RS57412B1 - Anti-dll3 antitelo - Google Patents
Anti-dll3 antiteloInfo
- Publication number
- RS57412B1 RS57412B1 RS20180696A RSP20180696A RS57412B1 RS 57412 B1 RS57412 B1 RS 57412B1 RS 20180696 A RS20180696 A RS 20180696A RS P20180696 A RSP20180696 A RS P20180696A RS 57412 B1 RS57412 B1 RS 57412B1
- Authority
- RS
- Serbia
- Prior art keywords
- antibody
- dll3
- seq
- amino acid
- acid sequence
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G01N33/575—
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
Description
Opis
Oblast tehnike
[0001] Sadašnja prijava zahteva prioritet na osnovu Japanske patentne prijave br.2010-019391 (podnete 29. januara 2010. godine).
[0002] Sadašnji pronalazak se odnosi na antikancerogeni agens.
Stanje tehnike
[0003] Mikrocelularni (sitnoćelijski) karcinom pluća čini oko 20% svih slučajeva karcinoma pluća. Sitnoćelijski karcinom pluća brzo napreduje i teško ga je ukloniti hirurškim putem usled metastaze limfnih čvorova ili se u mnogim slučajevima već javljaju udaljene metastaze kada je dijagnoza postavljena. Ovaj karcinom pokazuje visoku stopu odgovora na antikancerogeni agens, u svom ranom stadijumu. Stoga se hemioterapija smatra prvim izborom za lečenje raka. Rak, međutim, odmah postaje rezistentan na hemioterapiju i ponavlja se, što rezultira stopom trogodišnjeg preživljavanja od 5% ili niže. Stoga je potrebna nova terapija.
[0004] Delta-nalik 3 (DLL3) je membranski protein tipa I, koji pripada članovima porodice Notch liganada. DLL3 je neophodan za normalno obrazovanje somita (sličnih segmenata) i kopiranje. Mutacije u DLL3-u uzrokuju rebarne defekte ili spondilolizu, kod pacijenata sa autozomno recesivnim spondilokostalnim disostozama [Nepatentna literatura 1 i 2]. DLL1 se lokalizuje na ćelijskoj površini i vezuje za Notch, dok se DLL3 pretežno lokalizuje na Goldžijevom aparatu i ne vezuje se za Notch [Nepatentna Literatura 3 i 4].
[0005] Postoje prethodne studije koje su prijavile amplifikaciju DLL3 gena na hromozomu i povećanu ekspresiju ovog gena u ćelijskim linijama raka pankreasa [Nepatentna Literatura 5] i povećanu DLL3 ekspresiju u nekim slučajevima glioma [Nepatentna Literatura 6]. Međutim, broj DLL3 proteina na ćelijskoj površini još uvek nije zabeležen. Potrebna je ekspresija od 10<5>ili više antigenskih molekula za nemodifikovana antitela ili antigenskih molekula reda 10<4>čak i za defukozilovana antitela koja imaju povećanu sposobnost da indukuju ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), za ciljanje antigenskih molekula na ćelijskoj površini, korišćenjem takvih antitela ili za uništavanje ćelija raka pod antitumorskim mehanizmom ADCC aktivnosti [Nepatentna Literatura 7]. Stoga je nejasno da li je DLL3 pogodan kao terapijski cilj baziran na antitelima.
[0006] Mišja anti-DLL3 monoklonska antitela (MAB4315, R&D Systems, Inc.) su već komercijalno dostupna kao istraživački reagens.
Spisak citata
Nepatentna Literatura
[0007]
Nepatentna Literatura 1: Bulman, M. P. i sar. (2000) Nat Genet 24, 438-441.
Nepatentna Literatura 2: Turnpenny, P. D. i sar. (2003) J Med Genet 40, 333-339. Nepatentna Literatura 3: Geffers, I. i sar. (2007) J Cell Biol 178, 465-476.
Nepatentna Literatura 4: Ladi, E. i sar. (2005) J Cell Biol 170, 983-992.
Nepatentna Literatura 5: Phillips, H. S. (2006) Cancer cell 9, 157-173.
Nepatentna Literatura 6: Mulledndore, M. E. (2009) Clin Cancer Res 15, 2291-2301. Nepatentna Literatura 7: Kenya Shitara (2009) YAKUGAKU ZASSHI 129, 3-9.
[0008] Sledeća, dalja dokumenta su takođe reference:
• Millipore „ Anti-Delta 3, klon 1E7.2“, internet citiranje, str 1-3, XP002697359;
• Tianyun i sar (2009) Cancer Research, 69(3): 845-854 koji se odnosi na Achaete- Scute kopleks homologa 1, kao regulisanje kapaciteta inicijacije tumora kod sitnoćelijskog karcinoma pluća; i
• WO2007/111733 koji se odnosi na metode za dijagnostikovanje, prognozu i lečenje glioma.
Rezime pronalaska
Tehnički problem
[0009] Predmet sadašnjeg pronalaska je da obezbedi novo antitelo, antikancerogeno sredstvo koje sadrži isto, i metod za dijagnozu raka korišćenjem istog.
Rešenje problema
[0010] Sadašnji pronalazači su otkrili da je ekspresija DLL3 mRNK povećana kod sitnoćelijskog karcinoma pluća. Ova ekspresija je bila niska u svim normalnim tkivima osim fetalnog mozga. Sadašnji pronalazači su pripremili monoklonska antitela protiv DLL3 proteina. Nivo antigena na ćelijskoj površini, izmeren na osnovu sposobnosti vezivanja za antitelo je bio manji samo od 10<4>po ekspresionoj ćeliji. Neočekivano, sadašnji pronalazači su otkrili da je antitelo koje je vezano za DLL3 putem karakterističnog epitopa u blizini C završetka ekstracelularnog domena, stabilno nastanjeno na ćelijskoj membrani i posedovalo je aktivnost koja indukuje ADCC. Specifično, sadašnji pronalazači su sukcesivno pratili antitelo koje ima antitumorsku aktivnost. Štaviše, sadašnji pronalazači su otkrili da antitelo konjugovano sa toksinom ima citotoksičnu aktivnost protiv ćelija koje izražavaju DLL3. Iz ovih nalaza, sadašnji pronalazači su otkrili da je anti-DLL3 antitelo korisno u dijagnozi, prevenciji i lečenju primarnog ili metastatskog karcinoma koji eksprimira DLL3. Na osnovu ovih nalaza, sadašnji pronalazak je završen.
[0011] Na taj način, sadašnji pronalazak obezbeđuje farmaceutski preparat koji sadrži antitelo koje se vezuje za DLL3 protein, kao aktivni sastojak, pri čemu antitelo ima citotoksičnu aktivnost. Sadašnji pronalazak dalje, obezbeđuje farmaceutski preparat prema pronalasku za upotrebu u postupku lečenja raka, gde antikancerogeno sredstvo cilja rak pluća.
[0012] Farmaceutski preparat prema sadašnjem pronalasku sadrži antitelo koje se vezuje za DLL3 protein, pri čemu antitelo ima citotoksičnu aktivnost. Posebno poželjna, citotoksična aktivnost je ćelijski posredovana citotoksična aktivnost zavisna od antitela (ADCC aktivnost). Takođe kao poželjno, antitelo ima aktivnost internalizacije. Takođe poželjno, antitelo je konjugovano sa citotoksičnom supstancom. Takođe poželjno, antitelo prepoznaje region od aminokiselina 216 do 492 u humanom DLL3 koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je dalje izneto u SEK ID BR: 1.
[0013] U drugom aspektu, farmaceutski preparat prema pronalasku sadrži antitelo izabrano od antitela koje se vezuje za DLL3 protein, opisano u bilo kojem od sledećeg:
(1) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 12, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 13 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 14 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 18, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 19 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 20;
(2) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je dalje izneto u SEK ID BR: 24, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 25 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 26 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 30, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 31 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 32; (3) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 36, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 37 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 42, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 43 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 44;
(4) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 48, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 49 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 50 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 54, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 55 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 56; i
(5) antitelo koje se vezuje za isti epitop kao onaj u DLL3 proteinu za koji se vezuje bilo koje od antitela (1) do (4) .
[0014] Farmaceutski preparat prema sadašnjem pronalasku, može da sadrži bilo koje od antitela, gore opisanih, kao aktivni sastojak koji se vezuje za DLL3 i ima citotoksičnu aktivnost. Sadašnji pronalazak takođe, obezbeđuje farmaceutski preparat za upotrebu u postupku za lečenje raka, pri čemu antikancerogeno sredstvo cilja rak pluća.
[0015] Takođe, odnosi se na postupak za dijagnostikovanje raka, koji obuhvata sledeće korake: (a) obezbeđivanje uzorka izolovanog od ispitivanog subjekta; i
(b) detektovanje nivoa ekspresije DLL3 proteina ili DLL3 gena u uzorku. Poželjno, metod dijagnoze je namenjen za dijagnozu karcinoma pluća. Takođe, obezbeđuje dijagnostičko sredstvo za rak, koje sadrži bilo koje od antitela, gore opisanih.
Kratak opis crteža
[0016]
[Slika 1] Slika 1 prikazuje povećanu ekspresiju DLL3 kod sitnoćelijskog karcinoma pluća i u fetalnom mozgu.
[Slika 2] Slika 2 prikazuje vezivanje anti-DLL3 monoklonskog antitela za rastvorljivi DLL3 protein.
[Slika 3] Slika 3 prikazuje vezivanje antitela za DLL3 protein na ćelijskoj membrani i kretanje antitela vezanog za ćeliju.
[Slika 4] Slika 4 prikazuje indukciju ADCC-a pomoću anti-DLL3 antitela (koncentracija: 2,5 μg/ml).
[Slika 5] Slika 5 prikazuje zavisnost koncentracije antitela ADCC aktivnosti protiv ciljnih ćelija DLL3/BaF3 (a) i NCI-H1184 (b).
[Slika 6] Slika 6 prikazuje inhibiciju rasta ćelija preuzimanjem anti-DLL3 antitela i antimišjeg sekundarnog antitela Mab-ZAP obeleženog sa toksinom.
[Slika 7] Slika 7 prikazuje vezivanje rekombinantnog anti-DLL3 antitela za DLL3 protein na ćelijskoj površini.
[Slika 8] Slika 8 prikazuje vezivanje rekombinantnog humanog himernog antitela protiv DLL3 za rastvorljivi DLL3 protein i konkurentnost vezivanja anti-DLL3 himernog antitela sa antitelom miša protiv rastvorljivog DLL3 proteina.
[Slika 9] Slika 9 prikazuje shematsku strukturu pune-dužine i rastvorljivih DLL3 proteina i mesto prepoznato od strane anti-DLL3 antitela.
[Slika 10] Slika 10 prikazuje vezivanje rekombinantnog anti-DLL3 humanog himernog antitela DL306 za DLL3 protein na površini ćelije.
[Slika 11] Slika 11 prikazuje zavisnost koncentracije antitela ADCC aktivnosti od anti-DLL3 humanog himernog antitela protiv ciljnih ćelija DLL3/BaF3 i NCI-H1184.
[Slika 12] Slika 12 prikazuje zavisnost koncentracije antitela ADCC aktivnosti od anti-DLL3 mišjeg nisko-fukoznog antitela protiv ciljnih ćelija DLL3/BaF3 i NCI-H1184.
Opis realizacija
DLL3
[0017] Aminokiselinska sekvenca DLL3 (Delta-nalik 3) je poznata u struci. Na primer, aminokiselinska sekvenca humanog DLL3 je navedena u SEK ID BR: 1 (NM_016941), a aminokiselinska sekvenca mišjeg DLL3 je navedena u SEK ID BR: 2 (NM_007866).
[0018] DLL3 protein korišćen u sadašnjem pronalasku, može biti DLL3 protein koji ima gore opisanu sekvencu ili može biti modifikovani protein koji ima sekvencu izvedenu iz sekvence iznad opisane, modifikacijom jedne ili više aminokiselina. Primeri modifikovanog proteina koji imaju sekvencu izvedenu iz sekvence, gore opisane, modifikacijom jedne ili više aminokiselina, mogu da uključuju polipeptide koji imaju 70% ili više, poželjno 80% ili više, poželjnije 90% ili više, čak još poželjnije 95% ili više homologije sa aminokiselinskom sekvencom. Alternativno, mogu se koristiti parcijalni peptidi ovih DLL3 proteina.
[0019] DLL3 protein korišćen u sadašnjem pronalasku nije ograničen njegovim poreklom i poželjno je humani DLL3 protein.
Anti-DLL3 antitelo
[0020] Anti-DLL3 antitelo koje se koristi u sadašnjem pronalasku treba samo da se vezuje za DLL3 protein i nije posebno ograničeno njegovim poreklom, tipom, oblikom itd., ali ima citotoksičnu aktivnost. Specifično, može biti korišćeno antitelo, kao što je antitelo koje nije humano izvedeno od životinje (npr. antitelo miša, pacova ili kamile), antitelo humanog porekla, himerno antitelo ili humanizovano antitelo. Anti-DLL3 antitelo korišćeno u sadašnjem pronalasku, može biti poliklonsko ili monoklonsko antitelo i poželjno je monoklonsko antitelo.
[0021] Anti-DLL3 antitelo koje se koristi u sadašnjem pronalasku je poželjno anti-humano DLL3 antitelo. Antitelo protiv humanog DLL3, može biti antitelo koje se specifično vezuje za humani DLL3 ili može biti antitelo koje se vezuje za humani DLL3, kao i DLL3 koji nije humani izveden od životinja (npr., DLL3 miša).
[0022] Anti-DLL3 antitelo korišćeno u sadašnjem pronalasku, može biti dobijeno kao poliklonsko ili monoklonsko antitelo, korišćenjem sredstava poznatih u struci. Anti-DLL3 antitelo koje se koristi u sadašnjem pronalasku je posebno poželjno, monoklonsko antitelo izvedeno iz sisara. Monoklonsko antitelo izvedeno od sisara obuhvata, na primer, ona proizvedena pomoću hibridoma i ona proizvedena pomoću domaćina transformisanih sa ekspresionim vektorima koji sadrže gen antitela pomoću pristupa genetskog inženjeringa.
[0023] Antitelo protiv DLL3 prema sadašnjem pronalasku, može biti modifikovano sa različitim molekulima kao što je polietilen glikol (PEG). Kao što je kasnije opisano, anti-DLL3 antitelo iz sadašnjeg pronalaska takođe, može biti modifikovano sa hemioterapeutskim sredstvom, radioaktivnom hemikalijom ili slično, koje ima citotoksičnu aktivnost.
[0024] Primeri antitela korišćenih u sadašnjem pronalasku, koja prepoznaju DLL3 i vezuju se za njega, mogu da obuhvate sledeća antitela:
(1) antitelo (DL301) koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 12, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 13 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 14 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 18, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 19 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 20;
(2) antitelo (DL306) koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 24, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 25 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 26 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 30, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 31 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 32;
(3) antitelo (DL309) koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 36, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 37 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 42, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 43 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 44;
(4) antitelo (DL312) koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 48, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 49 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 50 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 54, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 55 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 56; i
(5) antitelo koje se vezuje za isti epitop kao onaj u DLL3 proteinu za koji se vezuje bilo koje od antitela (1) do (4) .
[0025] Antitela (1) do (5) mogu da sadrže konstantne regione. Konstantni regioni koji se koriste nisu posebno ograničeni i može se koristiti bilo koji konstantni region. Poželjni primeri konstantnih regiona koji se koriste u sadašnjem pronalasku, mogu da uključuju konstantne regione izvedene iz čoveka. Na primer, konstantni regioni izvedeni iz humanog IgG1, izvedeni iz humanog IgG2, izvedeni iz humanog IgG3 ili izvedeni iz humanog IgG4, mogu biti korišćeni kao konstantan region teškog lanca. Takođe, na primer, konstantni region izveden iz humanog κ lanca ili humanog λ lanca, može biti korišćen kao konstantni region lakog lanca. Konstantni regioni koji se koriste u sadašnjem pronalasku, mogu biti konstantni regioni koji imaju prirodnu sekvencu ili mogu biti modifikovani konstantni regioni koji imaju sekvencu izvedenu iz nativne sekvence modifikacijom jedne ili više aminokiselina.
[0026] Antitela (1) do (5) mogu da sadrže FR-ove. Korišćeni FR-ovi nisu posebno ograničeni, i bilo koji FR se može koristiti dokle god rezultujuće antitelo održava njegovu aktivnost vezivanja protiv humanog DLL3. Poželjni primeri FR-a koji se koriste u sadašnjem pronalasku, mogu da uključuju FR-ove izvedene iz humanog antitela. Budući da je tehnika zamene FR-a sa aktivnošću vezivanja antigena od održanog antitela poznata u struci, stručnjaci u struci mogu na odgovarajući način odabrati FR-ove. FR-ovi korišćeni u sadašnjem pronalasku mogu biti FR-ovi koji imaju prirodnu sekvencu ili mogu biti FR-ovi koji imaju sekvencu izvedenu iz nativne sekvence modifikacijom jedne ili više aminokiselina.
[0027] Primeri varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrže CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 12, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 13 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 14, mogu da uključuju varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 9.
Takođe, primeri teškog lanca koji sadrže varijabilni region teškog lanca, mogu da uključuju teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 10 ili 11.
[0028] Primeri varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrže CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 24, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID BR: 25 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 26, mogu da uključuju varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 21. Takođe, primeri teškog lanca koji sadrže varijabilni region teškog lanca, mogu uključivati teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 22 ili 23.
[0029] Primeri varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrže CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 36, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 37 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 38 mogu obuhvatiti varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 33. Takođe, primeri teškog lanca koji sadrže varijabilni region teškog lanca mogu uključivati teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 34 ili 35.
[0030] Primeri varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 48, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 49, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 50, mogu uključivati varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 45. Takođe, primeri teškog lanca koji sadrži varijabilni region teškog lanca, mogu uključivati teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 46 ili 47.
[0031] Primeri varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 18, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 19 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 20, mogu obuhvatiti varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 15. Takođe, primeri lakog lanca koji sadrže varijabilni region lakog lanca, mogu uključivati laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 16 ili 17.
[0032] Primeri varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 30, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 31 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 32, mogu da uključuju varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 27. Takođe, primeri lakog lanca koji sadrži varijabilni region lakog lanca, mogu uključivati laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 28 ili 29.
[0033] Primeri varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 42, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 43 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 44, mogu da uključuju varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 39. Takođe, primeri lakog lanca koji sadrže varijabilni region lakog lanca, mogu uključivati laki lanac koji imi aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 40 ili 41.
[0034] Primeri varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID NO: 54, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 55 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 56, mogu da uključuju varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 51. Takođe, primeri lakog lanca koji sadrži varijabilni region lakog lanca, mogu uključivati laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 52 ili 53.
[0035] U sadašnjem pronalasku, fraza "koje poseduje aktivnost ekvivalentnu onoj koju ima antitelo iz sadašnjeg pronalaska" odnosi se na posedovanje aktivnosti DLL3 vezivanja, aktivnost internalizacije i/ili citotoksičnu aktivnost (aktivnost ADCC, itd.) protiv ćelija koje izražavaju DLL3 ekvivalentno na ovo. U sadašnjem pronalasku, ekvivalentna aktivnost nije nužno zahtevana da bude identična aktivnost i može biti, na primer, 50% ili više, poželjno 70% ili više, poželjnije 90% ili više aktivnosti u poređenju sa aktivnošću bilo kojeg od antitela (1) do (12). Primeri gornje granice aktivnosti mogu da uključuju, ali ne ograničavaju se na 1000% ili manje, 500% ili manje, 300% ili manje, 150% ili manje i 100% ili manje.
