RU2129373C1 - Способ борьбы с нематодами - Google Patents
Способ борьбы с нематодами Download PDFInfo
- Publication number
- RU2129373C1 RU2129373C1 RU93005092A RU93005092A RU2129373C1 RU 2129373 C1 RU2129373 C1 RU 2129373C1 RU 93005092 A RU93005092 A RU 93005092A RU 93005092 A RU93005092 A RU 93005092A RU 2129373 C1 RU2129373 C1 RU 2129373C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nematode
- plant
- nematodes
- gene
- product
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 claims abstract description 92
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 claims abstract description 30
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 5
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 26
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 24
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 21
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 21
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 20
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 14
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 11
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 claims description 9
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 8
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 8
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 7
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 5
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 claims description 4
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 claims description 3
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 claims description 3
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 3
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 3
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 claims description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000010019 sublethal effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 241001442497 Globodera rostochiensis Species 0.000 description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 241000482313 Globodera ellingtonae Species 0.000 description 7
- 241001480224 Heterodera Species 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 5
- 230000001679 anti-nematodal effect Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241001489135 Globodera pallida Species 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000498254 Heterodera glycines Species 0.000 description 3
- 241000379510 Heterodera schachtii Species 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000005645 nematicide Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 2
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000923667 Globodera tabacum Species 0.000 description 2
- 241001481225 Heterodera avenae Species 0.000 description 2
- 101000728145 Homo sapiens Calcium-transporting ATPase type 2C member 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001064774 Homo sapiens Peroxidasin-like protein Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 240000001766 Mycetia javanica Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102100031894 Peroxidasin-like protein Human genes 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000001069 nematicidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 235000021533 Beta vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108700003861 Dominant Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100021587 Embryonic testis differentiation protein homolog A Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241001442498 Globodera Species 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 208000012766 Growth delay Diseases 0.000 description 1
- 101000898120 Homo sapiens Embryonic testis differentiation protein homolog A Proteins 0.000 description 1
- 101001095807 Homo sapiens Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 101000962469 Homo sapiens Transcription factor MafF Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001143352 Meloidogyne Species 0.000 description 1
- 241000243785 Meloidogyne javanica Species 0.000 description 1
- 206010061291 Mineral deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010051141 Myeloblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Natural products CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039187 Transcription factor MafF Human genes 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 241001002356 Valeriana edulis Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- QGLZXHRNAYXIBU-WEVVVXLNSA-N aldicarb Chemical compound CNC(=O)O\N=C\C(C)(C)SC QGLZXHRNAYXIBU-WEVVVXLNSA-N 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003967 crop rotation Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Natural products NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000009343 monoculture Methods 0.000 description 1
- LCNBIHVSOPXFMR-UHFFFAOYSA-N n'-(3-aminopropyl)butane-1,4-diamine;hydron;trichloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.NCCCCNCCCN LCNBIHVSOPXFMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к способам борьбы с корневыми, цистообразующими нематодами, паразитирующими на растениях. Способ борьбы с нематодами предусматривает идентификацию гена, индуцируемого в успешно зараженном растении путем заражения этого растения нематодой, модификацию гена для придания растению устойчивости к нематодам и трансформацию растения модифицированным геном с последующим получением растения, устойчивого к нематодам. Способ может быть универсальным при защите от цистообразующих нематод, так как основан на использовании генов, являющихся специфичной частью чувствительности к нападению нематод. 8 з.п. ф-лы, 7 ил.
Description
Изобретение относится к борьбе с нематодами, паразитирующими на растениях, главным образом к способу борьбы с корневыми цистообразующими нематодами. Изобретение также касается придания устойчивости к нематодам растениям большого числа видов, чувствительным к корневым цистообразующим нематодам, например растениям картофеля (Solanum tuberosum).
Цистообразующие нематоды (особенно Heterodera и Globodera spp) являются основными вредителями большинства сельскохозяйственных культур. Они вызывают прямые потери урожая, а также косвенные потери, например из-за затрат на пестициды и неоптимального использования севооборота. Картофельные цистообразующие нематоды (Globodera rostochiensis и Globodera pallida) являются основными вредителями картофеля в Соединенном Королевстве, многих других районах Европы и в других основных областях возделывания картофеля. Heterodera glycines (цистообразующая нематода оси) при возделывании сои наносит экономический ущерб, который может превышать 500 миллионов долларов в год только в США. Heterodera schachtii (цистообразующая нематода свеклы) является главной проблемой для возделывающих сахарную свеклу в Европе и США. Heterodera avenae (цистообразующая нематода хлебных злаков) представляет собой всемирную экономическую проблему.
Экономически значимые плотности цистообразующих нематод обычно вызывают задержки в росте сельскохозяйственных растений. Их корневая система меньше, чем у незараженных растений, что приводит к появлению на листьях симптомов минеральной недостаточности и увеличивает опасность увядания в засушливых почвенных условиях. Потери урожая зависит от плотности цистообразующих нематод в посадках и в некоторых случаях могут достигать существенно более 50% для таких культур, как картофель и соя.
До недавнего времени борьба с нематодами растений проводилась путем использования химических препаратов с нематоцидной активностью, а также с использованием соответствующих агротехнических приемов и путем возделывания устойчивых сортов. Все это может быть применено в интегрированной форме. Нематоциды принадлежат к наиболее неприемлемым химическим веществам, широко применяемым для защиты сельскохозяйственных растений. Например, Алдикарб (Aldicarb) и продукты его распада высокотоксичны для млекопитающих и загрязняют почвенные воды. В итоге правительства некоторых штатов США ввели ограничения на использование этого нематоцида. В Нидерландах проводится политика сокращения применения нематоцидов со сроком использования более 5 лет. Сельскохозяйственные меры борьбы с нематодами не являются идеальным решением, т.к. такие меры, как смена культур, обуславливают скрытые потери, которые неприемлемы для тех, кто выращивает специализированные монокультуры или лишь несколько экономических альтернативных культур.
Устойчивость растения к нематодам может быть вызвана неспособностью последних размножаться на генотипе видов растений-хозяев, и может иметь место доминантный, полудоминантный или рецессивный тип наследования, основанный на одном или нескольких генах растения. Однако их коммерческая ценность для селекционера растений и фермера ограничена. Например, у картофеля могут быть различные источники устойчивости, обуславливающие разделение популяций в Европе, как в случае с одиночным доминантным геном H1, обуславливающим устойчивость к G. rostochiensis (Ro1 и Ro4), но не к другим формам этого вида (Ro2, Ro3 и Ro5).
Сорт Maris Piper экспрессирует H1 и широко используется в Соединенном Королевстве против G.rostochiensis, но его использование совпало с повышенным преобладанием G. pallida, способной размножаться при наличии H1. Проблема, обуславливаемая патотипами, преодолевающими устойчивость, существует и в случае других цистообразующих нематод, источники устойчивости к которым известны. В некоторых случаях источники устойчивости являются полигенными, что создает дополнительные трудности для селекционера растений. Кроме того, устойчивость у некоторых сортов является по своей природе скорее количественной, нежели качественной, и поэтому в ответ на частое использование таких культур со временем может произойти усиленное размножение.
В последнее время все большее распространение получают генно-инженерные подходы к защите растений от болезней и вредителей, в том числе и от нематод. Так, известен (EP 0352052 A3 (A 01 N 63/02)) способ борьбы с нематодами, включающий в себя встраивание в геном растений гена Bacillus thuringiensis, кодирующего токсин, который обладает нематоцидной активностью. При этом указанный ген экспрессируется в растении конститутивно, в результате чего в указанном растении создается и поддерживается определенный уровень чужеродного для него продукта (токсина), что может оказывать определенное отрицательное действие как на само растение, так и на его потребителей.
Предлагаемым изобретением решается задача создания способа борьбы с нематодами, при котором продукт, обеспечивающий устойчивость растения к нематодам, начинает продуцироваться именно при заражении паразитом и продуцируется специфично в кормовой зоне наметод.
Эта задача решается тем, что предложен способ борьбы с нематодами, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии:
(а) идентифицирует ген, который индуцируется в успешно зараженном нематодой растении;
(б) получают конструкцию, объединяя промоторный участок данного гена с другой областью, кодирующей продукт, нарушающий жизнедеятельность нематод или предотвращающий инфицирование растения нематодами;
(в) трансформируют растение указанной конструкцией с получением растения, устойчивого к нематодам.
(а) идентифицирует ген, который индуцируется в успешно зараженном нематодой растении;
(б) получают конструкцию, объединяя промоторный участок данного гена с другой областью, кодирующей продукт, нарушающий жизнедеятельность нематод или предотвращающий инфицирование растения нематодами;
(в) трансформируют растение указанной конструкцией с получением растения, устойчивого к нематодам.
Целесообразно на стадии (а) идентифицировать ген, который индуцируется в растении в зоне кормления нематод.
Поверхность раздела между растением и патогеном является ключевым местом в определении чувствительности или устойчивости к инвазии. В ходе ранних детерминирующих стадий инвазионного процесса поверхность раздела ограничивается очень малым количеством растительных клеток в месте инфекции. Позднейшая редифференцировка существующих растительных клеток формирует синцитий, которым питается животное. Синцитий индуцируется личинками второй стадии после их перемещения в корни хозяина, возможно, в ответ на выделения животного в первичные кормовые клетки. Если растение чувствительно, то синцитий увеличивается в объеме и поддерживается в течение всего периода питания нематоды. В случае с самками этот период может длиться несколько недель. Клеточная биология синцития подробно описана.
