RS59447B1

RS59447B1 - Antigeni, vektori i sastavi virusa humane imunodeficijencije, i postupci njihove primene

Info

Publication number: RS59447B1
Authority: RS
Inventors: Johannes Petrus Maria Langedijk; Benoit Christophe Stephan Callendret; Manen Danielle Van; Anders Krarup; Jörn Stitz; Frank Wegmann; Jort Vellinga
Original assignee: Janssen Vaccines & Prevention Bv
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2016-12-15
Publication date: 2019-11-29
Also published as: IL259942A; US11896663B2; EP3964569A1; SG10202109457RA; HRP20211566T1; US10369214B2; US20210220468A1; PT3390430T; DK3390430T3; KR20180086207A; LT3584252T; TW201734210A; MA55825A; TW202106701A; CN108368157B; RS62360B1; SMT201900629T1; CN108368157A; EA201891415A8; HUE055916T2

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

[0001] Virus humane imunodeficijencije (HIV) utiče na milione ljudi širom sveta, i prevencija HIV efikasnom vakcinom ostaje veoma važan prioritet, čak i u doba široko rasprostranjenog anti-retrovirusnog tretmana. HIV-1 je najčešći i patogeni soj virusa, s tim da više od 90% HIV/AIDS slučajeva potiče od infekcije HIV-1 grupe M. Grupa M je podeljena dalje na grane ili podtipove. Idealno je da efikasna vakcina bude sposobna da izazove kako snažne ćelijske reakcije, tako i široko neutralizujuća antitela sposobna da neutrališu sojeve HIV-1 iz različitih grana.

[0002] Visoka genetička varijabilnost HIV-1 čini razvoj HIV-1 vakcine izazovom bez presedana. Kako bi se poboljšala pokrivenost potencijalnim epitopima T-ćelija i poboljšali ćelijski odgovori, „mozaični“ HIV-1 Gag, Pol i Env antigeni, izvedeni iz proteina HIV grupe antigena (Gag), polimeraze (Pol) i omotača (Env), opisani su od strane drugih i razvijeni u pokušaju da se pruži maksimalno pokrivanje potencijalnih epitopa T-ćelija (npr. Barouch i dr, Nat Med 2010, 16: 319-323). Mozaični antigeni su po dužini i strukturi domena slični divljim vrstama HIV-1 antigena, koji se javljaju u prirodi.

[0003] Na primer, mozaični HIV antigeni opisani i korišćeni u vakcinama uključuju one opisane kod Barouch i dr, supra, i WO 2010/059732 kao što su:

(a) Gag mozaični antigeni, uključujući:

(a) (i) prvu mozaičnu Gag sekvencu („mos1Gag“) koja ima aminokiselinsku sekvencu kao što je ovde navedeno u SEQ ID NO: 1, i

(a) (ii) drugu mozaičnu Gag sekvencu („mos2Gag“) koja ima aminokiselinsku sekvencu kao što je ovde navedeno u SEQ ID NO: 2;

(b) Pol mozaični antigeni, uključujući:

(b) (i) prvu mozaičnu Pol sekvencu („mos1Pol“) koja ima aminokiselinsku sekvencu kao što je ovde navedeno u SEQ ID NO: 3, i

(b) (ii) drugu mozaičnu Pol sekvencu („mos2Pol“) koja ima aminokiselinsku sekvencu kao što je ovde navedeno u SEQ ID NO: 4; i

(c) Env mozaički antigeni uključujući:

(c) (i) prvu mozaičnu Env sekvencu („mos1Env“) koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je ovde navedeno u SEQ ID NO: 5, i

(c) (ii) drugu mozaičnu Env sekvencu („mos2Env“) koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je ovde navedeno u SEQ ID NO: 6.

[0004] Sekvence koje kodiraju ove antigene klonirane su u vektorima, na primer, kao što su rekombinantni vektori adenovirusa, npr., rekombinantni adenovirusni serotip 26 (rAd26), i ti rekombinantni vektori prethodno su korišćeni kao vakcine za generisanje imunih odgovora na antigene (pogledati npr. Barouch i dr, supra; i WO 2010/059732). Na primer, mozaične antigen sekvence mos1Gag i mos1Pol obično se kombinuju u fuzioni protein Gag i Pol („mos1GagPol“), i njihova kodirajuća sekvenca je klonirana u prvi Ad26 vektor („rAd26.mos1GagPol“); i antigen sekvence mos2Gag i mos2Pol su kombinovane u drugi fuzioni protein Gag i Pol („mos2GagPol“), i njihova kodirajuća sekvenca je klonirana u drugi Ad26 vektor („rAd26.mos2GagPol“). Konstrukti koje kodiraju mos1Env i mos2Env obično se kloniraju u odvojene Ad26 vektore („rAd26.mos1Env“ i „rAd26.mos2Env“, respektivno).

[0005] Skup takvih mozaičnih antigena kako je gore opisano primenjuje dobru globalnu pokrivenost HIV-1izolata Grupe M, gde rAd26 vektori koji kodiraju mozaične 1 antigen sekvence (npr. RAd26.mos1GagPol i rAd26.mos1Env) favorizuju granu B i CRF01 podtipove HIV-1, i rAd26 vektori koji kodiraju mozaične 2 antigen sekvence (npr. rAd26.mos2GagPol i rAd26.mos2Env) pogoduju sojevima grane C. Mozaični antigeni HIV-1 Gag, Pol i Env eksprimirani u rAd26 vektorima mogu se koristiti za poboljšanje kako širine tako i dubine odgovora T-limfocita specifičnih za antigene kod rezus majmuna, i da pri tome ne naruše veličinu ćelijskih i humoralnih odgovora u poređenju sa konsenzus ili prirodnim sekvencama HIV-1 antigena (Barouch i dr, supra; i WO 2010/059732).

[0006] Međutim, daljim naporima na razvoju opisanih komponenti vakcine, ustanovljeno je da rAd26.mos2Env pokazuje ne-optimalno eksprimiranje ćelijske površine i imuni odgovor kod primata koji nisu ljudi, ali je osim toga pokazao do sada neprijavljenu, neočekivanu i nepredvidljivu ne-optimalnu genetsku stabilnost tokom proizvodnog procesa u poređenju sa drugim rAd26 vektorima, kao što je rAd26.mos1Env. Prema tome, vakcine koje sadrže rAd26.mos2Env mogu rezultovati ne-optimalnim imunim odgovorima protiv podtipa HIV-1 grane C, budući da mos2Env mozaični antigen pogoduje sojevima C HIV-1 grane C. Shodno tome, postoji potreba za alternativom mos2Env antigenu u vakcinama protiv HIV koja se može koristiti za indukciju poboljšanih imunih odgovora na HIV granu C.

KRATAK SAŽETAK PRONALASKA

[0007] Pronalazak se odnosi na nove sintetičke proteine omotača virusa humane imunodeficijencije (HIV) koji imaju poboljšano eksprimiranje ćelijske površine i genetsku stabilnost u poređenju sa ranije opisanim mos2Env antigenom. Pronalazak se takođe odnosi na sastave i postupke upotrebe takvih novih sintetičkih proteina HIV omotača i/ili kodirajuće sekvence za indukciju povećanih imunih odgovora protiv HIV-1, naročito HIV-1 granu C, poželjno kada se koristi u kombinaciji sa drugim HIV antigenima.

[0008] U jednom opštem aspektu, pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 8 koja ima jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koju čine (i) I529P (tj. supstitucija Ile u Pro na položaju 529 od SEQ ID NO: 8), (ii) K480E (tj. supstitucija Lys u Glu na položaju 480 od SEQ ID NO: 8), i (iii) a kombinacija EK479-480RRRR (tj. supstitucija Glu-Lys na položajima 479-480 od SEQ ID NO: 8 sa četiri uzastopna Arg ostatka), I529P, A471C (tj. supstitucija Ala-Cys na položaju 471 od SEQ ID NO: 8) i T575C (tj. supstitucija Thr za Cys na položaju 575 od SEQ ID NO: 8). U jednom aspektu, sintetički protein HIV omotača dalje sadrži signalnu sekvencu, na primer signalnu sekvencu koja ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 9-12. U jednom otelotvorenju, signalna sekvenca ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9.

[0009] U nekim otelotvorenjima, sintetički protein HIV omotača dalje sadrži transmembranski domen, poželjno transmembranski domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13.

[0010] U nekim otelotvorenjima, sintetički protein HIV omotača dalje sadrži fragment citoplazmatičnog domena, poželjno fragment citoplazmatičnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, ili njegove aminokiseline 1-4 (tj. NRVR). U otelotvorenjima gde sintetički protein HIV omotača dalje sadrži transmembranski domen i fragment citoplazmatičnog domena, poželjno je da protein takođe sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37, koja je spojena sa karboksil-terminusom (C-terminus) SEQ ID NO:8 i amino-terminusom (N-terminus) transmembranskog regiona.

[0011] U drugom otelotvorenju, sintetički protein HIV omotača sadrži domen trimerizacije, na primer, domen trimerizacije koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 (GCN4) ili SEQ ID NO: 16 (foldon domen). U jednom poželjnom otelotvorenju, domen trimerizacije sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15. Takve otelotvorenja sa domenima trimerizacije su korisni za rastvorljive (tj. koji nisu vezani na membranu) sintetičke proteine HIV omotača na osnovu ovde prikazanih sekvenci ektodomena, kao što je onaj koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, gde se domen trimerizacije nalazi na C-terminusu sintetičkog proteina HIV omotača.

[0012] U drugim otelotvorenjima, sintetički protein HIV omotača sadrži SEQ ID NO: 8 sa narednim mutacijama: EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C. Uvođenje 6 uzastopnih ostataka arginina (položaji 478 i 481 u matičnoj sekvenci SEQ ID NO: 8 su već Arg ostaci) rezultuje dodatnim optimizovanim mestom cepanja furina, tako da se dobija poboljšani prerađeni (tj. otcepljeni) ektodomen. Tri mutacije I529P, A471C i T575C poznate su kao SOSIP mutacije, od čega poslednje dve mutacije rezultuju uvođenjem mogućeg disulfidnog mosta između novostvorenih cisteinskih ostataka. Sveukupno, ove mutacije rezultuju rastvorljivim, trimerizovanim, sintetičkim proteinima HIV omotača, bez potrebe za domenom trimerizacije.

[0013] U poželjnom otelotvorenju, pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 ili aa 1-686 od SEQ ID NO: 19. Najpoželjnije sintetički protein HIV omotača kodiran nukleinskom kiselinom sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18.

[0014] U drugom opštem aspektu, pronalazak se odnosi na vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sintetički protein HIV omotača prema otelotvorenju pronalaska. U jednom otelotvorenju, vektor je virusni vektor. U poželjnom otelotvorenju, virusni vektor je vektor adenovirusa. U jednom poželjnom otelotvorenju, vektor adenovirusa je vektor adenovirusa 26.

[0015] Naredni opšti aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na sastav, poželjno sastav vakcine koji sadrži imunogeno efikasnu količinu vektora prema otelotvorenju pronalaska i nosač, gde je nukleinska kiselina koja kodira sintetički protein HIV omotača operativno povezana sa promoterskom sekvencom. U jednom aspektu, sastav sadrži vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18.

[0016] U drugom opštem aspektu, pronalazak se odnosi na kombinaciju vakcina za indukciju imunog odgovora protiv virusa humane imunodeficijencije (HIV) kod pacijenta kom je to potrebno. Kombinacija vakcine sadrži prvi sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu vektora, poželjno vektor adenovirusa, poželjnije vektor adenovirusa 26, koji kodira sintetički protein HIV omotača koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18, i drugi sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu drugog vektora, poželjno drugog vektora adenovirusa, poželjnije drugog vektora adenovirusa 26, koji kodira HIV antigeni polipeptid, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i opciono najmanje jedan dodatni sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu od najmanje jednog odabranog iz grupe koju čine vektora koji kodira antigeni polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1-4, 28 i 29, i polipeptida koji sadrži imunogeno efikasnu količinu izolovanog HIV antigenog polipeptida, uključujući, ali ne ograničavajući se na, polipeptid koji ima ostatke 30-708 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7, ili polipeptid koji ima ostatke 30-724 od SEQ ID NO: 36, gde su prvi sastav, drugi sastav i opciono dodatni sastav prisutni u istom sastavu, ili u jednom ili više različitih sastava.

[0017] Još jedan opšti aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na postupke izazivanja imunog odgovora protiv virusa humane imunodeficijencije (HIV) kod pacijenta kom je to potrebno, i koji uključuje primenu pacijentu sastava ili kombinacije vakcine prema otelotvorenju pronalaska. Pronalazak se takođe odnosi na postupke izazivanja imunog odgovora protiv HIV, koji sadrže prajmer i pojačavanje imunog odgovora korišćenjem sastava ili kombinacije vakcine prema otelotvorenju predmetnog pronalaska.

[0018] Ipak, dalji aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 8 koja ima jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koju čine (i) I529P, (ii) K480E, (iii) kombinacije EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C. U jednom otelotvorenju, sintetički protein HIV omotača sadrži SEQ ID NO: 8 sa mutacijama EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C. U drugom otelotvorenju, sintetički protein HIV omotača sadrži ostatke 30-704 ili 30-711 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18. U drugom otelotvorenju, sintetički protein HIV omotača sadrži ostatke 30-686 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 19.

[0019] Naredni aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na ćeliju, poželjno izolovanu ćeliju, koja sadrži vektor prema otelotvorenju predmetnog pronalaska.

KRATAK OPIS NEKOLIKO PRIKAZA SA SLIKA

[0020] Prethodni sažetak, kao i naredni detaljni opis pronalaska, biće bolje razumljivi kada se čitaju zajedno sa priloženim slikama. Treba da se razume da pronalazak nije ograničen na tačna otelotvorenja prikazana na slikama.

[0021] Na slikama:

SLIKE 1A-1C su šematski prikazi struktura proteina HIV omotača; SLIKA 1A pokazuje protein HIV omotača pune dužine; SLIKA 1B prikazuje strukturu rastvorljivog jednolančanog proteina HIV omotača, prema otelotvorenju pronalaska, u kom je transmembranski domen (TM) zamenjen GCN4 domenom trimerizacije, i mesto razdvajanja furina je mutirano (sC4); SLIKA 1C prikazuje strukturu proteina HIV omotača vezane za membranu, prema otelotvorenju predmetnog pronalaska, koja sadrži transmembranski domen i fragment citoplazmatičnog domena (C4D7);

SLIKA 2 prikazuje nivoe eksprimiranja rastvorljivog proteina omotača sC1, koji je zasnovan na sekvenci mozaičkog antigena mos2Env sa dodatnim C-terminalnim domenom trimerizacije i rastvorljivim sintetičkim proteinima HIV omotača (sC4) prema otelotvorenju pronalaska; eksprimiranje je mereno kvantitativnim Western blotom koristeći poliklonska antitela protiv gp120; plazmidi koji kodiraju sC1 ili sC4 bili su prolazno eksprimirani dva puta, i svaka transfekcija je dva puta kvantifikovana denzitometrijom; sC1 protein je pokazao veoma niske nivoe eksprimiranja u poređenju sa sC4 sintetičkim proteinima HIV omotača, koji su pokazali relativno visoke nivoe eksprimiranja;

SLIKE 3A i 3B pokazuju vezivanje sintetičkih proteina HIV omotača sa monoklonskim antitelom 17b (mAb17b) u prisustvu (svetlo siva) i odsustvu (tamno siva) rastvorljivog CD4, što je određeno ELISA testom; SLIKA 3A pokazuje vezivanje sC1; SLIKA 3B pokazuje vezivanje sC4;

SLIKA 4 je slika Western blot sa prirodnom poliakrilamidnom elektroforezom sC1 proteina i sC4 sintetičkog proteina HIV omotača;

SLIKA 5 prikazuje relativne nivoe eksprimiranja ćelijske membrane za membranskovezane C1, C1D7, C4 i C4D7 sintetičke proteine FACS analizom ćelija koje eksprimiraju ove proteine korišćenjem poliklonskog antitela anti-gp120 (GP120), i vezivanjem za široko neutralizujuća antitela PG9 (PG9) i PG16 (PG16) koja su zavisna od kvartarne strukture i poželjno se vezuju za pravilno savijeni Env trimer; SLIKA 6 je grafički prikaz stabilnosti vektora adenovirusa koji sadrže sekvence koje kodiraju sintetičke proteine HIV omotača predmetnog pronalaska, uključujući C4 (FLC4), C4D7 i sC4 posle višestrukih virusnih prolaza; rekombinantni vektor adenovirusa 26 je generisan u PER.C6 ćelijama; nakon početna 3 prolaza za transfekciju i prečišćavanje plaka, odabrano je 5 plaka za 10 prolaza u T25 formatu, što je rezultovalo ukupnim brojem virusnih prolaza (vpn) od 13; prikazana je stabilnost nakon vpn 3, 5, 10 i 13, kako je utvrđeno lančanom reakcijom polimeraze transgene kasete E1 (PCR); na primer, 3/5 znači da su 3 plake od 5 testiranih plaka bile stabilne, i 5/5 znači da je 5 od 5 testiranih plaka bilo stabilno; i

SLIKE 7A i 7B pokazuju titre neutralizacije virusa protiv čestica HIV-1 omotača pseudotipizovanih virusa (EVP) u testu neutralizacije ćelija na TZM-bl kod zečeva; log10-transformisane IC50vrednosti doznih grupa sa visokim vektorom adenovirusa merene su u odnosu na EVP VSV-G (negativna kontrola) i MV965.26 (nivo 1A grana C) u nedeljama 1, 8, 14 i 20; svaka tačka predstavlja log10-transformisanu IC50vrednost pojedinačnog zeca, gde je srednja vrednost grupe označena horizontalnom linijom; HD: najviše testirano razređivanje (gornja čvrsta linija); LD: najniže testirano razređivanje (donja čvrsta linija); LOB: granica pozadine, 95 procentualna vrednost sastavljenih negativnih uzoraka (isprekidana linija); Log10 IC50vrednosti koje prelaze LD ili HD prag postavljene su u odgovarajućoj liniji; za svaku vremensku tačku izvršeno je jednosmerno ne-parametarsko poređenje sa kontrolom pomoću Dunn postupka za zajedničko rangiranje; statistički značajne razlike prikazane su na graficima: * = P <0,05, ** = P <0,01, i *** = P <0,001; SLIKA 7A prikazuje rezultate sa VSV-G (negativna kontrola); i SLIKA 7B prikazuje rezultate sa MV965.26 (nivo 1A grana C).

