JP2022530045A - ポリペプチド鎖の交換により活性化される治療用多重特異性ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
【要約書】
本発明は、ヘテロ二量体ポリペプチドの組と、例えばがんを治療するための、治療法におけるその使用とに関する。
【選択図】図１
本発明は、ヘテロ二量体ポリペプチドの組と、例えばがんを治療するための、治療法におけるその使用とに関する。
【選択図】図１
Description
発明の分野
本発明は、例えばポリペプチド鎖の交換による多重特異性抗原バインダー生成のための、ヘテロ二量体ポリペプチドの組とその使用に関する。
本発明は、例えばポリペプチド鎖の交換による多重特異性抗原バインダー生成のための、ヘテロ二量体ポリペプチドの組とその使用に関する。
発明の背景
例えばＣＤ３を介してがん細胞及びＴ細胞の表面に発現される抗原を標的とする二重特異性抗体によるがん治療、及びそれによりＡＤＣＣをがん細胞に向けて媒介することは、標的外Ｔ細胞活性化に起因して投薬に課題を提供し、これは望ましくない。
例えばＣＤ３を介してがん細胞及びＴ細胞の表面に発現される抗原を標的とする二重特異性抗体によるがん治療、及びそれによりＡＤＣＣをがん細胞に向けて媒介することは、標的外Ｔ細胞活性化に起因して投薬に課題を提供し、これは望ましくない。
ＥＰ３１８０３６１（特許文献１）には前駆体分子が開示されており、この場合ＣＤ３に特異的に結合する結合部位は、標的細胞上で活性化される。このような前駆体分子はＦａｂ断片を含み、この場合Ｃ末端に対し、例えばＣＤ３に結合する、前記Ｆａｂ断片、ＣＨ２ドメイン及び可変抗体ドメインが融合する。異なる可変ドメインを含む２つの前駆体分子の標的細胞結合時、機能的抗原結合部位（例えばＣＤ３に結合する）が、前記可変ドメインの会合により形成される。
Ｌａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．には、制御されたＦａｂアーム交換による安定な二重特異性ＩｇＧ１の効率的な生成が開示されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０（２０１３）５１４５－５１５０（非特許文献１））。簡潔には、ＣＨ３ドメインに点突然変異を有するＩｇＧ様ドメイン構成の２つの単一特異性前駆体分子を接触させてポリペプチド鎖の交換を生じさせ、やはりＩｇＧ様ドメイン構成のものである二重特異性生成物分子を形成する。
公開されていない先行技術ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７８６７５（特許文献２）及びＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７９５２３（特許文献３）には、ポリペプチド鎖の交換により２つの異なる前駆体分子から多重特異性抗原バインダーを生成するための方法が開示されている。両方の前駆体分子は、非対称なドメイン構成のヘテロ二量体ポリペプチドである。両方の前駆体分子が、「ノブ・イントゥー・ホール」技術（国際公開第９６／０２７０１１号（特許文献４）、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ９（１９９６）６１７－６２１（非特許文献２）；及びＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６（１９９８）６７７－６８１（非特許文献３））に従って修飾されたＣＨ３ドメインを含み、非対称なパターンに構成されている不安定化変異をさらに含む。前駆体分子の各々において、ＣＨ３ドメインの一方のみがこのような不安定化変異を含む。ポリペプチド鎖の交換の際に、２つの生成物分子が形成され、生成物分子の各々は前駆体分子の各々からのポリペプチドを含む。前駆体分子と生成物分子は異なるドメイン構成のものである。ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７８６７５（特許文献２）及びＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７９５２３（特許文献３）には、置換される前駆体分子のＣＨ３／ＣＨ３接触面内のアミノ酸位置が開示されている。
しかし、治療法において、依然としてポリペプチド鎖の交換により多重特異性抗原バインダーを生成するためのさらなる方法が必要とされている。
Ｌａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０（２０１３）５１４５－５１５０
Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ９（１９９６）６１７－６２１
Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６（１９９８）６７７－６８１
本発明は、
－ ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第１の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと、
－ ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第２の抗原結合部分を含み、第２の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと
を含む、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組に関し、
ここで、
Ａ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含むか、又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含み；
Ｂ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合するか；又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合し、
Ｃ）
ｉ）ノブ変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びホール変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、又は
ｉｉ）ホール変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びノブ変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン
は、番号付けがカバット番号付けシステムによる以下のアミノ酸置換を含んでいる：
－ ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、
・正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び
・疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み；
－ 任意選択的に、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに
・疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
－ ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第１の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと、
－ ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第２の抗原結合部分を含み、第２の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと
を含む、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組に関し、
ここで、
Ａ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含むか、又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含み；
Ｂ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合するか；又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合し、
Ｃ）
ｉ）ノブ変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びホール変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、又は
ｉｉ）ホール変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びノブ変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン
は、番号付けがカバット番号付けシステムによる以下のアミノ酸置換を含んでいる：
－ ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、
・正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び
・疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み；
－ 任意選択的に、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに
・疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
本発明の一実施形態は、ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むか、又はｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含む、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドの組に関する。
本発明の一実施形態は、第１の抗原結合部分及び／又は第２の抗原結合部分が抗体断片である、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドの組に関する。
本発明の一実施形態は、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドがヒンジ領域を含み、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドがヒンジ領域に鎖間ジスルフィド結合を含まない、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドの組に関する。
本発明の一実施形態は、Ｂ）に示されるＶＨドメインとＶＬドメインが、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドの組に関する。
本発明の別の態様は、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖と、第２のヘテロ二量体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖とを含む第３のヘテロ二量体ポリペプチドを形成するために、本発明による第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドとを接触させることを含む、ヘテロ二量体ポリペプチドを生成するための方法である。
本発明の一実施形態は、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドがヒンジ領域を含み、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドがヒンジ領域に鎖間ジスルフィド結合を含まず；接触させることが還元剤の非存在下で実施される、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドを生成する方法に関する。
本発明の一実施形態は、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含み、第３のヘテロ二量体ポリペプチドが、第１の抗原に特異的に結合する抗原結合部分と第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部分とを含み、第３の抗原結合部分が、Ｂ）に示されるＶＬドメインとＶＨドメインによって形成される、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドを生成する方法に関する。
本発明の別の態様は、本発明による方法により得られたヘテロ二量体ポリペプチドである。
本発明の別の態様は、医薬としての使用のための、本発明によるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組である。
本発明の別の態様は、第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド中で、Ｂ）に示されるＶＨドメインとＶＬドメインが、がんの治療における使用のための、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、本発明によるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組である。
本明細書に開示される発明により、生成物ポリペプチドを生成するために、ポリペプチド鎖の交換を受けることのできる前駆体ポリペプチドが提供される。それにより、多重特異性抗原結合ポリペプチドが生成されうる。多重特異性抗原結合ポリペプチドの生成は、ポリペプチド鎖の交換により抗原結合部位を活性化し、抗原に特異的に結合する抗体可変ドメインの会合をもたらすことを含む。また、多重特異性抗原結合ポリペプチドは、異なる抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含む２つの前駆体ポリペプチド間の組み合わせ及びポリペプチド鎖の交換により形成される。
本発明の方法及びポリペプチドの組は、治療的使用のため；例えばがんの治療のための、抗原結合ポリペプチドを提供するために有利に使用されうる。
本発明の前駆体ポリペプチドの組の治療応用により、標的部位に所望の生成物ポリペプチドを生成することが可能となり、したがって生成物ポリペプチドの望ましくない標的外効果が低減されうる。
発明の詳細な説明
１．定義
ここで別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。本開示の方法及び技術は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って実施される。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子生物学、細胞生物学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸の化学並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及び技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。
１．定義
ここで別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。本開示の方法及び技術は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って実施される。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子生物学、細胞生物学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸の化学並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及び技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。
用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別段の指定がない限り、一般に複数の指示対象を含む。
ここで別段の定義がない限り、「で構成される」という用語は、「からなる」という用語を含むものとする。
「又は」を使用した二者択一の提供は、別段の指定がない限り、互いに排他的な代替案を指定する。
本明細書で使用される用語「抗原結合部分」は、標的抗原に特異的に結合する部分を指す。この用語には、抗体並びに標的抗原に特異的に結合することのできる他の天然（例えば受容体、リガンド）又は合成（例えばＤＡＲＰｉｎｓ）分子が含まれる。
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
本明細書で使用される用語「結合部位」又は「抗原結合部位」は、抗原が実際に結合する抗原結合部分の１つ又は複数の領域を意味する。抗原結合部分が抗体である場合、抗原結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又はＶＨ／ＶＬの対を含む。標的抗原に特異的に結合する抗体に由来する抗原結合部位は、ａ）抗原に特異的に結合する既知の抗体から、又はｂ）特に抗原タンパク質若しくは核酸又はそれらの断片を使用する新規の免疫化方法により、又はファージディスプレイ方法により得られた新規の抗体若しくは抗体断片から得ることができる。
抗体から得られたとき、本発明による抗体の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位の親和性に様々な度合いで寄与する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことができる。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）と３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、それらの領域を配列中の可変性に従って定義したアミノ酸配列のコンパイルデータベースとの比較により決定される。本発明の範囲には、より少ないＣＤＲから構成される（即ち、結合特異性が３つ、４つ又は５つのＣＤＲにより決定される）機能性抗原結合部位も含まれる。例えば、６つのＣＤＲの完全な組を満たさなくとも結合に十分でありうる。
本明細書で使用される用語「価」は、抗体分子内の特定数の結合部位の存在を示す。自然抗体は、例えば２つの結合部位を有し、２価である。したがって、用語「３価」は、抗体分子内の３つの結合部位の存在を示す。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「特異性」は、抗原結合部分、例えば抗体による抗原の特定のエピトープの選択的認識を指す。例えば、自然抗体は単一特異性である。本明細書で使用される用語「単一特異性抗体」は、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を示す。「多重特異性抗体」は、２つ以上の異なるエピトープ（例えば、２つ、３つ、４つ、又はそれより多い異なるエピトープ）に結合する。エピトープは、同じ又は異なる抗原上に位置しうる。多重特異性抗体の一例は、２つの異なるエピトープに結合する「二重特異性抗体」である。抗体が１つより多い特異性を保有するとき、認識されたエピトープは、単一の抗原又は１つより多い抗原と会合することができる。
エピトープは、抗原結合部分、例えば抗体が結合する抗原の領域である。用語「エピトープ」は、抗体又は抗原結合部分に特異的結合することのできるあらゆるポリペプチド決定基を含む。一部の実施形態では、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面グルーピング、例えば、アミノ酸、グリカン側鎖、ホスホリル、又はスルホニルを含み、一部の実施形態では、特定の三次元構造特徴、及び／又は特定の電荷特徴を有しうる。
本明細書で使用される用語「結合」及び「特異的結合」は、精製された野生型抗原を用いたインビトロアッセイ、好ましくはプラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）における抗体又は抗原結合部分の、抗原のエピトープへの結合を指す。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合部分は、タンパク質及び／又は高分子の複合混合物においてその標的抗原を優先的に認識するとき、抗原に特異的に結合すると言われている。
抗体の抗原に対する結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合の速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって定義される。一実施形態において、結合又は特異的に結合するものは、１０－８ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性（ＫＤ）を意味し、一実施形態では、１０－８～１０－１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性を意味する。したがって、抗原結合部分、特に抗体結合部位は、それが特異的である各抗原に、１０－８ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性（ＫＤ）、例えば１０－８～１０－１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）で特異的に結合し、一実施形態においては、１０－９～１０－１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）で特異的に結合する。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、通常同様の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ． Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。）単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分でありうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを使用し、それぞれ、相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。
本出願内で使用される「定常ドメイン」又は「定常領域」という用語は、可変領域以外の抗体のドメインの合計を示す。定常領域は、抗原の結合に直接関与していないが、様々なエフェクター機能を呈する。
それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体は、「クラス」：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分けられ、これらのうちのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３並びにＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２といったサブクラスへとさらに分けることができる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。５つの抗体クラスすべてに見られる軽鎖定常領域（ＣＬ）は、κ（カッパ）及びλ（ラムダ）と呼ばれる。
本明細書で使用される「定常ドメイン」は、好ましくは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域及び／又は定常軽鎖カッパ又はラムダ領域に由来する、ヒト起源由来である。そのような定常ドメイン及び領域は、当技術分野でよく知られており、例えば、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって記載されている。
野生型抗体において，「ヒンジ領域」は、ＩｇＧ及びＩｇＡ免疫グロブリンクラスの重鎖の中央部の柔軟なアミノ酸ストレッチであり、２つの重鎖間に形成されると、２つの重鎖をジスルフィド結合、即ち「鎖間ジスルフィド結合」により結合する。ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域は、一般に、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６又は約Ｃｙｓ２２６～約Ｐｒｏ２３０に伸びていると定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６（１９８５））。ヒンジ領域内のシステイン残基を欠失させることにより、又はヒンジ領域内のシステイン残基を他のアミノ酸、例えばセリンによって置換することにより、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合の形成が回避される。
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの別個の型のうちの１つに割り当てることができる。野生型軽鎖は一般に２つの免疫グロブリンドメインを含み、それらは通常、抗原への結合に重要な１つの可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）である。
抗体のクラス又はアイソタイプを定義するいくつかの異なるタイプの「重鎖」が存在する。野生型重鎖には一連の免疫グロブリンドメインが含まれ、通常、抗原の結合に重要な１つの可変ドメイン（ＶＨ）といくつかの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３等）が含まれる。
用語「Ｆｃ領域」は、本明細書では定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異Ｆｃ領域とを含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びている。本明細書において別段の定めがない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から、約３４０位のアミノ酸残基まで延びている。多重特異性抗体はＣＨ２ドメインを欠く。「ＣＨ２ドメインを欠く」とは、本発明によるに抗体がＣＨ２ドメインを含まないことを意味する。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端に残基のストレッチを含む（即ち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から、約４４７位のアミノ酸残基まで）。本明細書の「ＣＨ３ドメイン」はバリアントＣＨ３ドメインであり、天然ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、多重特異性抗体内部で互いに対向する２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を促進するために、少なくとも１つの別個のアミノ酸置換（即ちＣＨ３ドメインのアミノ酸配列の修飾）に供された。
典型的には、当技術分野において既知のヘテロ二量体化手法では、一方の重鎖のＣＨ３ドメインと他方の重鎖のＣＨ３ドメインは、１つの操作ＣＨ３ドメインを含む重鎖が同じ構造の別の重鎖ともはやホモ二量体化できないように、両方が相補的に操作される。それにより、一方の操作ＣＨ３ドメインを含む重鎖は、相補的に操作されたＣＨ３ドメインを含む他方の重鎖とヘテロ二量体化することを余儀なくされる。
当技術分野において既知の１つのヘテロ二量体化手法は、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」技術であり、これは、例えば国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ９（１９９６）６１７－６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６（１９９８）６７７－６８１；及び国際公開第９８／０５０４３１号において複数の実施例を提供しながら詳述されており、これら文献は参照により本明細書に含まれる。「ノブ・イントゥー・ホール」技術では、抗体の三次構造内で２つのＣＨ３ドメイン間に形成される接触面内において、各ＣＨ３ドメインの特定のアミノ酸が、ＣＨ３ドメインの一方に隆起（「ノブ」）を、他方のＣＨ３ドメインに空洞（「ホール」）を、それぞれ生成するように操作されている。多重特異性抗体の三次構造において、一方のＣＨ３ドメインに導入された隆起は、他方のＣＨ３ドメインに導入された空洞内に位置させることが可能である。
ノブ・イントゥー・ホール技術による置換と組み合わせて、追加の鎖間ジスルフィド結合をＣＨ３ドメインに導入し、ヘテロ二量体化ポリペプチドをさらに安定させてもよい（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６（１９９８）６７７－６８１）。このような鎖間ジスルフィド結合は、例えば以下のアミノ酸置換をＣＨ３ドメインに導入することによって形成される：一方のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｃと他方のＣＨ３ドメインにおけるＫ３９ｋ２Ｃ；一方のＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃと他方のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ；一方のＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃと他方のＣＨ３ドメインにおけるＥ３５６Ｃ；一方のＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃと他方のＣＨ３ドメインにおけるＥ３５７Ｃ；一方のＣＨ３ドメインにおけるＬ３５１Ｃと他方のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ；一方のＣＨ３ドメインにおけるＴ３９４Ｃと他方のＣＨ３ドメインにおけるＶ３９７Ｃ。本明細書で使用される「システイン変異」は、ＣＨ３ドメイン内のアミノ酸のシステインによる１つのアミノ酸置換を指し、このアミノ酸置換は、第２のＣＨ３ドメイン内のアミノ酸のシステインによる別の一致するアミノ酸置換と鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。
ヘテロ二量体化を必然的に起こすためにＣＨ３ドメインを修飾するための、前述の「ノブ・イントゥー・ホール」技術以外のさらなる技術は、当技術分野において既知である。これらの技術、特に国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号及び国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されるものは、本明細書において、本発明により提供されるポリペプチドのための「ノブ・イントゥー・ホール技術」の代替として考慮される。これらの技術のすべては、反対の電荷の又は異なる側鎖体積のアミノ酸の導入によりＣＨ３ドメインを相補的に操作し、それによりヘテロ二量体化をサポートすることを含む。
本明細書で使用される用語「ポリペプチド鎖」は、ペプチド結合を介してまとまって結合した多数のアミノ酸を含む線状有機ポリマーを指す。１つ以上のポリペプチド鎖は「ポリペプチド」又は「タンパク質」を形成し、本明細書において両用語は互換可能に使用される。本発明により組として提供されるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。したがって、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド鎖は、第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と「会合」して二量体ポリペプチドを形成する。第１のＣＨ３ドメインと第２のＣＨ３ドメインはノブ・イントゥー・ホール技術によるアミノ酸置換を含むため、２つのポリペプチド鎖は「ヘテロ二量体」、即ち２つの同一でないポリペプチドにより形成された二量体を形成する。
ヘテロ二量体ポリペプチド、即ちヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及びヘテロ二量体生成物ポリペプチドに含まれるポリペプチド鎖は、１つ又は２つのポリペプチドドメインを含む。本明細書においてポリペプチドドメインの順序が示されるとき、それはＮ末端からＣ末端の方向に示される。
各ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。
２つのヘテロ二量体前駆体ポリペプチド中に存在する抗原結合部分が抗体由来の抗原結合部位、例えば抗体断片である場合、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を本明細書では「重鎖ポリペプチド」とも呼ぶ。この場合、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、典型的には抗体可変ドメイン及び抗体定常ドメイン、例えばＶＬ及びＣＬを含む「軽鎖ポリペプチド」も含んでよい。
本発明は、少なくとも２つのポリペプチドを含む組を提供する。この組は、少なくとも２つのヘテロ二量体「前駆体」ポリペプチドを含む。前駆体ポリペプチドを反応させて互いによるポリペプチド鎖の交換を受けさせると、「生成物」ポリペプチドが形成される。本発明は、少なくとも２つのヘテロ二量体前駆体ポリペプチドを接触させることにより、ヘテロ二量体ポリペプチド、即ちヘテロ二量体生成物ポリペプチドを生成するための方法も提供する。接触させる工程は、ポリペプチド鎖の交換を、好ましくは適切な緩衝液中で、可能にする任意の適切な方法で実行することができる。本明細書で本発明に関連して言及するとき、「ポリペプチド鎖の交換」は、２つのヘテロ二量体（前駆体）ポリペプチド間にＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖の交換を意味する。ポリペプチド鎖の交換は、前駆体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む、最初に会合した２つのポリペプチド鎖が解離し、解離したポリペプチド鎖のうちの少なくとも１つが、別の前駆体ポリペプチドに由来するＣＨ３ドメインを含む、等しく解離したポリペプチド鎖との会合により新しいヘテロ二量体を形成するとき、生じる。ポリペプチド鎖の交換の機序は図１及び２にも示す。
