JPH11504521A

JPH11504521A - 植物病原体耐性遺伝子およびそれの使用

Info

Publication number: JPH11504521A
Application number: JP8533898A
Authority: JP
Inventors: マーチントーマス，コルウィン; ジョンバリント−コーティ，ピーター; アレンジョーンズ，デビット; ダラスジョージジョーンズ，ジョナサン
Original assignee: ジョンインズセンターイノベイションズリミティド
Priority date: 1995-05-11
Filing date: 1996-05-13
Publication date: 1999-04-27
Also published as: GB9509575D0; AU5699196A; CA2218554A1; WO1996035790A1; US6225527B1; AU702130B2; EP0830451A1

Abstract

(57)【要約】位置クローニングによりトマトCf-4遺伝子を単離し、その配列をコードされるアミノ酸配列と共に提供する。ポリペプチド、それの対立遺伝子、変異体および誘導体をコードするＤＮＡ、並びにそれと有意な程度の相同性を示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを植物細胞に導入し、コードされるポリペプチドを発現せしめ、そのような細胞およびそれの子孫を含んで成る植物に病原体耐性を付与することができる。Cf-4配列はCf-9と高度な相同性を示し、高ロイシン反復配列を含んで成る。

Description

【発明の詳細な説明】植物病原体耐性遺伝子およびそれの使用本発明は植物における病原体耐性に関し、より詳しくは、病原体耐性遺伝子の同定および使用に関する。それはトマトCf-4遺伝子のクローニングに基づく。植物は潜在的に病原性の微生物により常に攻撃を受けている。作物は普通、遺伝子的に均一な単一栽培（モノカルチャー）として栽培されるので、それらは特に害を受けやすい。しかしながら、植物は先在性防御と誘発性防御の両方の系列を進化させてきたが、病原体、特に生存している植物細胞との密接な関連によりそれらの栄養を得る病原体は、それらの防御を巧みに免れるに違いない。病原体が病気を引き起こし得るなら、そのような相互作用は和合性であると言われ、植物が耐性であるなら、相互作用は不和合性であると言われる。品種特異的耐性はしばしば（排他的でなく）優性Ｒ遺伝子により指定される。病原体がＲ遺伝子に打ち勝つように突然変異する時、変異はしばしば劣性である。Ｒ遺伝子が機能するには、非病原性遺伝子（avirulence gene; Avr）と呼ばれる病原体中の対応遺伝子も存在しなければならない。毒性になるためには、病原体（真菌、細菌またはウイルス）がもはやＲ遺伝子依存性防御機構を始動させる物質を生産しなくならなければならない（Flor，1971）。しばしばエリシター／レセプターモデルと呼ばれる１つのモデルは、もし病原体が対応するAvr 遺伝子を有するなら、Ｒ遺伝子が植物に該病原体の存在を検出することができるようにする生成物をコードするというものである（Gabriel および Rolfe，1990）。その後でこの認識が防御反応の活性化に変換される。トマト腐葉土病原体であるクラドスポリウム・フルバム（Cladosporium fulvu m ）からの２つの真菌非病原性遺伝子の特徴付けが報告されている。Avr9とAvr4 遺伝子は小さな高システインペプチドをコードし（van Kan 他，1991；Joosten 他，1995）、それらのプロセシングされた成熟形では、両遺伝子はそれぞれ28および106 アミノ酸残基から構成される。Avr9とAvr4はそれぞれＲ遺伝子Cf-9とCf -4 を担持しているトマト系統にＣ．フルバムの品種に対する非病原性を付与する。本発明者らは、それらの２つのＲ遺伝子が遺伝子的に密接に連鎖しているか、ことによると対立遺伝子であるかもしれないことを示した（Jones 他，1993；Ba lint-Kurti他，1994）。本発明者らはトランスポゾン標識法によりCf-9遺伝子を単離した（Jones 他，1994；WO 95/18230 として公開されたPCT/GB94/02812）ので、本明細書中でより精妙な遺伝子分析およびプローブとしてCf-9ＤＮＡを使ったCf-4の位置クローニングを報告する。クローン化された非毒性遺伝子およびそれらの同種の耐性遺伝子の入手可能性は、究極的には広範囲の作物において広域型で且つ永続性の病気抵抗性を構築するために利用することかできる（de Wit， 1992；Staskawicz他，1995）。植物では遺伝子の単離は２つの主なアプローチ、即ち位置クローニングおよびトランスポゾン標識付けにより達成されている。幾つかの植物遺伝子が位置クローニングにより好結果に単離されており（Tanksley他，1995中に概説されている）、それらの遺伝子としては、幾つかのＲ遺伝子、即ちPto （Martin他，1993）およびトマトからのCf-2（Dixon 他，1996）、並びにアブラナ科（Arabidopsis ）からのRPS2およびRPM1（Bent他，1994；Mindrinos他，1994；Grant他，1995）が挙げられる。大部分の位置クローニング方法は、制限断片長さ多形性（RFLP）マーカーの使用に大きく頼っている。しかしながら、最近になって、もっと多数のＤＮＡ配列を多形性について調査できるようにする、より微妙なＤＮＡ配列変異を検出することのできるＰＣＲをベースにした方法が開発された。これらの技術はランダム増幅多形性ＤＮＡ（RAPD、Williams他，19 90）および増幅制限断片多形性分析（AFLP、ZabeauおよびVos，1992，EP-A-9240 2629.7；Vos 他，1995；Thomas他，1995）を含み、そして位置クローニング方法による植物遺伝子の単離を促進するだろう。トランスポゾン標識付けは、タバコからＮ遺伝子（Whitham 他，1994）、亜麻からＬ⁶ （Lawrence他，1995）、トマトからCf-9（Jones 他，1994；WO 95/18230 として公開されたPCT/GB94/02812）を単離するのに使われている。植物Ｒ遺伝子のアミノ酸配列の比較は、現在のところそれらが２つの主なクラスを構成することを示している。ＰＴＯを除く全部が高ロイシン反復（ＬＲＲ）モチーフを含むと思われるが、しかしＲ遺伝子のＬ ⁶、Ｎ、RPM1およびRPS2はCf- 9 （Staskawicz他，1995）およびCf-2（Dixon 他，1996）中に存在しない追加の領域を有するようである。更に、Ｌ ⁶、ＮおよびRPS2は、大部分がＬＲＲから成り且つ主に細胞質外膜結合型タンパク質であると予想されるCf-9およびCf-2とは対照的に、恐らく細胞内に存在するだろう。本発明者らの分析は、推定上のCf-4 タンパク質がCf-9と高度に相同であることを示す。 WO 93/11241 は、Cf-9と、および我々かたった今発見したCf-4（本発明の主題である）と幾らか相同性を有するポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質（PGIP）をコードする遺伝子の配列を報告している。Cf-9，Cf-4および他のもの（Cf-5，-2 など）は、当業者により「病原体耐性遺伝子」または「耐病性遺伝子」と呼ばれている。 PGIPをコードする遺伝子は病原体耐性遺伝子ではない。病原体耐性遺伝子（Ｒ）は、対応する非病原性遺伝子（Avr ）を発現している病原体の存在を植物が検出できるようにする。病原体が検出されると、過敏性反応（ＨＲ）のような防御反応が活性化される。そのような手段により、植物は病原体が侵入を試みた部位における局所的な細胞死によって生存細胞の病原体を滅ぼすことができる。他方で、WO 93/11241 のPGIP遺伝子（例えば）は、Ｒ遺伝子による病原体の検出に起因する植物防御反応において誘導される種類の遺伝子である。よって、病原体耐性遺伝子は、病原体由来で且つAvr 依存性の分子に対する受容体をコードするものと見なすことができる。かくして、それは病原体の検出のための植物のRADAR にたとえることができるのに反して、PGIPは一度検出されたら病原体に対して植物が開始する防御に関与しており且つ病原体耐性遺伝子ではない。植物中の病原体耐性遺伝子の発現は、その植物における防御反応の活性化を引き起こす。これは、植物と病原体または対応するエリシター分子との接触によって起こることができるが、エリシターの不在下での耐性遺伝子の過剰発現により活性化を引き起こす可能性が報告されている。防御反応は、局所的に、例えば植物と病原体またはエリシター分子との接触部位で、または全身的に活性化されてもよい。病原体耐性遺伝子を発現する植物における防御反応の活性化は、適当な対応するエリシター分子、例えば記載されるようなクラドスポリウム・フルバム（Cladosporium fulvum）avr 遺伝子により生産されるようなもの、と植物との接触によって引き起こすこともできる。エリシターはクラドスポリウム・フルバム（Cladosporium fulvum）のような病原体の抽出物中に含まれるか、または完全にもしくは部分的に精製されてもよく、完全にもしくは部分的に合成されたものであってもよい。エリシター分子は、それが防御反応の活性化を惹起せしめるためのＲ遺伝子産物に対する適当なリガンドであるならば、「対応する」と言うことができる。「Cf-x」／「Avrx」という用語は当業界で標準的である。Cf耐性遺伝子および対応する真菌非病原性遺伝子（Avr ）は、最初はそれの測定可能な活性が互いに排他的な相互作用ペアに属する遺伝子の相互作用ペアとして遺伝学的に定義された。Cf-4により認識される成分がCf-9により認識されるものとは異なっているので、Avr9はCf-9含有トマトに対して壊死反応を誘発するが、Cf-4含有トマトに対しては全く反応を誘発しない。植物中でのCf-4機能の発現は、様々なＣ．フルバム品種の和合性を調べることにより決定することができる。全ての既知Avr 遺伝子の機能性コピーを有するＣ．フルバムの品種（品種０）は、全Cf遺伝子を欠いているトマト上でのみ増殖する（和合性である）だろう。それはいずれかの機能性Cf遺伝子を有する植物上では増殖しない（不和合性である）だろう。もしＣ．フルバム品種が機能性Avr4遺伝子を欠いているならば（品種４）、それはいずれかのCf遺伝子を欠いている植物上で増殖できるだけでなく、Cf-4遺伝子を有する植物上でも増殖できるだろう。機能性Avr2遺伝子も欠いている品種（品種２，４）は、Cf-2遺伝子を有する植物上で増殖できるだろう。機能性Avr2遺伝子のみを欠く品種（品種２）は、Cf-4遺伝子を有する植物上で増殖できないだろう。同様に、Ｃ．フルバム品種５（機能性Avr5遺伝子を欠く）は、Cf-4 遺伝子を有する植物上で増殖できないだろう。品種４も品種２，４もどちらも、他のCf遺伝子のいずれかを有する植物上で増殖できないだろう。様々な品種が当業界で一般に入手可能であり、例えば、Research Institute for Plant Pro tection(IPO-DLO)，PO Box 9060，6700 GW Wageningen，The Netherlandsから入手可能である。