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0022] Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kao što je uobičajeno poznato osobama u struci na koje se ovaj pronalazak odnosi. Inače, određeni izrazi koji se ovde koriste imaju značenja koja su utvrđena u specifikaciji. Mora se primetiti da, kako se koristi ovde i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju množinu, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije.

[0023] Kako se ovde koristi, „pacijent“ označava bilo koju životinju, poželjno sisara, najpoželjnije čoveka, kojoj će biti ili je primenjen vektor, sastav ili kombinovana vakcina prema otelotvorenjima pronalaska. Izraz „sisar“ kako se ovde koristi obuhvata bilo kog sisara. Primeri sisara uključuju, ali nisu ograničeni na, krave, konje, ovce, svinje, mačke, pse, miševe, pacove, zečeve, zamorce, majmune, ljude itd., najpoželjnije ljude.

[0024] Pronalazak se generalno odnosi na sintetičke proteine HIV omotača, nukleinsku kiselinu i vektore koji kodiraju sintetičke proteine HIV omotača i postupke izazivanja imunog odgovora na HIV vektorima koji kodiraju sintetičke proteine HIV omotača ili sintetičke proteine HIV omotača, same ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih vektora koji kodiraju jedan ili više dodatnih antigenih polipeptida i/ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih izolovanih HIV antigenih polipeptida.

[0025] Virus humane imunodeficijencije (HIV) je član roda Lentivirinae, koji je deo porodice Retroviridae. Dve vrste HIV zaražavaju ljude: HIV-1 i HIV-2. HIV-1 je najčešći soj virusa HIV, i poznato je da je patogeniji od HIV-2. Kako se ovde koristi, izrazi „virus humane imunodeficijencije“ i „HIV“ odnose se, ali nisu ograničeni na, HIV-1 i HIV-2.

[0026] HIV je kategorisan u više grama sa visokim stepenom genetske divergencije. Kako se ovde koristi, izraz „HIV grana“ ili „HIV podvrsta“ odnosi se na srodne viruse humane imunodeficijencije klasifikovane u skladu sa svojim stepenom genetske sličnosti. Trenutno postoje tri grupe HIV-1 izolata: M, N i O. Grupa M (glavni sojevi) se sastoji od najmanje deset slojeva, od A do J. Grupa O (spoljni sojevi) može se sastojati od sličnog broja slojeva. Grupa N je novi izolat HIV-1 koji nije kategorisan ni u grupu M ni u O.

[0027] Kako se ovde koristi, izrazi „HIV antigeni polipeptid“, „HIV antigeni protein“ i „HIV imunogen“ odnose se na polipeptid koji može kod pacijenta da indukuje imuni odgovor, npr., humoralni i/ili ćelijski posredovani odgovor protiv HIV. antigeni polipeptid može biti protein HIV, njegov fragment ili epitop ili kombinacija više HIV proteina ili njihovih delova koji mogu izazvati imuni odgovor ili proizvesti imunitet, npr., zaštitni imunitet protiv HIV kod pacijenta.

[0028] Poželjno, antigeni polipeptid je sposoban da kod domaćina podigne zaštitni imuni odgovor, npr., indukuje imuni odgovor protiv virusne bolesti ili infekcije i/ili stvori imunitet (tj. Vakciniše) pacijenta protiv virusne bolesti ili infekcije, koji štiti pacijenta od virusne bolesti ili infekcije. Na primer, antigeni polipeptid može da sadrži protein ili njegove fragmente od virusa simijanske imunodeficijencije (SIV) ili HIV, poput proteina omotača gp160 za HIV ili SIV, HIV ili SIV matriks/kapsid proteina i HIV ili SIV gag, pol i env genetskih proizvoda.

[0029] HIV antigeni polipeptid može biti bilo koji HIV-1 ili HIV-2 antigen ili njegov fragment. Primeri HIV antigena uključuju, ali nisu ograničeni na gag, pol, i env genske proizvode, koji kodiraju strukturne proteine i esencijalne enzime. Gag, pol, i env genski proizvodi se sintetišu kao poliproteini, koji se dalje prerađuju u više drugih proteinskih proizvoda. Primarni proteinski proizvod geg gena je gag poliprotein virusnog strukturnog proteina koji se dalje prerađuje u proteinske proizvode MA, CA, SP1, NC, SP2 i P6. pol gen kodira virusne enzime (pol, polimeraza), i primarni proteinski proizvod se dalje prerađuje u proteinske proizvode RT, RNaza H, IN i PR. env gen kodira strukturne proteine, posebno glikoproteine virionskog omotača. Primarni proteinski proizvod env gena je gp160, koji se dalje obrađuje u gp120 i gp41. Ostali primeri HIV antigena uključuju gensko regulisane proteine Tat i Rev; pomoćne proteine Nef, Vpr, Vif i Vpu; kapsidne proteine, nukleokapsidne proteine i p24 virusni protein.

[0030] U određenim otelotvorenjima, HIV antigeni polipeptid sadrži HIV Gag, Env ili Pol antigen, ili bilo koji deo antigena ili epitop ili njihovu kombinaciju, poželjno HIV-1 Gag, Env, ili Pol antigen ili bilo koji deo antigena ili epitop ili njihovu kombinaciju.

[0031] HIV antigeni polipeptidi takođe mogu biti mozaični HIV antigeni. Kako se ovde koristi, „mozaični antigen“ se odnosi na rekombinantni protein sastavljen od fragmenata prirodnih sekvenci. Mozaični antigeni podsećaju na prirodne antigene, ali su optimizovani da maksimizuju pokrivanje potencijalnih epitopa T-ćelija koji se nalaze u prirodnim sekvencama, što poboljšava širinu i pokrivenost imunog odgovora. Mozaični HIV antigeni za upotrebu sa pronalaskom su poželjno mozaični Gag, Pol i/ili Env antigeni, i poželjnije mozaični HIV-1 Gag, Pol i/ili Env antigeni. Kako se ovde koristi, „mozaični HIV Gag, Pol i/ili Env antigen“ specifično se odnosi na mozaični antigen koji sadrži više epitopa izvedenih iz jedne ili više Gag, Pol i/ili Env poliproteinskih sekvenci od HIV.

[0032] U jednom aspektu, mozaični HIV antigen za upotrebu u pronalasku je mozaični HIV Gag antigen sa epitopima dobijenim iz sekvenci geg genskih proizvoda (primeri su dati u SEQ ID NO: 1,2); mozaični HIV Pol antigen sa epitopima dobijenim iz sekvenci pol genskih proizvoda (primeri su dati u SEQ ID NO: 3, 4); ili mozaični HIV Env antigen sa epitopima dobijenim iz sekvenci env genskih proizvoda (primeri su dati u SEQ ID NO: 5, 6; takođe se novi antigeni predmetnog pronalaska, npr. u SEQ ID NO: 8, 17, 18, 19, mogu smatrati mozaičnim HIV Env antigenima). U nekim otelotvorenjima, mozaični HIV antigen za upotrebu sa pronalaskom može da sadrži kombinaciju epitopa dobijenih iz sekvenci gag, pol, i/ili env genetskih proizvoda. Ilustrativni i neograničavajući primeri uključuju mozaične Env-Pol antigene sa epitopima dobijenim iz sekvenci env i pol genetskih proizvoda; mozaične Gag-Pol antigene sa epitopima dobijenim iz sekvenci geg i pol genetskih proizvoda; i mozaične Gag-Env antigene sa epitopima dobijenim iz sekvenci geg i env genetskih proizvoda. Sekvence gag, pol, i env genetskih proizvoda mogu se izvesti iz jednog ili više slojeva.

[0033] Primeri mozaičnih HIV Gag, Pol i/ili Env antigena koji se mogu koristiti u pronalasku uključuju one opisane u, npr. US20120076812; Barouch i dr., Nat Med 2010, 16:319-323; i Barouch i dr., Cell 155:1-9, 2013, koji su ovde u celosti uključeni referencom. Poželjno, mozaični HIV Gag, Pol i/ili Env antigeni za upotrebu sa predmetnim pronalaskom uključuju, ali nisu ograničeni na, mos1Gag (SEQ ID NO: 1), mos2Gag (SEQ ID NO: 2), mos1Pol (SEQ ID NO: 3), mos2Pol (SEQ ID NO: 4), mos1Env (SEQ ID NO: 5), mos2Env (SEQ ID NO: 6), mos1GagPol (SEQ ID NO: 28), mos2GagPol (SEQ ID NO: 29) i njihove kombinacije.

[0034] Kako se ovde koristi, svaki od izraza „protein HIV omotača“, „env protein“ i „Env“ odnosi se na protein koji se eksprimira na omotaču HIV viriona i omogućava da HIV cilja i pričvrsti se na plazma membranu HIV inficirane ćelije, ili njegov fragment ili derivat koji mogu izazvati imuni odgovor ili proizvesti imunitet na HIV kod pacijenta kom je to potrebno. HIV env gen kodira prekursor protein gp160, koji se proteolitički cepa na dva zrele glikoproteina omotača, gp120 i gp41. Reakcija cepanja je posredovana proteazom ćelije domaćina, furinom, u sekvenci koja je visoko konzervirana u prekursorima glikoproteina retrovirusnog omotača. Tačnije, gp160 se trimerizuje na (gp 160)3i zatim je podvrgnut cepanju na dva nekovalentno povezana gp120 i gp41. Virusni unos se zatim posreduje trimerom gp120/gp41 heprodimera. Gp120 je fragment koji se vezuje za receptor i vezuje se za CD4 receptor na ciljanoj ćeliji koji ima takav receptor, kao što je, na primer, T-pomoćna ćelija. Gp41, koji je nekovalentno vezan za gp120, je fuzioni fragment i pruža drugi korak kojim HIV ulazi u ćeliju. Gp41 je prvobitno zaklonjen unutar virusnog omotača, ali kada se gp120 vezuje za CD4 receptor, gp120 menja svoju konformaciju, čime gp41 postaje izložen, gde može pomoći u fuziji sa ćelijom domaćinom. Gp140 je nerazdvojeni ektodomen trimernog gp160, tj. (gp160)3, koji se koristio kao surogat za matično stanje razdvojenog, virusnog vrha.

[0035] Prema otelotvorenjima predmetnog pronalaska, „protein HIV omotača“ može biti gp160, gp140, gp120, gp41 protein, njihove kombinacije, fuzije, skraćenja ili derivati. Na primer, „protein HIV omotača“ može da sadrži gp120 protein koji je nekovalentno povezan sa gp41 proteinom. Takođe može da uključuje stabilizovani trimerni gp140 protein koji može imati ili može biti modifikovan tako da uključuje domen trimerizacije koji stabilizuje trimere od gp140. Primeri domena trimerizacije uključuju, ali nisu ograničeni na, T4-fibritin „foldon“ domen trimerizacije; domen trimerizacije namotane zavojnice izveden iz GCN4; i katalitičku podjedinicu E. coli aspartat transkarbamoilaze kao trimer oznaku. „Protein HIV omotača“ takođe može biti skraćeni protein HIV omotača koji uključuje, ali se ne ograničava na, proteine omotača koji sadrže C-terminalno skraćenje u ektodomenu (tj. domen koji se proteže u vanćelijski prostor), skraćenje u gp41, kao što su skraćenje u transmembranskom domenu gp41, ili skraćenje u citoplazmatičnom domenu gp41. „Protein HIV omotača“ može dalje biti derivat proteina HIV omotača koji se prirodno pojavljuje sa mutacijama sekvenci, npr., na mestima cepanja furina i/ili takozvanim SOSIP mutacijama.

[0036] Poželjno, „protein HIV omotača“ je „sintetički protein HIV omotača.“ Kako se ovde koristi, izraz „sintetički protein HIV omotača“ odnosi se na protein HIV omotača koji nije prirodan i koji je optimizovan da indukuje imuni odgovor ili proizvede imunitet protiv jednog ili više sojeva virusa HIV koji se javljaju kod pacijenta kom je to potrebno. Mozaični HIV Env proteini su primeri sintetičkih HIV Env proteina, i pronalazak pruža nove sintetičke HIV Env antigene, npr. one koje sadrže SEQ ID NO: 8, 17, 18 ili 19.

Sintetički proteini HIV omotača i njihove kodirajuće sekvence

[0037] Otelotvorenja pronalaska se odnose na nove sintetičke proteine HIV omotača i molekule nukleinske kiseline koji ih kodiraju.

[0038] U jednom otelotvorenju, pronalazak se odnosi na sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 8 koja ima jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koju čine (i) I529P, (ii) K480E i (iii) kombinacija EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C. SEQ ID NO: 8 sadrži sintetički zreli gp120 i sintetički skraćeni gp41 bez transmembranskog regiona, i bez citoplazmatičnog domena. SEQ ID NO: 8 je sekvenca koja nije prirodna i sastoji se od himera sekvenci mos2Env mozaičnog antigena (SEQ ID NO: 6) i drugih proteinskih sekvenci HIV omotača. Sekvenca novog sintetičkog Env antigena koji sadrži SEQ ID NO: 8 je optimizovana da pruži široku pokrivenost i pojačan odgovor T-ćelija protiv HIV grane C (u poređenju sa mos2Env antigenom (SEQ ID NO: 6)). U nekim otelotvorenjima, dodatne aminokiseline mogu da se dodaju SEQ ID NO: 8 ili jednoj od njegovih ovde definisanih varijanti.

[0039] U nekim otelotvorenjima, sintetički protein HIV omotača dalje sadrži signalnu sekvencu. Sintetički protein HIV omotača sintetisan je sa signalnom sekvencom koja se odvaja iz urođenog polipeptidnog lanca tokom transporta u lumen endoplazmatičnog retikuluma (ER). U principu, može se koristiti bilo koja poznata signalna sekvenca. Poželjno se koristi signalna sekvenca HIV Env ili njena varijanta. U struci su korišćene različite signalne sekvence za HIV Env proteine (pogledati npr. WO 2014/107744). U nekim otelotvorenjima, signalna sekvenca sadrži SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ili SEQ ID NO: 12. U jednom poželjnom otelotvorenju, signalna sekvenca sadrži SEQ ID NO: 9.

