолярного порядка [Skelton, 1999]. CXCR1 в отличие от CXCR2 селективен в отношении IL-8. Поэтому растворимая часть рецептора - рекомбинантного CXCR1 - более предпочтительна как потенциальный ингибитор IL-8.
Характер взаимодействия комплекса IL-8 с его рецепторами делает затруднительным получение рекомбинантных ингибиторов IL-8 на основе CXCR1 или CXCR2 из-за недостаточной афинности. Необходимый уровень аффинности, сопоставимый с таковым у природного аналога (Kd 1-5 nM), может быть достигнут только путем искусственной иммобилизации полноразмерного CXCR1 в липидном бислое [Park, 2011]. Однако процесс получения таких структур является достаточно трудоемким и дорогостоящим.
Тем не менее установлено, что конструирование поливалентных структур - это эффективный способ повышения аффинности целевого белка за счет увеличения числа контактов между молекулами; многие естественные процессы, в том числе и взаимодействие антиген-антитело, основаны на этом принципе [Krishnamurthy, 2006]. Эта характеристика очень важна для противоопухолевого препарата, т.к. позволяет снизить дозировку и, следовательно, уменьшить потенциальный токсический эффект на организм. Кроме того, крупные молекулы имеют большее время циркуляции в организме [Kontermarnn, 2011].
Для получения бивалентных молекул использовали Fc-фрагмент иммуноглобулинов G. Известны подходы к получению мультвалентных комплексов путем присоединения к Fc фрагменту дополнительного адаптора (изолейцинового сайта, шарнирной области IgG2, С-концевого фрагмента IgM) [Levin et al., 2015]. Fc фрагмент обладает рядом преимуществ по сравнению с другими олигомеризующими элементами. Присутствие Fc домена заметно увеличивает время полувыведения белка и, следовательно, продлевает терапевтическую активность [Roopenian, 2007], Fc содержащие молекулы могут взаимодействовать с Fc-рецепторами на клетках иммунной системы, что дает им преимущество при использовании в терапии онкологических и инфекционных заболеваний [Nimmerjahn, 2008]. Кроме этого Fc домен сворачивается независимо и может повысить растворимость и стабильность адресующего компонента химерной молекулы. С технологической точки зрения Fc фрагмент удобен, т.к. позволяет очистить целевой белок с помощью аффинной хроматографии на белок A/G носителе.
Исходя из целевого назначения будущего препарата при разработке метода получения рекомбинантного белка CXCRs-Fc следует учитывать необходимость выполнения ряда требований:
а) рецепторная часть рекомбинантного химерного белка должна связывать биомишень IL-8, блокируя его опухоль-индуцирующие свойства;
б) адапторная часть химерного белка должна индуцировать олигомеризацию химерного белка и утилизацию комплекса «лиганд-рецептор».
Для дополнительного повышения авидности рецепторной части в конструкцию был включен адаптер (Fc фрагмент иммуноглобулина G человека), ответственный за олигомеризацию химерного белка. Такая модификация позволит получить димер CXCs-Fc, стабилизированный дисульфидной связью.
Как упоминалось, гибридные белки, содержащие Fc, способны выполнять эффекторные функции иммуноглобулинов in vivo. Финальный продукт, таким образом, будет способен не только связывать IL-8, но участвовать в его утилизации.
Для удобства очистки в структуру химерного белка была добавлена N-концевая сигнальная последовательность CD33. Она обеспечивает транспорт белка в среду культивирования, а наличие Fc-фрагмента позволяет быстро и эффективно очистить белок из среды методом аффинной хроматографии носителе с белком A/G.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является создание рекомбинантной плазмиды, предназначенной для высокой продукции химерного белка CXCRs-Fc. Рекомбинантные плазмиды обладают биологическими характеристиками, позволяющими использовать данную конструкцию для высокоэффективной продукции химерного белка CXCRs-Fc. Для эффективной наработки белков, слитых с Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека, использовали систему экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих. Выбор системы экспрессии опосредован тем, что антиген является гликопротеином. Наработка его в бактериальной или дрожжевой системах повышает риск образования неправильно свернутых форм белка с некорректным профилем гликозилирования или агликозилированных форм. Для наработки белка была выбрана культура клеток почки НЕК. Культура HEK широко используется для наработки белков в научно-исследовательских и промышленных целях. К достоинствам культуры относят высокую скорость пролиферации и высокую степень трансфекции [Backliwal, 2008; Geisse, 2009]. Также культура легко адаптируется к росту в суспензии в широком спектре классических и бессывороточных сред [Brunner, 2010].
Для наработки значительных количеств рекомбинантного рецептора должна быть получена стабильная культура-продуцент. Для этого был сконструирован плазмидный вектор, где нуклеотидная последовательность целевого белка была интегрирована в одну экспрессионную кассету с последовательностью маркера селекции; такая конструкция вектора позволяет отобрать клоны продуцентов с наибольшим уровнем экспрессии белка CXCRs-Fc.
Объектом техники является генетическая конструкция pCXC8R-Fc, кодирующая рекомбинантный слитый белок, состоящий из растворимого рецептора к интерлейкину-8 (IL-8) и Fc-фрагмента иммуноглобулина G. Ниже приводится обоснование для осуществления настоящего изобретения.
Предлагаемая генетическая конструкция pCXC8R-Fc описывается следующими признаками: 5' - P-SP-CXCR-Fc - 3', где:
- Р - промоторная последовательность цитомегаловируса;
- SP - нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид CD33;
- CXC8R - нуклеотидная последовательность экстраклеточного домена рецептора интерлейкина 8;
- Fc -нуклеотидная последовательность константного домена иммуноглобулина G человека.