品種４は受託番号IPO103 79のもとに入手可能であり、そして品種２，４は受託番号IPO50379のもとに入手可能である。 Cf-2遺伝子は1996年４月１日にJohn Innes Centre Innovations Limited により出願されそしてGB9506658.5 から優先権を主張しているPCT/GB96/00785の主題である。本発明者らは、今ここで、真菌クラドスポリウム・フルバム（Cladosporium fulvum ）に対する耐性を付与するトマト遺伝子Cf-4を単離し、そしてそのＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を決定した。トマトCf-4遺伝子のＤＮＡ配列を図５（配列番号１）に示し、そして推定アミノ酸配列を図６（配列番号２）に示す。ある面によれは、本発明は病原体耐性遺伝子をコードする核酸単離物であって、前記遺伝子が配列番号２に示されるアミノ酸配列もしくはその断片、またはそれに対してかなりの程度の相同性を示すアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、核酸単離物を提供する。これは、Cf-9，Cf-2およびCf-5のいずれかのアミノ酸配列により示されるよりも程度の大きい、配列番号２のアミノ酸配列との配列同一性であることができる。これは少なくとも約95％の同一性であることができる。最も好ましくは、前記核酸は配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードし、この場合、前記核酸単離物は配列番号１に示される配列を有する核酸、または所望のポリペプチドをコードするのに十分な部分（例えばメチオニン開始コドンからフレーム内の最初の下流終止コドンまで）を含んで成ることができる。一態様では、ＤＮＡが配列番号１のヌクレオチド201 〜2618であるヌクレオチド配列、またはその変異体、誘導体もしくは対立遺伝子を含んで成る。本発明の更なる面は、配列番号１のヌクレオチド201 〜2618またはそれの断片、誘導体、変異体もしくは対立遺伝子を含んで成るプローブを使ってＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そして植物に病原体耐性、例えばクラドスポリウム・フルバムの品種（例えばAvr4を発現する品種）に対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードするＤＮＡを単離することにより得られる、病原体耐性遺伝子をコードする核酸単離物、またはその断片を提供する。前記植物はトマトであることができる。適当な技術は当業界で周知である。よって、本発明は、病原体耐性遺伝子をコードする核酸を同定しそして／または単離する方法であって、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするか、コード配列に相補的であるか、またはコード配列かもしくはコード配列に相補的な配列のいずれかの断片をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を使って、候補の（または「標的」の）核酸を探査することを含んで成る方法も提供する。前記候補の核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであることができる）は、病原体耐性遺伝子をコードする核酸を含有するかまたは含有する疑いのある任意の細胞または生物から得ることができる。好ましいヌクレオチド配列は配列番号１を有する。示された配列に相補的な配列、およびそれの断片を使ってもよい。好ましい探査条件は、その先調査することができる、陽性と同定される少数のハイブリダイゼーションを有する単純なパターンが得られるのに十分な位に緊縮である条件である。少数の陽性クローンのみが残るまでハイブリダイゼーションの緊縮性を徐々に増加することは当業界で周知である。本発明の核酸は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または与えられた配列の変異体、誘導体もしくは対立遺伝子をコードすることができる。好ましい変異体、誘導体および対立遺伝子は、野性型遺伝子によりコードされるタンパク質の機能的特徴、特に病原体耐性を付与する能力、最も特別にはAvr4エリシター分子を発現する病原体に対する耐性を付与する能力、を保持しているものである。変異体または誘導体を作製するための配列の変更は、１もしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換をもたらすような、核酸中の１もしくは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換のうちの１つもしくは複数によることができる。もちろん、コードされるアミノ酸配列に何ら変化を生じないような核酸の変更も含まれる。本発明の一面によれば、本明細書中に提供されるいずれかのコード配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んで成る核酸も提供される。これの別の見方は、この面での核酸が本明細書中に提供されるいずれかのコード配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズできることである。もちろん、ＤＮＡは通常二本鎖であり、鎖の分離後、鎖のどちらがハイブリダイズしているかその間に区別を付けることなくサザンハイブリダイゼーションのようなブロット技術が実施される。好ましくは、ハイブリダイズできる核酸またはそれの相補物は、宿主に病原体耐性を付与することができるポリペプチドをコードし、即ち病原体耐性遺伝子を含有する。好ましいハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であるが、通常は他の配列を除外してしまう程に着目の配列間に陽性のハイブリダイゼーションが起こるのに十分な位、緊縮である。本発明の核酸、例えば本明細書中に開示される特定の配列の変異体、誘導体および対立遺伝子は、下記の特徴のうちの１つもしくは複数により、またはCf-4アミノ酸配列とその他の各配列との比較から直接引き出せる他の特徴により、または遺伝子機能の観察により、Cf-9，Cf-2および／またはCf-5から区別することができる： − アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約95％の同一性を有すること； − 例えばAvr4を発現するクラドスポリウム・フルバム（Cladosporium fulvum ）品種（技術の現状で入手可能である）により与えられるようなAvr4エリシター分子と植物とを接触せしめた時、該核酸を発現する植物において防御反応を誘発すること； − Research Institute for Plant Protection(IPO-DLO)，PO Box 9060，6700 GW Wageningen，The Netherlands に受託番号IPO10379 のもとに寄託されており且つそこから入手可能であるＣ．フルバム品種４またはそれの抽出物と植物とを接触せしめた時、該核酸を発現する植物において防御反応を誘発しないこと； − 前記機関に受託番号IPO50379のもとに寄託されており且つそこから入手可能であるＣ．フルバム品種２，４またはそれの抽出物と植物とを接触せしめた時、該核酸を発現する植物において防御反応を誘発しないこと； − 例えばAvr4を発現するクラドスポリウム・フルバム品種または他の生物により提供されるようなAvr4エリシター分子、WO 95/31564の配列番号13におよび本明細書中の図４に与えられるアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列と植物とを接触せしめた時、該核酸を発現する植物において防御反応を誘発すること； − 例えばAvr9を発現するクラドスポリウム・フルバム品種または他の生物により提供されるようなAvr9エリシター分子（de Wit，1992）、例えばWO 95/18230 中に配列番号３としておよびWO 95/31564 中に配列番号４として与えられるキメラ形態のアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列と植物とを接触せしめた時、該核酸を発現する植物において防御反応を誘発しないこと； − 例えばAvr2を発現するクラドスポリウム・フルバム品種または他の生物により提供されるようなAvr2エリシター分子と植物とを接触せしめた時、該核酸を発現する植物において防御反応を誘発しないこと； − 例えばAvr5を発現するクラドスポリウム・フルバム品種または他の生物により提供されるようなAvr5エリシター分子と植物とを接触せしめた時、該核酸を発現する植物において防御反応を誘発しないこと； − 該核酸および対応するエリシター分子を発現する植物において、Cf-9遺伝子および対応するAvr9分子を発現する植物において誘発される防御反応よりも早い発育段階で、防御反応を誘発すること； − 対応するエリシター分子、例えばAvr4と植物とを接触せしめた時、該核酸を発現する植物の非光合成組織（例えば根）において防御反応を誘発すること； − Cf-4についての本明細書中に与えられる配列情報から同定することができる高ロイシン反復配列（ＬＲＲ）の数を含んで成ること。 Cf-4ポリペプチド、並びにCf-9，Cf-2およびCf-5のような他のものは、推定膜貫通型タンパク質であることにより、他の病原体耐性遺伝子の生産物から区別することができる。例えば、アブラナ科（Arabidopsis ）RPP5遺伝子の遺伝子産物は推定上細胞質タンパク質である。本発明の核酸単離物は、植物中でのそれの発現が植物において防御反応の活性化を引き起こすことができる病原体耐性遺伝子をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成ることができる。そのような活性化は、病原体または対応するエリシター分子と植物との接触によることができる。前記ヌクレオチド配列は配列番号１に示されるコード配列を含んで成ることができる。例えば、該配列は配列番号１のヌクレオチド201 〜2619を含んで成ることができる。前記核酸は、１もしくは複数のヌクレオチドの付加、挿入、欠失または置換による、配列番号１に示されるコード配列の対立遺伝子、誘導体または変異体を含んで成るヌクレオチド配列を含むことができる。本発明の核酸は、植物中でのそれの発現が植物において防御反応の活性化を引き起こすことができる病原体耐性遺伝子であって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成り、前記ポリペプチドが１もしくは複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換による配列番号２に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子、誘導体または変異体を含んで成るアミノ酸配列を含んで成る病原体耐性遺伝子をコードすることができる。配列番号２のアミノ酸配列またはそれに対してかなりの程度の相同性を示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡをゲノムＤＮＡとしてまたはｃＤＮＡとして含むことができる本発明の核酸単離物は、組換えベクター、例えばファージまたはコスミドベクターの形であることができる。