[0036] Antitelo, izvedeno iz antitela prema sadašnjem pronalasku supstitucijom, delecijom, dodatkom i/ili umetanjem jedne ili više aminokiselina je takođe inkorporirano u obim predmetnog pronalaska i može biti pripremljeno veštački ili se nalazi prirodno. Primeri postupka za uvođenje mutacije u polipeptid uključuju, mutagenezu usmerenu na mesto (Hashimoto-Gotoh, T. i sar. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ i Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. i sar. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, i Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol.154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol.85, 2763-2766). Ovo je jedna od metoda poznata stručnjacima u struci za pripremu polipeptida koji je funkcionalno ekvivalentan određenom polipeptidu. Stručnjaci u stanju tehnike, mogu na odgovarajući način uvesti mutaciju u antitelo predmetnog pronalaska, korišćenjem takvog postupka i na taj način pripremiti antitelo funkcionalno ekvivalentno antitelu. Štaviše, mutacije aminokiselina, mogu se javiti u prirodnom svetu. Takvo antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz aminokiselinske sekvence antitela sadašnjeg pronalaska pomoću mutacije jedne ili više aminokiselina i funkcionalno ekvivalentno antitelu je takođe, obuhvaćeno pomoću antitela iz sadašnjeg pronalaska.
[0037] Broj aminokiselina mutiranih u takvoj varijanti je obično u okviru 50 aminokiselina, poželjno u okviru 30 aminokiselina, poželjnije u okviru 10 aminokiselina (npr. u okviru 5 aminokiselina).
[0038] Da bi aminokiselinski ostaci bili mutirani, poželjno je da se ova mutacija konzervativno izvrši između aminokiselina koje imaju isto svojstvo bočnog lanca. Na primer, uspostavljena je sledeća klasifikacija bazirana na svojstvima bočnih lanaca aminokiselina:
hidrofobne aminokiseline (A, I, L, M, F, P, W, Y i V), hidrofilne aminokiseline (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S i T),
aminokiseline koje imaju alifatični bočni lanac (G, A, V, L, I i P),
aminokiseline koje imaju bočni lanac koji sadrži hidroksi grupu (S, T i Y), aminokiseline koje imaju bočni lanac koji sadrži atom sumpora (C i M), aminokiseline koje imaju bočni lanac koji sadrži karboksilnu kiselinu i amid (D, N, E i Q),
aminokiseline koje imaju bočni lanac koji sadrži bazu (R, K i H) i
aminokiseline koje imaju bočni lanac koji sadrži aromatičnu grupu (H, F, Y i W) (svi simboli u zagradama predstavljaju pojedinačne slovne kodove aminokiselina).
[0039] Polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu, modifikovanu iz određene aminokiselinske sekvence putem brisanja i/ili dodavanja jednog ili više aminokiselinskih ostataka i/ili njegove supstitucije sa drugim aminokiselinama je već poznato da održava biološku aktivnost originalnog polipeptida (Mark, DF i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M.J. i Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. i sar., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD (1982) 79, 6409-6413). Specifično, kada su aminokiseline u aminokiselinskoj sekvenci koje čine određeni polipeptid supstituisane sa aminokiselinama klasifikovanim u istoj grupi, generalno se kaže da polipeptid verovatno zadržava svoju aktivnost. U sadašnjem pronalasku, supstitucija između aminokiselina unutar iste grupe aminokiselina, gore opisana, se naziva konzervativna supstitucija.
[0040] Sadašnji pronalazak takođe, obezbeđuje farmaceutski preparat prema pronalasku koji sadrži antitelo koje se vezuje za isti epitop kao onaj za koji se vezuje bilo koje od antitela (1) do (4). Specifični primeri antitela (1) do (4) mogu da uključe antitela DL301, DL306, DL309 i DL312, opisana niže u Primerima. Specifično, sadašnji pronalazak može takođe da upotrebi antitelo koje prepoznaje isti epitop, kao onaj koji je prepoznat od strane bilo kojeg od ovih antitela.
[0041] Da li ili ne antitelo analita deli epitop sa određenim antitelom, može biti potvrđeno na osnovu njihove kompeticije za isti epitop. Kompeticija između antitela je detektovana testom unakrsnog blokiranja ili slično. Test unakrsnog blokiranja je poželjan, na primer, kompetitivni ELISA test.
[0042] Specifično, test unakrsnog blokiranja uključuje, preinkubiranje DLL3 proteina obloženih na bazenčićima mikrotitarske ploče, u prisustvu ili odsustvu kandidata konkurentskog antitela, a zatim dodavanjem na ovo anti-DLL3 antitela iz sadašnjeg pronalaska. Količina anti-DLL3 antitela prema predmetnom pronalasku koja se vezuje za DLL3 protein u svakom bazenčiću, indirektno korelira sa sposobnošću vezivanja kandidatskih konkurentskih antitela (antitela analita) koja se takmiče sa njima, za vezivanje za isti epitop. Specifično, veći afinitet antitela analita za isti epitop rezultira u manjoj količini anti-DLL3 antitela iz sadašnjeg pronalaska vezanog za DLL3 proteinom obložene bazenčiće i umesto toga, veća količina antitela analita vezanog za DLL3 proteinom obložene bazenćiće.
[0043] Količina svakog antitela vezana za bazenčić, može biti lako određena obeležavanjem antitela unapred. Na primer, biotinilovano antitelo, može biti analizirano korišćenjem konjugata avidin-peroksidaze i odgovarajućeg supstrata. Test unakrsne blokade korišćenjem enzimskog (npr. peroksidaze) obeležavanja se posebno naziva kompetitivni ELISA test. Antitelo može biti obeleženo sa bilo kojim drugim detektibilnim ili merljivim obeležavajućim materijalima. Specifično, na primer, radioaktivno obeležavanje ili fluorescentno obeležavanje je poznato u struci.
[0044] Osim toga, kada antitelo analita ima konstantne regione izvedene iz vrste različite od one kod anti-DLL3 antitela iz sadašnjeg pronalaska, količina bilo kog antitela vezanog za bazenčić, može takođe biti merena korišćenjem obeleženog antitela koje prepoznaje bilo koji konstantni region. Alternativno, čak i antitela koja se razlikuju u klasi, iako izvedena iz iste vrste, mogu biti izmerena za njihove odgovarajuće količine vezane za bazenčić korišćenjem antitela koja diskriminišu svaku klasu.
[0045] Pod uslovom da kandidatsko antitelo može da blokira vezivanje anti-DLL3 antitela za najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 50%, čak i poželjnije najmanje 80%, u poređenju sa aktivnošću vezivanja dobijenom u kontrolnom testu izvedenom u odsustvu kompetitivnog antitela, ovo kandidatsko antitelo se određuje kao antitelo koje se vezuje za suštinski isti epitop kao onaj za koji se vezuje anti-DLL3 antitelo iz sadašnjeg pronalaska ili kao antitelo koje se takmiči s ovim za vezivanje za isti epitop.
[0046] Dalji primeri antitela, upotrebljenih u farmaceutskom preparatu prema sadašnjem pronalasku, mogu da uključuju antitelo koje prepoznaje region od aminokiselina 27 do 175 u humanom DLL3 (SEK ID BR: 1) i antitelo koje prepoznaje region od aminokiselina 216 do 492 u humanom DLL3. Primeri drugog aspekta antitela, upotrebljenih u farmaceutskom preparatu prema sadašnjem pronalasku, mogu da uključuju antitelo koje se vezuje za humani DLL3, ali se ne vezuje za polipeptid (DLL3delta1-Fc) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 6 ili polipeptid (DLL3delta2-Fc) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 7 i antitela koje se vezuje za humani DLL3 i takođe se vezuje za polipeptid (DLL3delta1-Fc) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 6 i polipeptid (DLL3delta2-Fc) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 7.
[0047] Antitelo, upotrebljeno u farmaceutskom preparatu prema sadašnjem pronalasku ima aktivnosti kao što su ADCC aktivnost i aktivnost internalizacije i kao takvo je korisno kao farmaceutski lek, posebno antikancerogeni agens, gde je rak karcinom pluća. Antitelo ima citotoksičnu aktivnost.
Genetski rekombinantno anti-DLL3 antitelo
[0048] Antitelo koje će se primenjivati kod ljudi, može biti pretvoreno u genetski rekombinantno antitelo koje je veštački dizajnirano, na primer, radi smanjenja heteroantigenosti kod ljudi. Genetski rekombinantno antitelo obuhvata, na primer, himerna antitela i humanizovana antitela. Ova konstruisana antitela, mogu biti proizvedena korišćenjem postupka poznatog u tehnici.
(1) Himerno antitelo
[0049] Himerna antitela se odnose na antitela koja sadrže varijabilne i konstantne regione različitog porekla, vezane jedne s drugima. Na primer, mišja-humana heterogena himerna antitela su antitela koja sadrže varijabilne regione teškog i lakog lanca antitela miša i konstantne regione teškog i lakog lanca humanog antitela. Varijabilni regioni mišjeg antitela koji kodiraju DNK su vezani sa konstantnim regionima koji kodiraju DNK humanog antitela, a vezani proizvodi mogu biti inkorporirani u ekspresione vektore, za pripremu rekombinantnih vektora koji izražavaju himerno antitelo. Ćelije transformisane sa ovim vektorima (rekombinantne ćelije), mogu biti kultivisane za ekspresiju DNK umetka, kako bi se dobila himerna antitela proizvedena tokom gajenja.
[0050] Konstantni regioni humanih antitela su korišćeni kao konstantni regioni himernih antitela. Na primer, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cμ, Cδ, Cα1, Cα2 i Cε mogu biti korišćeni kao konstantni regioni teškog lanca. Štaviše, Cκ i Cλ mogu biti korišćeni kao konstantni regioni lakog lanca. Aminokiselinske sekvence ovih konstantnih regiona i nukleotidne sekvence koje ih kodiraju su poznate u struci. Štaviše, jedna ili više aminokiselina u konstantnim regionima humanih antitela, mogu biti supstituisane, obrisane, dodate i/ili ubačene radi poboljšanja stabilnosti samog antitela ili njegove proizvodnje.
(2) Humanizovano antitelo
[0051] Generalno, himerna antitela obuhvataju ne-humane varijabilne regione antitela izvedene od životinja i konstantne regione izvedene iz humanih antitela. Nasuprot tome, humanizovana antitela obuhvataju ne-humane regione izvedene od životinja koji određuju komplementarnost antitela (CDR), okvirne regione izvedene iz humanih antitela (FR) i konstantne regione izvedene iz humanih antitela. Humanizovana antitela se takođe nazivaju prepravljena humana antitela. Specifično, na primer, humanizovana antitela koja sadrže ne-humana životinjska (npr., miša) antitela CDR-ova, presađena u ljudska antitela su poznata u stanju tehnike. Humanizovana antitela su korisna kao aktivni sastojci za terapeutski agens prema sadašnjem pronalasku, zahvaljujući njihovoj smanjenoj antigenosti u ljudskom telu.
[0052] Svaki varijabilni region antitela obično sadrži 3 CDR-a okruženih sa 4 FR-a. CDR regioni suštinski određuju specifičnost vezivanja antitela. CDR-ovi imaju različite aminokiselinske sekvence. Sa druge strane, aminokiselinske sekvence koje čine FR-ove često pokazuju visoku homologiju među antitelima koja imaju različite specifičnosti vezivanja. Prema tome, generalno, specifičnost vezivanja određenog antitela može navodno biti transplantirana na druga antitela preko presađivanja CDR-a.
[0053] Generalni pristupi rekombinacije gena su takođe, poznati za dobijanje humanizovanih antitela. Specifično, na primer, PCR metoda preklapajućeg širenja je poznata u oblasti tehnike kao metoda za presađivanje CDR-a antitela miša u humane FR-ove. Preklapajuća ekstenziona PCR koristi prajmere za sintezu FR humanog antitela koji sadrži dodatnu nukleotidnu sekvencu koja kodira svaki CDR antitela miša koji treba da se presadi. Prajmeri su pripremljeni za svaki od 4 FR-ova. Kod mišjeg CDR presađivanja u humane FR-ove, u osnovi, navodno je povoljno odabrati humane FR-ove visoko-homologne za mišje FR-ove za održavanje CDR funkcija. Specifično, uopšteno je poželjno da se koriste humani FR-ovi koji sadrže aminokiselinske sekvence visoko homologne onima iz FR-ova susednih prema mišjim CDR-ovima koje treba presaditi.
[0054] Osim toga, nukleotidne sekvence koje treba da se vežu su dizajnirane tako da su povezane u okviru. Nukleotidne sekvence koje kodiraju humani FR su pojedinačno sintetizovane pomoću njihovih odgovarajućih prajmera. Kao rezultat, dobijaju se proizvodi koji sadrže CDR-kodirajuću DNK miša koja se dodaje u svaku FR-kodirajuću sekvencu. Nukleotidna sekvenca koja kodira CDR miša u svakom proizvodu je dizajnirana tako da se nukleotidna sekvenca preklapa sa drugom. Nakon toga, CDR delovi koji se preklapaju su kaljeni međusobno za reakciju sinteze komplementarnog niza. Preko ove reakcije, humane FR sekvence su vezane preko CDR sekvence miševa.
[0055] Na kraju, gen celokupne dužine varijabilnog regiona koji sadrži vezana 3 CDR-a i 4 FR-a je amplifikovan sa prajmerima koji su respektivno zagrevani do njegovih krajeva 5' i 3' i uključuju dodatnu sekvencu prepoznavanja za odgovarajući restrikcioni enzim. DNK tako dobijena i DNK koja kodira konstantni region humanog antitela, može biti ubačena u ekspresione vektore tako da su oni spojeni u okvir, kako bi se pripremili vektori za ekspresiju humanizovanog antitela. Domaćini su transformisani sa ovim vektorima da bi se uspostavile rekombinantne ćelije, koje su zatim kultivisane za ekspresiju DNK koja kodira humanizovana antitela da bi proizvela humanizovana antitela u kulturama kultivisanih ćelija (videti evropsku patentnu publikaciju br. EP 239400 i međunarodnu publikaciju br. WO 96/02576).
[0056] Humanizovana antitela na taj način pripremljena, mogu biti procenjena za njihove aktivnosti vezivanja za antigen kvalitativnim ili kvantitativnim testom. Kao rezultat, FR-ovi humanog antitela, mogu biti izabrani poželjno tako da omogućavaju CDR-ovima da formiraju povoljno mesto za vezivanje antigena kada se vezuju preko CDR-a. Ako je potrebno, FR aminokiselinski ostatak(ci) mogu biti supstituisani tako da CDR-ovi humanizovanog antitela formiraju odgovarajuće mesto za vezivanje antigena. Na primer, mutacija može biti uvedena u aminokiselinskoj sekvenci FR-a primenom PCR metode koja se koristi u presađivanju mišjeg CDR-a u humane FR-ove. Specifično, mutacija parcijalne nukleotidne sekvence, može biti uvedena u prajmere zagrejavanjem na FR nukleotidnoj sekvenci. FR nukleotidna sekvenca sintetisana pomoću takvih prajmera sadrži tako unetu mutaciju. Varijantna antitela koja imaju supstituisanu aminokiselinu(e), mogu biti procenjena za njihove aktivnosti vezivanja za antigen istim testom, kao što je gore navedeno, za odabir varijantnih FR sekvenci koje imaju željeno svojstvo (Sato, K. i sar., Cancer Res, 1993, 53, 851-856).
(3) Polivalentno antitelo
[0057] Antitelo koje je prisutno u farmaceutskom preparatu iz predmetnog pronalaska, obuhvata ne samo bivalentna antitela tipizirana pomoću IgG (IgG1, IgG2, IgG4 itd.), već i monovalentna antitela ili polivalentna antitela tipizirana pomoću IgM, sve dok se ova antitela vezuju za DLL3 protein. Polivalentno antitelo koje može biti prisutno u farmaceutskom preparatu prema predmetnom pronalasku, obuhvata polivalentna antitela koja imaju mesta za vezivanje antigena, od kojih su sva ista međusobno ili od kojih su neka ili sva međusobno različita.
(4) Niskomolekularno antitelo
[0058] Antitelo koje je prisutno u farmaceutskom preparatu iz predmetnog pronalaska nije ograničeno na celu molekulu antitela i može biti niskomolekularno antitelo ili njegov modifikovani oblik, sve dok se antitelo vezuje za DLL3 protein.
[0059] Niskomolekularno antitelo, obuhvata fragment antitela koji je deficitaran u delu od celog antitela (npr. celi IgG). Takav parcijalni nedostatak molekule antitela je prihvaćen sve dok je fragment antitela koji se dobija sposoban za vezivanje za DLL3 antigen. Poželjno je da fragment antitela, upotrebljen u farmaceutskom preparatu prema predmetnom pronalasku treba da sadrži jedan ili oba varijabilna regiona teškog lanca (VH) i varijabilne regione lakog lanca (VL). Takođe je poželjno da fragment antitela, upotrebljen u farmaceutskom preparatu prema predmetnom pronalasku treba da sadrži regione koji određuje komplementarnost (CDR regione). Broj CDR-ova koji su sadržani u fragmentu antitela, upotrebljenog u farmaceutskom preparatu prema sadašnjem pronalasku nije posebno ograničen i poželjno je najmanje 6 CDR-ova: CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca.
[0060] Aminokiselinska sekvenca VH ili VL, može sadržati supstituciju, brisanje, dodavanje i /ili umetanje. Osim toga, fragment antitela koji može biti upotrebljen u farmaceutskom preparatu prema sadašnjem pronalasku, može biti deficijentan u delu jednog ili oba VH i VL, sve dok je dobijeni fragment antitela sposoban za vezivanje za DLL3 antigen. Štaviše, njegov varijabilni region može biti himerizovan ili humanizovan. Specifični primeri fragmenata antitela, mogu da uključuju Fab, Fab', F(ab')2 i Fv. Štaviše, specifični primeri niskomolekularnog antitela, mogu da uključuju Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv (jednolančni Fv), dijatelo, sc(Fv)2 (jednolančni (Fv)2) i scFv-Fc. U sadašnjem pronalasku, niskomolekularno antitelo je poželjno dijatelo ili sc(Fv)2. Ovi multimeri antitela (npr., dimeri, trimeri, tetrameri i polimeri) su takođe, obuhvaćeni niskomolekularnim antitelima koja mogu biti upotrebljena u farmaceutskom preparatu iz sadašnjeg pronalaska.
[0061] Takvi fragmenti antitela, mogu biti dobijeni enzimskim tretiranjem antitela za formiranje fragmenata antitela. Digestivni enzimi cepaju fragment antitela u određenom položaju, kako bi dali fragmente antitela koji imaju posebnu strukturu. Na primer, papain, pepsin ili plazmin je u struci poznat kao enzim za formiranje fragmenata antitela. Digestija papainom daje F(ab)2 ili Fab, dok digestija pepsinom daje F(ab')2 ili Fab'. Alternativno, geni koji kodiraju ove fragmente antitela su konstruisani i ovi geni mogu biti uvedeni u ekspresione vektore i zatim izraženi u odgovarajućim ćelijama domaćina (videti npr. Co, M. S. i sar., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515, Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1986) 121, 652-663, Rousseaux, J. i sar., Methods in Enzymology (1986) 121, 663-669, Bird, R.E. i sar., TIBTECH (1991) 9, 132-137).
