RU2119341C1

RU2119341C1 - Средство, ослабляющее течение болезни при нефротическом синдроме и симптомах гепатопатии, водорастворимый полисахарид, способ получения полисахарида

Info

Publication number: RU2119341C1
Application number: RU94026096A
Authority: RU
Inventors: Дзи Йе Го; Кадзихара Юн-ити; Кирихара Сей; Като Казуо; Абе Хироко
Original assignee: Джей-Си-Ар Фармасьютикалз Ко., Лтд.
Priority date: 1993-07-15
Filing date: 1994-07-14
Publication date: 1998-09-27
Also published as: CA2127934A1; EP0635519B1; AU6747094A; EP0635519A1; AU686161B2; FI943242L; RU94026096A; DE69413467D1; FI943242A0; US5547945A; DE69413467T2; KR960013374A; ATE171462T1

Abstract

Средство содержит полисахарид, выделенный экстракцией из Tanjcn водой или водным растворителем, имеющий в своем составе: (от общего количества сахаров) 40-80% D-галактуроновой кислоты и 10-30% нейтральных сахаров, в том числе от общего количества нейтральных сахаров: 20-55% галактозы и 30-60% арабинозы, рамнозы не более 15%, глюкозы не более 15%, маннозы не более 15%, полисахарид имеет молекулярный вес 150000-300000, при этом средство содержит указанный полисахарид в эффективном количестве, а также нейтральный наполнитель. Способ получения полисахарида путем экстрагирования, пропускания экстракта через пористую полимерную смолу, гельхроматографии. Средство безопасно и обладает большой эффективностью. 2 с. и 6 з.п.ф-лы, 4 ил, 8 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к безопасному терапевтическому средству для перорального и внутримышечного применения, которое можно назначать пациентам с диагнозом поражения почечными болезнями, в том числе, нефротическим синдромом, и пациентам с печеночными расстройствами, например, вирусным гепатитом или гепатитом, обусловленным действием лекарственного средства, тем самым, позволяя указанным пациентам посещать больницы в качестве амбулаторных больных, причем, особое внимание следует уделить тем фактам, что указанные почечные болезни в последнее время имеют тенденцию встречаться с большей частотой не только у старого, но также и у молодого поколения, и что считается, что нефротический синдром является стадией индуцирования хронической почечной недостаточности.

В качестве внутреннего терапевтического средства для липоидного нефроза или нефротического синдрома с минимальными изменениями применяли химически синтезированные стероиды или дипиридамол, лекарство, представляющее собой тромбоцитарный антиплазмин, которые, однако, требуют длительного применения и, при использовании молодыми людьми, вызывают значительные опасения из-за появления побочных эффектов, например лунообразного лица, менструальных расстройств, головокружения, головной боли, тошноты и рвоты, а также в серьезных случаях, инфекций, желудочно-кишечного кровотечения, метаболических расстройств, остеопороза, тромбоза, недостаточности надпочечников и психических расстройств.

Гепатиты, которые разделяются на вирусные и обусловленные действием лекарственного средства, существуют, в основном, в виде вирусного типа, и в качестве лекарственных средств против гепатитов для клинического использования применяются модификаторы биологической реакции (в дальнейшем для краткости называемые МБРы), например, интерфероны и интерлейкин 2, и Минофаген C, препарат глицирризина для внутривенных инъекций. Однако, как оказалось, МБРы вызывают побочные эффекты, например, лихорадку, и их применение сталкивается с трудностями при последовательном применении в течение длительного времени, поскольку глицерризин, являясь, по существу, противовоспалительным средством, требует лечения повышенного артериального давления и электролитов для длительного применения. Кроме того, Сайкосапонин, сапонин, Гомишин и т.д. известны, но никогда, тем не менее, не направлялись для клинического использования.

В качестве водорастворимых полисахаридов, содержащих поли-D-галактуроновую кислоту следующей формулы I

(в которой карбонильная группа (группы) может быть этерифицирована метильной) известны, например, пектиновые вещества, представляющие собой водорастворимые полисахариды, состоящие в основном, из поли-D-галактуроновой кислоты, получаемой экстрагированием апельсиновых корок водно-кислотным раствором, осуществлением деметилирования кислотой, щелочью или энзимом и затем осаждением при помощи добавления органического растворителя, например, спиртов. Водорастворимые пектиновые вещества делятся на пектин и пектиновую кислоту в зависимости от степени метильной этерификации карбонильных групп в поли-D-галактуроновой кислоте, при этом вещество, по существу не содержащее остатки метилового эфира, называют пектиновой кислотой.

Водорастворимые пектиновые вещества, в основном, используются в пищевой промышленности в качестве исходного сырья для желе и т.д., но едва ли они нашли применение в качестве лекарственного средства, за исключением того, что их применяют для покрытия слизистых оболочек.

