CN113924314B - 通过多肽链交换活化的治疗性多特异性多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一组异二聚体多肽及其在治疗中的用途，例如用于治疗癌症。
Description
技术领域
本发明涉及一组异二聚体多肽及其用途，例如用于通过多肽链交换产生多特异性抗原结合物。
背景技术
通过靶向在癌症和T细胞表面表达的抗原的双特异性抗体进行癌症治疗，例如通过CD3，从而介导对癌细胞的ADCC提供剂量挑战，这是由于不希望的脱靶T细胞活化。
EP3180361公开了前体分子，其中与CD3特异性结合的结合位点在靶细胞上被活化。此类前体分子包含Fab片段，其中CH2结构域和可变抗体结构域(例如与CD3结合)融合到所述Fab片段的C末端。在靶细胞与两个包含不同可变结构域的前体分子结合后，功能性抗原结合位点(例如与CD3结合)通过所述可变结构域的缔合形成。
Labrijn,A.F.等人公开了通过受控的Fab臂交换有效产生稳定的双特异性IgG1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(2013)5145-5150)。简而言之，使在CH3结构域中具有点突变的IgG样结构域布置的两个单特异性前体分子接触以进行多肽链交换，以形成双特异性产物分子，其也是IgG样结构域布置。
未公布的现有技术PCT/EP2018/078675和PCT/EP2018/079523公开了通过多肽链交换从两种不同的前体分子产生多特异性抗原结合物的方法。两种前体分子都是不对称结构域布置的异二聚体多肽。两种前体分子都包含根据“杵入臼”技术(WO 96/027011,Ridgway,J.B.,et al.,Protein Eng.9(1996)617-621；and Merchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681)修饰的CH3结构域并包含以不对称模式布置的进一步去稳定突变。在每个前体分子中，只有一个CH3结构域包含这种去稳定突变。多肽链交换后，形成两个产物分子，其中每个产物分子包含来自每个前体分子的多肽。前体分子和产物分子具有不同的结构域布置。PCT/EP2018/078675和PCT/EP2018/079523公开了待取代前体分子的CH3/CH3界面中的氨基酸位置。
然而，仍然需要在治疗中通过多肽链交换产生多特异性抗原结合剂的其他方法。
发明内容
本发明涉及一组异二聚体前体多肽，其包含：
-第一异二聚体前体多肽，其包含至少两条包含CH3结构域的多肽链，其中所述两条包含CH3结构域的多肽链通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变，
其中所述第一异二聚体前体多肽包含第一抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分的至少一部分布置在所述两条包含CH3结构域的多肽链之一上，和
-第二异二聚体前体多肽，其包含至少两条包含CH3结构域的多肽链，其中所述两条包含CH3结构域的多肽链通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变，
其中所述第二异二聚体前体多肽包含第二抗原结合部分，其中所述第二抗原结合部分的至少一部分布置在所述两条包含CH3结构域的多肽链之一上；
其中
A)或者i)在所述第一异二聚体前体多肽内，包含含有杵突变的CH3结构域的多肽链包含所述第一抗原结合部分的至少一部分，并且在所述第二异二聚体前体多肽内，包含具有臼突变的CH3结构域的多肽链包含所述第二抗原结合部分的至少一部分，或者ii)在所述第一异二聚体前体多肽内，包含含有臼突变的CH3结构域的多肽链包含所述第一抗原结合部分的至少一部分，并且在所述第二异二聚体前体多肽内，包含具有杵突变的CH3结构域的多肽链包含所述第二抗原结合部分的至少一部分；并且其中
B)或者i)所述第一异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中所述第二异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；或者ii)所述第一异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中所述第二异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；并且其中
C)或者
i)包含杵突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含臼突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域，或者
ii)包含臼突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含杵突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域
包含以下氨基酸取代，其中根据Kabat编号系统进行编号：
-具有臼突变的CH3结构域包含至少一个选自下组的氨基酸取代：
o用带正电荷的氨基酸替换E357；
o用疏水性氨基酸替换S364；
o用疏水性氨基酸替换A368；和
o用疏水性氨基酸替换V407；和
-任选地，具有杵突变的CH3结构域包含至少一个选自下组的氨基酸取代：
o用带负电荷的氨基酸替换K370；
o用带负电荷的氨基酸替换K370，并用带负电荷的氨基酸替换K439；
o用带负电荷的氨基酸替换K392；和
o用疏水性氨基酸替换V397。
本发明的一个实施例涉及本发明的所述一组异二聚体多肽，其中或者i)包含所述第一异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，或者ii)包含所述第一异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变。
本发明的一个实施例涉及本发明的所述一组异二聚体多肽，其中所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分是抗体片段。
本发明的一个实施例涉及本发明的异二聚体多肽组，其中第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含铰链区，并且其中第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽不包含铰链区的链间二硫键。
本发明的一个实施例涉及本发明的异二聚体多肽组，其中B)中指示的VH结构域和VL结构域能够形成与CD3特异性结合的抗原结合位点。
本发明的另一方面是产生异二聚体多肽的方法，其包括使根据本发明的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽接触以形成第三异二聚体多肽，其包含至少一条包含来自所述第一异二聚体前体多肽的CH3结构域的多肽链，和至少一条包含来自所述第二异二聚体多肽的CH3结构域的多肽链。
本发明的一个实施例涉及产生本发明的异二聚体多肽的方法，其中第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含铰链区，并且其中第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽不包含铰链区的链间二硫键；并且其中接触在不存在还原剂的情况下进行。
本发明的一个实施例涉及产生本发明的异二聚体多肽的方法，其中第二异二聚体前体多肽包含与第二抗原特异性结合的抗原结合部分，并且其中第三异二聚体多肽包含与第一抗原特异性结合的抗原结合部分，和与第二抗原特异性结合的抗原结合部分，并且第三抗原结合部分由B)中指示的VL结构域和VH结构域形成。
本发明的另一方面是通过根据本发明的方法获得的异二聚体多肽。
本发明的另一方面是用作药物的根据本发明的所述一组异二聚体前体多肽。
本发明的另一方面是根据本发明的异二聚体前体多肽组，其中在第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽中，B)中指示的VH结构域和VL结构域能够形成与CD3特异性结合的抗原结合位点，用于用于治疗癌症。
通过本文公开的发明，提供了能够进行多肽链交换以形成产物多肽的前体多肽。因此，可以产生多特异性抗原结合多肽。多特异性抗原结合多肽的产生涉及由于多肽链交换而活化抗原结合位点，导致与抗原特异性结合的抗体可变结构域的缔合。此外，多特异性抗原结合多肽在包含与不同抗原特异性结合的抗原结合部分的两个前体多肽之间组合和多肽链交换后形成。
本发明的方法和多肽组可以有利地用于提供用于治疗用途的抗原结合多肽；例如用于治疗癌症。
本发明的前体多肽组的治疗应用允许在靶位点产生所需的产物多肽，从而减少不期望的产物多肽的脱靶效应。
附图说明
图1：异二聚体前体多肽和在多肽链交换后形成的相应产物多肽的示例性结构，其中多肽链交换导致抗原结合位点的活化。第一异二聚体前体多肽包含三条多肽链：1.第一重链多肽，其从N末端到C末端方向包含抗体结构域VH、CH1、肽连接体、源自第一抗体的VH结构域和CH3。CH3结构域包含杵突变并且不包含去稳定突变。2.第二重链多肽，其从N末端到C末端方向包含以下抗体结构域：源自第二抗体的VL结构域和CH3。CH3结构域包含臼突变和去稳定突变。3.轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含抗体结构域VL和CL。来自第一重链多肽的N末端VH结构域和来自轻链多肽的VL结构域形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。第一异二聚体前体多肽的重链多肽通过其CH3结构域相互缔合。在第一重链多肽和第二重链多肽之间没有形成链间二硫键。在源自第一抗体的VH结构域和源自第二重链多肽的VL结构域之间形成一对VH结构域和VL结构域。两个可变结构域相互缔合，但不形成与抗原特异性结合的结合位点。第二异二聚体前体多肽包含三条多肽链：1.第一重链多肽，其从N末端到C末端方向包含抗体结构域VH、CH1、肽连接体、源自第一抗体的VL结构域和CH3。CH3结构域包含臼突变并且不包含去稳定突变。2.第二重链多肽，其从N末端到C末端方向包含以下抗体结构域：源自第三抗体的VH结构域和CH3。CH3结构域包含杵突变和去稳定突变。3.轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含抗体结构域VL和CL。第一重链多肽的N末端VH结构域和来自轻链多肽的VL结构域形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。第二异二聚体前体多肽的重链多肽通过其CH3结构域相互缔合。在第一重链多肽和第二重链多肽之间没有形成链间二硫键。在源自第一抗体的VL结构域和源自第二重链多肽的VH结构域之间形成一对VH结构域和VL结构域。两个可变结构域相互缔合，但不形成与抗原特异性结合的结合位点。多肽链交换后，形成异二聚体产物多肽。第一产物多肽包含两个来自前体多肽的抗原结合位点，即来自第一异二聚体前体多肽的抗原结合位点和来自第二异二聚体前体多肽的抗原结合位点。第一产物多肽包含来自第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽的第一重链多肽，它们通过其CH3结构域缔合。第一产物多肽内包含的两种重链多肽都包含不包含去稳定突变的CH3结构域。通过来自第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽的第一重链多肽的缔合，形成了一对源自第一抗体的VH结构域和源自第一抗体的VL结构域，它们形成了与第一抗原特异性结合的抗原结合位点。该抗原结合位点不存在于任何前体多肽内，并且仅在多肽链交换后形成(活化)。第二产物多肽包含来自第一异二聚体前体多肽的第二重链多肽和来自第二异二聚体前体多肽的第二重链多肽。两种重链多肽均通过其CH3结构域缔合。两个CH3结构域都包含去稳定突变，它们相互作用并支持异二聚体产物多肽的形成。通过来自第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽的第二重链多肽的缔合，形成了一对新的VH结构域和VL结构域。两个可变结构域都在第二产物多肽内缔合。
图2：异二聚体前体多肽和在多肽链交换后形成的相应产物多肽的示例性结构，其中多肽链交换导致抗原结合位点的活化。第一异二聚体前体多肽包含三条多肽链：1.第一重链多肽，其从N末端到C末端方向包含抗体结构域VH、CH1、肽连接体、源自第一抗体的VH结构域、CH2和CH3。CH3结构域包含杵突变并且不包含去稳定突变。2.第二重链多肽，其从N末端到C末端方向包含以下抗体结构域：源自第二抗体的VL结构域、CH2和CH3。CH3结构域包含臼突变和去稳定突变。3.轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含抗体结构域VL和CL。来自第一重链多肽的N末端VH结构域和来自轻链多肽的VL结构域形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。第一异二聚体前体多肽的重链多肽通过其CH3结构域相互缔合。在第一重链多肽和第二重链多肽之间没有形成链间二硫键。在源自第一抗体的VH结构域和源自第二重链多肽的VL结构域之间形成一对VH结构域和VL结构域。两个可变结构域相互缔合，但不形成与抗原特异性结合的结合位点。第二异二聚体前体多肽包含三条多肽链：1.第一重链多肽，其从N末端到C末端方向包含抗体结构域VH、CH1、肽连接体、源自第一抗体的VL结构域、CH2和CH3。CH3结构域包含臼突变并且不包含去稳定突变。2.第二重链多肽，其从N末端到C末端方向包含以下抗体结构域：源自第三抗体的VH结构域、CH2和CH3。CH3结构域包含杵突变和去稳定突变。3.轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含抗体结构域VL和CL。第一重链多肽的N末端VH结构域和来自轻链多肽的VL结构域形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。第二异二聚体前体多肽的重链多肽通过其CH3结构域相互缔合。在第一重链多肽和第二重链多肽之间没有形成链间二硫键。在源自第一抗体的VL结构域和源自第二重链多肽的VH结构域之间形成一对VH结构域和VL结构域。两个可变结构域相互缔合，但不形成与抗原特异性结合的结合位点。多肽链交换后，形成异二聚体产物多肽。第一产物多肽包含两个来自前体多肽的抗原结合位点，即来自第一异二聚体前体多肽的抗原结合位点和来自第二异二聚体前体多肽的抗原结合位点。第一产物多肽包含来自第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽的第一重链多肽，它们通过其CH3结构域缔合。第一产物多肽内包含的两种重链多肽都包含不包含去稳定突变的CH3结构域。通过来自第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽的第一重链多肽的缔合，形成了一对源自第一抗体的VH结构域和源自第一抗体的VL结构域，它们形成了与第一抗原特异性结合的抗原结合位点。该抗原结合位点不存在于任何前体多肽内，并且仅在多肽链交换后形成(活化)。第二产物多肽包含来自第一异二聚体前体多肽的第二重链多肽和来自第二异二聚体前体多肽的第二重链多肽。两种重链多肽均通过其CH3结构域缔合。两个CH3结构域都包含去稳定突变，它们相互作用并支持异二聚体产物多肽的形成。通过来自第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽的第二重链多肽的缔合，形成了一对新的VH结构域和VL结构域。两个可变结构域都在第二产物多肽内缔合。
图3：第一异二聚体前体多肽的示例性结构域布置。杵入臼突变、不稳定突变和半胱氨酸突变的描述与图1和图2中的相同。前体多肽可包含一个或多个抗原结合位点，其可布置在C末端或N末端。虽然图像指示包含Fab片段的前体多肽，但应理解前体多肽可包含其他合适的抗原结合部分。半胱氨酸突变的描述是示例性的，但在本发明的前体多肽内不是强制性的。A)具有可活化结合位点，包含N末端Fab片段和VH结构域的前体多肽。B)具有可活化结合位点，包含C末端和N末端Fab片段和VH结构域的前体多肽。C)具有可活化结合位点，包含C末端Fab片段和VH结构域的前体多肽。D)具有可活化结合位点，包含N末端Fab片段和VL结构域的前体多肽。E)具有可活化结合位点，包含含有N末端Fab片段和VH结构域的CH2结构域的前体多肽。F)具有可活化结合位点，包含含有N末端和C末端Fab片段和VH结构域的CH2结构域的前体多肽。G)具有可活化结合位点，包含含有C末端Fab片段和VH结构域的CH2结构域的前体多肽。H)具有C末端可活化结合位点，包含含有N末端Fab片段和VH结构域的CH2结构域的前体多肽。
图4：第二异二聚体前体多肽的示例性结构域布置。杵入臼突变、不稳定突变和半胱氨酸突变的描述与图1和图2中的相同。前体多肽可包含一个或多个抗原结合位点，其可布置在C末端或N末端。虽然图像指示包含Fab片段的前体多肽，但应理解前体多肽可包含其他合适的抗原结合部分。半胱氨酸突变的描述是示例性的，但在本发明的前体多肽内不是强制性的。A)具有可活化结合位点，包含N末端Fab片段和VL结构域的前体多肽。B)具有可活化结合位点，包含C末端和N末端Fab片段和VL结构域的前体多肽。C)具有可活化结合位点，包含C末端Fab片段和VL结构域的前体多肽。D)具有可活化结合位点，包含N末端Fab片段和VH结构域的前体多肽。E)具有可活化结合位点，包含含有N末端Fab片段和VL结构域的CH2结构域的前体多肽。F)具有可活化结合位点，包含含有N末端和C末端Fab片段和VL结构域的CH2结构域的前体多肽。G)具有可活化结合位点，包含含有C末端Fab片段和VL结构域的CH2结构域的前体多肽。H)具有C末端可活化结合位点，包含含有N末端Fab片段和VL结构域的CH2结构域的前体多肽。
具体实施方式
1.定义
除非本文另有定义，否则与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。本公开的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行。通常，与本文所述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的术语和技术是本领域公知的和常用的。
除非上下文另外清楚指出，否则术语“一个”、“一种”、“所述”一般包含复数指代。
除非本文另有定义，否则术语“包括”应包括术语“由……组成”。
除非上下文另有明确说明，否则使用术语“或者……或”提供两种替代方案是指相互排斥的替代方案。
如本文所用，术语“抗原结合部分”是指与靶抗原特异性结合的部分。该术语包括能够与靶抗原特异性结合的抗体以及其他天然的(例如受体、配体)或合成的(例如DARPin)分子。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用，术语“结合位点”或“抗原结合位点”表示抗原实际结合的抗原结合部分的一个或多个区域。在抗原结合部分是抗体的情况下，抗原结合位点包括抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)，或VH/VL对。源自与靶抗原特异性结合的抗体的抗原结合位点可源自a)与抗原特异性结合的已知抗体或b)新的抗体或抗体片段，其通过使用抗原蛋白或核酸或其片段的从头免疫方法，或通过噬菌体展示方法获得。
当源自抗体时，根据本发明的抗体的抗原结合位点可包含六个互补决定区(CDR)，其在不同程度上对抗原结合位点的亲和力有贡献。有三个重链可变结构域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。CDR和框架区(FR)的范围通过与氨基酸序列的汇编数据库进行比较来确定，在该数据库中，已根据序列之间的变异性定义了那些区域。本发明范围内还包括由较少CDR组成的功能性抗原结合位点(即，其中结合特异性由三个、四个或五个CDR决定)。例如，少于一组完整的6个CDR可能足以用于结合。
如本文所用，术语“价”表示抗体分子中存在指定数目的抗原结合位点。例如，天然抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此，术语“三价”表示抗体分子中存在三个结合位点。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv、scFab)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“特异性”是指抗原结合部分(例如抗体)对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体为单特异性的。如本文所用，术语“单特异性抗体”表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点与相同抗原的相同表位结合。“多特异性抗体”结合两个或更多个不同的表位(例如，两个、三个、四个或更多个不同的表位)。表位可以在相同或不同的抗原上。多特异性抗体的一个实例是结合两个不同表位的“双特异性抗体”。当抗体具有不止一种特异性时，识别的表位可能与单一抗原或不止一种抗原缔合。
表位是与抗原结合部分(例如抗体)结合的抗原区域。术语“表位”包括能够与抗体或抗原结合部分特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施例中，表位决定簇包括分子诸如氨基酸的化学活性表面基团、聚糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施例中，可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