[0062] Korišćenje pristupa genetičkog inženjeringa za enzimski dobijene fragmente antitela, može da izbriše proizvoljni deo antitela. Niskomolekularno antitelo prema predmetnom pronalasku, može imati nedostatak proizvoljnog regiona sve dok rezultujući fragment antitela ima afinitet vezivanja za DLL3.
i) Dijatelo
[0063] Dijatelo se odnosi na fragment bivalentnog antitela koji je izgrađen fuzijom gena (npr., Holliger P i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 90: 6444-6448 (1993), EP404,097 i WO 93/11161). Dijatelo je dimer koji sadrži dva polipeptidna lanca. Obično, svaki od polipeptidnih lanca koji čine dimer, obuhvataju varijabilne regione teških i lakih lanaca povezane preko linkera na istom lancu. Linker u dijatelu je uglavnom suviše kratak da bi omogućio sparivanje između varijabilnih regiona teških i lakih lanaca u istom lancu. Specifično, broj aminokiselinskih ostataka koji čine linker je, na primer, oko 5 ostataka. Stoga, varijabilni regioni teškog i lakog lanca kodirani na istom polipeptidnom lancu ne mogu zajedno formirati fragment pojedinačnog lanca varijabilnog regiona. Umesto toga, oni formiraju dimer uparivanjem sa drugim fragmentom pojedinačnog lanca varijabilnog regiona. Kao rezultat, dijatelo ima dva mesta za vezivanje antigena.
ii) scFv
[0064] ScFv je dobijen povezivanjem varijabilnih regiona teškog i lakog lanca antitela. U scFvu, varijabilni regioni teškog i lakog lanca su povezani preko linkera, poželjno, peptidnog linkera (Huston, J. S. i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 5879-5883). Varijabilni regioni teškog i lakog lanca u scFv-u, mogu biti izvedeni iz bilo kojeg antitela, opisanog u sadašnjoj specifikaciji. Peptidni linker koji povezuje varijabilne regione nije posebno ograničen. Na primer, proizvoljni jednolančani peptid od oko 3 do 25 ostataka, može biti korišćen kao linker. Specifično, na primer, može se koristiti peptidni linker koji je kasnije opisan.
[0065] Varijabilni regioni oba lanca, mogu biti povezani, na primer, pomoću PCR-a. Prvo, sekvence DNK koji kodiraju teški lanac ili varijabilni region teškog lanca antitela i sekvence DNK koji kodiraju laki lanac ili varijabilni region lakog lanca antitela, DNK koje kodiraju celu ili željenu parcijalnu aminokiselinsku sekvencu su korišćene kao templejti za povezivanje varijabilnih regiona PCR-om.
[0066] DNK koja kodira varijabilni region teškog lanca i DNK koja kodira varijabilni region lakog lanca su odvojeno amplifikovane pomoću PCR-a, korišćenjem para prajmera koji imaju sekvence koje odgovaraju za obe terminalne sekvence svake DNK koja će biti amplifikovana. Zatim je pripremljena DNK koja kodira deo peptidnog linkera. DNK koja kodira peptidni linker, može takođe biti sintetisata pomoću PCR-a. Nukleotidne sekvence koje mogu biti povezane sa proizvodom amplifikacije od svakog varijabilnog regiona odvojeno su sintetizovane respektivno, dodate 5' sekvencama prajmera korišćenih u ovom PCR-u. Nakon toga, PCR reakcija se izvodi korišćenjem svake DNK od [DNK varijabilnog regiona teškog lanca]- [DNK peptidnog linkera]-[DNK varijabilnog regiona lakog lanca] i prajmera za PCR sakupljanje.
[0067] Prajmeri za sakupljanje PCR-a sadrže kombinaciju prajmera zagrejavanjem do 5' sekvence [DNK varijabilnog regiona teškog lanca] i zagrejavanjem prajmera prema 3' sekvenci [DNK varijabilnog regiona lakog lanca]. Specifično, prajmeri za sakupljanje PCR-a su set prajmera koji je sposoban za amplifikaciju DNK koja kodira punu dužinu sekvence scFv koja će biti sintetisana. Nasuprot tome, [DNK peptidnih linkera] sadrži dodatnu nukleotidnu sekvencu koja može biti povezana sa svakom DNK varijabilnog regiona. Kao rezultat toga, ove DNK su povezane, i dalje, konačno pripremljene u proizvod amplifikacije ScFv pune dužine, korišćenjem prajmera za sastavljanje PCR. Kada je jednom pripremljena DNK koja kodira scFv, ekspresioni vektori koji sadrže ovu DNK i ćelije transformisane sa ekspresionim vektorima (rekombinantne ćelije), mogu biti dobijene prema rutinskoj metodi. Štaviše, rezultujuće rekombinantne ćelije, mogu biti kultivisane za ekspresiju scFv-kodirajuće DNK da bi se dobio scFv.
iii) scFv-Fc
[0068] ScFv-Fc je niskomolekularno antitelo koje sadrži Fc region fuzionisan sa scFv-om (Cellular & Molecular Immunology 2006; 3: 439-443). Poreklo scFv-a koji se koristi u scFv-Fc nije posebno ograničeno, i na primer, može biti korišćen scFv izveden iz IgM. Štaviše, poreklo Fc nije posebno ograničeno, i, na primer, može se koristiti Fc izveden iz humanog IgG (humani IgG1, itd.). Stoga, primeri poželjnog aspekta scFv-Fc, mogu da uključuju scFv-Fc koji sadrži scFv fragment IgM antitela povezanog sa humanim IgG1 CH2 (npr., Cγ2) i CH3 (npr., Cγ3) preko spojnog regiona (Hγ) humanog IgG1.
iv) sc(Fv)2
[0069] Sc(Fv)2 je niskomolekularno antitelo koje ima pojedinačni lanac koji sadrži dva varijabilna regiona teškog lanca (VHs) i dva varijabilna regiona lakog lanca (VLs) povezana preko linkera ili slično (Hudson i sar., J Immunol. Methods 1999; 231: 177-189). Sc(Fv)2 se može pripremiti, na primer, povezivanjem scFv-ova preko linkera. Tri linkera su obično neophodna za povezivanje četiri varijabilna regiona antitela.
[0070] Štaviše, sc(Fv)2 je poželjno antitelo gde su dva VH-a i dva VL-a poravnjana kao VH, VL, VH i VL (tj. [VH]-linker-[VL]-linker-[VH]-linker-[VL]) u ovom redu počevši od N-završetka polipeptida sa jednim lancem.
[0071] Red od dva VH-a i dva VL-a nije posebno ograničen na gore opisano poravnjanje i može biti bilo koji red poravnjanja. Primeri takvih, takođe, mogu da uključuje sledeće aranžmane:
[VL]-linker-[VH]-linker-[VH]-linker-[VL]
[VH]-linker-[VL]-linker-[VL]-linker-[VH]
[VH]-linker-[VH]-linker-[VL]-linker-[VL]
[VL]-linker-[VL]-linker-[VH]-linker-[VH]
[VL]-linker-[VH]-linker-[VL]-linker-[VH]
[0072] Na primer, proizvoljni peptidni linker ili linker sintetičkog jedinjenja (npr. linkeri otkriveni u referentnom proteinskom inženjerstvu, 9 (3), 299-305, 1996) koji se mogu uvesti putem genetskog inženjeringa, može biti korišćen kao linker koji povezuje varijabilne regione antitela. Može biti korišćeno mnoštvo istih ili različitih linkera. U sadašnjem pronalasku, poželjan je peptidni linker. Dužina peptidnog linkera nije posebno ograničena i može biti odabrana na odgovarajući način od strane stručnjaka u tehnici, u skladu sa namenom. Broj aminokiselinskih ostataka koji čine peptidni linker je obično 1 do 100 aminokiselina, poželjno 3 do 50 aminokiselina, još poželjnije 5 do 30 aminokiselina, posebno poželjno 12 do 18 aminokiselina (npr., 15 aminokiselina).
[0073] Aminokiselinska sekvenca koja čini peptidni linker, može biti proizvoljna sekvenca sve dok ova sekvenca ne inhibira efekat vezivanja scFv-a. Na primer, za peptidni linker mogu biti korišćene sledeće aminokiselinske sekvence:
Ser
Gli · Ser
Gli · Gli · Ser
Ser · Gli · Gli
Gli · Gli · Gli · Ser (SEK ID BR: 61)
Ser · Gli · Gli · Gli (SEK ID BR: 62)
Gli · Gli · Gli · Gli · Ser (SEK ID BR: 63)
Ser · Gli · Gli · Gli· Gli (SEK ID BR: 64)
Gli · Gli · Gli · Gli · Gli · Ser (SEK ID BR: 65)
Ser ·Gli · Gli · Gli · Gli · Gli (SEK ID BR: 66)
Gli · Gli · Gli · Gli · Gli · Gli · Ser (SEK ID BR: 67)
Ser · Gli · Gli · Gli · Gli · Gli · Gli (SEK ID BR: 68)
(Gli · Gli · Gli · Gli · Ser) n
(Ser · Gli · Gli · Gli · Gli) n
[n predstavlja ceo broj od 1 ili više].
[0074] Aminokiselinska sekvenca peptidnog linkera, može biti pogodno odabrana od strane stručnjaka u struci, prema nameni. Na primer, ceo broj n koji određuje dužinu peptidnog linkera je obično 1 do 5, poželjno 1 do 3, poželjnije 1 ili 2.
[0075] Prema tome, primeri naročito poželjnog aspekta sc(Fv)2 koji može biti upotrebljen u farmaceutskom preparatu prema sadašnjem pronalasku, mogu da uključuju sledeći sc(Fv)2:
[VH]-peptidni linker (15 aminokiselina)-[VL]-peptidni linker (15 aminokiselina)-[VH]-peptidni linker (15 aminokiselina)-[VL].
[0076] Alternativno, varijabilni regioni takođe, mogu biti povezani korišćenjem hemijski sintetisanog linkera (hemijski agens za unakrsno povezivanje). Agens unakrsnog povezivanja obično korišćen u unakrsnom vezivanju peptidnih jedinjenja ili slično, može biti korišćen u sadašnjem pronalasku. Na primer, hemijski agensi za unakrsno vezivanje, kao što je prikazano u nastavku su poznati u tehnici. Ovi agensi unakrsnog vezivanja su komercijalno dostupni:
N-hidroksisukcinimid (NHS),
disukcinimidil suberat (DSS),
bis (sulfosukcinimidil) suberat (BS3),
ditiobis (sukcinimidil propionat) (DSP),
ditiobis (sulfosukcinimidil propionat) (DTSSP),
etilen glikol bis (sukcinimidil sukcinat) (EGS),
etilen glikol bis (sulfosukcinimidil sukcinat) (sulfo-EGS),
disukcinimidil tartarat (DST), disulfosukcinimidil tartarat (sulfo-DST),
bis[2- (sukcinimidoksikarboniloksi) etil] sulfon (BSOCOES), i
bis [2- (sulfosukcinimidoksikarboniloksi) etil] sulfon (sulfo-BSOCOES), itd.
Aktivnost anti-DLL3 antitela
(1) Citotoksična aktivnost
[0077] Za lečenje ćelijske proliferativne bolesti, kao što je rak, poželjno je da antitelo treba da održi svoju efektorsku aktivnost. Posebno, poželjno antitelo prema sadašnjem pronalasku poseduje oboje, od afiniteta vezivanja za DLL3 i efektorske funkcije. Upotrebljeno antitelo ima citotoksičnu aktivnost. Efektorske funkcije upotrebljenih antitela u farmaceutskom preparatu prema pronalasku, mogu da obuhvataju ćelijski posredovanu citotoksičnu aktivnost zavisnu od antitela (ADCC) i citotoksičnu aktivnost zavisnu od komplementa (CDC). Terapeutsko antitelo, upotrebljeno u farmaceutskom preparatu prema pronalasku, može naročito poželjno da poseduje ADCC aktivnost kao efektorske funkcije.
[0078] Antitelo korišćeno u terapeutskoj svrsi je antitelo koje ima citotoksičnu aktivnost.
[0079] Primeri citotoksične aktivnosti prema predmetnom pronalasku, mogu da uključuju ADCC i CDC aktivnosti. U sadašnjem pronalasku, ADCC aktivnost označava aktivnost oštećenja ciljnih ćelija preko vezivanja ćelija koje nose Fcγ receptor (imunociti, itd.), putem Fcγ receptora za Fc domene antitela, specifično vezanih za ćelijske površinske antigene ciljnih ćelija. S druge strane, CDC aktivnost označava citotoksičnu aktivnost posredovanu sistemom komplementa.
[0080] Bez obzira da li ili ne anti-DLL3 antitelo ima ADCC aktivnost ili ima CDC aktivnost, može biti određeno metodom poznatom u struci (npr. Trenutni protokoli u imunologiji, poglavlje 7. Imunološke studije kod ljudi, Izdavač, John E, Coligan i sar., John Wiley & Sons, Inc., (1993)). Posebno, prvo se pripremaju efektorske ćelije, rastvor komplementa i ciljne ćelije.
i) Priprema efektorskih ćelija
[0081] Slezine su isečene od miševa CBA/N ili slično, a ćelije slezine su odvojene od njih u medijumu RPMI1640 (proizvođač Invitrogen Corp.). Ćelije mogu biti isprane sa ovim medijumom koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, proizvođač Hyclone Laboratories, Inc.), a zatim podešene do ćelijske koncentracije od 5x10<6>ćelija/ml za pripremu efektorskih ćelija.
ii) Priprema rastvora komplementa
[0082] Bebi zečji komplement (proizvođač CEDARLANE Laboratories Ltd.), može biti razblažen 10 puta sa medijumom (proizveden od Invitrogen Corp.) koji sadrži 10% FBS za pripremu rastvora komplementa.
iii) Priprema ciljne ćelije
[0083] Ćelije koje eksprimiraju DLL3 proteine, mogu biti kultivisane na 37 ° C tokom 1 sata zajedno sa 0,2 mCi<51>Cr-natrijum hromatom (proizvođača GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), u DMEM medijumu koji sadrži 10% FBS-a, za radiološko obeležavanje ciljne ćelije. Ćelije transformisane sa DLL3 protein-kodirajućim genima, ćelijske linije sitnoćelijskog karcinoma pluća, ili slično, mogu biti korišćene kao ćelije koje izražavaju DLL3 proteine. Ćelije koje su tako radioaktivno obeležene, mogu biti isprane tri puta sa medijumom RPMI1640 koji sadrži 10% FBS i podešene do ćelijske koncentraciji od 2x10<5>ćelija/ml za pripremu ciljnih ćelija.
[0084] ADCC ili CDC aktivnost, može biti analizirana metodom opisanom u daljem tekstu. Za ispitivanje ADCC aktivnosti, ciljne ćelije i anti-DLL3 antitelo (50 μl svako) su dodati u ploču sa 96 bazenčića sa U-dnom (proizvedene od strane Becton, Dickinson and Company) i reagovali tokom 15 minuta na ledu. Zatim, je dodato na ploču 100 μl efektorskih ćelija, a ćelije su kultivisane tokom 4 sata u CO2inkubatoru. Konačna koncentracija antitela je podešena na 0 ili 10 μg/ml. Nakon kultivisanja je sakupljeno 100 μl supernatanta, a radioaktivnost je izmerena korišćenjem gama brojača (COBRA II AUTO-GAMMA, MODEL D5005, proizvođača Packard Instrument Company). Citotoksična aktivnost (%) može biti izračunata na osnovu formule za izračunavanje (A - C) / (B - C) x 100 korišćenjem dobijene vrednosti. U formuli, A predstavlja radioaktivnost (cpm) iz svakog uzorka; B predstavlja radioaktivnost (cpm) iz uzorka dopunjenog sa 1% NP-40 (proizvođača Nacalai Tesque, Inc.); i C predstavlja radioaktivnost (cpm) iz uzorka koji sadrži samo ciljne ćelije.
[0085] Sa druge strane, za ispitivanje CDC aktivnosti, ciljne ćelije i anti-DLL3 antitelo (po 50 μl svaki) su dodati u ploču sa 96 bazenčića ravnog dna (proizvedene od strane Becton, Dickinson and Company) i reagovali tokom 15 minuta na ledu. Zatim je na ploču dodato 100 μl rastvora komplementa, a ćelije su kultivisane tokom 4 sata u CO2inkubatoru. Konačna koncentracija antitela je podešena na 0 ili 3 μg/ml. Nakon kulture je sakupljeno 100 μl supernatanta, a radioaktivnost je izmerena korišćenjem gama brojača. Citotoksična aktivnost može biti izračunata na isti način kao u testu ADCC aktivnosti.
[0086] Nasuprot tome, u testu citotoksične aktivnosti koji koristi konjugate antitela, ciljne ćelije i konjugate antitela protiv DLL3 (po 50 μl svaki), dodati su u ploču od 96 bazenčića sa ravnim dnom (proizvedena od strane Becton, Dickinson and Company) i reagovali tokom 15 minuta na ledu. Ćelije su kultivisane tokom 1 do 4 sata u CO2inkubatoru. Konačna koncentracija antitela je podešena na 0 ili 3 μg/ml. Nakon kulture, sakupljeno je 100 μl supernatanta, a radioaktivnost je izmerena pomoću gama brojača. Citotoksična aktivnost može biti izračunata na isti način kao u analizi aktivnosti ADCC-a.
(2) Konjugovano antitelo
[0087] Antitelo može biti konjugovano sa citotoksičnom supstancom, kao što je hemioterapeutski agens, toksični peptid ili radioaktivna hemikalija. Takvo modifikovano antitelo (u daljem tekstu, naziva se konjugat antitela), može biti dobijeno hemijskim modifikovanjem dobijenih antitela. Postupak za modifikaciju antitela je već uspostavljen u struci.
[0088] Primeri hemioterapeutskog sredstva čija citotoksična aktivnost funkcioniše preko konjugacije za anti-DLL3 antitela, mogu da uključuju sledeća hemioterapeutska sredstva: azaribin, anastrozol, azacitidin, bleomicin, bortezomib, briostatin-1, busulfan, kamptotecin, 10-hidroksikamptotecin, karmustin, celebreks, hlorambucil, cisplatin, irinotekan, karboplatin, kladribin, ciklofosfamid, citarabin, dakarbazin, docetaksel, daktinomicin, daunomicin glukuronid, daunorubicin, deksametazon, dietilstilbestrol, doksorubicin, doksorubicin glukuronid, epirubicin, etinil estradiol, estramustin, etopozid, etopozid glukuronid, floksuridin, fludarabin, flutamid, fluorouracil, fluoksimesteron, gemcitabin, hidroksiprogesteron kaproat, hidroksiureu, idarubicin, ifosfamid, leukovorin, lomustin, mekloretamin, medroksiprogesteron acetat, megestrol acetat, melfalan, merkaptopurin, metotreksat, mitoksantron, mitramicin, mitomicin, mitotan, fenilbutirat, prednizon, prokarbazin, paklitaksel, pentostatin, semustin, streptozocin, tamoksifen, taksani, taksol, testosteron propionat, talidomid, tioguanin, tiotepa, tenipozid, topotekan, uracil mustard, vinblastin, vinorelbin, vinkristin.
[0089] Hemioterapeutski agens je poželjno, niskomolekularni hemioterapeutski agens. Niskomolekularni hemioterapeutski agens verovatno neće ometati funkcije antitela i nakon njegove konjugacije sa antitelom. U sadašnjem pronalasku, niskomolekularni hemioterapeutski agens obično ima molekulsku težinu od 100 do 2000, poželjno 200 do 1000. Svi hemioterapeutski agensi, koji su gore navedeni su niskomolekularni hemioterapeutski agensi. Ovi hemioterapeutski agensi prema predmetnom pronalasku, obuhvataju prolekove koji su konvertovani in vivo do aktivnih hemioterapeutskih agenasa. Aktivacija proleka, može biti enzimska konverzija ili ne-enzimska konverzija.