[0040] U nekim otelotvorenjima, sintetički protein HIV omotača dalje sadrži transmembranski domen. Transmembranski domen pričvršćuje sintetički protein HIV omotača u ER membranu i doprinosi sklapanju i funkciji membrane HIV omotača. Poželjno, transmembranski domen sadrži SEQ ID NO: 13.

[0041] U drugom otelotvorenju, sintetički protein HIV omotača sadrži gp41 koji ima skraćen citoplazmatični domen. Gp41 ima neobično dug citoplazmatični domen na svom karboksilnom kraju, obično oko 150 aminokiselina (Edwards i dr., J. Virology, 2002, 76:2683-2691). Otkriveno je da skraćenje citoplazmatičnog domena izaziva izlaganje konzerviranog regiona u ektodomenu HIV-1 Env proteina (Id.). Skraćeni citoplazmatični domen u sintetičkom HIV omotaču predmetnog pronalaska može da se kreće od jedne do oko 140 aminokiselina, kao što je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 ili 140 aminokiselina citoplazmatičnog domena pune dužine. U nekim otelotvorenjima, skraćeni citoplazmatični domen je izveden iz aminokiselina 704-862 od SEQ ID NO: 17 (tj. iz citoplazmatičnog domena C4 molekula predmetnog pronalaska), skraćivanjem posle date aminokiseline do C-terminusa. U poželjnom otelotvorenju, sintetički protein HIV omotača sadrži skraćeni citoplazmatični domen koji sadrži 1 do 10 aminokiselinskih ostataka, poželjnije 4 do 8 aminokiselinskih ostataka, i najpoželjnije 7 aminokiselinskih ostataka HIV gp41 citoplazmatičnog domena. Citoplazmatični domen ili njegov fragment sintetičkog proteina HIV omotača nalaze se C-terminalno u odnosu na vanćelijski domen (ektodomena), i kada sintetički protein HIV omotača takođe sadrži transmembranski domen, citoplazmatični domen ili njegov fragment se nalaze C-terminalno u odnosu na transmembranski domen. Pogledati, na primer, Slike.1A i 1C. U posebnom otelotvorenju, sintetički protein HIV omotača sadrži gp41 sa skraćenim citoplazmatičnim domenom koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 ili njen fragment, kao što su njegovi ostaci 1-4 (tj. NRVR). Opisani su i drugi skraćeni citoplazmatični domeni i mogu se koristiti (npr. Schiernle i dr., PNAS 1997; Abrahamyan i dr., J Virol 2005).

[0042] U otelotvorenjima gde sintetički protein HIV omotača dalje sadrži transmembranski domen i fragment citoplazmatičnog domena, poželjno je da protein takođe sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37, koja sadrži ostatke 655-682 od SEQ ID NO.18, gde se aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 37 spaja na C-terminusu od SEQ ID NO: 8 i N-terminusu transmembranskog domena.

[0043] U jednom posebno poželjnom otelotvorenju pronalaska, sintetički protein HIV omotača dalje sadrži transmembranski domen, kao što je onaj koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13, i skraćen citoplazmatični domen ili fragment citoplazmatičnog domena, poput onog koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 ili ostatke 1-4 od SEQ ID NO: 14 (tj. NRVR). Najpoželjnije, sintetički protein HIV omotača sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18, sa ili bez signalne sekvence (tj., aminokiselinski ostaci 1-29 od SEQ ID NO: 18).

[0044] U drugom otelotvorenju, sintetički protein HIV omotača sadrži domen trimerizacije koji zamenjuje Env transmembranski region. Domen trimerizacije povećava stabilnost Env trimerne strukture. Poželjno, sintetički protein HIV omotača sadrži gp140 polipeptid koji je modifikovan tako da uključuje domen trimerizacije koji stabilizuje trimere od gp140. Primeri domena trimerizacije uključuju, ali nisu ograničeni na, domen trimerizacije T4-fibritin „foldon“, kao onaj koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID: 16; domen trimerizacije namotane zavojnice izveden iz GCN4, kao onaj koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID: 15; katalitičku podjedinicu E. coli aspartata transkarbamoilazu kao trimer oznaku; ili motive trimerizacije na bazi matrilina. Ako je prisutan, domen trimerizacije obično se nalazi C-terminalno u odnosu na vanćelijski domen (pogledati Sliku 1B). U nekim poželjnim otelotvorenjima gde sintetički protein HIV omotača sadrži domen trimerizacije, sintetički protein HIV omotača sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19, sa ili bez signalne sekvence (tj. aminokiselinskih ostataka 1-29 od SEQ ID NO: 19). Ova otelotvorenja sa domenima trimerizacije su uglavnom korisna za rastvorljive varijante ektodomaina sintetičkog proteina HIV omotača. U određenim otelotvorenjima takvih rastvorljivih varijanti pronalaska, moguće je mutirati mesto cepanja furina (npr. mutacija Lys do Glu-a na položaju 480 u SEQ ID NO: 8) da se to mesto cepanja inaktivira, tako da će protein biti jednostruki lanac; ovo se dobro kombinuje sa domenom trimerizacije, posebno sa GCN4 domenom trimerizacije od SEQ ID NO: 19.

[0045] Alternativne verzije takvih rastvorljivih ektodomenskih varijanti sintetičkog proteina HIV omotača bez upotrebe domena trimerizacije takođe su otelotvorenja pronalaska i mogu se pripremiti iz SEQ ID NO: 8 kombinovanjem mutacija koje optimizuju mesto cepanja furina (zamenjujući Gly-Lys dipeptid na položajima 479-480 od četiri Arg ostatka), kao i takozvane SOSIP mutacije (I>P mutacija na položaju 529, i uvođenje disulfidnog mosta između položaja 471 i 575 zamenom odgovarajućih Ala i Thr na tim položajima u SEQ ID NO: 8, svaki sa Cys ostatkom). Ovo primenjuje protein koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 sa narednom kombinacijom mutacija: EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C.

[0046] Jedna moguća modifikacija za dalje povećanje sadržaja trimera u sintetičkom proteinu HIV omotača predmetnog pronalaska (koji sadrži SEQ ID NO: 8) je modifikacija Ile u Pro na položaju 529. Ovo može biti efikasno i za rastvorljive i za membranski-vezane varijante.

Vektori

[0047] Naredni opšti aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na vektore koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira sintetički protein HIV omotača. Prema otelotvorenjima pronalaska, vektori mogu sadržati bilo koji od ovde opisanih sintetičkih proteina HIV omotača. U poželjnom otelotvorenju pronalaska, vektor sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, ili SEQ ID NO: 19, i još poželjnije SEQ ID NO: 18.

[0048] Prema otelotvorenjima pronalaska, nukleinska kiselina koja kodira sintetički protein HIV omotača operativno je povezana sa promoterom, što znači da je nukleinska kiselina pod kontrolom promotera. Promoter može biti homologni promoter (tj. izveden iz istog genetskog izvora kao vektor) ili heterologni promoter (tj., izveden iz drugog vektora ili genetskog izvora). Primeri pogodnih promotera uključuju promoter citomegalovirusa (CMV) i promoter Rous Sarcoma virusa (RSV). Poželjno, promoter se nalazi ispred nukleinske kiseline unutar kasete eksprimiranja. Primer CMV promoterske sekvence koja se može operativno povezati sa nukleinskom kiselinom koja kodira sintetički protein HIV omotača prikazan je u SEQ ID NO: 24.

[0049] Prema otelotvorenjima pronalaska, vektor može biti vektor eksprimiranja. Vektori eksprimiranja uključuju, ali nisu ograničeni na, vektore eksprimiranja rekombinantnog proteina i vektor za isporuku nukleinske kiseline pacijentu za eksprimiranje u tkivu pacijenta, kao što je virusni vektor. Primeri virusnih vektora koji su pogodni za upotrebu sa pronalaskom uključuju, ali nisu ograničeni na vektore adenovirusa, adeno-pridružene virusne vektore, vektore pox virusa, MVA vektore, vektor enteričkog virusa, vektore venecuelanskog konjskog encefalitisa, vektore Semliki Forest virusa, vektore duvanskog mozaičnog virusa, lentivirusne vektori itd. Vektor takođe može biti nevirusni vektor. Primeri nevirusnih vektora uključuju, ali nisu ograničeni na plazmide, bakterijske veštačke hromozome, veštačke hromozome kvasca, bakteriofage itd.

[0050] U nekim otelotvorenjima pronalaska, vektor je vektor adenovirusa. Adenovirus prema pronalasku pripada porodici Adenoviridae, i poželjno pripada rodu Mastadenovirus. Može biti ljudski adenovirus, ali i adenovirus koji inficira druge vrste, uključujući goveđi adenovirus (npr. goveđi adenovirus 3, BAdV3), pseći adenovirus (npr. CAdV2), svinjski adenovirus (npr. PAdV3 ili 5) ili simijanski adenovirus (koji uključuje adenovirus majmuna i adenovirus čovekolikog majmuna, kao što je adenovirus šimpanze ili adenovirus gorile). Poželjno, adenovirus je ljudski adenovirus (HAdV, ili AdHu), ili simijanski adenovirus poput adenovirusa šimpanze ili gorile (ChAd, AdCh, ili SAdV). U pronalasku, ljudski adenovirus podrazumeva se ako se navodi kao Ad bez naznake vrsta, npr. kratko navođenje

„Ad26“ znači isto što i HadV26, koji je ljudski adenovirusni serotip 26. Takođe, kako se ovde koristi, navođenje „rAd“ znači rekombinantni adenovirus, npr., „rAd26“ se odnosi na rekombinantni ljudski adenovirus 26.

[0051] Većina naprednih studija je rađena korišćenjem ljudskih adenovirusa, i ljudski adenovirusi su poželjni u skladu sa određenim aspektima pronalaska. U nekim poželjnim otelotvorenjima, rekombinantni adenovirus prema pronalasku je zasnovan na ljudskom adenovirusu. U poželjnim otelotvorenjima, rekombinantni adenovirus zasnovan je na ljudskom adenovirusnom serotipu 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49, 50, 52, itd. Prema posebno poželjnom otelotvorenju pronalaska, adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26. Prednost ovih serotipova je niska seroprevalencija i/ili nizak prethodno postojeći titar neutralizujućih antitela u ljudskoj populaciji i iskustvo upotreba kod ljudi u kliničkim ispitivanjima.

[0052] Simijanski adenovirusi uglavnom imaju nisku seroprevalenciju i/ili nizak prethodno postojeći titar neutralizujućih antitela u ljudskoj populaciji, i značajan deo rada je prijavljen korišćenjem vektora adenovirusa šimpanze (npr. US6083716; WO 2005/071093; WO 2010/086189; WO 2010085984; Farina i dr, 2001, J Virol 75: 11603-13 [13]; Cohen i dr, 2002, J Gen Virol 83: 151-55 [69]; Kobinger i dr, 2006, Virology 346: 394-401 [70]; Tatsis i dr., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17 [71]; pogledati takođe pregled od Bangari and Mittal, 2006, Vaccine 24: 849-62 [72]; i pregled od Lasaro and Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39 [73]). Stoga, u drugim otelotvorenjima, rekombinantni adenovirus prema pronalasku zasnovan je na simijanskom adenovirusu, npr. adenovirus šimpanze. U nekim otelotvorenjima, rekombinantni adenovirus zasnovan je na simijanskom adenovirusu tipa 1, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,1, 28,1, 29, 30, 31,1, 32, 33, 34, 35,1, 36, 37,2, 39, 40,1, 41,1, 42,1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50 ili SA7P.

[0053] Poželjno, vektor adenovirusa je rekombinantni virusni vektor sa nedostatkom replikacije, poput rAd26, rAd35, rAd48, rAd5HVR48, itd.

[0054] U poželjnom otelotvorenju predmetnog pronalaska, vektori adenovirusa sadrže kapsidne proteine retkih serotipova, uključujući Ad26. U tipičnom otelotvorenju, vektor je rAd26 virus. „Kapsidni protein adenovirusa“ odnosi se na protein na kapsidi adenovirusa (npr. Ad26, Ad35, rAd48, rAd5HVR48 vektori) koji je uključen u određivanje serotipa i/ili tropizma određenog adenovirusa. Adenovirusni kapsidni proteini obično uključuju proteine vlakana, pentona i/ili heksona. Kako se ovde koristi, „kapsidni protein“ za određeni adenovirus, kao što je „Ad26 kapsidni protein“, može biti, na primer, himerni kapsidni protein koji uključuje bar deo Ad26 kapsidnog proteina. U nekim otelotvorenjima, kapsidni protein je ceo kapsidni protein Ad26. U nekim otelotvorenjima, heksoni, penton i vlakna su iz Ad26.

[0055] Stručnjak će prepoznati da se elementi izvedeni iz više serotipova mogu kombinovati u jednom rekombinantnom vektoru adenovirusa. Tako se može proizvesti himerni adenovirus koji kombinuje poželjna svojstva različitih serotipova. Stoga, u nekim otelotvorenjima, himerni adenovirus pronalaska može kombinovati odsustvo prethodno postojećeg imuniteta prvog serotipa sa karakteristikama kao što su temperaturna stabilnost, sklapanje, sidrenje, proizvodni prinos, preusmerena ili poboljšana infekcija, stabilnost DNK u ciljanoj ćelija i slično.

[0056] U nekim otelotvorenjima rekombinantni vektor adenovirusa koji je koristan u pronalasku potiče uglavnom ili u potpunosti iz Ad26 (tj., vektor je rAd26). U nekim otelotvorenjima adenovirus ima nedostatak replikacije, npr. zato što sadrži brisanje u E1 regionu genoma. Za adenoviruse koji potiču iz adenovirusa koji nisu iz grupe C, poput Ad26 ili Ad35, tipično je razmenjivanje E4-orf6 kodirajuće sekvence adenovirusa sa E4-orf6 od adenovirusa ljudske podgrupe C, kao što je Ad5. Ovo omogućava razmnožavanje takvih adenovirusa u dobro poznatim komplementarnim ćelijskim linijama koje eksprimiraju E1 gene Ad5, kao što su na primer 293 ćelije, PER.C6 ćelije i slično (pogledati, npr. Havenga, i dr., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; WO 03/104467). Međutim, takvi adenovirusi neće biti sposobni da se replikuju u ne-komplementarnim ćelijama koje ne eksprimiraju E1 gene od Ad5.

[0057] Priprema rekombinantnih vektora adenovirusa je dobro poznata u struci. Priprema rAd26 vektora je opisana, na primer, u WO 2007/104792, i kod Abbink i dr., (2007) Virol 81(9): 4654-63. Primeri genomskih sekvenci od Ad26 nalaze se u GenBank Accession EF 153474 i u SEQ ID NO: 1 od WO 2007/104792. Primeri vektora korisnih za pronalazak, na primer, uključuju one opisane u WO2012/082918.

[0058] Tipično, vektor koristan u predmetnom pronalasku se proizvodi upotrebom nukleinske kiseline koja sadrži ceo rekombinantni adenovirusni genom (na primer., vektor plazmida, kosmida ili bakulovirusa). Prema tome, pronalazak takođe pruža izolovane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju vektore adenovirusa predmetnog pronalaska. Molekuli nukleinske kiseline predmetnog pronalaska mogu biti u obliku RNK ili u obliku DNK dobijeni kloniranjem ili proizvedeni sintetički. DNK može biti dvolančana ili jednolančana.