如本文所用，术语“结合”和“特异性结合”是指在体外测定中，优选地在使用纯化的野生型抗原进行的等离子体共振测定(GE-Healthcare Uppsala，Sweden)中，抗体或抗原结合部分与抗原表位的结合。在某些实施例中，当抗体或抗原结合部分优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原时，该抗体或抗原结合部分被称为特异性结合抗原。
抗体与抗原结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合速率常数)、kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义。在一个实施例中，结合或特异性地结合是指10-8mol/l或更小的结合亲和力(KD)，在一个实施例中为10-8M至10-13mol/l。因此，抗原结合部分，特别是抗体结合位点以10-8mol/l或更小的结合亲和力(KD)特异性地结合其特异性的每种抗原，例如，结合亲和力(KD)为10-8至10-13mol/l。在一个实施例中，结合亲和力(KD)为10-9mol/l至10-13mol/l。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见例如，Kindt等人，KubyImmunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
本申请内使用的术语“恒定结构域”或“恒定区”表示除可变区之外的抗体结构域的总和。恒定区不直接参与抗原的结合，但表现出多种效应子功能。
根据其重链的恒定区的氨基酸序列不同，将抗体分为以下“类别”：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类，诸如IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的抗体的重链恒定区分别称为α,δ,ε,γ和μ。可以在所有五种抗体类别中找到的轻链恒定区(CL)称为κ(卡帕)和λ(兰姆达)。
如本文所用的“恒定结构域”优选来自人源，其来自亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区。这种恒定结构域和区在现有技术中是众所周知的，例如Kabat等人《免疫学兴趣蛋白质序列(第五版》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))。
在野生型抗体中，“铰链区”是IgG和IgA免疫球蛋白类重链中央部分的柔性氨基酸段，其通过二硫键连(即“链间二硫键”，因为它们在两条重链之间形成)接两条重链。人IgG1的铰链区通常定义为从人IgG1的约Glu216或约Cys226延伸至约Pro230(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。通过删除铰链区中的半胱氨酸残基或将铰链区中的半胱氨酸残基取代为其他氨基酸，如丝氨酸，避免了铰链区中二硫键的形成。
来自任何脊椎动物物种抗体(免疫球蛋白)的“轻链”基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归为两种不同的类型中的一种，这两种类型分别称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。野生型轻链通常包含两个免疫球蛋白结构域，通常是一个对于结合至抗原而言很重要的可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。
存在几种不同类型的“重链”，它们定义了抗体的类别或同种型。野生型重链包含一系列免疫球蛋白结构域，通常具有一个对于结合至抗原而言很重要的可变结构域(VH)和几个恒定结构域(CH1、CH2、CH3等)。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从大致231位的氨基酸残基延伸至大致340位的氨基酸残基。多特异性抗体没有CH2结构域。“没有CH2结构域”是指根据本发明的抗体不包含CH2结构域。
“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C末端的一段残基(即，从IgG的约341位的氨基酸残基到约447位的氨基酸残基)。本文的“CH3结构域”是变体CH3结构域，其中天然CH3结构域的氨基酸序列经历了至少一个不同的氨基酸取代(即CH3结构域的氨基酸序列的修饰)以促进多特异性抗体中彼此面对的两个CH3结构域的异二聚化。
通常，在本领域已知的异二聚化方法中，一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域均以互补方式工程化，使得包含一个工程化CH3结构域的重链不再与另一条相同结构的重链同二聚化。因此，包含一个工程化改造CH3结构域的重链被迫与包含以互补方式工程化的CH3结构域的其它重链异二聚化。
本领域中已知的一种异二聚化方法是所谓“杵入臼”技术，其提供几个实例详细描述于例如WO 96/027011,Ridgway,J.B.,et al.,Protein Eng.9(1996)617-621；Merchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；和WO 98/050431，其通过引用包括在本文中。在“杵入臼”技术中，在抗体三级结构中两个CH3结构域之间形成的界面内，每个CH3结构域上的特定氨基酸被工程化以在一个CH3结构中产生突起(“杵”)并在另一个CH3结构域中产生空腔(“臼”)。在多特异性抗体的三级结构中，在一个CH3结构域中引入的突起可定位在另一个CH3结构域中引入的空腔中。
结合根据杵入臼技术的取代，另外的链间二硫键可以引入到CH3结构域中以进一步稳定异二聚化多肽(Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16(1998)677-681)。例如通过将以下氨基酸取代引入CH3结构域以形成这种链间二硫键：在一个CH3结构域中的D399C和在另一个CH3结构域中的K392C；在一个CH3结构域中的Y349C和在另一个CH3结构域中的S354C；在一个CH3结构域中的Y349C和在另一个CH3结构域中的E356C；在一个CH3结构域中的Y349C和在另一个CH3结构域中的E357C；在一个CH3结构域中的L351C和在另一个CH3结构域中的S354C；在一个CH3结构域中的T394C和在另一个CH3结构域中的V397C。如本文所用，“半胱氨酸突变”是指CH3结构域中的氨基酸被半胱氨酸取代的氨基酸，其能够与另一个匹配的第二CH3结构域中的氨基酸被半胱氨酸取代的氨基酸形成链间二硫键。
除了之前提到的“杵入臼”技术之外，用于修饰CH3结构域以执行异二聚化的其他技术是本领域已知的。这些技术，尤其是在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的技术，在本文中被认为是本发明提供的多肽的“杵入臼技术”的替代方案。所有这些技术都涉及通过引入相反电荷或不同侧链体积的氨基酸以互补方式工程化CH3结构域，从而支持异二聚化。
如本文所用，术语“多肽链”是指包含大量通过肽键连接在一起的氨基酸的线性有机聚合物。一个或多个多肽链形成“多肽”或“蛋白质”，其中这两个术语在本文中可互换使用。根据本发明的一组中提供的异二聚体前体多肽包含至少两条包含CH3结构域的多肽链。因此，包含第一CH3结构域的第一多肽链与包含第二CH3结构域的第二多肽链“缔合”以形成二聚体多肽。由于第一CH3结构域和第二CH3结构域包含根据杵入臼技术的氨基酸取代，两条多肽链形成“异二聚体”，即由两种不同的多肽形成的二聚体。
异二聚体多肽内包含的多肽链，即异二聚体前体多肽和异二聚体产物多肽，包含一个或两个多肽结构域。当在本文中指明多肽结构域的顺序时，以N末端至C末端方向指明。
每个异二聚体前体多肽包含至少两条包含CH3结构域的多肽链。
在两个异二聚体前体多肽内存在的抗原结合部分是抗体衍生的抗原结合位点，例如抗体片段的情况下，包含CH3结构域的多肽链在本文中也称为“重链多肽”。在这种情况下，异二聚体前体多肽还可以包含“轻链多肽”，通常包含抗体可变结构域和抗体恒定结构域，例如VL和CL。
本发明提供包含至少两种多肽的组。该组包含至少两种异二聚体“前体”多肽。当使前体多肽反应以进行彼此的多肽链交换后，形成“产物”多肽。本发明还提供了通过使至少两种异二聚体前体多肽接触来产生异二聚体多肽，即异二聚体产物多肽的方法。接触步骤可以在任何合适的允许多肽链交换的条件下进行，优选在合适的缓冲溶液中进行。当在本文中提及与本发明相关时，“多肽链交换”是指包含两个异二聚体(前体)多肽之间的CH3结构域的多肽链的交换。当包含来自前体多肽的CH3结构域的两条最初缔合的多肽链解离，并且至少一条解离的多肽链通过与同样解离的包含来自另一种前体多肽的CH3结构域缔合形成新的异二聚体时，多肽链交换发生。多肽链交换的机制也如图1和图2所示。
“分离的”异二聚体多肽，例如抗体，是已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些实施例中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置是根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号的。特别地，对于κ和λ同种型的可变结构域和轻链恒定结构域CL，使用Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号系统(参见647-660页)，对于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，使用Kabat EU索引编号系统(参见661-723页)。本文提供的氨基酸位置通常由
多肽链内的氨基酸“取代”或“替换”或“突变”(所有术语在本文中可互换使用)通过将合适的核苷酸变化引入抗体DNA或通过核苷酸合成来制备。但是，此类修饰只能在非常有限的范围内进行。例如，修饰不会改变上述抗体特征，诸如IgG同种型和抗原结合，但可以进一步提高重组生产的产率、蛋白质稳定性或促进纯化。在某些实施例中，提供了具有一或多个保守性氨基酸取代的抗体变体。如本文所提及的“双突变”是指在各自的多肽链中存在两个指定的氨基酸取代。
如本文所用的术语“氨基酸”表示具有位于羧基基团的α-位的氨基部分的有机分子。氨基酸的实例包括精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸。在各种情况下采用的氨基酸任选地为L型氨基酸。术语“带正电”或“带负电”氨基酸是指在pH 7.4时氨基酸侧链的电荷。可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性；正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Tyr、Phe；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性或带负电荷：Asp、Glu；
(4)碱性或带正电荷：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro。
表–具有特定性质的氨基酸
如本文所用，“标记部分”是出于各种目的(例如以支持纯化)遗传接枝到多肽链上的肽序列。在一个实施例中，标记部分是亲和标签。因此，包含所述亲和标签的多肽可以通过适当的亲和技术(例如通过亲和色谱)纯化。通常，标记部分通过肽连接体融合到CH3结构域的C末端。通常，肽连接体由柔性的氨基酸残基(如甘氨酸和丝氨酸)组成。因此，用于将标记部分融合到多肽的典型肽连接体是甘氨酸-丝氨酸连接体，即由甘氨酸和丝氨酸残基模式组成的肽连接体。
如本文所用，术语“纯化的”是指从其天然环境或从重组生产来源移除或以其他方式分离的，并且至少60％，例如至少80％，不含与其自然缔合的其他组分(例如膜和微粒体)的多肽。进行抗体纯化(从宿主细胞培养物中回收抗体)以通过标准技术消除细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)，所述标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域中熟知的其他技术。参见Ausubel,F.等人主编的CurrentProtocols in Molecular Biology(Greene Publishing and Wiley Interscience,NewYork,1987)。不同的方法已经成熟并广泛用于蛋白质纯化，诸如微生物蛋白亲和色谱(例如使用亲和介质用于纯化κ或λ同种型恒定轻链结构域，例如KappaSelect或LambdaSelect)、离子交换色谱(例如，阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附色谱(例如，使用苯基-琼脂糖、氮杂需氧树脂(aza-arenophilic resin)或间氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和色谱(例如，使用Ni(II)-亲和材料和Cu(II)-亲和材料)、体积排阻色谱和电泳方法(诸如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
包含标签部分的多肽可以通过“标签特异性亲和色谱”纯化。标签合适的纯化方法是本领域已知的。因此，包含聚(his)标签的多肽可以例如通过金属螯合亲和色谱，特别是镍螯合亲和色谱被纯化。
如本文所用，术语“肽连接体”表示具有优选为合成来源的氨基酸序列的肽。在用于本发明的异二聚体多肽内，肽连接体可用于将另外的多肽结构域，如抗体片段，融合到单条多肽链的C末端或N末端。在一个实施例中，所述肽连接体是具有长度为至少5个氨基酸的氨基酸序列的肽，在另一个实施例中，长度为5至100个氨基酸，在又一个实施例中为10至50个氨基酸。在一个实施例中，肽连接体是甘氨酸-丝氨酸连接基。在一个实施例中，肽连接体是由甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基组成的肽。在一个实施例中，所述肽连接体是
(GxS)n或(GxS)nGm
其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且
x＝3，n＝3、4、5或6，m＝0、1、2或3；或者
x＝4，n＝2、3、4或5，m＝0、1、2或3。
在一个实施例中，x＝4且n＝2或3，在另一实施例中，x＝4，n＝2。在一个实施例中，所述肽连接体是(G4S)2。
如本文所用的术语“价”表示在抗原结合分子中存在指定数目的结合位点。例如，天然抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此，术语“三价”表示抗原结合分子中存在三个结合位点。
根据本发明的多肽通过重组方式产生。多肽(例如抗体)的重组生产方法是现有技术中所熟知的，并且包括在原核和真核宿主细胞中表达蛋白质，随后分离出抗体，并且通常将其纯化至药用纯度。为了在宿主细胞中表达上述多肽，通过标准方法将编码相应多肽链的核酸插入表达载体中。在适当的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，并从细胞中回收多肽(裂解后的上清液或细胞)。用于重组生产多肽(例如抗体)的一般方法是现有技术中所熟知的，并且综述于以下论文中：Makrides,S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.，Mol.Biotechnol16(2000)151-161；Werner,R.G.，Drug Res.48(1998)870-880。
宿主细胞产生的多肽可以对来自在C末端包含CH3结构域的多肽链的C末端的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸进行翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码这种多肽链的特定核酸分子产生的多肽可以包括全长多肽链，其包括全长CH3结构域，或者该多肽可以包括全长多肽链的切割的变体(在本文中也称为“切割的变异多肽链”)。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447)的情况。
本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及其类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可包含合成后进行的修饰，如与标记缀合。其他类型的修饰包括，例如，“封端”，用类似的核苷酸间修饰，诸如，例如，那些具有不带电荷的键(例如，甲基磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯)和具有带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，那些含有侧基的，诸如，例如，蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-赖氨酸等)，那些含有嵌入剂的(例如，吖啶、补骨脂素等)，那些含有螯合剂的(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)，那些含有烷基化剂的，那些具有修饰键的(例如，α-异头核酸等)以及未修饰形式的多核苷酸来取代一个或多个天然存在核苷酸。此外，糖中通常存在的任何羟基基团可以被(例如，膦酸酯基团、磷酸基团)替换，受标准保护基团保护，或者被活化以制备与另外的核苷酸的另外的连接，或者可以与固体或半固体支持物缀合。5'和3'末端的OH可被磷酸化或被1-20个碳原子的胺或有机封端基团部分取代。其他羟基也可以被衍生为标准保护基团。多核苷酸还可以包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖(诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、无环类似物和碱性核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键可以被可替代的连接基团替换。这些可替代的连接体团包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR2(“酰胺酸酯”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”)替换，其中每个R或R'独立地为H或取代或未取代的烷基(1-20 C)任选地包含醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳基取代的实施例。并非多核苷酸中的所有连接都需要相同。先前的描述适用于本文所指的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
“经分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码异二聚体多肽的分离的核酸”是指编码所述异二聚体多肽的一个或多个多肽链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或不同的载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文所用，术语“载体”是指能够载运与其相链接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。该术语包括主要用于将DNA或RNA插入细胞(例如染色体整合)的载体，主要用于DNA或RNA复制的复制载体，以及用于DNA或RNA转录和/或翻译的表达载体。还包括提供一种以上所述功能的载体。
“表达载体”是能够指导与其可操作连接的核酸表达的载体。当表达载体被引入合适的宿主细胞时，它可以被转录和翻译成多肽。当在根据本发明的方法中转化宿主细胞时，使用“表达载体”；因此，如本文所述，与宿主细胞转化相关的术语“载体”是指“表达载体”。“表达系统”通常是指由表达载体组成的合适宿主细胞，该表达载体能够产生所需的表达产物。
如本文所用，“表达”是指核酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA(也称为转录物)随后被翻译成肽或多肽的过程。转录物和编码的多肽单独或统称为基因产物。如果核酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括相应mRNA的剪接。
如本文所用，术语“转化”是指将载体或核酸转移到宿主细胞中的过程。如果没有强大的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，则进行转染，例如通过Graham和Van der Eh,Virology 52(1978)546ff所述的磷酸钙沉淀法转染。然而，也可以使用将DNA引入细胞的其他方法，例如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或含有大量细胞壁结构的细胞，例如一种转染方法是使用氯化钙的钙处理，如Cohen，F.N等人，PNAS 69(1972)7110et seq所述。
如本申请中所用的术语“宿主细胞”表示可以被工程化以产生本发明提供的多肽的任何种类的细胞系统。
如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和从该细胞衍生的培养物，而不考虑转化次数。还应当理解，由于故意的或非故意的突变，所有子代可能在DNA含量上不是精确地相同的。包括如在原始转化细胞中筛选的具有相同功能或生物活性的变体子代。如果打算使用不同的名称，则从上下文中会很清楚。
