CN108517322B

CN108517322B - 一种掌叶半夏胰蛋白酶抑制剂基因、其编码的蛋白及抗虫应用

Info

Publication number: CN108517322B
Application number: CN201810370845.8A
Authority: CN
Inventors: 董文琦; 吴志明; 高俊平; 田哲娟; 蒲娜娜; 党红凯; 李亚栋
Original assignee: Hebei academy of agriculture and forestry sciences
Current assignee: Hebei academy of agriculture and forestry sciences
Priority date: 2018-04-24
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2038-04-24
Also published as: CN108517322A

Abstract

本发明公开了一种掌叶半夏胰蛋白酶抑制剂基因、其编码的蛋白及抗虫应用。基因的核苷酸序列表如SEQ ID NO：1所示。在培育耐抗虫转基因植物时，首先构建含有SEQ ID NO：1所示基因的重组表达载体，然后利用所得重组表达载体构建转化体，再利用所得转化体转化目的植物，筛选阳性植株，经过三代筛选得到纯合的与正常植物相比具有抗虫性的转基因植物。发明人通过大量科学研究证明本发明的基因对植物的抗虫特性具有明显的提升作用，证明其与植物的抗虫性具有紧密联系，基于此并利用现有基因工程方法得到了具有高抗虫性的转基因植物，对减少农药防治蚜虫、提高作物种植效率和种植产量具有重大的实际意义。

Description

一种掌叶半夏胰蛋白酶抑制剂基因、其编码的蛋白及抗虫应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种与掌叶半夏蛋白酶抑制剂基因的制备、编码的蛋白及其在抗虫相关中的应用。

背景技术

蚜虫是繁殖最快的昆虫，在地球上危害作物广泛，且因发展出了多种自我保护的防御方式很难防治，有的种类能够分泌植物激素，使得植物形成瘿瘤巢；有的分泌一层蜡质覆盖于体表令药物难于渗入；有的释放强烈芥末油气味吓跑天敌。蚜虫还是农业上很多病害的传播媒体,棉蚜分泌物是人类呼吸道重要过敏源，严重破坏城乡生活环境。掌叶半夏（Pinellia pedatisecta）是一种具天然抗虫特性的中草药。化学成分主要包括生物碱类及脂肪酸类和凝集素类、蛋白质等，总蛋白成分对麦长管蚜、禾缢管蚜、棉蚜和桃蚜等刺吸口器害虫有致死活性。在农作物上利用这一特性采用生物技术的方法改良提高其对蚜虫抗性。国内外研究现状与发展动态综述如下。

⑴ 目前克隆的抗蚜基因少。抗蚜资源多存在于野生种或近源种中，在3500个大豆种质中仅筛选到11个抗源；在1200个莴苣种质中筛选到2个抗源；4万个小麦资源中，仅300个表现抗性。植物对昆虫的抗性一般可分为3种类型, 即驱避性、抗生性和耐害性，其中抗性作用最明显，包括多基因控制和单显（隐）基因控制，如小麦对麦双尾蚜（Diuraphis noxia Mordvilko)的抗性、大豆对大豆蚜（Aphis glycines Matsumura）的抗性是单显基因控制；但在小麦、大麦中也发现了用于对豌豆蚜（Acythosiphon pisum Harris）、玉米蚜（Rhopalosiphum maidisFitch）的隐性抗蚜基因，数量性状控制的抗性更多。理论上只有单显基因控制的抗性有利于通过基因克隆和转化应用于其他物种上，更多的资源适用于本作物的远源杂交或常规育种。随着植物基因组学和功能基因组学的发展,一些抗蚜基因被克隆出来，如：野生番茄Mi-1基因可抗大戟长管蚜（Macrosiphum euphorbiae），另一个Vat基因可抗甜瓜棉蚜（Aphis gossypiiGlover），这类抗蚜基因一般与植物超敏反应有关，即对应植物能识别被蚜虫入侵的信号，以合成酚类物质、在细胞壁上沉积胼胝质、木质素等方式对抗蚜虫。虽已有抗蚜基因被克隆，但因为蚜虫的种类很多，一种基因可抗的蚜虫种类过少，远不能满足作物抗虫的需要。