「単離された」ヘテロ二量体ポリペプチド、例えば抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフ（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超又は９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照。
本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されるカバット番号付けシステムに従って番号付けされる。特に、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬについて及び可変ドメインについては、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のカバット番号付けシステム（６４７－６６０ページ参照）が使用されており、定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）についてはＫａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１－７２３ページ参照）が使用されている。本明細書で提供されるアミノ酸位置は、通常、により示される。
ポリペプチド鎖内のアミノ酸の「置換」又は「置き換え」又は「変異」（すべての用語は本明細書で交換可能に使用される）は、適切なヌクレオチドの変更を抗体ＤＮＡに導入することにより、又はヌクレオチド合成により、調製される。しかしながら、このような修飾は、極めて限定された範囲でのみ実施することができる。例えば、修飾は、ＩｇＧアイソタイプや抗原結合等の上記の抗体特性を変更しないが、組み換え生成の収率、タンパク質の安定性をさらに改善するか、又は精製を容易にする可能性がある。一部の実施形態では、１つ以上の保存されたアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。本明細書で言及される「二重変異」は、示されるアミノ酸置換の両方がそれぞれのポリペプチド鎖中に存在することを意味する。
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、カルボキシル基のα位に位置するアミノ部分を保有する有機分子を意味する。アミノ酸の例には、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンが含まれる。使用されるアミノ酸は、任意選択的に、それぞれの場合に、Ｌ形態である。「正に帯電した」又は「負に帯電した」アミノ酸という用語は、ｐＨ７．４でのアミノ酸側鎖電荷を指す。アミノ酸は、一般的な側鎖特性：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性、即ち負に帯電：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性、即ち正に帯電：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
に従ってグループ化されうる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性、即ち負に帯電：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性、即ち正に帯電：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
に従ってグループ化されうる。
（表）特定の特性を有するアミノ酸
本明細書で使用される「タグ付け部分」は、様々な目的のために、例えば精製をサポートするために、ポリペプチド鎖上に遺伝的に移植されたペプチド配列である。一実施形態において、タグ付け部分は親和性タグである。したがって、前記親和性タグを含むポリペプチドは、適切な親和性技術により、例えばアフィニティークロマトグラフィーにより精製されうる。典型的には、タグ付け部分は、ペプチドコネクターを介してＣＨ３ドメインのＣ末端に融合される。典型的には、ペプチドコネクターは、グリシン及びセリンのような柔軟性のアミノ酸残基から構成される。したがって、タグ付け部分のポリペプチドへの融合に使用される典型的なペプチドコネクターは、グリシン－セリンリンカー、即ちグリシン及びセリン残基のパターンからなるペプチドコネクターである。
本明細書で使用される用語「精製された」は、それらの自然環境から若しくは組み換え生成源から除去されたか、又はそうでない場合には単離若しくは分離され、少なくとも６０％、例えば、少なくとも８０％、それらが自然に会合する他の成分、例えば膜及びミクロソームを含まないポリペプチドを指す。抗体の精製（宿主細胞培養部からの抗体の回収）は、細胞成分又は他の夾雑物、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を排除するために、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野で周知の他の技術を含む標準的な技術により実施される。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ． Ｃｕｒｒｅｎｔ プロトコール＿ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）参照。タンパク質精製のために種々の方法が確立されて広く使用されており、それらは例えば、微生物タンパクを用いた（例えばカッパ又はラムダアイソタイプ定常軽鎖ドメインの精製のための親和性培地、例えばＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ又はＬａｍｂｄａＳｅｌｅｃｔを用いた）アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（例えば陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、イオン交換（アミノエチル樹脂）及び混合モード交換）、チオフィリック吸着（例えばベータ－メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドを用いた）、疎水性相互作用又は芳香性吸着クロマトグラフィー（例えばフェニル－セファロース、アザ－アレノフィリック樹脂、又はｍ－アミノフェニルボロン酸を用いた）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えばＮｉ（ＩＩ）－及びＣｕ（ＩＩ）－親和性材料を用いた）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動的方法（例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）である（Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ，Ｍ．Ａ．，Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ７５（１９９８）９３－１０２）。
タグ付け部分を含むポリペプチドは、「タグ特異的アフィニティークロマトグラフィー」により精製することができる。タグの適切な精製方法は当技術分野において既知である。したがって、ポリ（ｈｉｓ）タグを含むポリペプチドは、例えば金属キレートアフィニティークロマトグラフィー、特にニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
本明細書で使用される用語「ペプチドコネクター」は、好ましくは合成起源の、アミノ酸配列を有するペプチドを意味する。本発明のために使用されるヘテロ二量体ポリペプチド内では、ペプチドコネクターが、抗体断片のような追加のポリペプチドドメインを個々のポリペプチド鎖のＣ末端又はＮ末端に融合させるために使用されうる。一実施形態において、前記ペプチドコネクターは、少なくとも５アミノ酸の長さ、別の実施形態では５～１００アミノ酸の長さ、また別の実施形態では１０～５０アミノ酸の長さのアミノ酸配列を有するペプチドである。一実施形態において、ペプチドコネクターはグリシン－セリンリンカーである。一実施形態において、ペプチドコネクターは、グリシン及びセリンアミノ酸残基からなるペプチドである。一実施形態において、前記ペプチドコネクターは、
（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ
［式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリンであり、且つ
ｘ＝３、ｎ＝３、４、５若しくは６、ｍ＝０、１、２若しくは３であるか；又は
ｘ＝４、ｎ＝２、３、４若しくは５、ｍ＝０、１、２若しくは３］
である。
（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ
［式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリンであり、且つ
ｘ＝３、ｎ＝３、４、５若しくは６、ｍ＝０、１、２若しくは３であるか；又は
ｘ＝４、ｎ＝２、３、４若しくは５、ｍ＝０、１、２若しくは３］
である。
一実施形態において、ｘ＝４であり、ｎ＝２又は３であり、別の実施形態ではｘ＝４であり、ｎ＝２である。一実施形態において、前記ペプチドコネクターは（Ｇ４Ｓ）２である。
「価」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合分子内の特定数の結合部位の存在を示す。自然抗体は、例えば２つの結合部位を有し、２価である。したがって、用語「３価」は、抗原結合分子内の３つの結合部位の存在を示す。
本発明によるポリペプチドは、組み換え手段により生成される。ポリペプチド、例えば抗体の組み換え生成のための方法は、当技術分野において広く知られており、原核宿主細胞及び真核宿主細胞におけるタンパク質発現と、それに続くポリペプチドの単離、及び通常は薬学的に許容される純度への精製を含む。宿主細胞における前述のようなタンパク質の発現のために、それぞれのポリペプチド鎖をコードする核酸が、標準的な方法によって発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、大腸菌細胞等の適切な原核宿主細胞又は真核宿主細胞で実施され、ポリペプチドは細胞（上清又は溶解後の細胞）から回収される。ポリペプチド、例えば抗体の組み換え生成のための一般的な方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． １７（１９９９）１８３－２０２；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ８（１９９６）２７１－２８２；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６（２０００）１５１－１６１；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． ４８（１９９８）８７０－８８０の概説に記載されている。
宿主細胞によって生成されるポリペプチドは、Ｃ末端にＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖のＣ末端から１つ以上の、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、このようなポリペプチド鎖をコードする特異的核酸分子の発現により、宿主細胞によって生成されるポリペプチドは、全長ＣＨ３ドメインを含む全長ポリペプチド鎖を含みうるか、又は全長ポリペプチド鎖の切断されたバリアント（本明細書では切断されたバリアントポリペプチド鎖とも呼ぶ）を含みうる。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７）である場合にも当てはまる。
本明細書で互換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは塩基、及び／若しくはそれらの類似体であっても、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによって若しくは合成反応によってポリマーに組み込むことのできる任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体等の修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識へのコンジュゲーションといった、合成後に行われる修飾（複数可）を含んでもよい。他の種類の修飾としては、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上のアナログとの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合を有するもの（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバミン酸塩等）及び荷電結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、ペンダント部分、例えば、タンパク質等を含有するもの（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ－Ｌ－リジン等）、インターカレータを有するもの（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレート剤を含有するもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）、アルキル化剤を含有するもの、修飾結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸等）、並びにポリヌクレオチド（複数可）の非修飾形態が挙げられる。さらに、糖内に通常存在するヒドロキシル基のいずれかを、例えば、ホスホネート基、リン酸基により置き換えるか、標準的な保護基により保護するか、若しくは活性化して追加のヌクレオチドへの追加の結合を準備してもよく、又は固体若しくは半固体支持体にコンジュゲートしてもよい。５’及び３’末端ＯＨは、リン酸化することができるか、又はアミン若しくは１～２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルを、標準的な保護基に誘導体化してもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、２’－Ｏ－メチル－、２’－Ｏ－アリル、２’－フルオロ－、又は２’－アジド－リボース、炭素環糖アナログ、α－アノマ－糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、又はリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、及び塩基性ヌクレオシドアナログ、例えば、メチルリボシドを含む、当技術分野で一般的に知られているリボース糖又はデオキシリボース糖の類似形態も含みうる。１つ以上のホスホジエステル結合は、代替的な連結基によって置き換えられてもよい。これらの代替的な結合基には、限定されないが、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（「ホルムアセタール」）により置き換えられる実施形態が含まれ、各Ｒ又はＲ’は、独立してＨであるか、又は置換若しくは非置換アルキル（１～２０個のＣ）（任意にエーテル（－Ｏ－）結合を含む）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、又はアラルジルである。ポリヌクレオチドにおける結合のすべてが同一である必要はない。前述の記載は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外に存在するか、又は自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「ヘテロ二量体ポリペプチドをコードする単離された核酸」は、前記ヘテロ二量体ポリペプチドの１つ以上のポリペプチド鎖（又はその断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、これには単一のベクター又は分離したベクター内のそのような核酸分子（複数可）、及び宿主細胞内の１つ以上の位置に存在するそのような核酸分子（複数可）が含まれる。
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、結合している別の核酸を増殖させることのできる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。この用語は、主にＤＮＡ若しくはＲＮＡの細胞中への挿入（例えば、染色体組み込み）のために機能するベクター、主にＤＮＡ若しくはＲＮＡの複製のために機能するベクターの複製、及びＤＮＡ若しくはＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含む。さらには、記載される機能のうちの複数を提供するベクターが含まれる。
「発現ベクター」は、核酸の発現を、それらが共有結合するものに向けることのできるベクターである。発現ベクターは、適切な宿主細胞中に導入されると、ポリペプチドへと転写及び翻訳されうる。本発明による方法において宿主細胞を形質転換するとき、「発現ベクター」が使用される；それにより、本明細書に記載の宿主細胞の形質転換との関連での用語「ベクター」は、「発現ベクター」を意味する。「発現系」は通常、所望の発現生成物を生むように機能することのできる発現ベクターから構成される適切な宿主細胞を指す。
本明細書で使用される「発現」は、核酸をｍＲＮＡに転写する過程及び／又は転写されたｍＲＮＡ（転写物とも呼ばれる）をその後ペプチド又はポリペプチドに翻訳する過程を指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、個々に又は集約的に遺伝子産物と呼ぶ。核酸がゲノムＤＮＡから得られる場合、真核細胞中の発現は、対応するｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
本明細書で使用される用語「形質転換」は、ベクター又は核酸の宿主細胞中への移行の過程を指す。堅い細胞壁のバリアを有さない細胞が宿主細胞として使用される場合、例えばＧｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｈ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７８）５４６ｆｆにより記載されたリン酸カルシウム沈殿方法により、トランスフェクションが実行される。しかしながら、ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法、例えば核注入により、又はプロトプラスト融合による方法も使用されてよい。原核細胞又は実質的な細胞壁構成を含む細胞が使用される場合、例えばトランスフェクションの１つの方法は、Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｎ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ６９（１９７２）７１１０ ｅｔ ｓｅｑ．により記載された、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。
本出願で使用される用語「宿主細胞」は、本発明により提供されるポリペプチドを生成するように操作することのできる任意の種類の細胞系を意味する。
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という表現は、交換可能に使用され、すべてのこのような表記は子孫を含む。このため、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、移行の数にかかわらず初代対象細胞及びそれ由来の培養物を含む。また、すべての子孫は、意図的な又は想定外の変異に起因して、ＤＮＡ含量において厳密に同一でない場合があることが理解される。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物活性を有するバリアントの子孫が含まれる。別個の指定が意図される場合には、それは文脈から明確となるであろう。
一過性発現は、例えばＤｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ３０（２００２）Ｅ９に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６（１９８９）３８３３－３８３７；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９（１９９２）４２８５－４２８９；ａｎｄ Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４（１９９７）７７－８７に記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．－Ｊ．，ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｋ．，ｉｎ Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（１９９９）７１－８３に、及びＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．－Ｊ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４（１９９６）１９１－１９９により記載されている。
用語「薬学的組成物」は、その中に含まれる有効成分の生物活性を有効にする形態であり、組成物を投与する対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。本発明の薬学的組成物は、当技術分野において既知の多様な方法により投与することができる。当業者に理解されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果によって変わるであろう。特定の投与経路により本発明によるに抗体を投与するために、その不活性化を防止する材料で抗体を被覆するか、又はそのような材料と一緒に抗体を共投与することが必要となりうる。例えば、ヘテロ二量体ポリペプチドは、対象に対し、適切な担体、例えば、リポソーム又は希釈剤中において投与されうる。薬学的に許容される希釈剤には、食塩水及び緩衝水溶液が含まれる。
薬学的組成物は、本発明により提供されるヘテロ二量体ポリペプチドの有効量を含む。薬剤、例えば、ヘテロ二量体ポリペプチドの「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び所要期間で有効な量を指す。特に、「有効量」は、対象に投与されたとき、本明細書に記載の（ｉ）特定の疾患、状態又は障害を治療又は予防する、（ｉｉ）特定の疾患、状態又は障害の１つ以上の症候を軽減、改善又は排除する、又は（ｉｉｉ）特定の疾患、状態又は障害の１つ以上の症候の発症を予防する又は遅らせる、本発明のヘテロ二量体ポリペプチドの量を意味する。治療的有効量は、使用されるヘテロ二量体ポリペプチド分子、治療される病状、治療される重症度又は疾患、対象の年齢及び相対的健康度、投与の経路及び形態、担当の医師又は獣医師の判断、及び他の要因に応じて変化するだろう。
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合する、あらゆるすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。好ましい一実施形態では、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば注射又は点滴による）に適している。
本発明による薬学的組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤といったアジュバントも含みうる。上記の滅菌化手順によって、及び種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の含有の両方によって、微生物の存在が確実に予防されうる。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を組成物に含めることも望ましい場合がある。加えて、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンといった吸収を遅延させる薬剤を含めることによって、注射用医薬形態の長期吸収をもたらすことができる。
本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口投与された」という表現は、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、限定しないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内への注射及び点滴を含む。
選択された投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用されうる本発明の化合物、及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られている一般的な方法により薬学的に許容される剤形に製剤化される。
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の投薬レベルは、患者に対して毒性でなく、特定の患者、組成物、及び投与様式に関して所望の治療的応答を達成するために効果的な有効成分の量を得るために、多様であってよい。選択される投薬レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄の速度、治療継続期間、用いられる特定の組成物との組み合わせで使用される他の薬物、化合物及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態及び既往歴、並びに医学分野において周知の同様の因子を含む種々の薬物動態因子に依存するであろう。
組成物は、滅菌されなければならず、且つ組成物がシリンジにより送達可能である程度に流動的でなければならない。水に加えて、一実施形態では、担体は等張緩衝生理食塩水である。
適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散体の場合には必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール又はソルビトールといった多価アルコール、及び塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。
本明細書で使用する「治療／処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変形語、例えば、「治療／処置する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療／処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、治療／処置される個体の本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に実施することができる。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発の予防、症候の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移の予防、疾患進行速度の低下、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改善された予後が挙げられるが、これらに限られない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。一部の実施形態では、個体又は対象は、ヒトである。
２．本発明の実施形態の詳細な記載
本発明は、例えばポリペプチド鎖の交換による生成物ポリペプチドのインビボ生成のために適用可能な、前駆体ポリペプチドを提供する。１つの用途は、新規に形成されるＶＨドメインとＶＬドメインの対が会合することによる、抗原結合部位の細胞上生成である。
本発明は、例えばポリペプチド鎖の交換による生成物ポリペプチドのインビボ生成のために適用可能な、前駆体ポリペプチドを提供する。１つの用途は、新規に形成されるＶＨドメインとＶＬドメインの対が会合することによる、抗原結合部位の細胞上生成である。
各前駆体ポリペプチドは一対のＣＨ３ドメインを含み、このドメイン対は、前記ＣＨ３ドメインを介して互いに会合している２つの個別のポリペプチド鎖に配置されている。前記ＣＨ３ドメインは、複数のアミノ酸置換を含む。このために、前駆体ポリペプチド中にＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖はヘテロ二量体を形成する。本発明により提供される前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、異なる機能性を有する少なくとも２つのパターンの変異を含む。第１のパターンの変異は、ＣＨ３ドメインを含む前記２つのポリペプチド鎖のヘテロ二量体化、即ちノブ・イントゥー・ホール変異をサポートする変異である。したがって、前駆体ポリペプチドの一方のＣＨ３ドメインはノブ変異を有し、前駆体ポリペプチドの他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含む。第２のパターンの変異は、前駆体ポリペプチドのヘテロ二量体に含まれるＣＨ３ドメインの一方にのみ提供される１つ以上の変異であり、前記変異はＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチドの相互作用を不安定にする。したがって、各前駆体ポリペプチドは、前駆体ポリペプチド間におけるポリペプチド鎖の交換の際に生成物ポリペプチドの正確な組み立てをサポートするように選択及び配置される、不安定化変異を有する１つのＣＨ３ドメインを含む。
各前駆体ポリペプチドは、それぞれの前駆体ポリペプチドにおいて、別の抗体に由来する対応する可変ドメインと会合し、その結果非機能的抗原結合部位を形成する１つの抗体可変ドメインを含む。標的抗原、例えばＣＤ３に特異的に結合する抗体に由来する抗体可変ドメインは、ポリペプチド鎖の交換及び２つの異なるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドからのポリペプチド鎖の組み立ての際に、標的抗原、例えばＣＤ３に特異的に結合する新しい抗原結合部位が、結果として得られる生成物ポリペプチド内に形成されるように、配置される。
前駆体ポリペプチド
一態様において、本発明は、
ａ）ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第１の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと、
ｂ）ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが第２の抗原結合部分を含み、第２の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと
を含む、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組を提供し、
ここで、
Ａ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含むか、又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含み；
Ｂ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合するか；又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合し、
Ｃ）
ｉ）ノブ変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びホール変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、又は
ｉｉ）ホール変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びノブ変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン
は、番号付けがカバット番号付けシステムによる以下のアミノ酸置換を含んでいる：
－ ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、
・正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び
・疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
－ ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに
・疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
一態様において、本発明は、
ａ）ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第１の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと、
ｂ）ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが第２の抗原結合部分を含み、第２の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと
を含む、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組を提供し、