Технический результат заключается в том, что получена генетическая конструкция, кодирующая рекомбинантный слитый белок, обладающий анти-IL-8 активностью.
Заявляемые признаки, предопределяющие получение вышеуказанного технического результата, явно не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».
Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретного применения, которыми заявляемое изобретение проиллюстрировано, но не исчерпано.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Схематическое изображение рекомбинантного вектора pIRESneo3-Fc. CMV IE Promoter - ранний промотор цитомегаловируса (CMV) человека (230-862), CD33 signal sequence - лидерная последовательность CD33 (906-959), Factor Ха site - сайт узнавания фактора Ха (1023-1034), IgG1 Fc tail - Fc фрагмент иммуноглобулина G1 человека (1050-1748), IVS - синтетический интрон (1808-2103), IRES - участок внутренней посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита (ECMV) (2129-2719), Neo (R) - неомицин-фосфотрансфераза (2755-3555), SV40 polyA signal - сигнальная последовательность полиаденилирования вируса SV40 (3719-3724 и 3748-3753), ColE1 ori - ориджин репликации ColE1 (4345-4944), Amp (R) - β-лактамаза (5071-5933).
Фигура 2. Схематическое изображение рекомбинантного вектора pCXC8R-Fc. CMV IE Promoter - ранний промотор цитомегаловируса (CMV) человека (230-862), CD33 signal sequence - лидерная последовательность CD33 (906-959), CXC8R - экстраклеточный домен рецептора интерлейкина 8 (966-1082), Factor Ха site - сайт узнавания фактора Ха (1089-1100), IgG1 Fc tail - Fc фрагмент иммуноглобулина G1 человека (1116-1814), IVS -синтетический интрон (1874-2169), IRES - участок внутренней посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита (ECMV) (2195-2785), Neo (R) - неомицин-фосфотрансфераза (2821-3621), SV40 polyA signal - сигнальная последовательность полиаденилирования вируса SV40 (3785-3790 и 3814-3819), ColE1 ori - ориджин репликации ColE1 (4411-5010), Amp (R) - β-лактамаза (5137-5999).
Фигура 3. Электрофорез в 2%-ном агарозном геле ПЦР- продуктов, полученных после амплификации фрагментов ДНК CXCRs-Fc. 16 - положительный контроль, где ПЦР проводили с использованием экспрессионной плазмиды в качестве ДНК-матрицы, 1 - отрицательный контроль, где ПЦР проводили с использованием хромосомной ДНК нетрансфицированной клеточной культуры в качестве ДНК-матрицы.
Фигура 4. Денатурирующий ПААГ-электрофорез очищенного рекомбинантного белка CXCRs-Fc, М - смесь маркерных белков.
Осуществление изобретения
Осуществление изобретения проиллюстрировано, но не ограничено, следующими примерами.
Пример 1. Получение промежуточного вектора pIRESneo3-Fc
На первом этапе получения запланированных генетических конструкций сконструирован новый рекомбинантный промежуточный вектор pIRESneo3-Fc (Фиг. 1). В данном векторе под регуляцией промотора CMV помещены элементы, кодирующие лидерную последовательность CD33 и Fc-фрагмент иммуноглобулина G человека. Присутствие CD33 сигнальной последовательности в составе целевого белка обеспечивает его транспорт в среду культивирования. Такой прием позволяет изолировать белок от внутриклеточных протеаз в процессе наработки, а также облегчает дальнейшую очистку.
Конструкция рекомбинантного слитого белка CXCRs-Fc обеспечивает возможность специфической одноэтапной очистки с помощью аффинной хроматографии. Очистка Fc-содержащих белков методом аффинной хроматографии на носителях с белком А или G обеспечивает довольно высокую чистоту продукта и низкий уровень потерь. Для очистки рекомбинантного белка CXCRs-Fc был выбран метод аффинной хроматографии на Prosep Ultra plus protein A.
Фрагмент ДНК, содержащий данные элементы, амплифицировали методом полимеразной цепной реакции. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием «KOD Hot Start DNA Polymerase» («Merck KGaA») согласно рекомендациям фирмы-производителя. В реакции использовали олигонуклеотиды:
spIg_f(5'-GGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTG-3')
spIg_r(5'-TTAGGTGATCATATAGAATAGGGCCCTCTAGC-3').
В качестве ДНК-матрицы использовали плазмидную ДНК spIg. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 1х буфер для «KOD Hot Start DNA Polymerase», по 8 пМ каждого олигонуклеотида, 200 нМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1,5 мМ MgSO4, 1 нг ДНК вектора spIg и 0,5 ед. «KOD Hot Start DNA Polymerase».
Условия амплификации фрагмента ДНК приведены в таблице 1.
Продукты ПЦР длиной 1344 п. н. анализировали электрофорезом в 0,8% агарозном геле. В качестве электрофорезного буфера использовали 1х ТАЕ буфер (40 мМ Трис, 20 мМ уксусная кислота, 1 мМ ЭДТА, рН 8,3). После окончания электрофореза гель окрашивали раствором 5 мкг/мл бромистого этидия. Результаты визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете с помощью трансиллюминатора (Vilber Laurmat). Продукты полимеразной цепной реакции очищали с помощью набора «GeneJET PCR Purification Kit» («Thermo Scientific») в соответствии с инструкцией производителя. ПЦР фрагмент элюировали в объеме 25 мкл.
