RS59368B1

RS59368B1 - Fuzioni polipeptidi na bazi serpina i postupci za njihovu upotrebu

Info

Publication number: RS59368B1
Authority: RS
Inventors: Brendan P Eckelman; John C Timmer; Peter L Nguy; Grant B Guenther; Quinn Deveraux
Original assignee: Inhibrx Lp
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2012-06-28
Publication date: 2019-11-29
Also published as: CY1122195T1; JP2024138397A; RU2014102583A; US11827691B2; PL2726092T3; RU2727452C1; IL230209B; CA2839619A1; LT2726092T; US20130330769A1; JP6674604B2; US20130011398A1; JP2018008956A; AU2012275287B2; MX356517B; KR20230114318A; KR20140054000A; IL312872A; HRP20191652T1; SG10201811256QA

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na molekule, konkretno polipeptide, konkretnije fuzione proteine koji uključuju serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpinskog polipeptida i drugi polipeptid. Dodatno, pronalazak se odnosi na fuzione proteine koji uključuju serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpinskog polipeptida, drugi polipeptid, i treći polipeptid. Specifično, ovaj pronalazak se odnosi na fuzione proteine koji uključuju najmanje jedan serpinski polipeptid i drugi polipeptid ili fuzione proteine koji uključuju najmanje jedan serpinski polipeptid, drugi polipeptid, i treći polipeptid, pri čemu drugi i treći polipeptid u fuzionim proteinima pronalaska mogu da budu najmanje jedno od sledećeg: Fc polipeptid ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od Fc polipeptida; polipeptid usmeren na citokine ili sekvenca koja potiče od polipeptida usmerenog na citokine; polipeptid koji sadrži WAP domen ili sekvenca koja potiče od polipeptida koji sadrži WAP domen; ili polipeptid albumin ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od polipeptida serumskog albumina. Ovaj pronalazak takođe se odnosi na postupke za upotrebu takvih molekula u različitim terapijskim i dijagnostičkim indikacijama, kao i na postupke za proizvodnju takvih molekula.

Osnova pronalaska

[0002] Narušena aktivnost serin proteaze ili neravnoteža između proteaze i inhibitora proteaze može da dovede do uništavanja tkiva posredovanog proteazom i zapaljenskih odgovora. Prema tome, postoji potreba za terapeuticima i terapijama koje ciljno deluju na narušenu aktivnost serin proteaze i/ili neravnotežu između proteaze i inhibitora proteaze. Osim toga, poboljšana terapijska dejstva mogu se dobiti putem atenuacije narušenog signalnog puta citokina i aktivnosti serin proteaze. Dodatno, serpinski proteini su ispoljili antiinfektivne aktivnosti, dok se za ciljno delovanje na zapaljenske citokine pokazalo da povećava rizik od infekcije. Fuzioni proteini ovog pronalaska mogu potencijalno da ublaže zapaljensku aktivnost citokina i ograniče rizik od infekcije.

Suština pronalaska

[0003] Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima. Fuzioni proteini koji su ovde opisani uključuju najmanje serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpinskog polipeptida (Polipeptid 1) i drugi polipeptid (Polipeptid 2). Dodatno, ovde opisani fuzioni proteini uključuju serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpinskog polipeptida (Polipeptid 1), drugi polipeptid (Polipeptid 2), i treći polipeptid (Polipeptid 3). Kako se ovde koriste kao sinonimi, izrazi "fuzioni protein" i "fuzioni polipeptid" odnose se na serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpinskog polipeptida funkcionalno vezanu za najmanje drugi polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od najmanje drugog polipeptida. Pojedinačni elementi fuzionog proteina mogu da budu povezani na bilo koji od različitih načina, uključujući na primer, direktno spajanje, upotrebu posrednika ili peptida-spejsera, upotrebu linkerskog regiona, upotrebu zglobnog regiona ili upotrebu i linkerskog i zglobnog regiona. U nekim aspektima, linkerski region može da se nađe u okviru sekvence zglobnog regiona, ili alternativno, zglobni region može da se nađe u okviru sekvence linkerskog regiona. Poželjno, linkerski region je peptidna sekvenca. Na primer, linkerski peptid uključuje bilo koliko od nula do 40 aminokiselina, npr., od nula do 35 aminokiselina, od nula do 30 aminokiselina, od nula do 25 aminokiselina, ili od nula do 20 aminokiselina. Poželjno, zglobni region je peptidna sekvenca. Na primer, zglobni peptid uključuje bilo koliko od nula do 75 aminokiselina, npr., od nula do 70 aminokiselina, od nula do 65 aminokiselina ili od nula do 62 aminokiseline. U primerima izvođenja u kojima fuzioni protein uključuje i linkerski region i zglobni region, poželjno oba, i linkerski region i zglobni region su peptidna sekvenca. U ovim aspektima, zglobni peptid i linkerski peptid zajedno uključuju bilo koliko od nula do 90 aminokiselina, npr., od nula do 85 aminokiselina ili od nula do 82 aminokiseline.

[0004] U nekim aspektima, serpinski polipeptid i drugi polipeptid mogu da budu povezani preko intermedijarnog vezivnog proteina. U nekim aspektima, deo koji predstavlja serpin i deo koji predstavlja drugi polipeptid fuzionog proteina mogu da budu nekovalentno vezani.

[0005] U nekim aspektima, fuzioni proteini prema opisu mogu da imaju jednu od sledećih formula, u smeru od N-terminusa ka C-terminusu ili u smeru od C-terminusa ka N-terminusu:

Polipeptid 1(a)- zglobm- Polipeptid 2(b)

Polipeptid 1(a)- linkern- Polipeptid 2(b)

Polipeptid 1(a)- linkern- zglobm- Polipeptid 2(b)

Polipeptid 1(a)- zglobm- linkern- Polipeptid 2(b)

Polipeptid 1(a)- Polipeptid 2(b)- Polipeptid 3(c)

Polipeptid 1(a)- zglobm- Polipeptid 2(b)- zglobm- Polipeptid 3(c)

Polipeptid 1(a)- linkern- Polipeptid 2(b)- linkern- Polipeptid 3(c)

Polipeptid 1(a)- zglobm- linkern- Polipeptid 2(b)-zglobm- linkern- Polipeptid 3(c)Polipeptid 1(a)- linkern- zglobm- Polipeptid 2(b)- linkern- zglobm-Polipeptid 3(c)

gde je n ceo broj od nula do 20, gde je m ceo broj od 1 do 62 i gde su a, b, i c celi brojevi od najmanje 1. Ovi primeri izvođenja uključuju gornje formulacije i bilo koje njihove varijacije ili kombinacije. Na primer, redosled polipeptida u formulama takođe uključuje Polipeptid 3(c)-Polipeptid 1(a)- Polipeptid 2(b), Polipeptid 2(b)Polipeptid 3(c)- Polipeptid 1(a), ili bilo koju njegovu varijaciju ili kombinaciju.

[0006] U nekim aspektima, sekvenca Polipeptida 1 uključuje serpinski polipeptid. Serpini su grupa proteina sličnih struktura koji su prvi identifikovani kao niz proteina sposobnih da inhibiraju proteaze. Serpinski proteini pogodni za upotrebu u fuzionim proteinima koji su ovde dati uključuju, u smislu neograničavajućeg primera, alfa-1 antitripsin (AAT), protein srodan antitripsinu (SERPINA2), alfa 1-antihimotripsin (SERPINA3), kalistatin (SERPINA4), inhibitor monocit neutrofil elastaze (SERPINB1), PI-6 (SERPINB6), antitrombin (SERPINC1), inhibitor 1aktivatora plazminogena (SERPINE1), alfa 2-antiplazmin (SERPINF2), inhibitor komplementa 1 (SERPING1), i neuroserpin (SERPINI1).

[0007] U nekim aspektima, sekvenca Polipeptida 1 uključuje sekvencu polipeptida alfa-1 antitripsina (AAT) ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od AAT. U nekim aspektima, sekvenca Polipeptida 1 uključuje deo AAT proteina. U nekim aspektima, sekvenca Polipeptida 1 uključuje najmanje deo koji predstavlja petlju reaktivnog mesta AAT proteina. U nekim primerima izvođenja, deo koji predstavlja petlju reaktivnog mesta AAT proteina uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu: GTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNK SEQ ID NO: 1).

[0008] U poželjnim aspektima, sekvenca AAT polipeptida ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od AAT je, ili potiče od sekvence humanog AAT polipeptida.

[0009] U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein uključuje sekvencu cele dužine humanog AAT polipeptida koja ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

[0010] U nekim aspektima, fuzioni protein uključuje sekvencu humanog AAT polipeptida koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2.

[0011] U nekim aspektima, sekvenca AAT polipeptida je, ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od AAT polipeptida potiče od, jedne ili više od sekvenci humanog AAT polipeptida prikazanih u GenBank pod pristupnim br. AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP_001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172.1, i/ili AAA51547.1.

[0012] U nekim primerima izvođenja, fuzioni proteini sadrže jednu ili više mutacija. Na primer, fuzioni protein sadrži najmanje jednu mutaciju na metioninskoj (Met) rezidui u serpinskom delu fuzionog proteina. U ovim Met mutacijama, rezidua Met može da bude supstituisana bilo kojom aminokiselinom. Na primer, rezidua Met može da bude supstituisana aminokiselinom sa hidrofobnim bočnim lancem, kao što je, na primer, leucin (Leu, L). Bez želje za vezivanjem za neku određenu teoriju, Met mutacija/mutacije sprečava oksidaciju i posledičnu inaktivaciju inhibitorne aktivnosti fuzionih proteina pronalaska. U nekim primerima izvođenja, rezidua Met može da bude supstituisana naelektrisanom reziduom, kao što je, na primer, glutamat (Glu, E). U nekim primerima izvođenja, Met mutacija je na poziciji 358 u AAT polipeptidu. Na primer, Met mutacija je Met358Leu (M358L). U nekim primerima izvođenja, Met mutacija je na poziciji 351 u AAT polipeptidu. Na primer, Met mutacija je Met351Glu (M351E). U nekim primerima izvođenja, Met mutacija je na poziciji 351 i na poziciji 358 u AAT polipeptidu, na primer, Met mutacija je Met351Glu (M351E) i Met358Leu (M358L). Na primer, petlja reaktivnog mesta ove varijante fuzionog AAT polipeptida ima sledeću sekvencu: GTEAAGAEFLEAIPLS IPPEVKFNK (SEQ ID NO: 32). U nekim primerima izvođenja, Met mutacija je na poziciji 351 i na poziciji 358 u AAT polipeptidu, na primer, Met mutacija je Met351Leu (M351L) i Met358Leu (M358L). Na primer, petlja reaktivnog mesta ove varijante fuzionog AAT polipeptida ima sledeću sekvencu: GTEAAGALFLEAIPLS IPPEVKFNK (SEQ ID NO: 33).

[0013] U nekim aspektima, drugi polipeptid (Polipeptid 2) serpinskog fuzionog proteina je Fc polipeptid ili potiče od Fc polipeptida. Ovi aspekti se u ovom dokumentu zajednički nazivaju "fuzioni proteini serpin-Fc". Ovde opisani fuzioni proteini serpin-Fc uključuju najmanje serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpina i Fc polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od Fc polipeptida. U nekim aspektima, fuzioni protein serpin-Fc uključuje jedan serpinski polipeptid. U drugim aspektima, fuzioni proteini serpin-Fc uključuju više od jednog serpinskog polipeptida, i ovi primeri izvođenja su ovde zajednički nazvani "serpin -Fc fuzioni protein", pri čemu je ceo broj od najmanje 2. U nekim aspektima, svaki serpinski polipeptid u serpin -Fc fuzionom proteinu uključuje istu aminokiselinsku sekvencu. U drugim aspektima, svaki serpinski polipeptid u serpin -Fc fuzionom proteinu uključuje serpinske polipeptide sa različitim aminokiselinskim sekvencama. Serpinski polipeptidi serpin -Fc fuzionog proteina mogu da se nalaze na bilo kom položaju u fuzionom proteinu.

[0014] U nekim primerima izvođenja, serpinski polipeptid serpin-Fc fuzionog proteina uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu dela petlje reaktivnog mesta proteina AAT. U nekim primerima izvođenja, deo petlje reaktivnog mesta proteina AAT uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1. U nekim primerima izvođenja, serpinski polipeptid serpin-Fc fuzionog proteina uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu varijante dela petlje reaktivnog mesta proteina AAT. U nekim primerima izvođenja, varijanta dela petlje reaktivnog mesta proteina AAT uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32 ili SEQ ID NO:33. U nekim primerima izvođenja, serpinski polipeptid serpin-Fc fuzionog proteina uključuje najmanje celu dužinu sekvence humanog AAT polipeptida koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima serpinski polipeptid serpin-Fc fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog AAT polipeptida koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 ili 32 ili 33.

[0015] U nekim aspektima, serpinski polipeptid serpin-Fc fuzionog proteina uključuje sekvencu polipeptida AAT koja je, ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od AAT polipeptida koja potiče od, jedne ili više sekvenci humanih AAT polipeptida prikazanih u GenBank pod pristupnim br. AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP_001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172.1, i/ili AAA51547.1.

[0016] U nekim aspektima, Fc polipeptid fuzionog proteina je humani Fc polipeptid, na primer, sekvenca humanog IgG Fc polipeptida ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od sekvence humanog IgG Fc polipeptida. Na primer, u nekim aspektima, Fc polipeptid je humani IgG1 Fc polipeptid ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od sekvence humanog IgG1 Fc polipeptida. U nekim aspektima, Fc polipeptid je humani IgG2 Fc polipeptid ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od sekvence humanog IgG2 Fc polipeptida. U nekim aspektima, Fc polipeptid je humani IgG3 Fc polipeptid ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od sekvence humanog IgG3 Fc polipeptida. U nekim primerima izvođenja, Fc polipeptid je humani IgG4 Fc polipeptid ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od sekvence humanog IgG4 Fc polipeptida. U nekim aspektima, Fc polipeptid je humani IgM Fc polipeptid ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od sekvence humanog IgM Fc polipeptida.