ここで、
Ａ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含むか、又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含み；
Ｂ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合するか；又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合し、
Ｃ）
ｉ）ノブ変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びホール変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、又は
ｉｉ）ホール変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びノブ変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン
は、番号付けがカバット番号付けシステムによる以下のアミノ酸置換を含んでいる：
－ ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、
・正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び
・疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
－ ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに
・疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
別の態様では、本発明は、ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドを提供し、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖は、ＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成し、ＣＨ３ドメインの一方はノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含み、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第１の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分の少なくとも一部はＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されており；ＣＨ３ドメインの一方は、番号付けがカバット番号付けシステムによる以下のアミノ酸置換（即ち不安定化変異）を含む（他方のＣＨ３ドメインは含まない）：
－ ホール変異を有するＣＨ３ドメインが、正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換えの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、即ち不安定化変異を含むか；又は
－ ノブ変異を有するＣＨ３ドメインが、負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換えの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、即ち不安定化変異を含む。
－ ホール変異を有するＣＨ３ドメインが、正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換えの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、即ち不安定化変異を含むか；又は
－ ノブ変異を有するＣＨ３ドメインが、負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換えの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、即ち不安定化変異を含む。
別の態様では、本発明は、ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドを提供し、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖は、ＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成し、ＣＨ３ドメインの一方はノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含み、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第２の抗原結合部分を含み、第２の抗原結合部分の少なくとも一部はＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されており；ＣＨ３ドメインの一方は、番号付けがカバット番号付けシステムによる以下のアミノ酸置換（即ち不安定化変異）を含む（他方のＣＨ３ドメインは含まない）：
－ ホール変異を有するＣＨ３ドメインが、正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換えの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、即ち不安定化変異を含むか；又は
－ ノブ変異を有するＣＨ３ドメインが、負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換えの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、即ち不安定化変異を含む。
－ ホール変異を有するＣＨ３ドメインが、正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換えの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、即ち不安定化変異を含むか；又は
－ ノブ変異を有するＣＨ３ドメインが、負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換えの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、即ち不安定化変異を含む。
また別の態様では、本発明は、ヘテロ二量体生成物ポリペプチドの形成のための、本発明による第２のヘテロ二量体ポリペプチドとの組み合わせでの、本発明による第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの使用を提供する。一実施形態において、本発明による第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、本発明による第２のヘテロ二量体ポリペプチドとの組み合わせで、ポリペプチド鎖の交換によるヘテロ二量体生成物ポリペプチドの形成のために使用される。
また別の態様では、本発明は、ヘテロ二量体生成物ポリペプチドの形成のための、本発明による第１のヘテロ二量体ポリペプチドとの組み合わせでの、本発明による第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの使用を提供する。一実施形態において本発明による第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、本発明による第１のヘテロ二量体ポリペプチドとの組み合わせで、ポリペプチド鎖の交換によるヘテロ二量体生成物ポリペプチドの形成のために使用される。
本発明の別の態様では、本発明によるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組においての本発明による第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの使用が提供される。本発明の別の態様では、本発明によるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組においての本発明による第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの使用が提供される。
本発明の別の態様は、本発明によるヘテロ二量体ポリペプチドを生成するための方法における、本発明による第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの使用である。本発明の別の態様は、本発明によるヘテロ二量体ポリペプチドを生成するための方法における、本発明による第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの使用である。
本発明の別の態様は、本発明によるヘテロ二量体ポリペプチドを生成するための方法における、本発明によるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組の使用である。本発明の別の態様は、本発明による多重特異性ヘテロ二量体ポリペプチドを同定するための方法における、本発明によるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組の使用である。
一実施形態において、以下は第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドに当てはまる：
－ ノブ変異を有するＣＨ３ドメインが不安定化変異Ｅ３５７Ｋを含む場合、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは不安定化変異Ｋ３７０Ｅを含まない。
－ ノブ変異を有するＣＨ３ドメインが不安定化変異Ｅ３５７Ｋを含む場合、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは不安定化変異Ｋ３７０Ｅを含まない。
換言すれば、以下は、本発明により提供される前駆体ポリペプチドのための本発明の一実施形態に従って適用される：
－ ノブ変異を有するＣＨ３ドメインが不安定化変異としてのアミノ酸置換Ｅ３５７Ｋを含む場合、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは位置３７０にＫを含む。
－ ノブ変異を有するＣＨ３ドメインが不安定化変異としてのアミノ酸置換Ｅ３５７Ｋを含む場合、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは位置３７０にＫを含む。
一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含む、少なくとも２つの（一実施形態においては厳密に２つの）ポリペプチド鎖を含み；ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方は、抗原に特異的に結合する（第１の）抗原結合部分の少なくとも一部を含み；ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の他方は、抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含まない。一実施形態において、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含む、少なくとも２つの（一実施形態においては厳密に２つの）ポリペプチド鎖を含み、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方は、抗原に特異的に結合する（第１の）抗原結合部分の少なくとも一部を含み；且つ他方のＣＨ３ドメインにおけるを含む２つのポリペプチド鎖の他方は、抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含まない。一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含む、少なくとも２つの（一実施形態においては厳密に２つの）ポリペプチド鎖を含み、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方は、抗原に特異的に結合する（第１の）抗原結合部分の少なくとも一部を含み；且つＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の他方は、抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含まず；第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含む、少なくとも２つの（一実施形態においては厳密に２つの）ポリペプチド鎖を含み、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方は、抗原に特異的に結合する（第１の）抗原結合部分の少なくとも一部を含み；且つＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の他方は、抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含まない。換言すれば、本発明のこの実施形態により、１つ以上の機能性抗原結合部分は、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方にのみ配置され、ＣＨ３ドメインを含む他方のポリペプチド鎖には、機能性抗原結合部分は配置されない。本明細書では、このポリペプチド鎖は「ダミーポリペプチド」とも呼ぶ。一実施形態において、ダミーポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含む他方のポリペプチド鎖とのみ、即ちヘテロ二量体中で会合し、別の（例えば第３の）ポリペプチド鎖とは会合しない。ダミーポリペプチドは、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内で機能性抗原結合部位に関与しない、抗原結合部分の部分、例えば抗体可変ドメインを含んでもよい。１つ以上の機能性抗原結合部位の形成に関与する、このような構成、例えばＣＨ３ドメインを含むダミーポリペプチドと、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖との組み合わせの１つの利点は、ポリペプチド鎖の交換時に形成される生成物ポリペプチドが、ヘテロ二量体前駆体分子とは大きさが異なり、それにより未反応の前駆体ポリペプチドからの生成物ポリペプチド（複数可）の改善が可能になることである。
示されるように、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの各々において、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖の一方はノブ変異を有するＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ３ドメインを含む他方のポリペプチド鎖はホール変異を有するＣＨ３ドメインを含む。ポリペプチド鎖の交換の際に、第１の前駆体ポリペプチドからのノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は、第２の前駆体ポリペプチドからのホールを有するＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖とヘテロ二量体（即ち第１のヘテロ二量体生成物ポリペプチド）を形成し、第１の前駆体ポリペプチドからのホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は、第２の前駆体ポリペプチドからのノブを有するＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖とヘテロ二量体（即ち第２のヘテロ二量体生成物ポリペプチド）を形成する。
示されるように、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドに含まれる一方のＣＨ３ドメインは、上述のような１つ以上の不安定化変異を含み、前記第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドに含まれる他方のＣＨ３ドメインは、不安定化変異を含まず；第２のヘテロ二量体ポリペプチドに含まれる一方のＣＨ３ドメインは、上述のような１つ以上の不安定化変異を含み、前記第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドに含まれる他方のＣＨ３ドメインは、不安定化変異を含まない。前駆体ポリペプチド中に存在する不安定化変異は、ポリペプチド鎖の交換後に同じ生成物ポリペプチド内に存在するように配置される。したがって、前駆体ポリペプチドの一方において、１つ以上の不安定化変異が、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインに配置されており、他方の前駆体ポリペプチドにおいて、１つ以上の不安定化変異が、ホール変異を含むＣＨ３ドメインに配置されている。
一実施形態では、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖が、第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖が、第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含む。
一実施形態では、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖が、第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖が、第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含む。
一実施形態では、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含む、厳密に２つのポリペプチド鎖を含む。
一実施形態では、不安定化変異を含むＣＨ３ドメインは、１つ、２つ又は３つの不安定化変異を含む。一実施形態では、不安定化変異を含むＣＨ３ドメインは、１つ又は２つの不安定化変異を含む。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体ポリペプチドの、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖間に鎖間ジスルフィド結合は形成されない。本発明の一実施形態において、第２のヘテロ二量体ポリペプチドの、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖間に鎖間ジスルフィド結合は形成されない。本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体ポリペプチドと第２のヘテロ二量体ポリペプチドの、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖間に鎖間ジスルフィド結合は形成されない。ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖間に鎖間ジスルフィド結合を欠くヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、還元剤の非存在下でポリペプチド鎖の交換を受けることができる。したがって、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖間に鎖間ジスルフィド結合が存在しないヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、還元剤の存在が不可能であるか又は望ましくない用途；例えば治療法における用途に特に適している。
Ａ）ＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸置換
本発明により提供される前駆体ポリペプチドは、それらのＣＨ３ドメインにアミノ酸置換を含む。
本発明により提供される前駆体ポリペプチドは、それらのＣＨ３ドメインにアミノ酸置換を含む。
ノブ・イントゥー・ホール変異
一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドに含まれるノブ変異は、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドに含まれるノブ変異と同一である。
一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドに含まれるノブ変異は、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドに含まれるノブ変異と同一である。
一実施形態では、ノブ変異はＴ３６６Ｗである。一実施形態では、ホール変異はＴ３６６Ｓ Ｌ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖである。
不安定化変異
上記に示したように、各前駆体ポリペプチドの一方のＣＨ３ドメインのみが１つ以上の不安定化変異を含む。
上記に示したように、各前駆体ポリペプチドの一方のＣＨ３ドメインのみが１つ以上の不安定化変異を含む。
本発明によれば、ｉ）ノブ変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインと、ホール変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、又はｉｉ）ホール変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインと、ノブ変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、１つ以上の不安定化変異を含む。第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内の１つ以上の不安定化変異は、前駆体ポリペプチド間のポリペプチド鎖の交換により形成された生成物ポリペプチドのＣＨ３／ＣＨ３接触面において、それらが相互作用するように選択される。
ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインが不安定化変異を含む場合、前記ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインは不安定化変異を含まない。ＣＨ３ドメインは、それが「不安定化変異を含まない」とき、同じクラスの野生型免疫グロブリンのＣＨ３ドメインにおいて、対応するＣＨ３ドメインに含まれる不安定化変異の位置にあるアミノ酸残基と相互作用する位置に、野生型アミノ酸残基を含む。
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換えの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、即ち不安定化変異を含み；ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、不安定化変異を含まないか、又は負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換えの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、即ち不安定化変異を含む。
一実施形態において、疎水性アミノ酸は、ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＰｈｅから選択される。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｙｒから選択される。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＩｌｅである。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｌｅｕ又はＩｌｅである。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｌｅｕである。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｔｙｒである。一実施形態において、疎水性アミノ酸は、Ｐｈｅである。
一実施形態において、正に帯電したアミノ酸は、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｒｇである。一実施形態において、正に帯電したアミノ酸は、Ｌｙｓ又はＡｒｇである。一実施形態において、正に帯電したアミノ酸は、Ｌｙｓである。
一実施形態において、負に帯電したアミノ酸は、Ａｓｐ又はＧｌｕである。一実施形態において、負に帯電したアミノ酸は、Ａｓｐである。一実施形態において、負に帯電したアミノ酸は、Ｇｌｕである。
ＣＨ３ドメイン内に示されたアミノ酸位置にそれぞれの側鎖特性を有するアミノ酸でのアミノ酸置換は、２つの前駆体ポリペプチドからの生成物ポリペプチド形成とポリペプチド鎖の交換とをサポートすることが分かった。
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｓ３６４Ｌ、Ｓ３６４Ｉ、Ｖ４０７Ｙ、Ｖ４０７Ｆ及びＡ３６８Ｆの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み；ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、不安定化変異を含まないか、又はＫ３７０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｖ３９７Ｙ、並びに二重変異Ｋ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｅ、Ｋ３７０Ｄ Ｋ４３９Ｅ、Ｋ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｄ、及びＫ３７０Ｄ Ｋ４３９Ｄの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｋ、Ｓ３６４Ｌ、Ｖ４０７Ｙ及びＡ３６８Ｆの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み；ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｖ３９７Ｙ、及び二重変異Ｋ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｅの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｓ３６４Ｌ、Ｓ３６４Ｉ、Ｖ４０７Ｙ、及びＶ４０７Ｆの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み；ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｖ３９７Ｙ、並びに二重変異Ｋ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｅ、Ｋ３７０Ｄ Ｋ４３９Ｅ、Ｋ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｄ、及びＫ３７０Ｄ Ｋ４３９Ｄの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
本発明の一実施形態において、ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｅ３５７Ｋ、Ｓ３６４Ｌ、及びＶ４０７Ｙの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み；ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｖ３９７Ｙ、及び二重変異Ｋ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｅの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
本発明の一実施形態において、不安定化変異を含む、ホール変異を有するＣＨ３ドメイン及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、以下の表に示される群から選択されるアミノ酸置換のうちの１つを含む：
明瞭性のために、この表は、ホール変異を含むＣＨ３ドメインが、上記の表の第１のカラムに示される不安定化変異を含み、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインが、同じ行に示される、上記表の右カラムに列挙される不安定化変異を含むと理解される。
本発明の一実施形態において、不安定化変異を含む、ホール変異を有するＣＨ３ドメイン及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、以下の表に示される群から選択されるアミノ酸置換のうちの１つを含む：
本発明の一実施形態において、不安定化変異を含む、ホール変異を有するＣＨ３ドメイン及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、以下の表に示される群から選択されるアミノ酸置換のうちの１つを含む：
明瞭性のために、この表は、ホール変異を含むＣＨ３ドメインが、上記の表の第１のカラムに示される不安定化変異を含み、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインが、同じ行に示される、上記表の右カラムに列挙される不安定化変異を含むと理解される。このような不安定化変異の組み合わせを有する前駆体分子は、特定の有益なポリペプチド鎖の交換を呈する。
本発明の一実施形態において、不安定化変異を含む、ホール変異を有するＣＨ３ドメイン及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、以下の表に示される群から選択されるアミノ酸置換のうちの１つを含む：
明瞭性のために、この表は、ホール変異を含むＣＨ３ドメインが、上記の表の第１のカラムに示される不安定化変異を含み、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインが、同じ行に示される、上記表の右カラムに列挙される不安定化変異を含むと理解される。不安定化変異のこのような組み合わせを有する前駆体分子は、特定の有益なポリペプチド鎖の交換を呈するとともに、高い収率で生成可能である。
システイン変異
本発明の一実施形態において、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、相互作用位置において、システイン置換を有する２つのＣＨ３ドメインの間に鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にするために、第３のパターンの変異、即ちシステインによるＣＨ３／ＣＨ３接触面内の別個のアミノ酸の置換を含む。
本発明の一実施形態において、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、相互作用位置において、システイン置換を有する２つのＣＨ３ドメインの間に鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にするために、第３のパターンの変異、即ちシステインによるＣＨ３／ＣＨ３接触面内の別個のアミノ酸の置換を含む。
したがって、本発明の一実施形態において、ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むか、又はｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含む。換言すれば、一実施形態では、ｉ）第１のヘテロ二量体ポリペプチド内で、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、ホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含まず、且つ第２のヘテロ二量体ポリペプチド内で、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含まず、ホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むか、又はｉｉ）第１のヘテロ二量体ポリペプチド内で、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含まず、ホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、且つ第２のヘテロ二量体ポリペプチド内で、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、ホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含まない。
一実施形態において、ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインが第１のシステイン変異を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインが第２のシステイン変異を含むか、又はｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインが第１のシステイン変異を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインが第２のシステイン変異を含み、第１及び第２のシステイン変異が以下の対から選択される：
一実施形態において、第１のシステイン変異はＹ３４９Ｃであり、第２のシステイン変異はＳ３５４Ｃである。
本発明の一実施形態において、ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｓ３５４Ｃを含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｙ３４９Ｃを含むか、又はｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｙ３４９Ｃを含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｓ３５４Ｃを含む。