Амплифицированные фрагменты ДНК гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NdeI («Thermo Scientific») и BelI («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 2х буфер «Tango», 500 нг продуктов ПЦР и по 10 ед. эндонуклеаз рестрикции NdeI и BelI. Реакционную смесь инкубировали в течение 2 часов при 37°С, ферменты инактивировали прогреванием реакционной смеси при 80°С в течение 20 мин. Векторную ДНК pIRESneo3 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NdeI («Thermo Scientific») и BamHI («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 2х буфер «Tango», 500 нг векторной ДНК и по 10 ед. эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI. Реакционную смесь инкубировали в течение 2 часов при 37°С, ферменты инактивировали прогреванием реакционной смеси при 80°С в течение 20 мин. Продукты гидролиза очищали с помощью набора «GeneJET PCR Purification Kit» («Thermo Scientific») в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты ДНК элюировали в объеме 25 мкл.
Продукты гидролиза (линеаризованный вектор pIRESneo3 и ПЦР-фрагменты) лигировали с использованием Т4 ДНК лигазы («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 1х буфер для Т4 ДНК лигазы, 1 мМ АТФ, 1 ед. Т4 ДНК лигазы и по 100 пмоль продуктов гидролиза. Реакционную смесь инкубировали при 22°С в течение 20 мин.
Продуктами реакции лигирования трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма ТОР10. Трансформацию клеток Е. coli проводили химическим методом: реакционную смесь добавляли к компетентным клеткам и инкубировали в течение 60 мин на ледяной бане. Клетки инкубировали на водяной бане при 42°С в течение 90 сек, охлаждали на ледяной бане в течение 15 мин. К клеткам добавляли 1 мл среды LB и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. Трансформированные клетки высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Клетки инкубировали при 37°С в течение 14-16 часов.
Для анализа колоний клеток Е. coli проводили полимеразную цепную реакцию с использованием Taq ДНК полимеразы («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 1х буфер для Taq ДНК полимеразы, 200 нмоль каждого дизоксинуклеозидтрифосфата, по 10 пмоль олигонуклеотидов spIg_f и IRES_r (5' - ATGCCCGCTTTTGAGAGGGAGTACT-3') и 2,5 ед. Taq ДНК полимеразы. В качестве матричной ДНК использовали суспендированные колонии клеток Е. coli в 5 мкл раствора 1% Тритона Х-100.
Условия амплификации фрагмента ДНК приведены в таблице 2.
Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 0,8% агарозном геле. Из изолированных бактериальных колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды, выделяли векторную ДНК, используя набор «GeneJFT™ Plasmid Miniprep Kit» («Thermo Scientific») согласно рекомендациям производителя. Для подтверждения получения запланированного рекомбинантного вектора проводили секвенирование клонированного фрагмента ДНК, используя олигонуклеотиды spIg_f и IRES_r.
Таким образом, на данном этапе был получен вектор pIRESneo3-Fc, схематическое изображение которого представлено на Фигуре 1.
Пример 2. Получение вектора pCXC8R-Fc
Фрагмент ДНК, кодирующий экстраклеточный домен рецептора интерлейкина-8, амплифицировали в два этапа. На первом этапе проводили реакцию обратной транскрипции с использованием RevertAid обратной транскриптазы («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. В качестве матрицы для синтеза кДНК использовали препарат тотальной РНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови человека. В качестве праймера использовали олиго-дТ длиной 25 нуклеотидов. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 1х буфер для RevertAid обратной транскриптазы, 1 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 5 мкг тотальной РНК, 20 ед. RiboLock ингибитора РНКаз («Thermo Scientific»), 100 пмоль праймера олиго-дТ и 200 ед. RevertAid обратной транскриптазы. Реакционную смесь инкубировали при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали инкубацией реакционной смеси при 70°С в течение 10 мин.
На следующем этапе проводили полимеразную цепную реакцию с использованием «KOD Hot Start DNA Polymerase» («Merck KGaA») согласно рекомендациям фирмы-производителя. В реакции использовали олигонуклеотиды CXCR81-1 (5'-CGGAAGCTTATGTCAAATATTACAGATCCACAGATGTG-3') и CXCR81-2 (5'-TCCGGATCCTTGTTGAGTGTCTCAGTTTCTAGC-3'). В качестве ДНК-матрицы использовали продукты реакции обратной транскриции. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 1х буфер для «KOD Hot Start DNA Polymerase», по 8 пмоль каждого олигонулеотида, 200 нмоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1,5 мМ MgSO4, 2 мкл продуктов реакции обратной транскрипции и 0,5 ед. «KOD Hot Start DNA Polymerase». Условия амплификации фрагмента ДНК приведены в таблице 3.
Продукты ПЦР длиной 134 п.н. анализировали электрофорезом в 0,8% агарозном геле. Продукты полимеразной цепной реакции очищали с помощью набора «GeneJET PCR Purification Kit» («Thermo Scientific») в соответствии с инструкцией производителя. ПЦР фрагмент элюировали в объеме 25 мкл.
Амплифицированные фрагменты ДНК и векторную ДНК pIRESneo3-Fc гидролизовали эндонуклеазами рестрикции BamHI («Thermo Scientific») и HindIII («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 2х буфер «Tango», 500 нг продуктов ПЦР и по 10 ед. эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII. Реакционную смесь инкубировали в течение 2 часов при 37°С, ферменты инактивировали прогреванием реакционной смеси при 80°С в течение 20 мин. Продукты гидролиза очищали с помощью набора «GeneJET PCR Purification Kit» («Thermo Scientific») в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты ДНК элюировали в объеме 25 мкл.