В кормовой зоне цистообразующей нематоды экспрессируются гены, являющиеся специфичной частью чувствительности к нападению нематод. Идентификация этих генов может быть проведена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Целесообразно ген, индуцируемый в зоне кормления нематод, идентифицировать следующим образом:
(а) получают библиотеки кДНК зараженных и незараженных растений;
(б) сравнивают полученные библиотеки кДНК зараженных и незараженных растений;
(в) выявляют клон кДНК, содержащий ген, индуцируемый в зоне кормления нематод,
(г) используют данный клон кДНК для идентификации соответствующего гена в растении.
(а) получают библиотеки кДНК зараженных и незараженных растений;
(б) сравнивают полученные библиотеки кДНК зараженных и незараженных растений;
(в) выявляют клон кДНК, содержащий ген, индуцируемый в зоне кормления нематод,
(г) используют данный клон кДНК для идентификации соответствующего гена в растении.
Идентифицированные таким образом гены могут быть использованы для прямого выделения в ходе нападения нематоды веществ, токсичных либо для растительной клетки, либо для нематод, специфично в кормовой зоне. Специфичное выделение таких веществ дает возможность использовать соединения, которые в случае их конструктивной экспрессии в растении могли бы ослабить рост растения или привести к неприемлемому токсикологическому вреду. Диапазон таких соединений известен и для их применения согласно изобретению пригодны стандартные биотехнологические методики.
Соответствующие нематодспецифичные гены могут быть найдены у широкого ряда растений, что позволяет защитить любую культуру, с которой возможны генетические манипуляции для экспрессии промоторов генов, характерных для кормовой зоны и соединенных с последовательностями, способными нарушать размножение нематод. В качестве примеров можно привести картофель, томаты, сахарную свеклу и табак.
Известно также, что развитие синцития сходно для множества цистообразующих нематод. Поэтому использование специфично включающегося гена универсально для всех цистообразующих нематод. К ним относятся, например, Globodera pallida и Globodera rostochiensis (картофельные цистообразующие нематоды), Heterodera glycines (цистообразующие нематоды сои), Heterodera shachtii (цистообразующая нематода свеклы), Heterodera avenae (цистообразующая нематода хлебных злаков), Heterodera oryzae (рисовая цистообразующая нематода) и Giobodera tabacom (табачная цистообразующая нематода).
В настоящем описании термин "ген" относится к последовательности ДНК, которая включает в себя: (1) верхние (5') регуляторные сигналы, включая промотор, (2) кодирующую область, определяющую продукт, белок или РНК гена, и (3) нижние (3') области, включая сигналы терминации транскрипции и полиаденилирования, (4) ассоциированные с ними последовательности, необходимые для эффективной и специфичной экспрессии.
Термин "промотор" относится к области последовательности ДНК, включающей необходимые сигналы для эффективной экспрессии кодирующей последовательности. Это могут быть, например, последовательности, с которыми связывается РНК-полимераза, и области, с которыми связываются другие регуляторные белки, а также области, участвующие в контроле трансляции белка, и кодирующая последовательность.
Целесообразно на стадии (б) промоторный участок объединять с областью, кодирующей продукт, вызывающий гибель клетки, способной редифференцироваться для образования кормовой зоны.
Предпочтительно указанный продукт представляет собой ДНКазу, РНКазу, протеиназу, токсичный белок, токсичный пептид, продукт, обуславливающий мультигенный токсический синдром, или антисмысловую РНК редифференцирующихся клеток.
Под мультигенным токсическим синдромом понимают ситуацию, при которой промотор может экспрессировать белок или пептид, остающийся в неактивной форме до активизации белком, который продуцируется геном, соединенным с другой промоторной последовательностью, специфичной для кормовой зоны. Продукт первого гена A может быть неактивным до тех пор, пока не образует под действием продукта второго гена в новый продукт A', который является активным токсином или протеазой. В другом случае, A может быть неактивным без B, так что только молекулы A-B активны.
Антисмысловая РНК включает в себя один или несколько генов антисмысловой РНК, аналогичных генам, специфичным для кормовой зоны. Другими словами, промотор может быть использован для регуляции образования своей собственной антисмысловой РНК. Это сильно снижает уровень нормального продукта. И наоборот, промотор может быть использован для управления экспрессией антисмысловой РНК для общих клеток генов, таких как АТФ-синтетаза, необходимых для жизнеспособности клетки.
Целесообразно на стадии (б) промоторный участок объединять с областью, кодирующей продукт, оказывающий летальное или сублетальное действие на нематод.
Предпочтительно указанный продукт представляет собой токсичный для нематоды белок, антитело, нарушающее процесс питания нематод, или токсичный для нематод полипептид.
Примерами потенциально пригодных генов, которые могут быть использованы при реализации настоящего изобретения, являются:
(а) белковый токсин Bacillus thuringiensis (или сходного с ним организма), обладающий антинематодной активностью;
(б) ген токсичного для метода белка (заявка на патент Великобритании 9104617.7);
(в) антитело, нарушающее питание путем воздействия на глотание или переваривание пищи подобно одному из антител, описанных для соевой цистообразующей нематоды, включая действующие против спинной глоточной железы (Atkinson et al. , 1988 Annals of Applied Biology 112, 459-469), используя известные (Hiatt, A. , Cafferkey, R.C. & Bowdish, K. 1989 Production of Antibodies in Transgenic Plants Nature, 342, 76-78) процедуры для трансгенной экспрессии антител в растениях;
(г) белок или пептид типа нейропептида, оказывающий токсичное действие на питающихся цистообразующих нематод после заглатывания ими пищи.
(а) белковый токсин Bacillus thuringiensis (или сходного с ним организма), обладающий антинематодной активностью;
(б) ген токсичного для метода белка (заявка на патент Великобритании 9104617.7);
(в) антитело, нарушающее питание путем воздействия на глотание или переваривание пищи подобно одному из антител, описанных для соевой цистообразующей нематоды, включая действующие против спинной глоточной железы (Atkinson et al. , 1988 Annals of Applied Biology 112, 459-469), используя известные (Hiatt, A. , Cafferkey, R.C. & Bowdish, K. 1989 Production of Antibodies in Transgenic Plants Nature, 342, 76-78) процедуры для трансгенной экспрессии антител в растениях;
(г) белок или пептид типа нейропептида, оказывающий токсичное действие на питающихся цистообразующих нематод после заглатывания ими пищи.
Следует принять во внимание, что уровень устойчивости к нематоде не должен быть абсолютным, но должен в общем обеспечивать уровень, хозяйственно или экономически значительный для данного растения.
Изобретение предусматривает также создание средств, обеспечивающих устойчивость к нематоде, локализованную в зоне ее питания или рядом с ней. Этим устраняется необходимость для растения продуцировать антинематодные продукты конститутивно. Этим ограничивается любое вредное для растения действие, которое может возникнуть при конститутивной экспрессии. Многие культуры могут быть защищены от цистообразующих нематод с помощью данного изобретения, и, таким образом, являются возможными объектами генетического манипулирования с целью экспрессии промоторов генов, специфичных для синцития, соединенных с последовательностями, которые нарушают редифференцировку растительных клеток в синцитий или экспрессируют в синцитии продукты антинематодных генов. Это касается культур, поражающихся такими цистообразующими нематодами, как Globodera pallida и Globodera rostochiensis (картофельные цистообразующие нематоды), Heterodera giycines (цистообразующая нематода сои), Heterodera shachtii (cвекловичная цистообразующая нематода), Heterodera avenae (цистообразующая нематода хлебных злаков), Heterodera carotae (цистообразующая нематода моркови), Heterodera oryzae (цистообразующая нематода риса) и Globodera tabacum (табачная цистообразующая нематода). В качестве примеров культур, которые могут быть защищены от цистообразующих нематод благодаря данному изобретению, можно привести картофель, томаты, сою, сахарную свеклу, рапс, пшеницу, рожь, ячмень, овес, рис, морковь, капусту и табак.
На фиг. 1 показана зона кормления нематод, индуцированная корневой узловой нематодой в трансформированном растении табака.
На фиг. 2 показаны образцы ткани, взятые из различных частей целого трансформированного растения табака.
На фиг. 3 представлены результаты нозерн-блоттинга проб, полученных из здоровых и пораженных нематодами растений томатов и сахарной свеклы.
На фиг. 4 представлены результаты нозерн-блоттинга проб, полученных из здоровых и пораженных наматодой растений картофеля.
На фиг. 5 показан криосрез трансгенного корня A.thaliana.
На фиг. 6 показана зона кормления, индуцированная цистообразующей нематодой в трансформированном растении A.thaliana.
Фиг. 7 представляет собой гистограмму, демонстрирующую общее число мест внедрения нематоды для растений табака, трансформированных смысловой и антисмысловой последовательностью GUS.
Ниже изобретение поясняется примерами, которые, однако, не ограничивают его объема.
Первый пример касается способов, использованных для идентификации, характеристики и манипулирования генами картофеля с целью создания устойчивого трансгенного растения картофеля.