Настоящее изобретение в одном аспекте использует экстракционный компонент Tanjin. Tanjin представляет собой лекарственное растение, которое традиционно использовали в Китае из-за его эффективности в качестве средства, улучшающего циркуляцию крови и уменьшающего нарушение циркуляции крови. Что касается Tanjin, в последнее время в Японии и за рубежом было опубликовано много сообщений о его фармакологической активности, например, сосудо-расширяющей активности (Hikoyoshi Ohura: Wakan Iyaku Gakkai-Shi (Journal of the Society of Japanese-chinese Drugs Association), 5: 227 - 237, 1988), гипотензивной активности (Nakayama Igakuin-ron, опубликованное фирмой Ishiyaku Shuppan Co., Tokyo, 257 - 258, 1980), активности ингибитора коагуляции крови (Koui Ra: Acta Pharmaceutica Sinica, 23 (11); 830 - 834, 1988), активности ингибитора внутриклеточного синтеза холестерина (Sun Xi-ming; Chu-Yaku-Soh (Chinese Medical Plants), 22 (1); 20 - 23, 1991), активности по защите клеток печени (I Shinko et al; Chuh Sei I Ketsugo Zasshi (Chinese-Western Medicine Conjugating Gazette): 11 (2), 102 - 104, 1991) и активности по радикальной очистке (Ko Tenki: Journal of Shanghai сhinese Drugs Association, 9: 28 - 30, 1988), а также по улучшению почечной функции (Hikoyoshi Ohura: Proceedings of the 2nd Chinese-Japanese Symposium on Medical and Pharmaceutical Research on Japanese-Chinese Drugs: pp. 148 - 157, 1988), и эффективности для пациентов с хроническими болезнями почек и уремией (Cho Kyohjin Journal of Shanghai Chinese Drugs Association, 1. 17 - 18, 1981). Однако, в этих сообщениях не упоминалось ничего об идентификации активных веществ, проявляющих подобные активности или эффективности, за исключением веществ с низким молекулярным весом, которые полностью отличаются от того, к чему относится настоящее изобретение.

В то же самое время были осуществлены расширенные исследовательские работы по терапевтическим лекарствам на основе Tanjin для почечных болезней, приведшие, например, к выделению гомологов тансинона, которые относятся к фенантренхинонам с низким молекулярным весом, и магний литоспермината B, тетрамера кофеиновой кислоты (T. Yoozawa, H.Y.Chung, H.Oura, G.Nagaoka и I.Nishioka; Chem. Pharm. Bull. 36, 316 (1988)), все они представляют собой высоко липо-растворимые вещества, получаемые экстракцией при помощи растворов, содержащих органические растворители и еще не нашли клинического применения.

Болезни почек можно приблизительно классифицировать как болезни основного типа, затрагивающие гломерулы и вторичного типа, отличающиеся от других болезней, причем первые отвечают за более 80% от общего числа и проявляются чаще у молодых людей, занимая около 90% всех проявлений. С точки зрения результатов гистопатологии, эти болезни группируются в нефротический синдром с минимальными изменениями, гломерулосклероз, мембранозный нефрит, мезангиопролиферативный гломерулонефрит (IgA нефрит и не-IGa нефрит), мембранозный пролиферативный гломерулонефрит, гломерулонефрит, образующий полулуния и т. д. Протеинурия наблюдается в качестве клинического показателя обычно среди почти всей гистопатологических типов болезней, поэтому серьезная протеинурия приводит к диагнозу нефротического синдрома. Поскольку болезни почек, особенно болезни, вызванные органическим перерождением почки, проявляются в возрастающем объеме не только у старого, но и у молодого поколения и, поэтому, существует большая потребность в разработке водорастворимого лекарства на основе растительного компонента, обладающего пониженным побочным действием, которое можно назначать пациенту перорально или внутримышечно для лечения расстройств посредством органического уменьшения интенсивности заболевания.

С другой стороны, гепатиты, которые приблизительно разделяются на вирусный тип и тип, обусловленный действием лекарств, например, спирта, вызываются в подавляющем большинстве вирусами гепатита B и C. В настоящее время, сообщалось, что интерферон особенно эффективен при лечении гепатита C, причем, его применение становится более распространенным (S.Iino et al.: "Kiso to Rinsho" (Fundamental and Clinical), 26, 339, 1992: H. Suzuki et al. : "Kan. Tan. Sui" (Liver. Gallbladder. Pancreas); 23, 1065, 1991). Однако, как оказалось, интерферон при использовании в течение короткого промежутка времени вызывает гриппо-подобные симптомы, например, лихорадку, в то же время, отмечено, что в случае длительного применения он вызывает неблагоприятные эффекты, такие, как потеря веса, понос, рвота, аритмия, выпадение волос и аромалии в аутоиммунной реакции. В свете того факта, что традиционные лекарства находятся в виде раствора для инъекций, требовалось разработать простое и применимое на практике новое терапевтическое средство или водорастворимое лекарство на основе растительного лекарства или компонента лекарственного растения, вызывающее незначительные побочные эффекты, причем это лекарство можно назначать пациентам перорально или внутримышечно как дополнительное лекарство в сочетании с интерфероном и т.д. для лечения гепатита.