該ＤＮＡは、宿主細胞（例えば植物細胞）中での発現に備えて適当なプロモーターおよび調節因子の支配下にあってもよい。ゲノムＤＮＡの場合、これは自身のプロモーターおよび調節因子を含んでもよく、ゲノムＤＮＡの場合、これは宿主細胞の発現のための適当なプロモーターおよび調節因子の支配下に置くことができる。当業者は、組換え遺伝子発現のためにベクターを作製しそしてプロトコールを考案するのに十分な能力がある。適当な調節配列、例えばプロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を適宜含む、適当なベクターを選択しまたは作製することができる。更なる詳細については、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版，Sambrook他，1989， Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。例えば核酸構成物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのＤＮＡの導入および遺伝子発現に用いられる核酸の工作のための並びにタンパク質の分析のための多数の既知技術およびプロトコールが、Short Protocols in Molecular Biology，第２版，Ausubel 他編，John Wiley & Sons，1992 中に詳しく記載されている。Sambrook他および A usubel他の開示、並びに本明細書中に引用される他の全ての文献は、参考として本明細書中に組み込まれる。本発明の核酸分子およびベクターは、実質的に純粋なまたは均質な形態で、即ち必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外のいずれの起源のまたは着目の種の核酸もしくは遺伝子を含まないまたは実質的に含まない形で、それらの自然環境から単離されそして／または精製された状態で提供することができる。本発明の核酸はｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡを含んで成ることができ、そして完全にまたは部分的に合成のものであることができる。「単離物」という語はそれらの可能性の全てを包含する。所定の遺伝子構成物を細胞に導入する時、当業者に周知の幾つかの考慮すべき事柄を斟酌しなけれはならない。挿入しようとする核酸を、転写を促進する効率的な調節因子を含む構成物の中で構築することができる。該構成物を細胞中に導入する方法は入手可能であるに違いない。構成物が一端細胞膜の内側に入ったら、本発明の様々な態様に従って内因性染色体物質中への組込みが起こってもよくまたは起こらなくてもよい。最終的に、植物に関する限り、標的細胞のタイプは細胞を完全な植物に再生することができるようなものであるべきである。プレ配列を含むＤＮＡセグメントにより形質転換された植物は、植物の遺伝子操作について既に知られている標準技術によって作製することができる。任意の適当な技術、例えば本来の遺伝子伝達能力を利用したアグロバクテリウム（Agro bacterium ）所有の武装解除Tiプラスミドベクター（EP-A-270355，EP-A-011671 8，Bevan，1984）、粒子もしくはマイクロプロジェクタイル衝撃（US 5100792， EP-A-444882，EP-A-434616）、マイクロインジェクション（WO 92/09696，WO 94 /00583，EP 331083，EP 175966）、エレクトロポレーション（EP 290395，WO 87 06614）、または他の形態の直接ＤＮＡ取込み（DE 4005152，WO 9012096，US 46 84611）を使って、ＤＮＡにより植物細胞を形質転換せしめることができる。アクロバクテリウム形質転換は、双子葉植物種を形質転換せしめるのに当業者により広く利用されている。アグロバクテリウムは外来ＤＮＡにより幾つかの単子葉植物種を形質転換せしめることができると報告されている（WO 92/14828）けれども、アグロバクテリウムが非効率的であるかまたは無効である場合にはマイクロプロジェクタイル衝撃、エレクトロポレーションまたは直接ＤＮＡ取込みが好ましい。あるいは、異なる技術の組合せを使って、例えばアグロバクテリウムがコーティングされた微粒子での衝撃（EP-A-486234）、または外傷を誘導するためのマイクロプロジェクタイル衝撃の後のアグロバクテリウムとの共生培養（EP -A-486233）を使って、形質転換工程の効率を増大させることができる。形質転換技術の特定の選択は、ある植物宿主を形質転換するそれの効率、並びに選択した特定の方法を使って本発明を実施する人の経験および好みによって決定されるだろう。植物細胞中に核酸を導入するための形質転換法の特定の選択は、本発明にとって重要でないし本発明を制限するものでもない。 Cf-4遺伝子およびそれの変形、例えばCf-4遺伝子、それの対立遺伝子、変異体および誘導体のタンパク質産物にかなりの程度の相同性を示すタンパク質をコードするものは、植物に、特にトマトに、Ｃ．フルバムのような病原体に対する耐性を付与するために用いることができる。この例としては、Cf-4遺伝子と同じ染色体位置を有するトマト属〔ライコペルシコム・ヒルスツム（Lycopersicon hi rsutum ）〕からのクローン化ＤＮＡまたはそれの任意のサブクローン化断片を挙げることができる。この目的で、上述のベクターをトランスジェニック植物の生産に使うことができる。そのような植物はCf-4遺伝子により付与された病原体耐性を有することができる。本発明は更に、そのようなベクターにより形質転換された宿主細胞、特に植物または微生物細胞を包含する。よって、本発明の核酸を含んで成る宿主細胞、例えば植物細胞が提供される。細胞中、前記核酸は染色体中に組み込まれてもよい。本発明の核酸を含んで成るベクターは、特にゲノム中への組換えのために核酸を細胞中に導入するのに該ベクターを使用する予定である場合には、プロモーターを含む必要はない。本発明によれば、本発明により提供されるようなヌクレオチド配列を、コードされるポリペブチドの発現調節用プロモーターの作用可能な制御下において、それのゲノム中に組み込んでいる植物細胞も提供される。本発明の他の面は、植物細胞中にヌクレオチド配列を含んで成るベクターを導入することを含む、そのような植物細胞の作製方法を提供する。そのような導入の後、ベクターと植物細胞のゲノムとの間の組換えによって前記ヌクレオチド配列をゲノム中に導入することができる。次いで、導入された核酸によりコードされるポリペプチドを発現せしめることができる。本発明の植物細胞を含んで成る植物、並びにそのような植物の任意のクローン、種子、自殖もしくは雑種後代および子孫、並びにそれらのいずれかの任意部分、例えば挿し木、種子も提供される。本発明は、任意の植物栄養分体、即ち有性もしくは無性の繁殖または再生に使うことができる任意部分（挿し木、種子などを含む）を提供する。本発明は更に、植物のまたはそれの祖先の細胞中に核酸を導入する初期段階の後、植物の細胞内での、配列番号２のアミノ酸配列、またはそれの変異体、対立遺伝子もしくは誘導体、または有意に相同のアミノ酸配列をコードする核酸からの発現（それによりコードされるポリペプチドを生産すること）を含んで成る方法を提供する。そのような方法は該植物に病原体耐性を付与することができる。これは、WO 91/15585（Mogen）にまたはより好ましくはWO 95/31564として公開されたPCT/GB95/01075に記載された方法のいずれかに従って、Avr4遺伝子と、または病原体耐性を付与することに関与する他の任意の遺伝子と組み合わせることができる。 Cf-4，Cf-9およびCf-2遺伝子は、それらがトマト腐葉土Ｃ．フルバムの増殖を防止する耐性をトマトに付与するという点で同じように機能する。しかしながら、それらは異なるAvr 生産物の認識により動き、それらが病原体の増殖を止めて耐性応答を刺激する速度に微妙な差がある（Hammond-KosackおよびJones 1994； Ashfield他，1994）。それらの差は本明細書中およびWO 95/31564（前掲）に開示される用途に最大限に利用することができる。植物のゲノム中に安定に組み込まれた遺伝子は、世代から世代へと該植物の子孫に受け継がれ、その子孫の細胞はコードされるポリペプチドを発現することができ、そのため増強された病原体耐性を有することができる。病原体耐性は、病原体（例えばクラドスポリウム・フルバム）の和合性を評価することにより、または病原体非病原性遺伝子（例えばAvr-4 ）の組換え発現もしくは例えば本明細書中に記載されるような組換えウイルスの形でのAvr-4 遺伝子産物の伝達を使うことにより、決定することができる。 Cf-4遺伝子の配列分析は、Cf-9遺伝子（PCT/GB94/02812；Jones 他，1994）やCf-2 遺伝子（PCT/GB96/00785；Dixon 他，1996）と同様に、それが高ロイシン反復（ＬＲＲ）領域をコードするＤＮＡ配列を含むことを示し、そして相同性研究は、ＬＲＲを含む他の遺伝子との強力な相同性があることを明らかにした。それらの３つの遺伝子は全て同様な一般的特徴を示し、それ自体今までに特徴付けられた他の耐病性遺伝子とは異なる耐病性遺伝子の新規クラスを意味する。更なる面によれば、本発明は、新規耐性遺伝子を捜すために、病原体耐性遺伝子間で、例えばCf-9とCf-4の間で、および／またはCf-4とCf-2の間で保存されている１もしくは複数の配列を含んで成るオリゴヌクレオチドの使用を含む、植物病原体耐性遺伝子を同定する方法を提供する。よって、病原体耐性遺伝子を含んで成る（病原体耐性を付与することができるポリペプチドをコードする）核酸を得る方法であって、あるオリゴヌクレオチド（それの詳細は本明細書中に記載される）またはそのようなオリゴヌクレオチドを含む核酸分子を標的／候補核酸とハイブリダイズせしめることを含んで成る方法が提供される。標的または候補核酸は、例えば、病原体耐性遺伝子をコードすることが知られている生物から得られるゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを含んで成ることができる。ハイブリダイズするクローンを同定し、そして更なる調査および／または使用のために標的／候補核酸を単離することができる。ハイブリダイゼーションは、適当に緊縮な条件下で核酸を探査しそして陽性ハイブリダイゼーションを同定すること（既知技術に従う）および／または核酸増幅方法（例えばＰＣＲ）におけるプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの使用を必要とし得る。探査のための好ましい条件は、更に調査することができるような、陽性として同定される少数のハイブリダイゼーションを有する単純なパターンが得られるのに十分な位に緊縮である条件である。少数の陽性クローンだけが残るまでハイブリダイゼーションの緊縮性を高めることは当業界で周知である。探査に代わるものとして、まだ核酸ハイブリダイゼーションを使用するけれども、ＤＮＡ配列を増幅せしめる目的でデザインされたオリゴヌクレオチドを、常用手順を用いて、ＰＣＲ反応においてまたは別の核酸増幅を含む方法において使用することができる。