Пример 1
Этот пример описывает использование сорта картофеля, чувствительного к Globodera rostochiensis, патотип Ro2, для определения генов, экспрессирующихся в зоне питания нематоды. В разделах 1 - 5 предлагаются методики получения зараженной корневой ткани. Небольшие количества локально зараженных тканей дали количества РНК (раздел 6), наиболее удобные для конструирования библиотеки кДНК с помощью ПЦР-амплификации (разделы 7.1 - 7.4). Выделение клонов кДНК, специфичных для питающих клеток, проводилось с помощью дифференциальной гибридизации с пробами кДНК из зараженных и незараженных тканей (раздел 7.5). ДНК положительных клонов кДНК была секвенирована (раздел 10), и вставки использовались как пробы на следующих этапах. Проверка временной и пространственной экспрессии генов была проведена с помощью нозерн-анализа (раздел 8) с использованием разных тканей растения и разного времени заражения. Дальнейшая локализация экспрессии гена проводилась гибридизацией in situ (раздел 12). Геномные клоны, соответствующие кДНК клонам, специфичным для питающих клеток, выделялись из библиотеки геномной ДНК (раздел 11). Промоторы идентифицировались секвенированием ДНК (раздел 11) для создания конструкций, пригодных для создания трансгенных растений картофеля, обладающих устойчивостью к нематоде (раздел 13) локально в кормовой зоне.
Этот пример описывает использование сорта картофеля, чувствительного к Globodera rostochiensis, патотип Ro2, для определения генов, экспрессирующихся в зоне питания нематоды. В разделах 1 - 5 предлагаются методики получения зараженной корневой ткани. Небольшие количества локально зараженных тканей дали количества РНК (раздел 6), наиболее удобные для конструирования библиотеки кДНК с помощью ПЦР-амплификации (разделы 7.1 - 7.4). Выделение клонов кДНК, специфичных для питающих клеток, проводилось с помощью дифференциальной гибридизации с пробами кДНК из зараженных и незараженных тканей (раздел 7.5). ДНК положительных клонов кДНК была секвенирована (раздел 10), и вставки использовались как пробы на следующих этапах. Проверка временной и пространственной экспрессии генов была проведена с помощью нозерн-анализа (раздел 8) с использованием разных тканей растения и разного времени заражения. Дальнейшая локализация экспрессии гена проводилась гибридизацией in situ (раздел 12). Геномные клоны, соответствующие кДНК клонам, специфичным для питающих клеток, выделялись из библиотеки геномной ДНК (раздел 11). Промоторы идентифицировались секвенированием ДНК (раздел 11) для создания конструкций, пригодных для создания трансгенных растений картофеля, обладающих устойчивостью к нематоде (раздел 13) локально в кормовой зоне.
1. Растительный материал
Solanum tuberosum, сорт Maris Piper (шотландский семенной картофель, класс A) проращивался 24 дня (Kosack K.E., Atkinson H.J., Bowles D.J. 1990. Changes in abundance of translatable mRNA species in potato roots and leaves following root invasion by cyst-nematode G. rostochiensis pathotypes. Physiol. Mol. Plant Pathol.). Индивидуальные побеги отрезались после выращивания в мешках, либо для выращивания в горшках использовались целые клубни.
Solanum tuberosum, сорт Maris Piper (шотландский семенной картофель, класс A) проращивался 24 дня (Kosack K.E., Atkinson H.J., Bowles D.J. 1990. Changes in abundance of translatable mRNA species in potato roots and leaves following root invasion by cyst-nematode G. rostochiensis pathotypes. Physiol. Mol. Plant Pathol.). Индивидуальные побеги отрезались после выращивания в мешках, либо для выращивания в горшках использовались целые клубни.
2. Нематоды
Популяция цист Globodera rostochiensis, патотипы Ro1 и Ro2, содержались в сухих условиях при 4oC. Цисты замачивались в водопроводной воде на 7 дней при 4oC. Добавлялся диффузат из корней картофеля Shepherd A.M., 1986. In: Southey J.F. (ed) Laboratory methods for work with plant and soil nematodes: MAFF reference book 402, 6th edn.), и личинки выводились через 4 - 7 дней при комнатной температуре.
Популяция цист Globodera rostochiensis, патотипы Ro1 и Ro2, содержались в сухих условиях при 4oC. Цисты замачивались в водопроводной воде на 7 дней при 4oC. Добавлялся диффузат из корней картофеля Shepherd A.M., 1986. In: Southey J.F. (ed) Laboratory methods for work with plant and soil nematodes: MAFF reference book 402, 6th edn.), и личинки выводились через 4 - 7 дней при комнатной температуре.
3. Заражение
Материал в мешках. Индивидуальные побеги помещались в готовые мешки (Northup-King, Миннесота). Полоски бумаги Whatman GFA размером 1 х 0,5 см помещались под кончики индивидуальных корней. 50 червей в 10 мл корневого диффузата наносились на каждый кончик корня, который затем покрывался второй полоской GFA. Фильтровальная бумага GFA удалялась через 24 ч после инокуляции для синхронизации заражения. Основание отрезалось, и мешки промывались водопроводной водой.
Материал в мешках. Индивидуальные побеги помещались в готовые мешки (Northup-King, Миннесота). Полоски бумаги Whatman GFA размером 1 х 0,5 см помещались под кончики индивидуальных корней. 50 червей в 10 мл корневого диффузата наносились на каждый кончик корня, который затем покрывался второй полоской GFA. Фильтровальная бумага GFA удалялась через 24 ч после инокуляции для синхронизации заражения. Основание отрезалось, и мешки промывались водопроводной водой.
Материал в горшках. Проросшие клубни выращивались в горшках (25 см) в почве с невылупившимися цистами в количестве, достаточном для получения популяции в 50 яиц на грамм почвы.
Контрольные (неинокулированные) мешки и горшки содержались в тех же условиях, но без цист.
4. Условия выращивания
Зараженные растения картофеля выращивались в режиме 16 часов освещения при 22oC и 6 часов темноты при 18oC.
Зараженные растения картофеля выращивались в режиме 16 часов освещения при 22oC и 6 часов темноты при 18oC.
5. Сбор материала и анализ
Выращенные в мешках ткани собирали на 4-й, 7-й, 15-й и 24-й дни после инвазии. Обесцвеченные локально зараженные корни вырезались прямо в конверты из фольги в жидком азоте. Ткани корня, соседние с зоной заражения, также вырезались и замораживались отдельно.
Выращенные в мешках ткани собирали на 4-й, 7-й, 15-й и 24-й дни после инвазии. Обесцвеченные локально зараженные корни вырезались прямо в конверты из фольги в жидком азоте. Ткани корня, соседние с зоной заражения, также вырезались и замораживались отдельно.
Ткани, выращенные в горшках, собирались через 26 дней после заражения патотипом Ro2. Вылупившиеся самки и цисты удалялись тонкой кистью и локально зараженные ткани вырезались в жидком азоте в индивидуальные пакеты из фольги.
6. Выделение тотальной РНК
Ткани в пакетах из фольги дробили пестиком в порошок и хранили при -70oC. Размолотые ткани (12 мг) переносили в предварительно охлажденные в жидком азоте одноразовые пластиковые пробирки Sarstedt (на 20 мл), затем добавляли 0,5 мл смеси фенол/CH3Cl/изоамиловый спирт (25:24:1) и 0,5 мл буфера GuHCl (8M гуанидин-HCl), 20 мM МЭС (4-морфолино-этанол-сульфоновая кислота), 20 мМ Na2ЭДТА, доведенного до pH=7 с использованием NaOH, и 2-меркаптоэтанол, добавленный в количестве, достаточном для получения концентрации 50 нМ, непосредственно перед применением). Пока пробирки оттаивали во льду, ткани гомогенизировались 15 ударами смесителя Polytron (Kinematica, Швейцария). Водную фазу реэкстрагировали фенолом более трех раз перед осаждением в течение ночи при -20oC после добавления 0,2 объема 1M уксусной кислоты и 0,7 объема холодного 96%-ного этанола. РНК, собранная центрифугированием примерно при 13000 g в течение 15 мин в микроцентрифуге, промывалась в 400 мкл 3М раствора ацетата натрия (pH=5,5) при 4oC, затем в 70%-ном холодном этаноле перед окончательным растворением в 30 - 50 мкл воды, обработанной DEPC, и хранилась при -70oC.
Ткани в пакетах из фольги дробили пестиком в порошок и хранили при -70oC. Размолотые ткани (12 мг) переносили в предварительно охлажденные в жидком азоте одноразовые пластиковые пробирки Sarstedt (на 20 мл), затем добавляли 0,5 мл смеси фенол/CH3Cl/изоамиловый спирт (25:24:1) и 0,5 мл буфера GuHCl (8M гуанидин-HCl), 20 мM МЭС (4-морфолино-этанол-сульфоновая кислота), 20 мМ Na2ЭДТА, доведенного до pH=7 с использованием NaOH, и 2-меркаптоэтанол, добавленный в количестве, достаточном для получения концентрации 50 нМ, непосредственно перед применением). Пока пробирки оттаивали во льду, ткани гомогенизировались 15 ударами смесителя Polytron (Kinematica, Швейцария). Водную фазу реэкстрагировали фенолом более трех раз перед осаждением в течение ночи при -20oC после добавления 0,2 объема 1M уксусной кислоты и 0,7 объема холодного 96%-ного этанола. РНК, собранная центрифугированием примерно при 13000 g в течение 15 мин в микроцентрифуге, промывалась в 400 мкл 3М раствора ацетата натрия (pH=5,5) при 4oC, затем в 70%-ном холодном этаноле перед окончательным растворением в 30 - 50 мкл воды, обработанной DEPC, и хранилась при -70oC.