本発明の一実施形態では、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内で、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｓ３５４Ｃを含み、ホール変異を含むＣＨ３ドメインが位置３４９にＹを含み；且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内で、ホール変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｙ３４９Ｃを含み、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインが位置３５４にＳを含む。
本発明の一実施形態では、ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｔ３６６Ｗ Ｓ３５４Ｃを含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｔ３６６Ｓ Ｌ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖ Ｙ３４９Ｃを含むか、又はｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｔ３６６Ｓ Ｌ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖ Ｙ３４９Ｃを含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｔ３６６Ｗ Ｓ３５４Ｃを含む。
本発明の一実施形態では、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内で、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｔ３６６Ｗ Ｓ３５４Ｃを含み、且つホール変異を含むＣＨ３ドメインが位置３４９におけるＹと、置換Ｔ３６６Ｓ Ｌ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖとを含み；第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内で、ホール変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｔ３６６Ｓ Ｌ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖ Ｙ３４９Ｃを含み、且つノブ変異を含むＣＨ３ドメインが位置３５４におけるＳと、置換Ｔ３６６Ｗとを含む。
本発明の一実施形態において、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、鎖間ジスルフィド結合を含まない。
Ｂ）抗原結合部分
本発明の一実施形態において、抗原結合部分は、抗原に特異的に結合するポリペプチドである。一実施形態において、抗原結合部分は、抗原に特異的に結合することのできる抗体、受容体、リガンド、及びＤＡＲＰｉｎｓの群から選択される。
本発明の一実施形態において、抗原結合部分は、抗原に特異的に結合するポリペプチドである。一実施形態において、抗原結合部分は、抗原に特異的に結合することのできる抗体、受容体、リガンド、及びＤＡＲＰｉｎｓの群から選択される。
本発明の一実施形態において、本発明による（前駆体）ポリペプチドに含まれる抗原結合部分は、抗体断片である。
本発明の一実施形態において、抗原結合部分は、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成するＶＨドメインとＶＬドメインの対を含む。
本発明の一実施形態において、本発明による（前駆体）ポリペプチドに含まれる抗体断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、及びｓｃＦａｂの群から選択される抗体断片である。一実施形態において、本発明による（前駆体）ポリペプチドに含まれる抗体断片は、Ｆｖ又はＦａｂである。
本発明の一実施形態において、抗原結合部分はＦａｂ断片である。
本発明の一実施形態において、第１の抗原結合部分は第１のＦａｂ断片であり、第２の抗原結合部分は第２のＦａｂ断片である。本発明の一実施形態において、第１のＦａｂ断片、第２のＦａｂ断片又はそれらの両方、第１及び第２のＦａｂ断片は、以下のようなドメインクロスオーバーにより変更される：
ａ）ＣＨ１とＣＬドメインのみが互いにより置き換えられるか；
ｂ）ＶＨとＶＬドメインのみが互いにより置き換えられるか；又は
ｃ）ＣＨ１とＣＬドメインが互いにより置き換えられ、ＶＨとＶＬドメインが互いにより置き換えられる。
ａ）ＣＨ１とＣＬドメインのみが互いにより置き換えられるか；
ｂ）ＶＨとＶＬドメインのみが互いにより置き換えられるか；又は
ｃ）ＣＨ１とＣＬドメインが互いにより置き換えられ、ＶＨとＶＬドメインが互いにより置き換えられる。
本発明の一実施形態において、抗原結合部分はＦｖ断片である。本発明の一実施形態において、第１の抗原結合部分は第１のＦｖ断片であり、第２の抗原結合部分は第２のＦｖ断片である。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの抗原結合部分と第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの抗原結合部分は同じ抗原に結合する。本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの抗原結合部分と第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの抗原結合部分は、同一の抗原結合部分である。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの抗原結合部分と第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの抗原結合部分は異なる抗原に結合する。この場合、２つのヘテロ二量体前駆体ポリペプチド間のポリペプチド鎖の交換の際、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドを起源とする抗原結合部分と第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドを起源とする抗原結合部分とを含む多重特異性生成物ポリペプチドが形成される。
さらなる抗原結合部分がヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内に存在してよく、これは、より高い原子価の生成物ポリペプチドを提供するために、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドに含まれるポリペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端に融合しうる。
このようなさらなる抗原結合部分は、適切なペプチドコネクターを介してポリペプチド鎖に融合する。一実施形態において、ペプチドコネクターはグリシンセリンリンカーである。
本発明の一実施形態において、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドでは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖の一方のみが、抗原結合部分の少なくとも一部を含む。本発明の一実施形態において、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドでは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位のＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖の一方。本発明の一実施形態において、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドでは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖の一方は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、抗体可変ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、このポリペプチド鎖は、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位の一部ではない。本発明の一実施形態において、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドでは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖の一方は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、抗体可変ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、このポリペプチド鎖は、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位の一部ではない。
Ｃ）前駆体ポリペプチドのドメイン構成
本発明による前駆体ポリペプチドは、様々なドメイン構成を有する様々なフォーマットの生成物ポリペプチドの生成に適している。ドメインの選択及びヘテロ二量体前駆体分子に提供される抗原結合部分の数に応じて、異なる抗原結合特性（例えば特異性、原子価）及び異なるエフェクター機能を有する生成物ポリペプチドが生成されうる。
本発明による前駆体ポリペプチドは、様々なドメイン構成を有する様々なフォーマットの生成物ポリペプチドの生成に適している。ドメインの選択及びヘテロ二量体前駆体分子に提供される抗原結合部分の数に応じて、異なる抗原結合特性（例えば特異性、原子価）及び異なるエフェクター機能を有する生成物ポリペプチドが生成されうる。
一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、厳密に２つの、ＣＨ３ドメインを有するポリペプチド鎖を含む。したがって、ＣＨ３ドメインを欠くさらなるポリペプチド鎖が第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドに含まれてよい。
抗体断片を含む前駆体ポリペプチド
本発明の一実施形態において、抗原結合部分は、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成するＶＨドメインとＶＬドメインの対を含み；
ａ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、
－ ＣＨ３ドメインと第１の抗体可変ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ ＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ 第２の抗体可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１及び第２の抗体可変ドメインが一緒に、標的抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、
－ ＣＨ３ドメインと第３の抗体可変ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ ＣＨ３ドメインを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ 第４の抗体可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第３及び第４の抗体可変ドメインが一緒に、標的抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含む。
本発明の一実施形態において、抗原結合部分は、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成するＶＨドメインとＶＬドメインの対を含み；
ａ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、
－ ＣＨ３ドメインと第１の抗体可変ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ ＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ 第２の抗体可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１及び第２の抗体可変ドメインが一緒に、標的抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、
－ ＣＨ３ドメインと第３の抗体可変ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ ＣＨ３ドメインを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ 第４の抗体可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第３及び第４の抗体可変ドメインが一緒に、標的抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含む。
ＣＨ２ドメインを含む前駆体ポリペプチド
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含むヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、Ｆｃ媒介エフェクター機能の媒介及び循環における長い半減期といった有利な特性を呈する。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含むヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、Ｆｃ媒介エフェクター機能の媒介及び循環における長い半減期といった有利な特性を呈する。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。
本発明の一実施形態では、ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ＶＬドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ＶＨドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合するか；又はｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ＶＨドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ＶＬドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合する。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドはＣＨ２ドメインを欠く。ＣＨ２ドメインを欠くヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、循環からの迅速なクリアランスといった有利な特性を呈する。
活性化できる抗原結合部位を含む前駆体ポリペプチド
本発明によれば、各前駆体ポリペプチドは、抗原結合部分の一部を含み、前記抗原結合部分は、前駆体ポリペプチド内で非機能性であり、前駆体ポリペプチド間のポリペプチド鎖の交換により形成された生成物ポリペプチド内で、抗原結合部分は機能性であり、標的抗原に特異的に結合する。このような前駆体ポリペプチドの例示的構造は、図１及び図２に示される。
本発明によれば、各前駆体ポリペプチドは、抗原結合部分の一部を含み、前記抗原結合部分は、前駆体ポリペプチド内で非機能性であり、前駆体ポリペプチド間のポリペプチド鎖の交換により形成された生成物ポリペプチド内で、抗原結合部分は機能性であり、標的抗原に特異的に結合する。このような前駆体ポリペプチドの例示的構造は、図１及び図２に示される。
本発明の一実施形態において、前記抗原結合部分は、一対の抗体可変ドメインを含む抗原結合部位である。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合する。一実施形態において、ＶＨドメインとＶＬドメインの対が特異的に結合する抗原はＣＤ３である。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合する。
本発明の一実施形態において、
ａ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインが互いに会合して標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる。
ａ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインが互いに会合して標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる。
一実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ３ドメインとを含み、第２の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ３ドメインとを含み、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方はノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含み；第３の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ３ドメインとを含み、第４の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ３ドメインとを含み、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドはＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方はノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含む。一実施形態において、第１、第２、第３及び第４の重鎖ポリペプチドに含まれるペプチドコネクターは同一である。
一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドでは、第１の重鎖ポリペプチドに含まれる第２の抗体可変ドメインは、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体に由来しており、第２の重鎖ポリペプチドに含まれる抗体可変ドメインは、第２の標的抗原に特異的に結合する。両方の可変ドメインは、互いに会合することができる。したがって、重鎖ポリペプチドの一方はＶＨドメインを含み、他方の重鎖ポリペプチドはＶＬドメインを含む。ＶＨドメインとＶＬドメインは、互いに会合することができる。しかしながら、非機能性抗原結合部位が形成される。したがって、本発明の文脈で用語「互いに会合することのできる可変ドメイン」は、ＶＨドメインとＶＬドメインの対が提供されることを意味する。この実施形態では、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内で、第３の重鎖ポリペプチドに含まれる第３の抗体可変ドメインは、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体に由来しており（即ち第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの第１の重鎖ポリペプチドに含まれる第２の可変ドメインと機能性ＶＨ／ＶＬ対を形成することができる）、第４の重鎖ポリペプチドに含まれる抗体可変ドメインは、別の、例えば第２の、標的抗原に特異的に結合する。第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドに含まれる可変ドメインは、互いに会合することができ、即ち可変ドメインの一方がＶＨドメインであり、可変ドメインの他方がＶＬドメインであり；第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドに含まれる可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができ、即ち両方の可変ドメインが、標的抗原に特異的に結合する同じ抗体に由来している。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、ＶＬドメインとＶＨドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる。
本発明の一実施形態において、
ａ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる。
ａ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる。
一実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含み、第２の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含み、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方はノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含み；第３の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含み、第４の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含み、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドはＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方はノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含む。一実施形態において、第１、第２、第３及び第４の重鎖ポリペプチドに含まれるペプチドコネクターは同一である。
ヒンジ領域を含む前駆体ポリペプチド
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域とＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域とＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ヒンジ領域に鎖間ジスルフィド結合を含まない。鎖間ジスルフィド結合を含まないヒンジ領域を有するヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、還元剤の非存在下でポリペプチド鎖の交換を受けることができる。したがって、鎖間ジスルフィド結合を含まないヒンジ領域を有するヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、還元剤の存在が不可能であるか又は望ましくない用途に特に適している。したがって、それらのヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、治療法において有利でありうる。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、鎖間ジスルフィドを形成しない天然ヒンジ領域を含む。一例は、ＩｇＧ４アイソタイプの抗体に由来するヒンジ領域ペプチドである。
鎖間ジスルフィド結合を含まないヒンジ領域の代わりに、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、抗原結合部分（の一部）と定常抗体ドメイン（即ちＣＨ２又はＣＨ３）を接続するペプチドコネクターを含んでもよい。本発明の一実施形態において、第１のペプチドコネクターと第２のペプチドコネクターの間に鎖間ジスルフィド結合は形成されない。本発明の一実施形態において、第１のペプチドコネクターと第２のペプチドコネクターは互いと同一である。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ペプチドコネクターとＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ペプチドコネクターと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、第１のペプチドコネクターと、抗体可変ドメインと、任意選択的にＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１のポリペプチド鎖、及び第１のペプチドコネクターと、第１のポリペプチド鎖からの抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、任意選択的にＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２のポリペプチド鎖を含み；第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、第１のペプチドコネクターと、抗体可変ドメインと、任意選択的にＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１のポリペプチド鎖、及び第１のペプチドコネクターと、第１のポリペプチド鎖からの抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、任意選択的にＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２のポリペプチド鎖を含む。
本発明の一実施形態において、ペプチドコネクターは、少なくとも１５個のアミノ酸のペプチドである。本発明の別の実施形態では、ペプチドコネクターは、１５～７０個のアミノ酸のペプチドである。本発明の別の実施形態では、ペプチドコネクターは、２０～５０個のアミノ酸のペプチドである。本発明の別の実施形態では、ペプチドコネクターは、１０～５０個のアミノ酸のペプチドである。例えば活性化できる結合部位が結合する抗原の種類によっては、より短い（又は場合によってはより長い）ペプチドコネクターも本発明によるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドに適用可能でありうる。
本発明のまた別の実施形態では、第１及び第２のペプチドコネクターは、概ね天然ヒンジ領域の長さ（ＩｇＧ１アイソタイプの自然抗体分子の場合約１５個のアミノ酸、ＩｇＧ３アイソタイプの場合約６２個のアミノ酸）である。したがって、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドがＩｇＧ１アイソタイプである一実施形態では、ペプチドコネクターは、１０～２０個のアミノ酸の、好ましい一実施形態では１２～１７個のアミノ酸の、ペプチドである。別の一実施形態では、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドがＩｇＧ３アイソタイプである一実施形態では、ペプチドコネクターは、５５～７０個のアミノ酸の、好ましい一実施形態では６０～６５個のアミノ酸の、ペプチドである。
本発明の一実施形態において、ペプチドコネクターはグリシン－セリンリンカーである。本発明の一実施形態において、ペプチドコネクターは、グリシン残基及びセリン残基からなるペプチドである。本発明の一実施形態において、グリシン－セリンリンカーは、構造
（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ
（式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、ｘ＝３又は４、ｎ＝２、３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３である）のものである。
（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ
（式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、ｘ＝３又は４、ｎ＝２、３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３である）のものである。
上記で定義されたグリシン－セリンリンカーの一実施形態において、ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３；又はｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、及びｍ＝０、１、２又は３である。好ましい一実施形態では、ｘ＝４、及びｎ＝２又は３、及び、ｍ＝０である。また別の好ましい実施形態では、ｘ＝４及びｎ＝２である。一実施形態において、前記ペプチドコネクターは（Ｇ４Ｓ）４又は（Ｇ４Ｓ）６である。
本発明の一実施形態では、ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ＶＬドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ＶＨドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合するか；又はｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ＶＨドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ＶＬドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合する。
本発明の一実施形態では、ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ＶＬドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ＶＨドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合するか；又はｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ＶＨドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ＶＬドメインと、ペプチドコネクターと、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合する。
Ｄ）抗体のアイソタイプ及び原子価
本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドは、１つ以上の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリンクラスには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプが含まれ、ＩｇＧ及びＩｇＡの場合はそれらのサブタイプが含まれる。本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドは、ＩｇＧ型抗体の定常ドメイン構造を有する。
本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドは、１つ以上の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリンクラスには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプが含まれ、ＩｇＧ及びＩｇＡの場合はそれらのサブタイプが含まれる。本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドは、ＩｇＧ型抗体の定常ドメイン構造を有する。
本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドに含まれるＣＨ３ドメインは、哺乳動物のＩｇＧクラスのものである。本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドに含まれるＣＨ３ドメインは、哺乳動物のＩｇＧ１サブクラスのものである。本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドに含まれるＣＨ３ドメインは、哺乳動物のＩｇＧ４サブクラスのものである。
本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドに含まれるＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧクラスのものである。本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドに含まれるＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドに含まれるＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。
一実施形態において、本発明による前駆体ポリペプチドの定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。一実施形態において、本発明による前駆体ポリペプチドの定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。一実施形態において、本発明による前駆体ポリペプチドの定常ドメインは、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。
一実施形態において、前駆体ポリペプチドはＣＨ４ドメインを欠いている。