Продукты гидролиза (линеаризованный вектор pIRESneo3-Fc и ПЦР-фрагменты) лигировали с использованием Т4 ДНК лигазы («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 1х буфер для Т4 ДНК лигазы, 1 мМ АТФ, 1 ед. Т4 ДНК лигазы, 10 пмоль линеаризованного вектора pIRESneo3-Fc и 100 пмоль ПЦР-фрагментов. Реакционную смесь инкубировали при 22°С в течение 20 мин.
Продуктами реакции лигирования трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма ТОР10. Трансформацию клеток Е. coli проводили химическим методом: реакционную смесь добавляли к компетентным клеткам и инкубировали в течение 60 мин на ледяной бане. Клетки инкубировали на водяной бане при 42°С в течение 90 сек, охлаждали на ледяной бане в течение 15 мин. К клеткам добавляли 1 мл среды LB и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. Трансформированные клетки высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Клетки инкубировали при 37°С в течение 14-16 часов.
Для анализа колоний клеток Е. coli проводили полимеразную цепную реакцию с использованием Taq ДНК полимеразы («Thermo Scientific») согласно рекомендациям фирмы производителя. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 1х буфер для Taq ДНК полимеразы, 200 нмоль каждого дизоксинуклеозидтрифосфата, по 10 пмоль олигонуклеотидов splg_f и Fc_r (5,-GGGGGAAGAGGAAGACTGACGGT-3') и 2,5 ед. Taq ДНК полимеразы. В качестве матричной ДНК использовали суспендированные колонии клеток Е. coli в 5 мкл раствора 1% Тритона Х-100. Условия амплификации фрагмента ДНК приведены в таблице 4.
Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 0,8% агарозном геле. Из изолированных бактериальных колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды, выделяли векторную ДНК, используя набор «GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit» («Thermo Scientific») согласно рекомендациям производителя. Для подтверждения получения запланированного рекомбинантного вектора проводили секвенирование клонированного фрагмента ДНК, используя олигонуклеотид spIg_f. Таким образом, на данном этапе был получен вектор pCXC8R-Fc, схематическое изображение которого представлено на Фиг 2.
Нуклеотидная последовательность вектора pCXC8R-Fc и аминокислотная последовательность целевого белка CXCRs-Fc приведены в Перечне последовательностей как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 соответственно.
Пример 3. Получение штаммов-продуцентов рекомбинантного целевого белка CXCRs-Fc
Вектор pCXC8R-Fc с проверенной нуклеотидной последовательностью рекомбинантного белка CXCRs-Fc использовали для трансфекции культуры HEK293 клеток почки эмбриона человека. В связи с тем, что получение и очистку рекомбинантного белка предполагалось вести из культуральной среды, для повышения продуктивности трансфицированной культуры клеток была выбрана линия клеток НЕК293, адаптированных к росту в суспензии. Штамм характеризуется следующими свойствами:
Морфологические признаки. Под фазовоконтрастным и световым микроскопами культура представлена суспензией округлых клеток.
Культуральные свойства. Штамм HEK293 поддерживается в виде суспензионной культуры на отечественных средах DMEM, DMEM/F-12, IMDM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки при температуре 37°С.
Криоконсервация. Криоконсервацию проводят на среде, содержащей 10% DMEM/F-12, добавлением 80% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида в качестве криопротектора. Концентрация клеток (2-4)×106 /мл. Штамм хранится при температуре минус (196±1)°С. Жизнеспособными после восстановления остаются не менее 60% клеток.
Кариологическая характеристика. Кариотип стабилен при исследовании до 30 пассажа, модальное число хромосом - 64, уровень клеток с повышенной плоидностью - 4.2%. Обнаруженные нарушения кариотипа укладываются в требования, предъявляемые к клеточной линии-продуценту согласно РД 42-28-10-89. Кариотип соответствует виду.
Контроль контаминации. Бактерии, грибы, дрожжи, микоплазмы и вирусы методами контроля согласно РД 42 -28-10-89 не обнаружены.
Контроль на туморогенность. На 30 пассаже онкогенных потенций не обнаружено.
Стабильность биологических свойств. Сохраняет стабильность кариотипа, культуральных, морфологических и продуктивных свойств до 30 пассажа (время наблюдения).
Установленный уровень пассажей для использования в производстве - 30.
Пример 4. Исследование устойчивости наследования экспрессионной плазмиды штаммом-продуцентом и ее стабильности
Клетки вышеуказанного штамма HEK293 трансфицировали сконструированной экспрессионной плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность гибридого рекомбинантного белка CXCRs-Fc. Трансфицированные клетки HEK293-CXCRs-Fc культивировали в среде DMEM/F-12, содержащей 400 мкг/мл неомицина, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Через 7 дней среду культивирования меняли на свежую, содержащую 800 мкг/мл неомицина, и инкубировали еще 7 дней при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Выросшие клоны (14 штук) путем «пикирования» пересевали индивидуально на селективную среду вышеуказанного состава. Из клеток, полученных после шестого пассажа, выделяли хромосомную ДНК и подвергали ее ПЦР-анализу на присутствие целевых фрагментов ДНК (последовательности гибридного белка) с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. По данным электрофоретического разделения в агарозном геле, все клоны содержали вставку, несущую кДНК гибридного белка, о чем свидетельствует полоса ДНК-фрагмента размером 150 п. о. (Фигура 3).