例えば“PCR Protocols: A Guide to Methods and Applic ations”，Innis 他編，1990，Academic Press，New Yorkを参照のこと。プローブのまたはＰＣＲプライマーのデザインに使われる適当な好ましいアミノ酸配列は、病原体耐性を付与することができるポリペプチド間で保存された（完全に、実質的にまたは部分的に）配列、例えばCf-4とCf-9により、および／またはCf-4とCf-2により、および／またはCf-4，Cf-9およびCf-2によりコードされる配列である。アミノ酸配列情報に基づいて、遺伝暗号の縮重、および適当な場合、候補核酸が得られる元の生物のコドン使用頻度を考慮に入れながら、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーをデザインすることができる。好ましくは、例えば核酸増幅に使われる本発明のオリゴヌクレオチドは、約10 以下のコドン（例えば６，７または８個）を有し、即ち長さが約30以下のヌクレオチド（例えば18，21または24）である。ＰＣＲ生成物が耐性遺伝子に相当するかどうかの評価は様々な方法で行うことができる。ＰＣＲバンドは生成物の複雑な混合物を含むことがある。個々の生成物をクローニングし、そして各々を、このプローブに対して多形性を示した子孫において分離している既知の耐病性遺伝子への連鎖についてスクリーニングすることができる。あるいは、ＰＣＲ生成物を、変性ポリアクリルアミドＤＮＡ配列決定用ゲル上で多形性を示すことができるように処理し、耐性遺伝子に関連づけられる特定バンドをクローニング前に予備選択しておくことができる。一端候補のＰＣＲバンドがクローニングされそして既知の耐性遺伝子に関連づけられれば、それを使ってクローンを単離して、そのクローンを他の特徴についておよびCf-9，Cf-2，Cf-4または他の関連遺伝子との相同性について詳しく調べることができる。その後で形質転換によりそれを分析して、着目の植物の病気感受性品種への導入に対するそれの機能を評価することができる。あるいは、ＰＣＲバンドまたはそれを分析することにより誘導された配列を使って、植物育種家が有用な耐性遺伝子の分離をモニタリングするのを助けることができる。それらの技術は、植物の病原体耐性遺伝子の同定に一般的に応用可能である。この方法で同定することができる遺伝子のタイプの例としては、ジャガイモの疫病菌フィトフトラ（Phytophthora）耐性、大麦やトウモロコシのような穀物のうどんこ病耐性およびさび病耐性、キンギョソウ（Antirrhinum ）や亜麻のさび病耐性、レタスやアブラナ科（Arabidopsis ）のべと病耐性、ジャガイモ、トマトおよびタバコのウイルス耐性、トマトの線虫耐性、アブラナ科やトマトの細菌病原体に対する耐性、並びにトウガラシのザントモナス（Xanthomonas ）耐性が挙げられる。一端病原体耐性遺伝子が同定されれば、当業者に周知の技術を使ってそれを植物細胞の中に再導入してトランスジェニック植物を生産することができる。更なる面によれば、本発明は、ＬＲＲの存在により、または特に上述した技術により同定された植物病原体遺伝子のタンパク質産物をコードするＤＮＡ単離物を提供する。更に別の面によれば、本発明は、本明細書中に開示されるようにＬＲＲの存在によりまたは核酸ハイブリダイゼーションにより同定された病原体耐性遺伝子を有するように遺伝子操作されているトランスジェニック植物、特に作物を提供する。本発明に係る植物の例としては、タバコ、ウリ科、ニンジン、アブラナ科植物、レタス、イチゴ、アブラナ科油料種子、サトウキビ、小麦、大麦、トウモロコシ、米、大豆、えんどう豆、モロコシ類、ヒマワリ、トマト、ジャガイモ、トウガラシ、キク、カーネーション、ポプラ、ユーカリおよびパインが挙げられる。本発明の変形並びにその他の面および態様は当業者に明白であろう。本明細書中に引用される全ての文献は参考として組み込まれる。用語「含んで成る」とは、「包含する」または「有する」という意味であって「から成る」という意味ではないと解釈すべきである。既に指摘の通り、本発明はトマトCf-4遺伝子のクローニングおよび配列決定に基づいており、この実験操作について次の図面を参照しながら下記に更に詳しく説明する。図１は、Cf-9(Cf9)またはCf-4(Cf4)耐性遺伝子のいずれかを含むトマト（L ．e sculentum cv．Moneymaker）の近縁同質遺伝子系統（ＮＩＬ；near isogenic li ne）、Ｃ．フルバムに対する既知の耐性遺伝子を含まない系統(Cf0)、およびトマト染色体１の短いアームにもマッピングされているCf-1耐性遺伝子を含む別の系統（Cf1,L ．esculentum cv．Stirling Castle）から単離された、BglIIで消化したＤＮＡ断片のサザンブロットを示す。Cf-9遺伝子に相当する6.7 kbp の B gl IIバンド、並びにCf-4含有系統に特異的であり且つ明細書本文中に記載される３つの BglIIバンドの位置も示される。図２は、Cf-4／Cf-9トランス異型接合体検定交雑集団からの５つの病気感受性組換え体（V408，V512，V514，V516およびV517）の分析により同定された３クラスの組換え体を概略形で示す。Cf-4遺伝子座が上の行にCf-9遺伝子座が下の行に描写される。Cf-9遺伝子に隣接する２つのAFLPマーカー（Ｍ１とＭ２，Thomas他，1995）の位置が示される。それらのマーカーのうちの１つ（Ｍ２）はCf-4遺伝子座にも存在する。幾つかの病気感受性組換え体に存在する、Cf-9に対して遠位に位置する同義遺伝子ファミリー（multigene family）の別の２つのメンバー（図中、遺伝子ＡおよびＢとして示される）も示される。サザンハイブリダイゼーションとAFLP分析により推定された３クラスの各々における組換え区切り点は破線により表される。図３は、Cf-4／Cf-5コスミドライブラリーから単離された３つの重複コスミド（4/5-108，4/5-129および4/5-138）から推定されるCf-4遺伝子座の物理的地図を示す。各コスミドの物理的範囲が概略的に示され、そしてハイブリダイゼーションと配列分析によって決定された３つのCf-9相同配列の位置が黒のボックスにより表される。各遺伝子の転写極性は矢印により示される。Cf-4遺伝子の位置も示される。次の酵素についての制限酵素部位も示される：BglII，PstＩ，EcoRＩおよび XbaＩ。Cf-9の５′末端から誘導したプローブに対して高い相同性を示す３つの BglII断片（6.4 kbp，3.2 kbpおよび1.8 kbp）（図１参照）の位置が矢印により示される。Ｍ２は、初めCf-9遺伝子座において同定されCf-4遺伝子座にも存在するAFLPマーカーを表す。図４は、Ｃ．フルバムのAVR4のプロセシング後の成熟形をコードすると提唱された配列に融合したPR1aシグナルペプチド配列をコードする、ClaI／SalI ＤＮＡ断片の核酸（二本鎖形態）配列と推定アミノ酸配列を示す。翻訳開始コドンはヌクレオチド５のところで、翻訳終止コドンはヌクレオチド413 のところで始まる。アミノ酸１〜30はシグナルペプチド配列を表し、アミノ酸31〜136 は成熟AVR4ペプチドを表す。図５は、Cf-4のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。該配列の特徴は次のものを含む：ヌクレオチド201 のところの翻訳開始部位；ヌクレオチド2619で始まる翻訳終結；ヌクレオチド2835で始まる共通ポリアデニル化配列（AATAAA）；ヌクレオチド2641のところの３′非翻訳配列中のスプライス供与体配列；ヌクレオチド2755で終わるスプライス受容体配列；ヌクレオチド2955のところの推定上のポリアデニル化部位。図６は、一文字アミノ酸記号によるCf-4遺伝子の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。推定タンパク質配列は、806 アミノ酸の一次翻訳産物から構成され；シグナルペプチド配列アミノ酸１〜23；成熟ペプチドアミノ酸24〜806 である。図７は、Jones 他（1994）によりCf-9について記載されそして本文中で考察されるようなCf-4タンパク質の７つの提案される構造ドメインＡ〜Ｇを示す。Cf-9 に比較したCf-4中の欠失は、ドットにより表示される。２つのタンパク質を区別するアミノ酸の大部分はそれらの各々のＮ末端に位置しており、図中太ボールド字体で示されている。潜在的Ｎ−グリコシル化配列には下線が引かれている。図８は、Cf-4配列とCf-9配列の間の２つの主要配列相違領域を示す。（Ａ）ドメインＢのCf-9アミノ酸40〜79（上の行）とCf-4アミノ酸40〜69（下の行）との整列。（Ｂ）Cf-9アミノ酸285 〜426（ＬＲＲ 9〜14）とCf-4アミノ酸274 〜369 （ＬＲＲ 9〜12）との整列。図９は、本明細書中で報告するトランスジェンの発現に広く用いられる４つのバイナリーベクタープラスミドの構造を示す。ＬＢおよびＲＢは、各ベクター中のＴ−ＤＮＡの左端および右端に相当する。植物形質転換マーカー遺伝子はＬＢ末端に置かれ、そしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＰＴ）またはホスフィノトリシンに対する耐性を付与するストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）由来の遺伝子（ＢＡＲ）であった。形質転換マーカー遺伝子はカリフラワーモザイクウイルス35Ｓプロモーター（35Ｓ）かまたはＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）由来のノパリンシンターゼ遺伝子プロモーター（pnos）の調節下に置かれた。翻訳終結シグナルはＡ．ツメファシエンスのオクトピンシンターゼ遺伝子３′配列（ocs3' ）により提供された。SLJ7291，SLJ7292およびSLJ755A は全て、図面中に指摘される制限酵素部位を有するポリリンカー配列を含む。このポリリンカー配列は、Jo nes他（1992）により記載された変形pBluescriptプラスミドから得られた。全ての遺伝子の転写方向は矢印により示される。全操作はJones 他（1992）により記載された通りに実施した。SLJ10080は、ClaＩでの線状化、T4 DNAポリメラーゼ処理および自己連結によりポリリンカー配列中の ClaＩ部位を除去することによりバイナリーコスミドベクターpCLD04541 から誘導した。 SLJ4K1からの35Ｓ：uidAカセットをEcoRI ／BamHI 断片として生成プラスミドの中にクローニングした。一過性発現実験用にCf-4およびCf-9コード配列を ClaＩ／BamHI 断片としてクローニングしてuidA遺伝子と置き換えた（図10参照）。プラスミドSLJ755A およびpCLD04541並びにそれらの誘導体は、コスミドクローニングベクターとして使われるラムダファージ配列(cos)を含有する。図10は、一過性アッセイにおけるCf-9（pCf9/10080）およびCf-4（pCf4/10080 ）の発現用のバイナリーベクターを示す。各構成物の詳細については明細書本文を参照のこと。図11は、Ｃ．フルバム非病原性遺伝子Avr9またはAvr4のいずれかと組み合わせた、35Ｓプロモーター（35Ｓ）の支配下にCf-9またはCf-4遺伝子のいずれかを含む４つのバイナリー構成物を示す。