[0017] U nekim aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje Fc polipeptid, Fc polipeptid fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog IgG1 Fc polipeptida koji ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

[0018] U nekim aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje Fc polipeptid, Fc polipeptid fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog IgG1 Fc polipeptida koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 3.

[0019] U nekim primerima izvođenja gde fuzioni protein pronalaska uključuje Fc polipeptid, Fc polipeptid je mutiran ili modifikovan tako da poboljšava vezivanje FcRn. U ovim primerima izvođenja mutirani ili modifikovani Fc polipeptid uključuje sledeće mutacije: Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu (M252Y, S256T, T256E) ili Met428Leu i Asn434Ser (M428L, N434S) pri upotrebi sistema numeracije po Kabatu. U nekim aspektima deo Fc polipeptida je mutiran ili drugačije modifikovan tako da narušava Fc-posredovanu dimerizaciju. U ovim aspektima, fuzioni protein je po prirodi monomer.

[0020] U nekim aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje Fc polipeptid, Fc polipeptid fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog IgG2 Fc polipeptida koja ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

[0021] U nekim aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje Fc polipeptid, Fc polipeptid fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog IgG2 Fc polipeptida koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 4.

[0022] U nekim aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje Fc polipeptid, Fc polipeptid fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog IgG3 Fc polipeptida koja ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

[0023] U nekim aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje Fc polipeptid, Fc polipeptid fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog IgG3 Fc polipeptida koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 5.

[0024] U nekim primerima izvođenja gde fuzioni protein pronalaska uključuje Fc polipeptid, Fc polipeptid fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog IgG4 Fc polipeptida koja ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

[0025] U nekim aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje Fc polipeptid, Fc polipeptid fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog IgG4 Fc polipeptida koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 6.

[0026] U nekim aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje Fc polipeptid, Fc polipeptid fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog IgM Fc polipeptida koja ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

[0027] U nekim aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje Fc polipeptid, Fc polipeptid fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog IgM Fc polipeptida koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 7.

[0028] U nekim aspektima fuzionih proteina koji su ovde dati, drugi polipeptid (Polipeptid 2) serpinskog fuzionog proteina je polipeptid usmeren na citokine ili potiče od polipeptida koji je usmeren na citokine. Ovi aspekti su ovde zajednički označeni kao "fuzioni proteini serpin-polipeptid usmeren na citokine". Fuzioni proteini serpin-polipeptid usmeren na citokine koji su ovde opisani uključuju najmanje serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpinskog polipeptida i polipeptid usmeren na citokine, ili njihove derivate. U nekim aspektima, fuzioni protein serpin-polipeptid usmeren na citokine uključuje jedan serpinski polipeptid. U drugim aspektima, fuzioni protein serpin-polipeptid usmeren na citokine uključuje više od jednog serpinskog polipeptida, i ovi primeri izvođenja su ovde zajednički označeni kao "fuzioni proteini

polipeptid usmeren na citokine", gde je ceo broj od najmanje 2. U nekim aspektima, svaki serpinski polipeptid u fuzionom proteinu serpin -polipeptid usmeren na citokine uključuje istu aminokiselinsku sekvencu. U drugim aspektima, svaki serpinski polipeptid fuzionog proteina serpin(a)-polipeptid usmeren na citokine uključuje serpinske polipeptide sa različitim aminokiselinskim sekvencama.

[0029] U nekim aspektima, polipeptid usmeren na citokine fuzionog proteina serpin-polipeptid usmeren na citokine je receptor za citokine ili potiče od receptora za citokine. U poželjnom aspektu, polipeptid usmeren na citokine ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od receptora za citokine je, ili potiče od sekvence humanog receptora za citokine. U drugim aspektima, polipeptid usmeren na citokine je antitelo ili fragment antitela, na primer anticitokinsko antitelo ili fragment anticitokinskog antitela. U poželjnim aspektima, polipeptid usmeren na citokine ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od antitela ili fragmenta antitela potiče od sekvence himernog, humanizovanog, ili potpuno humanog antitela. Pojam fragment antitela uključuje jednolančano antitelo, Fab fragment, F(ab’)2fragment, scFv, scAb, dAb, jednodomenski teški lanac antitela, i jednodomenski laki lanac antitela.

[0030] U drugim aspektima, polipeptid usmeren na citokine vezuje receptor za citokine i sprečava vezivanje citokina za receptor. U drugim aspektima, polipeptid usmeren na citokine je antitelo ili fragment antitela, na primer antitelo protiv receptora za citokine ili fragment antitela protiv receptora za citokine.

[0031] U nekim aspektima, serpinski polipeptid fuzionih proteina serpin-polipeptid usmeren na citokine uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu dela petlje reaktivnog mesta proteina AAT.

U nekim aspektima, deo petlje reaktivnog mesta proteina AAT uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1. U nekim aspektima, serpinski polipeptid fuzionih proteina serpinpolipeptid usmeren na citokine uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu varijante dela petlje reaktivnog mesta proteina AAT. U nekim aspektima, varijanta dela petlje reaktivnog mesta proteina AAT uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32 ili SEQ ID NO:33. U nekim aspektima, serpinski polipeptid fuzionog proteina serpin-polipeptid usmeren na citokine uključuje, ili potiče od najmanje cele dužine sekvence humanog AAT polipeptida koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima serpinski polipeptid fuzionog proteina serpinpolipeptid usmeren na citokine uključuje sekvencu humanog AAT polipeptida koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 ili 32 ili 33.

[0032] U nekim aspektima, serpinski polipeptid fuzionog proteina serpin-polipeptid usmeren na citokine uključuje sekvencu AAT polipeptida ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od AAT polipeptida koja je, ili potiče od jedne ili više sekvenci humanih AAT polipeptida prikazanih u GenBank pod pristupnim br. AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP_001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172.1, i/ili AAA51547.1.

[0033] Fuzioni protein serpin-polipeptid usmeren na citokine može da uključuje deo serpin-Fc fuzionog proteina. Na primer, antitelo sadrži Fc polipeptid. Prema tome, u nekim aspektima gde je polipeptid usmeren na citokine antitelo usmereno na citokine, fuzioni protein serpin-polipeptid usmeren na citokine će uključivati deo serpin-Fc fuzionog proteina. Osim toga, većina receptorskih fuzionih proteina koji su terapijski korisni su Fc fuzioni proteini. Prema tome, u nekim aspektima, gde je fuzioni protein serpin-polipeptid usmeren na citokine fuzioni protein serpin-receptor za citokine, fuzioni protein serpin-polipeptid usmeren na citokine može da uključuje Fc polipeptid pored serpinskog dela i dela receptora za citokine.

[0034] U nekim aspektima, gde fuzioni protein serpin-polipeptid usmeren na citokine uključuje sekvencu Fc polipeptida, sekvenca Fc polipeptida uključuje, ili potiče od aminokiselinske sekvence bilo koje od SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, ili 7. U nekim aspektima gde fuzioni protein serpin-polipeptid usmeren na citokine uključuje sekvencu Fc polipeptida, sekvenca Fc polipeptida ima najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa bilo kojom od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, ili 7. U nekim aspektima, serpinski polipeptid i polipeptid usmeren na citokine su funkcionalno povezani putem linkerskog regiona, na primer, glicin-serin linkera ili linkera na bazi glicina-serina. U nekim aspektima, serpinski polipeptid i polipeptid usmeren na citokine su funkcionalno povezani putem zglobnog regiona. U nekim aspektima, serpinski polipeptid i polipeptid usmeren na citokine su funkcionalno povezani putem linkerskog regiona i zglobnog regiona. U drugim aspektima, serpinski polipeptid i polipeptid usmeren na citokine su direktno spojeni.

[0035] U nekim primerima izvođenja fuzionih proteina koji su ovde opisani, drugi polipeptid (Polipeptid 2) serpinskog fuzionog proteina je polipeptid koji sadrži domen kiselog proteina surutke (WAP), ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od polipeptida koji sadrži WAP domen. Ovi primeri izvođenja su ovde zajednički označeni kao "fuzioni proteini serpin-WAP domen". Fuzioni proteini serpin-WAP domen uključuju najmanje serpinski polipeptid ili najmanje aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpina, polipeptid koji sadrži WAP domen ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida koji sadrži WAP domen. U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein serpin-WAP domen uključuje jedan serpinski polipeptid. U drugim primerima izvođenja, fuzioni protein serpin-polipeptid usmeren na WAP uključuje više od jednog serpinskog polipeptida. Ovi primeri izvođenja su ovde zajednički označeni kao "fuzioni proteini serpin -WAP domen", gde je ceo broj od najmanje 2. U nekim primerima izvođenja, serpinski polipeptidi fuzionog proteina serpin -WAP domen uključuju iste aminokiselinske sekvence. U drugim primerima izvođenja, serpinski polipeptidi fuzionog proteina serpin -polipeptid usmeren na citokine, uključuje serpinske polipeptide sa različitim aminokiselinskim sekvencama.

[0036] Ovi fuzioni proteini serpin-WAP domen uključuju polipeptid koji sadrži WAP domen ili polipeptidnu sekvencu koja je, ili potiče od polipeptida koji sadrži WAP domen. WAP domen je evolutivno očuvani motiv sekvence od 50 aminokiselina koji sadrži osam cisteina koji se nalaze u karakterističnom uređenju jezgra sa 4 disulfida (nazvan i motiv četvoro-disulfidnog jezgra). Motiv sekvence WAP domena je funkcionalni motiv koji karakteriše aktivnost inhibicije serin proteaze kod brojnih proteina.

[0037] Polipeptidi koji sadrže WAP domen pogodni za upotrebu u ovde datim fuzionim proteinima uključuju, u smislu neograničavajućeg primera, sekretorni inhibitor leukocitne proteaze (SLPI), Elafin i Eppin.

[0038] U nekim aspektima, sekvenca polipeptida koji sadrži WAP domen fuzionog proteina uključuje polipeptidnu sekvencu sekretornog inhibitora leukocitne proteaze (SLPI) ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od SLPI. Ovi aspekti su ovde označeni kao "fuzioni proteini koji potiču od serpin-SLPI". U nekim aspektima, sekvenca polipeptida SLPI sadrži deo SLPI proteina, kao što je na primer, WAP2 domen ili njegov delić. U poželjnom aspektu, sekvenca polipeptida SLPI ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od SLPI je, ili potiče od sekvence humanog polipeptida SLPI.

[0039] U nekim aspektima fuzionih proteina serpin-SLPI pronalaska, SLPI sekvenca ili sekvenca koja potiče od SLPI fuzionog proteina uključuje celu dužinu sekvence humanog SLPI polipeptida koja ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

[0040] U nekim aspektima fuzionog proteina serpin-SLPI prema opisu, SLPI sekvenca ili sekvenca koja potiče od SLPI fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog SLPI polipeptida koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 8.

[0041] U nekim aspektima fuzionog proteina serpin-SLPI prema opisu, SLPI sekvenca ili sekvencu fuzionog proteina uključuje deo cele dužine sekvence humanog SLPI polipeptida, gde deo ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

[0042] U nekim aspektima fuzionog proteina serpin-SLPI prema opisu, SLPI sekvenca ili sekvenca koja potiče od SLPI fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog SLPI polipeptida koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 9.

[0043] U nekim aspektima fuzionog proteina serpin-SLPI prema opisu, SLPI sekvenca ili sekvenca koja potiče od SLPI fuzionog proteina uključuje WAP2 domen cele dužine sekvence humanog SLPI polipeptida, gde WAP2 domen ima sledeću aminokiselinsku sekvencu: 1 TRRKPGKCPV TYGQCLMLNP PNFCEMDGQC KRDLKCCMGM CGKSCVSPVK A (SEQ ID NO: 10)

[0044] U nekim aspektima fuzionog proteina serpin-SLPI prema opisu, SLPI sekvenca ili sekvenca koja potiče od SLPI fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog SLPI polipeptida koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 10.

[0045] U nekim aspektima fuzionih proteina serpin-SLPI prema opisu, sekvenca SLPI polipeptida ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od SLPI polipeptida je, ili potiče od, jedne ili više sekvenci humanog SLPI polipeptida prikazanih u GenBank pod pristupnim br. CAA28187.1, NP_003055.1, EAW75869.1, P03973.2, AAH20708.1, CAB64235.1, CAA28188.1, AAD19661.1, i/ili BAG35125.1.

[0046] U nekim aspektima fuzionih proteina serpin-SLPI prema opisu, sekvenca SLPI polipeptida ili sekvenca koja potiče od SLPI fuzionog proteina uključuje sekvencu humanog SLPI polipeptida koja je modifikovana na metioninskoj (Met) rezidui. U ovim Met mutacijama, rezidua Met može da bude supstituisana bilo kojom aminokiselinom. Na primer, rezidua Met može da bude supstituisana aminokiselinom sa hidrofobnim bočnim lancem, kao što je, na primer, leucin (Leu, L) ili valin (Val, V). Bez želje za vezivanjem za neku određenu teoriju, Met mutacija/mutacije sprečava oksidaciju i posledičnu inaktivaciju inhibitorne aktivnosti fuzionih proteina pronalaska. U nekim aspektima, Met mutacija je na poziciji 98 u SLPI polipeptidu. Na primer, modifikovana sekvenca SLPI polipeptida u serpin-SLPI uključuje mutacije M98L ili M98V u SEQ ID NO: 8.

[0047] U drugim aspektima, sekvenca polipeptida koji sadrži WAP domen fuzionog proteina uključuje sekvencu polipeptida elafina ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od elafina. Ovi aspekti su ovde označeni kao "fuzioni proteini serpin-elafin". U nekim aspektima, sekvenca polipeptida elafina uključuje deo proteina elafina, kao što je na primer, WAP domen ili njegov delić. U poželjnom aspektu, sekvenca polipeptida elafina ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od elafina je, ili potiče od sekvence humanog polipeptida elafina.