7. Конструирование библиотеки кДНК с помощью ПЦР
7.1 Синтез кДНК
1 мкг тотальной РНК из корней картофеля, собранных через 26 дней после заражения G. rostochiensis, патотип Ro2, денатурировался в течение 5 мин в водяной бане при 70oC и затем быстро охлаждался во льду. Проба этой РНК добавлялась в реакционную смесь, состоящую из 4 мкл 5 х AMVRT буфера (250 мМ Трис-HCl (pH= 8,3), 250 мМ KCl, 50 мМ MgCl2, 5 мМ DDT, 5 мМ ЭДТА, 50 мг/мл бычьего сывороточного альбумина), 2 uл олигонуклеотида (дТ17, 100 мкг/мл), 2 мкл смеси дНТФ (по 10 мМ АТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ), 1 мкл 10 мМ раствора спермидин-HCl, 1 мкл 80 мМ раствора пирофосфата натрия и 125 единиц плацентарного ингибитора рибонуклеазы человека (HPRNI). 10 единиц обратной транскриптазы вируса птичьей миелобластомы (AMV) добавлялись для доведения конечного реакционного объема до 20 мкл перед инкубацией его при 42oC в течение 1 ч. Реакция прерывалась добавлением 20 мкл 0,1 М раствора NaCl, 40 мМ ЭДТА. Размер и количество продуктов определяли проведением параллельной реакции, содержащей 50 мкКи дЦТФ, меченный 32P (3000 Ки/ммоль). Меченые продукты реакции фракционировались в щелочном геле, с которого затем делали авторадиографические снимки. Вся масса меченых продуктов была в пределах от 200 до 2000 т. п.о., с четко различимыми крупными продуктами.
7.1 Синтез кДНК
1 мкг тотальной РНК из корней картофеля, собранных через 26 дней после заражения G. rostochiensis, патотип Ro2, денатурировался в течение 5 мин в водяной бане при 70oC и затем быстро охлаждался во льду. Проба этой РНК добавлялась в реакционную смесь, состоящую из 4 мкл 5 х AMVRT буфера (250 мМ Трис-HCl (pH= 8,3), 250 мМ KCl, 50 мМ MgCl2, 5 мМ DDT, 5 мМ ЭДТА, 50 мг/мл бычьего сывороточного альбумина), 2 uл олигонуклеотида (дТ17, 100 мкг/мл), 2 мкл смеси дНТФ (по 10 мМ АТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ), 1 мкл 10 мМ раствора спермидин-HCl, 1 мкл 80 мМ раствора пирофосфата натрия и 125 единиц плацентарного ингибитора рибонуклеазы человека (HPRNI). 10 единиц обратной транскриптазы вируса птичьей миелобластомы (AMV) добавлялись для доведения конечного реакционного объема до 20 мкл перед инкубацией его при 42oC в течение 1 ч. Реакция прерывалась добавлением 20 мкл 0,1 М раствора NaCl, 40 мМ ЭДТА. Размер и количество продуктов определяли проведением параллельной реакции, содержащей 50 мкКи дЦТФ, меченный 32P (3000 Ки/ммоль). Меченые продукты реакции фракционировались в щелочном геле, с которого затем делали авторадиографические снимки. Вся масса меченых продуктов была в пределах от 200 до 2000 т. п.о., с четко различимыми крупными продуктами.
Олиго-дТ-праймер удалялся избирательной преципитацией. 0,5 мкг поли I поли C (Pharmacia) и 3 мкг 10%-ного (масс./об.) раствора СТАВ добавлялись в реакционную смесь перед центрифугированием в микроцентрифуге при комнатной температуре в течение 20 мин. Супернатант осторожно удалялся, и осадок ресуспендировался в 14 мкл 1М раствора NaCl, к которому добавили 25 мкл H2O и 1 мкл 10%-ного раствора СТАВ, и проба снова осаждалась микроцентрифугированием. Осадок окончательно ресуспендировался в 10 мкл 1М раствора NaCl и осаждался в 2,7 объеме этанола в течение ночи при -20oC. Осадок промывался в 70%-ном этаноле и растворялся в 7 мкл H2O. Реакцию дГ-наращивания проводили, добавив в пробу: 4 мкл 5 х буфера для наращивания (1М какодилата калия, 125 мМ Трис-HCl, pH 7,2), 1 мкл 2 мМ раствора ДТТ, 2 мкл 5 мМ раствора хлорида кобальта, 5 мкл 20 М раствора дГТФ и 25 единиц терминальной трансферазы (Boehringer) - и инкубируя смесь при 37oC 20 мин; для прекращения реакции добавляли 4 мкл 100 мМ раствора ЭТДА и 2 мкл 12 М раствора NaCl. Избыточные нуклеотиды удалялись добавлением 1 мкл 10%-ного (масса/объем) раствора СТАВ и микроцентрифугированием при 4oC в течение 20 мин. Осадок растворялся в 10 мкл 1 М раствора NaCl перед добавлением 0,25 мкг гликогена и 30 мкл холодного этанола и переосаждался в течение ночи при -20oC. После промывки в 70%-ном этаноле осадок растворялся в 20 мкл 50 мМ раствора NaOH, 2 мМ раствора ЭДТА и инкубировался 60 мин при 65oC для гидролиза РНК. кДНК снова осаждалась этанолом, промывалась, и осадок растворялся в 20 мкл H2O.
7.2. ПЦР амплификация
ПЦР амплификация первой цепи кДНК с гомополимерным хвостом проводилась с использованием затравок:
A (олиго-дТ17-Not I); ГЦГГЦЦГЦТТТТТТТТТТТТТТТТ, B (олиго-дЦ14-EcoRI); ААГГААТТЦЦЦЦЦЦЦЦЦЦЦЦЦЦ.
ПЦР амплификация первой цепи кДНК с гомополимерным хвостом проводилась с использованием затравок:
A (олиго-дТ17-Not I); ГЦГГЦЦГЦТТТТТТТТТТТТТТТТ, B (олиго-дЦ14-EcoRI); ААГГААТТЦЦЦЦЦЦЦЦЦЦЦЦЦЦ.
Реакционные смеси для ПЦР содержали 10 мкл 10 х ПЦР буфера (100 мМ Трис-HCl, pH = 8,3 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl2, 0,1% желатина), 10 мкл 10 х смеси дНТФ (по 5 мМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ), 100 пикомолей затравки B, 2 единицы Taq-полимеразы и 1-10 нг кДНК с олиго-(дГ) хвостом в общем реакционном объеме 20 мкл, сверху покрытом 20 мкл минерального масла. Режим термических циклов был следующим: 1 цикл 96oC, 2 мин, для денатурации продуктов; 96oC, 2 мин, 58oC, 2 мин, 72oC, 3 мин для синтеза второй цепи; 1 цикл (96oC, 2 мин, 40oC, 2 мин, 72oC, 2 мин) для получения хорошей затравки с олиго-(дТ) конца; 15 циклов (96oC, 2 мин, 58oC, 2 мин, 72oC, 3 мин) для амплификации продуктов. Реакционная смесь разделялась электрофоретически в NuSieve GTG LMP (FMC Bioproducts) геле с использованием лидерной ДНК в 123 т.п. о. как маркера для определения размеров, участки геля, соответствующие классам размерами меньше 500, от 500 до 1500, от 1500 до 2000 и более 2000 п.о. были вырезаны, и ДНК была выделена из геля путем замораживания при -20oC и последующего центрифугирования в микроцентрифуге в течение 10 мин в фильтры Spin-X (Costar). ПЦР-продукты были блот-гибридизированы по Саузерну с 3 клонами, которые, как было известно, конститутивно экспрессировались в корнях картофеля. Пробы кДНК длинных и коротких, а также имеющих высокое или малое относительное содержание транскриптов гибридизовались с продуктами ПЦР, демонстрируя четкое наличие различных с библиотекой транскриптов.
7.3. Создание библиотеки
Выделенная ДНК (более 200 п.о.) разрезалась с помощью EcoRI и NotI и лигировалась с ДНК лямбда-ZAP, а затем упаковывалась in vitro с помощью смеси Stratagene Giga Plus для упаковки согласно прилагаемой инструкции. Библиотека встраивалась в E.coli, штамм XL1-Blue, с использованием чашек LB с 1%-ным верхним агаром, содержащем 12,5 мМ IPTG и 6,25 мг/мл X-гала (X-gal).
Выделенная ДНК (более 200 п.о.) разрезалась с помощью EcoRI и NotI и лигировалась с ДНК лямбда-ZAP, а затем упаковывалась in vitro с помощью смеси Stratagene Giga Plus для упаковки согласно прилагаемой инструкции. Библиотека встраивалась в E.coli, штамм XL1-Blue, с использованием чашек LB с 1%-ным верхним агаром, содержащем 12,5 мМ IPTG и 6,25 мг/мл X-гала (X-gal).