[0090] Štaviše, antitelo, može biti modifikovano sa toksičnim peptidom. Primeri toksičnog peptida, mogu da uključuju sledeće: A lanac difteričnog toksina (Langone J.J, i sar., Metode u enzimologiji, 93, 307-308, 1983), egzotoksin Pseudomonasa (Nature Medicine, 2, 350-353, 1996), Ricinski A lanac (Fulton R.J., i sar., J. Biol. Chem., 261, 5314-5319, 1986; Sivam G., i sar., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Cumber A. J. i sar., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak E.J., i sar., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Gheeite V., i sar., J. Immunol. Methods, 142, 223-230, 1991); A lanac deglikozilovanog ricina (Thorpe P.E., i sar., Cancer Res., 47, 5924-5931, 1987); Abrinski A lanac (Wawrzynczak E. J., i sar., Br. J. Cancer, 66, 361-366, 1992; Wawrzynczak E.J., i sar., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Sivam G., i sar., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Thorpe PE, i sar., Cancer Res., 47, 5924-5931, 1987); Gelonin (Sivam G., i sar., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Cumber A. J. i sar., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak E. J., i sar., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Bolognesi A., i sar., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); PAP-s; Pokeweed anti-virusni protein iz semena (Bolognesi A., i sar., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); Briodin (Bolognesi A., i sar., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); Saporin (Bolognesi A., i sar., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); Momordin (Cumber A. J., i sar., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak E. J., i sar., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Bolognesi A., i sar., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); Momorkohin (Bolognesi A., i sar., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); Diantin 32 (Bolognesi A., i sar., Clin. Exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); Diantin 30 (Stirpe F., Barbieri L., FEBS pismo 195, 1-8, 1986); Modeccin (Stirpe F., Barbieri L., dopis FEBS 195, 1-8, 1986); Viskumin (Stirpe F., Barbieri L., dopis FEBS 195, 1-8, 1986); Volkesin (Stirpe F., Barbieri L., dopis FEBS 195, 1-8, 1986); Dodekandrin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS pismo 195, 1-8, 1986); Tritin (Stirpe F., Barbieri L., dopis FEBS 195, 1-8, 1986); Luffin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS pismo 195, 1-8, 1986); Trihokirin (Casellas P., i sar., Eur. J. Biochem. 176, 581-588, 1988; Bolognesi A., i sar., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992).
[0091] U sadašnjem pronalasku, radioaktivna hemikalija se odnosi na hemikaliju koja sadrži radioizotop. Radioizotop nije posebno ograničen i može biti korišćen bilo koji radioizotop. Na primer, može biti korišćen<32>P,<14>C,<125>J,<3>H,<131>I,<186>Re ili<188>Re.
[0092] U drugom aspektu, jedan ili dva ili više niskomolekularnih hemioterapeutskih agenasa i jedan ili dva ili više toksičnih peptida, mogu biti korišćeni u kombinaciji u modifikaciji antitela. Antitelo protiv DLL3 može biti konjugovano sa niskomolekularnim hemioterapeutskim agensom preko kovalentne ili nekovalentne veze. Postupak za pripremu takvog antitela konjugovanog sa hemioterapeutskim agensom je poznat u stanju tehnike.
[0093] Proteinski agens ili toksin može biti konjugovan sa antitelom putem pristupa genetičkog inženjeringa. Posebno, na primer, DNK koja kodira toksični peptid i DNK koja kodira anti-DLL3 antitelo su fuzionisane u okviru međusobno, a ova spojena DNK može biti inkorporirana u ekspresione vektore za konstrukciju rekombinantnih vektora. Vektori su uvedeni u odgovarajuće ćelije domaćina, a rezultujuće transformisane ćelije su kultivisane. DNK umetak može biti izražen pomoću ćelija za dobijanje konjugovog anti-DLL3 antitela sa toksičnim peptidom kao fuzionih proteina. Za dobijanje antitelo-fuzionih proteina, proteinski agens ili toksin se generalno nalazi na C-terminalnoj strani antitela. Peptidnom linkeru može biti dozvoljeno da interveniše između antitela i proteinskog agensa ili toksina.
(3) Bispecifično antitelo
[0094] Štaviše, antitelo prisutno u farmaceutskom preparatu iz sadašnjeg pronalaska, može biti bispecifično antitelo. Bispecifično antitelo se odnosi na antitelo koje ima, u istoj molekuli antitela, varijabilne regione koji prepoznaju različite epitope. U sadašnjem pronalasku, bispecifično antitelo može imati mesta za vezivanje antigena koja prepoznaju različite epitope na molekulu DLL3. Stoga, dva takva molekula bispecifičnog antitela mogu da se vezuju za jedan molekul DLL3. Kao rezultat, može se očekivati jači citotoksični efekat.
[0095] Alternativno, bispecifično antitelo prisutno u farmaceutskom preparatu iz sadašnjeg pronalaska, može imati mesto za vezivanje antigena, od kojih jedno prepoznaje DLL3, a od kojih drugo prepoznaje citotoksičnu supstancu. Citotoksična supstanca specifično obuhvata, na primer, hemioterapeutski agens, toksični peptid i radioaktivnu hemikaliju. Takvo bispecifično antitelo se vezuje za ćelije koje eksprimiraju DLL3, dok ono hvata citotoksičnu supstancu. Kao rezultat, citotoksičnoj supstanci može biti dozvoljeno da direktno deluje na ćelije koje eksprimiraju DLL3. Osobito, bispecifično antitelo koje prepoznaje citotoksičnu supstancu može specifično oštetiti tumorske ćelije i inhibirati rast tumorskih ćelija.
[0096] Štaviše, u sadašnjem pronalasku, može biti korišćeno bispecifično antitelo koje sadrži mesto za vezivanje DLL3 kombinovano sa mestom vezivanja antigena koje prepoznaje antigen koji nije DLL3. Mesto za vezivanje antigena koje može biti kombinovano s ovim u takvim bispecificnim antitelima prepoznaje, na primer, antigen koji je specifično izražen na površini ciljnih ćelija raka, kao sa DLL3, ali se razlikuje od DLL3.
[0097] Postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela je poznat u stanju tehnike. Na primer, dva antitela koja se razlikuju u prepoznatom antigenu u vezi stim, mogu biti vezana za pripremu bispecifičnog antitela. Svako od vezanih antitela, može biti 1/2 molekula koji ima teške i lake lance ili može biti 1/4 molekula koji se sastoji od teških lanaca. Alternativno, različiti hibridomi koji proizvode monoklonska antitela, mogu biti spojeni da bi se pripremile fuzione ćelije koje proizvode bispecifična antitela. Osim toga, bispecifično antitelo može biti pripremljeno pristupom genetičkog inženjeringa.
[0098] Aktivnost vezivanja antigena od antitela, može biti određena korišćenjem sredstava poznatih u struci (Antitela A Laboratorijski priručnik. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbour Laboratory, 1988). Na primer, može biti korišćen ELISA (enzimski vezani imunosorbentni test), EIA (enzimski imunotest), RIA (radioimunotest) ili fluoroimunotest.
(4) Modifikacija šećernog lanca
[0099] Antitelo, upotrebljeno u farmaceutskom preparatu iz predmetnog pronalaska, može biti antitelo koje ima modifikovani šećerni lanac. Poznato je da se citotoksične aktivnosti antitela, mogu poboljšati modifikovanjem njihovih šećernih lanaca. Na primer, glikozilovana antitela (WO 99/54342, itd.), antitela deficijentna u fukozi dodatoj njihovim šećernim lancima (WO 00/61739, WO 02/31140 itd.), i antitela koja imaju šećerni lanac koji ima bisekciju GlcNAc (WO 02/79255 itd.) su poznata u struci kao antitela sa modifikovanim šećernim lancem.
(5) Aktivnost internalizacije
[0100] Štaviše, antitelo upotrebljeno u farmaceutskom preparatu prema predmetnom pronalasku, može imati aktivnost internalizacije. U predmetnom pronalasku, "antitelo koje ima aktivnost internalizacije" označava antitelo koje se transportuje u ćelije (citoplazme, vezikule, druge organele, itd.) preko njegovog vezivanja za DLL3.
[0101] Bez obzira da li antitelo poseduje aktivnost internalizacije ili ne, može biti potvrđeno metodom koja je opšte poznata stručnjacima u struci i može biti potvrđeno pomoću, na primer, metode koja uključuje, kontaktiranje anti-DLL3 antitela vezanih za obeležavajući materijal sa ćelijama koje eksprimiraju DLL3 i potvrđujući da li je obeleženi materijal inkorporiran u ćelije ili nije, ili postupak koji uključuje, kontaktiranje anti-DLL3 antitela konjugovanog sa citotoksičnom sušstancom sa ćelijama koje eksprimiraju DLL3 i potvrđujući da li je indukovana smrt ćelija koje eksprimiraju DLL3 ili nije.
[0102] Konkretnije, aktivnost internalizacije anti-DLL3 antitela, može biti analizirana, na primer, metodom opisanom u Primerima.
[0103] Antitelo koje poseduje aktivnost internalizacije, može biti konjugovano sa, na primer, citotoksičnom supstancom i upotrebljava se kao farmaceutski preparat, kao što je antikancerogeni agens, kasnije opisan.
Priprema anti-DLL3 antitela
1. Priprema anti-DLL3 antitela korišćenjem hibridoma za proizvodnju monoklonskih antitela
[0104] Hibridomi koji proizvode monoklonska antitela, mogu biti pripremljeni u skladu sa tehnikom koja je poznata u struci, kao što sledi: prvo, životinje su imunizovane sa DLL3 proteinima ili njegovim delimičnim peptidima (koji će biti opisani kasnije) koji se koriste kao senzibilišući antigeni, prema uobičajenom postupku imunizacije. Dobijeni imunociti su spojeni sa roditeljskim ćelijama poznatim u struci, pomoću uobičajene metode fuzije ćelija za dobijanje hibridoma. Ovi hibridomi su dalje posmatrani za ćelije koje proizvode antitelo od interesa, uobičajenom metodom skrininga za odabir hibridoma koji proizvode anti-DLL3 antitela. Željeno anti-DLL3 monoklonsko antitelo je dobijeno iz odabranih hibridoma. Osobito, anti-DLL3 monoklonsko antitelo je pripremljeno na sledeći način:
(1) Priprema DLL3 proteina
[0105] Prvo, DLL3 geni mogu biti izraženi za dobijanje DLL3 proteina koji se koriste kao senzibilišući antigeni za dobijanje antitela. Osobito, sekvenca gena koja kodira DLL3 je ubačena u ekspresione vektore poznate u struci, sa kojima se zatim transformišu odgovarajuće ćelije domaćina. Zatim su prečišćeni humani DLL3 proteini od interesa iz ćelija domaćina ili supernatanta kulture od ovog, pomoću postupka poznatog u tehnici. Prečišćeni, prirodni DLL3 proteini ili fuzioni proteini koji sadrže željeni parcijalni polipeptid DLL3 proteina, fuzionisan sa različitim polipeptidom, mogu biti korišćeni kao imunogeni. Na primer, Fc fragmenti antitela, oznake peptida i tako dalje, mogu se koristiti za proizvodnju fuzionih proteina koji se koriste kao imunogeni. Ekspresioni vektori za fuzione proteine, mogu biti pripremljeni fuzionisanjem, u okviru, dva ili više gena, koja respektivno kodiraju željene polipeptidne fragmente i umetanjem ovog fuzionog gena u ekspresione vektore. Metoda za pripremu fuzionih proteina je opisana u Molekularnom kloniranju 2. izd. (Sambrook, J. i sar., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbour Lab. Press, 1989).
[0106] Tako prečišćeni DLL3 proteini, mogu biti korišćeni kao senzibilišući antigeni za imunizaciju sisara. Delimični peptidi iz DLL3, takođe, mogu biti korišćeni kao senzibilišući antigeni. Na primer, sledeći peptidi, mogu biti korišćeni kao antigeni za senzibilizaciju:
[0107] Region i veličina, korišćenog parcijalnog peptida DLL3 nisu ograničeni. Broj aminokiselina koje čine peptid koji služi kao antigen za senzibilizaciju je poželjno najmanje 3 ili više, na primer, 5 ili više ili 6 ili više. Specifičnije, peptidi od 8 do 50 ostataka, poželjno 10 do 30 ostataka, mogu biti korišćeni kao antigeni za senzibilizaciju.
(2) Imunizacija sa DLL3 proteinom
[0108] Sisari su imunizovani sa DLL3 proteinima ili njegovim delimičnim peptidima, kao senzibilišućim antigenima. Imunizovani sisari nisu posebno ograničeni. Za dobijanje monoklonskog antitela metodom fuzije ćelija, poželjno je da imunizovane životinje treba da budu odabrane uzimajući u obzir kompatibilnost sa roditeljskim ćelijama koje se koriste u fuziji ćelija. Generalno, glodari su poželjniji kao imunizovane životinje. Osobito, miševi, pacovi, hrčci ili zečevi, mogu biti korišćeni kao imunizovane životinje. Osim toga, majmuni ili slično, mogu biti korišćeni kao imunizovane životinje.
[0109] Ove životinje, mogu biti imunizovane sa senzibilišućim antigenom, prema postupku poznatom u struci. Na primer, opšti metod, može da uključuje imunizaciju sisara sa senzibilišućim antigenom intraperitonealnom ili subkutanom injekcijom. Osobito, senzibilišući antigeni su primenjeni kod sisara nekoliko puta, u intervalima od 4 do 21 dana. Senzibilišući antigeni su razblaženi sa PBS-om (fiziološki rastvor puferovan sa fosfatom), slanim rastvorom ili slično, pri odgovarajućem odnosu razblaženja i korišćeni su u imunizaciji. Osim toga, senzibilišući antigeni, mogu biti primenjivani zajedno sa adjuvansom. Na primer, antigeni se mogu mešati sa Freundovim kompletnim adjuvansom za emulzifikaciju kako bi se pripremili antigeni za senzibilizaciju. Štaviše, odgovarajući nosač može biti korišćen u imunizaciji sa senzibilišućim antigenom. Naročito, kada se delimični peptidi koji imaju malu molekulsku masu korišćeni kao antigeni za senzibilizaciju, poželjno je da peptidi antigena za senzibilizaciju budu vezani za proteinske nosače, kao što su albumin ili hemocijanin iz prilepka i korišćeni su u imunizaciji.
(3) DNK imunizacija
[0110] Monoklonsko antitelo se takođe, može dobiti pomoću imunizacije DNK. Imunizacija DNK je imunostimulaciona metoda koja uključuje: imunizaciju životinja primenom vektorske DNK koja je izgrađena u obliku sposobnom da eksprimira antigenske protein-kodirajuće gene kod imunizovanih životinja; i omogućava imunizovanim životinjama da izraze imunizirajuće antigene in vivo. Od DNK imunizacije se može očekivati da bude superiornija od opštih metoda imunizacije, korišćenjem primene proteinskih antigena na sledeći način:
- može da obezbedi imunostimulaciju sa strukturama proteina membrane (npr., DLL3); i
- eliminiše potrebu za prečišćavanjem imunizirajućih antigena.
[0111] Za dobijanje monoklonskog antitela koje će biti upotrebljeno u predmetnom pronalasku pomoću imunizacije DNK, prvo, životinje su imunizovane primenom DNK ekspresionog vektora DLL3 proteina. DLL3-kodirajuća DNK, može biti sintetizovana metodom poznatom u struci, kao što je PCR. Dobijena DNK se ubacuje u odgovarajuće vektore ekspresije, pomoću kojih se životinje imunizuju primenom. Na primer, komercijalno dostupni ekspresioni vektori kao što je pcDNA3.1, mogu biti korišćeni kao ekspresioni vektori. Isto tako, metod koji se generalno koristi, može se koristiti za davanje vektora životinjama. Na primer, zlatne čestice sa ekspresionim vektorima na kojima su adsorbovane, mogu se ubaciti u ćelije pomoću genskog pištolja za izvođenje imunizacije DNK.
(4) Priprema hibridoma
[0112] Povećanje količine željenog antitela je potvrđeno u serumu sisara, čime je imunizovan. Zatim se imunociti sakupljaju od sisara i podvrgavaju ćelijskoj fuziji. Naročito, ćelije slezine, mogu biti korišćene kao poželjni imunociti.
[0113] Mijelomske ćelije kod sisara se koriste u fuziji ćelija sa imunocitima. Poželjno je da ćelije mijeloma treba da imaju odgovarajući selekcioni marker za skrining. Selekcioni marker se odnosi na karakter koji može preživeti (ili ne može preživeti), pod određenim uslovima kulture. Na primer, nedostatak hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaze (u daljem tekstu, skraćeno na HGPRT-nedostatak) ili nedostatak timidin-kinaze (u daljem tekstu, skraćeno TK-nedostatak) je poznat u struci kao selekcioni marker. Ćelije koje imaju HGPRT ili TK nedostatak su osetljive na hipoksantin-aminopterin-timidin (u daljem tekstu, skraćeno na HAT-osetljiv). Ćelije osetljive na HAT su ubijene u selektivnom HAT medijumu, jer ne mogu sintetizovati DNK. Nasuprot tome, ove ćelije, kada se spajaju sa normalnim ćelijama, mogu da rastu čak i u HAT selektivnom medijumu, jer mogu nastaviti sintezu DNK pomoću spasonosnog puta normalnih ćelija.
[0114] Ćelije koje imaju HGPRT ili TK nedostatak, mogu biti izabrane u medijumu koji sadrži 6-tioguanin ili 8-azaguanin (u daljem tekstu, skraćenica do 8AG) za nedostatak HGPRT-a ili 5'-bromodeoksiuridin za nedostatak TK. Normalne ćelije su ubijene u takvom medijumu, jer inkorporiraju ove analoge pirimidina u svoje DNK. Nasuprot tome, ćelije sa nedostatkom ovih enzima mogu preživeti u selektivnom medijumu, jer ne mogu inkorporirati pirimidinske analoge u njima. Pored toga, selekcioni marker nazvan davaocem G418 rezistencije, u ćelijama, rezistencije na 2-deoksistreptaminski antibiotik (analog gentamicina) preko gena neomicinske rezistencije. Različite ćelije mijeloma pogodne za fuziju ćelija su poznate u struci. Na primer, mogu biti korišćene sledeće ćelije mijeloma u proizvodnji monoklonskih antitela, za upotrebu u farmaceutskim preparatima prema sadašnjem pronalasku:
P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550),
P3x63Ag8U.1 (Aktuelne teme u mikrobiologiji i imunologiji (1978) 81, 1-7),
NS-1 (Kohler. G. i Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519),
MPC-11 (Margulies. D. H. i sar., Cell (1976) 8, 405-415),
SP2/0 (Shulman, M. i sar., Nature (1978) 276, 269-270),
FO (de St. Groth. S. F. i sar. J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21),
S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323),
R210 (Galfre, G. i sar., Nature (1979) 277, 131-133) ili slično.
[0115] U osnovi, fuzija ćelija imunocita sa ćelijama mijeloma je izvedena u skladu sa postupkom poznatim u struci, na primer, metodom Kohler i Milstein i sar. (Kohler. G. i Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
[0116] Specifičnije, fuzija ćelija može biti izvedena, na primer, u uobičajenom hranljivom medijumu za kulturu u prisustvu promotera fuzije ćelija. Na primer, polietilen glikol (PEG) ili hemaglutinacijski virus Japana (HVJ), mogu biti korišćeni kao promoteri fuzije. Dalje, pomoćno sredstvo, kao što je dimetil sulfoksid, takođe može biti dodato, ako je potrebno, radi poboljšanja efikasnosti fuzije.