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования такого лекарственного вещества на основе широко используемой модели нефротического синдрома, реализованной у крыс при помощи пуромицина, который, как хорошо известно, порождает значительную протеинурию и показывает органические изменения в почке, и в результате обнаружили, что водный экстракт Tanjin содержит полисахариды, характерные для вышеописанной модели, и что полисахариды в основном состоят из поли-D-галактуроновой кислоты.

Настоящее изобретение выросло из вышеупомянутого результата и относится
(I) к средству, ослабляющему течение болезни для нефротического синдрома и симптомов гепатопатии, включающему водорастворимые полисахариды, содержащие в качестве эффективной составляющей поли-D-галактуроновую кислоту.

(II) к полисахаридам, которые можно экстрагировать из Tanjin водой или водным растворителем и которые обладают следующими характерными свойствами:
A. Содержание сахара: 60 до 100%
(1) Состав сахаросодержащей композиции: 40 до 80% уроновой кислоты (почти полностью состоящей из D-галактуроновой кислоты) и 10 до 30% нейтральных сахаров
(2) Состав нейтральных сахаров
0 до 15% рамнозы
0 до 15% глюкозы
25 до 55% галактозы
30 до 60% арабинозы
0 до 15% маннозы
B. Молекулярный вес 150000 - 300000, (III) к способу получения полисахарида, как описано выше, отличающемуся тем, что указанный способ включает экстрагирование корня или ризомы Tanjin водой или водным растворителем, пропускание раствора, в том виде, как он получен при удалении остатка из экстракта, через неполярную пористую полимерную смолу, концентрирование элюата посредством ультрафильтрации и подвергание концентрата гельфильтрационной хроматографии.

Водорастворимые полисахариды, содержащие полигалактуроновую кислоту в качестве активной составляющей в том виде, как они используются, представляют собой водорастворимые пектиновые вещества, в основном, экстрагируемые из растений, и могут представлять собой или пектины, содержащие не менее, чем около 7,5% карбонильных групп в метилэтерифицированной галактуроновой кислоте, пектины с пониженной степенью метильной этерификации, или пектиновые кислоты, содержащие практически полностью гидролизованные группировки метиловых эфиров. Как правило, такие водорастворимые пектиновые вещества часто содержат незначительные количества арабана, галактана, рамнозы и т.д., но могут быть использованы как таковые.

Водорастворимые полисахариды настоящего изобретения, в том виде, как они использованы, такие включают водорастворимые пектиновые вещества, которые экстрагируются, например, из Tanjin.

Термин Tanjin обычно обозначает корень или ризому Salviae miltiorrehizae Randix, но также могут быть использованы корни растений того же самого рода, например, Salvia bowleyana Dunn, Salviar przewalskii Maxim и Salvie yunnanensis C. H. Wright. В настоящее время все эти образцы растений в совокупности называют Tajin.

Хотя никакие особые ограничения не накладываются на место распространения Tanjin, в соответствии с используемым в настоящем изобретении, для эффективной экстракции и очистки полисахаридов настоящего изобретения предпочтительно использовать Tanjin, в том виде, в котором его производят с Шухуане, Китай.

Tanjin для экстракции желательно измельчать на возможно более мелкие кусочки, в качестве растворителей для экстракции используют воду или водные растворители, причем в качестве водных растворителей предпочтительно используют буферные растворы, например, фосфатные буферы и ацетатные буферы, или растворы хлорида натрия или других солей.

Желательно, довести величину pH растворителя для экстракции до около 2 до 9, и экстракцию предпочтительно осуществляют при температуре от 50 до около 100^oC, желательно, от 70 до 90^oC. Например, Tanjin помещают в теплую воду, заранее нагретую от 50 до 100^oC, предпочтительно от 70 до 90^oC или буфер, или раствор соли, имеющий величину pH в области от 2 до 9, или впоследствии нагревание осуществляют на водяной бане и т.д. вплоть до желательной температуры для проведения экстракции.

При помощи этой методики экстракцию осуществляют в течение 1 до 8 ч, предпочтительно, 3 до 5 ч, получая сырой экстракт. Остаточный корень или ризоид, содержащийся в экстракте, можно отфильтровать через грубый тканевый фильтр или воронку Бюхнера.

Экстракт, не содержащий остатка, дополнительно очищают посредством хроматографии на колонках, набитых неполярной пористой полимерной смолой, уравновешенной водой. В качестве полимерной смолы можно упомянуть, например HP-20 и MCI-Gel (производимые фирмой Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) и Amberlite XAD-2(производимую фирмой Organo Co).

Что касается активного компонента Tanjin, было опубликовано сообщение по литосперминату магния, веществу с низким молекулярным весом, которое элюировали 50% метанольным раствором из фракции, полученной адсорбционным фракционированием на MCl-Gel, и авторы настоящего изобретения также подтверждают, что аналогичная фракция проявляет подавляющую активность по отношению к выделениям протеинурии. Кроме того, проводили испытания со всеми элюированными фракциями, включая неадсорбированную фракцию для того, чтобы точно определить их подавляющую активность по отношению к выделениям протеинурии, и в результате было обнаружено, что, в противоположность тому, что первоначально ожидалось, даже свободно проходящие фракции элюента содержали активный компонент, проявляющий вышеуказанную активность. В этот момент предположили, что свободно проходящие фракции элюента являются низкополярными и в действительности не показывают никакого абсорбционного спектра в ультрафиолетовой области, обусловленного белком, что заставляет предположить, что эта фракция состоит из чего-то, отличного от белка.