瞬时表达描述于例如以下文献中：Durocher,Y.等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9。可变结构域的克隆描述于Orlandi,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Norderhaug,L.等人，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87。优选的瞬时表达系统(HEK 293)描述于Schlaeger,E.-J.和Christensen,K.，Cytotechnology 30(1999)71-83；和Schlaeger,E.-J.，J.Immunol.Methods 194(1996)191-199。
术语“药物组合物”是指一种制剂，该制剂的形式允许其中所含的活性成分的生物活性有效，并且该制剂不含对组合物将施用至的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。本发明的药物组合物可通过本领域中已知的多种方法来施用。如本领域的技术人员将认识到的，施用途径和/或模式将根据所需结果而变化。为了通过某些施用途径施用根据本发明的抗体，可能需要用材料包被抗体或将抗体与材料共同施用以防止其失活。例如，异二聚体多肽可以在合适的载体例如脂质体或稀释剂中施用于受试者。药用稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。
药物组合物包含有效量的本发明提供的异二聚体多肽。药剂(例如，异二聚体多肽)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所期望的治疗或预防结果的量。特别地，“有效量”是表示本发明的异二聚体多肽的量，当将其施用于受试者时，(i)治疗或预防特定疾病、病症或疾患，(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状的发作。“治疗有效量”将依据所使用的异二聚体多肽分子、被治疗的疾病状态、被治疗疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康情况、施予途径和形式、主治医生或兽医从业人员的判断和其他因素而变。
“药用载体”是指药物制剂中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用载体包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一个优选的实施例中，载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。
根据本发明的药物组合物还可包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过上述灭菌程序并且通过加入各种抗菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)以确保无微生物存在。还可能希望在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
如本文所用，短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”意指肠内和局部施用以外的其他施用方式(通常通过注射进行施用)，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、气管内、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
不管选择的施用途径如何，可以以合适的水合形式使用的本发明的化合物，和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药用剂型。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得有效实现特定患者、组合物和施用方式的所需治疗反应，而不对患者有毒的活性成分的量。所选剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用本发明特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、被治疗患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。
组合物必须是无菌的且流动性达到组合物可通过注射器递送的程度。除了水之外，在一个实施例中，载体是等渗缓冲盐水溶液。
例如，可以通过使用诸如卵磷脂之类的包衣、在分散的情况下通过保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇和氯化钠。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施例中，该个体或受试者为人。
2.具体实施方式
本发明提供了适用的前体多肽，例如，用于通过多肽链交换在体内产生产物多肽。一种应用是通过缔合新形成的VH结构域和VL结构域对在细胞上产生抗原结合位点。
每个前体多肽包含一对CH3结构域，其布置在通过所述CH3结构域相互缔合的两条单独的多肽链上。所述CH3结构域包含几个氨基酸取代。因此，包含前体多肽内CH3结构域的两条多肽链形成异二聚体。本发明提供的前体多肽的CH3结构域包含至少两种具有不同功能的突变模式。第一种突变模式是支持所述两条包含CH3结构域的多肽链异二聚化的突变，即杵入臼突变。因此，前体多肽的一个CH3结构域包含杵突变，并且前体多肽的另一个CH3结构域包含臼突变。第二种突变模式是仅在涉及前体多肽异二聚体的CH3结构域中的一个中提供的一种或多种突变，其中所述突变使包含CH3结构域的两种多肽的相互作用不稳定。因此，每个前体多肽包含一个具有去稳定突变的CH3结构域，其被选择和布置使得它们在前体多肽之间的多肽链交换后支持产物多肽的正确组装。
每个前体多肽包含一个抗体可变结构域，其在相应前体多肽中与源自另一抗体的相应可变结构域缔合，从而形成非功能性抗原结合位点。源自与靶抗原(例如CD3)特异性结合的抗体的抗体可变结构域，布置成使得来自两种不同异二聚体前体多肽的多肽链在多肽链交换和组装后，在所得产物多肽中形成新的抗原结合位点，其与靶抗原(例如CD3)特异性结合。
前体多肽
在一个方面，本发明提供了一组异二聚体前体多肽，其包含：
a)第一异二聚体前体多肽，其包含至少两条包含CH3结构域的多肽链，其中所述两条包含CH3结构域的多肽链通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变，
其中所述第一异二聚体前体多肽包含第一抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分的至少一部分布置在所述两条包含CH3结构域的多肽链之一上，和
b)第二异二聚体前体多肽，其包含至少两条包含CH3结构域的多肽链，其中所述两条包含CH3结构域的多肽链通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变，
其中所述第二异二聚体前体多肽包含第二抗原结合部分，其中所述第二抗原结合部分的至少一部分布置在所述两条包含CH3结构域的多肽链之一上，其中
A)或者i)在所述第一异二聚体前体多肽内，包含含有杵突变的CH3结构域的多肽链包含所述第一抗原结合部分的至少一部分，并且在所述第二异二聚体前体多肽内，包含具有臼突变的CH3结构域的多肽链包含所述第二抗原结合部分的至少一部分，或者ii)在所述第一异二聚体前体多肽内，包含含有臼突变的CH3结构域的多肽链包含所述第一抗原结合部分的至少一部分，并且在所述第二异二聚体前体多肽内，包含具有杵突变的CH3结构域的多肽链包含所述第二抗原结合部分的至少一部分；并且其中
B)或者i)所述第一异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中所述第二异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；或者ii)所述第一异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中所述第二异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；并且其中
C)或者
i)包含杵突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含臼突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域，或者
ii)包含臼突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含杵突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域
包含以下氨基酸取代，其中根据Kabat编号系统进行编号：
-具有臼突变的CH3结构域包含至少一个选自下组的氨基酸取代：
o用带正电荷的氨基酸替换E357；
o用疏水性氨基酸替换S364；
o用疏水性氨基酸替换A368；和
o用疏水性氨基酸替换V407；和
-具有杵突变的CH3结构域包含至少一个选自下组的氨基酸取代：
o用带负电荷的氨基酸替换K370；
o用带负电荷的氨基酸替换K370，并用带负电荷的氨基酸替换K439；
o用带负电荷的氨基酸替换K392；和
o用疏水性氨基酸替换V397。
在另一方面，本发明提供一种第一异二聚体前体多肽，其包含至少两条包含CH3结构域的多肽链，其中所述两条包含CH3结构域的多肽链通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变，其中所述第一异二聚体前体多肽包含第一抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分的至少一部分布置在两条包含CH3结构域的多肽链之一上；并且其中CH3结构域中的一个(但不是另一个CH3结构域)包含以下氨基酸取代(即去稳定突变)，其中根据Kabat编号系统进行编号：
-或者具有臼突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，即去稳定突变，其选自下组：用带正电荷的氨基酸替换E357；用疏水性氨基酸替换S364；用疏水性氨基酸替换A368；以及用疏水性氨基酸替换V407；或者
-具有杵突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，即去稳定突变，其选自下组：用带负电荷的氨基酸替换K370；用带负电荷的氨基酸替换K370，并且用带负电荷的氨基酸替换K439；用带负电荷的氨基酸替换K392；以及用疏水性氨基酸替换V397。
在另一方面，本发明提供一种第二异二聚体前体多肽，其包含至少两条包含CH3结构域的多肽链，其中所述两条包含CH3结构域的多肽链通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变，其中所述第二异二聚体前体多肽包含第二抗原结合部分，其中所述第二抗原结合部分的至少一部分布置在两条包含CH3结构域的多肽链之一上；并且其中CH3结构域中的一个(但不是另一个CH3结构域)包含以下氨基酸取代(即去稳定突变)，其中根据Kabat编号系统进行编号：
-或者具有臼突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，即去稳定突变，其选自下组：用带正电荷的氨基酸替换E357；用疏水性氨基酸替换S364；用疏水性氨基酸替换A368；以及用疏水性氨基酸替换V407；或者
-具有杵突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，即去稳定突变，其选自下组：用带负电荷的氨基酸替换K370；用带负电荷的氨基酸替换K370，并且用带负电荷的氨基酸替换K439；用带负电荷的氨基酸替换K392；以及用疏水性氨基酸替换V397。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的第一异二聚体前体多肽与根据本发明的第二异二聚体多肽组合用于形成异二聚体产物多肽的用途。在一个实施例中，根据本发明的第一异二聚体前体多肽用于与根据本发明的第二异二聚体多肽组合用于通过多肽链交换形成异二聚体产物多肽。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的第二异二聚体前体多肽与根据本发明的第一异二聚体多肽组合用于形成异二聚体产物多肽的用途。在一个实施例中，根据本发明的第二异二聚体前体多肽用于与根据本发明的第一异二聚体多肽组合用于通过多肽链交换形成异二聚体产物多肽。
在本发明的另一方面，提供了根据本发明的第一异二聚体前体多肽在根据本发明的一组异二聚体前体多肽内的用途。在本发明的另一方面，提供了根据本发明的第二异二聚体前体多肽在根据本发明的一组异二聚体前体多肽内的用途。
本发明的另一方面是根据本发明的第一异二聚体前体多肽在产生根据本发明的异二聚体多肽的方法中的用途。本发明的另一方面是根据本发明的第二异二聚体前体多肽在产生根据本发明的异二聚体多肽的方法中的用途。
本发明的另一方面是根据本发明的所述一组异二聚体前体多肽在产生根据本发明的异二聚体多肽的方法中的用途。本发明的另一方面是根据本发明的所述一组异二聚体前体多肽在鉴定根据本发明的多特异性异二聚体多肽的方法中的用途。
在一个实施例中，以下适用于第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽：
-在具有杵突变的CH3结构域包含去稳定突变E357K的情况下，具有臼突变的CH3结构域不包含去稳定突变K370E。
换句话说，根据本发明的一个实施例，以下适用于本发明提供的前体多肽：
-在具有杵突变的CH3结构域包含氨基酸取代E357K作为去稳定突变的情况下，具有臼突变的CH3结构域在位置370处包含K。
在一个实施例中，第一异二聚体前体多肽包含至少两条(在一个实施例中恰好为两条)包含CH3结构域的多肽链，其中包含CH3结构域的两条多肽链之一包含与抗原特异性结合的(第一)抗原结合部分的至少一部分；并且其中包含CH3结构域的两条多肽链中的另一条不包含与抗原特异性结合的抗原结合部分。在一个实施例中，第二异二聚体前体多肽包含至少两条(在一个实施例中恰好为两条)包含CH3结构域的多肽链，其中包含CH3结构域的两条多肽链之一包含与抗原特异性结合的(第一)抗原结合部分的至少一部分；并且其中包含CH3结构域的两条多肽链中的另一条不包含与抗原特异性结合的抗原结合部分。在一个实施例中，第一异二聚体前体多肽包含至少两条(在一个实施例中恰好为两条)包含CH3结构域的多肽链，其中两条包含CH3结构域的多肽链之一包含与抗原特异性结合的(第一)抗原结合部分的至少一部分；并且其中两条包含CH3结构域的多肽链中的另一条不包含与抗原特异性结合的抗原结合部分；并且第二异二聚体前体多肽包含至少两条(在一个实施例中恰好为两条)包含CH3结构域的多肽链，其中两条包含CH3结构域的多肽链之一包含与抗原特异性结合的(第一)抗原结合部分的至少一部分；并且其中两条包含CH3结构域的多肽链中的另一条不包含与抗原特异性结合的抗原结合部分。换句话说，根据本发明的该实施例，一个或多个功能性抗原结合部分仅布置在两条包含CH3结构域的多肽链之一上，而在包含CH3结构域的另一条多肽链上未布置功能性抗原结合部分。该多肽链在本文中也称为“模拟多肽”。在一个实施例中，模拟多肽仅与包含CH3结构域的另一条多肽链缔合，即在异二聚体中，但不与另一条(例如第三条)多肽链缔合。模拟多肽可以包含抗原结合部分的部分，例如抗体可变结构域，其不包含在异二聚体前体多肽内的功能性抗原结合位点中。这种布置的一个优点，例如组合包含CH3结构域的模拟多肽与包含参与一个或多个功能性抗原结合位点形成的CH3结构域的多肽链，在多肽链交换后形成的产物多肽与异二聚体前体分子的大小不同，其允许改进来自未反应的前体多肽的产物多肽。
如所指出的，在每个异二聚体前体多肽内，包含CH3结构域的多肽链之一包含具有杵突变的CH3结构域，并且包含CH3结构域的另一条多肽链包含具有臼突变的CH3结构域。在多肽链交换后，来自第一前体多肽的包含具有杵突变的CH3结构域的多肽链与来自第二前体多肽的包含具有臼的CH3结构域的多肽链形成异二聚体(即第一异二聚体产物多肽)，并且来自第一前体多肽的包含具有臼突变的CH3结构域的多肽链与来自第二前体多肽的包含具有杵的CH3结构域的多肽链形成异二聚体(即第二异二聚体产物多肽)。
如所指出的，第一异二聚体前体多肽内包含的一个CH3结构域包含一个或多个去稳定突变，如上所指出的，而所述第一异二聚体前体多肽内包含的另一个CH3结构域不包含去稳定突变；并且第二异二聚体多肽内包含的一个CH3结构域包含一个或多个去稳定突变，如上所指出的，而包含在所述第二异二聚体前体多肽内的另一个CH3结构域不包含去稳定突变。前体多肽内存在的去稳定突变的布置成使得它们在多肽链交换后存在于相同的产物多肽内。因此，在前体多肽之一中，一个或多个去稳定突变布置在包含杵突变的CH3结构域中，而在另一前体多肽内，一个或多个去稳定突变布置在包含臼突变的CH3结构域中。
在一个实施例中，在第一异二聚体前体多肽内，包含含有杵突变的CH3结构域的多肽链包含第一抗原结合部分的至少一部分，并且在第二异二聚体前体多肽内，包含具有臼突变的CH3结构域的多肽链包含第二抗原结合部分的至少一部分。
在一个实施例中，在第一异二聚体前体多肽内，包含含有臼突变的CH3结构域的多肽链包含第一抗原结合部分的至少一部分，并且在第二异二聚体前体多肽内，包含具有杵突变的CH3结构域的多肽链包含第二抗原结合部分的至少一部分。
在一个实施例中，异二聚体前体多肽包含恰好两条包含CH3结构域的多肽链。
在一个实施例中，包含去稳定突变的CH3结构域包含一个、两个或三个去稳定突变。在一个实施例中，包含去稳定突变的CH3结构域包含一个或两个去稳定突变。
在本发明的一个实施例中，在包含第一异二聚体多肽的CH3结构域的两条多肽链之间没有形成链间二硫键。在本发明的一个实施例中，在包含第二异二聚体多肽的CH3结构域的两条多肽链之间没有形成链间二硫键。在本发明的一个实施例中，在包含第一异二聚体多肽和第二异二聚体多肽的CH3结构域的两条多肽链之间没有形成链间二硫键。在包含CH3结构域的两条多肽链之间没有链间二硫键的异二聚体前体多肽能够在不存在还原剂的情况下进行多肽链交换。因此，其中在包含CH3结构域的多肽链之间不存在链间二硫键的异二聚体前体多肽特别适用于不可能或不希望存在还原剂的应用；例如用于治疗中的应用。
A)CH3结构域中的氨基酸取代
本发明提供的前体多肽在其CH3结构域中包含氨基酸取代。
杵入臼突变
在一个实施例中，包含在第一异二聚体前体多肽内的杵突变与包含在第二异二聚体前体多肽内的杵突变相同。
在一个实施例中，杵突变是T366W。在一个实施例中，臼突变是T366S L368AY407V。
去稳定突变
如上所指出的，每个前体多肽的仅一个CH3结构域包含一个或多个去稳定突变。
根据本发明，或者i)包含杵突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含臼突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域，或者ii)包含臼突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含杵钮突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域包含一个或多个去稳定突变。选择第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽内的一个或多个去稳定突变，使得它们在由前体多肽之间的多肽链交换形成的产物多肽的CH3/CH3界面中相互作用。
在异二聚体前体多肽的包含杵突变的CH3结构域包含去稳定突变的情况下，所述异二聚体前体多肽的包含臼突变的CH3结构域不包含去稳定突变。当CH3结构域“不包含去稳定突变”时，它包含在相同类别的野生型免疫球蛋白CH3结构域中与包含在相应CH3结构域中的去稳定突变位置上的氨基酸残基相互作用的位置处的野生型氨基酸残基。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，即去稳定突变，其选自下组：用带正电荷氨基酸替换E357；用疏水性氨基酸替换S364；用疏水性氨基酸替换A368；用疏水性氨基酸替换V407；并且具有杵突变的CH3结构域不包含去稳定突变，或包含至少一个氨基酸取代，即去稳定突变，其选自下组：用带负电荷的氨基酸替换K370；用带负电荷的氨基酸替换K370，并且用带负电荷的氨基酸替换K439；用带负电荷的氨基酸替换K392；以及用疏水性氨基酸替换V397。
在一个实施例中，疏水性氨基酸选自正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Tyr和Phe。在一个实施例中，疏水性氨基酸选自Ala、Val、Leu、Ile和Tyr。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Val、Leu或Ile。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Leu或Ile。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Leu。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Tyr。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Phe。
在一个实施例中，带正电荷的氨基酸是His、Lys或Arg。在一个实施例中，带正电荷的氨基酸是Lys或Arg。在一个实施例中，带正电荷的氨基酸是Lys。
在一个实施例中，带负电荷的氨基酸是Asp或Glu。在一个实施例中，带负电荷的氨基酸是Asp。在一个实施例中，带负电荷的氨基酸是Glu。