⑵ 掌叶半夏抗蚜资源的优势。掌叶半夏是一种天然高抗蚜、无特殊味道的中草药，从90年代起人们开始分离半夏的抗虫活性物质，开始认为主要作用是由植物凝集素形成的，先后从掌叶半夏中克隆出了PPA-1、PTA-1等多个基因，在抗蚜虫方面具有一定的意应用价值。此外，2010年范汉东等人从半夏块茎总蛋白鉴定出一种新的抗蚜活性物质，即植物胰蛋白酶抑制剂（Pinellia peatisecta trypsin inhibitor，以下称PPTI蛋白或PPTI基因）类型的抗蚜虫蛋白：当其浓度达到0.5%时，5天后蚜虫的校正死亡率达到100%。更重要的是经SDS-PAGE、反相高效液相色谱测算该物质为不含糖的纯蛋白，质谱分析显示其相对分子量为20596.09。PPTI蛋白与其它种类抗虫活性蛋白相比具有以下优点：首先，它是纯蛋白质作用的结果，相较于依赖与糖结合的凝聚素家族，基因更容易构建转化载体，应用植物范围广；其次，蛋白酶抑制剂一般具有更广谱的抗虫性，因此推测PPTI对多种蚜虫会有抗性；第三，昆虫不易产生对蛋白抑制剂的耐受性。我们进一步研究发现在掌叶半夏叶片部位可由机械损伤和病虫侵入诱导高浓度表达此类蛋白。

⑶ 蛋白酶抑制剂的抗虫及其特性。以往学者对此已有很多研究，如：达克东等、杜国强等系统研究了用豇豆CpTI基因转化苹果，60个转化株系中有2个对棉铃虫的抗性达到100%；王浩华等研究了虫害诱导杨树胰蛋白酶KTI基因过量表达情况，明确了杨树KTI基因家族的功能多样性及其抗病抗虫作用。徐平丽等从小麦中克隆到一个BBI型蛋白酶抑制剂TaUES基因，并证明其参与了盐和干旱胁迫应答。在植物中目前已经发现有三大类蛋白酶抑制剂: 丝氨酸、琉基和金属蛋白酶抑制剂，本发明申请的PPTI蛋白属于第一类及丝氨酸蛋白酶抑制剂，丝氨酸蛋白酶抑制剂也已至少经发现有6个家族，但只有部分成员具有较强抗性功能，除了以上几个以外，还有弧豆、马铃薯的蛋白酶抑制剂等，但已发现的蛋白酶抑制剂对抗逆境种类和作用效果差异千差万别，现有毒性的蛋白酶抑制剂基因搭配组成型启动子的转基因植物，其蛋白酶抑制剂表达量仍然较低，一般达不到蚜虫的致死剂量。

综上，抗蚜基础研究从国内外研究现状来看，存在问题包括：一是，作物对蚜虫的抗性基因研究还很少，可用广谱的单抗生性基因很少；二是，广谱的植物凝集素因大多含有糖链，而用基因工程的方法很难表达正确的糖链；三是，现有蛋白酶抑制剂基因搭配组成型启动子的转基因植物，一般达不到致死剂量，开发有效的无公害防治蚜虫的蛋白酶抑制剂基因具有十分重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中的不足，提供一种掌叶半夏胰蛋白酶抑制剂基因、其编码的蛋白及抗虫应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种与植物抗虫性相关的基因，其核苷酸序列表如SEQ ID NO：1所示。

本发明还包括含有上述基因的重组表达载体。

本发明还包括含有上述基因的核基因组转化体。

本发明还包括上述基因的扩增引物对。

本发明还包括上述述基因编码的蛋白。

本发明还包括上述上述基因在培育耐抗虫转基因植物中的应用。首先构建含有SEQ ID NO：1所示基因的重组表达载体，然后利用所得重组表达载体构建转化体，再利用所得转化体转化目的植物，筛选阳性植株，经过三代筛选得到纯合的与正常植物相比具有抗虫性的转基因植物。所述目的植物为烟草。所述抗虫性主要是指针对同翅目昆虫的抗性。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：发明人通过大量科学研究证明本发明的基因对植物的抗虫特性具有明显的提升作用，证明其与植物的抗虫性具有紧密联系，基于此，利用现有基因工程方法得到了具有高抗虫性的转基因植物，对减少农药防治蚜虫、提高作物种植效率和种植产量具有重大的实际意义。本发明详细的有益效果分述如下。