7.4. Анализ библиотеки
Качество библиотеки кДНК, сделанной с помощью ПЦР, анализировалось двумя способами. (1) Примерно 96% бляшек оказалось рекомбинантными, что было показано с помощью инсерционной инактивации альфа-комплементации бета-галактозидазы. (2) Бляшки, отобранные случайным образом в ПЦР буфер и амплифицированные с использованием затравок, комплементарных М13, имели, как было показано, одиночные инсерции от 230 до 1000 п.о. со средним размером инсерции 470 п.о.
Качество библиотеки кДНК, сделанной с помощью ПЦР, анализировалось двумя способами. (1) Примерно 96% бляшек оказалось рекомбинантными, что было показано с помощью инсерционной инактивации альфа-комплементации бета-галактозидазы. (2) Бляшки, отобранные случайным образом в ПЦР буфер и амплифицированные с использованием затравок, комплементарных М13, имели, как было показано, одиночные инсерции от 230 до 1000 п.о. со средним размером инсерции 470 п.о.
7.5. Дифференциальный скрининг
Библиотека дала 3,5 • 105 рекомбинантных фагов, 6 • 104 из которых были подвергнуты скринингу с использованием проб, меченных 32P-дЦТФ и синтезированных как первая цепь кДНК для 10 мкл тотальной РНК, выделенной из зараженных корневых тканей, собранных через 26 дней после инвазии Ro2, или из здоровых корней того же возраста (Gurr S.J., McPherson M.J. 1991. PCR-based cDNA library construction. In: McPherson V.J., Quirke P., Taylor G.R. (eds) Polymerase chain reaction: A practical approach. IRL Press at Oxford University Press, Oxford). Невключившийся изотоп удалялся осаждением с помощью ацетата аммония, и пробы доводились до получения гибридизационной жидкости, эквивалентной по числу отсчетов на микрограмм кДНК на миллилитр, после подсчета жидкостной сцинтилляции. Осуществлялся сбор бляшек в двух вариантах, и ДНК бляшек денатурировалась в растворе NaOH (0,5М) и NaCl (1,5М), нейтрализовалась в 1,5, 0,5 М Трис-HCl (pH = 7,2) и 1 мМ ЭДТА и высушивалась (80oC, 2 ч). Фильтры прегибридизовались отдельно в "здоровых" и "зараженных" прегибридизационных жидкостях, содержащих 5х SSPE, 6% ПЭГ 6000, 0,5% Marvel (сухое снятое молоко), 1% SDS, 0,1% пирофосфата натрия и 250 мкг/мл обработанной ультразвуком и денатурированной ДНК спермы сельди, при 65oC в течение 6 ч. Гибридизация проводилась при 65oC в течение 24 ч после добавления соответствующей пробы первой цепи, меченной радиоактивным изотопом. После гибридизации фильтры отмывались последовательно в растворе 5х SSC, 0,1% SDS, затем в растворе 1х SSC, 0,1% SDS при 65oC, дважды по 20 мин в каждом растворе. Блоты экспонировались на рентгеновскую пленку с использованием усиливающих экранов при -70oC. Бляшки, которые гибридизовались с 26-дневной пробой Ro2, но не со здоровой 26-дневной пробой, очищались до однородности двумя дополнительными циклами скрининга.
Библиотека дала 3,5 • 105 рекомбинантных фагов, 6 • 104 из которых были подвергнуты скринингу с использованием проб, меченных 32P-дЦТФ и синтезированных как первая цепь кДНК для 10 мкл тотальной РНК, выделенной из зараженных корневых тканей, собранных через 26 дней после инвазии Ro2, или из здоровых корней того же возраста (Gurr S.J., McPherson M.J. 1991. PCR-based cDNA library construction. In: McPherson V.J., Quirke P., Taylor G.R. (eds) Polymerase chain reaction: A practical approach. IRL Press at Oxford University Press, Oxford). Невключившийся изотоп удалялся осаждением с помощью ацетата аммония, и пробы доводились до получения гибридизационной жидкости, эквивалентной по числу отсчетов на микрограмм кДНК на миллилитр, после подсчета жидкостной сцинтилляции. Осуществлялся сбор бляшек в двух вариантах, и ДНК бляшек денатурировалась в растворе NaOH (0,5М) и NaCl (1,5М), нейтрализовалась в 1,5, 0,5 М Трис-HCl (pH = 7,2) и 1 мМ ЭДТА и высушивалась (80oC, 2 ч). Фильтры прегибридизовались отдельно в "здоровых" и "зараженных" прегибридизационных жидкостях, содержащих 5х SSPE, 6% ПЭГ 6000, 0,5% Marvel (сухое снятое молоко), 1% SDS, 0,1% пирофосфата натрия и 250 мкг/мл обработанной ультразвуком и денатурированной ДНК спермы сельди, при 65oC в течение 6 ч. Гибридизация проводилась при 65oC в течение 24 ч после добавления соответствующей пробы первой цепи, меченной радиоактивным изотопом. После гибридизации фильтры отмывались последовательно в растворе 5х SSC, 0,1% SDS, затем в растворе 1х SSC, 0,1% SDS при 65oC, дважды по 20 мин в каждом растворе. Блоты экспонировались на рентгеновскую пленку с использованием усиливающих экранов при -70oC. Бляшки, которые гибридизовались с 26-дневной пробой Ro2, но не со здоровой 26-дневной пробой, очищались до однородности двумя дополнительными циклами скрининга.
8. Нозерн- и Саузерн-гибридизация и приготовление проб
РНК массой по 10 мкг на дорожку разделялась в 0,6 М формальдегидагарозном геле при напряжении 7,5 Всм-1. Гель фотографировался и промывался дважды по 20 мин в растворе 10х SSC и переносился на мембрану Hybond-N (Amerisham) раствором 10х SSC. Фильтры высушивались (80oC, 2 ч) и прегибридизовались в течение 12 ч при 42oC в смеси, содержащей 50% формамида, 5x SSC, 1x раствор Денхардта, 100 мкг/мл ДНК спермы сельди и 250 мМ фосфатного буфера (pH = 6,5). Гибридизация проводилась в свежем прегибридизационном буфере, включающем 2-4 пробы pPSR (25 нг), меченые 32P-гексапраймером (Feinberg A.P. & Vogelstein B. 1983. Nucleic Acids Research, 14, 2229) при 42oC в течение 24 ч. Фильтры промывались последовательно в растворе 5x SSC, 0,1% SDC при 42oC, затем в растворе 2x SSC, 0,1% SDS при 42oC и окончательно в растворе 2x SSC 0,1% SDS при 65oC. Блоты экспонировались на рентгеновскую пленку с усиливающими экранами при -70oC. Инсерция PMR1 готовилась путем отбора одиночной очищенной бляшки в ПЦР буфере и амплифицировалась с использованием комплементарных затравок M13 согласно (Gussow D. & Clackson T. 1989. Nucleic Acids Research 17, 4000).
РНК массой по 10 мкг на дорожку разделялась в 0,6 М формальдегидагарозном геле при напряжении 7,5 Всм-1. Гель фотографировался и промывался дважды по 20 мин в растворе 10х SSC и переносился на мембрану Hybond-N (Amerisham) раствором 10х SSC. Фильтры высушивались (80oC, 2 ч) и прегибридизовались в течение 12 ч при 42oC в смеси, содержащей 50% формамида, 5x SSC, 1x раствор Денхардта, 100 мкг/мл ДНК спермы сельди и 250 мМ фосфатного буфера (pH = 6,5). Гибридизация проводилась в свежем прегибридизационном буфере, включающем 2-4 пробы pPSR (25 нг), меченые 32P-гексапраймером (Feinberg A.P. & Vogelstein B. 1983. Nucleic Acids Research, 14, 2229) при 42oC в течение 24 ч. Фильтры промывались последовательно в растворе 5x SSC, 0,1% SDC при 42oC, затем в растворе 2x SSC, 0,1% SDS при 42oC и окончательно в растворе 2x SSC 0,1% SDS при 65oC. Блоты экспонировались на рентгеновскую пленку с усиливающими экранами при -70oC. Инсерция PMR1 готовилась путем отбора одиночной очищенной бляшки в ПЦР буфере и амплифицировалась с использованием комплементарных затравок M13 согласно (Gussow D. & Clackson T. 1989. Nucleic Acids Research 17, 4000).
Геномная ДНК готовилась из ядер, выделенных из молодых листьев картофеля (сорт Maris Piper) согласно (Jofuku K.D. & Goldberg R.B. 1989. In Plant Molecular Biology: A practical Approach (ed C.S. Shaw)pp 37-66). Высокомолекулярная ДНК фракционировалась по размеру в 0,6%-ном агарозном геле после обработки ее рестрикционными ферментами. Для анализа экспрессии генов в растении РНК выделялась из стеблей, черешков, листьев, цветков и корней как зараженных, так и незараженных растений. Для анализа раневого ответа растительные корни или листья давили и выделяли РНК из обработанных тканей через определенный промежуток времени (3, 6, 9 и 12 ч после обработки). Пробы сравнивались с помощью нозерн-гибридизации с РНК, выделенной из зараженных нематодой корней. Гели отмывали, денатурировали и переносили на мембрану Hybond-N (Sambrook J., Fritsch E.F. & Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd edn., Cold Spring Harbour Press). Фильтр высушивался (80oC, 2 ч) и прегибридизовался в течение 6 ч при 65oC в прегибридизационной жидкости, как описано для дифференциального скрининга бляшек. Гомологичная гибридизация и условия отмывки были теми же, что и в случае фильтров для нозерн-гибридизации. Гетерологичная гибридизация проводилась при 56oC, фильтры отмывались в растворе 5x SSC при 65oC.