发现在CH3结构域中指定的氨基酸位置用具有各自侧链特性的氨基酸取代氨基酸支持来自两个前体多肽的多肽链交换和形成产物多肽。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，其选自下组：E357K、E357R、S364L、S364I、V407Y、V407F和A368F；并且具有杵突变的CH3结构域不包含去稳定突变，或包含至少一个氨基酸取代，其选自下组：至少一个氨基酸取代，其选自下组：K370E、K370D、K392E、K392D、V397Y和双突变K370E K439E、K370D K439E、K370EK439D和K370D K439D。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，其选自下组：E357K、S364L、V407Y和A368F；并且具有杵突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，其选自下组：K370E、K392D、V397Y和双突变K370E K439E。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，其选自下组：E357K、E357R、S364L、S364I、V407Y和V407F；并且具有杵突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，其选自下组：K370E、K370D、K392E、K392D、V397Y和双突变K370E K439E、K370D K439E、K370E K439D和K370D K439D。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，其选自下组：E357K、S364L和V407Y；并且具有杵突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，其选自下组：K370E、K392D、V397Y和双突变K370E K439E。
在本发明的一个实施例中，包含去稳定突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一：
为清楚起见，该表应理解为包含臼突变的CH3结构域包含如上表第一列中所示的去稳定突变，包含杵突变的CH3结构域包含上表右列中列出的去稳定突变表，显示在同一行。
在本发明的一个实施例中，包含去稳定突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一：
| 包含臼突变的CH3结构域 | 包含杵突变的CH3结构域 |
| E357K | V397Y |
| E357K | K370E |
| E357K | K392D |
| E357K | K370E K439E |
| V407Y | V397Y |
| V407Y | K370E |
| S364L | V397Y |
| S364L | K370E |
在本发明的一个实施例中，包含去稳定突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一：
为清楚起见，该表应理解为包含臼突变的CH3结构域包含如上表第一列中所示的去稳定突变，包含杵突变的CH3结构域包含上表右列中列出的去稳定突变表，显示在同一行。具有这种去稳定突变组合的前体分子表现出特别有益的多肽链交换。
在本发明的一个实施例中，包含去稳定突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一：
| 包含臼突变的CH3结构域 | 包含杵突变的CH3结构域 |
| S364A | W336I F405W K409D |
| S364I | W336I F405W K409D |
| S364L | W336I F405W K409D |
为清楚起见，该表应理解为包含臼突变的CH3结构域包含如上表第一列中所示的去稳定突变，包含杵突变的CH3结构域包含上表右列中列出的去稳定突变表，显示在同一行。具有这种去稳定突变组合的前体分子表现出特别有益的多肽链交换，同时可以高产率生产。
半胱氨酸突变
在本发明的一个实施例中，异二聚体前体多肽的CH3结构域包含第三种突变模式，即CH3/CH3界面中不同氨基酸被半胱氨酸取代以允许在相互作用位置具有半胱氨酸取代的两个CH3结构域之间形成链间二硫键。
因此在本发明的一个实施例中，或者i)包含所述第一异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，或者ii)包含所述第一异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变。换句话说，在一个实施例中，或者i)在第一异二聚体多肽内，包含杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且包含臼突变的CH3结构域不包含半胱氨酸突变，并且在第二异二聚体多肽内，包含杵突变的CH3结构域不包含半胱氨酸突变，并且包含臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，或者ii)在第一异二聚体多肽内，包含杵突变的CH3结构域不包含半胱氨酸突变，并且包含臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且在第二异二聚体多肽内，包含杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且包含臼突变的CH3结构域不包含半胱氨酸突变。
在一个实施例中，或者i)包含所述第一异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含第一半胱氨酸突变，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含第二半胱氨酸突变，或者ii)包含所述第一异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含第一半胱氨酸突变，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含第二半胱氨酸突变，其中第一半胱氨酸突变和第二半胱氨酸突变选自以下对：
| 第一半胱氨酸突变 | 第二半胱氨酸突变 |
| D399C | K392C |
| Y349C | S354C |
| Y349C | E356C |
| Y349C | E357C |
| L351C | S354C |
| T394C | V397C |
在一个实施例中，第一个半胱氨酸突变是Y349C，并且第二个半胱氨酸突变是S354C。
在本发明的一个实施例中，i)包含所述第一异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含取代S354C，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含取代Y349C，或者ii)包含所述第一异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含取代Y349C，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含取代S354C。
在本发明的一个实施例中，在所述第一异二聚体前体多肽内，包含杵突变的CH3结构域包含取代S354C，并且包含臼突变的CH3结构域在位置349处包含Y；并且其中在第二异二聚体前体多肽内，包含臼突变的CH3结构域包含取代Y349C，并且包含杵突变的CH3结构域在位置354处包含S。
在本发明的一个实施例中，i)包含所述第一异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含取代T366W S354C，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含取代T366S L368A Y407V Y349C，或者ii)包含所述第一异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含取代T366S L368A Y407V Y349C，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含取代T366W S354C。
在本发明的一个实施例中，在所述第一异二聚体前体多肽内，包含杵突变的CH3结构域包含取代T366W S354C，并且包含臼突变的CH3结构域在位置349处包含Y和取代T366SL368A Y407V；并且其中在第二异二聚体前体多肽中，包含臼突变的CH3结构域包含取代T366S L368A Y407V Y349C，并且包含杵突变的CH3结构域在位置354处包含S和取代T366W。
在本发明的一个实施例中，异二聚体前体多肽的CH3结构域不包含链间二硫键。
B)抗原结合部分
在本发明的一个实施例中，抗原结合部分是与抗原特异性结合的多肽。在一个实施例中，抗原结合部分选自能够与抗原特异性结合的抗体、受体、配体和DARPin。
在本发明的一个实施例中，包含在根据本发明的(前体)多肽中的抗原结合部分是抗体片段。
在本发明的一个实施例中，抗原结合部分包含一对VH结构域和VL结构域，它们形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。
在本发明的一个实施例中，包含在根据本发明的(前体)多肽中的抗体片段是选自以下组的抗体片段：Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、双抗体、scFv和scFab。在一个实施例中，包含在根据本发明的(前体)多肽中的抗体片段是Fv或Fab。
在本发明的一个实施例中，抗原结合部分是Fab片段。
在本发明的一个实施例中，第一抗原结合部分是第一Fab片段，并且第二抗原结合部分是第二Fab片段。在本发明的一个实施例中，第一Fab片段、第二Fab片段或两者、第一Fab片段和第二Fab片段通过结构域交换而改变，使得：
a)仅CH1结构域和CL结构域相互替换；
b)仅VH结构域和VL结构域相互替换；或者
c)CH1结构域和CL结构域相互替换，并且VH结构域和VL结构域相互替换。
在本发明的一个实施例中，抗原结合部分是Fv片段。在本发明的一个实施例中，第一抗原结合部分是第一Fv片段，并且第二抗原结合部分是第二Fv片段。
在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽的抗原结合部分和第二异二聚体前体多肽的抗原结合部分与相同的抗原结合。在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽的抗原结合部分和第二异二聚体前体多肽的抗原结合部分是相同的抗原结合部分。
在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽的抗原结合部分和第二异二聚体前体多肽的抗原结合部分与不同的抗原结合。在这种情况下，在两个异二聚体前体多肽之间的多肽链交换后，形成多特异性产物多肽，其包含来源于第一异二聚体前体多肽的抗原结合部分和来源于第二异二聚体前体多肽的抗原结合部分。
异二聚体前体多肽中可存在另外的抗原结合部分，其可融合至异二聚体前体多肽中包含的多肽链的N末端或C末端以提供更高价的产物多肽。
这种另外的抗原结合部分通过合适的肽连接体与多肽链融合。在一个实施例中，肽连接体是甘氨酸丝氨酸连接基。
在本发明的一个实施例中，在异二聚体前体多肽中，仅一条包含CH3结构域的多肽链包含抗原结合部分的至少一部分。在本发明的一个实施例中，在异二聚体前体多肽中,一条包含抗原结合位点的CH3结构域的多肽链与靶抗原特异性结合。在本发明的一个实施例中，在异二聚体前体多肽中，一条包含CH3结构域的多肽链从N末端到C末端方向包含铰链区、抗体可变结构域和CH3结构域，并且该多肽链不是与靶抗原特异性结合的抗原结合位点的一部分。在本发明的一个实施例中，在异二聚体前体多肽中，一条包含CH3结构域的多肽链从N末端到C末端方向包含铰链区、抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且该多肽链不是与靶抗原特异性结合的抗原结合位点的一部分。
C)前体多肽的结构域布置
根据本发明的前体多肽适用于产生各种形式和具有各种结构域布置的产物多肽。根据异二聚体前体分子中提供的结构域的选择和抗原结合部分的数量，可以产生具有不同抗原结合特征(例如特异性、效价)和不同效应子功能的产物多肽。
在一个实施例中，第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽恰好包含两条包含CH3结构域的多肽链。因此，在第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽中可以包含没有CH3结构域的另外的多肽链。
包含抗体片段的前体多肽
在本发明的一个实施例中，抗原结合部分包含一对VH结构域和VL结构域，它们形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且
a)所述第一异二聚体前体多肽包含：
-第一重链多肽，其包含CH3结构域和第一抗体可变结构域，
-第二重链多肽，其包含CH3结构域，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其包含第二抗体可变结构域，其中所述第一抗体可变结构域和所述第二抗体可变结构域一起形成与靶抗原特异性结合的第一抗原结合位点；并且其中
b)所述第二异二聚体前体多肽包含：
-第三重链多肽，其包含CH3结构域和第三抗体可变结构域，
-第四重链多肽，其包含CH3结构域，其中所述第三重链多肽和所述第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其包含第四抗体可变结构域，其中所述第三抗体可变结构域和所述第四抗体可变结构域一起形成与靶抗原特异性结合的第二抗原结合位点；并且其中
c)或者i)所述第一重链多肽包含含有杵突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含含有臼突变的CH3结构域；或者ii)所述第一重链多肽包含含有臼突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含含有杵突变的CH3结构域。
包含CH2结构域的前体多肽
在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含至少两条包含CH2结构域和CH3结构域的多肽链。包含CH2结构域和CH3结构域的异二聚体前体多肽表现出有利的特性，如循环中的长半衰期和Fc介导的效应子功能的介导。
在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含至少两条从N末端到C末端方向包含CH2结构域和CH3结构域的多肽链。
在本发明的一个实施例中，或者i)第一异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中第二异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；或者ii)第一异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中第二异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合。
在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽没有CH2结构域。没有CH2结构域的异二聚体前体多肽可以表现出有利的特性，如从循环中快速清除。
包含可活化抗原结合位点的前体多肽
根据本发明，每个前体多肽包含抗原结合部分的一部分，其中所述抗原结合部分在前体多肽中是无功能的，并且其中在由前体多肽之间的多肽链交换形成的产物多肽中，抗原结合部分是有功能的并且与靶抗原特异性结合。这种前体多肽的示例性结构示于图1和图2。
在本发明的一个实施例中，所述抗原结合部分是包含一对抗体可变结构域的抗原结合位点。
在本发明的一个实施例中，所述第一异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中所述第二异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH域和VL域相缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合。在一个实施例中，由一对VH结构域和VL结构域特异性结合的抗原是CD3。
在本发明的一个实施例中，所述第一异二聚体前体多肽包含一条从N末端到C末端方向包含VL结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中所述第二异二聚体前体多肽包含一条从N末端到C末端方向包含VH结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH域和VL域相缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合。
在本发明的一个实施例中，
a)所述第一异二聚体前体多肽包含：
-第一重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域，和CH3结构域，
-第二重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第一重链多肽的所述第二抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域，和CH3结构域，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含第一VL结构域和CL结构域，其中所述第一VH结构域和所述第一VL结构域相互缔合并形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且其中
b)所述第二异二聚体前体多肽包含：
-第三重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域，和CH3结构域，
-第四重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第三重链多肽的所述第三抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域，和CH3结构域，其中所述第三重链多肽和所述第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含第二VL结构域和CL结构域，其中所述第二VH结构域和所述第二VL结构域相互缔合并形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且其中
c)或者i)所述第一重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域；或者ii)所述第一重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域；并且其中
d)所述第一重链多肽和所述第三重链多肽的可变结构域能够形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。
在一个实施例中，第一重链多肽从N末端到C末端方向包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域、肽连接体和CH3结构域，并且第二重链多肽从N末端到C末端方向包含能够与第一重链多肽的第二抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、肽连接体和CH3结构域，其中第一重链多肽和第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；第三重链多肽从N末端到C末端方向包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域、肽连接体和CH3结构域，并且第四重链多肽从N末端到C末端方向包含能够与第三重链多肽的第三抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、肽连接体和CH3结构域，其中第三重链多肽和第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变。在一个实施例中，包含在第一重链多肽、第二重链多肽、第三重链多肽和第四重链多肽中的肽连接体是相同的。
在一个实施例中，在第一异二聚体前体多肽内，包含在第一重链多肽中的第二抗体可变结构域源自与第一靶抗原特异性结合的抗体，并且包含在第二重链多肽中的抗体可变结构域与第二个靶抗原特异性结合。两个可变结构域都能够相互缔合。因此，一个重链多肽包含VH结构域而另一个重链多肽包含VL结构域。VH结构域和VL结构域能够相互缔合。然而，形成了无功能的抗原结合位点。因此，本发明上下文中的术语“能够相互缔合的可变结构域”是指提供一对VH和VL结构域。在该实施例中，在第二异二聚体前体多肽内，包含在第三重链多肽中的第三抗体可变结构域源自与第一靶抗原特异性结合的抗体(即能够与包含在第一异二聚体前体多肽的第一重链多肽中的第二可变结构域形成功能性VH/VL对)，并且包含在第四重链多肽中的抗体可变结构域与另一个(例如第二)靶抗原特异性结合。包含在第一重链多肽和第三重链多肽中的可变结构域能够相互缔合，即一个可变结构域为VH结构域，并且另一个为VL结构域；并且包含在第一重链多肽和第三重链多肽中的可变结构域能够形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点，即两个可变结构域均源自与靶抗原(例如CD3)特异性结合的相同抗体。
在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含至少两条从N到C末端方向包含CH2结构域和CH3结构域的多肽链，其中第一异二聚体前体多肽包含一条从N到C末端方向包含VL结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中第二异二聚体前体多肽包含一条从N末端到C末端方向包含VH结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，其中VL结构域和VH结构域能够形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。