[0117] Odnos koji se koristi između imunocita i ćelija mieloma, može biti određen proizvoljno. Na primer, poželjno je da količina imunocita bude određena na 1 do 10 puta od ćelija mieloma. Na primer, medijum za kulturu RPMI1640 ili MEM koji je pogodan za rast linije ćelije mijeloma, kao i uobičajeni medijum za kulturu koji se koristi u ovoj kulturi ćelija, može biti korišćen kao medijum za kulturu u fuziji ćelija. Pored toga, u medijum za kulturu može biti dodat rastvor dopunjen sa serumom (npr. fetalnog telećeg seruma (FCS)).
[0118] Za fuziju ćelija, imunociti i ćelije mijeloma su dobro izmešane u prethodno određenim količinama, u medijumu za kulturu, a zatim pomešane sa rastvorom PEG-a, koji je prethodno zagrejan na približno 37 ° C da bi se formirale fuzione ćelije (hibridomi) od interesa. U metodi fuzije ćelija, na primer, PEG sa prosečnom molekulskom težinom reda od 1000 do 6000, može obično biti dodat pri koncentraciji od 30 do 60% (m/v). Nakon toga, odgovarajući medijum kulture, gore prikazan, sekvencijalno je dodat hibridomima, a smeša je centrifugirana, praćeno uklanjanjem supernatanta. Ova procedura je ponavljana kako bi se uklonili agensi fuzije ćelija ili slično, nepovoljni za rast hibridoma.
[0119] Tako dobijeni hibridomi, mogu biti izabrani korišćenjem selektivnog medijuma za kulturu koji odgovara selekcionom markeru ćelija mijeloma korišćenog u fuziji ćelija. Na primer, ćelije koje imaju HGPRT ili TK nedostatak, mogu biti odabrane kultivacijom hibridoma u medijumu za kulturu HAT (medijum za kulturu koji sadrži hipoksantin, aminopterin i timidin). Osobito, kada se u ćelijskoj fuziji koriste ćelije mijeloma osetljive na HAT, samo ćelije uspešno fuzionisane sa normalnim ćelijama, mogu biti selektivno gajene u medijumu kulture HAT. Kultura koja koristi HAT medijum za kulturu je nastavljena vremenski dovoljno dugo da ubije ćelije (nefuzionisane ćelije), drugačije od hibridoma od interesa. Osobito, kultura se generalno može izvoditi tokom nekoliko dana do nekoliko nedelja kako bi se odabrali hibridomi od interesa. Nakon toga, hibridomi koji proizvode antitelo od interesa, mogu biti prikazani i klonirani kao pojedinačni klonovi uobičajenim postupkom ograničavajućeg razblaženja.
[0120] Skrining antitela od interesa i kloniranje u obliku njegovih pojedinačnih klonova, može biti izvedeno poželjno metodom skrininga zasnovanom na reakciji antigen-antitelo, poznatoj u stanju tehnike. Na primer, antigeni su vezani za nosače, kao što su zrnca napravljena od polistirena ili slično ili komercijalno dostupne mikrotitarske ploče sa 96 bazenčića i reagovali su sa supernatantom kulture hibridoma. Nakon toga, nosač je ispran i zatim je reagovao sa sekundarnim antitelima obeleženim enzimom ili slično. Kada supernatant kulture sadrži antitelo od interesa koji reaguje sa senzibilišućim antigenima, sekundarna antitela se vezuju za nosač preko ovog antitela. Konačno, sekundarna antitela vezana sa nosačem, mogu biti otkrivena da bi se odredilo prisustvo antitela od interesa u supernatantu kulture. Hibridomi koji proizvode željeno antitelo sposobno za vezivanje za antigen, mogu biti klonirani metodom ograničavajućeg razblaživanja ili slično. U ovom skriningu, DLL3 proteini koji se koriste u imunizaciji ili DLL3 proteini koji su u suštini identični ovom, mogu biti korišćeni poželjno kao antigeni. Na primer, ćelijske linije koje izražavaju DLL3, rastvorljiv DLL3, ili slično, mogu biti korišćene kao antigeni.
[0121] Metoda opisana u međunarodnoj publikaciji br. WO 03/104453, može biti korišćena u proizvodnji antitela protiv humanog DLL3.
[0122] Štaviše, pored metode za dobijanje hibridoma imunizacijom ne-humanih životinja sa antigenima, humani limfociti mogu biti senzibilisani sa antigenom, za dobijanje antitela od interesa. Osobito, humani limfociti su prvo senzibilisani sa DLL3 proteinima in vitro. Nakon toga, senzibilisani limfociti su spojeni sa odgovarajućim fuzionim partnerima. Na primer, ćelije mijeloma izvedene od ljudi, sposobne da se dele tokom njihovog života, mogu biti korišćene kao fuzioni partneri (videti Japansku patentnu publikaciju br.1-59878).
[0123] Štaviše, takođe, može biti dobijeno anti-DLL3 humano antitelo davanjem DLL3 proteina kao antigena transgenim životinjama koje imaju sve repertoare gena humanih antitela ili imunizacijom životinja sa DNK koja je konstruisana da eksprimira DLL3 kod životinja.
Ćelije koje proizvode antitela iz imunizovanih životinja, mogu biti besmrtne pomoću tretmana kao što je fuzija ćelija sa odgovarajućim fuzionim partnerima ili infekcije virusom Epstein-Barr. Od besmrtnih ćelija tako dobijenih, mogu se izolovati humana antitela protiv DLL3 proteina (videti Međunarodne objave br. WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918 i WO 94/02602). Pored toga, besmrtne ćelije se takođe mogu klonirati kao ćelije koje proizvode antitela koja imaju specifičnost reakcije od interesa. Kada su korišćene transgene životinje kao imunizovane životinje, imuni sistem životinja prepoznaje humani DLL3 kao stranca. Stoga se humana antitela protiv humanog DLL3 mogu lako dobiti.
(5) Dobijanje monoklonskih antitela iz hibridoma
[0124] Tako pripremljeni hibridomi za proizvodnju monoklonskih antitela, mogu se podkultivisati u uobičajenom medijumu za kulturu. Štaviše, hibridomi se takođe mogu čuvati tokom dužeg perioda, u tečnom azotu.
[0125] Hibridomi su kultivisani prema uobičajenom postupku, a monoklonsko antitelo od interesa može biti dobijeno od supernatanta kulture. Alternativno, hibridomi se primenjuju na sisare koji su kompatibilni sa njim i uzgajaju, a monoklonsko antitelo se takođe, može dobiti u obliku ascitne tečnosti. Prethodna metoda je pogodna za dobijanje visoko čistih antitela.
2. Priprema anti-DLL3 antitela pomoću pristupa genetičkog inženjeringa
(1) Kloniranje gena antitela
[0126] Antitelo može biti pripremljeno pristupom genetičkog inženjeringa, korišćenjem gena antitela kloniranih iz ćelija koje proizvode antitela. Klonirani geni antitela, mogu biti inkorporirani u odgovarajuće vektore i izraženi kao antitela transformacijom domaćina. Metode izolacije gena antitela, uvođenje u vektore i transformacija ćelija domaćina su već utvrđene (videti npr., Vandamme, A. M. i sar., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775 ).
[0127] Na primer, cDNK koje kodiraju varijabilne regione anti-DLL3 antitela, mogu biti dobijene od ćelija hibridoma koji proizvode anti-DLL3 antitela. Za ovu svrhu, obično, ukupne RNK se prvo ekstrahuju iz hibridoma. Na primer, za ekstrakciju mRNK iz ćelija, mogu se koristiti sledeće metode:
- metoda ultracentrifugiranja gvanidina (Chirgwin, J. M. i sar., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) i
- AGPC metoda (Chomczynski, P. i sar., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159).
[0128] Ekstrahovane mRNK, mogu biti prečišćene, korišćenjem kompleta za prečišćavanje mRNK (proizvođača GE Healthcare BioSciences Corp.) ili slično. Alternativno, komplet za direktnu ekstrakciju ukupnih mRNK iz ćelija je takođe komercijalno dostupan, kao što je QuickPrep mRNA Purification Kit (proizvođača GE Healthcare BioSciences Corp.). Ukupne mRNK, mogu biti dobijene od hibridoma korišćenjem takvog kompleta. Iz dobijenih mRNK, cDNK koje kodiraju varijabilni region antitela, mogu biti sintetisane korišćenjem reverzne transkriptaze. U ovom postupku, kao prajmeri, mogu biti korišćene proizvoljne 15- do 30-baznih sekvenci, odabranih iz sekvenci uobičajenih za gene antitela. cDNK se mogu sintetisati korišćenjem kompleta za sintezu početnog lanca cDNK od AMV reverzne transkriptaze (proizveden od Seikagaku Corp.) ili slično. Pored toga, 5'-Ampli FINDER RACE Kit (proizvođača Clontech Laboratories, Inc.) i 5'-RACE PCR (Frohman, M. A. i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; i Belyavsky, A. i sar., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) se mogu koristiti za sintezu i amplifikaciju cDNK. Osim toga, odgovarajuća restrikciona enzimska mesta, opisana kasnije, mogu biti uvedena u oba kraja cDNK, u toku takve sinteze cDNK.
[0129] Od dobijenih PCR proizvoda, fragmenti cDNK od interesa su prečišćeni i zatim spojeni sa vektorskim DNK. Ovako pripremljeni rekombinantni vektori se uvode u E.coli ili slično. Nakon selekcije kolonije, željeni rekombinantni vektori, mogu biti pripremljeni od E. coli koja je formirala koloniju. Zatim, cDNK može biti sekvencirana postupkom poznatom u struci, na primer, metodom završetka dideoksinukleotidnog lanca.
[0130] Štaviše, mogu biti korišćene biblioteke cDNK, za dobijanje gena koji kodiraju varijabilni region antitela. Prvo, cDNK su sintetisane sa mRNK ekstrahovanih iz ćelija koje proizvode antitela, kao šabloni za dobijanje biblioteka cDNK. Komercijalno dostupan komplet je pogodno korišćen u sintezi biblioteke cDNK. U stvarnosti, mRNK su dobijene iz samo nekoliko ćelija, u vrlo malim količinama. Prema tome, njihovo direktno prečišćavanje rezultira niskim prinosima. Stoga se obično na ovo dodaju prenosive RNK koje su se pokazale oslobođenim od gena antitela, nakon čega sledi prečišćavanje mRNK. Alternativno, kada se RNK mogu ekstrahovati u datim količinama iz ćelija koje proizvode antitela, efikasna ekstrakcija se može postići bez korišćenja prenosnih RNK. Dodavanje nosivih RNK može biti nepotrebno za ekstrakciju RNK iz, na primer, 10 ili više ili 30 ili više, poželjno 50 ili više ćelija za proizvodnju antitela.
[0131] Geni antitela su amplifikovani pomoću PCR-a sa dobijenim bibliotekama cDNK-a, kao šablonima. Prajmeri za PCR amplifikaciju gena antitela su poznati u stanju tehnike. Na primer, prajmeri za amplifikaciju gena humanog antitela, mogu biti dizajnirani na osnovu otkrića dokumenta (J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597) ili slično. Ovi prajmeri imaju nukleotidnu sekvencu koja se razlikuje po osnovama podklasa imunoglobulina. Stoga, kada su kao šabloni korišćene biblioteke cDNK čiji podklasa nije poznata, PCR je izveden odabirom prajmera uzimajući u obzir svaku mogućnost.
[0132] Naročito, na primer, u svrhu dobijanja gena za kodiranje humanih IgG-a, mogu biti korišćeni prajmeri, koji su sposobni za amplificiranje svakog od gena koji kodiraju γl do γ4 teške lance i κ i λ lake lance. Prajmeri koji hibridizuju do dela koji odgovara spojnom regionu su generalno korišćeni kao 3' prajmeri za amplifikovanje gena varijabilnih regiona IgG-a. S druge strane, prajmeri pogodni za svaku podklasu mogu biti korišćeni kao 5' prajmeri.
[0133] Proizvodi PCR-a dobijeni iz prajmera za amplifikaciju gena, za ove podklase teškog i lakog lanca su pripremljeni kao njihove nezavisne biblioteke. Tako sintetizovane biblioteke, mogu biti korišćene za prepravljanje imunoglobulina koji sadrže teške i lake lance u kombinaciji. Antitelo od interesa može biti prikazano sa aktivnostima vezivanja preoblikovanih imunoglobulina za DLL3, kao indeks.
(2) Uvođenje gena antitela u ćeliju domaćina
[0134] Za proizvodnju anti-DLL3 antitela, geni kloniranih antitela, mogu biti inkorporirani u ekspresione vektore tako da su ovi geni izraženi pod kontrolom regiona za kontrolu ekspresije. Regioni kontrole ekspresije za ekspresiju antitela obuhvataju, na primer, pojačivače i promotere. Nakon toga, odgovarajuće ćelije domaćina, mogu biti transformisane sa ovim ekspresionim vektorima za dobijanje rekombinantnih ćelija koje eksprimiraju DNK koja kodira anti-DLL3 antitelo.
[0135] Za gensku ekspresiju antitela, DNK koje kodiraju teške lance i lake lance antitela, mogu biti inkorporirane odvojeno, u različitim ekspresionim vektorima. Ista ćelija domaćina može biti ko-transfektovana sa vektorima ugrađenim u teški lanac i laki lanac i omogućavajući na taj način, da izražava molekule antitela koji sadrže teške i lake lance. Alternativno, DNK koje kodiraju teške lance i lake lance antitela, mogu biti inkorporirane u pojedinačne ekspresione vektore, pomoću kojih su transformisane ćelije domaćina (videti Međunarodnu publikaciju br. WO 94/11523).
[0136] Mnoge kombinacije domaćina i ekspresionih vektora su poznate u tehnici za uvođenje izolovanih gena antitela u odgovarajuće domaćine za pripremu antitela. Svi ovi sistemi ekspresije, mogu biti primenjeni na sadašnji pronalazak. Kada se koriste eukariotske ćelije kao domaćini, mogu se koristiti ćelije životinja, biljaka ili gljiva. Osobito, primeri životinjskih ćelija koje mogu biti korišćene u predmetnom pronalasku, mogu da uključuju sledeće ćelije:
i) ćelije sisara kao što su CHO, COS, mijelomske, BHK (bubrega bebe hrčka), Hela, Vero, HEK293, Ba/F3, HL-60, Jurkat i SK-HEP1 ćelije;
ii) amfibijske ćelije kao što su oociti Xenopusa; i
iii) ćelije insekata kao što su: sf9, sf21 i Tn5 ćelije.
[0137] Za biljne ćelije, poznati su ekspresioni sistemi gena antitela u struci, koji uključuju ćelije izvedene iz roda Nicotiana (npr. Nicotiana tabacum). Kultivisane ćelije kalusa, mogu biti korišćene u transformaciji biljnih ćelija.
[0138] Nadalje, sledeće ćelije mogu biti korišćene kao gljivične ćelije:
ćelije koje se dobijaju od kvasaca, kao što su rodovi Saccharomyces (npr.
Saccharomyces cerevisiae) i filamentozne gljive iz roda Pichia (npr. Pichia pastoris) i ćelije izvedene iz roda Aspergillus (npr. Aspergillus niger).
[0139] Alternativno, sistemi ekspresije gena antitela koji koriste prokariotske ćelije su takođe, poznati u struci. Na primer, kada su korišćene bakterijske ćelije, bakterijske ćelije koje se dobijaju od E. coli, Bacillus subtilisa, ili slično mogu biti korišćene u sadašnjem pronalasku.
[0140] Za ekspresiju gena korišćenjem ćelija sisara, korisni promoter rutinski korišćen, gen antitela koji će biti eksprimiran i signal poli A koji se nalazi 3'-nishodno od njega, mogu biti funkcionalno vezani. Primeri promotera/pojačivača, mogu da uključuju neposrednog ranog promotera/pojačivača humanog citomegalovirusa.
[0141] Dodatno, na primer, virusni promoteri/inhenseri ili promoteri/inhenseri izvedeni iz ćelija sisara (npr., humani elongacioni faktor 1α (HEF1α)), mogu biti korišćeni u ekspresiji antitela. Primeri virusa čiji se promoter/pojačivač može koristiti posebno, uključuju, retrovirus, poliomavirus, adenovirus i simian virus 40 (SV40).
[0142] Promoter/pojačivač SV40, može biti korišćen prema postupku od strane Mulligan i sar. (Nature (1979) 277, 108). Štaviše, promoter / pojačivač HEF1 α može lako biti korišćen u ekspresiji gena od interesa metodom Mizushima i sar. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).
[0143] Kada su proizvedena antitela korišćenjem životinjskih ćelija, signalna sekvenca gena teškog ili lakog lanca antitela je poželjno, korišćena kao signalna sekvenca koja je potrebna za ekstracelularnu sekreciju. Štaviše, može biti korišćena signalna sekvenca sekretornog proteina kao što je IL-3 ili IL-6.
[0144] Za ekspresiju gena korišćenjem E. coli, korisni promoter rutinski korišćen, signalna sekvenca za sekreciju antitela i gen antitela koji se izražava, mogu biti funkcionalno vezani. Primeri promotera mogu da uključuju, promotere lacZ i araB. Promoter lacZ može biti korišćen u skladu sa metodom od strane Ward i sar. (Nature (1989) 341, 544-546; i FASEBJ. (1992) 6, 2422-2427). Alternativno, promoter araB može biti korišćen u ekspresiji gena od interesa pomoću metode od strane Better i sar. (Science (1988) 240, 1041-1043).
[0145] Kada su antitela proizvedena u periplazmi E.coli, signalna sekvenca pelB (Lei, S. P. i sar., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379), može biti korišćena za sekreciju antitela. Tada su antitela proizvedena u periplazmi odvojena i zatim ponovo uvijena pomoću proteinskih sredstava za denaturaciju, kao što su urea i gvanidin hidrohlorid, tako da rezultujuća antitela imaju željenu aktivnost vezivanja.
[0146] Izvor replikacije izveden iz SV40, poliomavirusa, adenovirusa, goveđeg papiloma virusa (BPV) ili slično, može biti ubačen u ekspresione vektore. Nadalje, može biti ubačen selekcioni marker u ekspresione vektore, za povećanje broja kopije gena u sistemima ćelija domaćina. Osobito, mogu se koristiti selekcioni markeri, kao što su gen aminoglikozidne fosfotransferaze (APH), gen timidin kinaze (TK), gen E. coli ksantin-guanin fosforiboziltransferaze (Ecogpt) i gena dihidrofolat reduktaze (dhfr).
(3) Dobijanje antitela iz ćelije domaćina
[0147] Ćelije domaćina su transformisane sa ovim ekspresionim vektorima, a transformisane ćelije domaćina su zatim kultivisane in vitro ili in vivo za proizvodnju antitela od interesa. Kultivisanje ćelija domaćina je izvršeno prema postupku poznatom u struci. Na primer, mogu biti korišćeni DMEM, MEM, RPMI1640 ili IMDM medijumi za kulturu i mogu biti korišćeni u kombinaciji sa rastvorom dopunjenim sa serumom, kao što je fetalni teleći serum (FCS).
[0148] Antitela koja su tako izražena i proizvedena, mogu biti prečišćena korišćenjem samostalno, ili u odgovarajućoj kombinaciji, uobičajenih metoda prečišćavanja proteina poznatih u stanju tehnike. Na primer, afinitetne ili hromatografske kolone (npr. kolone proteina A), filteri, ultrafiltracija, isoljavanje i dijaliza, mogu biti odabrane i odgovarajuće kombinovane za odvajanje i prečišćavanje antitela (Antitela A Laboratorijski priručnik. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbour Laboratory, 1988).