Часть свободно проходящей фракции элюента затем пропускали через систему, включающую две ультрафильтрационных мембраны (с относительными срезами молекулярных весов 300000 и 50000) для исследования на стадиях концентрирования и очистки. А именно, фракцию делили на три группы веществ, имеющих, каждое в отдельности, пределы молекулярного веса не менее 300000, 50000 до 300000 и менее 50000, которые испытывали на подавляющую активность по отношению к выделениям протеинурии с использованием модели вызванного пуромицином у крыс нефротического синдрома. В результате высокая активность была обнаружена во фракциях, имеющих молекулярный вес в пределах 50000 до 300000, при этом, слабая активность отмечалась во фракции с молекулярным весом менее 50000.

В свете вышеизложенного, свободно проходящие фракции элюента концентрировали с использованием ультрафильтрационной мембраны, имеющей срез молекулярного веса 3000. На стадии концентрирования для вещества настоящего изобретения можно использовать любые типы ультрафильтрационных мембран, но только, если они имеют эквивалентный размер среза молекулярного веса.

Затем концентрированную фракцию очищали посредством гельпроникающей хроматографии для того, чтобы идентифицировать активный компонент, содержащийся в концентрате, как вещество с узкими пределами молекулярного веса. В хроматографической методике для вещества настоящего изобретения можно использовать продукты серий Sephdex и Sepharose (производимые фирмой Pharmacia Co), Selurofin (производимый фирмой Seikagaku Kogyo K.K.), Biogel ( производимый фирмой Biorad Co), и т.д., которые обычно используют в качестве носителя для гельпроникающей хроматографии для очистки белков и т.п., причем носители для хроматографических использований, приготовленные химическими синтетическими средствами, например, Bio - Gel, предпочтительно подходят для очистки вещества настоящего изобретения. Имеются различные типы хроматографических насадок, имеющих различный размер сита или различный предел исключения, но любые из таких хроматографических насадок могут применяться только если они позволяют проводить фракционирование в пределах 10000 до 300000. Авторы настоящего изобретения предпочитали использование Bio-Gel P-30, -60 и -100, среды прочих Bio-Gel P-60, и концентрат пропускали через колонку, набитую Bio-Gel P-60, уравновешенным водой, при одновременном контроле элюатов посредством абсорбции при длине волны 280 нм. Фракции, которые демонстрировали и не демонстрировали абсорбцию, делили на несколько фракций с объемом вплоть до удвоенного объема колонки и испытывали на подавляющую активность по отношению к выделениям протеинурии в модели вызванного пуромицином нефротического синдрома у крыс, приходя к результату, что полисахариды, проявляющие эту активность, элюировались во фракциях с высокими пределами молекулярного веса.

Полисахариды при обработке посредством окисления иодной кислотой или восстановления теряет активность в то время, как обладают активностями ингибирования агрегации тромбоцитов и защиты оболочки эритроцитов, что показывают испытания in vitro. Хотя известно, что радикалы включаются в модель вызванного пуромицином нефроза или в модель вызванного тетрахлоридом углерода нефротического расстройства у крыс, тем не менее, эксперименты с ESR показали, что полисахариды не обладают непосредственным действием очистки от радикалов.

Полисахариды, полученные очисткой (фракционированием-очисткой) экстракта Tanjin посредством хроматографии на неполярной пористой полимерной смоле и гельпроникающей хроматографии, испытывали на их характерные свойства в соответствии с описанным в нижеследующем:
(1) Общее содержание сахара:
Способ фенольно-сернокислотный (Hodge, J.E. и Hofreiter, B.T. (1962), Methods in Garbohydrate Chemistry (Academic Press), v. 1, p. 338)
0,5 мл порцию испытываемого раствора отмеряли пипеткой и заливали в испытательную трубку, затем, к этому раствору добавляли 0,5 мл 5% (объемн.) фенольного раствора, и 2,5 мл концентрированной серной кислоты добавляли непосредственно на поверхность раствора; раствор тщательно перемешивали и выдерживали при комнатной температуре в течение 20 мин с последующим измерением меры поглощения света при длине волны 480 нм, причем водный раствор глюкозы (10 до 90 мг/мл) использовали в качестве стандарта.