非病原性遺伝子も35Ｓプロモーターの支配下にあり；転写終結配列はＡ．ツメファシエンス（A ．tumefaciens）オクトピンシンターゼ遺伝子３′非翻訳領域（ocs3' ）により提供された。各プラスミドの作製（詳細については明細書本文を参照のこと）に関係のある制限酵素部位だけが示されている。トマトCf-4遺伝子の位置クローニング (1) Cf-4マップ位置本発明者らは、トマトの古典的地図およびRFLP地図（Dickinson他，1993；Jon es 他，1993；Balint-Kurti他，1994；Thomas他，1995）上にＣ．フルバムに対する耐性を付与する数個の遺伝子をマッピングした。それらの研究は、Cf-4とCf -9 が、染色体１の短いアーム上の２つのRFLPマーカーCP46とTG236 により境界が定められた6 cM範囲内の類似位置にあることを証明した。Cf-4とCf-9は、それの近縁野性種であるL ．hirsutum およびL ．pimpinellifolium から培養されたトマト中に遺伝子移入されている（Jones 他，1993参照）。本発明者らの遺伝子分析は、それらの遺伝子が密接に連鎖しているか、もしかすると対立遺伝子かもしれないことを示唆する。本発明者らは、トウモロコシのトランスポゾン切断因子（ Jones 他，1994；PCT/GB/02812）を使ったトランスポゾン標識法によりCf-9を単離した。この結果、位置クローニングによりCf-4を単離することが可能になった。 (2) Cf-4遺伝子候補の同定 Cf-9，Cf-4またはＣ．フルバムに対する未知の耐性遺伝子を含むトマトのＮＩＬからＤＮＡを単離し、それを制限酵素 BglIIで消化した。Cf-9の５′末端を含むプローブpCf9XSを使ったサザンハイブリダイゼーション分析（Jo nes 他，1994）は、３系統の間に広範囲に渡るRFLPがあることを明らかにした（図１）。この結果は、それらの耐性遺伝子が異なる種から遺伝子移入されていることと、この遺伝子ファミリーの複数メンバーが同じ遺伝子移入染色体セグメント上に存在することから推測された。候補のCf-4遺伝子を同定するために、Cf4 NIL とCf9 NIL を交雑してCf-4／Cf -9 トランス異型接合体を作製した。次いで子孫をCf0と交雑してＦ₁検定交雑集団を得た。約7,500 の子孫に、Cf-4かCf-9のいずれかを含む植物に不和合性であるＣ．フルバム品種５を接種した。もしCf-4とCf-9が対立遺伝子であるなら、トランス異型接合性の親において遺伝子内組換えがたとえ低頻度でも起こり得ると我々は推論した。場合によっては、これは各遺伝子の耐性特異性を取り去るかもしれない。そのような組換え染色体を含む子孫は、病気感受性個体として本発明者らの分析により検出されるだろう。あるいは、もしCf-4とCf-9が対立遺伝子でなくて密接に連鎖しているだけなら、同じく低頻度で遺伝子間組換えが起こり、耐性遺伝子を両方とも含むかまたは両方とも含まない組換え体を生じるだろう。後者の組換え体のクラスは、減数分裂時の染色体の誤対合や不等交雑の結果としても生成することがある。本発明者らの分析では、Cf-4とCf-9を欠く子孫のみが同定された。7,500 の検定交雑子孫の中で５つのそのような病気感受性組換え体が検出された。それらの個体を自家受粉させそしてその子孫を再びＣ．フルバム品種５を使って試験して、それらがCf-4 とCf-9の両方を失っていることを確かめた。組換え染色体について同型接合である子孫も同定された。これは、その後のサザンハイブリダイゼーション分析を単純化するために行われ、Cf-9に対して2.5 cM 遠位に位置するRFLPマーカーCP46（Balint-K urti他，1994；Thomas他，1995）のCf9 対立遺伝子について同型接合である個体を同定することによって達成された。プローブとしてpCf9XSを使った５つの罹病性個体（V408，V512，V514，V516およびV517）からの BglII消化ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション分析は、予想通り、全てがCf-9遺伝子に相当する6.7 キロ塩基対(kbp)の BglIIバンド（Joh ns 他，1994）および該遺伝子の近位に位置する多数の他のバンドを欠いていることを確証した。この遺伝子ファミリーのうちの異なるメンバーを含んで成りそしてCf-9遺伝子に対して遠位に位置する２つの別の BglIIハンドは、ある組換え体では存在したが別のものには存在しなかった（図２）。Cf-4含有系統に存在する３つの BglIIバンド（6.4 kbp，3.2kbp および1.8 kbp、図１）も一貫して罹病性個体に欠けており、よってCf-4遺伝子の候補であった。この後者の結果は C f4×L.pennelliの交雑からのＦ₂植物の分析結果と一致する。TG236／CP46範囲で組み換わったＦ₂個体の特別クラスが、以前に記載された通り（Balint-Kurti他，1994；Thomas他，1995）葉材料のＰＣＲ分析により同定された。それらの結果は３つの BglII制限断片がCf-4と共に分離することを証明した。サザンハイブリダイゼーションとAFLP分析を使って、本発明者らは図２に示される３クラスの組換え体を区別することができた。それらの結果は、Cf-4とCf-9の両方を欠く組換え染色体を生じる染色体誤対合および不等交雑のモデルと一致したが、その証拠とはならない。 (3) Cf-9相同配列を含むバイナリーベクターコスミドクローンの単離染色体１上のCf-4遺伝子と染色体６上のCf-9遺伝子の両方を含む保存株から、両遺伝子を単離するためにライブラリーを使うことができるようにゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。該ライブラリーは、英国ノリッジのJohn Innes Centre のC．Dean 博士から入手したバイナリーコスミドクローニングベクターpCLD04541 中に作製した（Bent他，1994参照）。そのようなクローニングベクターの使用は、単離されるどんなクローンでも、クローン化遺伝子の機能について試験する目的で植物中に直接導入することができるために有利である。当業者に周知の技術を使って（Thomas他，1994）６週齢の温室栽培植物の葉から高分子量ＤＮＡを単離し、 MboＩ制限酵素で部分消化した。当業者に周知の技術を使って、部分消化生成物をショ糖勾配を用いてサイズ分画し、そしてサイズ範囲20〜25 kbpのＤＮＡをBam HIで消化したpCLD04541 ＤＮＡと連結せしめた。 Stratageneパッケージング抽出液を使って試験管内パッケージングした後、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）株SURE^TM（Stratagene）のテトラサイクリン感受性変異株の中に前記コスミドを導入した。 pCLD04541 上のテトラサイクリン耐性遺伝子を使って組換え体を選択した。プールあたり約1500個のクローンを含む144 のプールに前記ライブラリーを無作為に分配し、各プールから細胞を増殖させ、そして10mlの細胞のうち、９mlを大量プラスミドＤＮＡ抽出に使い、そして１mlを0.2 mlのグリセロールの添加後に凍結保存物の調製に使った。アルカリ溶解（BirnboimおよびDoly，1979）により該プールからプラスミドＤＮＡを単離し、そしてＤＮＡ試料を、Cf-9含有トマト系統からpCf9XS断片を増幅させるのに使用したプライマーＦ７とＦ10（Jones 他，1994）を用いたＰＣＲ分析にかけた。このライブラリーからのプール 108， 129 および138 はＦ７／Ｆ10ＰＣＲ生成物について陽性のプールであると同定された。各プールごとに、約 10,000コロニーを平板培養し、放射性標識pCf9XSを使ったコロニーハイブリダイゼーションにより探査した。各プールから単一の相同クローンを単離した。それらの技術は当業者に周知である。 4/5-108，4/5-129および4/5-138と命名した３つのコスミドクローンを、プローブとしてpCf9XSを使ったサザンブロットハイブリダイゼーションと制限酵素マッピングにより更に特徴づけた。３つのコスミドの物理的関係を図３に示す。この分析は、前に記載した結果と一致する、6.4，3.2および1.8 kbp のBgl II制限断片上に、pCf9XSとの高相同性を示す３つの領域があることを示した（図１および２）。これらの３つの領域を適当なコスミドクローンからPstＩ断片としてサブクローニングし、当業者に周知の技術を使って、Cf-9ゲノム配列を決定するのに以前に使われたオリゴヌクレオチドプライマー（Jones 他，1994）に加えて、３つの相同体の各々に特異的な新たなプライマーを使って、それらのＤＮＡ配列を決定した。それぞれコスミド4/5-108 と4/5-129 から誘導した PstＩクローンから、相同体ＩおよびIIのＤＮＡ配列を完全に決定した。相同体IIIを含むコスミド4/5-129 からの PstＩ断片のＤＮＡ配列分析は、このコスミドがこの遺伝子の完全コピーを含まないことを示唆した。物理的マッピングデータは、この配列がコスミド4/5-138 上ではより大きく先端が切り取られていることを示唆する（図３）。この説明は、Cf-4／Cf-5ｃＤＮＡライブラリーから単離された相同体II IのｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析により確かめられた。この分析は、コスミド4/5-129 上の相同体IIIのコピーがそれのＣ末端のところで74アミノ酸だけ切り取られていることを示した。相同体Ｉ（862アミノ酸）、相同体II（806 アミノ酸）および相同体III（855 アミノ酸）の推定アミノ酸配列は全て、Cf-9に対して高レベルの相同性（それぞれ86.5％、91.5％および86.5％が同一アミノ酸）を示す。 (4) 植物におけるCf-4遺伝子機能についての効率的アッセイの開発トランスジェニック植物中での推定上のクローン化Cf-4遺伝子の機能は、様々な方法で評価することができる。まず第一に、対応する非病原性遺伝子Avr4を含むＣ．フルバム品種を接種してその品種がトランスジェニック植物において不和合性応答を与えるかどうかを試験することにより；第二には、AVR4を含有する和合性相互作用から単離された細胞内液体を、トランスジェニック植物の葉に注入することにより；第三には、Cf-9／AVR9相互作用の研究において以前に記載されたように（Hammond-Kosack他，1995）組換えジャガイモウイルスＸの形でAVR4を伝達せしめることにより、評価することができる。 AVR4をコードするＣ．フルバム遺伝子のＤＮＡ配列、およびプロセシング後の成熟形ポリペプチドのアミノ酸配列は既に報告されている（Joosten 他，1994）。我々は、Ｃ．フルバム品種２，５からプライマーを使ってAvr4遺伝子を発表された配列にＰＣＲ増幅せしめ、提案された成熟ポリペプチドをコードする配列を、タバコPR1aタンパク質のＮ末端シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列に融合せしめた。これは、該遺伝子が発現されるトランスジェニック植物中の細胞内空間に向けたAVR4のターゲッティング（標的指向化）を促進するだろう。