[0048] U nekim aspektima fuzionih proteina serpin-elafin, fuzioni protein uključuje celu dužinu sekvence humanog polipeptida elafina koja ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

[0049] U nekim aspektima fuzionih proteina serpin-elafin, fuzioni protein uključuje sekvencu humanog polipeptida elafina koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 11.

[0050] U nekim aspektima fuzionih proteina serpin-elafin, fuzioni protein uključuje deo cele dužine sekvence humanog polipeptida elafina, gde deo ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

[0051] U nekim aspektima fuzionih proteina serpin-elafin, fuzioni protein uključuje sekvencu humanog polipeptida elafina koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 12.

[0052] U nekim aspektima fuzionih proteina serpin-elafin, fuzioni protein uključuje WAP domen cele dužine sekvence humanog polipeptida elafina, gde WAP domen ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

1 VSTKPGSCPI ILIRCAMLNP PNRCLKDTDC PGIKKCCEGS CGMACFVPQ (SEQ ID NO: 13) [0053] U nekim aspektima fuzionih proteina serpin-elafin, fuzioni protein uključuje sekvencu humanog polipeptida elafina koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 13.

[0054] U nekim aspektima fuzionih proteina serpin-elafin, sekvenca polipeptida elafina ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od polipeptida elafina potiče od jedne ili više sekvenci humanih polipeptida elafina prikazanih u GenBank pod pristupnim br. P19957.3, NP_002629.1, BAA02441.1, EAW75814.1, EAW75813.1, Q8IUB2.1, i/ili NP_542181.1.

[0055] U drugim aspektima, sekvenca polipeptida koji sadrži WAP domen fuzionog proteina uključuje sekvencu polipeptida Eppin ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od Eppin. Ovi aspekti su ovde označeni kao "fuzioni proteini serpin -Eppin". U nekim aspektima, sekvenca polipeptida Eppin fuzionog proteina serpin-Eppin uključuje deo Eppin proteina, kao što je na primer, WAP domen ili njegov delić. U poželjnom aspektu, sekvenca polipeptida Eppin ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od Eppin je, ili potiče od sekvence humanog polipeptida Eppin.

[0056] U nekim aspektima fuzionih proteina serpin-Eppin, sekvenca polipeptida Eppin ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od Eppin polipeptida je, ili potiče od jedne ili više sekvenci humanih polipeptida Eppin prikazanih u GenBank pod pristupnim br. O95925.1, NP_065131.1, AAH44829.2, AAH53369.1, AAG00548.1, AAG00547.1, i/ili AAG00546.1.

[0057] U nekim aspektima, serpinski polipeptid fuzionog proteina serpin-WAP domen uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu dela petlje reaktivnog mesta proteina AAT. U nekim primerima izvođenja, deo petlje reaktivnog mesta proteina AAT uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1. U nekim aspektima, serpinski polipeptid fuzionog proteina serpin-WAP uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu varijante dela petlje reaktivnog mesta proteina AAT. U nekim aspektima, varijanta dela petlje reaktivnog mesta proteina AAT uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32 ili SEQ ID NO:33. U nekim aspektima, serpinski polipeptid fuzionog proteina serpin-WAP domen uključuje najmanje celu dužinu sekvence humanog AAT polipeptida koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima serpinski polipeptid fuzionog proteina serpin-WAP domen uključuje sekvencu humanog AAT polipeptida koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 ili 32 ili 33.

[0058] U nekim aspektima, serpinski polipeptid fuzionog proteina serpin-WAP domen uključuje sekvencu AAT polipeptida koja je, ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od AAT polipeptida koja potiče od, jedne ili više sekvenci humanih AAT polipeptida prikazanih u GenBank pod pristupnim br. AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP_001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172.1, i/ili AAA51547.1.

[0059] U nekim aspektima, fuzioni protein serpin-WAP domen može takođe da uključuje Fc polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od Fc polipeptida. Ovi aspekti su ovde zajednički označeni kao "fuzioni proteini serpin-Fc-WAP domen". U ovim aspektima, pod ovom terminologijom ne treba podrazumevati nikakav konkretan redosled. Na primer, redosled fuzionog proteina može da bude serpin-Fc-WAP domen, serpin-WAP domen-Fc, ili bilo koja varijacija njihove kombinacije. Ovde opisani fuzioni proteini serpin-Fc-WAP domen uključuju najmanje serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpina, polipeptid koji sadrži WAP domen ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida koji sadrži WAP domen, i Fc polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od Fc polipeptida.

[0060] U nekim aspektima, gde fuzioni protein serpin-WAP domen uključuje sekvencu Fc polipeptida, sekvenca Fc polipeptida može da ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3-7. U drugim aspektima, gde fuzioni protein serpin-WAP domen uključuje sekvencu Fc polipeptida, sekvenca Fc polipeptida može da ima najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO. 3-7. U nekim aspektima, fuzioni protein serpin-WAP domen može takođe da uključuje polipeptid albumin, ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida albumina. Ovi aspekti su ovde zajednički označeni kao "fuzioni proteini serpin-albumin-WAP domen". U ovim aspektima, pod ovom terminologijom ne treba podrazumevati nikakav konkretan redosled. Na primer, redosled fuzionog proteina može da bude serpin-albumin-WAP domen, serpin-WAP domen-albumin, ili bilo koja varijacija njihove kombinacije. Ovde opisani fuzioni proteini serpin-albumin-WAP domen uključuju najmanje serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpina, polipeptid koji sadrži WAP domen, ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida koji sadrži WAP domen, i polipeptid albumin, ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida albumina.

[0061] U nekim aspektima gde fuzioni protein serpin-WAP domen uključuje sekvencu polipeptida albumina, sekvenca polipeptida albumina uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14-15, koja je ovde opisana. U drugim aspektima, gde fuzioni protein serpin-WAP domen uključuje sekvencu polipeptida albumina, sekvenca polipeptida albumina ima najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa bilo kojom od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 14 ili 15.

[0062] U nekim aspektima, drugi polipeptid (Polipeptid 2) serpinskog fuzionog proteina je polipeptid albumina ili potiče od polipeptida albumina. Ovi aspekti su ovde zajednički označeni kao "fuzioni proteini serpin -albumin". Ovde opisani fuzioni proteini serpin-albumin uključuju najmanje serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpina i polipeptid albumina ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida albumina. Dodatno, ovaj opis se odnosi na fuzione proteine serpin-albumin-vezivni polipeptid, u kojima je albumin funkcionalno povezan sa serpinom putem intermedijarnog vezivnog molekula. Ovde, serpin je nekovalentno ili kovalentno vezan za humani serumski albumin.

[0063] U aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje sekvencu polipeptida albumina, sekvenca polipeptida albumina fuzionog proteina je polipeptid humanog serumskog albumina (HSA) ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od HSA. U nekim aspektima, fuzioni protein uključuje sekvencu HSA polipeptida koja ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

[0064] U aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje sekvencu polipeptida albumina, sekvenca polipeptida albumina fuzionog proteina uključuje sekvencu polipeptida humanog serumskog albumina koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 14.

[0065] U aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje sekvencu polipeptida albumina, sekvenca polipeptida albumina fuzionog proteina uključuje domen 3 sekvence polipeptida humanog serumskog albumina koji ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:

[0066] U aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje sekvencu polipeptida albumina, sekvenca polipeptida albumina fuzionog proteina uključuje sekvencu polipeptida humanog serumskog albumina koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 15.

[0067] U nekim aspektima gde fuzioni protein prema opisu uključuje sekvencu polipeptida albumina, fuzioni protein je povezan sa humanim serumskim albuminom putem intermedijarnog albumin-vezujućeg polipeptida. Albumin-vezujući polipeptid može da bude antitelo ili fragment antitela, ili da potiče od antitela ili fragmenta antitela. U poželjnom aspektu, albumin-vezujući polipeptid ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od antitela ili fragmenta antitela potiče od sekvence himernog, humanizovanog, ili potpuno humanog antitela. Pojam fragment antitela uključuje jednolančano antitelo, Fab fragment, F(ab’)2fragment, scFv, scAb, dAb, jednodomenski teški lanac antitela i jednodomenski laki lanac antitela. Dodatno, albumin-vezujući polipeptid može da bude albumin-vezujući peptid. Još jedan aspekt prema opisu je fuzija serpin-albumin-vezujući polipeptid, u kojoj je albumin-vezujući polipeptid domen 3 streptokoknog proteina G ili sekvenca koja potiče od domena 3 streptokoknog proteina G.

[0068] U nekim aspektima, serpinski polipeptid fuzionih proteina serpin -albumin uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu dela petlje reaktivnog mesta proteina AAT. U nekim aspektima, deo petlje reaktivnog mesta proteina AAT uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1. U nekim aspektima, serpinski polipeptid fuzionog proteina serpin-albumin uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu varijante dela petlje reaktivnog mesta proteina AAT. U nekim aspektima, varijanta dela petlje reaktivnog mesta proteina AAT uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32 ili SEQ ID NO:33. U nekim aspektima, serpinski polipeptid fuzionih proteina serpin-albumin uključuje najmanje celu dužinu sekvence humanog AAT polipeptida koja ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima serpinski polipeptid fuzionih proteina serpin-albumin uključuje sekvencu humanog AAT polipeptida koja je najmanje 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 ili 32 ili 33.

[0069] U nekim aspektima, serpinski polipeptid fuzionih proteina serpin-albumin uključuje sekvencu polipeptida AAT ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida AAT koja je, ili potiče od jedne ili više sekvenci humanih polipeptida AAT prikazanih u GenBank pod pristupnim br. AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP_001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172.1, i/ili AAA51547.1.

[0070] U nekim aspektima, fuzioni proteini su modifikovani tako da povećavaju ili na drugi način inhibiraju proteolitičku degradaciju, na primer, mutiranjem jednog ili više mesta proteolitičke degradacije. U nekim primerima izvođenja, fuzioni proteini su modifikovani da bi se izmenila ili drugačije modulirala Fc efektorska funkcija fuzionog proteina, dok se u isto vreme zadržava vezivanje i inhibitorna funkcija u poređenju sa neizmenjenim fuzionim proteinom. Fc efektorske funkcije uključuju, u smislu neograničavajućih primera, vezivanje za Fc receptor, sprečavanje oslobađanja medijatora zapaljenja pri vezivanju za Fc receptor, fagocitozu, modifikovanu antitelozavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC), modifikovanu komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC), modifikovanu glikozilaciju na Asn297 rezidui (EU indeks numeracije po Kabatu, Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest) Fc polipeptida. U nekim primerima izvođenja, fuzioni proteini su mutirani ili drugačije modifikovani da utiču na vezivanje za Fc receptor. U nekim primerima izvođenja, Fc polipeptid je modifikovan da poboljšava vezivanje FcRn. Primeri mutacija Fc polipeptida koji poboljšavaju vezivanje za FcRn su Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu (M252Y, S256T, T256E) (numeracija po Kabatu, Dall’Acqua et al 2006, J. Biol Chem Vol 281(33) 23514-23524), ili Met428Leu i Asn434Ser (M428L, N434S) (Zalevsky et al 2010 Nature Biotech, Vol. 28(2) 157-159). (EU indeks prema Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest). U nekim primerima izvođenja deo Fc polipeptida je mutiran ili drugačije modifikovan tako da narušava Fc-posredovanu dimerizaciju (Ying et al 2012 J. Biol Chem 287(23): 19399-19408). U ovim primerima izvođenja, fuzioni protein je monomerne prirode.

[0071] Fuzioni proteini i njihove varijante koje su ovde date ispoljavaju inhibitornu aktivnost, na primer inhibiranjem serin proteaze kao što je humana neutrofilna elastaza (NE), serin proteaza sa naborom kao kod himotripsina koju sekretuju neutrofili tokom zapaljenskog odgovora. Fuzioni proteini koji su ovde dati potpuno ili delimično redukuju ili drugačije modulišu ekspresiju ili aktivnost serin proteaze nakon vezivanja, ili drugačije interakcije sa serin proteazom, npr., humanom serin proteazom. Redukcija ili modulacija biološke funkcije serin proteaze je potpuna ili delimična nakon interakcije fuzionih proteina i proteina, polipeptida i/ili peptida humane serin proteaze. Smatra se da fuzioni proteini potpuno inhibiraju ekspresiju ili aktivnost serin proteaze kada je nivo ekspresije ili aktivnosti serin proteaze u prisustvu fuzionog proteina smanjen za najmanje 95%, npr., za 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% u poređenju sa nivoom ekspresije ili aktivnosti serin proteaze u odsustvu interakcije, npr., vezivanja, sa ovde opisanim fuzionim proteinom. Smatra se da fuzioni proteini delimično inhibiraju ekspresiju ili aktivnost serin proteaze kada je nivo ekspresije ili aktivnosti serin proteaze u prisustvu fuzionog proteina smanjen za manje od 95%, npr., 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% ili 90% u poređenju sa nivoom ekspresije ili aktivnosti serin proteaze u odsustvu interakcije, npr., vezivanja, sa ovde opisanim fuzionim proteinom.

[0072] Ovde opisani fuzioni proteini su korisni u različitim terapijskim, dijagnostičkim i profilaktičkim indikacijama. Na primer, fuzioni proteini su korisni u lečenju različitih bolesti i poremećaja kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, serpinski fuzioni proteini, uključujući ovde opisane fuzione proteine, korisni su u lečenju, ublažavanju simproma, ublažavanju i/ili odlaganju progresije bolesti ili poremećaja kod subjekta koji pati od, ili za koga je utvrđeno da ispoljava rizik za dobijanje bolesti ili poremećaja, odabranog od nedostatka alfa-1-antitripsina (AAT), emfizema, hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD), akutnog respiratornog distres sindroma (ARDS), alergijske astme, cistične fibroze, kancera pluća, ishemijsko-reperfuzione povrede uključujući, npr., ishemijsko/reperfuzionu povredu nakon transplantacije srca, infarkta miokarda, reumatoidnog artritisa, septičkog artritisa, psorijaznog artritisa, ankiloznog spondilitisa, Kronove bolesti, psorijaze, dijabetesa tipa I i/ili tipa II, bakterijske infekcije, gljivične infekcije, virusne infekcije, pneumonije, sepse, bolesti kalem-protiv-domaćina (GVHD), zarastanja rane, sistemskog eritemskog lupusa i multiple skleroze.