[0149] Stoga se takođe, odnosi na gen koji kodira antitelo, ovde opisano. Takođe je otkriven vektor koji sadrži gen. Takođe je opisana ćelija domaćina koja nosi vektor. Takođe je opisana metoda za proizvodnju antitela kodiranog od strane gena, koja obuhvata korak kultivisanja ćelije domaćina.
3. Proizvodnja antitela pomoću transgene životinje
[0150] Pored ćelija domaćina, transgene životinje se takođe mogu koristiti u proizvodnji rekombinantnih antitela. Naročito, antitelo od interesa može biti dobijeno od životinja transfektovanih sa genima koji kodiraju ovo antitelo od interesa. Na primer, geni antitela, mogu biti ubačeni u okvir, u gene koji kodiraju proteine specifično proizvedene u mleku, za izgradnju fuzionih gena. Na primer, kozji β kazein, može biti korišćen kao protein koji se izlučuje u mleko. DNK fragmenti koji sadrže fuzione gene, koji imaju umetak gena antitela su injektirani u kozje embrione, koji se zapravo unose u ženke koza. Od mleka proizvedenog od transgenih koza (ili njihovog potomstva) koje su donele koze koje su primile embrione, željeno antitelo se može dobiti kao fuzioni protein sa mlečnim proteinom. Štaviše, kod transgenih koza, hormon može biti odgovarajuće korišćen za povećanje količine mleka koje sadrži željeno antitelo, proizvedeno od transgenih koza (Ebert, K. M. i sar., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
Farmaceutski preparat
[0151] Pošto je DLL3 visoko izražen u tkivima sitnoćelijskog karcinoma pluća, anti-DLL3 antitelo ima citotoksičnu aktivnost specifičnu za ćelije raka. Stoga, anti-DLL3 antitelo je korisno u lečenju raka pluća koji eksprimira DLL3.
[0152] Specifično, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutski preparat koji sadrži antitelo koje se vezuje za DLL3 protein, kao aktivni sastojak, pri čemu antitelo ima citotoksičnu aktivnost. U izvesnoj realizaciji, farmaceutski preparat je inhibitor ćelijskog rasta, naročito, antikancerogeni agens. Poželjno, inhibitor rasta ćelije i antikancerogeni agens prema predmetnom pronalasku se primenjuju kod subjekta koji ima rak pluća ili može imati rak pluća.
[0153] Antitelo protiv DLL3, korišćeno u farmaceutskom preparatu (npr., antikancerogeni agens) prema predmetnom pronalasku nije posebno ograničeno, i, na primer, može se koristiti bilo koje od gore opisanih anti-DLL3 antitela.
[0154] U sadašnjem pronalasku, fraza "sadrži antitelo koje se vezuje za DLL3 kao aktivni sastojak" označava da sadrži antitelo protiv DLL3, kao osnovni aktivni sastojak i ne ograničava sadržaj anti-DLL3 antitela.
[0155] Farmaceutski preparat iz sadašnjeg pronalaska, može da sadrži anti-DLL3 antitelo konjugovano sa citotoksičnom supstancom, kao aktivni sastojak. Ovaj farmaceutski preparat se može koristiti kao, na primer, inhibitor ćelijskog rasta, naročito antikancerogeni agens. Poželjno, inhibitor ćelijskog rasta i antikancerogeni agens prema predmetnom pronalasku se primenjuju kod subjekta koji ima rak ili može imati rak.
[0156] U sadašnjem pronalasku, fraza "koji sadrži anti-DLL3 antitelo konjugovano sa citotoksičnom supstancom kao aktivni sastojak" znači da sadrži anti-DLL3 antitelo konjugovano sa citotoksičnom supstancom kao glavni aktivni sastojak i ne ograničava sadržaj anti-DLL3 antitela konjugovanog sa citotoksičnom supstancom.
[0157] Kada je bolest ciljana farmaceutskim preparatom iz predmetnog pronalaska rak, ciljani rak je rak pluća, naročito mikrocelularni karcinom pluća. Rak može biti bilo koje od primarnih žarišta i metastatskih žarišta.
[0158] Farmaceutski preparat prema predmetnom pronalasku, može biti primenjen oralno ili parenteralno kod pacijenta. Parenteralna primena je poželjna. Specifični primeri takve metode primene, uključuju injekcionu, transnazalnu, pulmonarnu i transdermalnu primenu. Primeri injekcione primene uključuju, intravenozne, intramuskularne, intraperitonealne i subkutane injekcije, preko kojih se farmaceutski preparat iz sadašnjeg pronalaska može primenjivati sistemski ili lokalno. Štaviše, metoda primene može biti odgovarajuće izabrana u zavisnosti od uzrasta ili simptoma pacijenta. Doza farmaceutskog preparata iz sadašnjeg pronalaska može biti odabrana iz opsega doze od, na primer, od 0,0001 mg do 1000 mg po kg telesne težine po doziranju. Alternativno, doza može biti odabrana iz opsega od, na primer, od 0,001 do 100000 mg po telu. Međutim, farmaceutski preparat prema sadašnjem pronalasku nije ograničen na ove doze.
[0159] Farmaceutski preparat prema predmetnom pronalasku, može biti formulisan prema standardnom postupku (npr., Remington's Pharmaceutical Science, poslednje izdanje, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A) i može dodatno da sadrži farmaceutski prihvatljive nosače ili aditive. Primeri toga uključuju, ali se ne ograničavaju na, surfaktante, ekscipijense, sredstva za bojenje, sredstva za korekciju ukusa, konzervanse, stabilizatore, pufere, suspendujući agense, sredstva za toničnost, veziva, dezintegrante, lubrikanse, promotere protoka i korigense. Ostali nosači koji se rutinski koriste, mogu biti korišćeni na odgovarajući način. Specifični primeri nosača mogu da uključuju, laku anhidrovanu silikatnu kiselinu, laktozu, kristalnu celulozu, manitol, skrob, kalcijum karmelozu, natrijum karmelozu, hidroksipropilcelulozu, hidroksipropilmetilcelulozu, polivinil acetal dietilaminoacetat, polivinil pirolidon, želatin, triglicerid masnih kiselina srednjih lanaca, polioksietilen hidrogenizovano ricinusovo ulje 60, beli šećer, karboksimetilcelulozu, kukuruzni skrob i neorganske soli.
[0160] Nakon kontakta sa ćelijama koje izražavaju DLL3, anti-DLL3 antitelo prisutno u farmaceutskom preparatu prema sadašnjem pronalasku može da ošteti DLL3 ćelije koje eksprimiraju DLL3 ili inhibira njihov rast. Takav postupak koji koristi anti-DLL3 antitelo je takođe, inkorporiran u obim predmetnog pronalaska. Antitelo koje se koristi nije posebno ograničeno, i, na primer, može se koristiti bilo koje od gore opisanih antitela. Ćelije za koje se vezuju antitela protiv DLL3 nisu posebno ograničene, sve dok ćelije izražavaju DLL3. U sadašnjem pronalasku, ćelije koje izražavaju DLL3 su poželjno ćelije raka, još poželjnije ćelije raka pluća, naročito poželjno ćelije sitnoćelijskog karcinoma pluća.
[0161] "Kontakt" se izvodi, na primer, dodavanjem antitela u medijum za kulturu od ćelija koje izražavaju DLL3, kultivisane in vitro. "Kontakt" se takođe vrši primenjivanjem anti-DLL3 antitela kod ne-humanih životinja implantiranih sa ćelijama koje eksprimiraju DLL3 u njihovim telima ili životinjama koje endogeno imaju ćelije raka koje eksprimiraju DLL3.
[0162] Metode, niže prikazane su poželjno korišćene za procenu ili određivanje citotoksičnosti izazvane u ćelijama koje izražavaju DLL3, pomoću kontakta anti-DLL3 antitela. Primeri metoda za procenu ili određivanje citotoksične aktivnosti in vitro, mogu da uključuju analizu aktivnosti ADCC ili CDC, gore opisane. Bez obzira da li anti-DLL3 antitelo ima ili nema aktivnost ADCC ili aktivnost CDC, može se odrediti metodom poznatom u struci (npr. Trenutni protokoli u imunologiji, poglavlje 7. Imunološke studije kod ljudi, Izdavač, John E, Coligan i sar., John Wiley & Sons, Inc., (1993)). U testu aktivnosti, antitela koja imaju izotip identičan onom od anti-DLL3 antitela i koja se ne vezuju za ćelije se koriste kao kontrolna antitela na isti način kao u anti-DLL3 antitelu. Kada anti-DLL3 antitelo ispoljava jaču citotoksičnu aktivnost od one kod kontrolnih antitela, anti-DLL3 antitelo može biti određeno da ima aktivnost.
[0163] Izotip antitela je definisan na osnovu sekvence konstantnog regiona teškog lanca u aminokiselinskoj sekvenci ovog antitela. Izotip antitela je konačno određen u zavisnosti od prebacivanja klase izazvane genetskom rekombinacijom na hromozu, tokom in vivo sazrevanja B ćelija koje proizvode antitela. Razlika u izotipu odražava razliku između fizioloških / patoloških funkcija antitela. Specifično, poznato je da, na primer, na jačinu citotoksične aktivnosti utiču ne samo nivoi ekspresije antigena, već i izotipovi antitela. Prema tome, za analizu citotoksične aktivnosti opisane iznad, poželjno je da antitela koja se koriste kao kontrola treba da imaju izotip identičan onom iz antitela analita.
[0164] Štaviše, za procenu ili određivanje citotoksične aktivnosti in vivo, na primer, ćelije raka koje eksprimiraju DLL3 su intradermalno ili subkutano transplantirane u ne-humane testirane životinje. Zatim je na životinju primenjeno antitelo sa analitom intravenozno ili intraperitonealno, svakodnevno ili u intervalima od nekoliko dana od dana primene ili sledećeg dana. Citotoksična aktivnost može biti određena merenjem veličine tumora tokom vremena. Kontrolna antitela koja imaju identičan izotip na ovo se primenjuju na isti način u in vitro evaluaciji. Kada grupa kojoj su primenjena antitela protiv DLL3 ima značajno manju veličinu tumora od one grupe kojoj su primenjena kontrolna antitela, za anti-DLL3 antitelo se može odrediti da ima citotoksičnu aktivnost. Kada se miševi koriste kao ne-humane testirane životinje, mogu se poželjno koristiti goli (nu/nu) miševi, koji su genetski deficijentni u timusu i time im nedostaju funkcije T limfocita. Upotreba ovih miševa, može isključiti učešće endogenih T limfocita testiranih životinja u evaluaciji/određivanju citotoksične aktivnosti primenjenih antitela.
Dijagnostički lek (metoda dijagnoze)
[0165] Takođe se odnosi na metod za dijagnostikovanje raka, koji obuhvata detekciju DLL3 proteina ili gena koji kodira DLL3 protein. Ekspresija DLL3 je potvrđena da je značajno povećana u tkivima raka ili ćelijskim linijama karcinoma. Stoga, DLL3 je koristan kao marker za specifično otkrivanje kancera.
[0166] Jedan specifičan primer metode dijagnoze može da uključuje postupak za dijagnostikovanje raka, koji obuhvata sledeće korake:
(a) obezbeđivanje uzorka izolovanog iz testiranog subjekta; i
(b) detektovanje nivoa ekspresije DLL3 proteina ili DLL3 gena u uzorku.
[0167] Metoda može dalje da sadrži korak
(c) procene mogućnosti da ispitivani subjekt ima rak, zasnovan na nivou ekspresije
DLL3 proteina ili DLL3 gena.
Detekcija DLL3 proteina ili gena koji kodiraju DLL3 protein
[0168] Takođe, otkriven je postupak gde je rak dijagnostikovan otkrivanjem DLL3 proteina u uzorku. Poželjno je da se detekcija proteina DLL3 izvrši korišćenjem antitela koje prepoznaje DLL3 protein.
[0169] Detekcija obuhvata kvantitativno ili kvalitativno otkrivanje. Primeri kvalitativne detekcije mogu da uključuju sledeće analize:
- test za jednostavno određivanje prisustva ili odsustva DLL3 proteina,
- test za određivanje prisustva ili odsustva više od unapred definisane količine DLL3 proteina, i
- test za upoređivanje količine DLL3 proteina sa onim sadržanim u drugom uzorku (npr. kontrolni uzorak).
[0170] S druge strane, primeri kvantitativne detekcije mogu da uključuju merenje koncentracije DLL3 proteina i merenje količine DLL3 proteina.
[0171] Ispitivani uzorak nije posebno ograničen sve dok je verovatno da uzorak sadrži DLL3 protein. Specifično, poželjni su uzorci sakupljeni od živih organizama, kao što su sisari. Uzorci sakupljeni od ljudi su poželjniji. Specifični primeri test uzorka, mogu da uključuju krv, intersticijsku tečnost, plazmu, ekstravaskularnu tečnost, cerebrospinalnu tečnost, sinovijalnu tečnost, pleuralnu tečnost, serum, limfu, pljuvačku, urin i tkiva. Uzorak je poželjno uzorak dobijen iz uzorka za testiranje, kao što je preparat u kome su fiksirana tkiva ili ćelije sakupljene iz živog tela, ili medijuma ćelijske kulture.
[0172] Dijagnostikovani rak može biti bilo koji karcinom, bez posebnih ograničenja. Specifični primeri, mogu da uključuju karcinom pluća, naročito sitnoćelijski karcinom pluća. Mogu se dijagnostikovati svako od primarnih žarišta i metastatska žarišta ovih karcinoma.
[0173] Kada je otkriven protein u ispitivanom uzorku, dijagnostikovan je rak sa njegovim stepenom kao indeksom. Specifično, kada je količina otkrivenog DLL3 proteina u ispitivanom uzorku veća od negativne kontrole ili kod zdravog pojedinca, pokazano je da ispitivani subjekt ima rak ili je veoma moguće da će imati rak u budućnosti. Specifično, takođe je opisan postupak za dijagnostikovanje raka, koji obuhvata sledeće korake:
(1) detektovanje nivoa ekspresije DLL3 u biološkom uzorku sakupljenom od ispitivanog subjekta i
(2) upoređivanje nivoa ekspresije DLL3 detektovanog u koraku (1) sa kontrolom, pri čemu kada je nivo ekspresije DLL3 veći od onog iz kontrole, utvrđeno je da ispitivani subjekt ima rak.
[0174] Kontrola se odnosi na referentni uzorak za poređenje i obuhvata negativne kontrole i biološke uzorke zdravih pojedinaca. Negativne kontrole, mogu biti dobijene sakupljanjem bioloških uzoraka zdravih pojedinaca i njihovim mešanjem, ako je potrebno. Nivo ekspresije DLL3 u kontroli se može detektovati paralelno sa otkrivanjem nivoa ekspresije DLL3 u biološkom uzorku ispitivanog subjekta. Alternativno, nivo ekspresije DLL3 u velikom broju bioloških uzoraka zdravih pojedinaca može biti unapred detektovan, kako bi se statistički utvrdio standardni nivo ekspresije kod zdravih pojedinaca. Specifično, na primer, srednja vrednost ± 2 × standardna devijacija (S.D.) ili srednja ± 3 × standardna devijacija (S.D.) se takođe može koristiti kao standardna vrednost. Statistički, srednja ± 2 × standardna devijacija (S.D.) i srednja ± 3 × standardna devijacija (S.D.) uključuju, vrednosti od 80% i 90% zdravih pojedinaca, respektivno.
[0175] Alternativno, nivo ekspresije DLL3 u kontroli, može biti određen korišćenjem ROC krive. ROC kriva ili radna karakteristična kriva primaoca je grafikon koji pokazuje osetljivost detekcije na ordinati i lažno pozitivne stope (tj., 1-specifičnost) na abscisi. ROC kriva se može dobiti crtanjem promena u osetljivosti i lažno pozitivnim stopama, u serijama različitih referentnih vrednosti, za određivanje nivoa ekspresije DLL3 u biološkim uzorcima.
[0176] "Referentna vrednost" za dobijanje ROC krive je numerička vrednost privremeno korišćena za statističku analizu. Generalno, "referentna vrednost" za dobijanje ROC krive se serijski menja unutar opsega koji može pokriti sve odabrane referentne vrednosti. Na primer, referentna vrednost se može razlikovati između minimalno i maksimalno izmerenih vrednosti DLL3 u analiziranoj populaciji.
[0177] Standardna vrednost od koje se može očekivati da nudi željenu osetljivost i preciznost detekcije, može se odabrati na osnovu dobijene ROC krive. Standardna vrednost statistički podešena na osnovu ROC krive ili slično se takođe naziva granična vrednost. U postupku za otkrivanje raka na osnovu granične vrednosti, gore opisani korak (2) sadrži upoređivanje nivoa ekspresije DLL3 detektovanog u koraku (1) sa graničnom vrednošću. Zatim, kada je nivo ekspresije DLL3 detektovan u koraku (1) veći od granične vrednosti, kod ispitivanog subjekta je otkriven rak.
[0178] Nivo ekspresije DLL3, može biti određen proizvoljnim metodom. Specifično, nivo ekspresije DLL3, može biti određen procenom količine DLL3 mRNK, količine DLL3 proteina ili biološke aktivnosti DLL3 proteina. Količina DLL3 mRNK ili proteina, može se odrediti metodom opisanom u sadašnjoj specifikaciji.
[0179] Naročito poželjan, ispitivani subjekt je čovek. Kada se životinja koja nije humana koristi kao ispitivani subjekt, protein DLL3 koji se detektuje potiče od ove životinjske vrste.
[0180] Postupak otkrivanja DLL3 proteina koji se nalazi u ispitivanom uzorku nije posebno ograničen i poželjna je metoda imunološke detekcije koja koristi antitelo protiv DLL3, kao što je objašnjeno primerom u nastavku:
enzimski povezan imunosorbentni test (ELISA),
radioimunotest (RIA),
enzimski imunotest (EIA),
fluoroimunotest (FIA),
luminescentni imunotest (LIA),
imunoprecipitacija (IP),
turbidimetrijski imunotest (TIA),
Western blotting (VB),
imunohistohemijski (IHC) metoda,
pojedinačna radijalna imunodifuzija (SRID),
dot blot i
slot blot.
[0181] Među ovim pristupima, imunohistohemijska (IHC) metoda je poželjna metoda imunološke analize za dijagnostikovanje karcinoma, koja obuhvata korak otkrivanja DLL3 proteina u odeljcima u kojima su fiksirana tkiva ili ćelije dobijene od pacijenta koji ima rak. Imunološke metode opisane iznad, kao što je imunohistohemijska (IHC) metoda su generalno poznate stručnjacima u struci.
[0182] Pošto je DLL3 membranski protein čiji se ekspresija poboljšava na način specifičan za karcinom ćelija, ćelije raka ili tkiva raka se mogu detektovati korišćenjem anti-DLL3 antitela. Ćelije raka koje se nalaze u ćelijama ili tkivima sakupljenim iz živih organizama su detektovane imunohistološkom analizom.
[0183] Kancerogena tkiva takođe, mogu biti otkrivena in vivo korišćenjem anti-DLL3 antitela. Ovaj postupak specifično obuhvata sledeće korake: (1) primenjivanje, kod ispitivanog subjekta, materijala za obeležavanje (na primer, radioizotopom)-obeleženo antitelo koje se vezuje za DLL3 protein; i (2) otkrivanje nagomilavanja materijala za obeležavanje. Antitelo može biti detektibilno obeleženo za praćenje antitela primenjenog u živom organizmu. Na primer, antitelo može biti označeno fluorescentnim ili luminescentnim materijalom ili radioizotopom, a njegovo in vivo ponašanje može biti praćeno. Antitelo obeleženo fluorescentnim ili luminescentnim materijalom se može posmatrati korišćenjem endoskopa ili peritoneoskopa. Lokalizacija antitela se može snimiti traženjem radioaktivnosti radioizotopa. In vivo lokalizacija anti-DLL3 antitela predstavlja prisustvo ćelija raka.