このキメラ遺伝子（SPAvr4）を、以前に記載された通り（Hammond-Kosack他，1995）Cl a I／SalI ＤＮＡ断片として（図４）ジャガイモウイルスＸのｃＤＮＡコピーの中に挿入して、 PVX：SPAvr4を作製した。この組換えウイルスの感染性転写物を試験管内転写により得た。全ての核酸操作は当業者に周知の標準技術を使って実施した。３週齢のトマト実生において組換えウイルスを試験するために対照実験をデザインした。ウイルス接種部位においてわずかな機械的損傷の印を示しただけのCf0 対照とは対照的に、Cf-4含有植物では接種後（d.p. i.）３日目に子葉が乾燥しているように見えそして最終的に落果した。Cf0 植物は、野性型ウイルスで観察される病徴、即ち退緑（クロロシス）モザイク病徴に匹敵する目に見えるウイルス感染の病徴を７〜10 d.p.i．に表した。４〜５ d.p .i．に、Cf-4含有植物では、おそらくCf-9含有植物においてAvr9を含むＰＶＸを使った同様な実験で以前に記載されているようなウイルスの全身普及のために（ Hammond-Kosack他，1995）、より若い葉に壊死病斑が観察された。他の特徴としては、葉柄および茎における壊死セクターが挙げられる。この壊死表現型が全身に広がるのが観察され、そして14 d.p.i．にはCf-4含有実生の大部分が枯死していた。Cf0 対照植物は枯れなかったが退緑と葉脈透化の病徴を示した。従って、この手法は植物におけるCf-4機能についての迅速且つ信頼できるアッセイを提供するので、潜在的にCf-4遺伝子を含む個体を同定するためにトランスジェニック植物に適用した。 (5) Cf-4遺伝子のゲノムコピーを含有するバイナリーベクターコスミドクローンの同定 Cf-4／Cf-5バイナリーベクターコスミドライブラリーから単離した３つのバイナリーベクターコスミドクローン（4/5-108，4/5-129および4/5-138）のうちどれかCf-4遺伝子を含むものがあるかどうかを調べるために、当業者に周知の方法を使ってトランスジェニックトマト（Lycopersicon esclentum）およびタバコ（Nicotiana tabacum cv Petite Havana）植物を作製した（Fillatti他，1987；Ho rsch他，1985）。 12のトマト形質転換体に PVX：SPAvr4を接種することによりCf-4活性が検出できるように、挿し木によりトランスジェニック植物を繁殖させた。コスミド 4/5 -108を含むトランスジェニックトマト植物は１つも（０／３）PVX：SPAvr4依存性の葉壊死を示さなかった。対比して、コスミド 4/5-129を含む８つの形質転換体のうちの６つと、コスミド 4/5-138を含む４つの形質転換体のうちの３つが、３〜４ d.p.i．に接種した葉において葉壊死を示した（表１）。この壊死はCf-4対照植物において前に観察されたように最終的には全身に広かった。壊死葉セクターを示すトランスジェニック植物は最終的に枯れた。１回目の形質転換実験から得られた多数のトランスジェニック植物の挿し木を、Ｃ．フルバム品種５の接種によりCf-4機能について更にアッセイした（表１）。それらの試験では、PVX：SPAvr4依存性壊死を示すトランスジェニック植物とクラドスポリウム・フルバム（Cladosporium fulvum）品種５に耐性のものとの間に、正の相関性が観察された（表１）。和合性の対照植物(Cf0)では病原体増殖が観察されたが、不和合性の対照植物(Cf2)では観察されなかった。幾つかのトランスジェニック植物の自家子孫を再びＣ．フルバム品種５で試験し、その形質が遺伝性であることを確かめた。これは事実であると証明され、大部分の場合、単座Ｔ−ＤＮＡ形質転換体と一致したほぼ３：１の比で耐性が分離した（表２）。品種４がAvr4ペプチドを発現しないことから（Joosten 他，1994）予想される通り、Ｃ．フルバム品種５に対するトランスジェニック子孫耐性は品種４に対する耐性を付与しなかった。相同体IIIはコスミド 4/5-108に完全に欠けており、そしてこの遺伝子の先端が切り取られたコピーのみが他の２つのコスミド上に存在する。従って、相同体 IIIはCf-4の候補でなさそうである。Cf-2の場合に起こるように（Dixon 他，199 6）、この遺伝子座上の複数の遺伝子がAVR4ペプチドの認識と病原体耐性を付与することはあり得る。しかしながら、後者の例（Cf-2）では２つの遺伝子がほとんど同一であり、ここに記載する３つのCf-9相同遺伝子の推定アミノ酸配列とは対照的である。相同体Ｉの完全コピーは３つのコスミドの全てに存在する（図３）。コスミド 4/5-108の物理的地図作成およびＰＣＲ決定は、このクローンにおいて相同体IIの先端が切り取られており、それのＣ末端からの54アミノ酸並びに３′ 非翻訳領域並びに関連の転写終結およびポリアデニル化配列を欠いていることを示した。それらのデータは明らかに、相同体IIがCf-4遺伝子と関係があるとする。PVX ：SPAvr4依存性葉壊死およびＣ．フルバム品種５に対する耐性は、相同体IIの完全コピーを含むバイナリーベクターにより形質転換されたトランスジェニック植物においてのみ明白である（表１）。pCf9XSプローブを使った多数の耐性一次形質転換体（4/5-129A，4/5-129B，4/5-129D，4/5-129G，4/5-129H，4/5-138Aおよび4/5-138B）のサザンハイブリダイゼーション分析は、それら全てが相同体IIに特徴的な3.2 kbp のBglII ＤＮＡ断片を含むことを示した。相同体IIが特異的にAVR4を認識することは、前記３つのコスミドを含むトランスジェニックタバコ（N ．tubacum）植物の分析の結果により更に実証される。PV X：SPAvr4を接種した時（表３）、コスミド 4/5-129を含む形質転換体の大部分（７／10）およびコスミド4/5-138 を含む形質転換体の大部分（４／５）が３〜４ d.p.i．にウイルス接種部位のところに、幾つかのウイルス耐性変種においてウイルス接種に応答して見られる病斑と外観上同じ、壊死病斑を示した。それらの個体では、壊死は局部病斑にとどまらずに最終的には合体し、そして７〜10 d .p.i．には葉壊死がウイルス感染の全領域に渡ってはっきり見られる。幾つかの形質転換体では、PVX：SPAvr4に対する反応がもっと急性であり、葉壊死セクターを３〜４ d.p.i.に観察することができる（表３）。それらの表現型は、コスミド 4/5-108 を含むトランスジェニックタバコ（０／５，表３参照）でもPVX：SPAvr4でチャレンジした非形質転換対照植物でも観察されなかった。 (6) 相同体IIによりコードされるタンパク質の分析相同体IIのＤＮＡ配列（配列番号１、以後Cf-4と呼称する）を図５に示す。この配列は、概念翻訳上では配列番号２（図６）により示されるような806 アミノ酸タンパク質をコードする、長い連続した転写解読枠を含む。３′隣接領域におけるCf-4とCf-9の間の核酸配列相同性は非常に高く、ｃＤＮＡ分析により決定されたCf-9転写産物（Jones 他，1994）の終止コドンとポリアデニル化部位の間ではそれらが全く同じである。 Cf-4転写産物から誘導したＰＣＲ増幅後のｃＤＮＡクローンの分析は、それがCf-9 と同じように３′非翻訳領域中に１つのイントロンを含むことを示す（図５）。 Cf-4アミノ酸配列とCf-9の863 アミノ酸配列との比較は、それらが高度に相同であること（91.5％同一、95.5％類似）を示した。Cf-9 の場合と同じように、Cf-4アミノ酸配列はJones 他（1994）により提唱されたような７つの推定構造ドメイン（図７）を有する。ドメインＡ（アミノ酸１〜23）はシグナルペプチド配列と一致する。ドメインＢ（アミノ酸24〜81）はCf-4の成熟Ｎ末端領域に相当する；この領域はCf-9に比較して10アミノ酸の欠失を含む。ドメインＣ（アミノ酸82〜702 ）は24アミノ酸ＬＲＲ配列の26の不完全コピーを含む。この領域は、Cf-9に比較して、ＬＲＲ 10 で始まりそしてＬＲＲ 12 で終わる２つの完全ＬＲＲに相当する46アミノ酸の欠失を含む（図７）。Cf-9とCf -4 の間のアミノ酸変異はタンパク質のＮ末端半分にも存在する（図７）。この領域はおそらく、同族の非病原性ペプチドとまたは適当な非病原性ペプチドに結合する別の因子と特異的に相互作用する各タンパク質中の領域を表すのだろう。この領域に対してＣ末端側の配列では、推定Cf-4とCf-9タンパク質は高度に相同である；Cf-4のアミノ酸455 〜806 とCf-9のアミノ酸512 〜863 （Jones 他， 1994）が同一である。ドメインＤ（アミノ酸703 〜730）は何も目立った特徴を持たない。ドメインＥ（アミノ酸731 〜748）は10個の負に帯電した残基を含み著しく酸性である。ドメインＦ（アミノ酸749 〜785）は非常に疎水性であり、膜貫通領域と一致する。ドメインＧ（アミノ酸786 〜806）は著しく塩基性であり、８個の正に帯電した残基とわずか２個の負に帯電した残基を有する。 Cf-4タンパク質は、Cf-9と同様に、細胞膜結合型の細胞質外タンパク質に予想される性質の多くを有する。 (7) AVR4ペプチドを発現するトマトトランスジェニック植物前の研究は（Hammond-Kosack他，1994）、AVR9を発現するトランスジェニック植物と交雑したCf-9含有植物の子孫が発育段階で調節される植物枯死を示すことを証明した。発芽する実生は、子葉に壊死が観察される発芽後（dpg）10日目までにそれらの野性型相応物と表現型上区別可能である。この壊死は進行性であり、15 dpgには実生が枯れる。本発明者らは、SP：AVR4カセット（図４）をClaI／BamHI 断片としてベクター SLJ4K1（Jones 他，1992）の中にクローニングして、安定な発現に備えて植物プロモーター（CaMV 35S）と転写終結（nos3' ）調節配列を提供した。このクローンをpAVR4/4K1 と命名した。35Ｓ： Avr4：nos3’カセットを BglII／HindIII断片として切り出し、 BglIIとHindIII で消化したバイナリー形質転換ベクターSLJ7291（図９）の中にクローニングして、プラスミドpAVR4/7291を作製した。トランスジェニック植物を作り、Cf4 系統との検定交雑によりAVR4発現についてスクリーニングした。検定交雑子孫を実生致死表現型についてスクリーニングした。６つの独立した形質転換体との交雑から、野性型実生と壊死実生に１：１分離する子孫を同定した（AVR4/7291J，AVR4/72910，AVR4/7291L，AVR4/7291N， AVR4/7291MおよびAVR4/7291G）。それらの子孫では、壊死の発現パターンがAVR9とCF-9を発現する植物において記載されたものと本質的に同様であった。 AVR4/7291G（雌性親）とCf-4を発現する一次形質転換体(4/5-129H)との別の交雑からの子孫では、単座半接合性植物間の交雑に予想される通り、子孫（野性型 35：壊死型10）の25％において実生致死が観察された。それらの実生を生育室の中で普通寒天中で発芽させると、壊死のパターンが上述の対照交雑とは異なっていた。最終的に壊死を示した実生はそれらの野性型同胞と比較して矯化し、壊死はより早期の発育段階で明白であった。更に、Cf-9とAVR を発現する植物では観察されない表現型である、根の部分に壊死セクターも観察された。