⑴、通过3端RACE和5端DNA步移技术获得了一个全长的掌叶半夏胰蛋白酶抑制因子PPTI基因序列。PPTI基因全长642 bp，编码214个氨基酸，分子量为23 kD，pI 值为5.13；信号肽由N端19个氨基酸残基组成，具有STI（大豆蛋白酶抑制剂）结构域，为一种的胰蛋白酶抑制因子。蛋白跨膜域预测结果：inside线与outside线始终不曾交叉，因此认为该蛋白不具有跨膜域。蛋白亲疏水性在线分析：肽链主体部分大多分布于疏水区，只有少部分分布在亲水区，该蛋白属于脂溶性蛋白。

⑵、对该基因进行转化烟草的功能验证。不同的转基因植株抗虫性差异很大，从接虫后第15天结果来看，10种转基因烟草对烟蚜的种群抑制力由大到小为7、1、3、5、9、8、2、6、4、10；其中7号和1号对烟蚜的种群抑制率最高分别达到了100%和92.02%，3号植株的抑制率也较高为78.85%，5号的抑制率也分别为58.84%，其余的转基因植株并不表现抗性，这可能与转基因沉默导致转基因不表达引起的。尤其是7号转基因植株在接种7天后烟蚜全部死亡，表现了致死效应，说明我们分离克隆的基因是一个对蚜虫具有良好抗性的基因。

⑶、植物胰蛋白酶抑制剂与其它种类抗虫活性蛋白相比具有以下优点：首先，它是纯蛋白质作用的结果，相较于依赖与糖结合的凝聚素家族，克隆出的基因更容易构建转化载体，也就是容易应用；其次，蛋白酶抑制剂一般具有更广谱的抗虫性；第三，昆虫不易产生对蛋白抑制剂的耐受性，进一步研究发现在掌叶半夏叶片部位可由机械损伤和病虫侵入诱导高浓度表达此类蛋白。

综上可见，我们利用自身研究优势，分离克隆掌叶半夏蛋白酶抑制因子（Pinelliapeatisecta trypsin inhibitor，以下称PPTI），进行抗蚜虫功能分析和利用途径研究；并与植物蚜虫防治的紧迫性相结合，创制新材料和新方法，研究蛋白酶抑因子的生理遗传过程，该方法对农业生产和环境改善具有重要的理论和现实意义。

附图说明

图1、掌叶半夏cDNA文库克隆大小的测定。

图2、PPTI 基因cDNA3′末端扩增。

图3、第一次染色体步移电泳图：M:1Kb Plus DNA ladder 1B-4B:实验组 5B:阴性对照 6B-8B:为阳性对照。

图4、第二次染色体步移电泳图：M:1Kb Plus DNA ladder 1B-4B:实验组 5B:阴性对照 6B-8B:为阳性对照。

图5、 PPTI基因的PCR扩增：从左至右依次为：Marker DM2000；2-3：PPTI扩增片段；4：阴性对照水。

图6、真核表达产物生物信息学分析：编码214个氨基酸，预测分子量为23kD，pI值为5.13(图6a)；信号肽由N端19个氨基酸残基组成(图6b)，具有STI(大豆蛋白酶抑制剂) 结构域(图6c)；蛋白跨膜域预测结果如图6d示，inside线与outside线始终不曾交叉，因此认为该蛋白不具有跨膜域；蛋白亲疏水性在线分析如图6e示，肽链主体部分大多分布于疏水区，只有少部分分布在亲水区，推测该蛋白属于脂溶性蛋白。

图7、转PPTI基因烟草接种蚜虫试验：左为转基因烟草，右为对照。

图8、不同的转基因烟草对蚜虫虫口密度增长的抑制作用。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、通过cDNA文库测序查找蛋白酶抑制剂的序列信息。