9. Вырезание последовательности из лямбда-ZAP и очистка плазмиды
Плазмида pBlue из клона PMR1, содержащего вставку, последовательность которой соответствует одной из формул 1-8, вырезалась из положительно гибридизующегося клона лямбда-ZAP и освобождалась согласно (Stratagene manual). Плазмидная ДНК очищалась центрифугированием в градиенте плотности хлоридав цезия (Davis L.G., Dibner M.D., Batey J.F. 1986. Basic methods in molecular biology. Elsevier Science Publishers, New York).
Плазмида pBlue из клона PMR1, содержащего вставку, последовательность которой соответствует одной из формул 1-8, вырезалась из положительно гибридизующегося клона лямбда-ZAP и освобождалась согласно (Stratagene manual). Плазмидная ДНК очищалась центрифугированием в градиенте плотности хлоридав цезия (Davis L.G., Dibner M.D., Batey J.F. 1986. Basic methods in molecular biology. Elsevier Science Publishers, New York).
Последовательности формул 1-8
ГЦЦЦАААЦТТТЦЦГГТГТАЦТЦЦТТГТЦЦТТГТТТТТТГТАГТЦТТТТАЦЦТАТЦЦААЦАААААТ ТТЦТЦГЦЦААААААГГГТТАТААЦАЦЦГЦГАТАААГЦТЦТТАААТААТГ
(формула 1)
ААЦАТЦГГГТЦЦААГАГАГГААААГГЦАЦГААГААТГГАЦААТТТТАЦЦААААГЦАТТТЦЦТТАГ ГЦТЦАТАААГЦАТТТТАААЦЦЦЦГАТГЦТГТТГТТГТТТТГААГГ
(формула 2)
ГТАТЦЦАЦГЦЦТЦТГААТАГЦАЦАГАААЦАГАГТЦТАЦААГААААГЦАЦАЦАТАТТТТТГЦАГТТ ГГАГАААТААЦГАГЦЦАТТГТААТТГНЦГГТТЦТААГННТЦГААГЦГАТЦААААТТАААТТАААГТТАГЦААЦГГ
(формула 3)
ЦАТГАЦГАТГГАЦААААТЦАТТГАГГААЦТГГАТААЦАЦЦГННЦГГЦТГЦЦГГГГЦТГГЦГААТЦ ТГТГГГТНЦЦГЦЦААТТЦГТААЦЦГТАТЦГАТАТГЦТЦТЦААЦЦГГЦАТТАААА
(формула 4)
ЦАГЦАТТАЦАЦТГГЦЦЦАГГТГЦАГТАЦАГЦАТГТГГГТГАЦГНГГАААНАНННЦЦТГГТАЦТТТ ТЦГГААЦТАТГЦАЦАЦЦГГЦТГЦТАТЦАААГЦЦТГААГГЦЦТГЦАТА
(формула 5)
ГТЦГЦТАЦЦТТТЦГГГАЦГЦААТАЦЦГТАТТГЦТГЦГЦТТЦЦАГАГАГТЦАЦЦТАЦЦГЦТТТГААТГАЦ
(формула 6)
ГЦГЦЦГЦГГЦАЦАТЦГГГГГЦТЦГГНГГЦТАЦГГЦТАЦГГАГГТТГЦАЦААЦТТГЦГГАЦГЦАААТАААЦГЦГЦААЦААТЦГГ
(формула 7)
ЦГТГАГТЦАГТНАГТЦГТАТТАЦААТТЦАЦТГГЦЦГТЦГТТТТАЦААЦГТЦГТЦГТГАЦТГГГАА АЦЦЦ
(формула 8)
где А - аденин,
Ц - цитозин,
Т - тимин,
Г - гуанин,
Н - любой нуклеотид.
ГЦЦЦАААЦТТТЦЦГГТГТАЦТЦЦТТГТЦЦТТГТТТТТТГТАГТЦТТТТАЦЦТАТЦЦААЦАААААТ ТТЦТЦГЦЦААААААГГГТТАТААЦАЦЦГЦГАТАААГЦТЦТТАААТААТГ
(формула 1)
ААЦАТЦГГГТЦЦААГАГАГГААААГГЦАЦГААГААТГГАЦААТТТТАЦЦААААГЦАТТТЦЦТТАГ ГЦТЦАТАААГЦАТТТТАААЦЦЦЦГАТГЦТГТТГТТГТТТТГААГГ
(формула 2)
ГТАТЦЦАЦГЦЦТЦТГААТАГЦАЦАГАААЦАГАГТЦТАЦААГААААГЦАЦАЦАТАТТТТТГЦАГТТ ГГАГАААТААЦГАГЦЦАТТГТААТТГНЦГГТТЦТААГННТЦГААГЦГАТЦААААТТАААТТАААГТТАГЦААЦГГ
(формула 3)
ЦАТГАЦГАТГГАЦААААТЦАТТГАГГААЦТГГАТААЦАЦЦГННЦГГЦТГЦЦГГГГЦТГГЦГААТЦ ТГТГГГТНЦЦГЦЦААТТЦГТААЦЦГТАТЦГАТАТГЦТЦТЦААЦЦГГЦАТТАААА
(формула 4)
ЦАГЦАТТАЦАЦТГГЦЦЦАГГТГЦАГТАЦАГЦАТГТГГГТГАЦГНГГАААНАНННЦЦТГГТАЦТТТ ТЦГГААЦТАТГЦАЦАЦЦГГЦТГЦТАТЦАААГЦЦТГААГГЦЦТГЦАТА
(формула 5)
ГТЦГЦТАЦЦТТТЦГГГАЦГЦААТАЦЦГТАТТГЦТГЦГЦТТЦЦАГАГАГТЦАЦЦТАЦЦГЦТТТГААТГАЦ
(формула 6)
ГЦГЦЦГЦГГЦАЦАТЦГГГГГЦТЦГГНГГЦТАЦГГЦТАЦГГАГГТТГЦАЦААЦТТГЦГГАЦГЦАААТАААЦГЦГЦААЦААТЦГГ
(формула 7)
ЦГТГАГТЦАГТНАГТЦГТАТТАЦААТТЦАЦТГГЦЦГТЦГТТТТАЦААЦГТЦГТЦГТГАЦТГГГАА АЦЦЦ
(формула 8)
где А - аденин,
Ц - цитозин,
Т - тимин,
Г - гуанин,
Н - любой нуклеотид.
10. Анализ последовательности
Секвенирование плазмидной ДНК, денатурированной щелочью, проводилось согласно (Manufacturers protocols for Sequenase (Version 2.0) reactions (United States Biochemical Corp.)). Данные по секвенированию сравнивались с базами данных EMBL и GenBank (выпуск 23) с использованием программы QUICKN, использующей алгоритм Липмана и Пирсона (Lipman D.J.K., Pearson W.R. 1985. Rapid and sensitive protein similarity searches. Science, 227: 1435-1441) и введенной в операционную систему VMS компьютера VAX 11/750.
Секвенирование плазмидной ДНК, денатурированной щелочью, проводилось согласно (Manufacturers protocols for Sequenase (Version 2.0) reactions (United States Biochemical Corp.)). Данные по секвенированию сравнивались с базами данных EMBL и GenBank (выпуск 23) с использованием программы QUICKN, использующей алгоритм Липмана и Пирсона (Lipman D.J.K., Pearson W.R. 1985. Rapid and sensitive protein similarity searches. Science, 227: 1435-1441) и введенной в операционную систему VMS компьютера VAX 11/750.
11. Выделение геномного клона
Библиотека геномной ДНК на основе лямбда EMBL3 была сконструирована путем частичной рестрикции геномной ДНК сорта Maris Piper рестриктазой EcoI согласно (Sambrook J., Fritsch E.F & Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd edn., Cold Spring Harbour Press). Библиотека анализировалась путем перепечатки примерно 1,8 • 105 клонов, приготовления перенесенных на фильтры дуплицированных бляшек, прегибридизации, а затем гибридизации и отмывки, как описано выше в разделе 7.5, за исключением того, что проба была приготовлена путем мечения гексапраймером инсерционной ДНК и ее ПЦР амплификации (Gussow D., Clackson T. 1989. Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 17:10) из кДНК клонов, pPMR1, pRMR2 или pPMR3.
Библиотека геномной ДНК на основе лямбда EMBL3 была сконструирована путем частичной рестрикции геномной ДНК сорта Maris Piper рестриктазой EcoI согласно (Sambrook J., Fritsch E.F & Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd edn., Cold Spring Harbour Press). Библиотека анализировалась путем перепечатки примерно 1,8 • 105 клонов, приготовления перенесенных на фильтры дуплицированных бляшек, прегибридизации, а затем гибридизации и отмывки, как описано выше в разделе 7.5, за исключением того, что проба была приготовлена путем мечения гексапраймером инсерционной ДНК и ее ПЦР амплификации (Gussow D., Clackson T. 1989. Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 17:10) из кДНК клонов, pPMR1, pRMR2 или pPMR3.