[0073] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku uključuju fuzioni protein pronalaska, uključujući modifikovane fuzione proteine i druge varijante, zajedno sa pogodnim nosačem. Ove farmaceutske kompozicije mogu da budu uključene u komplete, kao što su, na primer, dijagnostički kompleti.

Kratak opis crteža

[0074]

Slika 1A je šematski prikaz nekih primera izvođenja fuzionih proteina serpin-Fc prema pronalasku. Serpin može da se nalazi na bilo kom položaju u fuzionom proteinu. Fuzioni proteini serpin-Fc koji uključuju više od jednog serpinskog polipeptida su takođe prikazani. Slika 1B je fotografija SDS-PAGE gela koja prikazuje serumski AAT (traka 1), AAT-Fc1 (traka 2, humani IgG1 Fc), i AAT-EL-Fc1 (traka 3, Met351Glu, Met358Leu mutacije u AAT, humani IgG1 Fc). Slika 1C je grafik koji prikazuje inhibiciju aktivnosti neutrofilne elastaze pomoću AAT-Fc fuzionih proteina. Slika 1D je fotografija SDS-PAGE gela koja prikazuje tetravalentni AAT-Fc-AAT, koji ima dva AAT polipeptida na jedan Fc polipeptid. Slika 1E je grafik koji prikazuje inhibiciju aktivnosti neutrofilne elastaze pomoću tetravalentnog AAT-Fc-AAT fuzionog proteina. Slika 1F je grafik koji prikazuje dejstvo elucije niskim pH sa smole protein A, gde je kapacitet AAT-Fc fuzionog proteina eluiranog na niskom pH za inhibiciju NE drastično redukovan. Slika 1G je grafik koji pokazuje da je dvostruki mutant, AAT-EL-Fc (mutacije Met351Glu, Met358Leu) otporan na inaktivaciju sa H2O2(konc.), u poređenju sa divljim tipom AAT i jednostrukim mutantom AAT-EM-Fc (Met351Glu). Slika 1H je grafik koji pokazuje brzine klirensa u serumu serumskog AAT (sdAAT) u poređenju sa AAT-Fc kod pacova koji su primili dozu od 10 mg/kg proteina (3 pacova/test proteinu). Polu-život AAT-Fc je suštinski duži od polu-života sdAAT.

Slika 2A je šematski prikaz nekih primera izvođenja fuzionog proteina serpin-polipeptid usmerenog na citokine prema pronalasku. Serpin može da bude fuzionisan ili sa teškim lancem, sa lakim lancem, ili sa oba lanca antitela. Fuzioni proteini serpin-receptor za citokine su takođe prikazani. Slika 2B je fotografija SDS-PAGE gela koja prikazuje D2E7 antitelo (traka 1), i D2E7 antitelo sa-AAT fuzionisanim sa teškim lancem (traka 2). Slika 2C je grafik koji prikazuje inhibiciju aktivnosti neutrofilne elastaze pomoću D2E7 antitela fuzionisanog sa AAT. Serumski AAT je prikazan kao pozitivna kontrola, dok je samo D2E7 antitelo prikazano kao negativna kontrola za inhibiciju NE.

Slika 3A je šematski prikaz nekih primera izvođenja fuzionih proteina serpin-Fc-WAP. Slika 3B je fotografija SDS-PAGE gela koja prikazuje AAT-Fc-ELAFIN (traka 1) i AAT-Fc-SLPI (traka 2). Slika 3C je grafik koji prikazuje inhibiciju aktivnosti neutrofilne elastaze pomoću fuzionog proteina AAT-Fc-ELAFIN i fuzionog proteina AAT-Fc-SLPI. Fuzioni protein AAT-Fc i serumski AAT su uključeni u svrhu poređenja.

Slika 4A je šematski prikaz nekih primera izvođenja fuzionih proteina AAT-HSA. Slika 4B je fotografija SDS-PAGE gela koja prikazuje fuziju AAT-HSA. Slika 4C je grafik koji prikazuje inhibiciju aktivnosti neutrofilne elastaze pomoću AAT-HSA u poređenju sa serumskim AAT.

Detaljan opis pronalaska

[0075] Humana neutrofilna elastaza (NE) je serin proteaza sa naborom kao kod himotripsina, koju sekretuju neutrofili tokom zapaljenja. Narušena aktivnost NE dovodi do progresivne razgradnje elastinskih tkiva i sporog uništavanja alveolarnih struktura pluća što vodi emfizemu i fibrozi pluća (Lungarella et al 2008 Int. J. Biochem Cell Biol 40:1287). Često, narušena aktivnost NE je posledica neravnoteže proteaze i njenog prirodnog inhibitora, alfa1-antitripsina (AAT). Ova neravnoteža može da nastane zbog pojačane infiltracije pluća neutrofilima, što se zapaža kod pušača i pacijenata sa cističnom fibrozom (CF), ili akutnim respiratornim distres sindromom (ARDS). Nasuprot tome, nedostatak AAT, obično kao rezultat tačkaste mutacije koja izazva agregaciju i nakupljanje ATT u jetri, ostavlja pluća izložena nekontrolisanoj aktivnosti NE. Pojedinci sa nedostatkom AAT imaju povećan rizik od emfizema, COPD, bolesti jetre i brojnih drugih stanja.

[0076] Nedostatak AAT pogađa približno 100000 Amerikanaca (prema procenama Alfa-1 fondacije), i mnogi od obolelih umru u svojim 30-im i 40-im godinama. Trenutno postoji samo nekoliko lekova koje je FDA odobrila za lečenje nedostatka ATT (Prolastin®, Aralast™, Zemaira®, Glassia™). Svaki lek je prirodni AAT dobijen od sakupljene humane plazme, što je, izgleda, nedovoljno da zadovolji očekivanu kliničku potražnju. Osim toga, ovi proizvodi imaju kratke serumske polu-živote (T1/2od približno 5 dana) i zahtevaju nedeljne infuzije visokih doza (60 mg/kg telesne težine). U ovom trenutku, tržište ovih lekova procenjeno je na oko 400 miliona dolara.

Tržište lekova sličnih AAT verovatno je suštinski veće, na osnovu procene da čak 95% osoba sa nedostatkom AAT ostaje bez dijagnoze, i činjenice da ovi lekovi imaju potencijal da predstavljaju efikasnu terapiju za patologije koje odlikuje pojačana aktivnost NE kod osoba koje nemaju nedostatak AAT (npr., kod cistične fibroze (CF), akutnog respiratornog distres sindroma (ARDS), emfizema uzrokovanog pušenjem i/ili COPD).

[0077] Sugerisano je da AAT ima širok spektar antizapaljenskih aktivnosti (Tilg et al 1993 J Exp Med 178:1629-1636, Libert et al 1996 Immunol 157:5126-5129, Pott et al, Journal of Leukocyte Biology 85 2009, Janciauskiene et al 2007 J. Biol Chem 282(12): 8573-8582, Nita et al 2007 Int J Biochem Cell Biol 39:1165-1176). Nedavno, pojavili su se dokazi da AAT može da bude koristan u lečenju brojnih humanih patologija, osim uobičajeno predloženih zapaljenskih stanja pluća. Pokazano je da humani AAT štiti miša od kliničkih i histopatoloških znakova eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa (EAE), sugerišući da bi on mogao da predstavlja potencijalni tretman za autoimune bolesti, kao što su multipla skleroza ili sistemski eritemski lupus (SLE) (Subramanian et al 2011 Metab Brain Dis 26:107-113). Serumski AAT je pokazao aktivnost u glodarskim modelima bolesti kalem-protiv-domaćina (GVHD) (Tawara et al 2011 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109: 564-569, Marcondes et al 2011 Blood Nov 3;118(18):5031-9), što je vodilo humanom kliničkom ispitivanju upotrebe AAT za lečenje osoba sa steroidno-neresponsivnim akutnim GVHD (NCT01523821). Dodatno, AAT je bio efikasan u životinjskim modelima dijabetesa tipa I i tipa II, prigušujući zapaljenje, štiteći ćelije ostrvaca od apoptoze i omogućavajući dugotrajan alograft ćelija ostrvaca (Zhang et al 2007 Diabetes 56:1316-1323, Lewis et al 2005 Proc Natl Acad Sci USA 102:12153-12158, Lewis et al 2008 Proc Natl Acad Sci USA 105:16236-16241, Kalis et al 2010 Islets 2:185-189). Trenutno, u toku su brojna rana humana klinička ispitivanja lečenja dijabetesa tipa I upotrebom proizvoda od serumskog AAT (NCT01183468, NCT01319331, NCT01304537).

[0078] Sadašnji proizvodi od serumskog AAT podležu intenzivnom prečišćavanju i ispitivanju da bi se osiguralo uklanjanje patogenih virusa, međutim, rizik od prenošenja infektivnih agenasa ne može se potpuno otkloniti. Osim toga, serum je ograničen, što ograničava kapacitet proizvodnje serumskog AAT. Pokušaji da se reši zabrinutost zbog proizvoda koji se dobijaju iz seruma i pitanja proizvodnje bili su usmereni na eksprimiranje rekombinantnog AAT. Međutim, posle 20 godina rada, generacija terapijski vijabilnog rekombinantnog AAT još nije stigla na tržište (Karnaukhova et al 2006 Amino Acids 30: 317). Kao i proizvodi koji potiču iz plazme, rekombinantne verzije AAT pate od kratkog serumskog polu-života, niskih prinosa proizvodnje i slabe raspodele u plućima.

[0079] Fuzioni proteini predmetnog pronalaska imaju poboljšanu funkcionalnost u poređenju sa nemodifikovanim molekulom AAT. Fuzija polipeptida AAT sa drugim polipeptidom koji interaguje sa neonatalnim Fc receptorom (FcRn), služi da poveća serumski polu-život, pružajući preko potrebnu korist pri doziranju za pacijente. Ovi polipeptidi fuzionog proteina koji interaguju sa FcRn uključuju imunoglobulinske (Ig) Fc polipeptide koji potiču od humanog IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, ili IgM, i derivate humanog albumina. U nekim primerima izvođenja, u AAT deo fuzionog proteina uvode se mutacije koje čine molekul otpornijim na inaktivaciju oksidacijom. Na primer Met351Glu, Met358Leu (AAT-EL-Fc), ispoljava rezistenciju na inaktivaciju oksidacijom pomoću H2O2(Slika 1G). Dok je AAT prirodni antizapaljenski protein, neki primeri izvođenja pronalaska obezbeđuju poboljšan kapacitet suzbijanja zapaljenja putem fuzije AAT polipeptida i polipeptida usmerenog na citokine. Povezivanje dvostruke antizapaljenske funkcionalnosti AAT i drugog polipeptida, obezbediće snažniji terapijski protein nego što je bilo koji od polipeptida pojedinačno. Dodatno, povezivanje antiinfektivne aktivnosti AAT smanjiće rizik od infekcije koji postoji kod većine bioloških preparata usmerenih na citokine. Neki primeri izvođenja obezbeđuju snažnije antizapaljenske i antiinfektivne proteine putem fuzije AAT polipeptida i polipeptida koji sadrži WAP domen. Očekuje se da fuzioni proteini predmetnog pronalaska imaju odličnu terapijsku upotrebljivost i da budu superiorni u odnosu na savremene serumske proizvode AAT.

[0080] Da bi se polu-život rekombinantnog AAT produžio, korišćena je tehnologija rekombinantne DNK za stvaranje fuzije gena AAT sa Fc domenom humanog IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, ili HSA, tako da bi očekivani proteinski proizvod bio AAT za kojim sledi Fc domenom ((AAT-Fc (IgG1), AAT-Fc (IgG2), AAT-Fc (IgG3), AAT-Fc (IgG4), AAT-Fc (IgM)) ili AAT za kojim sledi HSA. Dok je činjenica da bi fuzije Fc domena HSA sa nekim proteinima, proteinskim domenima ili peptidima mogle da produže njihove polu-živote bila poznata (videti npr., Jazayeri et al. BioDrugs 22, 11-26, Huang et al. (2009) Curr Opin Biotechnol 20, 692-699, Kontermann et al. (2009) BioDrugs 23, 93-109, Schmidt et al. (2009) Curr Opin Drug Discov Devel 12, 284-295), nije bilo poznato da li bi Fc domen ili HSA fuzionisani sa AAT dozvolili pravilno savijanje i održavanje aktivnosti inhibicije NE, ili da li bi mogli da produže polu-život rekombinantnog AAT. Pokazano je da su fuzioni proteini predmetnog pronalaska snažni inhibitori NE, da imaju produženi serumski polu-život, i u nekim primerima izvođenja su otporni na oksidaciju. U drugim primerima izvođenja, ovde opisani fuzioni proteini stiču drugačija svojstva uključivanjem drugih funkcionalnih polipeptida, uključujući polipeptide usmerene na citokine, i polipeptide koji sadrže WAP domen.

[0081] Ovde opisani fuzioni proteini uključuju najmanje serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpina i drugi polipeptid. U nekim primerima izvođenja, na primer, pronalazak obezbeđuje serpinski polipeptid fuzionisan sa humanim IgG1-Fc, IgG2-Fc, IgG3-Fc, IgG4-Fc, IgM-Fc, ili HSA derivatima. Očekuje se da ovde opisana fuzija serpina bude korisna u lečenju različitih indikacija, uključujući, u smislu neograničavajućeg primera, nedostatak alfa-1-antitripsina (AAT), emfizem, hroničnu opstruktivnu bolest pluća (COPD), akutni respiratorni distres sindrom (ARDS), alergijsku astmu, cističnu fibrozu, kancer pluća, ishemijsko-reperfuzionu povredu uključujući, npr., ishemijsko/reperfuzionu povredu nakon transplantacije srca, infarkt miokarda, reumatoidni artritis, septički artritis, psorijazni artritis, ankilozni spondilitis, Kronovu bolest, psorijazu, dijabetes tipa I i/ili tipa II, bakterijsku infekciju, gljivičnu infekciju, virusnu infekciju, pneumoniju, sepsu, bolest kalem-protiv-domaćina (GVHD), zarastanje rane, sistemski eritemski lupus i multiplu sklerozu.