После этого амплифицированные фрагменты ДНК клонировали в вектор pUC19 и проводили анализ соответствия структуры клонированного фрагмента ДНК, кодирующего кДНК гибридного рекомбинантного белка CXCRs-Fc, с помощью ДНК-секвенирования. В результате анализа было показано наличие целевого фрагмента ДНК у всех исследованных клонов и отсутствие мутаций, делеций, инсерций, перестроек. Для клеток-продуцентов рекомбинантных белков именно этот показатель - отсутствие перестроек в структуре искусственного гена гибридного белка - является принципиально важным для дальнейшей работы. Следует отметить, что культивирование клеток-продуцентов на среде с неомицином и сохранение целевой встроенной кДНК подтверждает стабильность и наследуемость данных генотипических признаков.
Полученные клоны-продуценты гибридного рекомбинантного белка CXCRs-Fc стабильно наследуют векторную кДНК, а анализ амплифицированных фрагментов ДНК подтвердил наличие целевого фрагмента и отсутствие в его последовательности мутаций, делеций, инсерций и перестроек. Таким образом, выполнено одно из основных условий получения клеток-продуцентов гибридных рекомбинантных белков в части их стабильности и наследуемости генотипических признаков (устойчивость к антибиотику, наличие чужеродного гена).
Пример 5. Оценка биосинтетического потенциала полученных штаммов-продуцентов
Полученные данные позволяли перейти к следующему этапу исследования сконструированных клеток-продуцентов - оценке их биосинтетического потенциала и выбору оптимального клона.
Для этого выращивали по 3×106 клеток каждого из клонов в бессывороточной среде BD Cell™ в течение 4 суток. Морфологический контроль культур проводили каждые 24 часа визуально под микроскопом. По окончании культивирования культуральные жидкости собирали и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Содержание гибридного рекомбинантного белка CXCRs-Fc в отобранных после центрифугирования супернатантах оценивали с помощью иммунохимического анализа в сэндвич-ELISA постановке. Для этого в лунки 96-луночного планшета вносили рекомбинантный человеческий IL-8 (Sigma-Aldrich, США) в количестве 100 нг/лунку. После блокирования свободной поверхности лунок 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в ФСБ добавляли по 100 мкл культуральной среды каждого клона и инкубировали 1 ч при 37°С. После тщательной промывки ФСБ с 0.025% Твин-20 в лунки вносили конъюгат белок А - пероксидаза хрена (Merck Millipore) в разведении 1:5000. Инкубировали 1 ч при 37°С, промывали и проявляли пероксидазную активность в цитратном буфере, рН 4.5, содержащем 1.0 мг/мл o-phenylenediamine и 0.1% urea hydrogen peroxide при 25°C. Наличие комплексов IL-8 - CXCRs определяли спектрометрически с использованием планшетного ридера (Biorad, США). Специфичным сигналом считали значения оптической плотности, в 3 раза превышающие значения отрицательного контроля. Как следует из полученных данных, в супернатантах всех клонов обнаруживался целевой гибридный рекомбинантный белок CXCRs-Fc.
Для более точного количественного определения уровней биосинтеза в различных клонах-продуцентах был проведен дополнительный иммунохимический анализ супернатантов. Для этого предварительно было проведено препаративное выделение рекомбинантного белка CXCRs-Fc из смеси супернатантов различных клонов на микроколонках (5×10 мм), содержащих в качестве аффинного носителя белок А-сефарозу. Смешанные супернатанты клеток-продуцентов наносили на колонку с помощью перистальтического насоса при постоянной скорости 0,5 мл/мин. Операции проводились при 4°С. Связывание белка с носителем на стадиях нанесения белка и промывки носителя контролировали по оптической плотности элюата на длине волны 280 с использованием системы проточного детектора Uvicord.
После связывания целевого белка с аффинным носителем носитель промывали буфером, содержащим 25 мМ трис-HCl, рН 7.1, 25 мМ NaCl г и 5 мМ ЭДТА, для отмывки белков, не связавшихся с белок А-сефарозой, с постоянным контролем по оптической плотности элюата (Uvicord).
Элюцию целевого белка с колонки проводили буфером с низким значением рН (50 мМ Na-ацетат, рН 2.7) в пробирки, содержащие по 0,5 мл 100 мМ раствора трис-HCl, рН 7.9. Скорость нанесения, промывок и элюции составляла не более 0,5 мл/мин.
Качество и количество выделенного рекомбинантного белка CXCRs-Fc определяли электрофоретически (Фигура 4) с последующей денситометрией окрашенного геля. Выделенный рекомбинантный белок CXCRs-Fc с известной концентрацией использовали в качестве положительного контроля и для построения калибровочной кривой.
Для количественной оценки продуктивности различных клонов HEK293-CXCRs-Fc был проведен иммунохимический анализ супернатантов в следующей постановке. В лунки 96-луночного планшета вносили рекомбинантный человеческий IL-8 (Sigma-Aldrich, США) в количестве 100 нг/лунку. После блокирования свободной поверхности лунок 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS добавляли по 100 мкл разведенной 1:10, 1:30 и 1:100 культуральной среды каждого клона или выделенный рекомбинантный белок CXCRs-Fc с известной концентрацией (1 мкг/лунку; 0.3 мкг/лунку; 0.1 мкг/лунку и 0.03 мкг/лунку). Инкубировали 1 ч при 37°С. После тщательной промывки PBS с 0.025% Твин-20 в лунки вносили конъюгат белок А - пероксидаза хрена (Merck Millipore) в разведении 1:5000. Инкубировали 1 ч при 37°С, промывали и проявляли пероксидазную активность в цитратном буфере, рН 4.5, содержащем 1.0 мг/мл о-phenylenediamine и 0.1% urea hydrogen peroxide при 25°C. Значения оптической плотности, определенной спектрометрически с использованием планшетного ридера (Biorad, США), сравнивали со значениями OD в лунках с выделенным рекомбинантным белком CXCRs-Fc.