[0059] Vektori adenovirusa koji su korisni u pronalasku su tipično replikaciono deficitarni. U ovim otelotvorenjima, virus čini da replikacija bude deficitarna brisanjem ili inaktivacijom regiona koji su kritična za replikaciju virusa, kao što je E1 region. Regioni mogu biti značajno izbrisani ili inaktivirani, na primer, umetanjem gena od interesa, kao što je gen koji kodira sintetički protein HIV omotača (obično povezan sa promoterom) ili gen koji kodira HIV antigeni polipeptid (obično povezan sa promoterom) u regionu. U nekim otelotvorenjima, vektori pronalaska mogu sadržati brisanja u drugim regionima, kao što su E2, E3 ili E4 regioni, ili umetanje heterolognih gena povezanih sa promoterom unutar jednog ili više od ovih regiona. Za E2- i/ili E4-mutirane adenoviruse, uglavnom se E2- i/ili E4-komplementarne ćelijske linije koriste za generisanje rekombinantnih adenovirusa. Mutacije u E3 regionu adenovirusa ne moraju biti dopunjene ćelijskom linijom, jer E3 nije potreban za replikaciju.

[0060] Linija ćelija za pakovanje se obično koristi za proizvodnju dovoljnih količina vektora adenovirusa za upotrebu u pronalasku. Ćelija za pakovanje je ćelija koja sadrži one gene koji su izbrisani ili inaktivirani u vektoru sa replikacionim deficitom, omogućavajući tako da se virus replicira u ćeliji. Pogodne ćelijske linije za pakovanje adenovirusa sa brisanjem u E1 regionu uključuju, na primer, PER.C6, 911, 293 i E1 A549.

[0061] Prema otelotvorenjima predmetnog pronalaska, kao što je prethodno napomenuto, bilo koji od ovde opisanih sintetičkih proteina HIV omotača može se eksprimirati u vektorima pronalaska. S obzirom na degeneraciju genetskog koda, stručnjak je svestan da se može načiniti nekoliko sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju isti protein, po postupcima koji su u praksi potpuno rutinski. Nukleinska kiselina koja kodira sintetički protein HIV omotača može po izboru biti optimizovana kodonom kako bi se osiguralo pravilno eksprimiranje u tretiranom domaćinu (npr. kod čoveka). Optimizacija kodona je tehnologija koja se široko primenjuje u nauci. Neki neograničavajući primeri sekvenci koje kodiraju sintetički protein HIV omotača predmetnog pronalaska nalaze se u SEQ ID NO: 25, 26 i 27. Obično se nukleinska kiselina koja kodira sintetički protein HIV omotača klonira u E1 i/ili E3 region adenovirusnog genoma.

[0062] U poželjnom otelotvorenju predmetnog pronalaska, vektor je vektor adenovirusa, i poželjnije rAd26 vektor, najpoželjnije rAd26 vektor sa barem brisanjem u E1 regionu adenovirusnog genoma, npr. kao što je opisano kod Abbink, J Virol, 2007.81(9): p.4654-63, koji je ovde uključen referencom.

[0063] Pronalazak takođe pruža ćelije, poželjno izolovane ćelije, koje sadrže bilo koji od ovde opisanih vektora. Ćelije se mogu koristiti za proizvodnju rekombinantnih proteina ili za proizvodnju virusnih čestica.

[0064] Otelotvorenja pronalaska se, takođe, odnose na postupak pravljenja sintetičkog HIV antigenog polipeptida. Postupak obuhvata transfekciju ćelije domaćina vektorom eksprimiranja koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sintetički HIV antigeni polipeptid operativno povezan sa promoterom, uzgajanje transfektovane ćelije pod uslovima pogodnim za eksprimiranje sintetičkog HIV antigenog polipeptida i izolovanje sintetičkog HIV antigenog polipeptida iz ćelija. Sintetički HIV antigeni polipeptid se može izolovati ili prikupiti iz ćelije bilo kojim poznatim postupkom, uključujući afinitetnu hromatografiju, itd. Tehnike korišćene za eksprimiranje rekombinantnih proteina u smislu predmetnog obelodanjenja biće dobro poznate stručnjaku.

[0065] Pronalazak takođe uključuje postupak za proizvodnju vektora koji kodira sintetički HIV antigeni polipeptid pronalaska, gde postupak uključuje kultivisanje ćelije koja sadrži vektor, za širenje i umnožavanje vektora tokom pomenute kultivacije i izolovanja vektora koji kodira sintetički HIV antigeni polipeptid predmetnog pronalaska iz ćelijske kulture, npr iz ćelija, iz medijuma kulture ili oboje. Vektor se može dalje prečišćavati postupcima poznatim u struci.

[0066] U određenim otelotvorenjima, pronalazak pruža vektor prema otelotvorenju predmetnog pronalaska koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sintetički HIV antigeni polipeptid, i u određenim primerima otelotvorenja nukleinska kiselina ima nukleotidnu sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 25, 26 i 27.

Sastavi

[0067] U drugom opštem aspektu, pronalazak se odnosi na sastav koji sadrži vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sintetički protein HIV omotača i nosač. Prema otelotvorenjima pronalaska, bilo koji od vektora ovde opisanih može biti uključen u sastav. Poželjno, vektor je virusni vektor, poželjnije vektor adenovirusa, i još poželjnije vektor adenovirusa 26. U poželjnom otelotvorenju, sastav sadrži vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26 koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 18, ili SEQ ID NO: 19, i poželjnije aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18.

[0068] U jednom aspektu, pronalazak pruža kombinovanu vakcinu koja sadrži jedan ili više vektora koji zajedno sadrže sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju (i) sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 (npr. SEQ ID NO: 18 ili 19) i (ii) drugi protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5. Vektori mogu biti u zasebnom sastavu ili biti kombinovani u jednom sastavu. Obe nukleinske kiseline u vektoru (i) su predviđene da se primenjuju jednom pacijentu, što će rezultovati imunim odgovorom na HIV koji je širi od imunog odgovora koji bi se dobio primenom bilo kog vektora samog. Obe sekvence nukleinske kiseline takođe mogu biti prisutne na jednom pojedinačnom vektoru.

[0069] Prema otelotvorenjima pronalaska, sastav sadrži imunogeno efikasnu količinu vektora, kao što je virusni vektor. Kako se ovde koristi, „imunogeno efikasna količina“ ili „imunološki efikasna količina“ znači količina smeše dovoljna da indukuje željeni imuni efekat ili imuni odgovor kod pacijenta kom je to potrebno. U jednom aspektu, imunogeno efikasna količina znači količinu dovoljnu da indukuje imuni odgovor kod pacijenta kom je to potrebno. U drugom otelotvorenju, imunogeno efikasna količina znači količinu dovoljnu za stvaranje imuniteta kod pacijenta kom je to potrebno, npr., pružanje zaštitnog efekta protiv bolesti poput virusne infekcije. Imunogeno efikasna količina može da varira u zavisnosti od različitih faktora, kao što su fizičko stanje pacijenta, uzrast, težina, zdravstveno stanje itd.; određena primena u pitanju, bilo da indukuje imuni odgovor ili pruža zaštitni imunitet; specifični rekombinantni vektor koji se primenjuje; imunogen ili antigeni polipeptid kodiran rekombinantnim vektorom; specifični antigeni polipeptid koji se primenjuje; i određena bolest u pitanju, npr. virusna infekcija, za koju se želi imunitet. Imunogeno efikasna količina u smislu predmetnog obelodanjenja može lako da se odredi od strane stručnjaka.

[0070] Kao opšte smernice, imunogeno efikasna količina kada se koristi u odnosu na rekombinantni virusni vektor, kao što je vektor adenovirusa, može biti u opsegu od oko 10<8>čestica virusa do oko 10<12>čestica virusa, na primer 10<8>, 10<9>, 10<10>, 10<11>, ili 10<12>čestica virusa. Imunogeno efikasna količina može se primeniti u jednom sastavu ili u više sastava, kao što je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 sastava (npr. tablete, kapsule ili injekcije), gde primena više kapsula ili injekcija kolektivno pruža pacijentu imunogeno efikasnu količinu. Generalno, kada se koristi u odnosu na polipeptid, kao što je izolovan antigeni polipeptid, imunogeno efikasna količina može biti u rasponu, npr. oko 0,3 do oko 3000 mikrograma (µg), npr.1-1000 µg, npr.10-500 µg, npr. oko 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ili 500 µg. Kao neograničavajući primer, moguće je kombinovati primenu vektora koji kodira sintetički HIV Env antigen predmetnog pronalaska (koji ima SEQ ID NO: 8) sa primenom Env polipeptida, npr.250 µg virusa HIV grana C Env trimer proteina sa aminokiselinama 30-708 SEQ ID NO: 7. Takođe je moguće primenjivati pacijentu imunogeno efikasnu količinu, i potom primenjivati drugu dozi imunogeno efikasne količine istom pacijentu, u takozvanom režimu prajmera-pojačanja. Ovaj opšti koncept režima prajmera-pojačanja dobro je poznat stručnjacima u oblasti vakcine. Dalje primene za pojačanje mogu se po potrebi dodati režimu.

[0071] Sastavi predmetnog pronalaska dalje sadrže nosač. Nosač može da sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa kao što su veznici, agensi za dezintegraciju, agensi za bubrenje, agensi za suspendovanje, emulgatori, agensi za vlaženje, lubrikanti, arome, zaslađivači, konzervansi, boje, solubilizatori i obloge. Precizna priroda nosača ili drugog materijala može zavisiti od puta primene, npr., intramuskularni, potkožni, oralni, intravenski, kožni, intramukozni (npr. creva), intranazalni ili intraperitonealni putevi. Za tečne preparate za injekcije, na primer, suspenzije i rastvore, pogodni nosači i aditivi uključuju vodu, glikole, ulja, alkohole, konzervanse, agense za bojenje i slično. Za čvrste oralne preparate, na primer, prahove, kapsule, kaplete, gelkape i tablete, pogodni nosači i aditivi uključuju skrob, šećere, razblaživače, granulacione agense, lubrikante, veznike, agensa za dezintegraciju i slično. Za nazalne sprejeve/smeše inhalatora, vodeni rastvor/suspenzija može da sadrži vodu, glikole, ulja, emolijense, stabilizatore, agense za vlaženje, konzervanse, arome, ukuse i slično kao pogodne nosače i aditive.

[0072] Sastavi predmetnog pronalaska mogu se formulisati u bilo kojoj materiji pogodnoj za primenu pacijentu kako bi se olakšala primena i poboljšala efikasnost, uključujući, ali ne ograničavajući se na, oralnu (enteralnu) primenu i parenteralne injekcije. Parenteralne injekcije uključuju intravensku injekciju ili infuziju, intraarterijsku injekciju, subkutanu injekciju, intramuskularnu injekciju i intraartikularnu injekciju. Sastavi predmetnog pronalaska mogu se takođe formulisati za druge načine primene, uključujući transmukoznu, okularnu, rektalnu primenu, implantaciju dugog dejstva, sublingvalnu primenu, pod jezik, primenu koja iz oralne sluznice zaobilazeći portalnu cirkulaciju, inhalaciju ili intranazalnu primenu.

[0073] Prema određenim otelotvorenjima pronalaska, sastav sadrži imunogeno efikasnu količinu prečišćenog ili delimično prečišćenog vektora adenovirusa, kao što je vektor adenovirusa 26, koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sintetički protein HIV omotača pronalaska. Spomenuti sastavi mogu se formulisati kao vakcina (koja se takođe naziva i „imunogeni sastav“) prema postupcima dobro poznatim u struci.

[0074] Sastavi predmetnog pronalaska mogu dodatno da sadrže adjuvans za poboljšanje imunih odgovora. Izrazi „adjuvans“ i „imuno stimulansi“ su ovde korišćeni naizmenično i definisani su kao jedna ili više supstanci koje izazivaju stimulaciju imunog sistema. U ovom kontekstu, adjuvans se koristi za pojačavanje imunog odgovora na vektore koji kodiraju sintetičke proteine HIV omotača pronalaska i/ili HIV antigene polipeptide koji se koriste u kombinaciji sa vektorima koji kodiraju sintetičke proteine HIV omotača predmetnog pronalaska.

[0075] Adjuvansi koji su pogodni za upotrebu prema pronalasku treba da budu potencijalno bezbedni, da se dobro podnose i da su efikasni kod ljudi, kao što su na primer QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, B-alethine, MPC-026, optimal, CpG ODN, Betafectin, aluminijumske soli (npr. AdjuPhos), Adjuplex i MF59. Optimalni odnosi svake komponente u formulaciji mogu se odrediti tehnikama koje su u smislu predmetnog obelodanjenja dobro poznate stručnjacima.

[0076] U poželjnom otelotvorenju, adjuvans je aluminijumska so, kao što je AdjuPhos.

[0077] Priprema i upotreba imunogenih sastava su dobro poznati uobičajenom stručnjaku. Tečni farmaceutski sastavi uglavnom sadrže tečni nosač kao što su voda, nafta, životinjska ili biljna ulja, mineralno ulje ili sintetičko ulje. Takođe se mogu dodati fiziološki rastvor, dekstroza ili drugi saharidni rastvor ili glikoli, poput etilen glikola, propilen glikola ili polietilen glikola.

[0078] Na primer, rekombinantni vektor adenovirusa može se smestiti u pufer koji se takođe koristi za svetski standard adenovirusa (Hoganson i dr., 2002, Bioprocessing J 1:43-8): 20 mM Tris pH 8, 25 mM NaCl, 2,5% glicerola. Naredni korisni pufer za adenovirusni oblik pogodan za primenu na ljudima je 20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 25 mM NaCl, saharoza 10% w/v, polisorbat-800,02% vwv. Drugi pufer za formulaciju koji je pogodan za rekombinantni adenovirus sadrži 10-25 mM citratnog pufera pH 5,9-6,2, 4-6% (w/w) hidroksipropil-betaciklodekstrin (HBCD), 70-100 mM NaCl, 0,018-0,035% (w/w) polisorbat-80, i opciono 0,3-0,45% (w/w) etanol. Očigledno je da se mogu koristiti mnogi drugi puferi, i poznato je nekoliko primera pogodnih formulacija za skladištenje i za farmaceutsku primenu prečišćenih vektora.

[0079] Prema otelotvorenjima pronalaska, sastav predmetnog pronalaska može se koristiti zajedno sa jednim ili više dodatnih vektora koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida i/ili jedan ili više izolovanih HIV antigenih polipeptida. Dodatni vektori i/ili HIV antigeni polipeptidi mogu biti prisutni u istom sastavu koji sadrži sintetički protein HIV Env predmetnog pronalaska. Takođe mogu da budu prisutni u jednom ili više različitih sastava koji se mogu koristiti zajedno sa sastavom koja sadrži sintetički HIV Env protein predmetnog pronalaska u kombinaciji vakcine. Poželjno, jedan ili više dodatnih vektora su virusni vektori, kao što su vektori adenovirusa, i najpoželjnije su vektori adenovirusa 26. Jedan ili više dodatnih vektora mogu kodirati bilo koji HIV antigeni polipeptid koji je u smislu predmetnog obelodanjenja poznat stručnjacima.

[0080] U jednom otelotvorenju, sastav ili kombinacija vakcine dalje sadrže drugi vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira HIV antigeni polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5. Prednost takvih otelotvorenja je povećana širina imunog odgovora (pokrivajući sojeve iz grana B i C).

[0081] U drugom otelotvorenju, sastav ili kombinacija vakcine predmetnog pronalaska dalje sadrži vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira HIV antigeni polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 (mos1GagPol).

[0082] U drugom otelotvorenju, sastav ili kombinacija vakcine predmetnog pronalaska dalje sadrži vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira HIV antigeni polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29 (mos2GagPol).

[0083] U određenom otelotvorenju, sastav ili kombinacija vakcine predmetnog pronalaska dalje sadrži drugi vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira HIV antigeni polipeptid, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i jedan ili više dodatnih vektora adenovirusa, poželjno vektore adenovirusa 26, koji kodiraju jedan ili više HIV antigenih polipeptida koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 28 ili SEQ ID NO: 29. Na primer, sastav ili kombinacija vakcine prema jednom aspektu predmetnog pronalaska može da sadrži četiri vektora adenovirusa, poželjno vektore adenovirusa 26, gde prvi vektor kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 (npr. SEQ ID NO: 18); drugi vektor kodira HIV antigeni polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; treći vektor kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; i četvrti vektor kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29.