[0082] U nekim primerima izvođenja, ovde opisani fuzioni proteini uključuju najmanje polipeptid alfa-1-antitripsina (AAT) ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od AAT i drugi polipeptid. Na primer, pronalazak obezbeđuje alfa-1-antitripsin (AAT) fuzionisan sa humanim IgG1-Fc, IgG2-Fc, IgG3-Fc, IgG4-Fc, IgM-Fc, ili HSA derivatima.

[0083] U nekim aspektima, ovde opisani fuzioni proteini uključuju najmanje serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpinskog polipeptida i polipeptid usmeren na citokine ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida usmerenog na citokine. Na primer, pronalazak obezbeđuje serpinski polipeptid ili sekvencu koja potiče od serpinskog polipeptida fuzionisanu sa humanim receptorom za citokine ili njegovim derivatom. Još jedan aspekt prema opisu obezbeđuje serpinski polipeptid ili sekvencu koja potiče od serpinskog polipeptida fuzionisanu sa antitelom usmerenim na citokine, npr., antitelom protiv citokina, ili sekvencom koja potiče od antitela usmerenog na citokine, npr., antitelom protiv citokina, ili sekvencom koja potiče od fragmenta antitela usmerenog na citokine, npr., fragmentom antitela protiv citokina. Na primer, opis obezbeđuje serpinski polipeptid ili sekvencu koja potiče od serpinskog polipeptida fuzionisanu sa polipeptidom usmerenim na citokine u kome polipeptid usmeren na citokine vezuje bilo koji od navedenih humanih citokina: TNFα, IgE, IL-12, IL-23, IL-6, IL-1α, IL-1β, IL-17, IL-13, IL-4, IL-10, IL-2, IL-18, IL-27, ili IL-32.

[0084] Na primer, u nekim aspektima, polipeptid usmeren na citokine ciljno deluje na TNFα i uključuje bilo koji od sledećih polipeptida usmerenih na TNFα ili sekvenci koje potiču od sledećih polipeptida usmerenih na TNFα: Remicade®, Humira®, Simponi®, Cimiza®, Enbrel® ili ATN-103 i ATN-192.

[0085] Na primer, u nekim aspektima, polipeptid usmeren na citokine ciljno deluje na IgE i uključuje bilo koji od sledećih polipeptida usmerenih na IgE ili sekvenci koje potiču od sledećih polipeptida usmerenih na IgE: Xolair ili FcεRI.

[0086] Na primer, u nekim aspektima, polipeptid usmeren na citokine ciljno deluje na pod-jedinicu p40 koju dele IL-12 i IL-23 i uključuje polipeptid Stelara® ili sekvence koje potiču od polipeptida Stelara®.

[0087] Na primer Stelara® polipeptid usmeren na citokine ciljno deluje na IL-13 i uključuje polipeptid CDP7766 ili sekvence koje potiču od polipeptida CDP7766.

[0088] U nekim aspektima, fuzioni proteini koji su ovde opisani uključuju najmanje polipeptid alfa-1-antitripsina (AAT) ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od AAT i polipeptid usmeren na citokine ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida usmerenog na citokine. Na primer, opis obezbeđuje inhibitor alfa-1-antitripsin (AAT) fuzionisan sa polipeptidom usmerenim na citokine u kome polipeptid usmeren na citokine vezuje bilo koji od sledećih humanih citokina: TNFα, IgE, IL-6, IL-1α, IL-1β, IL-12, IL-17, IL-13, IL-23, IL-4, IL-10, IL-2, IL-18, IL-27, ili IL-32.

[0089] U nekim aspektima polipeptid usmeren na citokine vezuje receptor za citokine i sprečava vezivanje citokina. Na primer, predmetni opis uključuje serpin fuzionisan sa antitelom usmerenim na receptor za citokine. Na primer, opis obezbeđuje inhibitor alfa-1-antitripsin (AAT) fuzionisan sa polipeptidom usmerenim na citokine u kome polipeptid usmeren na citokine vezuje receptor za bilo koji od sledećih humanih citokina: TNFα, IgE, IL-6, IL-1α, IL-1β, IL-12, IL-17, IL-13, IL-23, p40 podjedinicu IL-12 i IL-23, IL-4, IL-10, IL-2, IL-18, IL-27, ili IL-32.

[0090] Na primer, u nekim aspektima, polipeptid usmeren na citokine ciljno deluje na receptor za IL-6 i uključuje polipeptid Actemra® (kao što je opisano u patentnoj objavi EP0628639), ili polipeptid ALX-0061 (kao što je opisano u WO2010/115998), ili sekvence koje potiču od polipeptida Actemra®, ili polipeptida ALX-0061.

[0091] Na primer, Actemra® polipeptid usmeren na citokine ciljno deluje na receptor za IL-6 i uključuje polipeptid tocilizumab ili sekvence koje potiču od polipeptida tocilizumaba.

[0092] Ciljno delovanje na zapaljenske citokine i imunostimulatorne agense proteinskim terapeuticima pokazalo je klinički uspeh kod brojnih zapaljenskih stanja. Proteini koji se najčešće koriste kao agensi usmereni na citokine su rastvorljivi receptori za citokine i monoklonska antitela i njihovi fragmenti. Značajan nedostatak ciljanog delovanja na citokine je povećani rizik od infekcije kod ovih pacijenata, o čemu svedoče biološki preparati usmereni na TNFα, Remicade®, Humira®, Simponi®, Cimiza®, i Enbrel®, i antitelo usmereno na p40 u IL-12/23, Stelara®. Ovo je izgleda uobičajeni problem kod ciljnog delovanja na zapaljenske citokine koje vodi supresiji imunog sistema pacijenata. AAT i drugi serpinski proteini su zanimljivi po tome što pokazuju i antiinfektivne i antizapaljenske aktivnosti. Tako, fuzioni proteini serpin-polipeptid usmeren na citokine ovog opisa mogu da ublaže aberantne aktivnosti citokina uz ublažavanje rizika od infekcija.

[0093] U nekim primerima izvođenja, fuzioni proteini koji su ovde opisani uključuju serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpina, polipeptid koji sadrži WAP domen ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida koji sadrži WAP domen, i Fc polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od Fc polipeptida. Na primer, opis obezbeđuje serpinski polipeptid, polipeptid koji sadrži WAP domen i derivate humanog IgG1-Fc, IgG2-Fc, IgG3-Fc, IgG4-Fc ili IgM-Fc koji su međusobno funkcionalno povezani u bilo kojoj funkcionalnoj kombinaciji. U nekim primerima izvođenja, protein koji sadrži WAP domen je humani SLPI ili potiče od humanog SLPI. U drugim primerima izvođenja, protein koji sadrži WAP domen je humani ELAFIN ili potiče od humanog ELAFIN-a. U nekim primerima izvođenja, fuzioni proteini koji su ovde opisani uključuju najmanje polipeptid alfa-1-antitripsin (AAT) ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od AAT i polipeptid SLPI ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od SLPI. U nekim primerima izvođenja, fuzioni proteini koji su ovde opisani uključuju najmanje polipeptid AAT ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od AAT i polipeptid ELAFIN ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida Elafina.

[0094] SPLI i Elafin su proteini koji sadrže WAP domen koji ispoljavaju aktivnost inhibicije serin proteaze. Oba ova proteina imaju antizapaljensku ulogu. Pored toga, ovi proteini poseduju široke antiinfektivne kapacitete prema brojnim sojevima bakterija, virusa i gljiva.

[0095] U nekim aspektima, fuzioni proteini koji su ovde opisani uključuju najmanje serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpina i polipeptid humani serumski albumin (HSA) ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida HSA. Dodatni aspekti opisa uključuju fuzione proteine serpin-albumin-vezujući polipeptid, u kojima je albumin-vezujući polipeptid odgovoran za udruživanje serpina i HSA. Prema tome, opis uključuje i kovalentno i nekovalentno povezivanje serpinskog polipeptida i polipeptida HSA ili sekvenci koje potiču od serpinskog polipeptida ili polipeptida HSA. Na primer, opis obezbeđuje serpinski polipeptid fuzionisan sa humanim HSA, ili derivatima HSA, ili HSA-vezujućim peptidom ili polipeptidima.

[0096] U nekim aspektima, fuzioni proteini koji su ovde opisani uključuju najmanje polipeptid alfa-1-antitripsin (AAT) ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od AAT i polipeptid HSA ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida HSA. Na primer, opis obezbeđuje alfa-1-antitripsin (AAT) fuzionisan sa HSA ili fragment koji potiče od HSA, ili albumin-vezujući polipeptid.

[0097] U nekim aspektima, fuzioni proteini koji su ovde opisani uključuju serpinski polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od serpina, polipeptid HSA ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida HSA, i polipeptid koji sadrži WAP domen ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida koji sadrži WAP domen. U nekim aspektima, fuzioni proteini koji su ovde opisani uključuju najmanje polipeptid alfa-1-antitripsin (AAT) ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od AAT i polipeptid HSA ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida HSA, i polipeptid SLPI ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida SLPI. U drugim aspektima, fuzioni proteini koji su ovde opisani uključuju najmanje polipeptid alfa-1-antitripsin (AAT) ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od AAT i polipeptid HSA ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida HSA, i polipeptid Elafin ili aminokiselinsku sekvencu koja potiče od polipeptida Elafina.

[0098] Fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu lako da se proizvedu u ekspresionom sistemu sisarskih ćelija. Na primer ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelije bubrega humanog embriona (HEK) 293, COS ćelije, PER.C6<®>, NS0 ćelije, SP2/0, YB2/0 mogu lako da se koriste za ekspresiju serpinskih fuzionih proteina koji su ovde opisani. Bitno je napomenuti da ekspresioni sistemi na bazi sisarskih ćelija proizvode proteine koji su uopšteno optimalniji za terapijsku upotrebu. Nasuprot ekspresionim sistemima na bazi bakterijskih ćelija, insekatskih ćelija ili ćelija kvasca, ekspresioni sistemi na bazi sisarskih ćelija daju proteine sa obrascima glikozilacije koji su slični ili isti kao oni nađeni kod prirodnih humanih proteina. Ispravna glikozilacija proteina može snažno da utiče na serumsku stabilnost, farmakokinetiku, biološku raspodelu, uvijanje proteina i funkcionalnost. Stoga, mogućnost proizvodnje terapijskih proteina u sisarskim ekspresionim sistemima ima posebne prednosti u odnosu na druge sisteme. Osim toga, pomoću većine sisarskih ekspresionih sistema (npr., CHO, NS0, PER.C6® ćelije) može lako da se dostigne obim proizvodnje u komercijalnim proizvodnim pogonima za proizvodnju terapijskih proteina koji bi zadovoljili kliničke potrebe. Fuzioni proteini koji su ovde opisani imaju poboljšanu funkcionalnost u odnosu na prirodni oblik AAT i mogu da se proizvedu u sisarskim ekspresionim sistemima za kliničko i komercijalno snabdevanje. Neki primeri izvođenja pronalaska uključuju sistem za prečišćavanje koji omogućava izdvajanje serpinskih fuzionih proteina koji zadržavaju sposobnost da inhibiraju NE. Bitno je da postupak za prečišćavanje prema predmetnom pronalasku može lako da se ugradi u današnje komercijalne proizvodne postupke zasnovane na sisarskim ćelijama.

[0099] Osim ako nije drugačije definisano, naučni i tehnički pojmovi koji se koriste u vezi sa predmetnim pronalaskom imaće značenja koja uobičajeno podrazumevaju stručnjaci u ovoj oblasti. Dalje, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, pojmovi u jednini će uključivati množinu, i pojmovi u množini će uključivati jedninu. Uopšteno, nomenklatura korišćena u vezi sa, i tehnike ćelijske i tkivne kulture, molekularne biologije, i proteinske i oligo- ili polinukleotidne hemije i hibridizacije koje su ovde opisane dobro su poznate i uobičajeno korišćene u stanju tehnike. Standardne tehnike se koriste za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, i kulturu i transformaciju tkiva (npr., elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja izvode se prema specifikacijama proizvođača, ili kao što se obično izvode u stanju tehnike, ili kao što je ovde opisano. Gorepomenute tehnike i postupci se uobičajeno izvode prema uobičajenim metodama dobro poznatim u ovoj struci i kao što je opisano u mnogim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i razmatrane u predmetnoj specifikaciji. Videti npr., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Nomenklatura korišćena u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike analitičke hemije, sintetičke organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane dobro su poznate i uobičajeno korišćene u stanju tehnike. Standardne tehnike se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsku preparaciju, formulaciju i dostavu, i za lečenje pacijenata. Pojam pacijent uključuje humane i veterinarske subjekte.

[0100] Jasno je da će terapijski entiteti u skladu sa pronalaskom biti primenjivani sa pogodnim nosačima, puferima, ekscipijensima i drugim agensima uključenim u formulacije, da bi se obezbedio poboljšani prenos, dostava, tolerancija, i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija može se naći u formulaciji koja je poznata svim farmaceutskim hemičarima: Remington’s Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), posebno poglavlje 87 autora Blaug, Seymour, u njoj. Ove formulacije uključuju, na primer, praškove, paste, masti, gelove, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je Lipofectin™), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije ulje-u-vodi i voda-u-ulju, emulzije karbovaks (polietilen glikoli različitih molekulskih težina), polu-čvrste gelove, i polu-čvrste smeše koje sadrže karbovaks. Bilo koja od gorepomenutih smeša može da bude pogodna za tretmane i terapije u skladu sa predmetnim pronalaskom, pod uslovom da se aktivni sastojak u formulaciji ne inaktiviše formulacijom i da je formulacija fiziološki kompatibilna i tolerablna pri datom načinu primene. Videti takođe Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, i oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) i navode u njima, za dodatne informacije u vezi sa formulacijama, ekscipijensima i nosačima koji su dobro poznati farmaceutskim hemičarima.