4/5-129Hの子孫に PVX：SPAvr4を接種した実験では、Cf4 対照植物よりも早期に壊死が明白になった。この現象は、Ｔ−ＤＮＡ挿入の染色体位置の結果として増大された形質転換体 4/5-129H中のCf-4発現を反映するのかもしれない。この結果は、非光合成組織、例えば根において十分なレベルのCf-4が発現されるならは、AVR4の存在下で壊死が誘発され得ることを示唆する。従って、この結果は、広範囲の植物、例えば作物において、様々な組織の中で耐病性を工作するため、特に根系生息菌または線虫のような根病原体に対する耐性を作るために、二成分系（例えば WO 95/31564）を使用することを暗に示す。 (8) 相同体IIのみを含有するトマトトランスジェニック植物相同体IIがAVR4認識とＣ．フルバム品種５に対する耐性の原因であるという結論を更に調べるために、自身のプロモーターまたは植物中で高レベルの遺伝子発現を指令することができるプロモーター、即ちカリフラワーモザイクウイルス35 Ｓプロモーター（35Ｓ；Jones他，1992参照）の支配下の相同体IIを使って、トマトトランスジェニック植物を作製した。それらの作製は当業者に周知のＤＮＡ操作と修飾を必要とした。コスミド 4/5-129からの6.0 kbp PstI断片（129P1、図３参照）を、ポリリンカー配列からのEcoRI およびHindaIII制限部位を欠く変形pUC119ベクターの中にクローニングして、クローンp129P6A を得た。このクローンにまずオリゴヌクレオチド突然変異誘発を行って、それぞれヌクレオチド308 と312 で始まる内部のXba IとEcoRI制限部位を除去し、クローンp129P6A-3 を作製した。そのような変更はCf-4タンパク質の推定アミノ酸組成を変えなかった。自分自身のプロモーターの下で相同体IIを発現させるために、p129P6A-3から6 .0 kbp xbaI／BamHI カセットを切り取り、xbaI／BamHI で消化したSLJ7291（図９）の中にクローニングして、クローンpCf4XB/7291 を作製した。植物中で高レベルのCf-4発現を与えるであろうベクターの作製のために、更にオリゴヌクレオチド突然変異誘発によりp129P6A-3 に遺伝子操作を行った。同じく、この変更は Cf-4タンパク質の推定アミノ酸組成を変えず、全ての変更は完成構成物のＤＮＡ分析により確認した。これらの変更としては次の追加の修飾が挙げられる：(i)構成物SLJ4K1（Jones 他，1992）中の35Ｓプロモーターへの融合を促進するための、ヌクレオチド197 （図５）で始まるClaI制限部位（ATCGAT）の導入；(ii)ヌクレオチド1766で始まる内部HindIII制限部位の削除；(iii)ヌクレオチド2096で始まる内部 BglII部位の削除；(iv)ヌクレオチド2685で始まる３′非翻訳領域中の ClaＩ制限部位の削除。変形相同体IIコード配列と３′非翻訳領域をClaI／BamHI 断片として切り出し、それをSLJ4K1（Jones 他，1992）中にクローニングしてプラスミドp4K1/Cf4を作製した。35Ｓ：Cf-4カセットを BglII／HindIII断片として切り取り、それをB am HI ／HindIIIで切断されたSLJ7291 中にクローニングしてプラスミドp35SCf4/ 7291を作製した。前記２つのバイナリーベクタークローンを使ってトマトトランスジェニック植物を作り、上述した通りに PVX：SPAvr4またはＣ．フルバム品種５の接種により試験した。 pCf4XB/7291 を含む幾つかの独立形質転換体が、 PVX：SPAvr4を接種した時に全身性壊死を示した（表４）。試験した３つのトランスジェニック植物のうちの２つが、Ｃ．フルバム品種５に対しても十分に耐性であった。p35SCf4/7291を含む８つのトランスジェニック植物が PVX：SPAvr4依存性壊死を示し、また幾つかの試験植物はＣ．フルバム品種５に対して十分な耐性を与えるように見えた（表４）。これらの結果は、相同体IIがAVR4認識におよびＣ．フルバム品種５に対する十分な耐性を付与するのに必要且つ十分であることを証明する。 (9) 相同体IIのみを含有するタバコトランスジェニック植物先行実験は、Cf-9とAVR4を発現するトマト子孫において観察される実生致死表現型がタバコでも観察され得ることを示した。コスミド 4/5-129からサブクローニングした２つの PstＩ断片（図３）のいずれかを含有するバイナリーベクタープラスミドを作製した。それらの断片を当業者に周知の技術を使ってプラスミドSLJ755A 中にクローニングし、プラスミドp129P1/755とp129P2/755 を作製した。バイナリーベクターSLJ755A は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A ．tumefaciens）nos 遺伝子プロモーターの支配下にストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）BAR 遺伝子を含有する。この遺伝子は、除草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与することにより、植物において形質転換マーカーとして用いられている（Jones 他，1992）。これらの構成物はタバコ形質転換実験に上手く使えたが、トマトには使えず、トマト形質転換には別のベクターを使った（上記参照）。トランスジェニックタバコ植物に PVX：SPAvr4を接種し、上述したバイナリーコスミドベクター形質転換実験において観察されたような壊死病斑またはセクターの出現をモニタリングすることにより、Cf-4活性について試験した。p129P2/7 55A を含む７つのトランスジェニック植物のうち特徴的な壊死病斑やセクターを示したものはなく、これに対してp129P1/755A を含む13のトランスジェニック植物のうちの10個がそのような表現型を示した（表５）。この結果は、相同体IIがCf-4 機能を付与するという前の観察結果と再び一致する。 pAVR4/7291（上記参照）を含むタバコトランスジェニック植物も作製した。Cf -4 を発現するp129P1/755A を含む一次形質転換体（雌性親株として）をpAVR4/72 91トランスジェニック体と交雑して、Ｆ₁子孫における実生致死をモニタリングすることにより、AVR4を発現する個体を同定した。AVR4を発現する数個のトランスジェニック体が同定された（AVR4/7291 I，AVR4/7291 KおよびAVR4/7291 J）。検定交雑した全てのＦ₁子孫（表５）において、両方のトランスジェニック体が致死に必要であるならば単一Ｔ−ＤＮＡ遺伝子座半接合性両親の子孫について予測される通り、実生の25％において致死が観察された。実生致死の発育段階での発現の変化は、少なくとも巨視的レベルでは、様々な交雑の子孫において全く観察されなかった。しかしながら、Cf-4／AVR4相互作用で観察される表現型は、 Cf-9／AVR9相互作用で観察される表現型とは異なっている。具体的には、タバコ実生致死は実生発育の早期段階で観察される。（普通寒天上への）播種後７日目に、野性型同胞はCf-4／AVR4を発現しているものと容易に区別することができる。Cf-4とAVR4を発現する実生の子葉は完全に伸長せず、検知できる量のクロロフィルを生産しない。実生の大部分において、種皮が１つの子葉に付着した状態かまたは２つの子葉を取り囲んだ状態のままである。後者の特徴は、Cf-9／AVR9を発現するタバコ実生では観察されなかった。播種後14日目、Cf-4／AVR4を発現する実生の子葉は完全に壊死しているように見える。それらの実生はCf-9／AVR9相互作用について報告されたような広い根系を発生することもできない。これらの結果は、Cf-9／AVR9相互作用について報告されたものより早い発育段階で実生致死が表れることを示唆する。 (10) Cf-4およびCf-9活性をモニタリングするための一過性発現アッセイ我々の研究室での実験は、CaMV 35Sプロモーターの調節下にあるバイナリーベクタープラスミド上の遺伝子が、Ａ．ツメファシエンス（A ．tumefaciens）菌の懸濁液を浸潤させることによって葉の中に導入されると、タバコ（Nicotiana t abacum ）葉細胞において一過性発現され得ることを証明した。AVR9を発現する安定なトランスジェニック体の35Ｓ：Cf-9浸潤葉パネルを使った実験で、浸潤領域において壊死が観察された。この表現型はAVR9を発現する植物に特異的であった。uidA(GUS)レポーター遺伝子のイントロン含有変異体を使った別の実験は、この現象が植物の核内遺伝子発現の結果であることを証明した。我々がタバコに使った手法は、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）の葉での一過性遺伝子発現をアッセイするために開発されたプロトコールから変形したものであった。バイナリーベクタープラスミドを、当業者に周知の技術である三親交雑によりＡ．ツメファシエンスGV3101/pMP90の中に移入した。抗生物質リファンピシリン（50μg/ml）とテトラサイクリン（１μg/ml）を含むＬブロス培地上で増殖させた単コロニーを採取し、抗生物質を含む５mlのＬブロス上で振盪培養器の中で28 ℃にて48時間増殖させた。この飽和培養物の１mlを、抗生物質、10 mM ２−（Ｎ −モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）pH 5.6およびアグロバクテリウム（Agrobacterium ）Vir 遺伝子を誘導するための20μMアセトシリンゴンを含有するＬブロス 100ml中に接種した。培養物を振盪培養器の中で28℃で16時間培養した。細菌細胞を低速遠心によりペレット化し、ムラシゲ＆スクーグ（ＭＳ）塩、２％w/v ショ糖、500 μM ＭＥＳ pH 5.6 および10μM アセトシリンゴンを含有する緩衝液中に再懸濁した。各培養物のＯＤ₆₀₀を測定し、ＯＤ₆₀₀＝0.5 になるように調整した。次いで培養物を振盪せずに22℃で３時間インキュベートした。タバコ（N ．tabacum）の成葉に、標的葉パネル中に数個の小さな切り目を作った後で、シリンジを使ってアグロバクテリウム懸濁液を浸潤させた。数パネルの注入後、浸潤させた葉をプラスチック袋で覆って乾燥を防いだ。72時間後、袋を取り外した。 35Ｓ：Cf-4バイナリーベクターを含むアグロバクテリウムを使って同様な実験を行い、構成的に（非調節的に）AVR4を発現するタバコ（N ．tabacum）の葉に浸潤させた。35Ｓ：Cf-4バイナリーベクターは次のようにして作製した。Ｅ．コリからのuidA(GUS)遺伝子をコードする1.8 kbp のClaI／BamHI 断片を、バイナリーベクターSLJ10080中でプラスミドp4K1/Cf4（項目(8)を参照のこと）由来のCf-4をコードする2.9 kbp ClaI／BamHI断片で置換した。Cf-9ＤＮＡのオリゴヌクレオチド突然変異誘発を含む同様な変更を上記と同様に実施して同様な構成物を作製した。得られたバイナリーベクタープラスミド pCf4/10080 とpC f9/10080をＡ．ツメファシエンス中に移入した。