(2) Содержание уроновой кислоты
(m)-Гидроксидифенильный способ (Blumenkarantz, N. и Asboe Hansen G (1973), Anal. Biochem, 54, 484 - 489)
0,2 мл порцию испытываемого раствора смешивали с 1,2 мл 0,0125 M раствора бората натрия в концентрированной серной кислоте с последующим охлаждением льдом и перемешиванием. Реакционный раствор обрабатывают при 100^oC в течение 5 мин, затем охлаждают льдом и смешивают с 20 мл 0,15% раствора m-гидроксидифенила в 0,5%-ном растворе гидроксида натрия, с последующим измерением меры поглощения света при длине волны 520 нм, причем в качестве стандарта используют раствор галактуроновой кислоты.

(3) Содержание нейтрального сахара:
Способ Алдитол ацетатный ГХ-МС (Borchardt, L.S. и Piper, C.V. (1970), Tappi, 53, 257 - 260).

50 мг количество очищенной фракции экстракта Tanjin растворяют в 3 мл 72% (объемн.) серной кислоты и обрабатывают при 30^oC в течение 1 ч, и раствор смешивают с 84 мл дистиллированной воды с последующим выдерживанием в автоклаве при 120^oC в течение 1 ч и добавлением 4 мг инозита в качестве внутреннего стандарта, 30 мл этого раствора доводили гидроксидом бария до величины pH, равной 5.5, центрифугировали, получая всплывающую жидкость, 25 мл всплывающей жидкости смешивают с 80 мг борогидрида натрия, и смесь обрабатывают при комнатной температуре в течение 2 ч с последующим добавлением уксусной кислоты для того, чтобы остановить реакцию. Раствор концентрируют, и концентрат растворяют в дистиллированной воде с последующим выливанием в колонку DEAE Sephadex, чтобы собрать свободно проходящие фракции элюента. Эти фракции концентрируют и концентрат подвергают ацетилированию уксусным ангидридом и пиридином с последующей экстракцией раствором, представляющим собой смесь хлористого метилена и IN соляной кислоты. Органический слой промывают дистиллированной водой и концентрируют, и концентрат растворяют в ацетоне для количественного определения посредством газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) (колонка: капиллярная колонка Supelco для анализа сахаров). Стандартный продукт подвергают восстановительной обработке в соответствии с вышеописанным и анализируют при помощи тех же методик.

(4) Определение молекулярного веса.

Для определения молекулярного веса 10 мкл порцию испытываемого раствора вещества настоящего изобретения пропускают через Tosoh колонку жидкостной хроматографии высокого разрешения (изготовлена фирмой Tosoh Inc.), соединенную с Asahi Pack GS-520 (изготовлена фирмой Asahi Chemical Industries, Ldt) колонкой (внутренним диаметром 7.6 мм и длиной 500 мм) с использованием M: 11; Q воды (температура: комнатная температура, скорость потока: 0.5 мл/мин, детектор: RID). В качестве маркера молекулярного веса используют набор образцов амилозы с индивидуальными молекулярными весами, равными 10200, 30100, 75200, 111400 и 364200 и из калибровочной кривой, полученной на основе этих картин элюирования, определяют молекулярный вес вещества настоящего изобретения.

(5) Оценка при помощи модели вызванного пуромицином нефротического синдрома у крыс:
1) Получение крыс с моделью нефротического синдрома:
Самкам крыс (возрастом около 9 недель, весящим около 150 г) родительской линии Wistar для получения крыс с моделью нефротического синдрома через сонную артерию вводили единичную дозу, равную 60 мг, пуромицин аминонуклеозида (впоследствии кратко называемого "пуромицин", поставляемого Sigma Co.); (S. Tohzyo et al.: "Nephrotic Syndrome" составлено M. Kyogoku. Опубликовано Soft Science Shuppan K.K., Япония, 479 - 488, 1984).

2) Применение испытываемых раствором:
В течение 21 последовательного дня, начиная со дня применения пуромицин аминонуклеозида, каждый из испытываемых растворов вводили модельным крысам один раз в день перорально через желудочную канюлю или внутримышечно, причем очищенную воду для инъекций и раствор дипиридамола давали отрицательным и положительным контрольным группам, соответственно.

3) Определение уровня белка в моче:
Белок в моче определяли при помощи следующей методики: используя камеру для изучения метаболизма крыс, отбирали 24-часовую мочу с интервалами в 2 до 3 дней, начиная с 5 дня после применения пуромицин аминонуклеозида, тем самым измеряя ее объемы, а затем 1 мл всплывающей жидкости, полученной для каждого образца мочи центрифугированием (3000 об/мин • 10 мин) смешивали с 3 мл сульфосалициловой кислоты. Раствор оставляли стоять при комнатной температуре в течение 10 мин и подвергали измерению меры поглощения света при длине волны 660 нм, определяя уровень балка в моче из калибровочной кривой. Общее количество белка, выделенного в моче, рассчитывали, умножая уровень белка в моче на объем мочи. В качестве стандартного белка при получении калибровочной кривой использовали альбумин бычьей сыворотки (производимый фирмой Sigma Chemical Co.).

4) Определение уровней сывороточного холестерина, сывороточного альбумина, суммарного сывороточного белка и сывороточного пероксилипида;
На 7, 14 и 21 дни после применения пуромицин аминонуклеозида у крыс каждой группы под анестезией при помощи эфира отбирали образцы крови из вены для того, чтобы определить содержание холестерина, альбумина, суммарного белка и пероксилипида в сыворотке (использованные реагенты соответствовали поставляемым фирмой Wako Pure Chemicals).