Позитивно гибридизующиеся клоны, выделенные после трех циклов гибридизационного скрининга, были в дальнейшем охарактеризованы с помощью рестрикционного анализа и секвенирования ДНК (Sambrook J., Fritsch E.F. & Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd edn., Cold Spring Harbour Press) для локализации промоторных последовательностей.
12. Гибридизация in situ
Ткани зараженных и незараженных корней заливались парафином, резались, прегибридизовались и затем гибридизовались со смысловыми антисмысловыми пробами pPMR1, pPMR2 и pPMR3 согласно (Jackson D. In: Molecular Plant Pathology: A Practical Approach (ed. S.J. Gurr, M.J. McPherson and D.J. Bowles IRL Press, Oxford, 1991).
Ткани зараженных и незараженных корней заливались парафином, резались, прегибридизовались и затем гибридизовались со смысловыми антисмысловыми пробами pPMR1, pPMR2 и pPMR3 согласно (Jackson D. In: Molecular Plant Pathology: A Practical Approach (ed. S.J. Gurr, M.J. McPherson and D.J. Bowles IRL Press, Oxford, 1991).
13. Получение и регенерация трансгенных растений
Трансгенные растения картофеля были получены с помощью способов, описанных (Harch et al. 1985. Science, 227, 1229-1231), с использованием штамма GV3 101 Agrobacterium, содержащего плазмиду pGV3850, несущую промоторы, специфичные для кормовых клеток и слитые с соответствующим дисруптивным геном, выбранным из генов, перечисленных во вводной части настоящего описания, при этом до проверки на устойчивость к нематодам были регенерированы ростки.
Трансгенные растения картофеля были получены с помощью способов, описанных (Harch et al. 1985. Science, 227, 1229-1231), с использованием штамма GV3 101 Agrobacterium, содержащего плазмиду pGV3850, несущую промоторы, специфичные для кормовых клеток и слитые с соответствующим дисруптивным геном, выбранным из генов, перечисленных во вводной части настоящего описания, при этом до проверки на устойчивость к нематодам были регенерированы ростки.
Пример 2
В этом примере описывается реализация способа по изобретению на растениях табака, томатов, сахарной свеклы и Arabidopsis thaliana.
В этом примере описывается реализация способа по изобретению на растениях табака, томатов, сахарной свеклы и Arabidopsis thaliana.
1. Некоторое количество кДНК, индуцированных нематодами, было выделено из инфицированных Meloidogyne javanica (корневая узловая нематода) растений табака путем скринирования библиотеки кДНК. Ассоциированный с одной из этих кДНК протомор был выделен и соединен с репортерной последовательностью GUS, помещенной в Т-ДНК бинарного вектора; эта конструкция была использована для получения трансформированных корней табака путем сокультивирования с Agrobacterium rhizogenes. На прилагаемой фиг. 1 показана специфическая экспрессия (голубая окраска) репортерной последовательности GUS в зоне кормления нематод под управлением указанного промотора в корнях трансформированного таким образом растения табака. Нематода в зоне кормления окрашена красной краской. Та же самая конструкция была использована для трансформации целых растений табака путем сокультивирования с A.tumefaciens. На фиг. 2 показаны образцы, взятые из различных частей целого трансформированного растения табака, причем голубая окраска обнаруживается только на зараженных нематодой образцах корней.
Упомянутый выше промотор был соединен с барназой рибонуклеазой из Bacillus amyloliquefaciencs. Этой конструкцией трансформировали табак, используя A. tumefaciens. Трансформированные таким образом целые растения табака заражали затем M.javanica. Было определено, что среднее число мест внедрения нематоды на растение для контрольных растений табака, трансформированных GUS, было равно примерно 800, в то время как для двух независимо трансформированных растений табака, трансформацию которых осуществили согласно изобретению, число мест внедрения не растение было равно для одного из растений - 350, для другого - 10.
Эта методология была повторена с тем исключением, что индуцируемый нематодой промотор был соединен с кодирующей последовательностью гена, экспрессирующегоcя в зоне кормления нематоды, в антисмысловой ориентации. На фиг. 7 прямоугольные полоски обозначают общее число мест внедрения нематоды на растения для растений табака, трансформированных указанной антисмысловой последовательностью, растений табака, трансформированных контрольной GUS последовательностью, и нетрансформированных контрольных растений табака. На фиг. 7 легко увидеть, что некоторые из растений, трансформированных антисмысловой последовательностью, обнаруживают значительно более низкое количество мест внедрения по сравнению с контрольными популяциями. Такие устойчивые к нематодам представители этой популяции (трансформированной антисмысловой последовательностью) могут, конечно, быть использованы в стандартных процедурах скрещивания для получения большого числа индивидуальных устойивых к нематодам растений.
2. Тот ген, для которого была обнаружена экспрессия его промотора специфически в зоне кормления нематод при заражении корневой узловой нематодой в табаке (см. фиг. 1 и 2), также индуцируется в кормовых зонах других видов нематод и других видов растений. На фиг. 3 показан Нозерн-блот, демонстрирующий, что количество мРНК этого гена увеличено (т.е. этот ген индуцировался) как при заражении цистообразующей нематодой (Heterodera schactii) сахарной свеклы (Beta vulgaris), так и заражении корневой узловой нематодой (M. javanica) томатов (Lycospersicon esculentum). Таким образом, Нозерн-блот показывает, что гены, выделенные с использованием способа по изобретению, являются пригодными для создания устойчивости к широкому кругу корневых узловых и цистообразующих нематод во многих видах растений.
На фиг. 4 показан Нозерн-блот гена, индуцированного в картофеле в кормовой зоне цистообразующей нематоды картофеля Globodera rostochiensis. Это является дальнейшим подтверждением общей применимости данного способа.
Индуцированный нематодой ген был идентифицирован в Arabidopsis thaliana, и на фиг. 5 показана криосекция трансгенного корня A.thaliana со специфической экспрессией репортерной последовательности GUS в гигантской клетке в ответ на заражение Meloidogyne. На фиг. 6 показана специфическая экспрессия конструкции промотор/GUS в зоне кормления в ответ на заражение A.thaliana цистообразующей нематодой H.schactii.
Гены из растений одного вида могут точно экспрессироваться пространственно и по времени в растении другого вида, даже если эти виды принадлежат к разным семействам. Благодаря сходству в физиологии и патологии образования синцития и жизненных циклов цистообразующих нематод на ряде растений из разных семейств, ген, экспрессирующийся в синцитии одного растения, будет точно экспрессироваться при введении его в другие виды растений.
Подтверждение этого было получено с помощью идентификации эквивалентных генов в других видах растений. Рестрицированные геномные ДНК табака, томата и сахарной свеклы гибридизовались с pPMR1 (согласно методам раздела 8). Во всех вариантах кросс-гибридизация показала наличие в этих растениях эквивалентных генов. Конструкция, содержащая ген, представленный pPMR1, может, таким образом, управлять точно локализованной экспрессией подходящего антинематодного гена в ряде сельскохозяйственных растений. Эти эксперименты также позволяют создать способ выделения эквивалентных генов из других видов растений для экспрессии в них антинематодного защитного механизма.
Claims (9)
1. Способ борьбы с нематодами, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии: (а) идентифицируют ген, который индуцируется в успешно зараженном нематодой растении; (б) получают конструкцию, объединяя промоторный участок данного гена с другой областью, кодирующей продукт, нарушающий жизнедеятельность нематод или предотвращающий инфицирование растения нематодами, и (в) трансформируют растение указанной конструкцией с получением растения, устойчивого к нематодам.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на стадии (а) идентифицируют ген, который индуцируется в растении в зоне кормления нематод.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что ген, индуцируемый в зоне кормления нематод, идентифицируют следующим образом: (а) получают библиотеки кДНК зараженных и незараженных растений; (б) сравнивают полученные библиотеки кДНК; (в) выявляют клон кДНК, содержащий ген, индуцируемый в зоне кормления нематод, и (г) используют данный клон кДНК для идентификации соответствующего гена в растении.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (б) промоторный участок объединяют с областью, кодирующей продукт, вызывающий гибель клетки, способной редифференцироваться для образования кормовой зоны.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный продукт представляет собой ДНКазу, РНКазу, протеиназу, токсичный белок, токсичный пептид, продукт, обуславливающий мультигенный токсический синдром, или антисмысловую РНК редифференцирующихся клеток.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на стадии (б) промоторный участок объединяют с областью, кодирующей продукт, оказывающий летальное или сублетальное действие на нематод.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный продукт представляет собой токсичный для нематоды белок, антитело, нарушающее процесс питания нематод, или токсичный для нематод полипептид.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нематода является корневой цистообразующей нематодой.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что получают устойчивое к нематодам растение картофеля, томатов, сои, сахарной свеклы, рапса, пшеницы, ржи, ячменя, риса, моркови, капусты и табака.
Приоритет по признакам:
19.04.91 - признаки: антитело, нарушающее процесс питания нематод по п.7 и признак томатов, сои, сахарной свеклы, рапса, пшеницы, ржи, ячменя, риса, моркови и капусты по п.9;
10.09.90 - остальные пункты формулы и остальные признаки пп.7 и 9.