[0084] U nekim otelotvorenjima, sastav ili kombinacija vakcine dalje sadrže jedan ili više izolovanih HIV antigenih polipeptida. Bilo koji HIV antigeni polipeptid koji je u smislu predmetnog obelodanjenja poznat stručnjacima može se dalje uključiti u sastav ili kombinaciju vakcina predmetnog pronalaska, uključujući, ali ne ograničavajući se na protein HIV omotača (npr. Gp160, gp140, gp120 ili gp41), poželjno stabilizovani trimerni gp140 protein, kao što je stabilizovani protein gp140 grane C ili grane A. U poželjnom otelotvorenju, izolovani HIV antigeni polipeptid je stabilizovan HIV trimerni gp140 protein grane C, kao onaj koji sadrži ostatke 30-708 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7 (ostaci 1-29 SEQ ID NO: 7 su u signalnoj sekvenci). Alternativni ili dodatni HIV Env polipeptid koji bi mogao da se koristi pored gp140 proteina grane C ili sam, je mozaični Env trimer protein, na primer koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je obelodanjeno u aminokiselinama 30-724 od SEQ ID NO: 36 (što odgovara SEQ ID NO: 2 od WO 2014/107744, ostaci 1-29 SEQ ID NO: 36 su u signalnoj sekvenci).

[0085] Prema posebnom otelotvorenju pronalaska, HIV antigeni protein može biti sintetički protein HIV omotača pronalaska. Prema tome, sintetički protein omotača prema predmetnom pronalasku može se koristiti u izolovanom i/ili prečišćenom obliku kako bi se indukovao imuni odgovor ili pružio zaštitni imunitet, itd. protiv HIV kod pacijenta kom je to potrebno. Bilo koji od ovde opisanih sintetičkih proteina omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 može se koristiti kao HIV antigeni protein u izolovanom i/ili prečišćenom obliku. U poželjnom otelotvorenju, kada se koristi u izolovanom obliku kao HIV antigeni protein, sintetički protein omotača sadrži ostatke 30-711 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18 ili ostatke 30-686 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 19, i poželjnije ostatke 30-704 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18. Izolovani HIV antigeni polipeptid takođe može da sadrži SEQ ID NO: 8 sa narednim mutacijama: EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C.

[0086] Otelotvorenja pronalaska se takođe odnose na sastave ili kombinacije vakcina koje sadrže izolovani sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8. Bilo koji od ovde opisanih sintetičkih proteina HIV omotača može se koristiti. U posebnim otelotvorenjima pronalaska, izolovani sintetički protein HIV omotača sadrži ostatke 30-704 ili 30-711 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18, ostatke 30-686 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 19, ili aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 8 sa narednim mutacijama: EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C. Takvi sastavi ili kombinacije vakcina mogu dalje da sadrže jedan ili više vektora eksprimiranja, npr. vektore adenovirusa, kao što su vektori adenovirusa 26, koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida, kao što su sintetički proteini HIV omotača predmetnog pronalaska, ili drugi HIV antigeni proteini, kao što su drugi kao oni navedeni u SEQ ID NO: 4, 5, 7, 28 ili 29, ili njihovi fragmenti.

[0087] Pronalazak se takođe odnosi na postupak proizvodnje smeše ili kombinacije vakcine predmetnog pronalaska. Prema otelotvorenjima pronalaska, postupak proizvodnje sastava ili kombinacije sadrži kombinovanje vektora koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sintetički protein HIV omotača predmetnog pronalaska sa nosačem, i opciono jedan ili više dodatnih vektora koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida i/ili jedan ili više izolovanih HIV antigenih polipeptida. Stručnjak će biti upoznat sa konvencionalnim tehnikama koje se koriste za pripremu takvih sastava.

Vakcina i kombinacije vakcina

[0088] Prema otelotvorenjima pronalaska, smeša može biti vakcina. Kako se ovde koristi, izraz „vakcina“ odnosi se na sastav koji sadrži vektor eksprimiranja, poželjno virusni vektor, koji kodira sintetički protein HIV omotača pronalaska koji može pružiti zaštitni imunitet ili zaštitni imuni odgovor pacijentu, ili vakcinisati pacijenta. Prema otelotvorenjima pronalaska, nakon davanja smeše pacijentu, vektor eksprimiranja eksprimira kodirani sintetički protein HIV omotača, i eksprimirani sintetički protein HIV omotača je predstavljen imunom sistemu pacijenta, izazivajući tako potreban odgovor kako bi proizveo imunitet ili izazivajući imuni odgovor.

[0089] Prema tome, u drugom opštem aspektu, pronalazak pruža vakcinu za indukciju imunog odgovora protiv virusa humane imunodeficijencije (HIV) kod pacijenta. Prema otelotvorenjima pronalaska, vakcina sadrži sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu vektora eksprimiranja koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, i poželjno aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18. Poželjno, vektor eksprimiranja je virusni vektor, poželjnije vektor adenovirusa, i najpoželjnije vektor adenovirusa 26.

[0090] Prema otelotvorenjima pronalaska, „indukovanje imunog odgovora“ kada se koristi u odnosu na ovde opisane postupke i sastave obuhvata pružanje zaštitnog imuniteta i/ili vakcinisanje pacijenta protiv infekcije, kao što je HIV infekcija, u profilaktičke svrhe, kao i izazivanje željenog imunog odgovora ili efekta kod pacijenta, kom je to potrebno, protiv infekcije, kao što je HIV infekcija, u terapeutske svrhe. Poželjno, postupci predmetnog pronalaska su u profilaktičke svrhe, kao što su pružanje zaštitnog imuniteta. Imuni odgovor može biti ćelijski imuni odgovor i/ili humoralni imuni odgovor.

[0091] Kako se ovde koristi, izraz „zaštitni imunitet“ ili „zaštitni imuni odgovor“ znači da je vakcinisani pacijent u stanju da kontroliše infekciju patogenim agensom protiv kog je učinjena vakcinacija. Obično, pacijent koji je razvio „zaštitni imuni odgovor“ razvija samo blage do umerene kliničke simptome ili uopšte nema simptoma. Obično, pacijent koji ima „zaštitni imuni odgovor“ ili „zaštitni imunitet“ protiv određenog agensa neće umreti kao posledica infekcije navedenim agensom.

[0092] Prema otelotvorenjima pronalaska, sastavi vakcine mogu dalje da sadrže jedan ili više dodatnih vektora, npr. virusne vektora, kao što su vektori adenovirusa, poželjno vektori adenovirusa 26, koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida i/ili jedan ili više izolovanih HIV antigenih polipeptida. Sintetički protein HIV omotača, dodatni vektori i/ili jedan ili više izolovanih HIV antigenih polipeptida mogu da se formulišu u istom sastavu ili jednom ili više različitih sastava u vakcini.

[0093] Pronalazak se takođe odnosi na kombinacije vakcina za prajmer i pojačavanje imunog odgovora na jednu ili više HIV grana kod pacijenta koji ima potrebu za korišćenjem jednog ili više vektora u kombinaciji sa izolovanim antigenim polipeptidom. Prema tome, u drugom opštem aspektu, pronalazak pruža kombinaciju vakcina za indukciju imunog odgovora na HIV kod pacijenta. Prema otelotvorenjima pronalaska, kombinacija vakcine sadrži:

(i) prvi sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu vektora eksprimiranja koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 8 koja ima jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koju čine (a) I529P, (b) K480E i (c) kombinacije EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C, i nosača; i

(ii) drugi sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu izolovanog HIV antigenog polipeptida i nosač,

gde je jedan od prvog i drugog sastava namenjen za osnovne imunizacije, dok je drugi za pojačavanje imunizacije.

[0094] Prema otelotvorenjima pronalaska, kombinacija vakcine opciono dalje sadrži imunogeno efikasnu količinu jednog ili više dodatnih vektora eksprimiranja koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida. Jedan ili više dodatnih vektora eksprimiranja mogu biti uključeni u prvi sastav ili drugi sastav, ili jedan ili više dodatnih vektora eksprimiranja mogu biti uključeni u jedan ili više dodatnih sastava koje se primenjuju zajedno sa prvim i/ili drugim sastavom.

[0095] Kako se ovde koristi, izrazi „ko-isporuka“, „ko-primena“ ili „primenjuje se zajedno sa“ odnose se na istovremeno primenu dve ili više komponenti, kao što je virusni vektor eksprimiranja i izolovani antigeni polipeptid, ili više virusnih vektora eksprimiranja.

„Istovremena primena“ može biti primenu dve ili više komponenti najmanje u toku istog dana. Kada se dve komponente „primenjuju zajedno sa“, mogu se primenjivati u odvojenim sastavima sekvencijalno u kratkom vremenskom periodu, kao što su 24, 20, 16, 12, 8 ili 4 sata, ili u roku od jednog sata ili manje, ili mogu biti primenjivani u istom sastavu istovremeno.

[0096] U konkretnim otelotvorenjima kombinacije vakcine predmetnog pronalaska, prvi sastav sadrži vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; i izolovani HIV antigeni polipeptid sadrži ostatke 30-708 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7 ili ostatke 30-724 od SEQ ID NO: 36. U jednom određenom otelotvorenju, prvi sastav dalje sadrži vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira HIV antigeni polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5. U drugom određenom otelotvorenju, prvi sastav dalje sadrži jedan ili više dodatnih vektora adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida koji sadrže aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 28 i 29.

[0097] Naredni opšti aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na komplet koji sadrži kombinaciju vakcine prema otelotvorenju pronalaska.

[0098] Ostala otelotvorenja sintetičkog proteina HIV omotača, vektora eksprimiranja, dodatnih vektora eksprimiranja, HIV antigenih polipeptida kodiranih vektorima eksprimiranja, i izolovanog HIV antigenog polipeptida itd., koja se mogu koristiti u kombinacijama vakcina predmetnog pronalaska, detaljno su razmotrena iznad i u ilustrativnim primerima u nastavku.

Postupak izazivanja zaštitnog imuniteta protiv HIV infekcije

[0099] Pronalazak se takođe odnosi na postupak izazivanja imunog odgovora na jednu ili više HIV grana kod pacijenta kom je potrebno. Ovde opisani postupci uključuju postupke premazivanja i pojačavanja imunog odgovora korišćenjem jednog ili više vektora eksprimiranja u kombinaciji sa jednim ili više izolovanih antigenih polipeptida.

[0100] U jednom opštem aspektu, postupak izazivanja imunog odgovora protiv virusa humane imunodeficijencije (HIV) kod pacijenta obuhvata primenu pacijentu sastava koji sadrži imunogeno efikasnu količinu vektora eksprimiranja koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8. Bilo koji od ovde opisanih sastava može se koristiti u postupku izazivanja imunog odgovora na HIV kod pacijenta. Poželjno, sastav sadrži vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sintetički protein HIV omotača, sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18. Sastav može dalje da sadrži jedan ili više dodatnih vektora koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida i/ili jedan ili više dodatnih izolovanih HIV antigenih polipeptida.

[0101] U drugom opštem aspektu, postupak izazivanja imunog odgovora protiv virusa humane imunodeficijencije (HIV) kod pacijenta sadrži:

(i) primenu pacijentu prvog sastava koji sadrži imunogeno efikasnu količinu vektora eksprimiranja koji kodira mozaični protein HIV omotača koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 8 koja ima jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koju čine (a) I529P, (b) K480E i (c) kombinacije EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C, i nosača;

(ii) primenu pacijentu drugog sastava koji sadrži imunogeno efikasnu količinu izolovanog HIV antigenog polipeptida i nosača; i

(iii) opciono, primenu pacijentu imunogeno efikasne količine jednog ili više dodatnih vektora eksprimiranja koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida, gde se koraci (i) i (ii) izvode u bilo kom redosledu, gde je jedan od koraka za osnovnu imunizaciju i drugi korak je za pojačavanje imunizacije. Prema otelotvorenjima pronalaska, opciona, efektivna količina jednog dodatnog vektora eksprimiranja se primenjuje zajedno sa prvim sastavom ili drugim sastavom. U poželjnom otelotvorenju, opciona efektivna količina jednog ili više dodatnih vektora eksprimiranja se primenjuje zajedno sa prvim sastavom.

[0102] U posebnom otelotvorenju postupka izazivanja imunog odgovora, prvi sastav sadrži vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 i drugi vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira HIV antigeni polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; drugi sastav sadrži izolovani HIV antigeni polipeptid koji ima ostatke 30-708 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7 ili ostatke 30-724 od SEQ ID NO: 36; i jedan ili više dodatnih vektora eksprimiranja su vektori adenovirusa, poželjno vektori adenovirusa 26, koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida koji sadrže aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 28 i 29; gde se prvi sastav daje pacijentu, zajedno sa jednim ili više dodatnih vektora eksprimiranja, jedan ili više puta kod osnovne imunizacije, i drugi sastav se primenjuje pacijentu jednom ili više puta za pojačavanje imunizacije.

[0103] Primena imunogenih sastava koji sadrže vektore eksprimiranja i/ili antigene polipeptide je obično intramuskularna, intradermalna ili subkutana. Međutim, mogu se navesti i drugi načini primene, poput intravenske, rektalne, kožne, oralne, nazalne, itd.

Intramuskularna primena imunogenih sastava može se postići korišćenjem igle za davanje injekcijom suspenzije vektora eksprimiranja, npr. vektori adenovirusa i/ili antigeni polipeptidi. Alternativa je upotreba uređaja za injekcije bez iglica za primenu sastave (koristeći, na primer, Biojector™) ili prašak osušen smrzavanjem, koji sadrži vakcinu.

[0104] Za intramuskularnu, intravensku, kutanu ili subkutanu injekciju, ili injekciju na mestu bola, vektor će biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora koji nije pirogen i ima pogodan pH, izotoničnost i stabilnost. Isto tako, izolovani antigeni polipeptid biće u obliku parenteralno prihvatljivog rastvora koji ima pogodan pH, izotoničnost i stabilnost. Stručnjaci su u stanju da pripreme pogodne rastvore koristeći, na primer, izotonične nosače kao što su injekcija natrijum hlorida, Ringerova injekcija, laktairana Ringerova injekcija. Konzervansi, stabilizatori, puferi, antioksidansi i/ili drugi aditivi mogu biti uključeni, prema potrebi. Formulacija sa sporim otpuštanjem može se takođe koristiti.

[0105] Tipično, primena sastava vakcine u skladu sa otelotvorenjima predmetnog pronalaska imaće profilaktički cilj da se generiše imuni odgovor na HIV antigen pre infekcije ili razvoja simptoma. U drugim otelotvorenjima, vektori eksprimiranja, npr. vektori adenovirusa i/ili HIV antigeni polipeptidi se mogu primeniti za profilaksu posle izlaganja.

[0106] Imunogeni preparati koji sadrže vektore eksprimiranja, npr. vektore adenovirusa i/ili antigene polipeptide se primenjuju pacijentu, što izaziva anti-HIV imuni odgovor kod pacijenta. Količina smeše dovoljna da indukuje detektovan imuni odgovor je definisana kao „imunogeno efikasna doza“ ili „imunogeno efikasna količina.“ U tipičnom otelotvorenju predmetnog pronalaska, imuni odgovor je zaštitni imuni odgovor.

[0107] Stvarna količina koja se primenjuje, brzina i vremenski tok primene zavisiće od prirode i ozbiljnosti tretmana. Propisivanje tretmana, npr. odluke o doziranju itd., u nadležnosti je lekara opšte prakse i drugih lekara, ili u veterinarskom kontekstu veterinara, i obično uzima u obzir poremećaj koji treba tretirati, stanje pojedinačnog pacijenta, mesto primene, način primene i druge faktori koji su poznati stručnjacima. Primeri gore navedenih tehnika i protokola mogu se naći u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, Osol, A. ed., 1980.

[0108] Nakon proizvodnje vektora adenovirusa i opcione formulacije takvih čestica u sastavima, vektori se mogu primeniti kod pojedinca, posebno čoveka ili drugog primata. Dostava sisaru koji nije čovek ne mora biti u terapeutske svrhe, ali može biti korišćena u eksperimentalnom kontekstu, na primer u istraživanju mehanizma imunog odgovora na sintetički protein HIV omotača eksprimiran od strane vektora adenovirusa pronalaska.