[0101] Terapijske formulacije pronalaska, koje uključuju fuzioni protein pronalaska, koriste se za lečenje ili ublažavanje simptoma udruženih sa bolešću ili poremećajem povezanim sa narušenom aktivnošću serin proteaze kod subjekta. Predmetni opis takođe obezbeđuje postupke za lečenje ili ublažavanje simptoma udruženih sa bolešću ili poremećajem povezanim sa narušenom aktivnošću serin proteaze kod subjekta. Terapijski režim se sprovodi identifikovanjem subjekta, npr., humanog pacijenta koji pati od (ili je u riziku od razvoja) bolesti ili poremećaja povezanog sa narušenom aktivnošću serin proteaze, upotrebom standardnih postupaka, uključujući bilo koju od različitih kliničkih i/ili laboratorijskih procedura. Pojam pacijent uključuje humane i veterinarske subjekte. Pojam subjekat uključuje ljude i druge sisare.

[0102] Efikasnost lečenja određuje se pomoću bilo koje poznate metode za dijagnostikovanje ili lečenje određene bolesti ili poremećaja udruženog sa narušenom aktivnošću serin proteaze. Ublažavanje jednog ili više simptoma bolesti ili poremećaja udruženog sa narušenom aktivnošću serin proteaze ukazuje na to da fuzioni protein donosi kliničku korist.

[0103] Metode za skrining fuzionih proteina koji imaju željenu specifičnost uključuju, ali nisu ograničene na enzimski imunosorbentni test (ELISA), enzimske testove, protočnu citometriju, i druge imunološki posredovane tehnike poznate u ovoj oblasti.

[0104] Fuzioni proteini koji su ovde opisani mogu da se koriste u metodama poznatim u stanju tehnike koji se tiču lokalizacije i/ili kvantitativnog određivanja ciljnog molekula kao što je serin proteaza, npr., za upotrebu pri merenju nivoa ovih molekula u odgovarajućim fiziološkim uzorcima, za upotrebu u dijagnostičkim metodama, za upotrebu u snimanju proteina, i slično). Izrazi "fiziološki uzorak" i "biološki uzorak", korišćeni kao sinonimi, ovde su namenjeni da uključuju tkiva, ćelije i biološke fluide izolovane iz subjekta, kao i tkiva, ćelije i fluide prisutne u subjektu. Upotreba izraza "fiziološki uzorak" i "biološki uzorak", uključuje, stoga, krv i frakciju ili komponentu krvi uključujući krvni serum, krvnu plazmu, ili limfu.

[0105] U datom primeru izvođenja, fuzioni proteini specifični za dati ciljni molekul, ili njihov derivat, fragment, analog ili homolog koji sadrži domen koji se vezuje za ciljni molekul, koriste se kao fiziološki aktivna jedinjenja (u daljem tekstu označena kao "terapeutici").

[0106] Fuzioni protein pronalaska može da se koristi za izolovanje određenog ciljnog molekula upotrebom standardnih tehnika, kao što su imunoafinitetna tehnika, hromatografija ili imunoprecipitacija. Detekcija može da bude olakšana kuplovanjem (tj., fizičkim vezivanjem) fuzionog proteina za detektabilnu supstancu. Primeri detektabilnih supstanci uključuju različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale, bioluminiscentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih kompleksa prostetičkih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; primer luminiscentnog materijala uključuje luminol; primeri bioluminiscentnih materijala uključuju luciferazu, luciferin i ekvorin, i primeri pogodnog radioaktivnog materijala uključuju<125>I,<131>I,<35>S ili<3>H.

[0107] Terapijski efikasna količina fuzionog proteina pronalaska odnosi se uopšteno na količinu potrebnu da se postigne terapijski cilj. Kao što je gore pomenuto, ovo može da bude interakcija vezivanja između fuzionog proteina i njegovog ciljnog molekula koja, u određenim slučajevima, interferira sa funkcionisanjem ciljnog molekula. Količina koju je potrebno primeniti dalje će zavisiti od afiniteta vezivanja fuzionog proteina za njegov specifični ciljni molekul, i takođe će zavisiti od brzine kojom se primenjeni fuzioni protein troši iz slobodne frakcije kod drugog subjekta kod koga je primenjen. Uobičajeni opsezi za terapijski efikasno doziranje fuzionog proteina ili njegovog fragmenta prema pronalasku mogu da budu, u smislu neograničavajućeg primera, od oko 0.1 mg/kg telesne težine do oko 250 mg/kg telesne težine. Uobičajena učestalost doziranja može da bude, na primer, od dvaput dnevno do jednom mesečno.

[0108] Kada se koriste fragmenti fuzionog proteina, poželjno se koristi najmanji inhibitorni fragment koji se specifično vezuje za ciljni molekul. Na primer, mogu da se konstruišu peptidni molekuli koji zadržavaju sposobnost da se vežu za ciljni molekul. Takvi peptidi mogu da budu sintetisani hemijski i/ili proizvedeni rekombinantnom DNK tehnologijom. (Videti, npr., Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)). Formulacija takođe može, ako je to potrebno za konkretnu indikaciju koja se leči, da sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja, poželjno jedinjenja sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedne na druge. Alternativno, ili dodatno, kompozicija može da sadrži agens koji pojačava njenu funkciju, kao što je, na primer, citotoksični agens, citokin, hemoterapeutski agens, agens koji inhibira rast, antizapaljenski agens ili antiinfektivni agens. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne u postizanju predviđene svrhe.

[0109] Aktivni sastojci mogu takođe da budu zatvoreni u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, pomoću koacervacionih tehnika ili pomoću polimerizacije na graničnoj površini, na primer, u hidroksumetilceluloznim ili želatinskim mikrokapsulama i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsulama, redom, u koloidnim sistemima za dostavu leka (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama.

[0110] Formulacije koje će se koristiti za in vivo primenu moraju da budu sterilne. Ovo se lako postiže filtracijom pomoću membrana za sterilnu filtraciju.

[0111] Mogu da se pripreme preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice od čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže fuzioni protein, koje su u vidu oblikovanih elemenata, npr., filmova, ili mikrokapsula. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (SAD pat. br. 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i γ etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradive kopolimere mlečne kiseline-glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT™ (injektabilne mikrosfere koje se sastoje od kopolimera mlečne kiseline-glikolne kiseline i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksibuterne kiseline. Dok polimeri kao što je etilen-vinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula tokom više od 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine tokom kraćih vremenskih perioda.

Farmaceutske kompozicije

[0112] Fuzioni proteini pronalaska (ovde označeni i kao "aktivna jedinjenja"), i njihovi derivati, fragmenti, analozi i homolozi, mogu da budu uključeni u farmaceutske kompozicije pogodne za primenu. Takve kompozicije tipično sadrže fuzioni protein i farmaceutski prihvatljiv nosač. U značenju koje je ovde primenjeno, izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" namenjen je da uključuje bilo koji, i sve rastvarače, medijume za dispergovanje, prevlake, antibakterijske i antigljivične agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, i slično, kompatibilne sa farmaceutskom primenom. Pogodni nosači su opisani u većini skorašnjih izdanja dela Remington’s Pharmaceutical Sciences, standardnog referentnog teksta u ovoj oblasti. Poželjni primeri takvih nosača ili razblaživača uključuju, ali nisu ograničeni na vodu, fiziološki rastvor, Ringerove rastvore, rastvor dekstroze, i 5% humani serumski albumin. Lipozomi i ne-vodeni vehikulumi kao što su fiksna ulja, takođe mogu da se koriste. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance dobro je poznata u stanju tehnike. Osim u slučaju da je bilo koji uobičajeni medijum ili agens nespojiv sa aktivnim jedinjenjem, njegova upotreba se razmatra u kompozicijama. Dodatna aktivna jedinjenja mogu takođe da budu uključena u kompozicije.

[0113] Farmaceutska kompozicija pronalaska je formulisana tako da bude kompatibilna sa predviđenim putem primene. Primeri puteva primene uključuju parenteralnu, npr., intravensku, intradermalnu, subkutanu, oralnu (npr., inhalacija), transdermalnu (tj., topikalnu), transmukoznu i rektalnu primenu. Rastvori ili suspenzije koji se koriste za parenteralnu, intradermalnu, ili subkutanu primenu mogu da uključuju sledeće komponente: sterilni razblaživač kao što su voda za injekcije, slani rastvor, fiksna ulja, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili druge sintetske rastvarače; antibakterijske agense kao što su benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidanse kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helirajuće agense kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA); pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati, i agense za podešavanje toničnosti kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. Vrednost pH može da se podesi pomoću kiselina ili baza, kao što su hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid. Parenteralni preparat može da bude smešten u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili višedozne bočice napravljene od stakla ili plastike.

[0114] Farmaceutske kompozicije pogodne za injektabilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore (kada su rastvorljive u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za magistralnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Za intravensku primenu, pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor, bakteriostatsku vodu, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) ili fosfatno puferisani fiziološki rastvor (PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora da bude sterilna i treba da bude tečna do stepena u kome može lako da se istisne iz šprica. Mora da bude stabilna pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora da bude zaštićena od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama kao što su bakterije i gljive. Nosač može da bude rastvarač ili medijum za dispergovanje koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Ispravna fluidnost može da se održi, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje dejstva mikroorganizama može da se ostvari pomoću različitih antibakterijskih i antigljivičnih agenasa, na primer, parabena, hlorobutanola, fenola, askorbinske kiseline, timerosala, i slično. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključivanje izotoničnih agenasa, na primer, šećera, polialkohola kao što su manitol, sorbitol, natrijum hlorida u kompoziciju. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može da se ostvari uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0115] Sterilni injektabilni rastvori mogu da se pripreme putem uključivanja aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka koji su nabrojani u tekstu iznad, po potrebi praćenog sterilnom filtracijom. Uopšteno, disperzije se pripremaju uključivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni medijum za dispergovanje i druge potrebne sastojke od onih koji su nabrojani u tekstu iznad. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, postupci za pripremu su sušenje na vakuumu i sušenje zamrzavanjem koje daje prašak aktivnog sastojka i bilo kog željenog dodatnog sastojka njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0116] Oralne kompozicije uopšteno uključuju inertni razblaživač ili jestivi nosač. One mogu da budu zatvorene u želatinske kapsule ili presovane u tablete. Za oralnu terapijsku primenu, aktivno jedinjenje može da bude pripremljeno sa ekscipijensima i korišćeno u obliku tableta, troha, ili kapsula. Oralne kompozicije takođe mogu da se pripreme upotrebom tečnog nosača za upotrebu kao tečnost za ispiranje usta, kod kojih se jedinjenje u tečnom nosaču primenjuje oralno, i promućka u ustima i ispljune, ili proguta. Farmaceutski kompatibilni vezivni agensi, i/ili adjuvansi mogu da budu uključeni kao deo kompozicije. Tablete, pilule, kapsule, trohe i slično mogu da sadrže bilo koji od sledećih sastojaka, ili jedinjenja slične prirode: vezivo kao što je mikrokristalna celuloza, guma tragakant ili želatin; ekscipijens kao što je skrob ili laktoza, sredstvo za raspadanje kao što je alginska kiselina, Primogel, ili kukuruzni skrob; lubrikans kao što je magnezijum stearat ili Sterotes; sredstvo za klizanje kao što je koloidni silicijum dioksid; zaslađivač kao što je saharoza ili saharin; ili aromu kao što je pepermint, metil salicilat, ili aroma pomorandže.

[0117] Za primenu inhalacijom, jedinjenja se dostavljaju u obliku aerosol spreja iz kontejnera ili uređaja za doziranje pod pritiskom koji sadrži pogodan propelant, npr., gas kao što je ugljen dioksid, ili iz nebulizera.

[0118] Sistemska primena može takođe da se ostvari na transmukozni ili transdermalni način. Za transmukoznu ili transdermalnu primenu, u formulaciji se koriste penetranti prikladni za barijeru kroz koju jedinjenje treba da prodre. Takvi penetranti su opšte poznati u stanju tehnike, i uključuju, na primer, za transmukoznu primenu, deterdžente, žučne soli, i derivati fuzidinske kiseline. Transmukozna primena može da se postigne upotrebom nazalnih sprejeva ili supozitorija. Za transdermalnu primenu, aktivna jedinjenja su formulisana u masti, meleme, gelove, ili kreme kao što je opšte poznato u stanju tehnike.

[0119] Jedinjenja mogu takođe da se pripreme u obliku supozitorija (npr., sa uobičajenim bazama za supozitorije kao što je kakao buter i drugi gliceridi) ili retencionih klizmi za rektalnu dostavu.

[0120] U jednom aspektu, aktivna jedinjenja se pripremaju sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brze eliminacije iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i mikroinkapsulirane sisteme za dostavu. Mogu da se koriste biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Metode za pripremu takvih formulacija očigledne su stručnjacima u oblasti. Materijali mogu da se nabave i komercijalno kod Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Lipozomske suspenzije mogu takođe da se koriste kao farmaceutski prihvatljivi nosači. One mogu da se pripreme postupcima poznatim stručnjacima u oblasti, na primer, kao što je opisano u SAD patentu br.

4,522,811.