掌叶半夏的块茎来自河北省农林科学院经济作物所生物技术中心。Taq DNA 聚合酶、反转录酶（M-MLV）、连接酶、引物合成、Oligo d(T)、染色体步移试剂盒（ GenomeWalking Kit）等均为宝生物工程（大连）有限公司出品，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒由天根生化科技（北京）有限公司提供。先用CTAB-土皂法构建了掌叶半夏的块茎和叶片的全长cDNA文库克隆插入片段大部分大小在500至3000 bp之间（图1）。

随机挑取6000个克隆测序，以M13为测序引物，进行测序，分析测序的数据，通过美国国际基因库上的blast软件在线分析序列，对序列进行同源性比对分析，侧重查找具有蛋白酶抑制剂的cDNA序列信息。根据获得的信息设计基因特异性引物，以dT18为下游引物进行RT-PCR扩增。利用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒扩增PPTI基因cDNA′末端全长（图2）。

表1.PPTI的3RACE和染色体步移引物

引物名称	序列	说明
			PPTIF1	5' CTGGTGTCCTGCAGTAGTAA 3'（SEQ ID NO：4）	3′ RACE外围引物
PPTIF2	5' TCTAGCGTTTGAGTTCACCC 3'（SEQ ID NO：5）	3′ RACE内围引物
			PPTIGSP1	5' GTTTGTGAAGGTGAAGGAAG 3'（SEQ ID NO：6）	步移外围引物
PPTIGSP2	5' GAGGATGCTGCTTCGTCGTC 3'（SEQ ID NO：7）	步移内围引物
			PPTI- F	5'-TCAACCATGGAGTTTATCCTG- 3'（SEQ ID NO：8）	全长序列
PPTI-R	5'-ATC CCT TCC TTC ACC TTC AC-3'（SEQ ID NO：9）	全长序列

将目的片段纯化(按照TIANgel MiDi purification Kit操作步骤进行)并插入到pMD19-T载体，随机挑选3个克隆进行测序(由华大基因测定序列)。

实施例2、CTAB法提取掌叶半夏叶片基因组DNA。

(1)称取100mg 叶片，迅速放入液氮研磨呈粉末状，转入2mL离心管内，加入65℃预热的提取液1mL和2%(V/V)的β-巯基乙醇，65℃温浴30min，其间混匀2-3次。

(2)冷却至室温，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)混匀，静置10min，离心(室温,10000rpm,10min)。重复抽提一次。

(3)吸上清于新的2mL离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇混匀，-20℃静置15min，离心(室温,12000rpm,10min)，去除上清。

(4)用1mL70%的乙醇洗涤两次，室温下微干，用100μLTE缓冲液(PH8.0)溶解沉淀。

(5)加入10μL RNaseA，37℃温浴30min。

(6)加入等体积的氯仿:异戊醇(24：1)混匀，静置10min，离心(室温,12000rpm,10min)。重复抽提一次。

(7)加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，-20℃静置1h，离心(4℃,12000rpm,10min)弃上清液。

(8)用70%的乙醇洗涤两次，干燥后用100μL无菌水溶解沉淀，-80℃保存备用。

(9)取5μL进行1.0%普通琼脂糖凝胶电泳。

实施例3、利用cDNA已知序列设计引物进行DNA克隆。

根据PPTI基因cDNA已知序列设计基因特异性引物PPTIGSP1，利用TaKaRaGenomeWalker Universal Kit试剂盒扩增得到片段Promoter-1。将目的片段纯化(按照TIANgel MiDi purification Kit操作步骤进行)并插入到pMD19-T载体，随机挑选3个克隆进行测序(由华大基因测定序列)。根据Promoter-1设计基因特异性引物PPTIGSP2，利用TaKaRa GenomeWalker Universal Kit试剂盒扩增得到片段Promoter-2。将目的片段纯化(按照TIANgel MiDi purification Kit操作步骤进行)并插入到pMD19-T载体，随机挑选3个克隆进行测序(由华大基因测定序列) Promoter-1见图3，Promoter-2见图4。