[0109] U jednom otelotvorenju opisanih postupaka, jedan ili više vektora adenovirusa koji kodiraju jedan ili više HIV antigenih polipeptida koriste se za izazivanje imunog odgovora. Jedan ili više izolovanih HIV antigenih polipeptida može da se koristi zajedno sa jednim ili više vektora adenovirusa za osnovne imunizacije. Osnovna imunizacije može se primeniti samo jednom, ali opciono se takođe može primenjivati više puta, na primer, početna primena prajmera u vremenu 0, nakon čega sledi druga primena prajmera oko 4-14 nedelja, npr.4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ili 14 nedelja, ili bilo koje vreme između, posle inicijalne primene prajmera. Jedan ili više izolovanih HIV antigenih polipeptida, opciono zajedno sa jednim ili više dodatnih adenovirusa ili drugih vektora koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih antigena mogu se koristiti za pojačavanje imunog odgovora. Pojačana imunizacija se takođe može primeniti jedanput ili više puta, na primer, najpre oko 18-36, npr.18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ili 36 nedelja, ili bilo koje vreme između, posle inicijalne primene prajmera, i zatim sledila druga primena pojačavanja na oko 36-52, npr 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ili 60 nedelja ili bilo koje vreme između, nakon inicijalne primene prajmera. Prati se imuni odgovor indukovan imunizacijom.

[0110] Otelotvorenja obelodanjenih postupaka takođe razmatraju kraće režime prajmerapojačanja, što znači da se konačno pojačavanje imunizacije primenjuje oko 22-26 nedelja nakon inicijalne primene prajmera. Imunizacija se može primeniti u nedelji 0. Pojačana imunizacija može se primenjivati više puta, na primer, najpre oko 7-9 nedelja ili 11-13 nedelja, ili oko 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ili 14 nedelja, ili bilo koje vreme između, nakon inicijalne primene prajmera, praćeno drugom primenom pojačavanja oko 22-26 nedelja, ili oko 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ili 28 nedelja, ili bilo koje vreme između, nakon inicijalne primene prajmera. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više izolovanih HIV antigenih polipeptida primenjuje se zajedno sa jednim ili više vektora adenovirusa za osnovne i/ili pojačane imunizacije.

[0111] Stručnjaci sa lakoćom shvataju da se režim primenjivanja i pojačavanja može podesiti na osnovu izmerenih imunih odgovora nakon primene. Na primer, sastavi za pojačavanje obično se primenjuju nedeljama ili mesecima nakon sastava za prajming, na primer, oko 2-3 nedelje ili 4 nedelje, ili 8 nedelja, 16 nedelja, 20 nedelja, ili 24 nedelje, ili 28 nedelja ili 30 nedelja ili 32 nedelje ili jedne do dve godine nakon primene sastava za prajming.

[0112] Prema otelotvorenjima predmetnog pronalaska, adjuvans se može primeniti zajedno sa izolovanim HIV antigenim polipeptidom kao deo prajminga i/ili pojačavanja imunizacije. Bilo koji adjuvans se može koristiti u smislu predmetnog obelodanjenja, i u određenim otelotvorenjima je adjuvans aluminijumska so, kao što je AdjuPhos.

[0113] U poželjnom otelotvorenju predmetnog pronalaska, vektori adenovirusa koji se koriste u ovde opisanim postupcima uključuju rAd26 vektor. Poželjno, rAd26 vektor koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 ili SEQ ID NO: 19, najpoželjnije SEQ ID NO: 18, koristi se za prajming imunog odgovora, sam ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih rAd26 vektora koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida, poput mos1Env koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i izolovani HIV antigeni polipeptid, poput onog koji sadrži ostatke 30-708 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7 ili ostatke 30-724 od SEQ ID NO: 36, koristi se za pojačavanje imunog odgovora, ili obrnuto.

[0114] U jednom primernom otelotvorenju, rAd26 vektor koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 koristi se za prajming imunog odgovora u kombinaciji sa rAd26 vektorom koji kodira HIV antigeni polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5. Jedan ili više dodatnih rAd26 vektora koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida koji imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1-4, 28 i 29 takođe se mogu primeniti zajedno sa ostalim rAd26 vektorima kako bi izazvali imuni odgovor. primena prajmera u određenim otelotvorenjima se primenjuje dva puta pre nego što se primeni pojačanje imunizacije.

Izolovani HIV antigeni polipeptid, takav kakav sadrži ostatke 30-708 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7 (poželjno), ili onaj koji sadrži ostatke 30-724 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 36, ili kombinacija najmanje dva takva izolovana HIV antigena polipeptida, zatim se primenjuje kako bi se povećao imuni odgovor, i poželjno se primenjuje više puta. Poželjno, adjuvans se dalje primenjuje sa izolovanim antigenim polipeptidom za HIV u pojačanoj imunizaciji.

[0115] U posebnom otelotvorenju, imuni odgovor se primenjuje primenom četiri HIV antigena kodirana na vektorima adenovirusa, poželjno rAd26 vektorima, gde su četiri kodirana antigena: (i) sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18, (ii) polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, (iii) polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, i (iv) polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29. Svaki od ova četiri antigena može se kodirati na poseban vektor adenovirusa, poželjno rAd26 vektor, koji se primenjuje u ukupnoj dozi od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 x1010 virusnih čestica (vp), npr. oko 5x10<10>vp (za sve vektore zajedno). Vektori se mogu prethodno pomešati, npr. u odnosu 1:1:1:1. primena prajmera može se ponoviti nakon inicijalne primene prajmera, npr. na 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 nedelja nakon inicijalne primene prajmera. U ovom aspektu, imuni odgovor se pojačava primenom iste vakcine vektora adenovirusa koja se koristi za primenu prajmera zajedno sa izolovanim proteinima HIV Env gp140, npr. protein gp140 grane (sadrži ostatke 30-708 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7) ili mozaični protein gp140 (koji sadrži ostatke 30-724 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 36), ili protein gp140 grane i mozaični gp140 protein, u ukupnoj dozi od oko 50-300 µg proteina, npr 50, 100, 150, 200, 250 ili 300 mikrograma, ili bilo koja količina između, gp140 proteina grane C, ili npr.50, 100, 150, 200, 250 ili 300 mikrograma, ili bilo koja količina između, mozaičnog gp140 proteina, ili npr.50, 100, 150, 200, 250 ili 300 mikrograma, ili bilo koja količina između, kombinacije gp140 proteina grane C i mozaičnog gp140 proteina (npr. u odnosu 1:1, pomešani zajedno ili odvojeno primenjeni). Poželjno je da se gp140 protein primenjuje zajedno sa adjuvansom, npr. aluminijum fosfatom. Primena adenovirusa plus gp140 protein za pojačavanje imunog odgovora može se izvesti otprilike 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nedelja, ili u bilo koje vreme između, nakon inicijalne primene prajmera. Primena pojačavanja može se ponoviti, npr. oko 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 ili 54 nedelja, ili bilo koje vreme između, nakon inicijalne primene prajmera. Sve primene u skladu sa ovim otelotvorenjem poželjno se sprovode intramuskularnim putem.

Otelotvorenja

[0116]

Otelotvorenje 1 je nukleinska kiselina koja kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 8 koja ima jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koju čine (i) I529P, (ii) K480E i (iii) kombinacija EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C.

Otelotvorenje 2 je nukleinska kiselina prema otelotvorenju 1, gde sintetički protein HIV omotača dalje sadrži signalnu sekvencu, na primer signalnu sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 9 do 12, poželjno SEQ ID NO: 9.

Otelotvorenje 3 je nukleinska kiselina prema otelotvorenju 1 ili 2, gde sintetički protein HIV omotača dalje sadrži transmembranski domen, na primer transmembranski domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13, poželjno je da sintetički protein HIV omotača dalje sadrži SEQ ID NO: 37 koja se fuzioniše za C-terminus od SEQ ID NO: 8 i N-terminus transmembranskog domena. Otelotvorenje 4 je nukleinska kiselina prema otelotvorenju 3, gde sintetički protein HIV omotača dalje sadrži fragment citoplazmatičnog domena, poželjno fragment citoplazmatičnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, ili njene aminokiselinske ostatke 1-4 (tj. NRVR).

Otelotvorenje 5 je nukleinska kiselina bilo kog od prethodnih otelotvorenja 1-4, gde sintetički protein HIV omotača sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18. Otelotvorenje 6 je nukleinska kiselina prema otelotvorenju 1 ili 2, gde sintetički protein HIV omotača (a) dalje sadrži domen trimerizacije izabran iz grupe koju čine GCN4, fibritina (foldon domen), na primer domena trimerizacije koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 ili SEQ ID NO: 16, poželjno SEQ ID NO: 15 ili (b) sadrži SEQ ID NO: 8 sa kombinacijom narednih mutacija: EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C.

Otelotvorenje 7 je nukleinska kiselina prema otelotvorenju 6, gde sintetički protein HIV omotača sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19.

Otelotvorenje 8 je nukleinska kiselina prema otelotvorenju 5, gde se sintetički protein HIV omotača sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18.

Otelotvorenje 9 je nukleinska kiselina prema otelotvorenju 7, gde se sintetički protein HIV omotača sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 19.

Otelotvorenje 10 je vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema bilo kom otelotvorenju 1-9, gde je nukleinska kiselina operativno povezana sa promoterskom sekvencom.

Otelotvorenje 11 je vektor prema otelotvorenju 10, koji je virusni vektor, poželjno vektor adenovirusa, i poželjnije vektor adenovirusa 26.

Otelotvorenje 12 je izolovana ćelija koja sadrži vektor otelotvorenja 10 ili otelotvorenja 11.

Otelotvorenje 13 je sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu vektora iz otelotvorenja 10 ili patentnog zahteva 11 i nosač.

Otelotvorenje 14 je kombinacija vakcine, koja sadrži prvi sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu vektora adenovirusa, poželjno vektora adenovirusa 26, koja kodira sintetički protein HIV omotača koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18, i drugi sastav sadrži imunogeno efikasnu količinu drugog vektora adenovirusa, poželjno drugog vektora adenovirusa 26, koja kodira HIV antigeni polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 i opciono najmanje jedan dodatni sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu najmanje jednog člana odabranog iz grupe koju čine vektora koji kodira antigeni polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1-4, 28 i 29, i izolovani HIV antigeni polipeptid koji ima ostatke 30-708 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7, ili ostatke 30-724 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 36, gde su prvi sastav, drugi sastav i dodatni sastav prisutni u istom sastavu ili u jednom ili više različitih sastava.

Otelotvorenje 15 je postupak izazivanja imunog odgovora protiv virusa humane imunodeficijencije (HIV) kod pacijenta kom je to potrebno, gde postupak uključuje primenu pacijentu sastava otelotvorenja 13 ili kombinacije vakcine iz otelotvorenja 14.

Otelotvorenje 16 je sastav otelotvorenja 13 ili kombinacija vakcine iz otelotvorenja 14, koja sadrži vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18, drugi vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira antigeni polipeptid HIV koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, jedan ili više dodatnih vektora adenovirusa koji kodiraju jedan ili više dodatnih antigenih polipeptida koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1-4, 28 i 29, i izolovani HIV antigeni polipeptid koji sadrži ostatke 30-708 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7 ili ostatke 30-724 od SEQ ID NO: 36, za upotrebu u izazivanju imunog odgovora protiv virusa humane imunodeficijencije (HIV).

Otelotvorenje 17 je sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 8 koja ima jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koju čine (i) I529P, (ii) K480E i (iii) kombinacija EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C.

Otelotvorenje 18 je sintetički protein HIV omotača iz otelotvorenja 17, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 sa kombinacijom mutacija EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C, ili ostatke 30-704 sekvence aminokiseline SEQ ID NO: 18 ili ostatke 30-686 od SEQ ID NO: 19.

Otelotvorenje 19 je sastav otelotvorenja 13, koji dalje sadrži jedan ili više dodatnih vektora eksprimiranja koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida i/ili jedan ili više izolovanih HIV antigenih polipeptida.

Otelotvorenje 20 je sastav otelotvorenja 13 koji sadrži vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira sintetički protein HIV omotača koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18.

Otelotvorenje 21 je sastav prema otelotvorenju 20, koji dalje sadrži drugi vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira HIV antigeni polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i opciono jedan ili više dodatnih vektora adenovirusa, po mogućnosti vektore adenovirusa 26, koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1-4, 28 i 29.

Otelotvorenje 22 je postupak proizvodnje imunog odgovora protiv virusa humane imunodeficijencije (HIV) kod pacijenta kom je to potrebno, gde postupak uključuje primenu pacijentu sastava prema bilo kom otelotvorenju 19, 20 ili 21.

Otelotvorenje 23 je postupak za proizvodnju sastava ili kombinacije vakcina, koji uključuje kombinovanje vektora iz otelotvorenja 10 ili otelotvorenja 11 sa nosačem, i opciono jednim ili više dodatnih vektora koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida i/ili jedan ili više izolovanih HIV antigenih polipeptida u jednom ili više sastava, zajedno sa nosačem.

Otelotvorenje 24 je kombinacija vakcine za indukciju imunog odgovora protiv virusa humane imunodeficijencije (HIV) kod pacijenta, koja obuhvata:

(i) prvi sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu vektora eksprimiranja koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 8 koja ima jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koju čine (i) I529P, (ii) K480E i (iii) kombinacija EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C, i nosača; i

gde je jedan od prvog i drugog sastava namenjen osnovnoj imunizaciji, i drugi sastav je za pojačavanje imunizacije i

gde kombinacija vakcine opciono dalje sadrži imunogeno efikasnu količinu jednog ili više dodatnih vektora eksprimiranja koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida, i jedan ili više dodatnih vektora eksprimiranja su uključeni u prvi ili drugi sastav ili jedan ili više dodatnih sastava koji se koriste zajedno sa prvim ili drugim sastavom.

Otelotvorenje 25 je kombinacija vakcine prema otelotvorenju 24, gde prvi sastav sadrži vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; izolovani HIV antigeni polipeptid sadrži ostatke 30-708 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7, ili ostatke 30-724 od SEQ ID NO: 36; i jedan ili više dodatnih vektora eksprimiranja su vektori adenovirusa, poželjno vektori adenovirusa 26, koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida koji sadrže aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1-5, 28 i 29.

Otelotvorenje 26 je postupak izazivanja imunog odgovora protiv virusa humane imunodeficijencije (HIV) kod pacijenta kom je to potrebno, gde postupak sadrži: (i) primenu pacijentu prvog sastava koji sadrži imunogeno efikasnu količinu vektora eksprimiranja koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 8 koja ima jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koju čine (i) I529P, (ii) K480E i (iii) kombinacije EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C, i nosača;

(ii) primenu pacijentu drugog sastava koji sadrži imunogeno efikasnu količinu izolovanog HIV antigenog polipeptida i nosač; i

(iii) opciono, primenu pacijentu imunogeno efikasne količine jednog ili više dodatnih vektora eksprimiranja koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida, gde se koraci (i) i (ii) izvode u bilo kom redosledu, sa jednim od koraka za osnovnu imunizaciju i drugim korakom za pojačavanje imunizacije, i poželjno, opciono, efektivna količina još jednog dodatnog vektora eksprimiranja se primenjuje zajedno sa prvim sastavom. Otelotvorenje 27 je postupak prema otelotvorenju 26, gde prvi sastav sadrži vektor adenovirusa, poželjno vektor adenovirusa 26, koji kodira sintetički protein HIV omotača koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 i drugi vektor adenovirusa, poželjno i vektor adenovirusa 26, koji kodira HIV antigeni polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; drugi sastav sadrži izolovani HIV antigeni polipeptid koji ima ostatke 30-708 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7, ili ostatke 30-724 od SEQ ID NO: 36; i opciono jedan ili više dodatnih vektora eksprimiranja su vektori adenovirusa, poželjno vektori adenovirusa 26, koji kodiraju jedan ili više dodatnih HIV antigenih polipeptida koji sadrže aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 28 i 29; gde se prvi sastav primenjuje pacijentu, opciono zajedno sa jednim ili više dodatnih vektora eksprimiranja, jedan ili više puta za osnovnu imunizaciju, i drugi sastav se primenjuje pacijentu jednom ili više puta radi pojačavanja imunizacije.

Otelotvorenje 28 je sintetički protein HIV omotača koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18 ili SEQ ID NO: 19, sa ili bez signalne sekvence.