本発明の一実施形態において、本発明による前駆体ポリペプチドの定常ドメインは、同じ免疫グロブリンサブクラスのものである。本発明の一実施形態において、本発明による前駆体ポリペプチドの可変ドメインと定常ドメインは、同じ免疫グロブリンサブクラスのものである。
本発明の一実施形態において、前駆体ポリペプチドは、単離された前駆体ポリペプチドである。本発明の一実施形態において、生成物ポリペプチドは、単離された生成物ポリペプチドである。
一実施形態において、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体前駆体ポリペプチド又はヘテロ二量体生成物ポリペプチドは、全長ＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメインを含み、１つ又は２つのＣ末端アミノ酸残基、即ちＧ４４６及び／又はＫ４４７は存在しない。
一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、単一特異性であり、第２の抗原結合部位の一部を含み；第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、単一特異性であり、第２の抗原結合部位の他の部分を含む。前記実施形態では、ヘテロ二量体生成物ポリペプチドは、二重特異性又は三重特異性である。
一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、単一特異性であり、第２の抗原結合部位の一部を含み；第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、単一特異性であり、第２の抗原結合部位の他の部分を含む。前記実施形態では、ヘテロ二量体生成物ポリペプチドは三重特異性である。
一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは二重特異性である。一実施形態において、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは単一特異性である。
一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは二重特異性である。一実施形態において、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは二重特異性である。
一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは１価である。一実施形態において、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは１価である。
一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは２価である。一実施形態において、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは２価である。
一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは３価である。一実施形態において、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは３価である。
一実施形態において、ヘテロ二量体生成物ポリペプチドは３価である。一実施形態において、ヘテロ二量体生成物ポリペプチドは４価である。
Ｅ）生成物ポリペプチドを生成する方法
一態様において、本発明は、ヘテロ二量体生成物ポリペプチドを生成する方法を提供し、この方法は、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖と、第２のヘテロ二量体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖とを含む第３のヘテロ二量体ポリペプチドを形成するために、本発明による第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドとを接触させることを含む。本発明の一実施形態において、方法は、第３のヘテロ二量体ポリペプチドを回収する工程を含む。
一態様において、本発明は、ヘテロ二量体生成物ポリペプチドを生成する方法を提供し、この方法は、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖と、第２のヘテロ二量体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖とを含む第３のヘテロ二量体ポリペプチドを形成するために、本発明による第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドとを接触させることを含む。本発明の一実施形態において、方法は、第３のヘテロ二量体ポリペプチドを回収する工程を含む。
一実施形態において、本発明による第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドとを接触させて、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖と、第２のヘテロ二量体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖とを含む第３のヘテロ二量体ポリペプチド、及び第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む他のポリペプチドと、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む他のポリペプチドとを含む第４のヘテロ二量体ポリペプチドを形成する。一実施形態において、方法は、第４のヘテロ二量体生成物ポリペプチドを回収する工程を含む。
本発明の一実施形態において、方法は、第３のヘテロ二量体生成物ポリペプチド及び第４のヘテロ二量体生成物ポリペプチドの形成を含み、生成物ポリペプチドの一方（即ち第３のヘテロ二量体生成物ポリペプチド、又は第４のヘテロ二量体生成物ポリペプチド）は、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含まない。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、第１の抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含み、且つ第２の抗原結合部位の一部を含み、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、第３の抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含み、且つ第２の抗原結合部位の他の部分を含み、第３のヘテロ二量体ポリペプチドは、第１の抗原に特異的に結合する抗原結合部分、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部分；及び第３の抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含む。
本発明の一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合を含まないヒンジ領域を含む。この場合、ポリペプチド鎖の交換は、還元剤の非存在下で起こりうる。したがって、一実施形態において、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合を含まないヒンジ領域を含み、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、還元剤の非存在下で接触させない。
本発明の一実施形態において、第１及び第２のヘテロ二量体ポリペプチドの、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖間に鎖間ジスルフィド結合は形成されず、接触は還元剤の非存在下で実施される。
Ｆ）ヘテロ二量体生成物ポリペプチド
本発明の一態様は、本発明のヘテロ二量体生成物ポリペプチドを生成する方法により得られるヘテロ二量体生成物ポリペプチドである。
本発明の一態様は、本発明のヘテロ二量体生成物ポリペプチドを生成する方法により得られるヘテロ二量体生成物ポリペプチドである。
本発明の一態様はヘテロ二量体ポリペプチドであり、一実施形態では、ヘテロ二量体生成物ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖はＣＨ３ドメインを介して互いに結合してヘテロ二量体を形成し、ＣＨ３ドメインの一方はノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインはホール変異を含み；ヘテロ二量体ポリペプチドは第１の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分の少なくとも一部は、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されており；ヘテロ二量体ポリペプチドは第２の抗原結合部分を含み、第２の抗原結合部分の少なくとも一部は、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の他方に配置されており；ここで
第３の抗原結合部位が、抗原に特異的に結合するＶＨドメインとＶＬドメインの対により形成され、ＶＨドメインは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖の一方に配置されており、ＶＬドメインは、ＣＨ３ドメインを含む他方のポリペプチド鎖に配置されており；
ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、
－ 正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；
－ 疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；
－ 疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び
－ 疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み；
任意選択的に、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、
－ 負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；
－ 負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；
－ 負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに
－ 疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
第３の抗原結合部位が、抗原に特異的に結合するＶＨドメインとＶＬドメインの対により形成され、ＶＨドメインは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖の一方に配置されており、ＶＬドメインは、ＣＨ３ドメインを含む他方のポリペプチド鎖に配置されており；
ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、
－ 正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；
－ 疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；
－ 疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び
－ 疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み；
任意選択的に、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、
－ 負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；
－ 負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；
－ 負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに
－ 疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
本発明によるヘテロ二量体（生成物）ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖を含み、少なくとも、ホール変異を含むＣＨ３ドメインは、上記に定義された不安定化変異を含む。一実施形態において、本発明によるヘテロ二量体（生成物）ポリペプチドは、上記に定義された不安定化変異を含む、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖を含む。本発明のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド中の不安定化変異に関して上記に列挙されたすべての実施形態は、ヘテロ二量体生成物ポリペプチドに当てはまる。ヘテロ二量体生成物ポリペプチドが、各々が少なくとも１つの不安定化変異を含む、２つのヘテロ二量体前駆体ポリペプチドから形成される場合、ヘテロ二量体生成物ポリペプチドは、両方のＣＨ３ドメインに不安定化変異を含む。
ヘテロ二量体生成物ポリペプチドを生成する方法の別の生成物、したがって本発明の別の態様は、好ましくは本発明の方法により得られた、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体生成物ポリペプチドであり、ＣＨ３ドメインの両方が不安定化変異を含まない。
本発明の一実施形態において、ヘテロ二量体生成物ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖を含み、両方のＣＨ３ドメインが上記に定義されたシステイン変異を含む。本発明の一実施形態において、ヘテロ二量体生成物ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖を含み、両方のＣＨ３ドメインが、上記に定義されたシステイン変異を含まない。
Ｇ）組み換え方法
本発明による前駆体ポリペプチドは、組み換え方法により調製される。したがって、本発明は、本発明によるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの調製のための方法にも関し、この方法は、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドをコードするための核酸を含む宿主細胞を、前駆体ポリペプチドの発現に適した条件下で培養することを含む。
本発明による前駆体ポリペプチドは、組み換え方法により調製される。したがって、本発明は、本発明によるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの調製のための方法にも関し、この方法は、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドをコードするための核酸を含む宿主細胞を、前駆体ポリペプチドの発現に適した条件下で培養することを含む。
一態様において、本発明のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドを作製する方法が提供され、この方法は、上記に提供されたヘテロ二量体前駆体ポリペプチドをコードする核酸（複数可）を含む宿主細胞を、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること、及び任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培地）からヘテロ二量体前駆体ポリペプチドを回収することを含む。
一実施形態において、方法は、宿主細胞を、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換する工程、前記宿主細胞を、前記ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの合成を可能にする条件下で培養する工程、及び前記ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドを、前記宿主細胞培養物から回収する工程を含む。
ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組み換え生成のために、例えば上述の、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞中でのさらなるクローニング及び／又は発現のために、単離されて、１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離して従来の手順を使用して配列決定することができる（例えば、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）か、又は組み換え方法に生成することができるか若しくは化学合成により得ることができる。
抗体コード化ベクターのクローニング又は発現のための好適な宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、細菌中において生成されうる。ポリペプチドの細菌中での発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（大腸菌における抗体断片の発現を記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ． ２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３），ｐ． ２４５－２５４も参照）。発現後、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、可溶性の画分中の細菌細胞ペーストから単離することが可能で、さらに精製することができる。
原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌及び酵母株を含む糸状菌又は酵母といった真核微生物が、本発明のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドをコードするためのベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、部分的に又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドがもたらされる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２２（２００４）１４０９－１４１４；及びＬｉ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２４（２００６）２１０－２１５を参照のこと。
また、（グリコシル化）ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と併せて、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用することができる、多数のバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７６号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成のためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
脊椎動物細胞も、宿主として使用されてよい。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６（１９７７）５９－７４）に記載されるような２９３細胞又は２９３Ｔ細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３（１９８０）２４３－２５２）に記載されるようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３（１９８２）４４－６８に記載されるＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６－４２２０）；及び骨髄腫細胞株、例えばＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ． ａｎｄ Ｗｕ，Ａ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ． ２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００４），ｐｐ． ２５５－２６８を参照。
一態様では、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
一態様において、本発明は、本発明のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。一態様において、本発明は、本発明による核酸を含む発現ベクターを提供する。別の態様では本発明は、本発明の核酸を含む宿主細胞を提供する。
Ｈ）治療応用
本発明のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組は、治療法において使用されうる。治療法に使用されるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、上記に定義された活性化できる抗原結合部位を含む。
本発明のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組は、治療法において使用されうる。治療法に使用されるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、上記に定義された活性化できる抗原結合部位を含む。
したがって、本発明の一態様は、医薬としての使用のための、本発明によるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組である。本発明の別の態様は、本発明のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組を含む薬学的組成物と、薬学的に許容される担体とを含む。本発明の別の態様は、疾患を有する個体を治療する方法であり、この方法は、個体に対し、本発明の第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド又は本発明の薬学的組成物の有効量を投与することを含む。
本発明の一態様は、第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド中で、Ｂ）に示されるＶＨドメインとＶＬドメインが、がんの治療における使用のための、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、本発明によるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組である。本発明の別の態様は、がんを有する個体を治療する方法であり、この方法は、個体に対し、本発明の第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの有効量を投与することを含み、第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド中で、Ｂ）に示されるＶＨドメインとＶＬドメインは、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる。
一実施形態において、治療法に使用されるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、上記に定義されたヒンジ領域を含み、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドはヒンジ領域に鎖間ジスルフィド結合を含まない。ヒンジ領域における鎖間ジスルフィド結合の非存在下では、ポリペプチド鎖の交換が還元剤の非存在下で起こり、したがって自然発生的に；例えば両方のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが標的抗原又は標的細胞に結合したときに、起こりうる。
一実施形態において、治療法に使用されるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合を含まないヒンジ領域；及び上記に定義された活性化できる抗原結合部位を含む。
３．本発明の特定の実施形態
１．以下を含む、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組：
－ ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第１の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド、及び
－ ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第２の抗原結合部分を含み、第２の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド、
ここで、
Ａ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含むか、又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含み；
Ｂ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合するか；又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合し、
Ｃ）
ｉ）ノブ変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びホール変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、又は
ｉｉ）ホール変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びノブ変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン
は、番号付けがカバット番号付けシステムによる以下のアミノ酸置換を含んでいる：
－ ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、
・正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び
・疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
－ ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに
・疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
１．以下を含む、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組：
－ ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第１の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド、及び
－ ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第２の抗原結合部分を含み、第２の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド、
ここで、
Ａ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含むか、又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含み；
Ｂ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合するか；又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合し、
Ｃ）
ｉ）ノブ変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びホール変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、又は
ｉｉ）ホール変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びノブ変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン
は、番号付けがカバット番号付けシステムによる以下のアミノ酸置換を含んでいる：
－ ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、
・正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び
・疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
－ ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに
・疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
２．Ｃ）に示される、ノブ変異を含むＣＨ３ドメイン及びホール変異を含むＣＨ３ドメインが、以下の表：
に示される群から選択されるアミノ酸置換のうちの１つを含む、実施形態１によるヘテロ二量体ポリペプチドの組。
３．Ｃ）に示される、ノブ変異を含むＣＨ３ドメイン及びホール変異を含むＣＨ３ドメインが、以下の表：
に示される群から選択されるアミノ酸置換のうちの１つを含む、実施形態１によるヘテロ二量体ポリペプチドの組。
４．Ｃ）に示される、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインが、変異Ｅ３５７Ｋを含む場合に、Ｃ）に示される、ホール変異を有するＣＨ３ドメインが、変異Ｋ３７０Ｅを含まない、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
５．ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むか、又はｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
６．ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｓ３５４Ｃを含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｙ３４９Ｃを含むか、又はｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｙ３４９Ｃを含み、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｓ３５４Ｃを含む、実施形態５に記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
７．第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内で、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｓ３５４Ｃを含み、ホール変異を含むＣＨ３ドメインが位置３４９にＹを含み；第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内で、ホール変異を含むＣＨ３ドメインが置換Ｙ３４９Ｃを含み、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインが位置３５４にＳを含む、実施形態６に記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
８．第１の抗原結合部分及び／又は第２の抗原結合部分が、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成するＶＨドメインとＶＬドメインの対を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
９．第１の抗原結合部分及び／又は第２の抗原結合部分が抗体断片である、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
１０．
－ 第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ ＣＨ３ドメインと第１の抗体可変ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ ＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ 第２の抗体可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１及び第２の抗体可変ドメインが一緒に、標的抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
－ 第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ ＣＨ３ドメインと第３の抗体可変ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ ＣＨ３ドメインを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ 第４の抗体可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第３及び第４の抗体可変ドメインが一緒に、標的抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
－ ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含む、