根据PPTI基因的3末端序列和上游的序列，拼接成一个完整的基因序列，随后设计引物扩增全长的PPTI基因序列。以合成的cDNA第一链为模板和PPTI基因引物进行PCR。将目的片段纯化(按照TIANgen MiDi purification Kit操作步骤进行)并插入pMD19-T载体，随机挑选3个克隆进行测序(由上海生物工程测定序列)，见图5。通过分析发现一个具有蛋白酶抑制因子结构域的部分cDNA序列，如SEQ ID NO：2所示。该基因终止密码子下游3′端非编码区序列，如SEQ ID NO：3所示。

实施例4、3′RACE扩增PPTI基因cDNA末端序列

利用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒扩增PPTI基因cDNA′末端全长。

⑴、RT-PCR反应体系：

Total RNA 1μg 5.5μL

3′RACE adaptor 1μL

70℃变性10min，冰上冷却3min，加入下列反应试剂

5 x M-MLVBuffer 2μL

dNTP(10mM each) 1μL

RNase inhibitor 0.25μL

M-MLV(RNase H^-) 0.25μL

42℃延伸60min，合成cDNA第一链。

⑵、Outer PCR反应体系及Outer PCR反应条件：

cDNA第一链 2μL 94℃ 3min

PPTIF1(10μM) 2μL 94℃ 30s

3′RACE Outer Primer 2μL 54℃ 30s

1×cDNA Dilution Buffer II 8μL 72℃ 3min

10 x Buffer 5μL 72℃ 10min

Taq酶 1μL

H₂O至 50μL。

⑶、Inner PCR反应体系及Inner PCR反应条件：

Outer PCR 1μL 94℃ 3min

PPTIF2(10μM) 2μL 94℃ 30s（30个循环）

3′RACE Inner Primer 2μL 55℃ 30s（30个循环）

dNTPs(2.5mM each) 4μL 72℃ 1min（30个循环）

10 x Buffer 5μL 72℃ 10min

Taq酶 1μL

H₂O至 50μL

取10μL Inner PCR产物进行1.0%普通琼脂糖凝胶电泳。

⑷、连接反应体系：

Outer PCR产物回收片段 4.5μL

pMD19-T载体 0.5μL

Solution I 5μL

16℃连接12h。

实施例5、DraI、EcoRV、StuI、PvuII四种限制性内切酶消化基因组DNA。

酶切反应体系：

基因组DNA 80μL

限制性内切酶 8μL

10 x Buffer 10μL

H₂O至 100μL。

37℃酶切12h，每种酶切产物取5μL，进行1.0%普通琼脂糖凝胶电泳，检测酶切情况。

实施例6、纯化DNA片段。

(1)将各组酶切产物分别转入1.5mL离心管内，加无菌水至500μL。

(2)加入等体积的Tris饱和酚，混匀，离心(室温,12000rpm,10min)，吸取上层水相到新的1.5ml离心管中。

(3)加入等体积的氯仿，混匀，离心(室温,12000rpm,10min)，吸取上层水相到新的2ml离心管中。

(4)加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃静置1h，离心(4℃,12000rpm,10min)，弃上清液。

(5)用70%预冷的乙醇洗涤两次，干燥后用20μL无菌水溶解沉淀，取1μL进行电泳检测。

实施例7、5′RACE扩增PPTI基因片段.