6) Оценка при помощи модели вызванного тетрахлоридом углерода повреждения печени у крыс:
1) Получение крыс с моделью повреждения печени:
Самкам крыс Wistar (возрастом 9 до 11 недель, весящим около 160 г) для получения модели повреждения печени один раз дозой в 1,5 мл/кг вводили внутрибрюшинно смесь 1:1 тетрахлорида углерода (производимого фирмой Wako Pure Chemicals) и оливкового масла (Enshohgaku - Sho; Experimental Methods with Inflammatory Animals Experimental Hepatic Fibrosis. Опубликовано Igaku Shoin, 253 - 277).

2) Применение испытываемого раствора
Каждый из испытываемых растворов вводили обрабатываемым группам внутримышечно один раз в день в течение трехдневного периода со дня 3 до 1 или перорально один раз в день в течение семидневного периода со дня 7 до 1 до применения тетрахлорида углерода, причем отрицательной контрольной группе вводили очищенную воду для инъекций.

3) Биохимическое испытание сыворотки:
Образцы крови объемом 2 мл отбирали у крыс, подвергнутых торакотомии под анестезией с эфиром, через сердце, затем оставляли стоять при комнатной температуре и центрифугировали, получая сыворотки, которые анализировали на активность сывороточной трансаминазы (ГОТ: глутаминовая щавелево-уксусная трансаминаза, ГПТ: глутаминовая пировиноградная трансаминаза), используя набор образцов для испытаний, изготовленный фирмой Wako Pure Chemecals Ind.

4) Статистический анализ
Измеренные величины выражали в виде среднее значение ± квадратичное отклонение и анализировали посредством студенческого т-испытания.

Как указывается в нижеописанных примерах, в экспериментах на животных полисахариды настоящего изобретения эффективны для ослабления течения нефротического синдрома и улучшения симптомов гепатопатии и поэтому могут обычным образом назначаться взрослым людям в качестве средства, ослабляющего течение болезни для нефротического синдрома или улучшающего средства для симптомов гепатопатии, перорально с дневной дозой около 10 до 150 мг или внутримышечно с дневной дозой около 0,5 до 10 мг.

Для более детальной иллюстрации настоящего изобретения ниже приводятся примеры и испытательные примеры.

Ниже представлено краткое описание прилагаемых фигур:
На фиг. 1 графически показана абсорбция при длине волн 280 и 480 нм (A₂₈₀ и A₄₈₀) фракций, полученных гельфильтрационной хроматографией по примеру 1.

На фиг. 2 и 3 графически показаны временные изменения в выделении белка в моче в примере 1, причем полисахариды (AF) согласно настоящему изобретению вводили крысам с моделью нефротического синдрома перорально в различных дозах.

На фиг. 4 показаны временные изменения в выделении белка в моче после введения окисленных и восстановленных AF соответственно.

Пример 1. К 10 кг маленьких кусочков корня Salviae miltiorrhizae Radix, выросшего в Сычуани, Китай, добавляли 30 литров воды, и смесь перемешивали при 80^oC, используя помещенный в нее нагреватель погружения, с последующей экстракцией в течение 3 ч при перемешивании. Остаток корня в экстракте отделяли посредством фильтрования с нутч-фильтром, и выделенный остаток корня еще раз обрабатывали 80 л воды тем же самым способом, что и вышеописанный, получая второй экстракт. Первый и второй экстракт (130 л) соединяли и концентрировали при 40^oC и пониженном давлении, используя испаритель и получая концентрат (10 л).

Затем концентрат загружали в колонку (11 см х 45 см), набитую НР-20 (4 л, изготовленный фирмой Mitsubishi Chemical Industries); используя воду в качестве выравнивающего и проявляющего раствора, соответственно, хроматографию осуществляли при комнатной температуре, и выделяли свободно прошедшую фракцию элюента и вымытую водой фракцию (не адсорбируемую). Колонку промывали 50% метанолом и ацетонитрилом, соответственно, с последующим полным вытеснением водой для рециркуляционного использования. Вышеупомянутую неадсорбируемую фракцию три раза обрабатывали посредством той же самой методики, получая полностью неадсорбируемую фракцию (55 литров). Полностью неадсорбируемую фракцию подвергали ультрафильтрованию для концентрирования, используя устройство для ультрафильтрования типа SEP-1013 (поставляемое Asahi Chemical Industries), снабженное ультрафильтрационной мембраной со срезом молекулярного веса, равным 3000, и получая раствор элюента (с молекулярным весом менее около 3000, называемой "SEP-OUT") и неадсорбируемый раствор неэлюента (с молекулярным весом не менее чем около 3000, называемый "SEP-IN"). Концентрированный неадсорбируемый раствор неэлюента (SEP-IN) заливали в колонку (1,5 см х 100 см), набитую Bio-Gel P-60, уравновешенным водой, и осуществляли хроматографию, причем воду использовали в качестве проявляющего раствора. Регистрацию осуществляли одновременно посредством измерения меры поглощения света при длине волны 280 нм, график строили, откладывая измеренные меры поглощения света по ординате в зависимости от номеров фракций по абсциссе, а суммарное содержание сахаров измеряли в основном с фракциями, не проявляющими абсорбцию, причем результаты указаны на том же рисунке (фиг. 1).