前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
－ 第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ ＣＨ３ドメインと第１の抗体可変ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ ＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ 第２の抗体可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１及び第２の抗体可変ドメインが一緒に、標的抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
－ 第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ ＣＨ３ドメインと第３の抗体可変ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ ＣＨ３ドメインを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ 第４の抗体可変ドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第３及び第４の抗体可変ドメインが一緒に、標的抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
－ ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含む、
前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
１１．第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドがヒンジ領域を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
１２．第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ヒンジ領域に鎖間ジスルフィド結合を含まない、実施形態１４に記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
１３．第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
１４．第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
１５．第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域と、抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
１６．
ａ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインが互いに会合して標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、
前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
ａ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインが互いに会合して標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、
前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
１７．
第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、
第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、ＶＬドメインとＶＨドメインが、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、
前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、
第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、ＶＬドメインとＶＨドメインが、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、
前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
１８．
ａ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、
前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
ａ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、
前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
１９．第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの抗原結合部分と第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの抗原結合部分が同じ抗原に結合する、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組。
２０．第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの抗原結合部分と第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの抗原結合部分が異なる抗原に結合する、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組。
２１．Ｂ）に示されるＶＨドメインとＶＬドメインが、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組。
２２．第１のヘテロ二量体ポリペプチドと第２のヘテロ二量体ポリペプチドの、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されない、前述の実施形態のいずれか１つに記載のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組。
２３．第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖と、第２のヘテロ二量体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖とを含む第３のヘテロ二量体ポリペプチドを形成するために、実施形態１～２２のいずれか１つに定義された、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドとを接触させることを含む、ヘテロ二量体ポリペプチドを生成するための方法。
２４．第３のヘテロ二量体ポリペプチドを回収する工程を含む、実施形態２３に記載の方法。
２５．第３のヘテロ二量体ポリペプチドが少なくとも３つの抗原結合部位を含む、実施形態２３又は２４に記載の方法。
２６．第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含み、第３のヘテロ二量体ポリペプチドが、第１の抗原に特異的に結合する抗原結合部分と、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部分とを含み、第３の抗原結合部分が、Ｂ）に示されるＶＬドメインとＶＨドメインによって形成される、実施形態２３～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．第３のヘテロ二量体ポリペプチドが少なくとも３つの抗原結合部位を含み、第１の抗原結合部位が第１の抗原結合部分であり、第２の抗原結合部位が第２の抗原結合部分であり、第３の抗原結合部分が、Ｂ）に示されるＶＬドメインとＶＨドメインによって形成される、実施形態２３～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドがヒンジ領域を含み、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、ヒンジ領域に鎖間ジスルフィド結合を含まない、実施形態２３～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．接触させることが、還元剤の非存在下で実施される、実施形態２６に記載の方法。
３０．実施形態２３～２９のいずれか１つに記載の方法により得られるヘテロ二量体ポリペプチド。
３１．実施形態１～２２のいずれか１つに定義された第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド。
３２．実施形態１～２２のいずれか１つに定義された第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド。
３３．医薬としての使用のための、実施形態１～２２のいずれか１つに記載のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組。
３４．実施形態１～２２のいずれか１つに記載のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
３５．疾患を有する個体を治療する方法であって、個体に対し、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド又は実施形態３４に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む方法。
３６．第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド中で、Ｂ）に示されるＶＨドメインとＶＬドメインが、がんの治療における使用のための、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、実施形態１～２２のいずれか１つに記載のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組。
３７．がんを有する個体を治療する方法であって、個体に対し、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの有効量を投与することを含み、第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド中で、Ｂ）に示されるＶＨドメインとＶＬドメインが、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、方法。
アミノ酸配列の記載
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は、特許請求の範囲に明記されている。本発明の要旨から逸脱することなく、明記される手順に変更を加えることができることが理解される。
実施例１：
完全Ｆｃドメインを含む単一特異性前駆体ポリペプチドの生成
単一特異性前駆体ポリペプチドからの二重特異性抗ビオシチンアミド／抗フルオレセイン抗体をもたらすポリペプチド鎖交換の有効性を評価するために、以下の単一特異性前駆体ポリペプチドを生成した：
完全Ｆｃドメインを含む単一特異性前駆体ポリペプチドの生成
単一特異性前駆体ポリペプチドからの二重特異性抗ビオシチンアミド／抗フルオレセイン抗体をもたらすポリペプチド鎖交換の有効性を評価するために、以下の単一特異性前駆体ポリペプチドを生成した：
第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ビオ前駆体」とも呼ぶ）は、配列番号０１のＶＬドメインと配列番号０２のＶＨドメインとを有する、ビオチン誘導体であってビオシチンアミド（「ビオ」）に特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。第１の前駆体ポリペプチドは、配列番号０３の軽鎖ポリペプチド（「ビオＬＣ」とも呼ぶ）、配列番号０４の第１の重鎖ポリペプチド（「ビオＨＣ」とも呼ぶ）及び配列番号０５に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を有さない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示す不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミーホール」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含んでいた。
第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗フルオ前駆体」とも呼ぶ）は、配列番号０６のＶＬドメインと配列番号０７のＶＨドメインとを有するフルオレセイン（「フルオ」）に特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。第２の前駆体ポリペプチドは、配列番号０８の軽鎖ポリペプチド（「フルオＬＣ」とも呼ぶ）、配列番号０９の第１の重鎖ポリペプチド（「フルオＨＣ」とも呼ぶ）及び配列番号１０に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を有さない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示す不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミーノブ」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む。
示されるポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、以下の変異を含む：
（表１）前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸置換
配列番号０５のアミノ酸配列を有するダミーホールポリペプチドを含む抗ビオ前駆体を生成し、そこでは以下のアミノ酸置換のうちの１つを行った：Ｅ３５７Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、Ａ３６８Ｆ、Ｖ４０７Ｙ、Ｄ３９９Ａ Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３５４Ｖ、又はＳ３６４Ｌ。
配列番号１０のアミノ酸配列を有するダミーノブポリペプチドを含む抗フルオ前駆体を生成し、そこでは以下のアミノ酸置換のうちの１つを行った：Ｋ３７０Ｅ、Ｗ３６６Ｉ Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｅ、又はＫ３９２Ｄ。
前駆体ポリペプチドのための発現プラスミドを以下のように生成した：
本明細書に報告される抗ビオ及び抗フルオ前駆体の発現のために、以下の機能的要素を含む以下の転写単位を使用した：
－イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）からの前早期エンハンサー及びプロモーター、
－ヒト重鎖免疫グロブリン ５’－非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－それぞれの前駆体ポリペプチドをコードする核酸、及び
－ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。
－発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットの他に、基本的な／標準の哺乳動物発現プラスミドは、
－大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、及び
－大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータ－ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
本明細書に報告される抗ビオ及び抗フルオ前駆体の発現のために、以下の機能的要素を含む以下の転写単位を使用した：
－イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）からの前早期エンハンサー及びプロモーター、
－ヒト重鎖免疫グロブリン ５’－非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－それぞれの前駆体ポリペプチドをコードする核酸、及び
－ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。
－発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットの他に、基本的な／標準の哺乳動物発現プラスミドは、
－大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、及び
－大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータ－ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
前駆体ポリペプチドの組み換え生成
本明細書に報告される抗ビオ及び抗フルオ前駆体の一過性発現を、トランスフェクション試薬ミックスＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３トランスフェクションキット（Ａ１４５２４；Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ）を用いて、Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ発現培地（Ａ１４３５１０１；Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ）において懸濁に適合させたＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞（Ａ１４５２７；Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ）中で実施した。
本明細書に報告される抗ビオ及び抗フルオ前駆体の一過性発現を、トランスフェクション試薬ミックスＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３トランスフェクションキット（Ａ１４５２４；Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ）を用いて、Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ発現培地（Ａ１４３５１０１；Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ）において懸濁に適合させたＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞（Ａ１４５２７；Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ）中で実施した。
細胞は、１２５ｍｌの振盪フラスコ中で解凍後に少なくとも４回（容積３０ｍｌ）希釈することにより継代した（３７℃、７％ ＣＯ２、湿度８５％、１３５ｒｐｍでインキュベート／振盪）。細胞を、２５０ｍｌの容積中において３ｘ１０５細胞／ｍｌまで増殖させた。３日後、細胞を分割し、１リットルの振盪フラスコ内で２５０ｍｌの容積中に、１．３＊１０６細胞／ｍｌの密度で新たに播種した。トランスフェクションは、凡そ２．２－２．８ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞密度で２４時間後に実施した。
トランスフェクションの前に、３０μｇのプラスミドＤＮＡを、余熱した（水槽；３７℃）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて最終容積１．５ｍｌに希釈した。溶液を穏やかに混合し、室温で最長５分間インキュベートした。次いで、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ試薬のプレインキュベート溶液１．５ｍｌを、ＤＮＡ－ＯｐｔｉＭＥＭ溶液に加えた。その結果得られた溶液を穏やかに混合し、室温で２０～３０分間インキュベートした。混合物の全容量を、３０ｍｌのＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ培養物を含む４８ウェルディープウェルプレート中のディープウェル、５０ｍｌのファルコンチューブ又は１００ｍｌの振盪フラスコに加えた。
トランスフェクトされた細胞を、３７℃、７％ ＣＯ２、湿度８５％で７日間インキュベートし、振盪フラスコの場合は１１０ｒｐｍで、ファルコンチューブの場合は２０５ｒｐｍで振盪した。
トランスフェクション後１６～２４時間、２０μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＥｎｈａｎｃｅｒ１及び２００μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭエンハンサー２を、３０ｍｌの細胞培養物に加えた。
上清を、２０分にわたる４，０００ｒｐｍ、４℃での遠心分離により回収した。その後、無細胞上清を、０．２２μｍのボトルトップフィルターを通して濾過し、冷凍庫（－２０℃）内で貯蔵した。
抗体を細胞培養物の上清から、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
簡潔に述べれば、無菌濾過された細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて平衡化されたＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ樹脂に捕捉させ、平衡化緩衝液を用いて洗浄し、２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いてｐＨ３．０で溶出した。それぞれの前駆体ポリペプチドの溶出された画分をプールし、２ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９．０で中和した。
別法として、前駆体ポリペプチドを細胞培養上清から、抗Ｃｋａｐｐａ樹脂（ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
簡潔に述べれば、滅菌濾過された細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化されたＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂に捕捉させ、平衡化緩衝液で洗浄し、２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いてｐＨ３．０で溶出した。溶出された前駆体ポリペプチドの画分をプールし、２ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９．０で中和した。
前駆体ポリペプチドの同一性を質量分析により確認した。各個別試料について、保存されたＦｃ Ｎ－グリコシル化を酵素により（Ｎ－グリコシダーゼＦを使用して）除去し、タンパク質を変性させ（塩酸グアニジン）、ジスルフィド結合を低減した（ＤＴＴ又はＴＣＥＰを使用して）。試料を、液体クロマトグラフィーにより（サイズ排除又は逆相クロマトグラフィーにより）脱塩し、質量分析（Ｂｒｕｋｅｒ Ｍａｘｉｓ Ｑ－ＴｏＦ）により分析した。各分子の同一性を、正確な質量測定、及び理論的に予測される分子質量との比較により確認した。
分析的サイズ排除クロマトグラフィーを、流量１ｍｇ／ｍｌで２００ｍＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０のランニングバッファーを使用して、ＢｉｏＳｕｉｔｅ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＣカラム（２５０Å，Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳＡ）により実行した。すべての個々の前駆体ポリペプチドの単量体含有量を、反応設定の前に評価した。
実施例２：
ＥＬＩＳＡによる二重特異性生成物ポリペプチド形成の直接検出によるポリペプチド鎖交換効率の分析
異なる不安定化変異のポリペプチド鎖の交換に対する影響を評価するために、交換反応を、実施例１において生成した前駆体ポリペプチドを使用して設定した。
ＥＬＩＳＡによる二重特異性生成物ポリペプチド形成の直接検出によるポリペプチド鎖交換効率の分析
異なる不安定化変異のポリペプチド鎖の交換に対する影響を評価するために、交換反応を、実施例１において生成した前駆体ポリペプチドを使用して設定した。
この実験におけるポリペプチド鎖の交換は、さらなる抗原結合部位の活性化をもたらさない。
二重特異性抗ビオシチンアミド／抗フルオレセイン生成物ポリペプチドの存在を、ＥＬＩＳＡにより評価した。
交換反応を開始するために、抗ビオ前駆体ポリペプチドと抗フルオ前駆体ポリペプチドを、３８４ウェルＲＥＭＰ（登録商標）プレート（Ｂｒｏｏｋｓ，＃１８０００３０）において、合計容量４８μｌの１ｘＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０＋０．２５ｍＭのＴＣＥＰ中２μＭのタンパク質濃度で、等モル量で混合した（単一反応中での同量のインタクト分子を確実にするために、％単量体ＳＥＣ値に正規化した）。特に、還元剤ＴＣＥＰの付加は、ヒンジジスルフィドを低減し、したがってポリペプチド鎖の解離をサポートする。遠心分離後、プレートをシールし、１時間３７℃でインキュベートした。その結果得られた反応混合物を、ＥＬＩＳＡにより分析した。
ビオチン－フルオレセイン架橋ＥＬＩＳＡをその後使用して二重特異性抗体を定量化した：
したがって、白色Ｎｕｎｃ（登録商標）ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ３８４ウェルプレートを、１μｇ／ｍｌのアルブミン－蛍光イソチオシアネートコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ９７７１）でコーティングし、一晩４℃でインキュベートした。９０μｌのＰＢＳＴ－緩衝液（ＰＢＳＴ、再蒸留水、１０ｘＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）ブロッキング緩衝液（１ｘＰＢＳ、２％のゼラチン、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄した後、９０μｌ／ウェルを加え、１時間室温でインキュベートした。９０μｌのＰＢＳＴ－緩衝液で３回洗浄した後、２５μｌの１：４希釈の各反応混合物を、各ウェルに加えた。１時間にわたる室温でのインキュベーションの後、プレートを再び９０μｌのＰＢＳＴ－緩衝液で３回洗浄した。０．５％のＢＳＡ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ－２０、１ｘＰＢＳ中、２５μｌ／ウェルのビオチン－Ｃｙ５コンジュゲートを、最終濃度０．１μｇ／ｍｌになるまで加え、プレートを１時間に室温わたって室温でインキュベートした。９０μｌのＰＢＳＴ－緩衝液で６回洗浄した後、２５μｌの１ｘＰＢＳを各ウェルに加えた。Ｃｙ５蛍光を、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２ Ｒｅａｄｅｒで、発振波長６７０ｎｍ（６４９ｎｍで励起）で測定した。
したがって、白色Ｎｕｎｃ（登録商標）ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ３８４ウェルプレートを、１μｇ／ｍｌのアルブミン－蛍光イソチオシアネートコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ９７７１）でコーティングし、一晩４℃でインキュベートした。９０μｌのＰＢＳＴ－緩衝液（ＰＢＳＴ、再蒸留水、１０ｘＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）ブロッキング緩衝液（１ｘＰＢＳ、２％のゼラチン、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄した後、９０μｌ／ウェルを加え、１時間室温でインキュベートした。９０μｌのＰＢＳＴ－緩衝液で３回洗浄した後、２５μｌの１：４希釈の各反応混合物を、各ウェルに加えた。１時間にわたる室温でのインキュベーションの後、プレートを再び９０μｌのＰＢＳＴ－緩衝液で３回洗浄した。０．５％のＢＳＡ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ－２０、１ｘＰＢＳ中、２５μｌ／ウェルのビオチン－Ｃｙ５コンジュゲートを、最終濃度０．１μｇ／ｍｌになるまで加え、プレートを１時間に室温わたって室温でインキュベートした。９０μｌのＰＢＳＴ－緩衝液で６回洗浄した後、２５μｌの１ｘＰＢＳを各ウェルに加えた。Ｃｙ５蛍光を、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ ２ Ｒｅａｄｅｒで、発振波長６７０ｎｍ（６４９ｎｍで励起）で測定した。
前もって形成した抗フルオレセイン／抗ビオシチンアミド二重特異性参照抗体（配列番号０３のビオ軽鎖、配列番号０４のビオ重鎖、配列番号０８のフルオ軽鎖及び配列番号０９のフルオ重鎖）を、反応結果の１００％コントロールとして使用した。
前もって形成した二重特異性参照抗体を、上記に示したように分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより分析した：
（表２）二重特異性参照抗体の単量体含有量
架橋ＥＬＩＳＡ設定の参照抗体からの吸収度シグナルを、２３の反応に基づいて平均した。この平均値を、すべてのポリペプチド鎖の交換反応の正規化のために、１００％架橋シグナルとして使用した。架橋ＥＬＩＳＡにおける参照抗体のアッセイの変動性は１００＋／－１５．２％である。１００％を上回るポリペプチド鎖の交換反応は、この変動性内にありうる。加えて、反応混合物中に起こりうる潜在的な凝集は、架橋シグナルの増加に繋がりうる。
結果を表３に示す。
（表３）ダミー鎖のＣＨ３ドメイン内に示される不安定化変異（複数可）を含む抗ビオ及び抗フルオ前駆体ポリペプチドからのポリペプチド鎖反応による二重特異性生成物ポリペプチドの形成。列は、抗ビオ前駆体のダミーホールポリペプチド中の不安定化変異を示し；行は、抗フルオ前駆体のダミーノブポリペプチド中の不安定化変異を示す。架橋ＥＬＩＳＡにより検出された相対的吸収度を示す。
実施例３：
ポリペプチド鎖交換の際の活性化できる結合部位の生成のための単一特異性前駆体ポリペプチドの生成
単一特異性前駆体ポリペプチドからの二重特異性抗ＬｅＹ／抗ＣＤ３抗体の形成を評価するために、図１及び図２に示される第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドについて示されたドメイン構成の単一特異性前駆体ポリペプチドを生成した。
ポリペプチド鎖交換の際の活性化できる結合部位の生成のための単一特異性前駆体ポリペプチドの生成
単一特異性前駆体ポリペプチドからの二重特異性抗ＬｅＹ／抗ＣＤ３抗体の形成を評価するために、図１及び図２に示される第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドについて示されたドメイン構成の単一特異性前駆体ポリペプチドを生成した。
ＣＨ２ドメインを欠く前駆体ポリペプチド
実験の第１の組では、図１に示されるドメイン構成を有するヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが提供された。この前駆体ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインを欠いており、ＣＨ３ドメインのＮ末端に配置された抗体可変ドメインを含む。
実験の第１の組では、図１に示されるドメイン構成を有するヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが提供された。この前駆体ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインを欠いており、ＣＨ３ドメインのＮ末端に配置された抗体可変ドメインを含む。
第１の代替例では、以下の前駆体ポリペプチドが提供された：
－ 第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－ノブ前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－ノブ前駆体は、配列番号１１の軽鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ ＬＣ」とも呼ぶ）、ＣＤ３に特異的に結合する抗体に由来するＶＨドメイン（「ＣＤ３（ＶＨ）」）を含む配列番号１２の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－ノブＨＣとも呼ぶ」）、及び配列番号１３に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を有さない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示す不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＬ－ホール」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域と、ジゴキシゲニン（「ｄｉｇ」）に特異的に結合する抗体に由来するＶＬドメインと、ＣＨ３ドメインとを含んでいた。