在本发明的一个实施例中，
a)所述第一异二聚体前体多肽包含：
-第一重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，
-第二重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第一重链多肽的所述第二抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含第一VL结构域和CL结构域，其中所述第一VH结构域和所述第一VL结构域相互缔合并形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且其中
b)所述第二异二聚体前体多肽包含：
-第三重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，
-第四重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第三重链多肽的所述第三抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中所述第三重链多肽和所述第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含第二VL结构域和CL结构域，其中所述第二VH结构域和所述第二VL结构域相互缔合并形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且其中
c)或者i)所述第一重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域；或者ii)所述第一重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域；并且其中
d)所述第一重链多肽和所述第三重链多肽的可变结构域能够形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。
在一个实施例中，第一重链多肽从N末端到C末端方向包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域，并且第二重链多肽从N末端到C末端方向包含能够与第一重链多肽的第二抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域，其中第一重链多肽和第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；第三重链多肽从N末端到C末端方向包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域，并且第四重链多肽从N末端到C末端方向包含能够与第三重链多肽的第三抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域，其中第三重链多肽和第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变。在一个实施例中，包含在第一重链多肽、第二重链多肽、第三重链多肽和第四重链多肽中的肽连接体是相同的。
包含铰链区的前体多肽
在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含至少两条从N末端到C末端方向包含铰链区和CH3结构域的多肽链。
在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含至少两条从N末端到C末端方向包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。
在本发明的一个实施例中，所述第一异二聚体前体多肽和所述第二异二聚体前体多肽在铰链区不包含链间二硫键。具有没有链间二硫键的铰链区的异二聚体前体多肽能够在没有还原剂的情况下进行多肽链交换。因此，具有没有链间二硫键的铰链区的异二聚体前体多肽特别适用于其中不可能或不希望存在还原剂的应用。因此，那些异二聚体前体多肽可有利地用于治疗。
在本发明的一个实施例中，所述第一异二聚体前体多肽和所述第二异二聚体前体多肽在铰链区包含不形成链间二硫化物的天然铰链区。一个实例是源自IgG4同种型抗体的铰链区肽。
代替没有链间二硫键的铰链区，异二聚体前体多肽可以包含肽连接体，其将抗原结合部分(的一部分)与恒定抗体结构域(即CH2或CH3)连接起来。在本发明的一个实施例中，在第一肽连接体和第二肽连接体之间没有形成链间二硫键。在本发明的一个实施例中，第一肽连接体和第二肽连接体彼此相同。
在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含至少两条从N末端到C末端方向包含肽连接体和CH3结构域的多肽链。
在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含至少两条从N末端到C末端方向包含肽连接体、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。
在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽包含含有第一肽连接体、抗体可变结构域、任选地CH2结构域和CH3结构域的第一多肽链，以及含有第一肽连接体、能够与来自第一多肽链的抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、任选地CH2结构域和CH3结构域的第二多肽链；并且第二异二聚体前体多肽包含含有第一肽连接体、抗体可变结构域、任选的CH2结构域和CH3结构域的第一多肽链，以及含有第一肽连接体、能够与来自第一多肽链的抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域，任选地CH2结构域和CH3结构域的第二多肽链。
在本发明的一个实施例中，肽连接体是至少15个氨基酸的肽。在本发明的另一个实施例中，肽连接体是15-70个氨基酸的肽。在本发明的另一个实施例中，肽连接体是20-50个氨基酸的肽。在本发明的另一个实施例中，肽连接体是10-50个氨基酸的肽。取决于例如要被可活化结合位点结合的抗原类型，更短(或甚至更长)的肽连接体也可适用于根据本发明的异二聚体前体多肽。
在本发明的又一个实施例中，第一和第二肽连接体的长度大约为天然铰链区的长度(对于天然铰链区而言，IgG1同种型的抗体分子约15个氨基酸，而IgG3同种型的抗体分子约62个氨基酸)。因此，在一个实施例中，其中第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽是IgG1同种型，肽连接体是10-20个氨基酸的肽，在一个优选的实施例中是12-17个氨基酸。在另一个实施例中，其中第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽是IgG3同种型，肽连接体是55-70个氨基酸的肽，在一个优选的实施例中是60-65个氨基酸。
在本发明的一个实施例中，肽连接体是甘氨酸-丝氨酸连接基。在本发明的一个实施例中，肽连接体是由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。在本发明的一个实施例中，甘氨酸-丝氨酸连接基具有以下结构
(GxS)n或(GxS)nGm
其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，x＝3或4，n＝2、3、4、5或6，并且m
＝0、1、2或3。
在一个实施例中，上述定义的甘氨酸-丝氨酸连接基中，x＝3，n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3；或者x＝4，n＝2、3、4或5，并且m＝0、1、2或3。在一个优选实施例中，x＝4且n＝2或3，并且m＝0。在又一个优选实施例中，x＝4且n＝2。在一个实施例中，所述肽连接体是(G4S)4或(G4S)6。
在本发明的一个实施例中，或者i)第一异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域、肽连接体和CH3结构域的多肽链，并且其中第二异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域、肽连接体和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；或者ii)第一异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域、肽连接体和CH3结构域的多肽链，并且其中第二异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域、肽连接体和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合。
在本发明的一个实施例中，或者i)第一异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中第二异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；或者ii)第一异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中第二异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合。
D)抗体同种型和效价
在本发明的一个实施例中，前体多肽包含一种或多种免疫球蛋白类别的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白类别包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型，在IgG和IgA的情况下，还包括它们的亚型。在本发明的一个实施例中，前体多肽具有IgG型抗体的恒定结构域结构。
在本发明的一个实施例中，包含在前体多肽中的CH3结构域属于哺乳动物IgG类。在本发明的一个实施例中，包含在前体多肽中的CH3结构域属于哺乳动物IgG1亚类。在本发明的一个实施例中，包含在前体多肽中的CH3结构域属于哺乳动物IgG4亚类。
在本发明的一个实施例中，包含在前体多肽中的CH3结构域属于人IgG类。在本发明的一个实施例中，包含在前体多肽中的CH3结构域属于人IgG1亚类。在本发明的一个实施例中，包含在前体多肽中的CH3结构域属于人IgG4亚类。
在一个实施例中，根据本发明的前体多肽的恒定结构域属于人IgG类。在一个实施例中，根据本发明的前体多肽的恒定结构域属于人IgG1亚类。在一个实施例中，根据本发明的前体多肽的恒定结构域属于人IgG4亚类。
在一个实施例中，前体多肽没有CH4结构域。
在本发明的一个实施例中，根据本发明的前体多肽的恒定结构域属于相同的免疫球蛋白亚类。在本发明的一个实施例中，根据本发明的前体多肽的可变结构域和恒定结构域属于相同的免疫球蛋白亚类。
在本发明的一个实施例中，前体多肽是分离的前体多肽。在本发明的一个实施例中，产物多肽是分离的产物多肽。
在一个实施例中，包含包括CH3结构域的多肽链的异二聚体前体多肽或异二聚体产物多肽包括全长CH3结构域或CH3结构域，其中一个或两个C末端氨基酸残基，即G446和/或K447不存在。
在一个实施例中，第一异二聚体前体多肽是单特异性的并且包含第二抗原结合位点的一部分；第二异二聚体前体多肽是单特异性的并且包含第二抗原结合位点的另一部分。在所述实施例中，异二聚体产物多肽是双特异性或三特异性的。
在一个实施例中，第一异二聚体前体多肽是单特异性的并且包含第二抗原结合位点的一部分；第二异二聚体前体多肽是单特异性的并且包含第二抗原结合位点的另一部分。在所述实施例中，异二聚体产物多肽是三特异性的。
在一个实施例中，第一异二聚体前体多肽是双特异性的。在一个实施例中，第二异二聚体前体多肽是单特异性的。
在一个实施例中，第一异二聚体前体多肽是双特异性的。在一个实施例中，第二异二聚体前体多肽是双特异性的。
在一个实施例中，第一异二聚体前体多肽是单价的。在一个实施例中，第二异二聚体前体多肽是单价的。
在一个实施例中，第一异二聚体前体多肽是二价的。在一个实施例中，第二异二聚体前体多肽是二价的。
在一个实施例中，第一异二聚体前体多肽是三价的。在一个实施例中，第二异二聚体前体多肽是三价的。
在一个实施例中，异二聚体产物多肽是三价的。在一个实施例中，异二聚体产物多肽是四价的。
E)产生产物多肽的方法
一方面，本发明提供一种产生异二聚体产物多肽的方法，所述方法包括使根据本发明的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽接触以形成第三异二聚体多肽，其包含至少一条包含来自所述第一异二聚体前体多肽的CH3结构域的多肽链，和至少一条包含来自所述第二异二聚体多肽的CH3结构域的多肽链。在本发明的一个实施例中，所述方法包括回收第三异二聚体多肽的步骤。
在一个实施例中，使根据本发明的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽接触以形成第三异二聚体多肽，其包含至少一条包含来自第一异二聚体前体多肽的CH3结构域的多肽链和至少一条包含来自第二异二聚体多肽的CH3结构域的多肽链，以及第四个异二聚体多肽，其包含含有来自第一异二聚体前体多肽的CH3结构域的另一条多肽和包含来自第二异二聚体前体多肽的CH3结构域的另一条多肽。在一个实施例中，所述方法包括回收第四异二聚体产物多肽的步骤。
在本发明的一个实施例中，所述方法包括形成第三异二聚体产物多肽和第四异二聚体产物多肽，其中一个产物多肽(即第三异二聚体产物多肽或第四异二聚体产物多肽)不包含与抗原特异性结合的抗原结合位点。
在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽包含与第一抗原特异性结合的抗原结合部分并且包含第二抗原结合位点的一部分，其中第二异二聚体前体多肽包含与第三抗原特异性结合的抗原结合部分并且包含第二抗原结合位点的另一部分，并且其中第三异二聚体多肽包含与第一抗原特异性结合的抗原结合部分，与第二抗原特异性结合的抗原结合部分；和与第三抗原特异性结合的抗原结合部分。
在本发明的一个实施例中，第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含不包含链间二硫键的铰链区。在这种情况下，多肽链交换可以在没有还原剂的情况下发生。因此，在一个实施例中，第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含不包含链间二硫键的铰链区，并且第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽在不存在还原剂的情况下接触。
在本发明的一个实施例中，在包含第一异二聚体多肽和第二异二聚体多肽的CH3结构域的两条多肽链之间没有形成链间二硫键，并且在不存在还原剂的情况下进行接触。
F)异二聚体产物多肽
本发明的一个方面是通过产生本发明的异二聚体产物多肽的方法获得的异二聚体产物多肽。
本发明的一个方面是一种异二聚体多肽，在一个实施例中，一种异二聚体产物多肽，其包含至少两条包含CH3结构域的多肽链，其中所述两条包含CH3结构域的多肽链通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中一个CH3结构域包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；其中所述异二聚体多肽包含第一抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分的至少一部分布置在两条包含CH3结构域的多肽链之一上；并且其中所述异二聚体多肽包含第二抗原结合部分，其中所述第二抗原结合部分的至少一部分布置在两条包含CH3结构域的多肽链中的另一条链上；并且其中
第三抗原结合位点由一对与抗原特异性结合的VH结构域和VL结构域形成，其中VH结构域布置在一条包含CH3结构域的多肽链上，VL结构域布置在另一条包含CH3结构域的多肽链多肽链上；并且
其中具有臼突变的CH3结构域包含至少一个选自下组的氨基酸取代：
-用带正电荷的氨基酸替换E357；
-用疏水性氨基酸替换S364；
-用疏水性氨基酸替换A368；和
-用疏水性氨基酸替换V407；并且其中
任选地，具有杵突变的CH3结构域包含至少一个选自下组的氨基酸取代：
-用带负电荷的氨基酸替换K370；
-用带负电荷的氨基酸替换K370，并用带负电荷的氨基酸替换K439；
-用带负电荷的氨基酸替换K392；和
-用疏水性氨基酸替换V397。
根据本发明的异二聚体(产物)多肽包含两条包含CH3结构域的多肽链，其中至少包含臼突变的CH3结构域包含上文定义的去稳定突变。在一个实施例中，根据本发明的异二聚体(产物)多肽包含两条包含CH3结构域的多肽链，其中所述CH3结构域包含上文定义的去稳定突变。上文针对本发明的异二聚体前体多肽中的去稳定突变列出的所有实施例都适用于异二聚体产物多肽。在异二聚体产物多肽由两个各自包含至少一个去稳定突变的异二聚体前体多肽形成的情况下，异二聚体产物多肽在两个CH3结构域中都包含去稳定突变。
产生异二聚体产物多肽的方法的另一种产物，因此是本发明的另一方面，是优选通过本发明的方法获得的异二聚体产物多肽，其包含两条包含CH3结构域的多肽链，其中两个CH3结构域都不包含去稳定突变。
在本发明的一个实施例中，异二聚体产物多肽包含两条包含CH3结构域的多肽链，其中两个CH3结构域都包含上文定义的半胱氨酸突变。在本发明的一个实施例中，异二聚体产物多肽包含两条包含CH3结构域的多肽链，其中两个CH3结构域都不包含上文定义的半胱氨酸突变。
G)重组方法
根据本发明的前体多肽通过重组方法制备。因此，本发明还涉及制备根据本发明的异二聚体前体多肽的方法，其包括在适合前体多肽表达的条件下培养包含编码异二聚体前体多肽的核酸的宿主细胞。
一方面，提供了制备本发明的异二聚体前体多肽的方法，其中所述方法包括在适合异二聚体前体多肽表达的条件下培养包含编码如上所提供的异二聚体前体多肽的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收异二聚体前体多肽。
在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：用包含编码异二聚体前体多肽的核酸的表达载体转化宿主细胞，在允许合成所述异二聚体前体多肽的条件下培养所述宿主细胞，以及从所述宿主细胞培养物中回收所述异二聚体前体多肽。
对于异二聚体前体多肽的重组生产，编码异二聚体前体多肽(如，如上所述)的核酸，被分离并插入到一种或多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码异二聚体前体多肽的多肽链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，或通过重组方法产生或通过化学合成获得此类核酸。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，异二聚体前体多肽可以在细菌中产生。关于在细菌中表达多肽，参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523，(还参见Charlton,K.A.,在：Methods inMolecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2003),第245-254页中，描述的抗体片段在大肠杆菌中的表达。)异二聚体前体多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是编码本发明异二聚体前体多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；以及Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用于表达(糖基化)异二聚体前体多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的示例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293或293T细胞)；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞(如例如在Mather,J.P.等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编辑)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。
一方面，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
一方面，本发明提供了编码本发明的异二聚体前体多肽的分离的核酸。一方面，本发明提供了包含根据本发明的核酸的表达载体。另一方面，本发明提供了一种包含本发明核酸的宿主细胞。
H)治疗应用
本发明的所述一组异二聚体前体多肽可用于治疗。用于治疗的异二聚体前体多肽包含如上定义的可活化抗原结合位点。
因此，本发明的一个方面是用作药物的根据本发明的异二聚体前体多肽组。本发明的另一方面是包含本发明的异二聚体前体多肽组和药用载体的药物组合物。本发明的另一方面是一种治疗患有疾病的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的本发明的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽或本发明的药物组合物。