Целевые полисахариды получали из фракционированных растворов (AF) Фракций N 11 - 22 с последующей лиофилизацией с получением порошкообразного продукта (30 г, партия N A).

Получающиеся очищенные полисахариды для характеристики испытывали в соответствии с испытательными методами, аналогичными ранее упомянутым, причем были определены следующие характерные свойства:
1) Содержание сахара (фенольносернокислотный метод): 79%
(1) Состав сахарсодержащей композиции
Содержание уроновой кислоты: 62%
(m-гидроксифенильный метод)
Содержание нейтрального сахара: 17%
(алдитол ацетатный ГХ-МС метод).

(2) Состав нейтрального сахара
(алдитол ацетатный ГХ-МС метод):
Содержание глюкозы: 5,5%
Содержание галактозы: 39,7%
Содержание арабинозы: 44,6%
Содержание маннозы: 5,5%
Содержание рамнозы: 4,7%
(3) Разные сахара:
Аминосахариды, альдегексозы и 2-деоксин-сахара не содержались.

2) Молекулярный вес: 259000
(стандартные полисахариды: набор образцов амилазы, молекулярный вес 100 до 360 К).

3) Оценка на крысах с моделью нефротического синдрома:
Очищенный испытываемый образец (AF) при назначении крысам перорально в дозах 10 мг/кг и 400 мг/кг и внутримышечно в дозах 0,5 мг/кг и 2,5 мг/кг индивидуально вызывал значительное подавление выделений протеинурии, как показано на фиг. 2 и 3. В соответствии с этим наблюдались существенные улучшающие действия на уровень сывороточного холестерина, уровень сывороточного альбумина и альбуминовоглобулиновый индекс A/G и уровень сывороточного пероксилипида (MDA).

4) Оценка при помощи крыс с моделью вызванного тетрахлоридом углерода поражения печени:
В соответствии с представленным в табл.1 очищенный испытательный образец (AF) при назначении крысам перорально в дозах 7 мг/кг и 35 мг/кг и внутримышечно в дозах 0,3 мг/кг и 1,5 мг/кг, соответственно, подавлял увеличение уровней сывороточных ГОТ и ГПТ зависимым от дозы образом. См. табл. 1.

Пример 2. Различные партии сырых материалов Salviae miltiorrhizae очищали индивидуально при помощи методик, аналогичной описанной в примере 1, получая 3 партии очищенных продуктов (Партии N B, C и D), отличающиеся от партии, описанной в примере 1, которые оценивали на их характерные свойства.

1) Содержание сахара (фенольно-сернокислотный способ)
Партия N B, 65%
Партия N C, 80%
Партия N D, 93%
(1) Состав композиции, содержащей сахар
См. табл. 2.

(2) Состав нейтральных сахаров
(алдитол ацетатный ГХ-МС способ)
См. табл. 3.

(3) Разные сахара
Ни одна из Партий NN B, C, и D не содержала никаких аминосахаров, альдогексоз и 2-деокси-сахаров.

2) Молекулярный вес:
(стандартный сахар: набор образцов амилозы с молекулярными весами 100 до 360 К).

Партия N B, 150000
Партия N C, 280000
Партия N D, 250000
3) Оценка на крысах с моделью нефротического синдрома
Партии NN B, C и D оценивали на эффективность с тем результатом, что были получены действия, почти эквивалентные действию партии примера 1.

Пример 3. С целью исследования того, относятся ли, по существу, активность к сахару, и до какой степени уроновая кислота включается в эффективность, очищенный продукт настоящего изобретения подвергали окислению и восстановлению при помощи следующих методик, и продукты окисления и восстановления индивидуально проверяли, давая продукты реакции крысам с моделью нефротического синдрома и крысам с моделью поражения печени перорально дозой 40 мг/кг и внутримышечно дозами 40 и 1,5 мг/кг соответственно.

(1) Окисление (в соответствии со способом, описанным в Noble, D.W и Sturgeon, R.J., (1970), Carbohyd., Res., 12, 448):
600 мг количество очищенного продукта растворяли в 150 мл дистиллированной воды, и к нему добавляли 150 мл 0.2 М раствора периодата натрия, чтобы дать возможность реакции протекать при 37^oC в течение 240 ч. После того, как добавляли 150 мл этиленгликоля, чтобы суспендировать реакцию, к реакционной смеси добавляли 500 мг борогидрата натрия, реакционную смесь обрабатывали при комнатной температуре в течение 24 ч с последующим суспендированием реакции при помощи добавленной уксусной кислоты. Реакционный раствор диализировали водой, и диализат лиофилизировали.