－ 第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－ホール前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－ホール前駆体は、配列番号１１の軽鎖ポリペプチド、即ちＬｅＹ ＬＣ；ＣＤ３に特異的に結合する抗体に由来するＶＬドメイン（「ＣＤ３（ＶＬ）」）を含む配列番号１４の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－ホールＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号１５に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＨ－ノブ」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、非結合抗体に由来するＶＨドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
－ 第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－ノブ前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－ノブ前駆体は、配列番号１１の軽鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ ＬＣ」とも呼ぶ）、ＣＤ３に特異的に結合する抗体に由来するＶＨドメイン（「ＣＤ３（ＶＨ）」）を含む配列番号１２の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－ノブＨＣとも呼ぶ」）、及び配列番号１３に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を有さない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示す不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＬ－ホール」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域と、ジゴキシゲニン（「ｄｉｇ」）に特異的に結合する抗体に由来するＶＬドメインと、ＣＨ３ドメインとを含んでいた。
－ 第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－ホール前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－ホール前駆体は、配列番号１１の軽鎖ポリペプチド、即ちＬｅＹ ＬＣ；ＣＤ３に特異的に結合する抗体に由来するＶＬドメイン（「ＣＤ３（ＶＬ）」）を含む配列番号１４の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－ホールＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号１５に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＨ－ノブ」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、非結合抗体に由来するＶＨドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
第２の代替例では、以下の前駆体ポリペプチドが提供された：
－ 第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－ノブ前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－ノブ前駆体は、配列番号１１の軽鎖ポリペプチド、即ちＬｅＹ ＬＣ、ＣＤ３（ＶＬ）ドメインを含む配列番号１６の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－ノブＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号１７に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＨ－ホール」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、非結合抗体に由来するＶＨドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
－ 第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－ホール前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－ホール前駆体は、配列番号１１の軽鎖ポリペプチド、即ちＬｅＹ ＬＣ；ＣＤ３（ＶＨ）ドメインを含む配列番号１８の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－ホールＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号１９に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＬ－ノブ」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、抗ｄｉｇ抗体に由来するＶＬドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
－ 第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－ノブ前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－ノブ前駆体は、配列番号１１の軽鎖ポリペプチド、即ちＬｅＹ ＬＣ、ＣＤ３（ＶＬ）ドメインを含む配列番号１６の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－ノブＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号１７に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＨ－ホール」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、非結合抗体に由来するＶＨドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
－ 第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－ホール前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－ホール前駆体は、配列番号１１の軽鎖ポリペプチド、即ちＬｅＹ ＬＣ；ＣＤ３（ＶＨ）ドメインを含む配列番号１８の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－ホールＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号１９に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＬ－ノブ」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、抗ｄｉｇ抗体に由来するＶＬドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
示されるポリペプチド鎖は、以下の変異を含む：
（表４）前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸置換
Ｆｃドメインを有する前駆体ポリペプチド
実験の第２の組では、図２に示されるドメイン構成を有するヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが提供された。前駆体ポリペプチドは、完全なＦｃドメインを含み、ＣＨ２ドメインのＮ末端に配置された抗体可変ドメインを含む。
実験の第２の組では、図２に示されるドメイン構成を有するヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが提供された。前駆体ポリペプチドは、完全なＦｃドメインを含み、ＣＨ２ドメインのＮ末端に配置された抗体可変ドメインを含む。
第１の代替例では、以下の前駆体ポリペプチドが提供された：
－ 第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－Ｆｃ（ノブ）前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－Ｆｃ（ノブ）前駆体は、配列番号１１の軽鎖ポリペプチド、即ちＬｅＹ ＬＣ、ＣＤ３（ＶＨ）ドメインを含む配列番号２０の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－Ｆｃ（ノブ）ＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号２１に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示される不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＬ－Ｆｃ（ホール）」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、ジゴキシゲニン（「ｄｉｇ」）に特異的に結合する抗体に由来するＶＬドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
－ 第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－Ｆｃ（ホール）前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－Ｆｃ（ホール）前駆体は、ＬｅＹ ＬＣ；ＣＤ３（ＶＬ）ドメインを含む配列番号２２の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－Ｆｃ（ホール）ＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号２３に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示される不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＨ－Ｆｃ（ノブ）」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、抗ｄｉｇ抗体に由来するＶＨドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
－ 第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－Ｆｃ（ノブ）前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－Ｆｃ（ノブ）前駆体は、配列番号１１の軽鎖ポリペプチド、即ちＬｅＹ ＬＣ、ＣＤ３（ＶＨ）ドメインを含む配列番号２０の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－Ｆｃ（ノブ）ＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号２１に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示される不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＬ－Ｆｃ（ホール）」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、ジゴキシゲニン（「ｄｉｇ」）に特異的に結合する抗体に由来するＶＬドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
－ 第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－Ｆｃ（ホール）前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－Ｆｃ（ホール）前駆体は、ＬｅＹ ＬＣ；ＣＤ３（ＶＬ）ドメインを含む配列番号２２の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－Ｆｃ（ホール）ＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号２３に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示される不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＨ－Ｆｃ（ノブ）」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、抗ｄｉｇ抗体に由来するＶＨドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
第２の代替例では、以下の前駆体ポリペプチドが提供された：
－ 第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－Ｆｃ（ノブ）前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－Ｆｃ（ノブ）前駆体は、ＬｅＹ ＬＣ、ＣＤ３（ＶＬ）ドメインを含む配列番号２４の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－Ｆｃ（ノブ）ＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号２５に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示される不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＨ－Ｆｃ（ホール）」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、抗ｄｉｇ抗体に由来するＶＨドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
－ 第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－Ｆｃ（ホール）前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－Ｆｃ（ホール）前駆体は、ＬｅＹ ＬＣ；ＣＤ３（ＶＨ）ドメインを含む配列番号２６の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－Ｆｃ（ホール）ＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号２７に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示される不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＬ－Ｆｃ（ノブ）」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、抗ｄｉｇ抗体に由来するＶＬドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
－ 第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－Ｆｃ（ノブ）前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－Ｆｃ（ノブ）前駆体は、ＬｅＹ ＬＣ、ＣＤ３（ＶＬ）ドメインを含む配列番号２４の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＬ）－Ｆｃ（ノブ）ＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号２５に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示される不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＨ－Ｆｃ（ホール）」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、抗ｄｉｇ抗体に由来するＶＨドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
－ 第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－Ｆｃ（ホール）前駆体」とも呼ぶ）は、ＬｅＹに特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。抗ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－Ｆｃ（ホール）前駆体は、ＬｅＹ ＬＣ；ＣＤ３（ＶＨ）ドメインを含む配列番号２６の第１の重鎖ポリペプチド（「ＬｅＹ－ＣＤ３（ＶＨ）－Ｆｃ（ホール）ＨＣ」とも呼ぶ）、及び配列番号２７に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を含まない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示される不安定化変異と、ヒスチジンタグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミー－ＶＬ－Ｆｃ（ノブ）」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、抗ｄｉｇ抗体に由来するＶＬドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。
示されるポリペプチド鎖は、以下の変異を含む：
（表５）前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸置換
上記に示したそれぞれのダミーポリペプチドのアミノ酸配列を有する上記に示した配列番号１３のダミーＶＬ－ホールポリペプチド及び配列番号１７のダミーＶＨ－ホールポリペプチドを含むヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが生成され、以下のアミノ酸置換のうちの１つが作製された：Ｅ３５７Ｋ、Ａ３６８Ｆ、Ｄ３９９Ａ Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３６４Ｌ、Ｙ４０７Ｗ、又はＳ３５４Ｖ。
上記に示したそれぞれのダミーポリペプチドのアミノ酸配列を有する上記に示した配列番号１５のダミーＶＨ－ノブポリペプチド及び配列番号１９のダミーＶＬ－ノブポリペプチドを含むヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが生成され、以下のアミノ酸置換のうちの１つが作製された：Ｋ３７０Ｅ、不安定化変異なし、Ｗ３６６Ｉ Ｋ４０９Ｄ、Ｖ３９７Ｙ、又はＫ３９２Ｄ。
上記に示したそれぞれのダミーポリペプチドのアミノ酸配列を有する上記に示した配列番号２１のダミーＶＬ－Ｆｃ（ホール）ポリペプチド及び配列番号２５のダミー －ＶＨ－Ｆｃ（ホール）ポリペプチドを含むヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが生成され、以下のアミノ酸置換のうちの１つが作製された：Ｅ３５７Ｋ、Ａ３６８Ｆ、Ｄ３９９Ａ Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３６４Ｌ、Ｄ３５６Ｋ、又はＳ３５４Ｖ。
上記に示したそれぞれのダミーポリペプチドのアミノ酸配列を有する上記に示した配列番号２３のダミー－ＶＨ－Ｆｃ（ノブ）ポリペプチド及び配列番号２７のダミー－ＶＬ－Ｆｃ（ノブ）ポリペプチドを含むヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが生成され、以下のアミノ酸置換のうちの１つが作製された：Ｋ３７０Ｅ、不安定化変異なし、Ｗ３６６Ｉ Ｋ４０９Ｄ、Ｖ３９７Ｙ、Ｋ３９２Ｄ、又はＫ３７０Ｅ Ｋ４３９Ｅ。
前駆体ポリペプチドの組み換え生成
発現は、従来技術による、各前駆体ポリペプチドの３つのポリペプチド鎖のプラスミドの、哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ２９３又はＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ）への同時トランスフェクションにより行った。
発現は、従来技術による、各前駆体ポリペプチドの３つのポリペプチド鎖のプラスミドの、哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ２９３又はＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ）への同時トランスフェクションにより行った。
上記に示した前駆体ポリペプチドの発現のために、以下の機能的要素を含む転写単位を使用した：
－イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）からの前早期エンハンサー及びプロモーター、
－ヒト重鎖免疫グロブリン ５’－非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－それぞれの前駆体ポリペプチドをコードする核酸、及び
－ポリアデニル化シグナル配列を有する３’－非翻訳領域。
－イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）からの前早期エンハンサー及びプロモーター、
－ヒト重鎖免疫グロブリン ５’－非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－それぞれの前駆体ポリペプチドをコードする核酸、及び
－ポリアデニル化シグナル配列を有する３’－非翻訳領域。
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットの他に、基本的な／標準の哺乳動物発現プラスミドは、
－ 大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にする複製開始点、及び
－ 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータ－ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
－ 大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にする複製開始点、及び
－ 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータ－ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
前駆体ポリペプチド鎖を含む発現カセットのコード化は、ＰＣＲ及び／又は遺伝子合成によって生成され、例えばそれぞれのプラスミド中の固有の制限部位を使用して、一致した核酸セグメントの接続による既知の組み換え方法及び技術によって組み立てられた。サブクローン化された核酸配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。一過性のトランスフェクションのために、大量のプラスミドが、形質転換された大腸菌培養物（ＨｉＳｐｅｅｄ プラスミド Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）からプラスミド調製によって調製された。
標準的な細胞培養技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｄａｓｓｏ，Ｍ．，Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ． ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているように使用した。
前駆体ポリペプチド誘導体が、製造者の指示に従ってＨＥＫ２９３－Ｆ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ系（Ｌｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、それぞれのプラスミドを用いた一過性のトランスフェクションにより生成された。簡潔に述べれば、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）若しくはＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の撹拌された発酵槽内又は振盪フラスコ内において、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞（Ｌｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、それぞれの発現プラスミド及び２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ、ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）又は試薬ミックスＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３ トランスフェクション Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクトした。１～２Ｌの振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の場合、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞又はＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞を、２５０～６００ｍＬ中、１～１．３＊１０６細胞／ｍＬの密度で播種し、１２０ｒｐｍ、８％ ＣＯ２でインキュベートした。翌日、細胞を、適切な発現プラスミドでトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞は、Ａ）３００μｇの総プラスミドＤＮＡ（０．５μｇ／ｍＬ）を含む２０ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、Ｂ）２０ｍｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ＋１．２ｍＬ ２９３ｆｅｃｔｉｎ又はｆｅｃｔｉｎ（２μＬ／ｍＬ）又は７５０μｌのＰＥＩｐｒｏ（１．２５μＬ／ｍＬ）との約４２ｍＬのミックスを用いて、概ね１．５＊１０６細胞／ｍＬの細胞密度でトランスフェクトした。Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞は、凡そ２．２～２．８ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞密度でトランスフェクトした。トランスフェクションの前に、３０μｇのプラスミドＤＮＡを、余熱した（水槽；３７℃）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて最終容積１．５ｍｌに希釈した。溶液を穏やかに混合し、室温で最長５分間インキュベートした。次いで、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ試薬のプレインキュベート溶液１．５ｍｌを、ＤＮＡ－ＯｐｔｉＭＥＭ溶液に加えた。その結果得られた溶液を穏やかに混合し、室温で２０～３０分間インキュベートした。混合物の全容量を、３０ｍｌのＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ培養物を含む１００ｍｌの振盪フラスコに加えた。培養物を、３７℃、７％ ＣＯ２、湿度８５％で７日間にわたり１１０ｒｐｍでインキュベートした。Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ培養物の場合、２０μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ Ｅｎｈａｎｃｅｒ１及び２００μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＥｎｈａｎｃｅｒ２を、トランスフェクション後に、３０ｍｌの細胞培養物に１５～２４時間にわたって加えた。グルコース消費に従って発酵の経過の間にグルコース溶液を加えた。正確に組み立てられたスプリットサイトカイン分子が、標準ＩｇＧのような培養上清中に分泌された。スプリットサイトカイン分子を含有する上清を５～１０日後に回収し、スプリットサイトカイン分子を、上清から直接精製したか、又は上清を－２０℃で凍結し、貯蔵した。
完全Ｆｃ領域（ＣＨ２－ＣＨ３）を有する前駆体ポリペプチドはプロテインＡに結合する。これらの前駆体を、プロテインＡクロマトグラフィーにより、続いてＳＥＣにより精製した。
前駆体ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインを欠き、カッパ軽鎖を含んでいた。したがって、これらの前駆体は、標準的なカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィーを適用することにより精製された。前駆体ポリペプチドは、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するアフィニティークロマトグラフィー及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーにより、細胞培養上清から精製した。
簡潔に述べれば、無菌濾過された細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて平衡化されたＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂に捕捉させ、平衡化緩衝液を用いて洗浄し、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いてｐＨ３．０で溶出した。溶出された前駆体ポリペプチドの画分をプールし、２ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９．０で中和した。前駆体ポリペプチドプールを、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。サイズ排除クロマトグラフィーの場合、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０を用いて平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ｐｇ ＨｉＬｏａｄＴＭ １６／６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラム。イオン交換クロマトグラフィーのために、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ精製から得られたタンパク質試料を、２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０中で１：１０に希釈し、緩衝液Ａ（２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐＴＭ ＳＰ ＨＰイオン交換（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラムにローディングした。０～１００％のグラジエントの緩衝液Ｂ（２０ｍＭのヒスチジン、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）を適用し、異なるタンパク質種を溶出した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる精製後に純度及び完全性を分析した。タンパク質溶液（１３μｌ）を、５μｌ ４ｘ ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２μｌ １０ｘ ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、９５℃に５分間加熱した。試料をＮｕＰＡＧＥ４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にローディングし、Ｎｏｖｅｘ Ｍｉｎｉ－Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、製造者の指示に従って実行した。ゲルを、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅＴＭ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅタンパク質染色剤を使用して染色した。さらに、タンパク質の完全性及び均一性を、分析的サイズ排除クロマトグラフィーを使用して分析した。
（ＣＥ－）ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、すべての予想ポリペプチド鎖が調製物中に存在することが明らかになった；分析的サイズ排除により、調製物の純度が＞９０％であることが確認された。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｈｒｏｍ． Ｂ ８４８（２００７）７９－８７を参照されたい。
実施例４：
Ｔ細胞活性化アッセイによるポリペプチド鎖交換の決定
異なる不安定化変異のポリペプチド鎖の交換に対する影響を評価するために、交換反応を、実施例３において生成した前駆体ポリペプチドを使用して設定した。予想される生成物ポリペプチドの構造が、ＣＨ２ドメインを欠く前駆体ポリペプチドについては図１に、完全Ｆｃドメインを含む前駆体ポリペプチドについては図２に、示されている。ポリペプチド鎖の交換により、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位が形成される。二重特異性抗ＬｅＹ／抗ＣＤ３生成物ポリペプチドの存在を、細胞ベースアッセイにより評価した。
Ｔ細胞活性化アッセイによるポリペプチド鎖交換の決定