Количественную оценку биосинтетической активности клонов-продуцентов рассчитывали как среднее из трех независимых экспериментов с использованием программы «StatPlus2007» [www.analystsoft.com]. Уровни продукции рекомбинантного белка CXCRs-Fc клетками-продуцентами представлены в таблице 5.
Анализ полученных данных показывает, что биосинтетическая активность полученных штаммов-продуцентов различается менее чем на порядок и максимальная продукция целевого белка наблюдается для клона G2K. Уровень продукции составляет по расчетным данным более 180±16 мг/л. В связи с этим он был выбран как наиболее эффективный продуцент в ряду исследованных клонов HEK293-CXCRs-Fc, и дальнейшая работа проводилась именно с ним.
Пример 6. Выделение и очистка рекомбинантного белка CXCRs-Fc из культуральной жидкости
Для отработки условий выделения и очистки рекомбинантного CXCRs-Fc маточную культуру из матраца вносили в культуральный пакет с 1000 мл среды BD Cell™ MAb. Подготовленный пакет соединяли с модулями подачи воздуха, термостатирования и датчиками рН и DO биореактора BIOSTAT® CultiBag RM и культивировали в течение 7 суток. По окончании культивирования культуральную жидкость переносили в стеклянную емкость и использовали для оптимизации условий очистки.
Основной протокол выделения и очистки целевого белка включает ряд стадий:
1) стадия центрифугирования культуральной жидкости;
2) аффинная хроматография на Prosep Ultra plus protein A;
3) катионообменная хроматография с использованием носителя Poros HS 50;
4) анионообменная хроматография с использованием носителя Q Sepharose FF.
Стадия центрифугирования. В качестве исходного материала для выделения и очистки целевого белка использовали культуральную жидкость клеток-продуцентов рекомбинантного белка - Hek-CXCRs-Fc. По окончании инкубации клеток, культуральную жидкость объединяли (общий объем примерно 500 мл) и отделяли биомассу центрифугированием при 3000 об/мин при +4°С. Полученный супернатант использовали для выделения целевого белка.
Очистка целевого белка методом аффинной хроматографии. Для оптимизации условий аффинной хроматографии сравнивали несколько матриц с иммобилизованными белками А или G: протеин А-агароза (Pierce), протеин G сефароза (GE), ProSepUltra Plus Protein A (Merck KGaA). Сравнительный анализ показал, что ProSepUltra Plus Protein А в отличие от других матриц характеризуется большой емкостью при скорости нагрузки до 10 мл/мин и устойчивостью к износу в процессе использования. Таким образом, для очистки рекомбинантного CXCRs-Fc использовали ProSepUltra Plus Protein А. Для этого культуральную жидкость наносили с помощью перистальтического насоса на колонку (2,5×10,2 см) с ProSepUltra Plus Protein А. После нанесения культуральной жидкости колонку промывали буферным раствором, содержащим 25 мМ Трис-HCl, 25 мМ натрия хлористого, 5 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,5 М хлорида тетраметиламмония, рН 7,0, затем аналогичным буфером без хлорида тетраметиламмония. Контроль проводили по оптической плотности элюата на длине волны 280 нм. Промывку проводили до полной отмывки несвязавшихся белков (значение оптической плотности на длине волны 280 нм меньше 0,001). Связавшийся с носителем целевой белок элюировали 100 мМ раствором уксусной кислоты. Скорость посадки, промывок и элюции поддерживали 10 мл/мин. Полученный образец белка хранили при температуре +4°С.
Очистка целевого белка методом катионообменной хроматографии. Для отработки условий катионообменной хроматографии определяли оптимальные условия для нанесения и элюции целевого белка. Образец наносили в буфере с различными концентрациями соли и значениями рН (4,0, 4,5). Было установлено, что оптимальный состав буфера для нанесения образца 20 мМ натрия ацетат, 60 мМ натрий хлористый, рН 4,5. Для определения условий фракционирования образца элюцию белка вели линейным градиентом концентрации натрия хлористого (60-1000 мМ). Определили, что фракция целевого белка элюируется в буфере с 160 мМ концентрацией натрия хлористого. Ниже представлен конечный протокол очистки CXCRs-Fc на стадии катионообменной хроматографии.
Образец белка после аффинной хроматографии титровали 100 мМ раствором едкого натра до рН 4,5 и наносили с помощью перистальтического насоса на колонку (2,5×5,1 см) с носителем - Poros HS 50. После нанесения образца колонку промывали буферным раствором, содержащим 20 мМ натрия ацетат трехводный, 60 мМ натрий хлористый, рН 4,5. Контроль проводили по оптической плотности элюата на длине волны 280 нм. Промывку проводили до полной отмывки несвязавшихся белков (значение оптической плотности на длине волны 280 нм меньше 0,001). Связавшийся с носителем целевой белок элюировали буферным раствором, содержащим 20 мМ натрия ацетат трехводный, 160 мМ натрий хлористый, рН 4,5. Скорость посадки 5 мл/мин, промывок и элюции -10 мл/мин. Полученный образец белка хранили при температуре +4°С.