[0184] Nukleid koji emituje pozitron, može biti korišćen kao radioizotop za obeležavanje antitela za in vivo detekciju raka. Na primer, antitelo može biti obeleženo sa nukleidom koji emituje pozitron, kao što su 18F, 55Co, 64Cu, 66Ga, 68Ga, 76Br, 89Zr i 124I. Može biti korišćen postupak poznat u stanju tehnike (Acta Oncol 32, 825-830, 1993), u obeležavanju anti-DLL3 antitela sa ovim nukleidima koji emituju pozitrone.
[0185] Antitelo protiv DLL3 obeleženo sa pozitron-emitujućim nukleidom je primenjeno kod ljudi ili životinja. Zatim, zračenje emitovano od strane radionukleida je izmereno neinvazivno korišćenjem PET-a (pozitron emisiona tomografija) i konvertovano u slike pomoću računarskog tomografskog pristupa. PET aparat je namenjen za neinvanzivno dobijanje podataka o in vivo ponašanju leka ili slično. PET može kvantitativno prikazati intenzitet zračenja kao intenzitet signala. Ovakvom upotrebom PET-a, molekule antigena visoko izražene kod određenog raka, mogu biti otkrivene bez sakupljanja uzoraka od pacijenata. Antitelo protiv DLL3, može biti obeleženo radiološkim markiranjem pomoću nukleida sa kratkim životom, korišćenjem nukleida koji emituje pozitron, kao što su 11C, 13N, 15O, 18F i 45Ti, pored gore opisanih nukleida.
[0186] Istraživanje i razvoj se prate kao, na primer, tehnike proizvodnje kratkotrajnih nukleida, korišćenjem medicinskog ciklotrona i nukleida gore opisanih ili proizvodnja kratkotrajnih radioobeleženih jedinjenja. Antitela protiv DLL3, mogu biti obeležena raznim radioizotopima pomoću ovih tehnika. Antitelo protiv DLL3 primenjeno kod pacijenata se akumulira u primarnim žarištima i metastatskim žarištima, u skladu sa specifičnošću anti-DLL3 antitela za patološka tkiva na svakom mestu. Kada je anti-DLL3 antitelo obeleženo nukleidom koji emituje pozitron, njegova radioaktivnost se može detektovati da bi se otkrilo prisustvo primarnih žarišta i metastatskih žarišta zasnovanih na lokalizaciji radioaktivnosti. Aktivna vrednost gama zračenja ili pozitronske emisije od 25 do 4000 keV, može biti korišćena za dijagnostičku upotrebu. Štaviše, terapeutski efekat se takođe, može očekivati odabirom odgovarajućeg nukleida i primenjivanjem izabranog nukleida u većim količinama. Nukleid koji obezbeđuje vrednost gama zračenja ili pozitronske emisije od 70 do 700 keV može se koristiti za dobijanje antikancerogenog efekta pripisanog zračenju.
Detekcija polinukleotida koji kodira DLL3 protein
[0187] U alternativnom aspektu postupka, detektovana je ekspresija DLL3 polinukleotida. Detektovani polinukleotid nije posebno ograničen i poželjno je mRNK. Detekcija obuhvata kvantitativno ili kvalitativno otkrivanje. Primeri kvalitativne detekcije, mogu uključivati sledeće postupke analize:
- test za jednostavno određivanje prisustva ili odsustva DLL3 mRNK,
- test za određivanje prisustva ili odsustva više od unapred određene količine DLL3 mRNK, i
- test za poređenje količine DLL3 mRNK sa onom sadržanom u drugom uzorku (npr.
kontrolni uzorak).
[0188] S druge strane, primeri kvantitativne detekcije mogu da uključuju merenje koncentracije DLL3 mRNK i merenje količine DLL3 mRNK.
[0189] Proizvoljni uzorak koji verovatno sadrži DLL3 mRNK, može biti korišćen kao ispitivani uzorak Poželjni su uzorci sakupljeni od živih organizama, kao što su sisari. Poželjniji su uzorci sakupljeni od ljudi. Specifični primeri ispitivanog uzorka, mogu da uključuju krv, intersticijsku tečnost, plazmu, ekstravaskularnu tečnost, cerebrospinalnu tečnost, sinovijalnu tečnost, pleuralnu tečnost, serum, limfu, pljuvačku, urin i tkiva. Uzorak je poželjno uzorak dobijen iz uzorka za testiranje, kao što je preparat u kome su fiksirana tkiva ili ćelije sakupljene iz živog tela, ili medijuma ćelijske kulture. Ovi uzorci su obuhvaćeni ispitivanim uzorkom.
[0190] In situ hibridizacija je poželjno, korišćena za uzorak dobijen od uzorka za testiranje, kao što je preparat u kome su fiksirana tkiva ili ćelije sakupljene iz živog tela, ili medijuma ćelijske kulture. In situ hidridizacija je razvijena kao pristup za potvrđivanje prisustva ili odsustva ili distribucije određene DNK ili RNK u ćelijama ili tkivima i jačine njenog izražavanja. Ovaj metod primenjuje principe na kojima probna nukleinska kiselina koja ima nukleotidnu sekvencu komplementarnu intracelularnoj određenoj sekvenci nukleinske kiseline ima svojstvo specifičnog formiranja kompleksa. Proba je unapred obeležena sa radioizotopom (RI), antigenom (hapten) ili slično. Kao rezultat, mesto hibridizacije se može razlikovati preko detekcije oznake. Stoga, in situ hibridizacija je korišćena u, na primer, detekciji intracelularne DNK ili RNK, ili slično. Poželjno, RI se može koristiti za obeležavanje probe. Na primer, poželjno je korišćenje fluorescentnog obeležavanja sa supstancom koja nije radioaktivna, kao što su biotin ili hapten (npr., digoksigenin). Na primer, posebno je poželjno korišćen metod detekcije fluorescentnom in situ hibridizacijom nazvan FISH.
[0191] Dijagnostikovan je rak pluća, naročito sitnoćelijski rak pluća. Mogu se dijagnostikovati bilo koja od primarnih žarišta i metastatskih žarišta ovih karcinoma.
[0192] Proizvoljna životinjska vrsta koja eksprimira DLL3 gen, može biti korišćena kao ispitivani subjekt. Posebno poželjno, ispitivani subjekt je čovek. Kada se kao subjekt ispitivanja koristi ne-humana životinjska vrsta, DLL3 gen koji se detektuje je izveden iz ove životinjske vrste.
[0193] U nastavku će biti opisan poseban aspekt metode za detekciju. Prvo, uzorak je pripremljen od ispitivanog subjekta. Nakon toga, otkrivena je DLL3 mRNK sadržana u uzorku. U metodi, takođe, može biti otkrivena cDNK sintetizovana iz mRNK. Kada je u testiranom uzorku otkrivena cDNK koja kodira DLL3, ispitivani subjekt se dijagnostikuje kao onaj koji je moguće da ima rak. Na primer, kada je količina DLL3 mRNK ili DLL3-kodirajuće cDNK koja je otkrivena u testiranom uzorku veća od one iz negativnih kontrola ili zdravih pojedinaca, pokazano je da ispitivani subjekt ima rak ili je veoma verovatno da će imati rak u budućnosti.
[0194] Postupak za otkrivanje mRNK je poznat u stanju tehnike. Specifični primeri postupka koji se mogu koristiti uključuju: hibridizaciju nukleinske kiseline korišćenjem uzoraka koji su imobilisani na čvrstoj fazi odabranoj od čipova genoma, nizova cDNK i membranskih filtera; RT-PCR; PCR u realnom vremenu; metod oduzimanja; metodu diferencijalnog prikaza; diferencijalnu hibridizaciju; i ukrštenu hibridizaciju.
[0195] Postupak detekcije, može biti automatizovan korišćenjem različitih automatskih detektora. Takva automatizacija postiže otkrivanje velikog broja uzoraka u kratkom vrememskom periodu.
Komplet za dijagnozu raka
[0196] Takođe je opisan dijagnostički lek ili komplet za dijagnozu karcinoma, koji sadrži reagens za detekciju DLL3 proteina, u ispitivanom uzorku. Dijagnostički lek sadrži najmanje anti-DLL3 antitelo.
[0197] Reagens za dijagnozu karcinoma, može biti kombinovan sa drugim faktorima koji se koriste kod otkrivanja DLL3 da bi se pripremio komplet za dijagnozu karcinoma. Specifično, takođe je opisan komplet za dijagnozu karcinoma, koji obuhvata: antitelo koje se vezuje za DLL3; i reagens za otkrivanje vezivanja antitela za DLL3 i dalje može sadržati kontrolni uzorak koji sadrži biološki uzorak koji sadrži DLL3. Priručnik za izvođenje postupaka ispitivanja, može dalje, biti uključen u kompletu.
Primeri
[0198] U daljem tekstu, sadašnji pronalazak će biti opisan konkretnije u odnosu na primere. Međutim, predmetni pronalazak nije namenjen da bude ograničen na ove primere.
[Primer 1] Povećana transkripcija DLL3 (delta-like 3) u sitnoćelijskom raku pluća
[0199] Analizirana je distribucija genske ekspresije humane DLL3 mRNK u kliničkim karcinomima, ćelijskim linijama raka i raznim normalnim organima, korišćenjem Human Exon 1.0 ST Array (Affymetrix, Inc.). U analizi ekspresije, korišćene ukupne RNK su izvedene iz tumorskih mesta u 13 slučajeva izolovanih tkiva od sitnoćelijskog karcinoma pluća, 3 tipa ćelijskih linija sitnoćelijskog karcinoma pluća i 49 tipova normalnih tkiva (nabavljenih od od Clontech Laboratories, Inc., Ambion, Inc., Stratagene Corp., Cell Applications, Inc., Panomics, Inc., CHEMICON i BioChain Institute, Inc.). Sve lokacije tumora u izolovanim kliničkim tkivima raka i ćelijskim ćelijama karcinoma (kupljene od ATCC) su podvrgnute ukupnoj RNK ekstrakciji korišćenjem Trizol (Invitrogen Corp.) prema protokolu koji je uključen u proizvod. Eksperiment analize genske ekspresije je sproveden korišćenjem 1 μg od svake ukupne RNK dobijene prema GeneChip Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay Manual (Affymetrix, Inc.). Human Exon 1.0 ST Array. Podaci su digitalizovani pomoću softvera ExACT (Exon Array Computational Tool) koji je obezbedio Affymetrix, Inc.
[0200] 13 probnih kompleta za DLL3 je bilo prisutno na Human Exon 1.0 ST Array. Sredina vrednosti ekspresije je određena iz ovih probnih kompleta, a nivo ekspresije gena je upoređen među tkivima. Podaci o ekspresiji dobijeni od normalnih tkiva, tumorska mesta u izolovanim tkivima sitnoćelijskog karcinoma pluća i ćelijske linije sitnoćelijskog karcinoma pluća su prikazane na slici 1.
[0201] Nađeno je da je genska ekspresija humanog DLL3 značajno povećana na mestima tumora, u izolovanim tkivima sitnoćelijskog karcinoma pluća i ćelijskim linijama sitnoćelijskog karcinoma pluća, u poređenju sa normalnim tkivima, osim fetalnog mozga. Ovi rezultati obećavaju efikasnost terapije, korišćenjem antitumorskog sredstva koje molekularno cilja humani DLL3, tj. mogućnost smanjenja veličine tumora bez oštećenja normalnih tkiva.
[Primer 2] Kloniranje cDNK i priprema rekombinantne ćelije
[0202] Humana DLL3 cDNK (NM_016941), koja je navedena u SEK ID BR-a: 1 i 57 je amplifikovana PCR-om iz biblioteke cDNK humanog fetalnog mozga i klonirana u ekspresione vektore pMCN za sisare. Vektor pMCN postiže ekspresiju stranog gena pod kontrolom mišjeg CMV promotera (GenBank: U68299). Vektor pMCN ima gen za rezistenciju na Geneticin. Ćelijska linija CHO DG44 (Invitrogen Corp.) je transformisana sa humanim DLL3 ekspresionim vektorom. Ćelije otporne na lekove su odabrane u prisustvu Geneticina. Klonirane ćelije koje stabilno izražavaju ljudski protein DLL3 su odabrane korišćenjem komercijalno dostupnih anti-DLL3 antitela (R & D Systems, Inc., MAB4315) za uspostavljanje humanih DLL3/DG ćelija. Slično tome, mišja IL-3-zavisna pro B ćelijska linija Ba/F3 je transformisana pomoću humanog DLL3 ekspresionog vektora, za uspostavljanje humanih DLL3/BaF3 ćelija.
[0203] DLL3 cDNK miša (NM_007866), kao što je navedeno u SEK ID BR-a: 2 i 58 je amplifikovana PCR-om iz biblioteke cDNK fetusa miša i klonirana u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija Ba/F3 je transformisana sa mišjim DLL3 ekspresionim vektorom. Ćelije otporne na lekove su odabrane u prisustvu Geneticina. Ćelije koje eksprimiraju mišji DLL3 protein su odabrane korišćenjem komercijalno dostupnih antitela (R & D Systems, Inc., MAB4315), za uspostavljanje mišjih DLL3/BaF3 ćelija.
[0204] Humana DLL1 cDNK (NM_005618), kao što je navedeno u SEK ID BR-a: 3 i 59 je amplifikovana PCR-om iz biblioteke cDNK humane slezine i klonirana u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija Ba/F3 je transformisana pomoću humanog DLL1 ekspresionog vektora. Ćelije otporne na lekove su odabrane u prisustvu Geneticina. Ćelije koje eksprimiraju humani DLL1 protein su odabrane korišćenjem komercijalno dostupnih antitela (R & D Systems, Inc., MAB1818), za uspostavljanje humanih DLL1/BaF3 ćelija.
[0205] cDNK humanog Notch1 (NM_017617), kao što je navedeno u SEK ID BR-a: 4 i 60 je amplifikovana PCR-om iz biblioteke cDNK ćelijske linije raka dojke DU4475 i klonirana u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija DG44 je transformisana sa humanim Notch1 ekspresionim vektorom. Ćelije otporne na lekove su odabrane u prisustvu Geneticina. Ćelije koje eksprimiraju humani protein Notch1 su odabrane korišćenjem komercijalno dostupnih antitela (GeneTex Inc., GTX23294), za uspostavljanje humanih celija Notch1/ DG44.
[0206] Ćelijske linije koje proizvode rastvorljivi DLL3 protein ili njegov varijantni protein N-terminalne delecije, pripremljene su u svrhu dobijanja imunogena za dobijanje anti-DLL3 antitela i određivanje epitopa za dobijena antitela. Humana DLL3 ekstracelularna sekvenca je sastavljena od motiva DSL domena za vezivanje Notch receptora (Br-a 176-215 u aminokiselinskoj sekvenci) i šest EGF-sličnih domena (1: 216-249, 2: 274-310, 3: 312-351, 4: 353-389, 5: 391-427 i 6: 429-465).
[0207] cDNK koja kodira humerni molekul humanog DLL3-Fc (SEK ID BR: 5) koji se sastoji od humanog DLL3 ekstracelularnog regiona (27-492 u aminokiselinskoj sekvenci od SEK ID BR: 1) i sekvence konstantnog regiona mišjeg IgG2a antitela je pripremljena i klonirana u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija DG44 je transformisana pomoću humanog DLL3-Fc ekspresionog vektora. Ćelije otporne na lekove su odabrane u prisustvu Geneticina. Klonovi koji visoko izražavaju humani DLL3-Fc protein su izabrani pomoću metode ELISA, korišćenjem anti-mišjih antitela za uspostavljanje DG44 ćelija koje proizvode humani DLL3-Fc.
[0208] cDNK koja kodira himerni molekul humanog DLL3delta1-Fc (SEK ID BR: 6) koji se sastoji od parcijalne sekvence humanog DLL3 ekstracelularnog regiona (176-492 u aminokiselinskoj sekvenci od SEK ID BR: 1) i sekvenci konstantnog regiona mišjeg IgG2a antitela je pripremljena i klonirana u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija DG44 je transformisana sa humanim DLL3delta1-Fc ekspresionim vektorom. Ćelije otporne na lekove su odabrane u prisustvu Geneticina. Klonovi koji su izrazito izražavali humani DLL3delta1delta1-Fc protein su odabrani pomoću ELISA, korišćenjem anti-mišjih antitela za uspostavljanje DG44 ćelija koje proizvode humani DLL3delta1-Fc.
[0209] Pripremljena je cDNK koja kodira himerni molekul humanog DLL3delta2-Fc (SEK ID BR: 7) koji se sastoji od parcijalne sekvence iz humanog DLL3 ekstracelularnog regiona (216-492 u aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 1) i sekvenci konstantnog regiona mišjeg IgG2a antitela i klonirana je u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija DG44 je transformisana sa humanim DLL3delta2-Fc ekspresionim vektorom. Ćelije otporne na lekove su odabrane u prisustvu Geneticina. Klonovi koji izrazito izražavaju humani DLL3deltaldelta2-Fc protein su odabrani pomoću analize ELISA, korišćenjem anti-mišjih antitela za uspostavljanje DG44 ćelija koje proizvode humani DLL3delta2-Fc.
[0210] cDNK koja kodira himerni molekul mišjeg DLL3-Fc (SEK ID BR: 8) koji se sastoji od ekstracelularnog regiona DLL3 miša (33-490 u sekvenci aminokiseline od SEK ID BR: 2) i sekvenci konstantnog regiona mišjeg IgG2a antitela je pripremljena i klonirana u ekspresione vektore pMCN za sisare. Ćelijska linija DG44 je transformisana pomoću DLL3-Fc ekspresionog vektora miša. Ćelije otporne na lekove su odabrane u prisustvu Geneticina.
Klonovi koji izrazito izražavaju mišji DLL3-Fc protein su odabrani pomoću analize ELISA, korišćenjem antitela protiv miša za uspostavljanje DG44 ćelija koje proizvode DLL3-Fc miša.
[0211] Svaki protein od interesa je prečišćen iz supernatanta kulture ćelijske linije koja proizvodi Fc fuzioni protein, pomoću afinitetne hromatografije na koloni proteina G i gel filtracione hromatografije. Koncentracija prečišćenog proteina je određena DC proteinskim testom (Bio-Rad Laboratories, Inc.) sa IgG-om poznate koncentracije kao standardom.