(2) Восстановление (в соответствии со способом, описанным в Taylor, R.L. и Conrad, H.E. (1972) Biochemistry, 11, 1383 - 1388).

50 мг количество очищенного продукта растворяли в дистиллированной воде, затем добавляли 249 мг ЭДК (1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимида), и реакционный раствор подвергали реакции в течение 19 ч, поддерживая pH равным 4,75 при помощи 0,1N соляной кислоты. Затем к раствору по каплям в течение 1 ч добавляли 10 мл 2М раствора борогидрида натрия, поддерживая раствор при pH 7, с последующим перемешиванием в течение еще 1 ч, диализом и лиофилизацией.

Результаты, в соответствии с представленным на фиг. 4 и в табл. 4 и 5, указывают, что окисленные и восстановленные образцы совсем не оказывают действия, заставляя предположить, что активное вещество в очищенном образце состоит из полисахаридов и основано, главным образом, на уроновой кислоте. Сравнение содержания нейтрального сахара до и после восстановления показывает, что уроновая кислота, содержащаяся в настоящем образце, состоит почти исключительно из галактуроновой кислоты.

См. фиг. 4 и табл. 4 и 5.

Пример 4. Поскольку в примере 3 было обнаружено, что D-галактуроновая кислота имеет решающее значение для активности продукта настоящего изобретения, оценивали действие пектиновой кислоты растительного источника, содержащей скелет полигалактуроновой кислоты, при помощи моделей вызванного пуромицином нефроза и вызванного тетрахлоридом углерода поражения печени.

Пектиновую кислоту вводили крысам с нефротической моделью перорально в дозах 10 и 40 мг/кг и внутримышечно в дозе 2,5 мг/кг соответственно, с последующим определением уровней выделенного количества белка в моче и сывороточных холестерина и альбумина, тогда как крысам с моделью поражения печени пектиновую кислоту назначали внутримышечно в дозе 1.5 мг/кг, определяя уровни сывороточных ГОТ и ГПТ.

Результаты в соответствии с представленными в табл. 6, 7 и 8 показали, что пектиновая кислота, при введении внутримышечно, существенно подавляет выделение белка в моче в модели нефротического синдрома и даже после перорального применения демонстрирует тенденцию к улучшению. Кроме того, пектиновая кислота демонстрировала заметное улучшение сывороточных параметров в случаях перорального и внутримышечного применения. В случае перорального применения было показано, что AF является более эффективной, чем пектиновая кислота по любому из подобных показателей.

Пектиновая кислота проявляла ту же самую степень эффективности по отношению к гепатитам, что и AF, и существенно подавляла увеличение уровней сывороточных ГОТ и ГПТ.

На основании вышеописанных результатов было показано, что не только полисахариды (AF), получаемые из Tanjin, но также и полисахариды различного происхождения, содержащие скелет поли-D-галактуроновой кислоты, обладают аналогичным действием.

Claims

1. Средство, ослабляющее течение болезни при нефротическом синдроме и симптомах гепатопатии, включающее экстракт из Tanjin, отличающееся тем, что содержит полисахарид, выделенный экстракцией водой или водным растворителем, имеющий в своем составе : (от общего количества сахаров) 40 - 80% D-галактуроновой кислоты и 10 - 30% нейтральных сахаров, в том числе от общего количества нейтральных сахаров: 20 - 55% галактозы и 30 - 60% арабинозы; полисахарид имеет молекулярный вес 150000 - 300000, при этом средство содержит указанный полисахарид в эффективном количестве, а также нейтральный наполнитель.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что нейтральные сахара дополнительно содержат (от их общего количества) : рамнозы не более 15%, глюкозы не более 15%, маннозы не более 15%.

3. Средство по пп.1 и 2, отличающееся тем, что его применяют внутримышечно или перорально.

4. Средство по пп.1 и 2, отличающееся тем, что полисахарид представляет собой водорастворимое пектиновое вещество.

5. Водорастворимый полисахарид, экстрагируемый из Tanjin водой или водным растворителем, отличающийся тем, что имеет в своем составе (от общего количества сахаров) 40 - 80% D-галактуроновой кислоты и 10 - 30% нейтральных сахаров, в том числе от общего количества нейтральных сахаров: 20 - 55% галактозы и 30 - 60% арабинозы, полисахарид имеет молекулярный вес 150000 - 300000.

6. Полисахарид по п.5, отличающийся тем, что нейтральные сахара дополнительно содержат (от их общего количества) : рамнозы не более 15%, глюкозы не более 15%, маннозы не более 15%.

7. Способ получения полисахарида по п.5, включающий экстракцию растения Tanjin, отличающийся тем, что экстрагируют корень или ризому Tanjin водой или водным растворителем, пропускают полученный экстракт через неполярную, пористую, полимерную смолу, концентрируют элюат ултрафильтрованием и подвергают полученный концентрат гельфильтрационной хроматографии.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что экстрагирование Tanjin осуществляют при pH 2 - 8 и при температуре 40 - 100^oC.