19.04.91 - признаки: антитело, нарушающее процесс питания нематод по п.7 и признак томатов, сои, сахарной свеклы, рапса, пшеницы, ржи, ячменя, риса, моркови и капусты по п.9;
10.09.90 - остальные пункты формулы и остальные признаки пп.7 и 9.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9019736.9 | 1990-09-10 | ||
| GB909019736A GB9019736D0 (en) | 1990-09-10 | 1990-09-10 | Plant parasitic nematode control |
| GB9108471.5 | 1991-04-19 | ||
| GB919108471A GB9108471D0 (en) | 1990-09-10 | 1991-04-19 | Plant parasitic nematode control |
| PCT/GB1991/001540 WO1992004453A1 (en) | 1990-09-10 | 1991-09-10 | Plant parasitic nematode control |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU93005092A RU93005092A (ru) | 1995-07-20 |
| RU2129373C1 true RU2129373C1 (ru) | 1999-04-27 |
Family
ID=26297633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU93005092A RU2129373C1 (ru) | 1990-09-10 | 1991-09-10 | Способ борьбы с нематодами |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0548197B1 (ru) |
| JP (1) | JPH06503470A (ru) |
| AT (1) | ATE166923T1 (ru) |
| AU (2) | AU8502391A (ru) |
| BG (1) | BG60686B1 (ru) |
| BR (1) | BR9106831A (ru) |
| CA (1) | CA2091450C (ru) |
| DE (1) | DE69129540T2 (ru) |
| DK (1) | DK0548197T3 (ru) |
| ES (1) | ES2118089T3 (ru) |
| HU (1) | HU218896B (ru) |
| RU (1) | RU2129373C1 (ru) |
| WO (1) | WO1992004453A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10480006B2 (en) | 2014-12-22 | 2019-11-19 | AgBiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2110169A1 (en) * | 1991-05-30 | 1992-12-10 | Walter Van Der Eycken | Nematode-responsive plant promoters |
| CA2112999C (en) * | 1991-10-04 | 2007-04-24 | Mark A. Conkling | Pathogen-resistant transgenic plants |
| US5866777A (en) * | 1991-11-20 | 1999-02-02 | Mogen International, N.V. | Method for obtaining plants with reduced susceptibility to plant-parasitic nematodes |
| GB9205474D0 (en) * | 1992-03-13 | 1992-04-29 | Cambridge Advanced Tech | Root knot nematode resistance |
| JPH07506485A (ja) * | 1992-03-20 | 1995-07-20 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト ズール フェルデルング デル ヴィッセンシャフテン エー ファウ | 真菌応答性キメラ遺伝子 |
| EP0666922A1 (en) * | 1992-11-02 | 1995-08-16 | Mogen International N.V. | Plants with reduced susceptibility to plant-parasitic nematodes |
| US6008436A (en) * | 1993-01-21 | 1999-12-28 | North Carolina State University | Nematode-resistant transgenic plants |
| ATE317445T1 (de) * | 1993-11-19 | 2006-02-15 | Biotechnology Res & Dev | Chimäre regulatorische regionen und gen - kassetten zur genexpression in pflanzen |
| GB9406371D0 (en) * | 1994-03-30 | 1994-05-25 | Axis Genetics Ltd | Nematicidal proteins |
| US5612471A (en) * | 1994-05-25 | 1997-03-18 | The Regents Of The University Of California | Nematode-induced genes in tomato |
| EP0871731A2 (en) * | 1995-01-17 | 1998-10-21 | Landbouwuniversiteit Wageningen | Antibodies for the control of cyst nematodes and transgenic plants expressing them |
| GB9524395D0 (en) * | 1995-11-29 | 1996-01-31 | Nickerson Biocem Ltd | Promoters |
| US6271437B1 (en) | 1998-05-18 | 2001-08-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Soybean gene promoters |
| GB0025225D0 (en) | 2000-10-14 | 2000-11-29 | Cambridge Advanced Tech | Plant cell death system |
| EP1753866B1 (en) | 2004-06-09 | 2010-09-22 | Pioneer-Hi-Bred International, Inc. | Plastid transit peptides |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA868242B (en) * | 1985-10-29 | 1987-06-24 | Monsanto Co | Protection of plants against viral infection |
| US4933286A (en) * | 1987-03-30 | 1990-06-12 | Plant Cell Research Institute, Inc. | Purification of apase-11 and retrieval of the nematode resistance gene |
-
1991
- 1991-09-10 RU RU93005092A patent/RU2129373C1/ru active
- 1991-09-10 HU HU9300681A patent/HU218896B/hu unknown
- 1991-09-10 WO PCT/GB1991/001540 patent/WO1992004453A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-09-10 EP EP91916522A patent/EP0548197B1/en not_active Revoked
- 1991-09-10 AU AU85023/91A patent/AU8502391A/en not_active Abandoned
- 1991-09-10 DK DK91916522T patent/DK0548197T3/da active
- 1991-09-10 CA CA002091450A patent/CA2091450C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-10 AT AT91916522T patent/ATE166923T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-10 JP JP3514974A patent/JPH06503470A/ja active Pending
- 1991-09-10 ES ES91916522T patent/ES2118089T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-10 BR BR919106831A patent/BR9106831A/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-09-10 DE DE69129540T patent/DE69129540T2/de not_active Revoked
-
1993
- 1993-04-05 BG BG97604A patent/BG60686B1/bg unknown
-
1995
- 1995-09-15 AU AU31708/95A patent/AU691020B2/en not_active Expired
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10480006B2 (en) | 2014-12-22 | 2019-11-19 | AgBiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
| RU2727665C2 (ru) * | 2014-12-22 | 2020-07-22 | Агбайоми, Инк. | Пестицидные гены и способы их применения |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT65684A (en) | 1994-07-28 |
| CA2091450C (en) | 2000-07-25 |
| EP0548197B1 (en) | 1998-06-03 |
| BG97604A (bg) | 1994-03-31 |
| AU8502391A (en) | 1992-03-30 |
| BR9106831A (pt) | 1994-01-25 |
| ES2118089T3 (es) | 1998-09-16 |
| DE69129540T2 (de) | 1998-10-01 |
| AU691020B2 (en) | 1998-05-07 |
| AU3170895A (en) | 1995-12-14 |
| BG60686B1 (bg) | 1995-12-29 |
| ATE166923T1 (de) | 1998-06-15 |
| EP0548197A1 (en) | 1993-06-30 |
| DE69129540D1 (de) | 1998-07-09 |
| DK0548197T3 (da) | 1998-10-12 |
| WO1992004453A1 (en) | 1992-03-19 |
| HU9300681D0 (en) | 1993-06-28 |
| CA2091450A1 (en) | 1992-03-11 |
| HU218896B (hu) | 2000-12-28 |
| JPH06503470A (ja) | 1994-04-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5589622A (en) | Plant parasitic nematode control | |
| RU2725953C2 (ru) | Подавление экспрессии генов у насекомых-вредителей | |
| Tennant et al. | Papaya ringspot virus resistance of transgenic Rainbow and SunUp is affected by gene dosage, plant development, and coat protein homology | |
| RU2129373C1 (ru) | Способ борьбы с нематодами | |
| US5824876A (en) | Plant parasitic nematode control | |
| WO2001096584A2 (en) | Materials and methods for the control of nematodes | |
| CN103562395A (zh) | 对昆虫害虫具有抗性的植物 | |
| EP0917583B1 (en) | Maize promoter sequence for leaf- and stalk-preferred gene expression | |
| AU2009271435B2 (en) | Plant regulatory sequences | |
| WO1993006710A1 (en) | Pathogen-resistant transgenic plants | |
| KR19980702463A (ko) | 저온유도성 프로모터 배열 | |
| HU220358B (hu) | Eljárás hibrid vetőmagok előállítására | |
| JPH07506485A (ja) | 真菌応答性キメラ遺伝子 | |
| BR112021000302A2 (pt) | Sequência de ácidos nucleicos, método para detectar a presença do dna do evento de milho transgênico dbn9501 em uma amostra, kit de detecção de dna, métodos para proteger uma planta de milho, método para criar uma planta de milho resistente a insetos e/ou tolerante ao herbicida glufosinato e produto ou commodity agrícola derivado do evento de milho transgênico dbn9501 | |
| CN110144363A (zh) | 抗虫耐除草剂玉米转化事件 | |
| CZ40494A3 (en) | Recombinant sequence dna, protein, micro-organism and a plant containing such dna | |
| ES2270431T3 (es) | Elemento regulador especifico de microesporas. | |
| US6284952B1 (en) | Transgenic plants with divergent [ScaM4 or] SCaM5 gene to achieve multiple disease resistance | |
| JPH11504521A (ja) | 植物病原体耐性遺伝子およびそれの使用 | |
| CN108517322B (zh) | 一种掌叶半夏胰蛋白酶抑制剂基因、其编码的蛋白及抗虫应用 | |
| CN108795949B (zh) | 一种水稻叶色调控相关基因OsWSL6及其编码蛋白质和应用 | |
| WO2000008189A2 (en) | Plant resistance gene | |
| RU2285045C2 (ru) | Система для уничтожения растительных клеток | |
| US11674152B2 (en) | Anti-armyworm use of CRY1AB/CRY1ACZM gene | |
| EA048659B1 (ru) | Ген устойчивости к патогену рода heterodera |