Otelotvorenje 29 je kombinacija vakcine koja sadrži jedan ili više vektora zajedno koji sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju (i) prvi sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 i (ii) drugi protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinu sekvencu SEQ ID NO: 5.

Otelotvorenje 30 je kombinacija vakcine prema otelotvorenju 29, gde prvi sintetički protein HIV omotača sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18.

Otelotvorenje 31 je kombinacija vakcine koja sadrži sledeće komponente:

(i) Ad26 vektor koji kodira sintetički protein HIV omotača koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18; i

(ii) Ad26 vektor koji kodira protein HIV omotača koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 5.

Otelotvorenje 32 je kombinacija vakcine prema otelotvorenju 31, koja dalje sadrži narednu komponentu:

(iii) Ad26 vektor koji kodira HIV antigene koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 28.

Otelotvorenje 33 je kombinacija vakcine prema otelotvorenju 31 ili 32, koja dalje sadrži narednu komponentu:

(iv) Ad26 vektor koji kodira HIV antigene koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 29.

Otelotvorenje 34 je kombinacija vakcine prema bilo kojoj otelotvorenju 31-33, koja dalje sadrži narednu komponentu:

(v) izolovani HIV antigeni polipeptid koji ima ostatke 30-708 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7, ili ostatke 30-724 iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 36, koji eventualno dalje sadrži adjuvans.

Otelotvorenje 35 je postupak izazivanja imunog odgovora protiv virusa humane imunodeficijencije (HIV) kod ljudskog pacijenta kom je to potrebno, gde postupak sadrži:

(a) primenu pacijentu: (i) vektora rAd26 koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; (ii) rAd26 vektora koji kodira antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; (iii) rAd26 vektora koji kodira antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; i (iv) rAd26 vektora koji kodira antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29; poželjno gde se rAd26 vektori primenjuju u odnosu od oko 1:1:1:1 u ukupnoj dozi od oko 1-10x10<10>virusnih čestica (vp), npr.5x10<10>vp;

(b) ponavljanje koraka (a) oko 10-14 nedelja, npr. 12 nedelja posle koraka (a);

(c) primenu pacijentu: (i) rAd26 vektora koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; (ii) rAd26 vektora koji kodira antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; (iii) rAd26 vektora koji kodira antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; (iv) rAd26 vektora koji kodira antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29; (v) izolovanog gp140 proteina HIV koji ima aminokiselinsku sekvencu 30-708 od SEQ ID NO: 7; i (vi) adjuvansa aluminijum fosfata; poželjno rAd26 vektori se primenjuju u odnosu od oko 1:1:1:1 u ukupnoj dozi od oko 1-10x10<10>virusnih čestica (vp), npr.

5x10<10>vp i gde se izolovani protein HIV gp140 primenjuje u dozi od oko 50-300 mikrograma, npr. 250 mikrograma; u približno 20-28 nedelja, npr. u roku od 24 nedelje nakon koraka (a); i

(d) ponavljanje koraka (c) otprilike 42-54 nedelje, npr. 48 nedelja nakon koraka (a). Otelotvorenje 36 je postupak izazivanja imunog odgovora na virus humane imunodeficijencije (HIV) kod ljudskog pacijenta kom je to potrebno, gde postupak sadrži:

(a) primenu pacijentu: (i) rAd26 vektora koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; (ii) rAd26 vektora koji kodira antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; (iii) rAd26 vektora koji kodira antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; i (iv) rAd26 vektora koji kodira antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29; poželjno gde se rAd26 vektori primenjuju u odnosu od oko 1:1:1:1 u ukupnoj dozi od oko 1-10x10<10>virusne čestice (vp), npr.5x10<10>vp;

(b) ponavljanje koraka (a) oko 10-14 nedelja, npr.12 nedelja posle koraka (a);

(c) primenu pacijentu: (i) rAd26 vektora koji kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; (ii) rAd26 vektora koji kodira antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; (iii) rAd26 vektora koji kodira antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; (iv) rAd26 vektora koji kodira antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29; (v) izolovanog gp140 proteina HIV koji ima aminokiselinsku sekvencu 30-708 od SEQ ID NO: 7; (vi) izolovanog HIV gp140 proteina koji ima aminokiselinsku sekvencu 30-724 od SEQ ID NO: 36; i (vii) adjuvansa aluminijum fosfata; poželjno gde se rAd26 vektori primenjuju u odnosu od oko 1:1:1:1 u ukupnoj dozi od oko 1-10x10<10>virusnih čestica (vp), npr.5x10<10>vp i gde se izolovani HIV gp140 proteini primenjuju u odnosu oko 1:1 u ukupnoj dozi od oko 50-300 mikrograma, npr.250 mikrograma; u približno 20-28 nedelja, npr. u roku od 24 nedelje nakon koraka (a); i

(d) ponavljanje koraka (c) otprilike 42-54 nedelje, npr.48 nedelja nakon koraka (a).

PRIMERI

Primer 1: Dizajn antigenih sekvenci virusa omotača

[0117] Konstruisano je nekoliko antigenih sekvenci HIV omotača sa sekvencom sličnom mozaičnom antigenu HIV2 mos2Env (SEQ ID NO: 6; prethodno takođe opisano u WO 2010/059732). Novo dizajnirane, membranski vezane sekvence zasnovane su na (kombinaciji) potpuno prirodnih sekvenci divljeg tipa iz proteina HIV omotača, ili na himernim mos2Env sekvencama i sekvencama divljeg tipa proteina HIV omotača. Pored sekvenci pune dužine proteina omotača (pogledati SLIKU 1A), takođe su dizajnirane sekvence koje imaju C-terminalno skraćenje citoplazmatičnog domena (pogledati, na primer, SLIKU 1C). pogledati takođe npr. Schiernle i dr., PNAS 1997; Abrahamyan i dr., J Virol 2005); Edwards i dr., J. Virology, 2002, 76:2683-2691. Rastvorljive varijante su takođe pripremljene pomoću C-terminalnog skraćenja pre transmembranskog (TM) regiona, koji je zamenjena domenom za trimerizaciju, kao što je domen trimerizacije GCN4 (pogledati npr. Sliku 1B). Ove rastvorljive varijante su dalje pretvorene u jednolančanu varijantu mutacijom mesta razdvajanja furina, čime je inhibirana obrada vanćelijskog domena proteina omotača u podjedinice gp120 i gp41.

[0118] Od svih gena koji su generisani i testirani, konstrukti zasnovani na C4 imali su najoptimalnija svojstva, npr. dobru obradivost, savijanje, imunogenost itd. i izabrani su za dalja ispitivanja. Takođe je generisana rastvorljiva varijanta C4 konstrukta koja ima domen trimerizacije GCN4 umesto transmembranskog domena (sC4, SLIKA 1B) i varijanta koja sadrži 7-aminokiselinski fragment citoplazmatičnog domena (C4D7, SLIKA 1C) je takođe testirana u daljim studijama. Aminokiselinske sekvence C4, sC4 i C4D7 su prikazane u SEQ ID NO: 17, 19 i 18, respektivno. Sekvence koje ih kodiraju prikazane su u SEQ ID NO: 25, 27 i 26, respektivno. Konstrukt C1 ima sekvencu vanćelijskog domena zasnovanu na mos2Env sekvenci (SEQ ID NO: 6). Takođe su generisane rastvorljiva varijanta konstrukta C1 koja ima domen trimerizacije GCN4 umesto transmembranskog domena (sC1) i varijanta koja sadrži 7-aminokiselinski fragment citoplazmatičnog domena (C1D7), sličan sC4 i C4D7 kao što je prikazano na SLIKAMA 1B i 1C. Konstrukt C1 i njegove varijante korišćeni su u daljim istraživanjima za poređenje, jer se oni u osnovi zasnivaju na mos2Env sekvenci prethodnog stanja tehnike. Aminokiselinske sekvence C1, sC1 i C1D7 su prikazane u SEQ ID NO: 31, 30, i 32, respektivno. Sekvence nukleinske kiseline koje ih kodiraju prikazane su u SEQ ID NO: 34, 33 i 35, respektivno. Ostali testirani konstrukti bili su manje optimalni od onih zasnovanih na konstruktu C4 i nisu uzeti u dalji razvoj.

Primer 2: Eksprimiranje i savijanje sintetičkih proteina HIV omotača

[0119] Izmereni su nivo eksprimiranja, savijanje i eksprimiranje sintetičkih proteina HIV omotača.

Nivoi eksprimiranja

[0120] HEK293F ćelije su prolazno transfektovane plazmidom koji kodira rastvorljive sintetičke proteine HIV omotača sC1 i sC4 kao što je opisano u Primeru 1. Nivoi eksprimiranja rastvorljivog proteina su mereni u supernatantu koristeći kvantitativni Western blot (KVB). Rezultati su prikazani na SLICI 2. Nizak nivo eksprimiranja za sC1 (koji u suštini odgovara mos2Env sa dodanim transmembranskim domenom) u skladu je s našim nedavnim saznanjima za mos2Env. Kao što su pokazali rezultati, sC4 varijanta predmetnog pronalaska pokazala je značajno veće nivoe eksprimiranja nego sC1 varijanta (kontrola).

Savijanje proteina

[0121] Savijanje proteina testirano je merenjem vezivanja rastvorljivih sintetičkih proteina HIV omotača za antitelo (MAb 17b) za koje se zna da vezuje mesto vezivanja ko-receptora od proteina HIV omotača, koje je izloženo tek nakon vezivanja CD4, enzimski-povezanim imunosorbentnim testom (ELISA). Konkretno, testirano je vezivanje prečišćenog sC4 za vezivanje za MAb 17b uz prethodno vezivanje sC4 za CD4 i bez prethodnog vezivanja sC4 za CD4. Prečišćeni sC1 je korišten kao kontrola. Vezivanje MAb 17b za sC4 bez prethodnog vezivanja CD4 za protein omotača je pokazatelj delimično nesavijenog ili prethodno aktiviranog proteina omotača (tj., nestabilnog Env koji prihvata „otvorenu“ konformaciju u odsustvu vezivanja za CD4). Rezultati ispitivanja ELISA prikazani su na SLIKAMA 3A i 3B.

[0122] Kao što je prikazano na SLICI 3B, sC4 pokazuje snažno vezivanje za MAb 17b sa prethodnim vezivanjem za CD4, ali nema detektabilnog vezivanja za MAb 17b bez prethodnog vezivanja za CD4. Suprotno tome, kao što je prikazano na SLICI 3A, sC1 je pokazao mnogo niže vezivanje za MAb 17, i sa i bez prethodnog vezivanja za CD4. Rezultati sugerišu da sC4 ima ispravan obrazac savijanja, bez izlaganja mesta vezivanja ko-receptora pre vezivanja za CD4.

[0123] Savijanje proteina je takođe analizirano nativnom poliforekrilamidnom elektroforezom (PAGE) za sC1 i sC4 radi procene kvaternarne strukture varijanti rastvorljivih proteina i mogućeg neispravnog formiranja mosta disulfida između promotera. Nakon elektroforeze nativnog gela, protein u gelu je otkriven Western blot analizom. Kao što su pokazuju rezultati na SLICI 4, većina sC4 je prisutna u trimernom stanju, što je ispravna kvartarna struktura.

[0124] Uzeti zajedno, rezultati eksperimenata sakupljanja proteina pokazuju da sC4 rastvorljivi sintetički protein HIV omotača ima željeni profil savijanja, koji je poboljšan u poređenju sa profilom savijanja postojećeg mos2Env antigena (predstavljenog sa sC1).

Eksprimiranje ćelijske površine

[0125] Takođe je proučavano eksprimiranje ćelijske površine membranski vezanih varijanti proteina HIV omotača C1 (puna dužine), C4 (puna dužina, pogledati SLIKU 1A), C1D7 i C4D7. HEK293T ćelije su prolazno transfektovane samo plazmidom koji kodira eGFP (negativna kontrola, NC), ili plazmidom koji kodira eGFP, zajedno sa konstruktom eksprimiranja koji kodira varijantu proteina HIV omotača. Dva dana nakon transfekcije, ćelije su podvrgnute fluorescencijom aktiviranom sortiranju ćelija (FACS) nakon izlaganja do nekoliko poli- i monoklonskih antitela usmerenih protiv gp120 i sekundarnih antitela, i zatim su ispitivane na nivoe eksprimiranja ćelijske površine proteina omotača. Kvalitet varijanti omotača je procenjen određivanjem ukupnih nivoa eksprimiranja korišćenjem anti-gp120 poliklonskog antitela i procenom relativnog vezivanja široko neutralizujućih antitela PG9 i PG16, koja su zavisna od kvartarne strukture, i poželjno se vezuju za pravilno savijeni trimer omotača.

[0126] Rezultati eksperimenata eksprimiranja ćelijske površine prikazani su na SLICI 5. Nivoi površinskog eksprimiranja skraćenih varijanti C1D7 i C4D7, mereni upotrebom antigp120 antitela, su mnogo veći od nivoa površinskog eksprimiranja njihovih pandana pune dužine, C1 i C4. Ovo potvrđuje da brisanje 144 ostataka sa karboksi-terminusa od Env povećava nivo površinskog eksprimiranja omotača. C4 konstrukata predmetnog pronalaska pune dužine takođe je pokazala poboljšano vezivanje PG9 i PG16 u poređenju sa C1 pune dužinom, sugerišući da je sekvenca omotača C4 pravilno savijena (tj., trimer) na ćelijskoj površini.

[0127] Rezultati takođe pokazuju da varijanta C1D7, koja je u osnovi Mos2Env sa dodatnim transmembranskim domenom i 7 aminokiselina citoplazmatičnog domena, može biti površinski eksprimirana na HEK293T ćelijama. To je u suprotnosti sa rastvorljivim konstruktom u Ad26.mos2Env, koji se ne može eksprimirati pri nivoima koji se mogu detektovati na površini kada se transfektuje do A549 ćelija. Međutim, relativno vezivanje za PG9 i PG16 je teško uočiti iznad pozadine, što sugeriše da je C1D7 sekvenca omotača slabo savijena i verovatno nije prisutna kao netaknuti trimer na površini ćelije.

[0128] Sveukupno, C4D7 varijanta omotača ima najoptimalniji profil vezivanja antitela, sa većim gp120 eksprimiranjem od njegovog pandana pune dužine C4, i sa više od 15 puta povećanim vezivanjem PG9 i PG16 u poređenju sa C1 i C1D7 (SLIKA 5).

Primer 3: Stabilnost vektora koji kodiraju sekvence HIV omotača

[0129] Prethodni radovi u našim laboratorijama (neobjavljeni) pokazali su da vektori adenovirusa 26 (Ad26) koji kodiraju sekvencu antigena mos2Env imaju relativno visoke odnose VP/IU (što ukazuje na niži kvalitet serija adenovirusnih proizvoda) i, takođe, takvi vektori su pokazali probleme sa stabilnošću. Shodno tome, bilo je važno testirati stabilnost konstrukata sintetičkih proteina omotača predmetnog pronalaska u adenovirusnoj pozadini.

[0130] Rekombinantni Ad26 (rAd26) vektori koji kodiraju HIV antigene sekvence pronalaska C4, C4D7 i sC4 kako je gore opisano u Primeru 1 generisani su u PER.C6 ćelijama (koje se nazivaju „rAd26.C4“, „rAd26.C4D7“ i „ rAd26.sC4“, respektivno).

Pokupljeni su vektorski klonovi (plakovi) i povećani za generacije istraživačkih serija.

Maksimalno 5 virusnih klonova (plakova) je smanjeno do T25 formata i serijski provučeno kroz 10 prolaza u T25 formatu (prolaza 1-3 su koraci transfekcije i prečišćavanja plaka, zatim 10 prolaza u T25 formatu, što rezultuje sa ukupno 13 prolaza). Genetska stabilnost procenjena je na broju prolaza virusa (vpn) 3, 5, 10 i 13 testom PCR transgene kasete E1, nakon čega je sledilo sekvencioniranje na vpn 13. Rezultati su prikazani na SLICI 6

[0131] RAd26 vektori koji kodiraju C4 pune dužine (rAd26.C4) pokazali su loše karakteristike rasta, što je utvrđeno nepotpunim citopatogenim efektom (CPE) za 2-3 dana; genetska nestabilnost, određena brisanjem regiona E1 transgenih kaseta; ili njihova kombinacije (SLIKA 6). Zbog loših karakteristika rasta i zapažene genetske nestabilnosti, ovaj vektor koji kodira C4 po čitavoj dužini nije dalje ispitivan.