Очистка целевого белка методом анионообменной хроматографии. Для отработки условий анионообменной хроматографии определяли оптимальные условия для нанесения и элюции целевого белка. Образец наносили в буфере с различными концентрациями соли и значениями рН (7,0, 8,0). Было установлено, что оптимальный состав буфера для нанесения образца 25 мМ Трис-HCl, 50 мМ натрий хлористый, рН 8,0. Для определения условий фракционирования образца элюцию белка вели линейным градиентом концентрации натрия хлористого (50-1000 мМ). Определили, что фракция целевого белка элюируется в буфере с 300 мМ концентрацией натрия хлористого. Ниже представлен конечный протокол очистки CXCRs-Fc на стадии анионообменной хроматографии.
Образец белка после катионообменной хроматографии титровали 1,5 М раствором трис(гидроксиметил)аминометана до рН 8,0 и наносили с помощью перистальтического насоса на колонку (1,2×8,9 см) с носителем Q Sepharose FF. После нанесения образца колонку промывали буферным раствором, содержащим 25 мМ Трис-HCl, 50 мМ натрий хлористый, рН 8,0. Контроль проводили по оптической плотности элюата на длине волны 280 нм. Промывку проводили до полной отмывки несвязавшихся белков (значение оптической плотности на длине волны 280 нм меньше 0,001). Связавшийся с носителем целевой белок элюировали буферным раствором, содержащим 25 мМ Трис-HCl, 300 мМ натрий хлористый, рН 8,0. Скорость посадки 5 мл/мин, промывок и элюции - 10 мл/мин. Полученный образец белка хранили при температуре +4°С.
Пробы полученного рекомбинантного белка анализировали с помощью электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Сканирование высушенных гелей показало, что степень чистоты целевого рекомбинантного белка составляет не менее 96%. Результаты очистки на промежуточных стадиях представлены в таблице 6.
Литературные источники
- Backliwal G. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions // Nucleic Acids Res. - 2008. - Vol.36. - N 15. - p. 96.
- Barter E.F., Stone, M.J. Synergistic Interactions between Chemokine Receptor Elements in recognition of Interleukin-8 by soluble receptor mimics. // Biochemistry. - 2012. - Vol. 51. - N6. - P. 1322-1331.
- Brunner, D. Serum-free cell culture: the serum-free media interactive online database // ALTEX. - 2010. - Vol. 27. - №1. - p. 53-62.
- Geisse S. Recombinant protein production by transient gene transfer into Mammalian cells // Methods Enzymol. - 2009. - Vol. 463. - p. 223-238.
- Helmer D. Rational design of a peptide capture agent for CXCL8 based on a model of the CXCL8:CXCR1 complex. // RSC Advances. - 2015. - V. 5. - p. 25657-25668.
- Joseph P.R., Solution N.M.R. Characterization of WTCXCL8 monomer and dimer binding to CXCR1 N-terminal domain // Protein Science. - 2015. - V. 24. - p. 81-92.
- Kontermann R.E. Strategies of extended serum half-life of protein terapeutics. // Curr. Opin. Biotechnol. - 2011. - V.22. - p. 868-876.
- Krishnamurthy, V.M. Multivalency in Ligand Design // Fragment-based Approaches in Drug Discovery. - Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2006. - p. 11-53.
- Levin D., Golding В., Strome S.E., Sauna Z.E. Fc fusion as a platform technology: potential for modulating immunogenicity.// Trends in Biotechnology. - 2015. - V. 33. - p. 27-34.
- Park, S.H. Interactions of Interleukin-8 with the Human Chemokine Receptor CXCR1 in Phospholipid Bilayers by NMR Spectroscopy // J Mol Biol. - 2011. - V. 414. - p. 194-203.
- Roopenian D.C., Akilesh S. FcRn: The neonatal Fc receptor comes of age. // Nat. Rev. Immunol. - 2007. - V. 7. - p. 715-725.
- Skelton N.J. Structure of a CXC chemokine-receptor fragment in complex with interleukin-8 // Structure. - 1999. - V. - p. 157-168.