[0121] Posebno je pogodno formulisati oralne ili parenteralne kompozicije u jediničnom doznom obliku zbog jednostavnosti upotrebe i ravnomernosti doziranja. Dozna jedinica, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički odvojene jedinice koje su pogodne kao pojedinačne doze za subjekta koji treba da se leči; gde svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu tako da proizvede željeno terapijsko dejstvo zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacije doznih oblika pronalaska su određene i neposredno zavise od jedinstvenih odlika aktivnog jedinjenja i konkretnog terapijskog dejstva koje treba da se postigne, i od ograničenja svojstvenih oblasti izrade lekova od takvog aktivnog jedinjenja za lečenje pojedinaca.

[0122] Farmaceutske kompozicije mogu da budu sadržane u kontejneru, pakovanju, ili uređaju za doziranje, zajedno sa uputstvom za primenu.

[0123] Pronalazak će biti dodatno opisan u primerima koji slede, koji ne ograničavaju obim pronalaska opisan u patentnim zahtevima.

PRIMERI

Primer 1: Fuzioni proteini AAT-Fc i varijante

[0124] Primeri, ali ne ograničavajući, fuzionih proteina AAT-Fc prema pronalasku, uključuju sledeće sekvence. Iako ovi primeri uključuju sekvencu zglobnog regiona i/ili linkera, fuzioni proteini prema pronalasku mogu da se naprave upotrebom bilo koje sekvence zglobnog regiona i/ili linkera koja je pogodne dužine i/ili fleksibilnosti. Alternativno, fuzioni proteini mogu da se naprave bez upotrebe sekvence zglobnog regiona i/ili linkera. Na primer, polipeptidne komponente mogu direktno da se spoje.

[0125] Primer AAT-Fc fuzionog proteina je AAT-hFc1 (humani IgG1 Fc), koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 2), a IgG-Fc polipeptidni deo fuzionog proteina je dat kurzivom (SEQ ID NO: 3).

AAT-hFc1 (humani IgG1 Fc)

[0126]

[0127] Primer AAT-Fc fuzionog proteina je AAT-hFc2 (humani IgG2 Fc), koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 2), a IgG-Fc polipeptidni deo fuzionog proteina je dat kurzivom (SEQ ID NO: 4).

AAT-hFc2 (humani IgG2 Fc)

[0128]

[0129] Primer AAT-Fc fuzionog proteina je AAT-MM-EL-hFc1 (humani IgG1 Fc, Met351Glu/Met358Leu), koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 34), IgG-Fc polipeptidni deo fuzionog proteina je dat kurzivom (SEQ ID NO: 3), a Met351Glu mutacija je uokvirena, dok je Met358Leu mutacija osenčena sivom bojom.

AAT-MM-EL-hFcl(humani IgG1 Fc, Met351Glu/Met358Leu)

[0130]

[0131] Primer AAT-Fc fuzionog proteina je AAT-MM-EL-hFc2 (humani IgG2 Fc, Met351Glu/Met358Leu), koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 34), IgG-Fc polipeptidni deo fuzionog proteina je dat kurzivom (SEQ ID NO: 4), Met351Glu mutacija je uokvirena, a Met358Leu mutacija je osenčena sivom bojom.

AAT-MM-EL-hFc2(humani IgG2 Fc, Met351Glu/Met358Leu)

[0132]

[0133] Primer AAT-Fc fuzionog proteina je AAT-MM-LL-hFc1 (humani IgG1 Fc, Met351Leu/Met358Leu), koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 35), IgG-Fc polipeptidni deo fuzionog proteina je dat kurzivom (SEQ ID NO: 3), Met351Leu mutacija je osenčena crnom bojom, a Met358Leu mutacija je osenčena sivom bojom.

AAT-MM-LL-hFcl(humani IgG1 Fc, Met351Leu/Met358Leu)

[0134]

[0135] Primer AAT-Fc fuzionog proteina je AAT-MM:LL-hFc2(humani IgG2 Fc, Met351Leu/Met358Leu), koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 35), IgG-Fc polipeptidni deo fuzionog proteina je dat kurzivom (SEQ ID NO: 4), Met351Leu mutacija je osenčena crnom bojom, a Met358Leu mutacija je osenčena sivom bojom.

AAT-MM:LL-hFc2 (humani IgG2 Fc, Met351Leu/Met358Leu)

[0136]

[0137] Primer AAT-Fc fuzionog proteina je AAT-hFc1-AAT (humani IgG1), koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 2), IgG-Fc polipeptidni deo fuzionog proteina je dat kurzivom (SEQ ID NO: 3).

AAT-hFcl-AAT (humani IgG1)

[0138]

[0139] Ovi primeri AAT-Fc fuzionih proteina napravljeni su upotrebom sledećih tehnika.

[0140] Gen koji kodira humani AAT amplifikovan je PCR metodom na osnovu cDNK (Zyagen) iz humane jetre. Specifične tačkaste mutacije u okviru gena koji kodira AAT ili Fc region generisane su metodom preklapajuće PCR. Gen koji kodira AAT kloniran je u istom okviru čitanja sa genom koji kodira zglobni region, praćen CH2 domenom i CH3 domenom humanog IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili IgM, u sisarski ekspresioni vektor koji sadrži sisarsku signalnu sekvencu za sekreciju uzvodno od mesta insercije AAT gena. Ovi ekspresioni vektori su transficirani u sisarske ćelije (konkretno HEK293 ili CHO ćelije) i gajeni nekoliko dana u 8% CO2na 37 °C. Rekombinantni AAT-Fc fuzioni proteini prečišćeni su iz supernatanta ekspresionih ćelija hromatografijom na koloni sa proteinom A. Važno je reći da je za eluciju AAT-Fc fuzionih proteina sa smole koja sadrži protein A, korišćen pufer sa skoro neutralnim pH (Gentle Ag/Ab Elution Buffer, Thermo Scientific). AAT-Fc fuzioni protein ne može da se eluira sa smole sa proteinom A upotrebom standardne elucije na niskom pH, pošto je sposobnost AAT da inhibira NE ugrožena nakon obrade niskim pH, verovatno usled toga što niski pH posreduje u oligomerizaciji AAT. Slika 1F prikazuje dejstvo elucije na niskom pH na sposobnost AAT da inhibira neutrofilnu elastazu. AAT-Fc fuzioni protein može da se prečisti ili proteinom A i puferom sa skoro neutralnim pH, pomoću CaptureSelect<®>alfa-1 antitripsin afinitetnog matriksa (BAC BV).

[0141] Aktivnost prečišćenih AAT-Fc fuzionih proteina testirana je određivanjem njihove sposobnosti da inhibiraju neutrofilnu elastazu (NE). Slika 1B i 1D prikazuju redukujući SDS-PAGE gel sa prečišćenim serumskim AAT (sdAAT) i sa fuzionim proteinima AAT-Fc (sl. 1B-traka 1: sdAAT, traka 2: AAT-Fc (SEQ ID NO: 16), traka 3: AAT-EL-Fc (SEQ ID NO: 18), Sl. ID AAT-Fc-AAT (SEQ ID NO: 20). Proteini su vizuelizovani pomoću bojenja bojom komasi plavo.

[0142] Za praćenje aktivnosti humane neutrofilne elastaze (NE) korišćen je fluorescentni test u mikrotitar pločama. Inhibitorna aktivnost je merena preko istovremenog smanjenja rezidualne NE aktivnosti, upotrebom sledećeg testa. Pufer za testiranje se sastoji od 100 mM Tris pH 7.4, 500 mM NaCl i 0.0005% Triton X-100. Humana NE koristi se u finalnoj koncentraciji od 5 nM (ali može da se koristi od 1-20 nM). U ovom testu, fluorescentni peptidni supstrat AAVP-AMC koristi se u finalnoj koncentraciji od 100 μM. Gemini EM čitač mikrotitar ploča, proizvođača Molecular Devices, koristi se za očitavanje kinetike testa upotrebom talasnih dužina za ekscitaciju i emisiju od 370 nm i 440 nm, redom, i granične vrednosti od 420 nm. Test se očitava tokom 10 min na sobnoj temperaturi, merenjem na svakih 5 do 10 sekundi. Vmax po sekundi odgovara rezidualnoj NE aktivnosti, koja se nanosi na grafik za svaku koncentraciju inhibitora. Mesto preseka sa x-osom označava koncentraciju inhibitora potrebnu za potpunu inaktivaciju početne koncentracije NE u testu. AAT (sdAAT) dobijen iz humanog seruma korišćen je kao pozitivna kontrola u ovim testovima. AAT Fc fuzioni proteini pokazuju snažnu NE inhibitornu aktivnost, kao što je prikazano na slici 1C. Fuzija kod koje su dva AAT polipeptida vezana sa jednim Fc polipeptidom (AAT-Fc-AAT) pokazuje pojačanu potenciju i u odnosu na sdAAT i na AAT-Fc fuzioni protein koji sadrži samo jedan AAT polipeptid (slika 1E). Ovi nalazi, koji su ovde predstavljeni, pokazuju po prvi put da AAT može da bude spojen sa Fc regionom, a da zadrži svoju sposobnost da inhibira NE. Što je naročito značajno, nađeno je da je fuzioni protein AAT-Fc-AAT potentniji inhibitor NE.

[0143] Slika 1F prikazuje otpornost fuzionog proteina AAT-EL-Fc (M351E, M358L) na inaktivaciju putem oksidacije. AAT fuzioni proteini, AAT-Fc (divljeg tipa), AAT-EL-Fc (M351E, M358L) i AAT-EM-Fc (M351E), obrađeni su 33mM H2O2i upoređeni sa neobrađenim fuzionim proteinima u testovima inhibicije NE. Inhibicija NE pomoću AAT-EL-Fc nije pogođena oksidacijom, za razliku od drugih testiranih proteina.

[0144] Osim toga, fuzioni protein AAT-Fc ispoljio je duži polu-život u serumu kod pacova u poređenju sa AAT dobijenim iz seruma (slika 1H). U ovim studijama, za svaki testirani protein su po 3 pacova injecirana intravenski sa 10 mg/kg sdAAT ili AAT-Fc. Uzorci seruma uzimani su u različitim momentima tokom perioda od 48h. Koncentracija ATT u serumu određena je pomoću ELISA testa. Ovi nalazi pokazuju da fuzioni proteini prema pronalasku imaju poboljšana farmakokinetička svojstva i da predstavljaju superioran terapeutski format u odnosu na serumski AAT za lečenje brojnih zapaljenskih stanja i infektivnih bolesti kod ljudi.

Primer 2: Fuzioni proteini AAT- molekul usmeren na TNFα

[0145] Ovde prikazane studije opisuju nekoliko neograničavajućih primera rekombinantnih derivata AAT koji uključuju humani AAT spojen sa anti-TNFa antitelom ili derivatom TNFα receptora. Ovi primeri su obezbeđeni u daljem tekstu kako bi se dodatno ilustrovala različita svojstva predmetnog pronalaska. Primeri takođe ilustruju korisnu metodologiju za primenu pronalaska. Ovi primerni ne ograničavaju, niti im je namera da ograniče, pronalazak za koji se traži zaštita.

[0146] Fuzioni proteini iz primera koji slede uključuju polipeptidne sekvence za ciljano delovanje na citokine, koje pripadaju, ili potiču od, (i) anti-TNFa antitela D2E7 (koje je poznato i kao Adalimumab ili Humira<®>) ili (ii) vanćelijskog domena TNFα receptora tipa 2 (TNFR2-ECD). AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen, konstantni regioni antitela (CH1-zglobni region-CH2-CH3 ili CL) su dati kurzivom, a D2E7-VH, D2E7-VK i TNFR2-ECD su označeni podebljanim tekstom. Iako ovi primeri uključuju sekvencu zglobnog regiona i/ili sekvencu linkera, fuzioni proteini prema pronalasku mogu da se naprave upotrebom bilo koje sekvence zglobnog regiona i/ili linkera koja je pogodne dužine i/ili fleksibilnosti. Alternativno fuzioni proteini mogu da se naprave bez upotrebe sekvence zglobnog regiona i/ili linkera.

[0147] Primer AAT-TNFα fuzionog proteina je ovde opisani D2E7-laki lanac-AAT (G3S)2linker. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 2), D2E7-VK je označen podebljanim tekstom (SEQ ID NO: 37), a konstantni regioni antitela dati su kurzivom (SEQ ID NO: 38)

D2E7-laki lanac-AAT (G3S)2linker

[0148]

[0149] Primer AAT-TNFα fuzionog proteina je D2E7-laki lanac-AAT ASTGS linker, koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 2), D2E7-VK je označen podebljanim tekstom (SEQ ID NO: 37), a konstantni regioni antitela su dati kurzivom (SEQ ID NO: 38)

D2E7-laki lanac-AAT ASTGS linker

[0150]

[0151] Primer AAT-TNFα fuzionog proteina je D2E7-teški lanac-AAT (G3S)2linker, koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 2), D2E7-VH je označen podebljanim tekstom (SEQ ID NO: 39), a konstantni regioni antitela su dati kurzivom (SEQ ID NO: 40)

D2E7-teški lanac-AAT (G3S)2linker

[0152]

[0153] Primer AAT-TNFα fuzionog proteina je D2E7- teški lanac -AAT ASTGS linker, koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 2), D2E7-VH je označen podebljanim tekstom (SEQ ID NO: 39), a konstantni regioni antitela su dati kurzivom (SEQ ID NO: 40)

D2E7- teški lanac -AAT ASTGS linker

[0154]

[0155] Primer AAT-TNFα fuzionog proteina je TNFR2-ECD-Fc1-AAT(G3S)2linker, koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 2), TNFR2-ECD je označen podebljanim tekstom (SEQ ID NO: 41), a konstantni regioni antitela su dati kurzivom (SEQ ID NO: 42)

TNFR2-ECD-Fc1-AAT(G3S)2linker

[0156]

[0157] Primer AAT-TNFα fuzionog proteina je TNFR2-ECD-Fc1-AAT ASTGS linker, koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 2), TNFR2-ECD je označen podebljanim tekstom (SEQ ID NO: 41), a konstantni regioni antitela su dati kurzivom (SEQ ID NO: 42)

TNFR2-ECD-Fc1-AAT ASTGS linker

[0158]

[0159] Ovi primeri molekula fuzionih proteina usmerenih na AAT-TNFα, napravljeni su upotrebom sledećih tehnika.