異なる不安定化変異のポリペプチド鎖の交換に対する影響を評価するために、交換反応を、実施例３において生成した前駆体ポリペプチドを使用して設定した。予想される生成物ポリペプチドの構造が、ＣＨ２ドメインを欠く前駆体ポリペプチドについては図１に、完全Ｆｃドメインを含む前駆体ポリペプチドについては図２に、示されている。ポリペプチド鎖の交換により、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位が形成される。二重特異性抗ＬｅＹ／抗ＣＤ３生成物ポリペプチドの存在を、細胞ベースアッセイにより評価した。
この鎖の交換反応の有効性に対する異なるＣＨ３接触面変異の影響を、以下の原理に従って、ＬｅＹ発現ＭＣＦ７細胞及びＪｕｒｋａｔレポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｊ１６２１）から構成される細胞ベースレポーターアッセイシステムにおいて評価した：第１及び第２のヘテロ二量体ポリペプチドのＭＣＦ７細胞への結合及びポリペプチド鎖の交換により、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位が形成される。ＣＤ３を発現するＪｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位によって結合され、その結果、Ｊｕｒｋａｔ細胞からルシフェラーゼが発現される。発光を、ＢｉｏＧｌｏ基質の付加後に検出した。
簡潔に述べれば、細胞ベースアッセイを、３８４ウェルプレートにおいて以下のように実行した。１０％のＦＣＳを有するＲＰＭＩ１６４０を、アッセイ培地として使用した。６ｘ１０４個のＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を、合計容量１０μｌで２ｘ１０４ ＭＣＦ７細胞と混合した。前駆体ポリペプチドを、単独で又は２００ｎＭ及び２ｎＭで組み合わせて適用し、最終容量を３０μｌとした。細胞を２０時間細胞培養条件でインキュベートした。２４μｌのＢｉｏｇｌｏを各ウェルに加え、５分間インキュベートした。発光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ＰＲＯリーダー（ＴＥＣＡＮ）で測定した。
（表６）ダミー鎖のＣＨ３ドメイン内に示される不安定化変異（複数可）を含む、実施例３で上記に定義されたＣＨ２ドメインを欠く前駆体ポリペプチドからの、ポリペプチド鎖反応による二重特異性生成物ポリペプチドの形成。結果は２００ｎＭの前駆体ポリペプチド濃度における交換反応から示される。発光有効性は以下のように評価される：＜１０％・・・「－」、１０－２９％・・・「＋」、３０－５０％・・・「＋＋」、＞５０％・・・「＋＋＋」）
（表７）ダミー鎖のＣＨ３ドメイン内に示される不安定化変異（複数可）を含む、実施例３で上記に定義されたＣＨ２ドメインを欠く前駆体ポリペプチドからの、ポリペプチド鎖反応による二重特異性生成物ポリペプチドの形成。結果は２ｎＭの前駆体ポリペプチド濃度における交換反応から示される。発光有効性は以下のように評価される：＜２％・・・「－」、２－４％・・・「＋」、５－１０％・・・「＋＋」、＞１０％・・・「＋＋＋」）
（表８）ダミー鎖のＣＨ３ドメイン内に示される不安定化変異（複数可）を含む、実施例３で上記に定義されたＦｃドメインを含む前駆体ポリペプチドからの、ポリペプチド鎖反応による二重特異性生成物ポリペプチドの形成。結果は２ｎＭの前駆体ポリペプチド濃度における交換反応から示される。発光有効性は以下のように評価される：＜１０％・・・「－」、１０－１９％・・・「＋」、２０－５０％・・・「＋＋」、＞５０％・・・「＋＋＋」）
実施例５：
Ｔ細胞活性化アッセイにより測定した溶液中ポリペプチド鎖交換と細胞上ポリペプチド鎖交換の組み合わせ評価
治療応用のために、望ましくない標的外効果を低減することが望ましい。したがって、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ポリペプチド鎖の交換時に治療的に活性な生成物ポリペプチドを形成するプロドラッグとして、治療的に適用される。ポリペプチド鎖交換の大部分が、好ましくは前駆体ポリペプチドが標的細胞に結合した後にのみ起こり、一方、循環中の自発的ポリペプチド鎖交換が起こらないか、又はごくわずかしか起こらないことが望ましい。このため、標的細胞で抗原結合部位を活性化するために、ポリペプチド鎖交換を受ける間に、溶液中で弱い又は低度のポリペプチド鎖交換を呈する前駆体ポリペプチドが、治療応用のために特に望ましい。したがって、実施例２（溶液中でのポリペプチド鎖交換）及び実施例４（細胞上でのポリペプチド鎖の交換）の結果を整列させた。
Ｔ細胞活性化アッセイにより測定した溶液中ポリペプチド鎖交換と細胞上ポリペプチド鎖交換の組み合わせ評価
治療応用のために、望ましくない標的外効果を低減することが望ましい。したがって、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ポリペプチド鎖の交換時に治療的に活性な生成物ポリペプチドを形成するプロドラッグとして、治療的に適用される。ポリペプチド鎖交換の大部分が、好ましくは前駆体ポリペプチドが標的細胞に結合した後にのみ起こり、一方、循環中の自発的ポリペプチド鎖交換が起こらないか、又はごくわずかしか起こらないことが望ましい。このため、標的細胞で抗原結合部位を活性化するために、ポリペプチド鎖交換を受ける間に、溶液中で弱い又は低度のポリペプチド鎖交換を呈する前駆体ポリペプチドが、治療応用のために特に望ましい。したがって、実施例２（溶液中でのポリペプチド鎖交換）及び実施例４（細胞上でのポリペプチド鎖の交換）の結果を整列させた。
（表９）ダミー鎖のＣＨ３ドメイン内に示される不安定化変異（複数可）を含む前駆体ポリペプチドからのポリペプチド鎖反応による二重特異性生成物ポリペプチドの形成。列はダミーノブポリペプチド中の不安定化変異を示し；行はダミーホールポリペプチド中の不安定化変異を示している。溶液中（実施例２で検出された「ＩＳ」）及び細胞上（ＣＨ２ドメインを欠くポリペプチドについて実施例４で検出された「ＯＣ」）における不安定化変異の各対に関するポリペプチド鎖の交換が示される。ポリペプチド鎖交換の有効性は、次のように評価される：低・・・「－」、弱・・・「＋」、中・・・「＋＋」、高・・・「＋＋＋」）
（表１０）ダミー鎖のＣＨ３ドメイン内に示される不安定化変異（複数可）を含む前駆体ポリペプチドからのポリペプチド鎖反応による二重特異性生成物ポリペプチドの形成。列はダミーノブポリペプチド中の不安定化変異を示し；行はダミーホールポリペプチド中の不安定化変異を示している。溶液中（実施例２で検出された「ＩＳ」）及び細胞上（Ｆｃドメインを有するポリペプチドについて実施例４で検出された「ＯＣ」）における不安定化変異の各対に関するポリペプチド鎖の交換が示される。ポリペプチド鎖交換の有効性は、次のように評価される：低・・・「－」、弱・・・「＋」、中・・・「＋＋」、高・・・「＋＋＋」）
抗原結合部位の細胞上活性化を媒介することができ、溶液中で低～弱のポリペプチド鎖の交換を呈する前駆体ポリペプチドが、治療応用に特に適していると考えられる。
したがって、試験した複数の異なる前駆体ポリペプチドからの、不安定化変異の以下の対を含む前駆体ポリペプチドが、治療応用のためのヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインにおける使用に有望であると考えられる：
（表１１）本発明によるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を有するＣＨ３ドメイン及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインに含まれる不安定化変異
治療応用のためのヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインにおける使用に有望と考えられる、上記に示した不安定化変異の対の中で、以下の不安定化変異の対を有する前駆体ポリペプチドが、低～弱の溶液中ポリペプチド鎖交換を呈するが、Ｔ細胞活性化アッセイにより検出した場合に高い細胞上ポリペプチド鎖交換を媒介した：
（表１２）本発明によるヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を有するＣＨ３ドメイン及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインに含まれる不安定化変異
実施例６：
完全Ｆｃドメインを含むさらなる単一特異性前駆体ポリペプチドの生成
単一特異性前駆体ポリペプチドからの二重特異性抗ビオシチンアミド／抗フルオレセイン抗体の形成を評価するために、図１に示される第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドについて示されたドメイン構成の単一特異性前駆体ポリペプチドを生成した。この実験では、ノブ変異とホール変異は互いの反対の鎖に配置されたことに注意されたい。
完全Ｆｃドメインを含むさらなる単一特異性前駆体ポリペプチドの生成
単一特異性前駆体ポリペプチドからの二重特異性抗ビオシチンアミド／抗フルオレセイン抗体の形成を評価するために、図１に示される第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドについて示されたドメイン構成の単一特異性前駆体ポリペプチドを生成した。この実験では、ノブ変異とホール変異は互いの反対の鎖に配置されたことに注意されたい。
第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗フルオ前駆体」とも呼ぶ）は、配列番号０６のＶＬドメインと配列番号０７のＶＨドメインとを有する、ビオチン誘導体であるフルオレセイン（「フルオ」）に特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。第１の前駆体ポリペプチドは、配列番号０８の軽鎖ポリペプチド（「フルオＬＣ」とも呼ぶ）、配列番号２９の第１の重鎖ポリペプチド（「フルオＨＣ」とも呼ぶ）及び配列番号０５に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を有さない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示す不安定化変異と、Ｃ－タグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミーホール」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含んでいた。
第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド（「抗ビオ前駆体」とも呼ぶ）は、配列番号０１のＶＬドメインと配列番号０２のＶＨドメインとを有するビオシチンアミド（「ビオ」）に特異的に結合するＦａｂ断片を含んでいた。第２の前駆体ポリペプチドは、配列番号０３の軽鎖ポリペプチド（「ビオＬＣ」とも呼ぶ）、配列番号２８の第１の重鎖ポリペプチド（「ビオＨＣ」とも呼ぶ）及び配列番号１０に基づく第２の重鎖ポリペプチド（不安定化変異を有さない塩基性アミノ酸配列を表す）を含み、以下に示す不安定化変異と、Ｃ－タグとを伴っていた。第２の重鎖ポリペプチド（「ダミーノブ」ポリペプチドとも呼ぶ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む。
第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、実施例１に開示される方法に従って生成された。
示されるポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、以下の変異を含む：
（表１３）ＣＨ３ドメインに示される不安定化変異を有するダミーホール鎖を含む抗フルオ前駆体ポリペプチドの精製収率及び単量体含有量（精製収率［ｍｇ／ｍｌ］＝％単量体ピークにより補正された、精製された抗体の量／リットル発現容積；単量体＝所望のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド）
（表１４）ＣＨ３ドメインに示される不安定化変異を有するダミーノブ鎖を含む抗ビオ前駆体ポリペプチドの精製収率及び単量体含有量（精製収率［ｍｇ／ｍｌ］＝％単量体ピークにより補正された、精製された抗体の量／リットル発現容積；単量体＝所望のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド）
実施例７：
実施例６からの前駆体ポリペプチドのポリペプチド鎖交換効率の分析
異なる不安定化変異のポリペプチド鎖交換に対する影響を評価するために、実施例６において生成した前駆体ポリペプチド間の交換反応を実施した。実験は、実施例２に記載の方法に従って実行した。予想される生成物ポリペプチドの構造を図１に示す。
実施例６からの前駆体ポリペプチドのポリペプチド鎖交換効率の分析
異なる不安定化変異のポリペプチド鎖交換に対する影響を評価するために、実施例６において生成した前駆体ポリペプチド間の交換反応を実施した。実験は、実施例２に記載の方法に従って実行した。予想される生成物ポリペプチドの構造を図１に示す。
（表１５）ダミー鎖のＣＨ３ドメイン内に示される不安定化変異（複数可）を含む抗ビオ及び抗フルオ前駆体ポリペプチドからのポリペプチド鎖交換反応による二重特異性生成物ポリペプチドの形成。列は、抗フルオ前駆体のダミーホールポリペプチド中の不安定化変異を示し；行は、抗ビオ前駆体のダミーノブポリペプチド中の不安定化変異を示す。値は、交換効率を生成物収率［％］により示す。実験により得られた収率は、二重特異性抗体の最大可能収率に関係している。単量体のみが組み換えに有効であると予想されるため、二重特異性抗体の最大可能収率は、各反応における２つのそれぞれの入力フォーマットの最も低い％単量体ピークＳＥＣにより補正される。
実施例８：
前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインがノブ・イントゥ・ホール変異を含むがシステイン変異を含まない場合の、完全Ｆｃドメインを含むさらなる単一特異性前駆体ポリペプチドの生成
単一特異性前駆体ポリペプチドからの二重特異性抗ビオシチンアミド／抗フルオレセイン抗体の形成を評価するために、図１に示される第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドについて示されたドメイン構成の単一特異性前駆体ポリペプチドを生成した。この実験では、ノブ変異とホール変異は互いの反対の鎖に配置されたことに注意されたい。
前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインがノブ・イントゥ・ホール変異を含むがシステイン変異を含まない場合の、完全Ｆｃドメインを含むさらなる単一特異性前駆体ポリペプチドの生成
単一特異性前駆体ポリペプチドからの二重特異性抗ビオシチンアミド／抗フルオレセイン抗体の形成を評価するために、図１に示される第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドについて示されたドメイン構成の単一特異性前駆体ポリペプチドを生成した。この実験では、ノブ変異とホール変異は互いの反対の鎖に配置されたことに注意されたい。
実施例５に記載される第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、本明細書に開示される構造及び方法に従って生成した。
さらに、実施例１から逸脱して、ビオＨＣは、配列番号２８に基づいているが、セリン残基を位置３５４に有し、フルオＨＣは、配列番号２９に基づいているが、チロシン残基を位置３４９に有する。したがって、ＣＨ３ドメインの変異は以下のように要約される：
（表１６）前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸置換
示されるポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、以下の変異を含む：
（表１７）ＣＨ３ドメインに示される不安定化変異を有するダミーノブ鎖を含む抗ビオ前駆体ポリペプチドの精製収率及び単量体含有量（精製収率［ｍｇ／ｍｌ］＝％単量体ピークにより補正された、精製された抗体の量／リットル発現容積；単量体＝所望のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド）
（表１８）ＣＨ３ドメインに示される不安定化変異を有するダミーホール鎖を含む抗フルオ前駆体ポリペプチドの精製収率及び単量体含有量（精製収率［ｍｇ／ｍｌ］＝％単量体ピークにより補正された、精製された抗体の量／リットル発現容積；単量体＝所望のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド）
実施例９：
実施例７からの前駆体ポリペプチドのポリペプチド鎖交換効率の分析
異なる不安定化変異のポリペプチド鎖交換に対する影響を評価するために、実施例７において生成した前駆体ポリペプチド間の交換反応を実施した。実験は、実施例２に記載の方法に従って実行した。
実施例７からの前駆体ポリペプチドのポリペプチド鎖交換効率の分析
異なる不安定化変異のポリペプチド鎖交換に対する影響を評価するために、実施例７において生成した前駆体ポリペプチド間の交換反応を実施した。実験は、実施例２に記載の方法に従って実行した。
（表１９）ダミー鎖のＣＨ３ドメイン内に示される不安定化変異（複数可）を含む抗ビオ及び抗フルオ前駆体ポリペプチドからのポリペプチド鎖交換反応による二重特異性生成物ポリペプチドの形成。列は、抗フルオ前駆体のダミーホールポリペプチド中の不安定化変異を示し；行は、抗ビオ前駆体のダミーノブポリペプチド中の不安定化変異を示す。値は、交換効率を生成物収率［％］により示す。実験により得られた収率は、二重特異性抗体の最大可能収率に関係している。単量体のみが組み換えに有効であると予想されるため、二重特異性抗体の最大可能収率は、各反応における２つのそれぞれの入力フォーマットの最も低い％単量体ピークＳＥＣにより補正される。
結果は、ポリペプチド鎖の交換がヘテロ二量体前駆体ポリペプチドについて検出可能であり、ノブ・イントゥー・ホール変異が追加のシステイン変異により安定化されないことを実証している。
実施例１０：
前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインに異なる変異を有する、完全Ｆｃドメインを含むさらなる単一特異性前駆体ポリペプチドの生成
単一特異性前駆体ポリペプチドからの二重特異性抗ビオシチンアミド／抗フルオレセイン抗体の形成を評価するために、図１に示される第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドについて示されたドメイン構成の単一特異性前駆体ポリペプチドを生成した。この実験では、ノブ変異とホール変異は互いの反対の鎖に配置されたことに注意されたい。
前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメインに異なる変異を有する、完全Ｆｃドメインを含むさらなる単一特異性前駆体ポリペプチドの生成
単一特異性前駆体ポリペプチドからの二重特異性抗ビオシチンアミド／抗フルオレセイン抗体の形成を評価するために、図１に示される第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドについて示されたドメイン構成の単一特異性前駆体ポリペプチドを生成した。この実験では、ノブ変異とホール変異は互いの反対の鎖に配置されたことに注意されたい。
実施例６に記載される第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドを、本明細書に開示される構造及び方法に従って、但し以下の差を有するように生成した：
実施例６から逸脱して、フルオレセインに特異的に結合する３つの前駆体ポリペプチドが生成された。ここではフルオＨＣは配列番号２９基づき、ダミーホールポリペプチドは配列番号０５に基づき、以下のＣＨ３変異を有する：
－実施例１から逸脱して、ビオシチンアミドに特異的に結合する３つの前駆体ポリペプチドが生成された。ここでは、ビオＨＣは配列番号２８基づき、ダミーノブポリペプチドは配列番号１０に基づき、以下のＣＨ３変異を有する：
（表２０）示される前駆体ポリペプチドの精製収率及び単量体含有量（精製収率［ｍｇ／ｍｌ］＝％単量体ピークにより補正された、精製された抗体の量／リットル発現容積；単量体＝所望のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド）
実施例１１：
実施例１０からの前駆体ポリペプチドのポリペプチド鎖交換効率の分析
異なる不安定化変異のポリペプチド鎖交換に対する影響を評価するために、実施例１０において生成した前駆体ポリペプチド間の交換反応を実施した。実験は、実施例２に記載の方法に従って実行した。
実施例１０からの前駆体ポリペプチドのポリペプチド鎖交換効率の分析
異なる不安定化変異のポリペプチド鎖交換に対する影響を評価するために、実施例１０において生成した前駆体ポリペプチド間の交換反応を実施した。実験は、実施例２に記載の方法に従って実行した。
（表２１）示される抗ビオ及び抗フルオ前駆体ポリペプチドからのポリペプチド鎖交換反応による二重特異性生成物ポリペプチドの形成値は、交換効率を生成物収率［％］により示す。実験により得られた収率は、二重特異性抗体の最大可能収率に関係している。単量体のみが組み換えに有効であると予想されるため、二重特異性抗体の最大可能収率は、各反応における２つのそれぞれの入力フォーマットの最も低い％単量体ピークＳＥＣにより補正される。
結果は、システイン変異をダミー鎖ポリペプチド又は抗原結合部分を含むポリペプチド鎖のいずれに配置するかに関係なく、ポリペプチド鎖が生じることを示している。
Claims (17)
- 以下を含む、ヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組：
－ ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第１の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド、及び
－ ＣＨ３ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドであって、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖がＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含み、
ここで、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは第２の抗原結合部分を含み、第２の抗原結合部分の少なくとも一部が、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖の一方に配置されている、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド、
ここで、
Ａ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含むか、又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第１の抗原結合部分の少なくとも一部を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド内において、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖は第２の抗原結合部分の少なくとも一部を含み；
Ｂ）
ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合するか；又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＨドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドは、ＶＬドメインとＣＨ３ドメインとを含む１つのポリペプチド鎖を含み、前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの対に会合すると、抗原に特異的に結合し、
Ｃ）
ｉ）ノブ変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びホール変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、又は
ｉｉ）ホール変異を含む、第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン、及びノブ変異を含む、第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのＣＨ３ドメイン
は、番号付けがカバット番号付けシステムによる以下のアミノ酸置換を含んでいる：
－ ホール変異を有するＣＨ３ドメインは、
・正に帯電したアミノ酸でのＥ３５７の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＳ３６４の置き換え；
・疎水性アミノ酸でのＡ３６８の置き換え；及び
・疎水性アミノ酸でのＶ４０７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
－ ノブ変異を有するＣＨ３ドメインは、
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３７０の置き換え、及び負に帯電したアミノ酸でのＫ４３９の置き換え；
・負に帯電したアミノ酸でのＫ３９２の置き換え；並びに
・疎水性アミノ酸でのＶ３９７の置き換え
の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。 - Ｃ）に示される、ノブ変異を含むＣＨ３ドメイン及びホール変異を含むＣＨ３ドメインが、以下の表：
に示される群から選択されるアミノ酸置換のうちの１つを含む、請求項１に記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
- Ｃ）に示される、ノブ変異を含むＣＨ３ドメイン及びホール変異を含むＣＨ３ドメインが、以下の表：
に示される群から選択されるアミノ酸置換のうちの１つを含む、請求項１に記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
- Ｃ）に示される、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインが、変異Ｅ３５７Ｋを含む場合に、Ｃ）に示される、ホール変異を有するＣＨ３ドメインが、変異Ｋ３７０Ｅを含まない、前記請求項のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
- ｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含むか、又は
ｉｉ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのホール変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含み、且つ第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドのノブ変異を含むＣＨ３ドメインがシステイン変異を含む、
前記請求項のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。 - 第１の抗原結合部分及び／又は第２の抗原結合部分が抗体断片である、前記請求項のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。
- ａ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインが互いに会合して標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、
前記請求項のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。 - ａ）第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第２の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第１の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１の重鎖ポリペプチドの第２の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第２の重鎖ポリペプチドであって、第１の重鎖ポリペプチドと第２の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第２の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第１のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインが互いに会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｂ）第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＨドメインと、ＣＨ１ドメインと、ＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される第３の抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第３の重鎖ポリペプチド、
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第３の重鎖ポリペプチドの第３の抗体可変ドメインと会合することのできる抗体可変ドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む第４の重鎖ポリペプチドであって、第３の重鎖ポリペプチドと第４の重鎖ポリペプチドがＣＨ３ドメインを介して互いに会合してヘテロ二量体を形成しており、ＣＨ３ドメインの一方がノブ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインがホール変異を含む、第４の重鎖ポリペプチド；及び
－ Ｎ末端からＣ末端の方向に、第２のＶＬドメインとＣＬドメインとを含む軽鎖ポリペプチドであって、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインが互いに会合して標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、前記軽鎖ポリペプチド
を含み；
ｃ）ｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含むか；又はｉｉ）第１の重鎖ポリペプチドが、ホール変異を含むＣＨ３ドメインを含み、且つ第３の重鎖ポリペプチドが、ノブ変異を含むＣＨ３ドメインを含み；
ｄ）第１の重鎖ポリペプチド及び第３の重鎖ポリペプチドの可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる
前記請求項のいずれか一項に記載のヘテロ二量体ポリペプチドの組。 - Ｂ）に示されるＶＨドメインとＶＬドメインが、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、前記請求項のいずれか一項に記載のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組。
- 第１及び第２のヘテロ二量体ポリペプチドの、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されない、前記請求項のいずれか一項に記載のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組。
- 第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖と、第２のヘテロ二量体ポリペプチドからのＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖とを含む第３のヘテロ二量体ポリペプチドを形成するために、請求項１～１０のいずれか一項に記載の第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドと第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドとを接触させることを含む、ヘテロ二量体ポリペプチドを生成するための方法。
- 第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドが、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含み、第３のヘテロ二量体ポリペプチドが、第１の抗原に特異的に結合する抗原結合部分と第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部分とを含み、第３の抗原結合部分が、Ｂ）に示されるＶＬドメインとＶＨドメインによって形成される、請求項１１に記載の方法。
- 第１及び第２のヘテロ二量体ポリペプチドの、ＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されず、前記接触させることが還元剤の非存在下で実施される、請求項１１又は１２に記載の方法。
- 請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法により得られるヘテロ二量体ポリペプチド。
- 請求項１～１０のいずれか一項に記載の第１のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド。
- 請求項１～１０のいずれか一項に記載の第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド。
- 第１及び第２のヘテロ二量体前駆体ポリペプチド中で、Ｂ）に示されるＶＨドメインとＶＬドメインが、がんの治療における使用のための、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる、請求項１～１０のいずれか一項に記載のヘテロ二量体前駆体ポリペプチドの組。
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