⑴、纯化的基因组DNA片段与接头连接。连接反应体系及连接反应条件：

纯化的基因组DNA片段 4μL 16℃ 12h

GenomeWalker接头 1.9μL 70℃ 5min

T4连接酶 0.5μL

10 x Buffer 1.6μL。

反应结束后加无菌水至80μL，用作Primary PCR的模板。

⑵、Primary PCR：

PCR反应体系及PCR反应条件：

模板 2μL 94℃ 5min

PPTIGSP1 (25μM) 1μL 94℃ 25s（7个循环）

AP1 (25μM) 1μL 72℃ 3min（7个循环）

10 x Buffer 5μL 94℃ 25s（32个循环）

dNTPs(2.5mM each) 4μL 62℃ 3min（32个循环）

Taq酶 0.5μL 62℃ 7min

H₂O至 50μL。

将Primary PCR反应产物稀释20倍，用作Secondary PCR的模板。

⑶、Secondary PCR。PCR反应体系及反应条件：

模板 2μL 94℃ 5min

PPTIGSP2 (25μM) 1μL 94℃ 25s（5个循环）

AP2 (25μM) 1μL 72℃ 3min（5个循环）

10 x Buffer 5μL 94℃ 25s（35个循环）

dNTPs(2.5mM each) 4μL 67℃ 3min（35个循环）

Taq酶 0.5μL 67℃ 7min

H2O至 50μL。

PCR反应体系及PCR反应条件：

模板 2μL 94℃ 5min

2GSP2 (25μM) 1μL 94℃ 25s（5个循环）

AP2 (25μM) 1μL 72℃ 3min（5个循环）

10 x Buffer 5μL 94℃ 25s（35个循环）

dNTPs(2.5mM each) 4μL 57℃ 3min（35个循环）

Taq酶 0.5μL 57℃ 7min

H2O至 50μL。

取10μL Secondary PCR产物进行1.0%普通琼脂糖凝胶电泳。

连接反应体系：

Secondary PCR产物回收片段 4.5μL

pMD19-T载体 0.5μL

Solution I 5μL

16℃连接12h。

实施例8、PPTI基因全长克隆及生物信息学分析。

根据PPTI基因的3末端序列和上游的序列，拼接成一个完整的基因序列，随后设计引物扩增全长的PPTI基因序列。以合成的cDNA第一链为模板和PPTI基因引物进行PCR。将目的片段纯化(按照TIANgen MiDi purification Kit操作步骤进行)并插入pMD19-T载体，随机挑选3个克隆进行测序(由上海生物工程测定序列)。

PCR反应体系及反应条件：

cDNA第一链 1μL 94℃ 5min

PPTIF1(25μM) 1μL 94℃ 30s（35个循环）

PPTIR1(25μM) 1μL 54℃ 30s（35个循环）

10 x Buffer 2.5μL 72℃ 1min（35个循环）

dNTPs(2.5mM each) 2μL 72℃ 10min

Taq酶 0.5μL

H₂O至 25μL。

取10μLPCR产物进行1.0%普通琼脂糖凝胶电泳。

连接反应体系：

PPTI基因回收片段 4.5μL

pMD19-T载体 0.5μL

Solution I 5μL

16℃连接12h。

克隆序列分析表明，PPTI基因全长642bp(SEQ ID NO：1)，编码214个氨基酸(参见图6a)，预测分子量为23kD，pI值为5.13；信号肽由N端19个氨基酸残基组成(图6b)，具有STI(大豆蛋白酶抑制剂)结构域(图6c)，为一种的胰蛋白酶抑制因子。蛋白跨膜域预测结果如图6d 示：inside线与outside线始终不曾交叉，因此认为该蛋白不具有跨膜域。蛋白亲疏水性在线分析如图6e示：肽链主体部分大多分布于疏水区，只有少部分分布在亲水区，推测该蛋白属于脂溶性蛋白。

实施例10、基因片段转化大肠杆菌DH5α和阳性克隆检测-菌落PCR。

大肠杆菌DH5α的转化如下。

(1)从-80℃冰箱中取出1支感受态细胞(100μL)，冰上融化。

(2)取10μL连接产物加入刚融化的感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min。

(3)42℃热激30s，立即放于冰上2min。

(4)加入500μL LB液体培养基，37℃，200rpm培养1h。

(5)4000rpm室温离心2min，去除部分上清，将剩余的菌液混匀。

(6)用涂布棒将菌液涂于LB+Amp固体培养基上，37℃倒置过夜培养。

在过夜培养的固体培养基上挑取部分白色单菌落分别放入加有10μL超纯水的小Ep管中，旋涡震荡直至菌落溶解于水中，以此为PCR模板，进行扩增，扩增条件同前一步扩增条件，电泳检测。