本发明的一方面是根据本发明的异二聚体前体多肽组，其中在第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽中，B)中指示的VH结构域和VL结构域能够形成与CD3特异性结合的抗原结合位点，用于用于治疗癌症。本发明的另一方面是一种治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的本发明的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽，其中在第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽中，B)中指示的VH结构域和VL结构域能够形成与CD3特异性结合的抗原结合位点。
在一个实施例中，用于治疗的异二聚体前体多肽包含如上定义的铰链区，其中所述第一异二聚体前体多肽和所述第二异二聚体前体多肽在铰链区中不包含链间二硫键。在铰链区不存在链间二硫键时，多肽链交换在不存在还原剂的情况下发生，因此可以自发发生；例如当两种异二聚体前体多肽都与靶抗原或靶细胞结合时。
在一个实施例中，用于治疗的异二聚体前体多肽包含不含有链间二硫键的铰链区；和如上定义的可活化抗原结合位点。
3.本发明的具体实施例
1.一组异二聚体前体多肽，其包含：
-第一异二聚体前体多肽，其包含至少两条包含CH3结构域的多肽链，其中所述两条包含CH3结构域的多肽链通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变，
其中所述第一异二聚体前体多肽包含第一抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分的至少一部分布置在所述两条包含CH3结构域的多肽链之一上，和
-第二异二聚体前体多肽，其包含至少两条包含CH3结构域的多肽链，其中所述两条包含CH3结构域的多肽链通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变，
其中所述第二异二聚体前体多肽包含第二抗原结合部分，其中所述第二抗原结合部分的至少一部分布置在所述两条包含CH3结构域的多肽链之一上；
其中
A)或者i)在所述第一异二聚体前体多肽内，包含含有杵突变的CH3结构域的多肽链包含所述第一抗原结合部分的至少一部分，并且在所述第二异二聚体前体多肽内，包含具有臼突变的CH3结构域的多肽链包含所述第二抗原结合部分的至少一部分，或者ii)在所述第一异二聚体前体多肽内，包含含有臼突变的CH3结构域的多肽链包含所述第一抗原结合部分的至少一部分，并且在所述第二异二聚体前体多肽内，包含具有杵突变的CH3结构域的多肽链包含所述第二抗原结合部分的至少一部分；并且其中
B)或者i)所述第一异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中所述第二异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；或者ii)所述第一异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中所述第二异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；并且其中
C)或者
i)包含杵突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含臼突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域，或者
ii)包含臼突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含杵突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域
包含以下氨基酸取代，其中根据Kabat编号系统进行编号：
-具有臼突变的CH3结构域包含至少一个选自下组的氨基酸取代：
o用带正电荷的氨基酸替换E357；
o用疏水性氨基酸替换S364；
o用疏水性氨基酸替换A368；和
o用疏水性氨基酸替换V407；和
-具有杵突变的CH3结构域包含至少一个选自下组的氨基酸取代：
o用带负电荷的氨基酸替换K370；
o用带负电荷的氨基酸替换K370，并用带负电荷的氨基酸替换K439；
o用带负电荷的氨基酸替换K392；和
o用疏水性氨基酸替换V397。
2.根据实施例1的异二聚体多肽组，其中C)中指示的包含杵突变的CH3结构域和包含臼突变的CH3结构域包含选自下表中指示的组的氨基酸取代之一：
3.根据实施例1的异二聚体多肽组，其中C)中指示的包含杵突变的CH3结构域和包含臼突变的CH3结构域包含选自下表中指示的组的氨基酸取代之一：
4.根据前述实施例之一的异二聚体多肽组，其中在C)中指示的具有杵突变的CH3结构域包含突变E357K的情况下，在C)中指示的具臼突变的CH3结构域不包含突变K370E。
5.根据前述实施例中的一项所述的一组异二聚体多肽，其中或者i)包含所述第一异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，或者ii)包含所述第一异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变。
6.根据实施例5所述的一组异二聚体多肽，其中i)包含所述第一异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含取代S354C，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含取代Y349C，或者ii)包含所述第一异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含取代Y349C，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含取代S354C。
7.根据实施例6的异二聚体多肽组，其中在所述第一异二聚体前体多肽内，包含杵突变的CH3结构域包含取代S354C，并且包含臼突变的CH3结构域在位置349处包含Y；并且其中在第二异二聚体前体多肽内，包含臼突变的CH3结构域包含取代Y349C，并且包含杵突变的CH3结构域在位置354处包含S。
8.根据前述实施例中的一项所述的一组异二聚体多肽，其中第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分包含一对VH结构域和VL结构域，它们形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。
9.根据前述实施例中的一项所述的一组异二聚体多肽，其中所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分是抗体片段。
10.根据实施例中的一项所述的一组异二聚体多肽，其中
-所述第一异二聚体前体多肽包含：
-第一重链多肽，其包含CH3结构域和第一抗体可变结构域，
-第二重链多肽，其包含CH3结构域，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其包含第二抗体可变结构域，其中所述第一抗体可变结构域和所述第二抗体可变结构域一起形成与靶抗原特异性结合的第一抗原结合位点；并且其中
-所述第二异二聚体前体多肽包含：
-第三重链多肽，其包含CH3结构域和第三抗体可变结构域，
-第四重链多肽，其包含CH3结构域，其中所述第三重链多肽和所述第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其包含第四抗体可变结构域，其中所述第三抗体可变结构域和所述第四抗体可变结构域一起形成与靶抗原特异性结合的第二抗原结合位点；并且其中
-或者i)所述第一重链多肽包含含有杵突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含含有臼突变的CH3结构域；或者ii)所述第一重链多肽包含含有臼突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含含有杵突变的CH3结构域。
11.根据前述实施例之一的异二聚体多肽组，其中所述第一异二聚体前体多肽和所述第二异二聚体前体多肽包含铰链区。
12.根据实施例14的异二聚体多肽组，其中所述第一异二聚体前体多肽和所述第二异二聚体前体多肽在铰链区不包含链间二硫键。
13.根据前述实施例中的一项所述的一组异二聚体多肽，其中所述第一异二聚体前体多肽和所述第二异二聚体前体多肽包含至少两条多肽链，其包含CH2结构域和CH3结构域。
14.根据前述实施例中的一项所述的一组异二聚体多肽，其中所述第一异二聚体前体多肽和所述第二异二聚体前体多肽包含至少两条多肽链，其从N末端到C末端方向包含CH2结构域和CH3结构域。
15.根据前述实施例之一的异二聚体多肽组，其中所述第一异二聚体前体多肽和所述第二异二聚体前体多肽包含至少两条多肽链，其从N末端到C末端方向包含铰链区、抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域。
16.根据实施例中的一项所述的一组异二聚体多肽，其中
a)所述第一异二聚体前体多肽包含：
-第一重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域，和CH3结构域，
-第二重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第一重链多肽的所述第二抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域，和CH3结构域，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含第一VL结构域和CL结构域，其中所述第一VH结构域和所述第一VL结构域相互缔合并形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且其中
b)所述第二异二聚体前体多肽包含：
-第三重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域，和CH3结构域，
-第四重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第三重链多肽的所述第三抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域，和CH3结构域，其中所述第三重链多肽和所述第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含第二VL结构域和CL结构域，其中所述第二VH结构域和所述第二VL结构域相互缔合并形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且其中
c)或者i)所述第一重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域；或者ii)所述第一重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域；并且其中
d)所述第一重链多肽和所述第三重链多肽的可变结构域能够形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。
17.根据实施例中的一项所述的一组异二聚体多肽，
其中第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含至少两条从N末端到C末端方向包含CH2结构域和CH3结构域的多肽链，
其中第一异二聚体前体多肽包含一条从N到C末端方向包含VL结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中第二异二聚体前体多肽包含一条从N末端到C末端方向包含VH结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，其中VL结构域和VH结构域能够形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。
18.根据实施例中的一项所述的一组异二聚体多肽，其中
a)所述第一异二聚体前体多肽包含：
-第一重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，
-第二重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第一重链多肽的所述第二抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含第一VL结构域和CL结构域，其中所述第一VH结构域和所述第一VL结构域相互缔合并形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且其中
b)所述第二异二聚体前体多肽包含：
-第三重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，
-第四重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第三重链多肽的所述第三抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中所述第三重链多肽和所述第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含第二VL结构域和CL结构域，其中所述第二VH结构域和所述第二VL结构域相互缔合并形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且其中
c)或者i)所述第一重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域；或者ii)所述第一重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域；并且其中
d)所述第一重链多肽和所述第三重链多肽的可变结构域能够形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。
19.根据前述实施例中的一项所述的一组异二聚体多肽，其中第一异二聚体前体多肽的抗原结合部分和第二异二聚体前体多肽的抗原结合部分与相同的抗原结合。
20.根据前述实施例中的一项所述的一组异二聚体多肽，其中第一异二聚体前体多肽的抗原结合部分和第二异二聚体前体多肽的抗原结合部分与不同的抗原结合。
21.根据前述实施例之一的异二聚体前体多肽组，其中B)中指示的VH结构域和VL结构域能够形成与CD3特异性结合的抗原结合位点。
22.根据前述实施例之一的异二聚体前体多肽组，其中在包含第一异二聚体多肽和第二异二聚体多肽的CH3结构域的两条多肽链之间没有形成链间二硫键。
23.一种产生异二聚体多肽的方法，其包括使如实施例1至22之一所定义的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽接触以形成第三异二聚体多肽，其包含至少一条包含来自所述第一异二聚体前体多肽的CH3结构域的多肽链，和至少一条包含来自所述第二异二聚体多肽的CH3结构域的多肽链。
24.根据实施例23的方法，其包括回收第三异二聚体多肽的步骤。
25.根据实施例23或24之一的方法，其中第三异二聚体多肽包含至少三个抗原结合位点。
26.根据实施例23至25之一的方法，其中第二异二聚体前体多肽包含与第二抗原特异性结合的抗原结合部分，并且其中第三异二聚体多肽包含与第一抗原特异性结合的抗原结合部分，和与第二抗原特异性结合的抗原结合部分，并且第三抗原结合部分由B)中指示的VL结构域和VH结构域形成。
27.根据实施例23至26之一的方法，其中第三异二聚体多肽包含至少三个抗原结合位点，其中第一抗原结合位点是第一抗原结合部分，第二抗原结合位点是第二抗原结合部分，并且第三抗原结合部分由B)中指示的VL结构域和VH结构域形成。
28.根据实施例23至27之一的方法，其中第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含铰链区，并且其中第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽不包含铰链区的链间二硫键。
29.根据实施例26的方法，其中在不存在还原剂的情况下进行接触。
30.一种通过根据实施例23至29中任一项的方法获得的异二聚体多肽。
31.如实施例1至22中任一项所定义的第一异二聚体前体多肽。
32.如实施例1至22中任一项所定义的第二异二聚体前体多肽。
33.根据实施例1至22中任一项的异二聚体前体多肽组用作药物。
34.一种药物组合物，其包含根据实施例1至22中任一项的异二聚体前体多肽组和药用载体。
35.一种治疗患有疾病的个体的方法，其包含向所述个体施用有效量的根据实施例1至22中任一项的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽或根据实施例34的药物组合物。
36.根据实施例1至22中任一项所述的异二聚体前体多肽组，其中在第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽中，B)中指示的VH结构域和VL结构域能够形成与CD3特异性结合的抗原结合位点，用于治疗癌症。
37.一种治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据实施例1至22中任一项的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽，其中在第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽中，B)中指示的VH结构域和VL结构域能够形成与CD3特异性结合的抗原结合位点。
氨基酸序列的描述
实例
提供以下实例以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解的是，在不脱离本发明精神的前提下，可以对阐明的程序进行修改。
实例1：
包含完整Fc结构域的单特异性前体多肽的产生
为了评估多肽链交换从单特异性前体多肽产生双特异性抗生物胞素酰胺(biocytinamid)/抗荧光素抗体的功效，产生以下单特异性前体多肽：
第一异二聚体前体多肽(也称为“抗生物前体”)包含与生物素衍生物生物胞素酰胺(“bio”)特异性结合的Fab片段，所述Fab片段具有SEQ ID NO:01的VL结构域和SEQ IDNO:02的VH结构域。第一前体多肽包含SEQ ID NO:03的轻链多肽(也称为“bio LC”)、SEQ IDNO:04的第一重链多肽(也称为“bio HC”)，以及基于SEQ ID NO：05的第二重链多肽(其代表没有去稳定突变的碱性氨基酸序列)，具有如下所示的去稳定突变和组氨酸标签。第二重链多肽(也称为“模拟臼”多肽)从N末端到C末端方向包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
第二异二聚体前体多肽(也称为“抗荧光素前体”)包含与荧光素(“fluo”)特异性结合的Fab片段，具有SEQ ID NO:06的VL结构域和SEQ ID NO:07的VH结构域。第二前体多肽包含SEQ ID NO:08的轻链多肽(也称为“fluo LC”)、SEQ ID NO:09的第一重链多肽(也称为“fluo HC”)，以及基于SEQ ID NO：10的第二重链多肽(其代表没有去稳定突变的碱性氨基酸序列)，具有如下所示的去稳定突变和组氨酸标签。第二重链多肽(也称为“模拟杵”多肽)从N末端到C末端方向包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
所示多肽链的CH3结构域包含以下突变：
表1：前体多肽的CH3结构域中的氨基酸取代
产生了包含具有SEQ ID NO:05的氨基酸序列的模拟臼多肽的抗生物前体，其中进行了以下氨基酸取代之一：E357K、D356K、A368F、V407Y、D399A F405W、S354V或S364L。
产生了包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的模拟杵多肽的抗荧光素前体，其中进行了以下氨基酸取代之一：K370E、W366I K409E、K370E K439E或K392D。
前体多肽的表达质粒如下产生：
对于如本文报道的抗生物和抗荧光素前体的表达，使用包含以下功能元件的转录单元：
-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的直接早期增强子和启动子，包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-编码相应前体多肽的核酸，以及
-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
-除了包括要表达的所需基因的表达单元/盒外，碱性/标准哺乳动物表达质粒还包含
-来自载体pUC18的复制起点，其允许在大肠杆菌中进行该质粒的复制，以及
-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
前体多肽的重组生产
本文报道的抗生物和抗荧光素前体的瞬时表达使用转染试剂混合物ExpiFectamineTM293转染试剂盒(A14524；Life TechnologiesTM)在Expi293FTM表达培养基(A1435101；LifeTechnologiesTM)中悬浮适应的Expi293FTM细胞(A14527；Life TechnologiesTM)中进行。
细胞在125ml摇瓶中解冻后通过稀释传代至少四次(体积30ml)(在37℃、7％CO2、85％湿度、135rpm下孵育/摇动)。在250ml体积中将细胞扩增至3x105个细胞/ml。三天后，将细胞分裂并以1.3*106个细胞/ml的密度新接种在1升摇瓶中的250ml体积中。24小时后以约2.2-2.8x106个细胞/ml的细胞密度进行转染。