一過性発現アッセイにおいて、 pCf4/10080 もしくはpCf9/10080を含有するアグロバクテリウム懸濁液またはバイナリーベクターを含まない対照はいずれも、非形質転換タバコにおいて目に見える壊死を全く誘導しなかった。pCf9/10080 を浸潤させた葉パネルのみが、AVR9を発現するタバコにおいて浸潤後５〜６日目に壊死応答を誘導した。トランスジェニック植物AVR4/7291 K（項目(9)を参照のこと）では、pCf4/10080 を感染させた葉パネルのみが、浸潤後５〜６日目に目に見える壊死を誘導した。従って、このアッセイは、別の種においてCf-9とCf-4遺伝子機能の両方を検定するためおよび変異Cf遺伝子を発現する安定なトランスジェニック植物を作製する必要なしに特定の変異の影響を調べるための、迅速で且つ信頼できる方法を提供する。本発明者らはまた、一過性アッセイにおいて、35Ｓ：Cf-4または35Ｓ：Cf-9遺伝子構成物と対応する35Ｓ：Avr 遺伝子構成物との両方を担持しているベクターが、浸潤させた葉において目に見える壊死を引き起こし得ると推論した。もしそうなら、該アッセイは、耐性遺伝子かまたは非病原性遺伝子成分のいずれかを発現するトランスジェニック植物を作製する必要なしに、Cf-4およびCf-9が機能することのできる種の範囲を決定するための方法を提供することができる。これは、別の作物種において耐性を付与するためのCf遺伝子／非病原性遺伝子二成分系（WO 95/31564）の利用に重要な含みを持つだろう。耐性遺伝子と非病原性遺伝子の両方を含むバイナリーベクタープラスミドを次のようにして作製した。35Ｓ：Cf-4および35Ｓ：Cf-9カセットをpCf4/10080およびpCf9/10080から次のように切除した：(i)Apa Ｉで消化しそしてT4 DNAポリメラーゼ処理してＤＮＡ断片を平滑末端にし；(ii)PstＩで消化して35Ｓ：Cf-4および35Ｓ：Cf-9カセットを遊離させ；(iii)ベクター SLJ456（Jones他，1992）を ClaＩで直鎖状にし、T4 DNAポリメラーゼで処理して該ＤＮＡを平滑末端にし、次いで PstＩで消化して2.1 kbp のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）レポーター遺伝子断片を遊離させ；(iv)4.3 kbpの35Ｓ：Cf-4および4.5 kbp の35Ｓ：Cf-9 ApaＩ（T4）／PstＩ断片を、ClaＩ（T4）／PstＩで処理した SLJ456の中にクローニングして、プラスミドp4/456およびp9/456を作製した。これらの技術は全て当業者に周知である。非病原性遺伝子構成物は次のようにして作製した。クローンpAVR4/4K1（項目(9)を参照のこと）をEcoRI とBamHI で消化して35Ｓ：AVR4カセットを切除した。精製した断片を、SLJ6B1（Jones 他，1992）からの約3.9 kbp のEcoRI ／BamHI 断片と連結せしめ、35Ｓ、AVR4およびＡ．ツメファシエンス（A ．tumefaciens）オクトピンシンターゼ遺伝子の転写ターミネーター（ocs3' ）を含有するプラスミドpAVR4/6B1 を作製した。クローンSLJ6071（Ham mond-Kosack他，1994）からも同様な方法で35Ｓ：AVR0：ocs3' 構成物を作製し、プラスミドpAVR9/6B1 を得た。プラスミド pAVR4/6B1と pAVR9/6B1をHindIII で直鎖状にし、T4 DNAポリメラーゼで処理してＤＮＡ断片を平滑末端にした。35Ｓ：AVR4：ocs3' および35Ｓ：AVR9：oc s3 ' カセットを BglIIでの処理により単離した。精製した各カセットをBamHI ／Hpa Ｉで処理したp4/456およびp9/456とそれぞれ連結せしめ、AVR4またはAVR9のいすれかと組み合わせて各耐性遺伝子（Cf-4またはCf-9）の機能をアッセイすることができる４種類のプラスミドを作製した。タバコ（Nicotiana benthamiana ）植物の単葉上の４つの葉パネルに、図11に示す４種のプラスミドの各々を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium ）を浸潤させた。ベクターp4/456/AVR4 を注射したパネルにおいて浸潤後５日目に葉壊死が観察された。 p4/456/AVR9 を注射したパネルにおいては全く壊死が観察されなかった。これは、後者の結果が同一細胞中でのCf-4とAVR4の同時発現のためであることを示す。７日後、壊死した葉を取り、密封したポリエチレン袋の中に室温で保存した。最終的に壊死はp9/456/Avr9 を注射した葉パネルで浸潤後12日目に観察されたが、p9/456/Avr4 を注射した葉パネルでは観察されなかった。これらの実験は、同族の非病原性決定基が同時発現される時に、別の種を使った一過性発現アッセイにおいてCf遺伝子の壊死誘発活性を検出できることを証明する。Cf-4/AVR4 相互作用により誘発される壊死は、Cf-9/AVR9 相互作用により誘発されるものよりもかなり早く出現した。各構成物中のプロモーター、翻訳および転写調節配列は全て同じであるので、この現象はそれらの対応する非病原性遺伝子産物に対するCf-4とCf-9の相対親和力の差を反映するのかもしれない。この説は、Cf-4とAVR4を発現するトランスジェニックタバコの方がCf-9とAVR9を発現するものに比べて早期に実生致死表現型を出現することと一致する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年６月６日【補正内容】９．前記ポリペプチドの発現のための調節配列を更に含んで成る、請求項８に記載の核酸。 10．トランスジェニック植物の生産における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸の利用。 11．請求項１〜９のいずれか一項に記載の外因性核酸を含んで成る宿主細胞。 12．微生物細胞である、請求項11に記載の宿主細胞。 13．植物細胞である、請求項11に記載の宿主細胞。 14．請求項13に記載の細胞を含んで成る植物またはそれの任意部分。 15．請求項14に記載の植物の種子、自殖もしくは雑種子孫または後代、派生物もしくは抽出物、あるいはそれの任意部分。 16．請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸を宿主細胞中に導入することを含んで成る方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ０１Ｎ 65/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バリント−コーティ，ピータージョンアメリカ合衆国，メリーランド 20892, ベゼスダ，ルーム１−22，ビルディング６，ラボラトリーオブセルラーディベロプメンタルバイオロジー，ナショナルインスティテュートオブダイアベテスアンドディジェスティブアンドキッドニーディズィーズ，ナショナルインスティテュートオブヘルス (72)発明者ジョーンズ，デビットアレンイギリス国，ノリッジエヌアール４６ピーディー，イートン，グリーンウェイズ 139 (72)発明者ジョーンズ，ジョナサンダラスジョージイギリス国，ノーフォークエヌアール４６エスジー，ノリッジ，ウェイバリーロード 19

Claims

【特許請求の範囲】１．植物中での発現が植物の防御反応の活性化を引き起こすことができる病原体耐性遺伝子をコードする核酸単離物であって、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸単離物。２．前記活性化が病原体または対応するエリシター分子と植物との接触による、請求項１に記載の核酸。３．前記ヌクレオチド配列が配列番号１に示されるコード配列を含んで成る、請求項１に記載の核酸。４．前記ヌクレオチド配列が、１もしくは複数のヌクレオチドの付加、挿入、欠失または置換による、配列番号１に示されるコード配列の対立遺伝子、誘導体または変異体を含んで成る、請求項１に記載の核酸。５．植物中での発現が植物の防御反応の活性化を引き起こすことができる病原体耐性遺伝子をコードする核酸であって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成り、前記ポリペプチドが１もしくは複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換による、配列番号２に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子、誘導体または変異体を含んで成るアミノ酸配列を含んで成り、ただし、コードされるポリペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有することを前提とする核酸単離物。６．植物中での発現が植物の防御反応の活性化を引き起こすことができる病原体耐性遺伝子をコードする核酸であって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成り、前記ポリペプチドが１もしくは複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換による、配列番号２に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子、誘導体または変異体を含んで成るアミノ酸配列を含んで成り、ただし、前記核酸の発現が植物とAvr4エリシター分子との接触によって防御反応の活性化を引き起こすことができることを前提とする核酸。７．前記活性化が病原体または対応するエリシター分子と植物との接触による、請求項５または６に記載の核酸。８．請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸を含んで成るベクターである核酸。９．前記ポリペプチドの発現のための調節配列を更に含んで成る、請求項８に記載の核酸。 10．トランスジェニック植物の生産における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸の利用。 11．請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸を含んで成る宿主細胞。 12．微生物細胞である、請求項11に記載の宿主細胞。 13．植物細胞である、請求項11に記載の宿主細胞。 14．請求項13に記載の細胞を含んで成る植物またはそれの任意部分。 15．請求項14に記載の植物の種子、自殖もしくは雑種子孫または後代、派生物もしくは抽出物、あるいはそれの任意部分。 16．請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸を宿主細胞中に導入することを含んで成る方法。 17．前記宿主細胞が植物細胞または微生物細胞である、請求項16に記載の方法。 18．植物に病原体耐性を付与する方法であって、前記植物のまたはそれの祖先の細胞への前記核酸の導入の初段階に続く、前記植物の細胞内での請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸からの発現を含んで成る方法。 19．前記核酸が配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする、請求項18に記載の方法。