实施例11、PPTI基因的功能在烟草上的验证。

构建成目的基因的植物表达载体 pCAMBIA1301-PPTI，用叶盘法转化烟草，转PPTI基因不同株系烟草均表现出对蚜虫的抑制能力，转基因烟草上的蚜虫随着天数的增加逐渐减少，在第15天时蚜虫数几乎为零。对蚜虫抑制率进行计算，发现在接种蚜虫第15天时转PI基因的烟草对蚜虫的平均抑制率为83.4%。与此同时，转相同基因的不同植株抗蚜能力存在一定差异，这可能是由于不同的转化植株中PPTI表达量不一样引起的，需要进一步研究转基因烟草的的PPTI蛋白的表达量与抗蚜虫水平的关系（图7）。本研究初步确定了PPTI 基因对蚜虫具有良好的抗性，这是首次在掌叶半夏中获得的一个抗蚜虫的蛋白酶抑制剂基因，为进一步利用该基因开展抗虫研究鉴定了基础。试验操作过程如下。

采用常规植物双元表达载体，优选植物双元表达载体pBI121(植物转基因中常用表达载体，在本发明中购自中国农业科学院作物研究所赵开军研究员)和菌株EHA105，利用克隆测序的PPTI基因序列，通过Xba I和Sma I双酶切后将PPTI基因亚克隆到pBI121的相应位点上，构建成35S：PPTI+GUS:NOS结构的植物表达载体pBI121-PPTI，转化到农杆菌菌株EHA105中。按照王关林等的方法采用叶盘法转化烟草获得抗卡那霉素（nptII）标记的转化再生植株(王关林等，2002)。

通过1%的琼脂糖电泳经Xba I和Sma I双酶切质粒的pBI121-PPTI，酶切产生两条片段，表明PPTI基因以正确的阅读框架插入到pBI121中。常规叶盘法转化烟草获得了抗抗卡那霉素（nptII）标记的转基因烟草植株。

A 转基因植株PCR检测剪取转基因植株和非转基因植株的幼嫩叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，在室温干燥后用适量无菌双重蒸馏水悬浮，-20℃保存。提取的DNA模板量调整为50ng/µL,取1µL做模板进行PCR扩增，94℃3 min；94℃ 30 S，57℃ 30 S，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10 min。PCR产物跑1%的琼脂糖电泳观察结果。结果表明获得了PPTI基因整合到烟草植物基因组的转基因植株。

B 转基因植株的半定量RT-PCR检测以烟草幼嫩叶片为试验材料，按照Promega公司的Trizol RNA提取试剂盒说明书对用PCR检测的阳性植株提取总RNA，进行半定量RT-PCR，验证转外源PPTI基因在RNA转录水平上是否表达。随机选用10个转基因单株进行检测，结果表明PPTI基因在mRNA水平上得到表达，但是不同的转基因植株在体内表达水平不一样。

C 转基因植株的抗蚜虫鉴定桃蚜(Myzus persicae)采自河北省农林科学院植保所温室内烟草上自然发生的种群，于温室内饲养稳定一段时间后，选取健康活泼、生理状态一致的无翅成蚜供试。将室内饲养的桃蚜分别接种到810叶龄的转基因烟草和非转基因烟草植株中层叶片上，随机选取10个转基因植株株系，每株系3株烟苗，每株苗接无翅成蚜20头，置于同一条件下（23～25℃）饲养，隔日调查记载各处理烟苗上蚜虫数量，直至15天。按照袁正强等的方法以转基因烟草对蚜虫的种群抑制率作为指标（袁正强等,2001），来评价各转基因烟草对蚜虫的毒力效果：种群抑制率（%）=（对照株活蚜数-处理区活蚜数）/对照株活蚜数×100。

鉴定结果表明，不同的转基因植株抗虫性差异很大，从接虫后第15天结果来看，10种转基因烟草对烟蚜的种群抑制力由大到小为7、1、3、5、9、8、2、6、4、10(图8)；其中7号和1号对烟蚜的种群抑制率最高分别达到了100%和92.02%，3号植株的抑制率也较高为78.85%，5号的抑制率也分别为58.84%，其余的转基因植株并不表现抗性，这可能与转基因沉默导致转基因不表达引起的。尤其是7号转基因植株在接种7天后烟蚜全部死亡，表现了致死效应，说明我们分离克隆的基因是一个对蚜虫具有良好抗性的基因。

上述实施例记载的描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110> 河北省农林科学院

<120> 一种与植物抗虫性相关的基因、其编码的蛋白及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 642