- www.analystsoft.com
Claims (1)
- Генетическая конструкция pCXC8R-Fc, последовательность которой представлена как SEQ ID NO: 1, кодирующая слитый белок, последовательность которого представлена как SEQ ID NO: 2, состоящий из экстраклеточного домена рецептора интерлейкина 8, CXC8R, и Fc-фрагмента иммуноглобулина G1 человека, обладающий противоопухолевым свойством за счет анти-IL-8 активности, характеризующаяся следующими конструктивными признаками: CMV IE Promoter - ранний промотор цитомегаловируса (CMV) человека (230-862), CD33 signal sequence - лидерная последовательность CD33 (906-959), CXC8R - экстраклеточный домен рецептора интерлейкина 8, последовательность первой части слитого колируемого белка (966-1082), Factor Ха site - сайт узнавания фактора Ха (1089-1100), IgG1 Fc tail - Fc фрагмент иммуноглобулина G1 человека, последовательность второй части слитого кодируемого белка (1116-1814), IVS - синтетический интрон (1874-2169), IRES - участок внутренней посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита (ECMV) (2195-2785), Neo (R) - неомицин-фосфотрансфераза (2821-3621), SV40 polyA signal - сигнальная последовательность полиаденилирования вируса SV40 (3785-3790 и 3814-3819), ColE1 ori - ориджин репликации ColE1 (4411-5010), Amp (R) - β-лактамаза (5137-5999).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017130708A RU2676317C1 (ru) | 2017-08-30 | 2017-08-30 | ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pCXCRs-Fc ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО СЛИТОГО БЕЛКА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИ-IL-8 АКТИВНОСТЬЮ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017130708A RU2676317C1 (ru) | 2017-08-30 | 2017-08-30 | ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pCXCRs-Fc ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО СЛИТОГО БЕЛКА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИ-IL-8 АКТИВНОСТЬЮ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2676317C1 true RU2676317C1 (ru) | 2018-12-27 |
Family
ID=64753700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017130708A RU2676317C1 (ru) | 2017-08-30 | 2017-08-30 | ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pCXCRs-Fc ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО СЛИТОГО БЕЛКА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИ-IL-8 АКТИВНОСТЬЮ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2676317C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992018641A1 (en) * | 1991-04-10 | 1992-10-29 | The Trustees Of Boston University | Interleukin-8 receptors and related molecules and methods |
| WO1995019436A1 (en) * | 1994-01-13 | 1995-07-20 | The Regents Of The University Of California | Mammalian monocyte chemoattractant protein receptors |
| US20130011436A1 (en) * | 2010-03-11 | 2013-01-10 | Health Research, Inc. | Methods and Compositions Containing Fc Fusion Proteins for Enhancing Immune Responses |
-
2017
- 2017-08-30 RU RU2017130708A patent/RU2676317C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992018641A1 (en) * | 1991-04-10 | 1992-10-29 | The Trustees Of Boston University | Interleukin-8 receptors and related molecules and methods |
| WO1995019436A1 (en) * | 1994-01-13 | 1995-07-20 | The Regents Of The University Of California | Mammalian monocyte chemoattractant protein receptors |
| US20130011436A1 (en) * | 2010-03-11 | 2013-01-10 | Health Research, Inc. | Methods and Compositions Containing Fc Fusion Proteins for Enhancing Immune Responses |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BALDI L. et al., "Transient Gene Expression in Suspension HEK-293 Cells: Application to Large-Scale Protein Production." Biotechnology progress, 2005, 21(1):148-153. * |
| BALDI L. et al., "Transient Gene Expression in Suspension HEK-293 Cells: Application to Large-Scale Protein Production." Biotechnology progress, 2005, 21(1):148-153. КОСОБОКОВА Е. Н. и др., "Слитные белки на основе антител и цитокинов: получение, функциональность и перспективы применения в онкологии." Соврем. технол. мед., 2013, 5(4):102-111. * |
| КОСОБОКОВА Е. Н. и др., "Слитные белки на основе антител и цитокинов: получение, функциональность и перспективы применения в онкологии." Соврем. технол. мед., 2013, 5(4):102-111. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102064230B1 (ko) | 키메라 항원 수용체 및 이의 이용 방법 | |
| US6476198B1 (en) | Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules | |
| US11591409B2 (en) | Anti-PD-L1/anti-PD-1 natural antibody structure-like heterodimeric bispecific antibody and preparation thereof | |
| CN109963876B (zh) | 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 | |
| BRPI0807344A2 (pt) | Antígenos multivariáveis complexados com anticorpo monoclonal humanizado de direcionamento | |
| JP2022513383A (ja) | 二重特異性抗体及びその作製方法と使用 | |
| JPH02295487A (ja) | キメラモノクローナル抗体の産生のための発現系 | |
| CN110028584B (zh) | 针对egfr蛋白和met蛋白的双特异性抗体 | |
| US20170274072A1 (en) | Bispecific antibody targeting human epidermal growth factor receptor | |
| WO2017143839A1 (zh) | 基于内含肽的药用重组蛋白的合成方法 | |
| JP2009504136A (ja) | 慢性リンパ性白血病治療のためのｃｄ５２に対するモノクローナル抗体産生のための組み換え法 | |
| CN114945384A (zh) | 高度唾液酸化的多聚体结合分子 | |
| GB2518221A (en) | Tetravalent antigen-binding protein molecule | |
| JP2022531128A (ja) | ポリペプチド鎖交換による抗体由来ポリペプチドの生成 | |
| CN114106195A (zh) | 一种多功能融合蛋白及其用途 | |
| CN100586960C (zh) | HAb18GC2单抗和其轻、重链可变区基因及应用 | |
| JP2022530045A (ja) | ポリペプチド鎖の交換により活性化される治療用多重特異性ポリペプチド | |
| WO2023070056A2 (en) | Heterodimeric fc cytokines and uses thereof | |
| RU2676317C1 (ru) | ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pCXCRs-Fc ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО СЛИТОГО БЕЛКА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИ-IL-8 АКТИВНОСТЬЮ | |
| RU2640259C2 (ru) | Антитело МАТ40, которое связывается с доменом I экстраклеточной части рецептора эпидермального фактора роста HER2/CD340, и его применение для лечения рака | |
| AU2022369312A1 (en) | Heterodimeric fc cytokines and uses thereof | |
| KR20230172538A (ko) | Fc-유래된 폴리펩티드 | |
| CN112409484A (zh) | 多功能抗体、其制备及其用途 | |
| US20100120090A1 (en) | MAMMALIAN EXPRESSION VECTOR pUHAB | |
| RU2822890C1 (ru) | Способ получения димерной формы иммуноглобулина IgA1-изотипа в клетках млекопитающих |