在转染之前，将30μg质粒DNA用预热(水浴；37℃)的Opti-MEM(Gibco)稀释成1.5ml的终体积。轻轻混合溶液并在室温下孵育不超过5分钟。然后将1.5ml ExpiFectamineTM试剂在Opti-MEM中的预孵育溶液添加到DNA-OptiMEM溶液中。将所得溶液轻轻混合并在室温下孵育20-30分钟。将全部体积的混合物加入到100ml摇瓶、50ml离心管或48孔深孔板中的深孔中，其中含有30ml Expi293FTM培养物。
转染的细胞在37℃、7％CO2、85％湿度下孵育7天，并在摇瓶中以110rpm和离心管以205rpm振荡。
16-24h转染后，将20μl ExpiFectamineTM增强子1和200μl ExpiFectamineTM增强子2添加到30ml细胞培养物中。
通过在4,000rpm、4℃下离心20分钟收集上清液。此后，无细胞上清液通过0.22μm瓶顶过滤器过滤并储存在冰箱(-20℃)中。
使用MabSelectSure-SepharoseTM(GE Healthcare,Sweden)通过亲和色谱从细胞培养上清液中纯化抗体。
简而言之，将无菌过滤的细胞培养上清液捕获在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mMKH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe树脂上，用平衡缓冲液洗涤并用25mM柠檬酸钠(pH 3.0)洗脱。将各个前体多肽的洗脱级分合并并用2M Tris，pH 9.0中和。
或者，使用ani-Ckappa树脂(KappaSelect，GE Healthcare，瑞典)通过亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化前体多肽。
简而言之，将无菌过滤的细胞培养上清液捕获在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mMKH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的KappaSelect树脂上，用平衡缓冲液洗涤并用25mM柠檬酸钠(pH 3.0)洗脱。将洗脱的前体多肽级分合并并用2M Tris，pH 9.0中和。
前体多肽的身份通过质谱法确认。对于每个单独的样品，酶促去除(使用N-糖苷酶F)保守的Fc N-糖基化，蛋白质变性(盐酸胍)并还原二硫键(使用DTT或TCEP)。样品通过液相色谱(通过尺寸排阻或反相色谱)脱盐并通过质谱法(Bruker Maxis Q-ToF)进行分析。每个分子的身份通过精确的质量测量和与理论预期分子质量的比较来确认。
使用流速为1mg/ml的200mM K2HPO4/KH2PO4，250mM KCl，pH 7.0运行缓冲液，通过BioSuite高分辨SEC色谱柱(Waters,USA)进行分析尺寸排阻色谱。在反应设置之前评估所有单个前体多肽的单体含量。
实例2：
通过ELISA直接检测双特异性产物多肽形成来分析多肽链交换效率
为了评估不同的去稳定突变对多肽链交换的影响，使用实例1中产生的前体多肽建立了交换反应。
本实验中的多肽链交换不会导致另外的抗原结合位点的活化。
通过ELISA评估双特异性抗生物胞素酰胺/抗荧光素抗体产物多肽的存在。
为了开始交换反应，将抗生物前体多肽和抗荧光素前体多肽以等摩尔量(标准化为％单体SEC值以确保在单次反应中具有相同数量的完整分子)在384孔板(Brooks,#1800030)上混合，其中总体积为48μl 1xPBS+0.05％Tween 20+0.25mM TCEP，蛋白质浓度为2μM。值得注意的是，添加还原剂TCEP会还原铰链二硫化物，从而支持多肽链的解离。离心后，将板密封并在37℃下孵育一小时。通过ELISA分析所得反应混合物。
随后使用生物素-荧光素桥接ELISA来量化双特异性抗体：
因此，白色MaxiSorpTM 384孔板用1μg/ml白蛋白-荧光素异硫氰酸酯缀合物(Sigma,#A9771)涂覆，并在4℃下孵育过夜。用90μl PBST-缓冲液(PBST，双蒸水，10xPBS+0.05％Tween 20)洗涤3次后，以90μl/孔加入封闭缓冲液(1xPBS，2％明胶，0.1％Tween-20)并在室温下孵育一小时。在用90μl PBST-缓冲液洗涤3次后，将25μl 1:4稀释的每种反应混合物加入到每个孔中。在室温下温育一小时后，将板再次用90μl PBST-缓冲液洗涤3次。将在0.5％BSA、0.025％Tween-20、1xPBS中的25μl/孔生物素-Cy5缀合物添加至终浓度为0.1μg/ml，并将板在室温下孵育一小时。在用90μl PBST-缓冲液洗涤6次后，将25μl 1xPBS添加到每个孔中。在Tecan Safire 2 Reader上以670nm的发射波长(在649nm激发)测量Cy5荧光。
预先形成的抗荧光素/抗生物胞素酰胺双特异性参考抗体(SEQ ID NO:03的生物轻链、SEQ ID NO:04的生物重链、SEQ ID NO:08的荧光轻链和SEQ ID NO:09的荧光重链)用作反应结果的100％对照。
如上所示，预先形成的双特异性参考抗体通过的分析性尺寸排阻色谱分析：
表2：双特异性参考抗体的单体含量
桥接ELISA设置中参考抗体的吸光度信号是23次反应的平均值。该平均值用作所有多肽链交换反应标准化的100％桥接信号。桥接ELISA中参考抗体的测定差异性为100+/-15.2％。高于100％的多肽链交换反应可能属于这种差异性。此外，反应混合物中可能出现的潜在聚集体可能会导致桥接信号增加。
结果在表3中示出。
表3：通过多肽链反应从抗生物和抗荧素光前体多肽形成双特异性产物多肽，所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含指示的去稳定突变。列表示抗生物前体的模拟臼多肽中的去稳定突变；行表示抗荧光素前体的模拟杵多肽中的去稳定突变。显示了通过桥接ELISA检测到的相对吸光度。
实例3：
用于在多肽链交换后产生可活化结合位点的单特异性前体多肽的产生
为了评估由单特异性前体多肽形成的双特异性抗LeY/抗CD3抗体，产生了如图1和图2所示的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽所描绘的结构域布置的单特异性前体多肽。
没有CH2结构域的前体多肽
在第一组实验中，提供了具有如图1所示结构域布置的异二聚体前体多肽。前体多肽没有CH2结构域并且包含布置在CH3结构域N末端的抗体可变结构域。
在第一个替代方案中，提供了以下前体多肽：
-第一异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VH)-杵前体”)包含与LeY特异性结合的Fab片段。抗LeY-CD3(VH)-杵前体包含SEQ ID NO:11的轻链多肽(也称为“LeY LC”)、SEQ ID NO:12的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VH)-杵HC”)，其包含源自与CD3特异性结合的抗体的VH结构域(“CD3(VH)”)，以及基于SEQ ID NO:13(其代表没有去稳定突变的碱性氨基酸序列)的第二重链多肽，具有如下所示的去稳定突变和组氨酸标签。第二重链多肽(也称为“模拟-VL-臼”多肽)从N末端到C末端方向包含铰链区、源自与地高辛(“dig”)特异性结合的抗体的VL结构域和CH3结构域。
-第二异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VL)-臼前体”)包含与LeY特异性结合的Fab片段。抗LeY-CD3(VL)-杵前体包含SEQ ID NO:11的轻链多肽(即LeY LC)；SEQ IDNO:14的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VL)-臼HC”)，其包含源自与CD3特异性结合的抗体的VL结构域(“CD3(VL)”)，以及基于SEQ ID NO:15(其代表没有去稳定突变的碱性氨基酸序列)的第二重链多肽，具有如下所示的去稳定突变和组氨酸标签。第二重链多肽(也称为“模拟-VH-杵”多肽)从N末端到C末端方向包含铰链区、源自非结合抗体的VH结构域和CH3结构域。
在第二个替代方案中，提供了以下前体多肽：
-第一异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VL)-杵前体”)包含与LeY特异性结合的Fab片段。抗LeY-CD3(VL)-杵前体包含SEQ ID NO:11的轻链多肽(即LeY LC)；SEQ IDNO:16的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VL)-杵HC”)，其包含CD3(VL)结构域，以及基于SEQID NO:17(其代表没有去稳定突变的碱性氨基酸序列)的第二重链多肽，具有如下所示的去稳定突变和组氨酸标签。第二重链多肽(也称为“模拟-VH-臼”多肽)从N末端到C末端方向包含铰链区、源自非结合抗体的VH结构域和CH3结构域。
-第二异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VH)-臼前体”)包含与LeY特异性结合的Fab片段。抗LeY-CD3(VH)-臼前体包含SEQ ID NO:11的轻链多肽(即LeY LC)；SEQ IDNO:18的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VH)-臼HC”)，其包含CD3(VH)结构域，以及基于SEQID NO:19(其代表没有去稳定突变的碱性氨基酸序列)的第二重链多肽，具有如下所示的去稳定突变和组氨酸标签。第二重链多肽(也称为“模拟-VL-杵”多肽)从N末端到C末端方向包含铰链区、源自抗dig抗体的VL结构域和CH3结构域。
所示多肽链包含以下突变：
表4：前体多肽的CH3结构域中的氨基酸取代
具有Fc结构域的前体多肽
在第二组实验中，提供了具有如图2所示结构域布置的异二聚体前体多肽。前体多肽包含完整的Fc结构域并包含布置在CH2结构域N末端的抗体可变结构域。
在第一个替代方案中，提供了以下前体多肽：
-第一异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VH)-Fc(杵)前体”)包含与LeY特异性结合的Fab片段。抗LeY-CD3(VH)-Fc(杵)前体包含SEQ ID NO:11的轻链多肽(即LeY LC)；SEQ ID NO:20的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VH)-Fc(杵)HC”)，其包含CD3(VH)结构域，以及基于SEQ ID NO:21(其代表没有去稳定突变的碱性氨基酸序列)的第二重链多肽，具有如下所示的去稳定突变和组氨酸标签。第二重链多肽(也称为“模拟-VL-Fc(臼)”多肽)从N末端到C末端方向包含铰链区、源自与地高辛(“dig”)特异性结合的抗体的VL结构域、CH2结构域和CH3结构域。
-第二异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VL)-Fc(臼)前体”)包含与LeY特异性结合的Fab片段。抗LeY-CD3(VL)-Fc(臼)前体包含LeY LC；SEQ ID NO:22的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VL)-Fc(臼)HC”)，其包含CD3(VL)结构域，以及基于SEQ ID NO:23(其代表没有去稳定突变的碱性氨基酸序列)的第二重链多肽，具有如下所示的去稳定突变和组氨酸标签。第二重链多肽(也称为“模拟-VH-Fc(杵)”多肽)从N末端到C末端方向包含铰链区、源自抗dig抗体的VH结构域、CH2结构域和CH3结构域。
在第二个替代方案中，提供了以下前体多肽：
-第一异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VL)-Fc(杵)前体”)包含与LeY特异性结合的Fab片段。抗LeY-CD3(VL)-Fc(杵)前体包含LeY LC；SEQ ID NO:24的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VL)-Fc(杵)HC”)，其包含CD3(VL)结构域，以及基于SEQ ID NO:25(其代表没有去稳定突变的碱性氨基酸序列)的第二重链多肽，具有如下所示的去稳定突变和组氨酸标签。第二重链多肽(也称为“模拟-VH-Fc(臼)”多肽)从N末端到C末端方向包含铰链区、源自抗dig抗体的VH结构域、CH2结构域和CH3结构域。
-第二异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VH)-Fc(臼)前体”)包含与LeY特异性结合的Fab片段。抗LeY-CD3(VH)-Fc(臼)前体包含LeY LC；SEQ ID NO:26的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VH)-Fc(臼)HC”)，其包含CD3(VH)结构域，以及基于SEQ ID NO:27(其代表没有去稳定突变的碱性氨基酸序列)的第二重链多肽，具有如下所示的去稳定突变和组氨酸标签。第二重链多肽(也称为“模拟-VL-Fc(杵)”多肽)从N末端到C末端方向包含铰链区、源自抗dig抗体的VL结构域、CH2结构域和CH3结构域。
所示多肽链包含以下突变：
表5：前体多肽的CH3结构域中的氨基酸取代
产生异二聚体前体多肽，其包含如上所示的SEQ ID NO:13的模拟VL-臼多肽和SEQID NO:17的模拟VH-臼多肽，具有如上所示的相应模拟多肽的氨基酸序列，其中进行了以下氨基酸取代之一：E357K、A368F、D399A F405W、S364L、Y407W或S354V。
产生异二聚体前体多肽，其包含如上所示的SEQ ID NO:15的模拟VH-杵多肽和SEQID NO:19的模拟VL-杵多肽，具有如上所示的相应模拟多肽的氨基酸序列，其中进行了以下氨基酸取代之一：K370E、无去稳定突变、W366I K409D、V397Y或K392D。
产生异二聚体前体多肽，其包含如上所示的SEQ ID NO:21的模拟VL-Fc(臼)多肽和SEQ ID NO:25的模拟-VH-Fc(臼)多肽，具有如上所示的相应模拟多肽的氨基酸序列，其中进行了以下氨基酸取代之一：E357K、A368F、D399A F405W、S364L、D356K或S354V。
产生异二聚体前体多肽，其包含如上所示的SEQ ID NO:23的模拟-VH-Fc(杵)多肽和SEQ ID NO:27的模拟-VL-Fc(杵)多肽，具有如上所示的相应模拟多肽的氨基酸序列，其中进行了以下氨基酸取代之一：K370E、无去稳定突变、W366I K409D、V397Y、K392D或K370EK439E。
前体多肽的重组生产
通过现有技术将质粒和每种前体多肽的三个多肽链共转染到哺乳动物细胞中(例如HEK293或Expi293FTM)来进行表达。
为了表达上述前体多肽，使用包含以下功能元件的转录单元：
-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的直接早期增强子和启动子，包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-编码相应前体多肽的核酸，以及
-具有聚腺苷酸化信号序列的3'-非翻译区。
除了包括要表达的所需基因的表达单元/盒外，碱性/标准哺乳动物表达质粒还包含
-复制起点，其允许在大肠杆菌中进行该质粒的复制，以及
-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
通过PCR和/或基因合成产生编码包含前体多肽链的表达盒，并将所述融合基因通过已知的重组方法和技术，通过例如使用相应质粒中的独特限制性位点连接相应的核酸区段来进行装配。通过DNA测序来验证亚克隆的核酸序列。为了进行瞬时转染，通过质粒制备从转化的大肠杆菌培养物制备较大量的质粒(HiSpeed Plasmid Maxi Kit,Qiagen)。
使用如在Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编辑)，John Wiley&Sons,Inc中所述的标准细胞培养技术。
前体多肽衍生物通过使用HEK293-F系统(Invitrogen)或Expi293FTM(LiveTechnologies)根据制造商的说明用相应的质粒瞬时转染产生。简而言之，在摇瓶或搅拌发酵罐中悬浮在无血清FreeStyleTM 293表达培养基(Invitrogen)或Expi293FTM表达培养基(Life Technologies)中生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)或Expi293FTM细胞(LiveTechnologies)用相应的表达质粒和293fectinTM、fectin(Invitrogen)或PEIpro(Polyplus)或试剂混合物ExpiFectamineTM 293转染试剂盒(Life Technologies)转染。对于1-2L摇瓶(Corning)，将HEK293-F细胞或Expi293FTM细胞在250-600mL中以1-1.3*106个细胞/mL的密度接种，并在120rpm、8％CO2下孵育。用适当的表达质粒转染细胞后的第二天。将HEK293-F细胞以约1.5*106个细胞/mL的细胞密度转染，其中体积为42mL的以下混合物：A)20mL Opti-MEM(Invitrogen)与300μg总质粒DNA(0.5μg/mL)和B)20ml Opti-MEM+1.2mL293 fectin或fectin(2μL/mL)或750μl PEIpro(1.25μL/mL)。Expi293FTM细胞以约2.2-2.8x106个细胞/ml的细胞密度进行转染。在转染之前，将30μg质粒DNA用预热(水浴；37℃)的Opti-MEM(Gibco)稀释成1.5ml的终体积。轻轻混合溶液并在室温下孵育不超过5分钟。然后将1.5ml ExpiFectamineTM试剂在Opti-MEM中的预孵育溶液添加到DNA-OptiMEM溶液中。将所得溶液轻轻混合并在室温下孵育20-30分钟。将全部体积的混合物加入到具有30mlExpi293FTM培养物的100ml摇瓶中。将培养物在37℃、7％CO2、85％湿度下以110rpm的速度孵育7天。对于Expi293FTM培养物，在转染后15-24h将20μl ExpiFectamineTM增强子1和200μlExpiFectamineTM增强子2添加到30ml细胞培养物中。根据葡萄糖消耗，在发酵过程中加入葡萄糖溶液。正确组装的分裂细胞因子分子像标准IgG一样被分泌到培养物上清液中。5-10天后收获含有分裂细胞因子分子的上清液，并且直接从上清液中纯化分裂细胞因子分子，或者将上清液在-20℃冷冻并储存。
具有完整Fc区(CH2-CH3)的前体多肽与蛋白A结合。这些前体通过蛋白A色谱和SEC进行纯化。
前体多肽不含CH2结构域但含有κ轻链。因此，通过应用标准κ轻链亲和色谱来纯化这些前体。通过使用KappaSelect(GE Healthcare，瑞典)的亲和色谱和Superdex 200尺寸排阻(GE Healthcare，瑞典)色谱或离子交换色谱，从细胞培养物上清液中纯化前体多肽。
简而言之，将无菌过滤的细胞培养上清液捕获在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mMKH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的KappaSelect树脂上，用平衡缓冲液洗涤并用50mM柠檬酸钠、150mM NaCl(pH 3.0)洗脱。将洗脱的前体多肽级分合并并用2M Tris，pH9.0中和。通过尺寸排阻色谱或离子交换色谱进一步纯化前体多肽库。对于尺寸排阻色谱，使用20mM组氨酸、140mM NaCl、pH 6.0平衡的SuperdexTM 200pg HiLoadTM 16/600(GEHealthcare，瑞典)柱。对于离子交换色谱，从KappaSelect纯化中获得的蛋白质样品在20mM组氨酸，pH 6.0中按1:10稀释，并装载到用缓冲液A(20mM组氨酸，pH 6.0)平衡的HiTrapTMSP HP离子交换(GE Healthcare，瑞典)柱。应用0-100％缓冲液B(20mM组氨酸，1M NaCl，pH6.0)的梯度来洗脱不同的蛋白质种类。
通过SDS-PAGE纯化后分析纯度和完整性。将蛋白质溶液(13μl)与5μl 4x NuPAGELDS样品缓冲液(Invitrogen)和2μl 10x NuPAGE样品还原剂(Invitrogen)混合并加热至95℃，持续5分钟。将样品装载到NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上，并根据制造商的说明使用Novex Mini-Cell(Invitrogen)和NuPAGE MES SDS运行缓冲液(LifeTechnologies).运行。凝胶使用InstantBlueTM考马斯蛋白染色剂染色。此外，使用分析尺寸排阻色谱分析蛋白质的完整性和均匀性。
(CE-)SDS-PAGE显示所有预期的多肽链都存在于制剂中；分析尺寸排阻确认了＞90％的制剂纯度。关于用于评估例如抗体纯度的方法的综述，参见Flatman,S.等人，J.Chrom.B 848(2007)79-87。
实例4：
通过T细胞活化测定法测定多肽链交换
为了评估不同的去稳定突变对多肽链交换的影响，使用实例3中产生的前体多肽建立了交换反应。不含CH2结构域的前体多肽的预期产物多肽的结构显示在图1中，包含完整Fc结构域的前体多肽的预期产物多肽的结构显示在图2中。多肽链交换导致形成与CD3特异性结合的抗原结合位点。双特异性抗LeY/抗CD3产物多肽的存在通过基于细胞的测定来评估。
根据以下原理，在由表达LeY的MCF7细胞和Jurkat报告基因细胞系(PromegaJ1621)组成的基于细胞的报告基因测定系统中评估不同CH3界面突变对该链交换反应效力的影响：第一异二聚体多肽和第二异二聚体多肽与MCF7细胞的结合和多肽链交换导致形成与CD3特异性结合的抗原结合位点。表达CD3的Jurkat细胞和与CD3特异性结合的抗原结合位点结合，这导致Jurkat细胞表达荧光素酶。加入BioGlo底物后检测到发光。