<212> DNA

<213> 烟草(nicotiana tabacum)

<400> 1

atggagttta tcctgctcct tgtgtcttcc ctcctcctca ccgcccgagc cgccgccgcc 60

gcctccaatc ccatcctcga caacgacggc aacgagctcc gacgtggcca actctactat 120

gcgatgtccg tgaagaggcc cggtggcggc ctgacgctgg cgccccccgc caacgcggcg 180

cggtgccctc tcaacgtggc ccaggcgccc ttcaacgact attccggccg cccgctggcc 240

ttcttcccgg agaacgccga cgacgacacc gtgcgagagg gaagtacact aaacatcatg 300

ttcccggagc cgacggagtg cgcccagtcc accgtgtgga ctctcgacag ggagaccggc 360

ctcgtgacca ccggcggaac cgcgtcgtcg gcggtcggcc cctactacag ccggttcgcc 420

atacgcaagg ccgaggatgc tgcttcgtcg tcccagcgcg atcgctacca gatccaggtt 480

tgcccctgca gctccggcgt gcggcggcct tcctgcagga tgggctgtct cggcagtctg 540

ggtttgagcg agggagagga gaacgtcatg ctcaacatca acaacgagcg ccctcacacc 600

gtcatgtttg tggaggtgaa ggaagggatc gctgccagca ta 642

<210> 2

<211> 560

<212> DNA

<213> 烟草(nicotiana tabacum)

<400> 2

tgcagctggc cattacggcc ggggccgacg acgacaccgt gcgagaggga agtacactaa 60

acatcatgtt cccggagccg acggagtgcg cccagtccac cgtgtggact ctcgacaggg 120

agaccggcct cgtgaccacc ggcggaaccg cgtcgtcggc ggtcggcccc tactacagcc 180

ggttcgccat acgcaaggcc gaggatgctg cttcgtcgtc ccagcgcgat cgctaccaga 240

tccaggtttg cccctgcagc tccggcgtgc ggcggccttc ctgcaggatg ggctgtctcg 300

gcagtctggg tttgagcgag ggagaggaga acgtcatgct caacatcaac aacgagcgcc 360

ctcacaccgt catgtttgtg aaggtgaagg aagggatcgc tgccagcata tagaggagcc 420

gttgatcgat cggccagtac ttgctagtcc catgttagta ctacgtacgt actttgtatc 480

gtccaccaaa taagctaggg ttcctataat agggaacgat cgagctgcca tggacagctc 540

ctctagcgtt tgagttcacc 560

<210> 3

<211> 270

<212> DNA

<213> 烟草(nicotiana tabacum)

<400> 3

tagaggagcc gttgatcgat cggccagtac ttgctagtcc catgttagta ctacgtacgt 60

actttgtatc gtccaccaaa taagctaggg ttcctataat agggaacgat cgagctgcca 120

tggacagctc ctctagcgtt tgagttcacc cagctggtgt cctgcagtag taactacagg 180

acatggtgtg ctgtgtagta gttaagcttg tcttctactt aagtataata agtggcgacg 240

tgcatggttc tctcgcaaaa aaaaaaaaaa 270

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

ctggtgtcct gcagtagtaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

tctagcgttt gagttcaccc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

gtttgtgaag gtgaaggaag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

gaggatgctg cttcgtcgtc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

tcaaccatgg agtttatcct g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

atcccttcct tcaccttcac 20

Claims

1.一种掌叶半夏胰蛋白酶抑制剂基因，其特征在于：其核苷酸序列表如SEQ ID NO：1所示。

2.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。

3.含有权利要求1所述基因的核转化体。

4.扩增权利要求1所述基因的引物对。

5.权利要求1所述基因编码的蛋白。

6.权利要求1所述的基因在培育耐抗虫转基因植物中的应用，所述抗虫是针对桃蚜。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：首先构建含有SEQ ID NO：1所示基因的重组表达载体，然后利用所得重组表达载体构建转化体，再利用所得转化体转化目的植物，筛选阳性植株，经过三代筛选得到纯合的与正常植物相比具有抗虫性的转基因植物。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述目的植物为烟草。