[0132] Suprotno tome, za vektore rAd26 koji kodiraju C4D7 (rAd26.C4D7) i sC4 (rAd26.sC4), svi plakovi koji su se razmnožili su tokom eksperimenta ostali genetski stabilni (SLIKA 6). Prema tome, novi konstrukti sC4 i C4D7 nadmašuju originalne mos2Env konstrukte u pogledu stabilnosti u pozadini vektora adenovirusa. Ispitivanje genetske stabilnosti do vpn 13 predstavlja razmnožavanje nekoliko prelaza van onih koji se koriste u industrijskoj pripremi vektora.

Primer 4: Eksprimiranje i in vivo antigenost sekvenci HIV omotača u vektorima adenovirusa

[0133] Eksprimiranje i antigenost rAd26.C4D7 i rAd26.sC4 procenjena je odvojeno ili u kombinaciji sa rekombinantnim Ad26 vektorom koji kodira mos1Env (SEQ ID NO: 5) (u daljem tekstu „rAd26.mos1Env“) u A549 ćelijama transdukovanim vektorom (ljudska ćelijska linija) in vitro (podaci nisu prikazani). Analiza protočne citometrije pokazala je da su svi antigeni eksprimirani u ćelijskim kulturama transdukovani bilo sa 2x10<4>čestice virusa (vp) pojedinačnih antigena omotača kao kontrole, ili sa 1x10<4>vp od 2 kombinovana Env antigena transdukcijom adenovirusa. Sve transdukcije dodatno su sadržale pojedinačne doze (1x10<4>vp) vektora adenovirusa koji kodiraju mos1GagPol („rAd26.mos1GagPol“) i mos2GagPol („rAd26.mos2GagPol“) (Barouch i dr, Nat Med 2010, 16:319-323), tako da su procenjene kombinacije vektora pokazale iste relativne odnose različitih vektora adenovirusa kao što je namenjeno za pretkliničku i kliničku upotrebu. Poželjno, vektori koji kodiraju sintetičke proteine HIV omotača predmetnog pronalaska kombinuju se sa vektorima koji kodiraju mos1GagPol i mos2GagPol antigene za kliničku upotrebu.

[0134] Kombinacija rAd26.mos1Env i rAd26.C4D7 dala je maksimalnu pokrivenost procenjenih epitopa kako je određeno monoklonskim vezivanjem antitela. Posebno, izlaganje PG16 epitopu, koje je doprinelo transformacijom sa Ad26.C4D7, deluje obećavajuće za upotrebu kao vakcina pošto PG16 predstavlja široko neutralizujuće monoklonsko antitelo koje prepoznaje V1/V2 petlje regiona od HIV-1 Env (Walker i dr, Science.2009). Dakle, sintetički protein HIV omotača pronalaska dobijen iz C4 sekvence povećava širinu imunog odgovora protiv proteina HIV omotača u poređenju sa imunim odgovorom koji generiše samo mos1Env. Reakcije antitela izazvane vakcinom usmereni na proteinski region omotača su pokazale da su u korelaciji sa zaštitom od HIV-1 infekcija u RV144 studiji (Haynes i dr, N Engl J Med.2012), i stoga je sintetički protein omotača predmetnog pronalaska obećavajući kandidat koji će se uključiti u režim vakcinacije protiv HIV.

Primer 5: Imunogenost vektora koji kodiraju sintetičke proteine HIV omotača [0135] Sekvence sintetičkih proteina HIV omotača predmetnog pronalaska u vektoru Ad26 testirane su na zečevima kako bi se utvrdilo da li su ovi konstrukti imunogena alternativa rAd26.mos2Env konstruktu.

[0136] Imunogenost vektora adenovirusa koji kodira mos1Env (rAd26.mos1Env; SEQ ID NO: 5) testirana je sama, i u kombinaciji sa vektorima adenovirusa koji kodiraju sintetičke proteine HIV omotača predmetnog pronalaska (rAd26.C4D7 i rAd26.sC4; koji sadrže SEQ ID NO: 8, posebno SEQ ID NO: 18 i 19, respektivno). U svim slučajevima su takođe primenjeni vektori adenovirusa 26 koji kodiraju mos1GagPol i mos2GagPol antigene (rAd26.mos1GagPol [SEQ ID NO: 28] i rAd26.mos2GagPol [SEQ ID NO: 29], respektivno). Preciznije, imunogenost samog rAd26.mos1Env (trovalentna vakcina: rAd26.mos1GagPol, rAd26.mos2GagPol i rAd26.mos1Env) je upoređena sa imunogenošću rAd26.mos1Env u kombinaciji sa jednim od rAd26.C4D7 ili rAd26.sC4 (tetravalentna vakcina: primena bilo rAd26.mos1GagPol, rAd26.mos2GagPol, rAd26.mos1Env i rAd26.C4D7; ili primena rAd26.mos1GagPol, rAd26.mos2GagPol, rAd26.mos1Env i rAd26.sC4). Ovo poređenje trovalentne vakcine, kojoj nedostaju bilo koji vektori koji kodiraju sintetičke proteine HIV omotača predmetnog pronalaska, sa tetravalentnom vakcinom, koja sadrži vektore koji kodiraju sintetičke proteine HIV omotača predmetnog pronalaska, omogućava utvrđivanje da li će HIV proteini omotača pronalaska doprinosi širini zaštite.

[0137] Primena je izvršeno u režimima vakcinacije, gde su ti Ad26 vektori primenjeni u nedeljama 0 i 6 kao dvostruki prajmer, i gp140 protein grane C (trovalentni Env gp140 protein koji ima SEQ ID NO: 7 bez signalne peptidne sekvence ostataka 1- 29, pogledati takođe WO 2010/042942) u nedeljama 12 i 18 kao dvostruko pojačanje (pogledati npr. Barouch i dr, 2015, Science 349: 320-324). Tabela 1 opisuje režime vakcinacije korišćene za tekuću studiju. rAd26.Empty se odnosi na kontrolni vektor kom nedostaje bilo koji gen koji kodira sekvencu za HIV antigeni protein. Svaka grupa je sadržala šest zečeva.

Tabela 1: Režimi vakcina testirane u studiji imunogenosti na zečevima

[0138] Poređenje trovalentne Ad26 vakcine (kojoj nedostaje novi Env antigen predmetnog pronalaska) sa četverovalentnom Ad26 vakcinom (koja obuhvata nove sC4 ili C4D7 Env antigene) omogućava testiranje da li novi antigeni doprinose širini zaštite. Uspostavljeni test neutralizacije na bazi TZM-bl ćelija [Montefiori DC. Methods Mol Biol 2009,485:395-405; Sarzotti-Kelsoe M i dr., J Immunol Methods 2014,409:131-146] korišćen je za merenje neutralizacije aktivnosti kandidata za vakcinu.

[0139] Rezultati su prikazani na Slici 7, i statistički su analizirani korišćenjem trovalentne vakcine (grupa 1 u Tabeli 1) kao kontrolne grupe, i upoređujući svaku novu četvorovalentnu vakcinu (grupe 2 i 3 u Tabeli 1).

[0140] Sveukupno, novi C4-izvedeni (tj. koji kodiraju Env proteine koji sadrže SEQ ID NO: 8, što je alternativa za mos2Env) adeno konstrukti su imunogeni nakon dve homologne intramuskularne imunizacije kod zečeva.

[0141] Kapacitet neutralizacije zečjih imunih seruma protiv pseudovirusa Nivoa 1B je izostao (podaci nisu prikazani), što nije neočekivano, jer se znalo da je takve viruse teže

neutralizovati.

[0142] Dodavanje novih komponenti nije imalo uticaj na kapacitet neutralizacije pseudovirusa zečjeg imunog seruma protiv virusa grane B Nivoa 1A (podaci nisu prikazani). Ovo pokazuje da novi antigen nije negativno uticao na imunogenost postojećeg antigena grane B koji je prisutan u vakcini (iako su nove komponente bile usmerene na granu C, takvo neželjeno uplitanje nije moglo a priori biti isključeno pre nego što je testirano).

[0143] Kapacitet neutralizacije pseudovirusa zečjeg imunog seruma protiv virusa grane B Nivoa 1A je značajno pojačan u četverovalentnom novom C4D7 imunizacijom, koja sadrži adeno (četvorovalentna, grupa 2), u poređenju sa samom trovalentnom (koja ima samo mos1Env) imunizacijom (grupa 1) (Slika 7 panel B). Pored toga, kapacitet neutralizacije pseudovirusa zečjeg imunog seruma protiv virusa grane B Nivoa 1A u nedelji 8 značajno je poboljšana kod četvorovalentne nove sC4 imunizacije koja sadrži adeno (četvorovalentna, grupa 3) u poređenju sa samom trovalentnom (koja ima samo mos1Env) imunizacijom (grupa 1) (Slika 7 panel B).

[0144] Zaključno, C4D7 i sC4 konstrukti kodirani u Ad26 bili su imunogeni i njihovo dodavanje je proširilo sposobnost vezivanja i neutralizacije vakcine koja ima mos1Env (uglavnom granu B) kao jedinu Ad26-kodiranu Env komponentu, prema sojevima grane C (Slika 7B).

Primer 6: Imunogenost režima vakcine koji uključuju vektore koji kodiraju sintetičke proteine omotača predmetnog pronalaska

[0145] Jedna dalja studija na zečevima procenila je tetravalentnu vektorsku kombinaciju Ad26.Mos4.HIV (koja se sastoji od četiri vektora adenovirusa: Ad26.Mos1GagPol [kodira SEQ ID NO: 28], Ad26.Mos2GagPol [kodira SEQ ID NO: 29], Ad26.Mos1Env [kodira SEQ ID NO: 5] i Ad26.Mos2SEnv [naziv „C4D7“ kako se gore koristi takođe se naziva i „Mos2S“; ovaj vektor kodira novi SEQ ID NO: 18 prema pronalasku], u 1:1:1:1 smeši u ukupnoj dozi od 5x10<9>vp,) primenjeno intramuskularno kao dvostruka primarna imunizacija u nedeljama 0 i 6, u kombinaciji sa rekombinantnim HIV-1 Env proteinskim pojačavanjem korišćenjem gp140 grane C [koji ima sekvencu aminokiselinskih ostataka 30-708 od SEQ ID NO: 7], mozaičnog gp140 [koji ima sekvencu aminokiselinskih ostataka 30-724 od SEQ ID NO: 36] ili kombinaciju gp140 grane C i mozaičnog gp140, u nedeljama 13 i 19. Ova proteinska pojačavanja primenjeni su intramuskularno u ukupnoj dozi od 10 ili 50 mikrograma proteina kombinovanih sa 250 mcg adjuvansom aluminijum-fosfata

formulisanim na dan imunizacije.

[0146] Rezultati pokazuju da su svi testirani režimi bili imunogeni kod svih životinja, što je izazivalo visoke titre antitela i umerenu neutralizacijsku aktivnost protiv Nivoa 1 Env pseudotipiziranih virusa. Ako se mozaični gp140 koristio kao antigen za vakcinu, bilo sam ili u kombinaciji sa gp140 grane C, ELISA titri specifični za mozaični gp140 i prepoznavanje pseudovirusa grane B značajno su porasli u nedelji 15 u poređenju sa referentnom grupom pojačanom samo sa gp140 grane C. Ukupna veličina efekta poboljšanja je bila umerena i veća za grupu pojačanu bivalentnom kombinacijom gp140 grane C - mozaični gp140, u poređenju sa mozaičnim gp140. U nedelji 21 studije, ove razlike su izgubljene i imuni odgovori mereni za kohorte koje su primale pojačavanja sa bivalentnim gp140 grane C -mozaičnim gp140, ili pojačavanja sa monovalentnim gp140 grane C, nisu imali statističke razlike.

[0147] Dvovalentni režim proteina pokazao je uporedivu indukciju titara ELISA grane C i pseudovirusno prepoznavanje kao režim pojačavanja samim gp140 grane C, što ukazuje da uključivanje gran-B povezanog imunogena mozaičnog gp140 nije negativno uticalo na pokrivenost antigena grane C, istovremeno značajno pojačavajući pokrivenost grane B u nedelji 15 studije.

[0148] Podaci potvrđuju da se vektor Ad26.Mos2SEnv koji kodira sintetički Env antigen prema pronalasku može uspešno koristiti u režimima vakcinacije.

Claims

Patentni zahtevi

1. Nukleinska kiselina koja kodira sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 8 koja ima jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koju čine (i) I529P, (ii) K480E i (iii) kombinacije EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C.

2. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 1, gde sintetički protein HIV omotača dalje sadrži signalnu sekvencu, na primer, signalnu sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 9 do SEQ ID NO: 12.

3. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde sintetički protein HIV omotača dalje sadrži transmembranski domen, na primer, transmembranski domen koji sadrži SEQ ID NO: 13, poželjno sintetički protein HIV omotača koji dalje sadrži SEQ ID NO: 37 spojen na C-terminusu od SEQ ID NO: 8 i N-terminusu transmembranskog domena.

4. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 3, gde sintetički protein HIV omotača dalje sadrži fragment citoplazmatičnog domena, poželjno fragment citoplazmatičnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 ili njene ostatke 1-4.

5. Nukleinska kiselina prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva 1-4, gde sintetički protein HIV omotača sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18.

6. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde sintetički protein HIV omotača: (a) dalje sadrži domen trimerizacije, na primer domen trimerizacije koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 ili SEQ ID NO: 16; ili (b) sadrži SEQ ID NO: 8 koja ima kombinaciju mutacija EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C.

7. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 6, gde sintetički protein HIV omotača sadrži aminokiselinsku sekvencu ostataka 1-686 od SEQ ID NO: 19.

8. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, gde je nukleinska kiselina operativno povezana sa promoterskom sekvencom.

9. Vektor prema patentnom zahtevu 8, koji je virusni vektor, poželjno vektor adenovirusa.

10. Vektor prema patentnom zahtevu 9, gde je vektor adenovirusa ljudski vektor adenovirusnog serotipa 26 (Ad26).

11. Izolovana ćelija koja sadrži vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 8-10.

12. Sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu vektora prema bilo kom od patentnih zahteva 8-10, i nosač.

13. Kombinacija vakcine, koja sadrži:

(i) prvi sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu vektora adenovirusa, poželjno vektora adenovirusa 26, koji kodira sintetički protein HIV omotača koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, poželjno SEQ ID NO: 18;

(ii) drugi sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu drugog vektora adenovirusa, poželjno drugog vektor adenovirusa 26, koji kodira HIV antigeni polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i opciono

(iii) najmanje jedan dodatni sastav koji sadrži imunogeno efikasnu količinu barem jednog izabranog iz grupe koju čine

(iiia) vektor koji kodira najmanje jedan antigeni polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1-4, 28 i 29, i

(iiib) polipeptid koji sadrži imunogeno efikasnu količinu izolovanog HIV antigenog polipeptida koji ima ostatke 30-708 od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7, ili ostatke 30-724 od SEQ ID NO: 36,

gde su prvi sastav, drugi sastav i dodatni sastav prisutni u istom sastavu ili u jednom ili više različitih sastava.

14. Sastav prema patentnom zahtevu 12 ili kombinacija vakcine prema patentnom zahtevu 13, za primenu u izazivanju imunog odgovora protiv virusa humane imunodeficijencije (HIV) kod pacijenta kom je to potrebno.

15. Sintetički protein HIV omotača koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 8 koja ima jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koju čine (i) I529P, (ii) K480E i (iii) kombinacija EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C, koji poželjno sadrži (i) SEQ ID NO: 8 koja ima kombinaciju mutacija EK479-480RRRR, I529P, A471C i T575C; (ii) aminokiselinske ostatke 30-704 od SEQ ID NO: 18, ili (iii) aminokiselinske ostatke 30-686 od SEQ ID NO: 19.