简而言之，基于细胞的测定如下在384孔板中进行。含有10％FCS的RPMI1640用作测定培养基。6x104Jurkat效应细胞与2x104MCF7细胞混合，总体积为10μl。前体多肽单独或组合以200nM和2nM应用，最终体积为30μl。细胞在细胞培养条件下孵育20小时。每孔加入24μl Bioglo，孵育5分钟。在200 PRO读取器(TECAN)中测量发光。
表6：通过多肽链反应从如上文实例3中定义的不含CH2结构域的前体多肽形成双特异性产物多肽，所述前体多肽包含在模拟链的CH3结构域中的指示的去稳定突变。结果显示前体多肽浓度为200nM时的交换反应。发光效率评定如下：<10％…“-“,10-29％…”+”,30-50％…“++”,>50％…”+++”)
表7：通过多肽链反应从如上文实例3中定义的不含CH2结构域的前体多肽形成双特异性产物多肽，所述前体多肽包含在模拟链的CH3结构域中的指示的去稳定突变。结果显示前体多肽浓度为2nM时的交换反应。发光效率评定如下：<2％…“-“,2-4％…”+”,5-10％…“++”,>10％…”+++”)
表8：通过多肽链反应从如上文实例3中定义的具有Fc结构域的前体多肽形成双特异性产物多肽，所述前体多肽包含在模拟链的CH3结构域中的指示的去稳定突变。结果显示前体多肽浓度为2nM时的交换反应。发光效率评定如下：<10％…“-“,10-19％…”+”,20-50％…“++”,>50％…”+++”)
实例5：
通过T细胞活化测定法测量溶液中多肽链交换和细胞内多肽链交换的组合评估
对于治疗应用，希望减少不希望的脱靶效应。因此，异二聚体前体多肽作为前药在治疗上应用以在多肽链交换后形成治疗活性产物多肽。希望多肽链交换优选仅在前体多肽与靶细胞结合后才在很大程度上发生，而循环中的自发多肽链交换不发生或仅很小程度的发生。因此，在进行多肽链交换以活化靶细胞处的抗原结合位点的同时在溶液中表现出轻度或低多肽链交换的前体多肽对于治疗应用是特别需要的。因此，将实例2(在溶液中的多肽链交换)和实例4(在细胞上的多肽链交换)的结果对齐。
表9：通过多肽链反应从前体多肽形成双特异性产物多肽，所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含指示的去稳定突变。列表示模拟杵多肽中的去稳定突变；行表示模拟臼多肽中的去稳定突变。显示了溶液中(“IS”，如实例2中检测到的)和细胞上(“OC”，如实例4中针对不含CH2结构域的多肽检测到的)中每对去稳定突变的多肽链交换。多肽链交换功效等级如下：低…“-”，轻度…“+”，中…“++”，高…“+++”)
表10：通过多肽链反应从前体多肽形成双特异性产物多肽，所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含指示的去稳定突变。列表示模拟杵多肽中的去稳定突变；行表示模拟臼多肽中的去稳定突变。显示了溶液中(“IS”，如实例2中检测到的)和细胞上(“OC”，如实例4中针对具有Fc结构域的多肽检测到的)每对去稳定突变的多肽链交换。多肽链交换功效等级如下：低…“-”，轻度…“+”，中…“++”，高…“+++”)
能够介导抗原结合位点的在细胞上的活化，并且在溶液中表现出低至轻度多肽链交换的前体多肽被认为特别适合于治疗应用。
因此，从测试的不同前体多肽中，包含以下去稳定突变对的前体多肽被认为有希望用于治疗应用的异二聚体前体多肽的CH3结构域：
表11：包含在根据本发明的异二聚体前体多肽的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域中的去稳定突变
在上文指出的被认为有希望用于治疗应用的异二聚体前体多肽的CH3结构域中的去稳定突变对中，具有以下去稳定突变对的前体多肽在溶液中表现出低至轻度的多肽链交换，但在细胞上介导高多肽链交换，如通过T细胞活化测定法检测到的：
表12：包含在根据本发明的异二聚体前体多肽的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域中的去稳定突变
实例6：
包含完整Fc结构域的其他单特异性前体多肽的产生
为了评估由单特异性前体多肽形成的双特异性抗生物胞素酰胺(biocytinamid)/抗荧光素抗体，产生了如图1所示的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽所描绘的结构域布置的单特异性前体多肽。请注意，在该实验中，杵突变和臼突变布置在相反的链上。
第一异二聚体前体多肽(也称为“抗荧光素前体”)包含与荧光素(“fluo”)特异性结合的Fab片段，生物素衍生物，具有SEQ ID NO:06的VL结构域和SEQ ID NO:07的VH结构域。第一前体多肽包含SEQ ID NO:08的轻链多肽(也称为“fluo LC”)、SEQ ID NO:29的第一重链多肽(也称为“fluo HC”)，以及基于SEQ ID NO：05的第二重链多肽(其代表没有去稳定突变的碱性氨基酸序列)，具有如下所示的去稳定突变和C标签。第二重链多肽(也称为“模拟臼”多肽)从N末端到C末端方向包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
第二异二聚体前体多肽(也称为“抗生物前体”)包含与生物胞素酰胺(“bio”)特异性结合的Fab片段，具有SEQ ID NO:01的VL结构域和SEQ ID NO:02的VH结构域。第二前体多肽包含SEQ ID NO:03的轻链多肽(也称为“bio LC”)、SEQ ID NO:28的第一重链多肽(也称为“bio HC”)，以及基于SEQ ID NO：10的第二重链多肽(其代表没有去稳定突变的碱性氨基酸序列)，具有如下所示的去稳定突变和C标签。第二重链多肽(也称为“模拟杵”多肽)从N末端到C末端方向包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
根据实例1中公开的方法产生第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽。
所示多肽链的CH3结构域包含以下突变：
表13：具有在CH3结构域中具有指示的去稳定突变的模拟臼链的抗荧光素前体多肽的纯化产率和单体含量(纯化产率[mg/ml]＝每升表达体积的纯化的抗体量，由％单体峰校正；单体＝所需的异二聚体前体多肽)
表14：具有在CH3结构域中具有指示的去稳定突变的模拟杵链的抗生物前体多肽的纯化收率和单体含量(纯化收率[mg/ml]＝每升表达体积的纯化的抗体量，由％单体峰校正；单体＝所需的异二聚体前体多肽)
| 去稳定突变 | 纯化产率[mg/L] | ％SEC单体 |
| W366I-K409D | 40.2 | 91.0 |
| K370E-K439E | 45.7 | 98.9 |
| W366I-F405W-K409D | 106.8 | 93.7 |
| W366I-K409D-K439E | 37.9 | 93.4 |
实例7：
来自实例6的前体多肽的多肽链交换效率分析
为了评估不同的去稳定突变对多肽链交换的影响，进行了实例6中产生的前体多肽之间的交换反应。根据实例2中描述的方法进行实验。预期产物多肽的结构如图1所示。
表15：通过多肽链交换反应从抗生物和抗荧素光前体多肽形成双特异性产物多肽，所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含指示的去稳定突变。列表示抗荧光素前体的模拟臼多肽中的去稳定突变；行表示抗生物前体的模拟杵多肽中的去稳定突变。数值通过产物产率[％]表示交换效率。实验获得的产率与双特异性抗体的最大可能产率有关。双特异性抗体的最大可能产率由每个反应中两种相应输入格式的最低％单体峰SEC校正，因为预计只有单体对重组有效。
实例8：
包含完整Fc结构域的其他单特异性前体多肽的产生，其中前体多肽的CH3结构域包含杵入臼突变但不包含半胱氨酸突变
为了评估由单特异性前体多肽形成的双特异性抗生物胞素酰胺(biocytinamid)/抗荧光素抗体，产生了如图1所示的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽所描绘的结构域布置的单特异性前体多肽。请注意，在该实验中，杵突变和臼突变布置在相反的链上。
根据其中公开的结构和方法产生如实例5中所述的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽。
此外，与实例1不同的是，bio HC基于SEQ ID NO:28，但在位置354处具有丝氨酸残基，而fluo HC基于SEQ ID NO:29，但在位置349处具有酪氨酸残基。因此，CH3结构域的突变总结如下：
表16：前体多肽的CH3结构域中的氨基酸取代
所示多肽链的CH3结构域包含以下突变：
表17：具有在CH3结构域中具有指示的去稳定突变的模拟杵链的抗生物前体多肽的纯化收率和单体含量(纯化收率[mg/ml]＝每升表达体积的纯化的抗体量，由％单体峰校正；单体＝所需的异二聚体前体多肽)
| 去稳定突变 | 纯化产率[mg/L] | ％SEC单体 |
| V407Y | 16.8 | 97.4 |
| D356K | 22.9 | 91.2 |
| D356K-E357K | 68.4 | 99.0 |
| S364L | 23.4 | 94.9 |
| S364A | 38.3 | 95.1 |
| S364I | 69.5 | 97.9 |
| S364Q | 36.4 | 95.3 |
| D356K-V407Y | 16.7 | 93.7 |
| D356K-S364L | 30.2 | 98.2 |
| E357K-T394I | 27.9 | 96.4 |
表18：具有在CH3结构域中具有指示的去稳定突变的模拟臼链的抗荧光素前体多肽的纯化产率和单体含量(纯化产率[mg/ml]＝每升表达体积的纯化的抗体量，由％单体峰校正；单体＝所需的异二聚体前体多肽)
| 去稳定突变 | 纯化产率[mg/L] | ％SEC单体 |
| W366I-K409D | 59.7 | 98.3 |
| D399K-K409E | 40.4 | 85.5 |
| W366I-F405W-K409D | 87.4 | 98.3 |
| W366I-K409D-K439E | 60.2 | 97.7 |
| Y349E-W366I-K409D | 58.1 | 98.4 |
实例9：
来自实例7的前体多肽的多肽链交换效率分析
为了评估不同的去稳定突变对多肽链交换的影响，进行了实例7中产生的前体多肽之间的交换反应。根据实例2中描述的方法进行实验。
表19：通过多肽链交换反应从抗生物和抗荧素光前体多肽形成双特异性产物多肽，所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含指示的去稳定突变。列表示抗荧光素前体的模拟臼多肽中的去稳定突变；行表示抗生物前体的模拟杵多肽中的去稳定突变。数值通过产物产率[％]表示交换效率。实验获得的产率与双特异性抗体的最大可能产率有关。双特异性抗体的最大可能产率由每个反应中两种相应输入格式的最低％单体峰SEC校正，因为预计只有单体对重组有效。
结果表明，对于异二聚体前体多肽，多肽链交换是可检测到的，其中杵入臼突变不会被另外的半胱氨酸突变稳定。
实例10：
包含完整Fc结构域的其他单特异性前体多肽的产生，在前体多肽的CH3结构域中具有不同的突变
为了评估由单特异性前体多肽形成的双特异性抗生物胞素酰胺(biocytinamid)/抗荧光素抗体，产生了如图1所示的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽所描绘的结构域布置的单特异性前体多肽。请注意，在该实验中，杵突变和臼突变布置在相反的链上。
根据其中公开的结构和方法产生如实例6中所述的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽，但是具有以下区别：
与实例6不同，产生了三种与荧光素特异性结合的前体多肽，其中fluo HC基于SEQID NO:29，并且模拟臼多肽基于具有以下CH3突变的SEQ ID NO:05：
-与实例1不同，产生了三种与生物胞素酰胺特异性结合的前体多肽，其中bio HC基于SEQ ID NO:28，并且模拟杵多肽基于具有以下CH3突变的SEQ ID NO:10：
表20：指示的前体多肽的纯化收率和单体含量(纯化收率[mg/ml]＝每升表达体积的纯化的抗体量，由％单体峰校正；单体＝所需的异二聚体前体多肽)
| 突变模拟 | 纯化产率[mg/L] | ％SEC单体 |
| #01 | 70.0 | 97.4 |
| #02 | 17.1 | 92.1 |
| #03 | 67.4 | 99.6 |
| #04 | 114.3 | 96.1 |
| #05 | 44.7 | 96.1 |
| #06 | 142.6 | 98.8 |
实例11：
来自实例10的前体多肽的多肽链交换效率分析
为了评估不同的去稳定突变对多肽链交换的影响，进行了实例10中产生的前体多肽之间的交换反应。根据实例2中描述的方法进行实验。
表21：从指示的抗生物和抗荧素光前体多肽通过多肽链交换反应形成双特异性产物多肽。数值通过产物产率[％]表示交换效率。实验获得的产率与双特异性抗体的最大可能产率有关。双特异性抗体的最大可能产率由每个反应中两种相应输入格式的最低％单体峰SEC校正，因为预计只有单体对重组有效。
结果表明多肽链的出现与在模拟链多肽或包含抗原结合部分的多肽链上布置半胱氨酸突变无关。
Claims (8)
1.一组异二聚体前体多肽，其包含：
-第一异二聚体前体多肽，其包含至少两条包含CH3结构域的多肽链，其中所述两条包含CH3结构域的多肽链通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变，
其中所述第一异二聚体前体多肽包含第一抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分布置在所述两条包含CH3结构域的多肽链之一上，和
-第二异二聚体前体多肽，其包含至少两条包含CH3结构域的多肽链，其中所述两条包含CH3结构域的多肽链通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变，
其中所述第二异二聚体前体多肽包含第二抗原结合部分，其中所述第二抗原结合部分布置在所述两条包含CH3结构域的多肽链之一上；
其中包含在前体多肽中的CH3结构域属于人IgG1亚类，其中
A)
i)在所述第一异二聚体前体多肽内，包含含有杵突变的CH3结构域的多肽链包含所述第一抗原结合部分，并且在所述第二异二聚体前体多肽内，包含具有臼突变的CH3结构域的多肽链包含所述第二抗原结合部分，或者ii)在所述第一异二聚体前体多肽内，包含含有臼突变的CH3结构域的多肽链包含所述第一抗原结合部分，并且在所述第二异二聚体前体多肽内，包含具有杵突变的CH3结构域的多肽链包含所述第二抗原结合部分；并且其中
B)
i)所述第一异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中所述第二异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；或者ii)所述第一异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域和CH3结构域的多肽链，并且
其中所述第二异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与一对VH结构域和VL结构域缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；并且其中
C)
i)包含杵突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含臼突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域，或者ii)包含臼突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含杵突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域
包含以下氨基酸取代，其中根据Kabat编号系统进行编号，
其中杵突变和臼突变包含选自下表中指示的组的氨基酸取代之一：
。
2.根据权利要求1所述的一组异二聚体多肽，其中杵突变和臼突变分别由选自下表中指示的组的氨基酸取代之一组成：
3.根据权利要求1或2所述的一组异二聚体多肽，其中或者i)包含所述第一异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，或者ii)包含所述第一异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且包含所述第二异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变。
4.根据权利要求1或2所述的一组异二聚体多肽，其中所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分是抗体片段。
5.根据权利要求1或2所述的一组异二聚体多肽，其中
a)所述第一异二聚体前体多肽包含：
-第一重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域，和CH3结构域，
-第二重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第一重链多肽的所述第二抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域，和CH3结构域，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含第一VL结构域和CL结构域，其中所述第一VH结构域和所述第一VL结构域相互缔合并形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且其中
b)所述第二异二聚体前体多肽包含：
-第三重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域，和CH3结构域，
-第四重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第三重链多肽的所述第三抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域，和CH3结构域，其中所述第三重链多肽和所述第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含第二VL结构域和CL结构域，其中所述第二VH结构域和所述第二VL结构域相互缔合并形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且其中
c)或者i)所述第一重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域；或者ii)所述第一重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域；并且其中
d)所述第一重链多肽和所述第三重链多肽的可变结构域能够形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。
6.根据权利要求1或2所述的一组异二聚体多肽，其中
a)所述第一异二聚体前体多肽包含：
-第一重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，
-第二重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第一重链多肽的所述第二抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含第一VL结构域和CL结构域，其中所述第一VH结构域和所述第一VL结构域相互缔合并形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且其中
b)所述第二异二聚体前体多肽包含：
-第三重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，
-第四重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第三重链多肽的所述第三抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中所述第三重链多肽和所述第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其从N末端到C末端方向包含第二VL结构域和CL结构域，其中所述第二VH结构域和所述第二VL结构域相互缔合并形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且其中
c)或者i)所述第一重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域；或者ii)所述第一重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域；并且其中
d)所述第一重链多肽和所述第三重链多肽的可变结构域能够形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。
7.根据权利要求1或2所述的一组异二聚体前体多肽，其中B)中指示的VH结构域和VL结构域能够形成与CD3特异性结合的抗原结合位点。
8.根据权利要求1或2所述的一组异二聚体前体多肽，其中在包含所述第一异二聚体多肽和所述第二异二聚体多肽的CH3结构域的两条多肽链之间没有形成链间二硫键。
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