[0160] Geni koji kodiraju varijabilne teške (VH) i varijabilne kapa (VK) regione anti-TNFa antitela, D2E7, generisani su sintezom gena. D2E7-VH gen je kloniran u istom okviru čitanja sa genom koji kodira konstantni region teškog lanca humanog IgG1 antitela, koji se sastoji od CH1 domena, domena zglobnog regiona, CH2 domena, i CH3 domena, u sisarski ekspresioni vektor koji sadrži sisarsku signalnu sekvencu za sekreciju, uzvodno od mesta insercije VH domena (D2E7-HC). D2E7-VK gen je kloniran u istom okviru čitanja sa konstantnim (CL) domenom lakog kapa lanca humanog antitela, u sisarski ekspresioni vektor koji sadrži sisarsku signalnu sekvencu za sekreciju, uzvodno od mesta insercije VK domena (D2E7-LC). Gen koji kodira AAT i susedna 5’ linkerska sekvenca klonirani su u istom okviru čitanja, u 3’ kraj kodirajućih sekvenci, ili CH3 domena D2E7 gena teškog lanca (D2E7-HC-AAT), ili CL domena D2E7 gena lakog lanca (D2E7-LC-AAT) u prethodno opisane sisarske ekspresione vektore. Vanćelijski domen TNFα receptora 2 (TNFR2-ECD) generisan je sintezom gena i kloniran u istom okviru čitanja sa genom koji kodira zglobni region, praćen CH2 domenom i CH3 domenom humanog IgG1 (hFc1) u sisarski ekspresioni vektor, koji sadrži sisarsku signalnu sekvencu za sekreciju, uzvodno od mesta insercije za TNFR2-ECD.

Gen koji kodira AAT i susedna 5’ linkerska sekvenca klonirani su u istom okviru čitanja, u 3’ kraj gena koji kodira TNFR2- ECD-hFc1, u sisarski ekspresioni vektor (TNFR2-ECD-hFc1-AAT).

[0161] Ekspresioni vektor D2E7-HC-AAT je bio ko-transficiran ili sa D2E7-LC ili D2E7-LC-AAT ekspresionim vektorom u sisarske ćelije (konkretno HEK293 ili CHO ćelije) kako bi bilo generisano D2E7 antitelo sa kod koga je AAT spojen sa C-terminusom teškog lanca ili C terminusim i teškog i lakog lanca, redom. D2E7-LC-AAT je bio ko-transficiran sa D2E7-HC ekspresionim vektorom u sisarske ćelije, kako bi bilo generisano D2E7 antitelo kod koga je AAT spojen sa C-terminusom lakog lanca. Ekspresioni vektor TNFR2-hFc1-AAT transficiran je u sisarske ćelije. Transficirane ćelije su gajene nekoliko dana u 8% CO2na 37 °C.

[0162] Rekombinantni fuzioni proteini usmereni na AAT-TNFα prečišćeni su iz supernatanta ekspresionih ćelija hromatografijom na koloni sa proteinom A. Za eluciju fuzionih proteina usmerenih na AAT-TNFα sa smole koja sadrži protein A, korišćen je pufer sa skoro neutralnim pH (Gentle Ag/Ab Elution Buffer, Thermo Scientific).

[0163] Slika 2B prikazuje SDS-PAGE gel samog D2E7 antitela (traka 1) i varijante kod koje je AAT spojen sa teškim lancem D2E7 (traka 2). Proteini su vizuelizovani pomoću bojenja bojom komasi plavo.

[0164] Aktivnost prečišćenih fuzionih proteina AAT-molekul usmeren na TNFα, testirana je određivanjem njihove sposobnosti da inhibiraju neutrofilnu elastazu. AAT (sdAAT) dobijen iz humanog seruma korišćen je kao pozitivna kontrola u ovim testovima. Test inhibicije NE sproveden je na način prethodno opisan u tekstu. Slika 2C pokazuje da, u odnosu na sdAAT, fuzioni protein AAT- molekul usmeren na TNFα, pokazuje sličnu inhibiciju neutrofilne elastaze, što ukazuje na to da kapacitet AAT za inhibiciju nije ugrožen njegovim spajanjem sa antitelom.

Primer 3 AAT-Fc-SLPI i AAT-Fc-elafin

[0165] Ovde prikazane studije opisuju nekoliko neograničavajućih primera derivata rekombinantnog AAT koji uključuju humani AAT spojen sa proteinom koji sadrži WAP domen. Ovi primeri su obezbeđeni u daljem tekstu kako bi se dodatno ilustrovala različita svojstva predmetnog pronalaska. Primeri takođe ilustruju korisnu metodologiju za primenu pronalaska. AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen, Fc deo je dat kurzivom, a polipeptid koji sadrži WAP domen je dat podebljanim slovima. Iako ovi primeri uključuju sekvencu zglobnog regiona i/ili linkera, fuzioni proteini prema pronalasku mogu da se naprave upotrebom bilo koje sekvence zglobnog regiona i/ili linkera koja je pogodne dužine i/ili fleksibilnosti. Alternativno, fuzioni proteini mogu da se naprave bez upotrebe sekvence zglobnog regiona i/ili linkera. Na primer, polipeptidne komponente mogu direktno da se spoje.

[0166] Primer AAT-Fc-SLPI fuzionog proteina je AAT-hFc1-SLPI (humani IgG1 Fc), koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 2), Fc deo je dat kurzivom (SEQ ID NO: 3), a polipeptid koji sadrži WAP domen je dat podebljanim slovima (SEQ ID NO: 9)

AAT-hFcl-SLPI (humani IgG1 Fc)

[0167]

[0168] Primer AAT-Fc-SLPI fuzionog proteina je AAT-hFc1-SLPI (humani IgG1 Fc), koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 2), Fc deo je dat kurzivom (SEQ ID NO: 3), a polipeptid koji sadrži WAP domen je dat podebljanim slovima (SEQ ID NO: 12)

AAT-hFc1-elafin (humani IgG1 Fc)

[0169]

[0170] Geni koji kodiraju SLPI i elafin amplifikovani su PCR metodom na osnovu cDNK (Zyagen) iz humane jetre. Ovi geni su klonirani u sisarske ekspresione vektore iz primera 1, pri čemu su SLPI ili elafinski gen ubačeni u istom okviru čitanja sa AAT-Fc genom. Ovi ekspresioni vektori su transficirani u sisarske ćelije (konkretno HEK293 ili CHO ćelije) i gajeni nekoliko dana u 8% CO2na 37 °C. Rekombinantni fuzioni proteini AAT-Fc-WAP domen prečišćeni su iz supernatanta ekspresionih ćelija hromatografijom na koloni sa proteinom A. Za eluciju fuzionog proteina AAT-Fc-WAP domen sa smole koja sadrži protein A, korišćen je pufer sa skoro neutralnim pH (Gentle Ag/Ab Elution Buffer, Thermo Scientific).

[0171] Slika 3B prikazuje SDS-PAGE gel fuzionih proteina AAT-Fc-WAP (traka 1 AAT-Fc-elafin, traka 2 AAT-Fc- SLPI). Proteini su vizuelizovani pomoću bojenja bojom komasi plavo. Aktivnost prečišćenih fuzionih proteina AAT-Fc-WAP domen, testirana je određivanjem njihove sposobnosti da inhibiraju neutrofilnu elastazu. Testovi NE inhibicije sprovedeni su na način prethodno opisan u tekstu. AAT (sdAAT) dobijen iz humanog seruma i fuzioni protein AAT-Fc, korišćeni su kao pozitivna kontrola u ovim testovima. U odnosu na sdAAT, fuzioni proteini AAT-Fc-molekul usmeren na WAP, pokazuju pojačanu potenciju NE inhibicije neutrofilne elastaze (slika 3C).

Primer 4 AAT-albumin

[0172] Ovde prikazane studije opisuju nekoliko neograničavajućih primera rekombinantnih derivata AAT koji uključuju humani AAT spojen sa albuminskim polipeptidom. Ovi primeri su obezbeđeni u daljem tekstu kako bi se dodatno ilustrovala različita svojstva predmetnog pronalaska. Primeri takođe ilustruju korisnu metodologiju za primenu pronalaska. Ovi primeri ne ograničavaju, niti im je namera da ograniče, pronalazak za koji se traži zaštita. AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen, a albuminski deo je dat kurzivom. Na primer, polipeptidne komponente mogu da budu direktno spojene.

[0173] Primer AAT-albumin fuzionog proteina je AAT-HSA, koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 2), a albuminski polipeptid je dat kurzivom (SEQ ID NO: 14)

AAT-HSA

[0174]

[0175] Primer AAT-albumin fuzionog proteina je AAT-HSA domen 3, koji je ovde opisan. Kao što je u tekstu koji sledi prikazano, AAT polipeptidni deo fuzionog proteina je podvučen (SEQ ID NO: 2), a albuminski polipeptid je dat kurzivom (SEQ ID NO: 15)

AAT-HSA domen 3

[0176]

[0177] Gen koji kodira humani serumski albumin (HSA) amplifikovan je PCR metodom na osnovu cDNK (Zyagen) iz humane jetre. Generisan je sisarski ekspresioni vektor, gde je gen koji kodira HSA ili domen 3 koji pripada HSA, kloniran u okviru čitanja u 3’ kraj gena koji kodira AAT, koji sadrži sisarsku signalnu sekvencu za sekreciju uzvodno od AAT.

[0178] Ovi ekspresioni vektori su transficirani u sisarske ćelije (konkretno HEK293 ili CHO ćelije) i gajeni nekoliko dana u 8% CO2na 37 °C. Rekombinantni AAT-HSA fuzioni proteini prečišćeni su iz supernatanta ekspresionih ćelija pomoću CaptureSelect<®>alfa-1 antitripsin afinitetnog matriksa (BAC BV), pri čemu se pufer za vezivanje sastojao od 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4, a pufer za eluciju od 20 mM Tris, 2M MgCl2pH 7.4.

[0179] Slika 4B pokazuje SDS-PAGE gel fuzionog proteina AAT-HSA. Proteini su vizuelizovani pomoću bojenja bojom komasi plavo. Aktivnost prečišćenih AAT-HSA fuzionih proteina testirana je određivanjem njihove sposobnosti da inhibiraju neutrofilnu elastazu. Testovi NE inhibicije sprovedeni su na način prethodno opisan u tekstu. AAT (sdAAT) dobijen iz humanog seruma korišćen je kao pozitivna kontrola u ovim testovima. U odnosu na sdAAT, fuzioni protein AAT-HS prikazuje sličnu potenciju NE inhibicije, pokazujući tako da fuzija sa albuminom ne prigušuje kapacitet AAT da inhibira NE (slika 4C.)

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovani fuzioni protein koji sadrži najmanje jedan humani polipeptid alfa-1 antitripsin (AAT) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 32 i SEQ ID NO: 33, u kome je polipeptid AAT funkcionalno povezan sa imunoglobulinskim Fc polipeptidom, naznačen time, što izolovani fuzioni protein ispoljava aktivnost inhibicije serin proteaze i namenjen je upotrebi u postupku za lečenje bolesti ili poremećaja kod subjekta, odabranog od nedostatka AAT, emfizema, hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD), akutnog respiratornog distres sindroma (ARDS), alergijske astme, cistične fibroze, kancera pluća, ishemijsko-reperfuzione povrede, ishemijsko/reperfuzione povrede nakon transplantacije srca, infarkta miokarda, reumatoidnog artritisa, septičkog artritisa, psorijaznog artritisa, ankiloznog spondilitisa, Kronove bolesti, psorijaze, dijabetesa tipa I i/ili tipa II, pneumonije, sepse, bolesti kalem-protiv-domaćina (GVHD), zarastanja rane, sistemskog eritemskog lupusa i multiple skleroze.

2. Izolovani fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što je bolest ili poremećaj nedostatak AAT.

3. Izolovani fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što je bolest ili poremećaj cistična fibroza, ARDS, emfizem uzrokovan pušenjem ili COPD.

4. Izolovani fuzioni protein za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time, što je subjekt čovek.

5. Izolovani fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što imunoglobulinski Fc polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 98% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 6.

6. Izolovani fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što su polipeptid AAT i imunoglobulinski Fc polipeptid funkcionalno povezani putem zglobnog regiona, linkerskog regiona, ili oba, zglobnog regiona i linkerskog regiona, gde opciono zglobni region, linkerski region ili oba, zglobni region i linkerski region, sadrže peptidnu sekvencu.

7. Izolovani fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što humani polipeptid AAT sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, pri čemu je polipeptid funkcionalno povezan sa imunoglobulinskim Fc polipeptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 98% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 6.

8. Izolovani fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što humani polipeptid AAT sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, pri čemu je polipeptid povezan sa imunoglobulinskim Fc polipeptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 98% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 6.

9. Izolovani fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što humani polipeptid AAT sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32, pri čemu je polipeptid povezan sa imunoglobulinskim Fc polipeptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 98% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 6.

10. Izolovani fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što humani polipeptid AAT sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33, pri čemu je polipeptid povezan sa imunoglobulinskim Fc polipeptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 98% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 6.

11. Izolovani fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što fuzioni protein dodatno sadrži polipeptidnu sekvencu koja sadrži WAP domen, pri čemu opciono:

a. polipeptidna sekvenca koja sadrži WAP domen sadrži sekvencu polipeptida SLPI koja sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 9 i 8; ili b. polipeptidna sekvenca koja sadrži WAP domen sadrži sekvencu polipeptida elafina koja sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13, 12 i 11.

12. Izolovani fuzioni protein za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, gde:

a. imunoglobulinski Fc polipeptid je modifikovan tako da poboljšava vezivanje FcRn;

b. imunoglobulinski Fc polipeptid sadrži najmanje jednu od sledećih mutacija: Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu, Met428Leu ili Asn434Ser.