[Primer 3] Dobijanje anti-DLL3 antitela i analiza epitopa i internalizacije antitelom
[0212] Miševi starosti šest do sedam nedelja Balb/c (Charles River Laboratories Japan, Inc.) i MRL/MpJJmsSlc-lpr/lpr (Japan SLC, Inc.) su imunizovani. Za početno izazivanje, pripremljeni u emulziji, korišćenjem Freundovog kompletnog adjuvansa (Becton, Dickinson and Company), antigenski proteini su primenjeni na miševima subkutano, u dozi od 0,1 mg humanog DLL3-Fc/glavi. Dve nedelje kasnije, antigenska emulzija, pripremljena pomoću Freundovog nepotpunog adjuvansa je primenjena subkutano na miševima, u dozi od 0,05 mg/ glavi, ukupno 3 do 6 puta jednom nedeljno.0,05 mg antigenskih proteina je intravenozno primenjeno svakom mišu pojedinačno koji je potvrdio da ima povećanje titra antitela u svom serumu. Tri dana kasnije, njihove ćelije slezine su ekstrahovane i pomešane sa ćelijama mijeloma miša P3-X63Ag8U1 (ATCC), pri odnosu broja ćelija od približno 3: 1. Ove ćelije su spojene metodom polietilenglikola (PEG). Nakon uklanjanja PEG-a centrifugiranjem, ćelije su suspendovane u medijumu RPMI1640 koji sadrži 1 x HAT dodatak medijumu (Sigma-Aldrich Corp.), 0,5 x BM-Condimed H1 Hibridoma dodatak za kloniranje (Roche Diagnostics GmbH) i 10% fetalnog goveđeg seruma za podešavanje koncentracije ćelija. Zatim, ćelije su zasejane u svaki bazenčić ploče sa 96 bazenčića. Potvrdjena je formacija kolonije hibridoma i prisustvo ili odsustvo anti-DLL3 antitela sadržanih u supernatantu kulture je zatim analizirano pomoću ELISA, korišćenjem ploče obložene sa humanim DLL3-Fc. Ćelije hibridoma sadržane u pozitivnim bazenčićima su klonirane metodom ograničavajućeg razblaživanja kako bi se uspostavile linije hibridoma koje proizvode anti-DLL3 antitela. Monoklonska antitela su izotipovana korišćenjem IsoStrip (Roche Diagnostics GmbH).
[0213] Svako IgG monoklonsko antitelo je prečišćeno iz kultura supernatanata od utvrđenih hibridoma pomoću protein G afinitetne hromatografije na koloni i tretamana desalinizacije. Koncentracija prečišćenog antitela je određena pomoću DC proteinskog testa.
[0214] Humani DLL3-Fc, mišji DLL3-Fc, humani DLL3delta1-Fc i humani DLL3delta2-Fc su posebno imobilizovani na Nunc imunoploču (439454). Nakon toga, površina ploče koja nije reagovala je blokirana sa rastvorom koji sadrži goveđi serumski albumin. Nakon ispiranja, svaki razblaženi rastvor antitela podešen na odgovarajuću koncentraciju je dodat na ploču i inkubiran na sobnoj temperaturi 1 sat. Reakcioni rastvor je uklonjen sa ploče. Nakon ispiranja sa TBS-om koji sadrži Tween 20, na ploču su dodata anti-mišja IgK antitela obeležena alkalnom fosfatazom i inkubirana tokom 1 sata. Nakon ispiranja ploče, dodat je supstrat alkalne fosfataze Sigma 104 i inkubiran na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, apsorbancija je izmerena na talasnoj dužini od 405 nm i referentnoj talasnoj dužini od 655 nm. Rezultati su prikazani na slici 2. Sva prečišćena antitela su vezana za humani DLL3-Fc na način koji je dozno zavisan. Monoklonska antitela DL301, DL302, DL306 i DL312 i komercijalno dostupna antitela MAB4315 vezana za mišji DLL3-Fc. Komercijalno dostupno antitelo MAB4315 vezano za humani DLL3delta1-Fc, ali nije vezano za humani DLL3delta2-Fc, pokazujući da se njegov epitop nalazi u domenu DSL. DL303, DL304, DL307 i DL311 antitela koja nisu vezana ni za humani DLL3delta1-Fc niti za humani DLL3delta2-Fc. Stoga su predviđeni epitopi za ova antitela locirani između ostataka 27 i 175 u aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 1. DL301, DL302, DL305, DL306, DL308, DL309 i DL312 vezana za oba, humani DLL3delta1-Fc i humani DLL3delta2-Fc, koja pokazuju da su epitopi za ova antitela locirani u ostacima 216-492 u aminokiselinskoj sekvenci SEK ID BR: 1. Shematska struktura DLL3 proteina u punoj dužini i rastvorljivog DLL3-Fc fuzionog proteina i mesta prepoznata od strane svakog antitela protiv DLL3 su prikazane na slici 9.
[0215] Vezivanje svakog monoklonskog antitela za humani DLL3, eksprimiran na ćelijskoj membrani i ponašanje kompleksa humanog DLL3-monoklonskog antitela na ćelijskoj membrani je analizirano protočnom citometrijom. Humane DLL3/BaF3 ćelije su suspendovane u FACS puferu (PBS koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma i 0,05% natrijum azida). Ćelijska suspenzija od 1 x 10<6>ćelija/ml je reagovala sa monoklonskim antitelom (konačna koncentracija: 5 μg/ml) na 4 ° C tokom 30 minuta. Nakon centrifugiranja i uklanjanja supernatanta, ćelije su jedanput isprane sa FACS puferom. Dodata su FITC-obeležena anti-mišja IgG (H L) antitela (Beckman Coulter, Inc.) i inkubirana na 4 ° C tokom 30 minuta. Neizreagovana FITC antitela su uklonjena centrifugiranjem. Zatim su ćelije resuspendovane i analizirane korišćenjem protočnog citometra FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). U svrhu analize kretanja ili nestanka kompleksa DLL3-antitela iz ćelijske membrane, humane DLL3/BaF3 ćelije su suspendovane u medijumu za kulturu RPMI1640 koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i mišji IL3. Ćelijska suspenzija od 1 x 10<6>ćelija/ml je izmešana sa monoklonskim antitelom (konačna koncentracija: 5 μg/ ml) i reagovala je na 37 ° C, tokom 1 sata ili 4 sata u CO2 inkubatoru. Nakon reakcije, količina vezanog antitela za ćelijsku membranu je analizirana protočnom citometrijom, na isti način, kao i gore. Geometrijska sredina vrednosti intenziteta fluorescencije (X Geo Mean) na dijagramu ćelijskog histograma je određena korišćenjem analitičkog softvera CELLQuest Pro koji je uključen u FACSCalibur. Sva izolovana anti-DLL3 monoklonska antitela vezana za DLL3 na ćelijama (Slika 3 (a)). Reakcija antitela sa ćelijama na 4 ° C inhibira fluidnost membrane, kao što je ćelijsko preuzimanje kompleksa DLL3-antitela iz ćelijske membrane. Reakcija antitela sa ćelijama na 37 ° C ,može prouzrokovati ćelijsko preuzimanje kompleksa DLL3-antitela i zatamnjenje (oslobađanje od ćelijske membrane) koje rezultira digestijom proteaze ili slično. Količina svakog monoklonskog antitela vezanog za ćelijsku membranu kao rezultat inkubacije na 37 ° C tokom 1 sata ili 4 sata je prikazana na slici 3 (b) kao relativna vrednost u poređenju sa onom na 4 ° C. Kao rezultat inkubacije na 37 ° C, smanjena je količina antitela DL303, DL304, DL305, DL308, DL309 ili MAB4315 na površini ćelijske membrane. Ovi rezultati ukazuju na internalizaciju ili senčenje kompleksa DLL3-antitela. Nasuprot tome, kao rezultat inkubacije na 37 ° C, količina antitela DL301, DL306, DL307, DL311 ili DL312 na površini ćelijske membrane je teško izmenjena ili je povećana, naprotiv. Poslednje, prikazuje da su ova antitela sposobna da se stalno nalaze u obliku kompleksa DLL3 na ćelijskoj membrani.
[0216] Broj DLL3 proteina na ćelijskoj površini je određen korišćenjem QIFIKIT-a (DAKO, F0479) za kvantitativno određivanje ćelijskog površinskog antigena ćelije, pomoću protočne citometrije. Analiza je sprovedena sa anti-DLL3 antitelom DL303 (konačna koncentracija: 5 μg/ml) kao primarnim antitelom, prema protokolu koji je u njemu uključen. Brojevi antigena na površinama humanih ćelija DLL3/BaF3, NCI-H1184 (ATCC), NCI-H1436 (ATCC) i Y79 (Riken Cell Bank) su bili približno 9000, 7000, 6000 i 3000, respektivno.
[Primer 4] Indukcija ADCC aktivnosti pomoću anti-DLL3 antitela i inhibicija rasta posredovane kompleksom antitela-toksina
[0217] Svako anti-DLL3 antitelo je ispitivano za njegovu ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC)-indukukujuću aktivnost protiv ćelija koje eksprimiraju DLL3 obeleženih sa kalceinom. Humane DLL3/BaF3 i ćelijske linije sitnoćelijskog karcinoma pluća NCI-H1184 (ATCC) koje eksprimiraju DLL3 su odvojeno kultivisane tokom 90 minuta u prisustvu 20 μg/ml Kalcein-AM (Dojindo, 349-07201), zatim centrifugirane i isprane kako bi se pripremile ciljne ćelije obeležene sa kalceinom. Ciljne ćelije su zasejane pri 1 x 10<4>ćelija/ bazenčiću na ploču sa 96 bazenčića (Coster 3799). Zatim je na ploču dodato antitelo podešeno na odgovarajuću finalnu koncentraciju i inkubirano na sobnoj temperaturi 15 minuta.
Efektorske ćelije su dodate pri 5 x 10<4>ćelija/bazenčiću. Reakciona ploča je inkubirana na 37 ° C u inkubatoru CO2. Korišćene efektorske ćelije su bile NK92 ćelije koje eksprimiraju mišji FcγR3-humani FcγR3 himerni molekul (WO 2008/093688). Nakon inkubacije od 4 sata, ploča je centrifugirana, i 100 μl supernatanta kulture je sakupljeno iz svakog bazenčića. Intenzitet fluorescencije je meren korišćenjem ARVO SX (Wallac).
[0218] Aktivnost koja indukuje ADCC je izračunata prema sledećoj formuli:
ADCC [%] = (A - C) / (B - C) × 100,
pri čemu A predstavlja intenzitet fluorescencije u svakom bazenčiću; B predstavlja sredinu intenziteta fluorescencije u supernatantu ćelija liziranih sa Nonidet P-40 sa konačnom koncentracijom od 1%; i C predstavlja sredinu intenziteta fluorescencije u bazenčiću dopunjenom samo sa medijumom. Srednja i standardna devijacija su izračunate iz tri merenja pod svakim eksperimentalnim uslovom. Na slici 4 je prikazana aktivnost antitela koje indukuje ADCC, dodato u konačnoj koncentraciji od 2,5 μg/ml prema DLL3/BaF3 ćelijama. Nije potvrđena aktivnost ADCC kontrolnih antitela IgG1 i IgG2b, dok je aktivnost indukovanja ADCC-a potvrđena u DL301, DL306 i DSL312. Nije bila potvrđena posebna aktivnost koja indukuje ADCC u komercijalno dostupnom monoklonskom antitelu MAB4315. Slika 5 pokazuje da DL301, DL306 i D312 antitela indukuju ADCC protiv DLL3/BaF3 i NCI-H1184, načinom koji je dozno zavisan.
[0219] Svako anti-DLL3 monoklonsko antitelo je ocenjeno za njegovo ćelijsko preuzimanje korišćenjem anti-mišjeg sekundarnog antitela Mab-ZAP (Advanced Targeting Systems) obeleženog sa toksinom. DLL3/BaF3 ćelije su zasejane pri 5 x 10<3>ćelija/bazenčiću na ploči sa 96 bazenčića. Kasnije su na ovo dodati anti-DLL3 mišje monoklonsko antitelo i Mab-ZAP (konačna koncentracija: 1 μg/ml) i inkubirani na 37 ° C u inkubatoru CO2. Četiri dana kasnije, njima je dodat reagens Cell Count Reagent SF (Nacalai Tesque, Inc.). Apsorbancija je merena na 450 nm i pri kontrolnoj talasnoj dužini od 620 nm korišćenjem čitača mikroploče za određivanje rasta ćelija (Slika 6). Dodavanje anti-DLL3 monoklonskog antitela i Mab-ZAP ćelijama je inhibiralo rast ćelija. DL301, DL306 i DL312 antitela su potvrdila da imaju aktivnost koja indukuje ADCC, ostajući u velikim količinama na ćelijama koje eksprimiraju DLL3 nakon što su izmešana sa ćelijama i kultivisana na 37 ° C, a pokazala su inhibitorni efekat slabog rasta donet pomoću ćelijskog preuzimanja kompleksa Mab-ZAP.
[Primer 5] Kloniranje varijabilnog regiona antitela i priprema rekombinantnog antitela
[0220] Pametna cDNK biblioteka 5'-RACE (Clontech Laboratories, Inc.) je pripremljena iz ukupnih RNK hibridoma koji proizvode svako anti-DLL3 antitelo. Ukupan RNK preparat je izveden korišćenjem kolone RNeasy Mini kolone (Qiagen). Priprema biblioteke cDNK je pratila uputstva proizvođača. Sekvence koje kodiraju varijabilne regione antitela (VH i VL) su amplifikovane pomoću PCR-a, korišćenjem prajmera komplementarnih sekvencama koje kodiraju konstantne regione antitela. Tako umnoženi fragmenti pomoću PCR-a su klonirani u pCR2.1TOPO i sekvencirani. Konstruisani su ekspresioni vektori himernog antitela koji sadrže dobijene sekvence koje kodiraju VH i VL i sekvence koje kodiraju konstantan region humanog IgG1. Sekvence koje kodiraju laki lanac i teški lanac su obe inkorporirane u jedan ekspresioni vektor za ćelije sisara i transkribovane pod kontrolom CMV promotera miša. Tabela 1 prikazuje SEK ID BR-a identifikovanih sekvenci varijabilnog regiona antitela i njihovih CDR sekvenci, sekvence antitela miša pune dužine i sekvence himernih antitela.
[0221] COS-7 ćelije su transfektovane sa svakim ekspresionim vektorom himernog antitela i dozvoljeno im je da kratkotrajno eksprimiraju himerno antitelo. Himerno antitelo u supernatantu kulture od COS-7 je potvrđeno da se vezuje za humani DLL3 protein pomoću protočne citometrije i analize ELISA. Koncentracija himernog antitela u supernatantu kulture od COS-7 je izračunata pomoću metode sendvič ELISA. U ovom izračunavanju koncentracije, humano himerno antitelo poznato po svojoj koncentraciji je korišćeno kao standard. Himerno antitelo (konačna koncentracija: 1 μg/ml) je dodato u humane DLL3/BaF3 ćelije suspendovane u FACS puferu (PBS koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma). Nakon inkubacije na 4 ° C tokom 30 minuta i ispiranja, ćelije su reagovale sa anti-humanim antitelima obeleženim sa FITC (Beckman Coulter, Inc.), a vezivanje himernog antitela je analizirano korišćenjem protočnog citometra FACSCalibur. Kao što je prikazano na slici 7, himerna antitela DL301, DL309 i DL312 su vezana za humane DLL3/BaF3. Nijedno od himernih antitela nije bilo vezano za ćelije Ba/F3, koje su bile roditeljska linija prisilnih ekspresionih ćelija. Humani DLL3-Fc je imobilizovan na imunoploču Nunca, a analizirano je vezivanje svakog himernog antitela za imobilizovani protein. Za detekciju antigen-vezanih himernih antitela njima je dodato je himerno antitelo, a zatim su ovim redom dodata anti-humana antitela označena alkalnom fosfatazom (Biosource, AHI0305) i supstrat alkalne fosfataze Sigma 104. Određena je apsorbanca. DL301, DL309 i DL312 himerna antitela su vezana za humani DLL3-Fc na način koji je dozno zavisan (slika 8 (a)).
[Primer 6] Grupisanje epitopa kompetitivnom metodom ELISA
[0222] Takmičenje himernog antitela i mišjeg antitela za vezivanje za molekul antigena je analizirano pomoću metode ELISA (slika 8 (b)). Humani DLL3-Fc je dodat pri 10 ng/bazenčiću na Nunc imunoploču i imobilizovan na njoj. Mešavina (konačna koncentracija: 50 ng/ml) himernog antitela i adekvatno razblaženog mišjeg antitela je dodata na ploču imobilizovanu sa DLL3-Fc proteinom. Ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 1 sat, a zatim isprana. Na ploču su dodata anti-humana antitela obeležena alkalnom fosfatazom i inkubirana. Nakon inkubacije, na ploču je dodat Sigma 104 i izmerena je apsorbanca. Vezivanje himernog antitela za molekul antigena se takmičilo sa onim od originalnog monoklonskog antitela miša. Antitela različita od antitela miša DL301 nisu inhibirala vezivanje himernog antitela DL301 za antigen. Antitela različita od antitela DL312 miša nisu inhibirala vezivanje DL312 himernog antitela za antigen. Ovi rezultati pokazuju da su DL301 i DL312 vezani za njihove jedinstvene epitope. DL305, DL308 i DL309 antitela miša su inhibirala vezivanje DL309 himernog antitela za antigen pri skoro istom nivou, što ukazuje na to da je epitop bio isti između ova 3 antitela. Potvrđeno je da antitelo miša DL306 ima aktivnost koja indukuje ADCC, nije inhibiralo vezivanje himernog antitela DL301, DL309 ili DL312 za antigen. Ovi rezultati pokazuju da DL306 prepoznaje epitop nezavisno od toga za DL301, DL309 ili DL312.
[Primer 7] Uspostavljanje ćelijske linije koja izražava rekombinantno anti-DLL3 antitelo i prečišćavanje rekombinantnog antitela
[0223] COS-7 ćelije su transfektovane sa DL306 ekspresionim vektorom himernog antitela i dozvoljeno je da privremeno eksprimiraju himerno antitelo. Himerno antitelo u supernatantu kulture od COS-7 je potvrđeno da se vezuje za humani DLL3 protein protočnom citometrijom. Koncentracija himernog antitela u supernatantu COS-7 kulture je izračunata pomoću sendvič ELISA. U ovom izračunavanju koncentracije, humano himerno antitelo poznato po svojoj koncentraciji je korišćeno kao standard. Himerno antitelo (konačna koncentracija: 1 μg/ml) je dodato u humane DLL3/BaF3 ćelije suspendovane u FACS puferu (PBS koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma). Nakon inkubacije na 4 ° C tokom 30 minuta i ispiranja, ćelije su reagovale sa anti-humanim antitelima obeleženim sa FITC (Beckman Coulter, Inc.), a vezivanje himernog antitela je analizirano korišćenjem protočnog citometra FACSCalibur. Kao što je prikazano na Slici 10, himerno antitelo DL306 je vezano za humane DLL3/BaF3 i nije se vezalo za Ba/F3 ćelije, koje su bile roditeljska linija.
[0224] Ćelijska linija DG44 je transformisana sa ekspresionim vektorom humanog himernog antitela DL301, DL306, DL309 ili DL312. Ćelije otporne na lekove su odabrane u prisustvu Geneticina. Klonovi koji visoko izražavaju humano himerno antitelo su odabrani pomoću metode ELISA korišćenjem anti-humanih antitela za uspostavljanje DG44 ćelija koje proizvode humana himerna antitela.
[0225] Svaki protein od interesa je prečišćen iz supernatanta kulture ćelijske linije koja proizvodi humano himerno antitelo pomoću rProtein A afinitetne hromatografije na koloni i gel filtracione hromatografije. Koncentracija prečišćenog proteina je određena DC proteinskim testom (Bio-Rad Laboratories, Inc.) sa IgG-om poznate koncentracije kao standardom.
[0226] Konstruisani su ekspresioni vektor mišjeg IgG2a antitela koji sadrži sekvence koje kodiraju VH i VL DL301, DL306 ili DL312 i sekvence koje kodiraju konstantan region mišjeg IgG2a. Sekvence koje kodiraju laki lanac i teški lanac su obe inkorporirane u jedan ekspresioni vektor za ćelije sisara i transkribovane pod kontrolom mišjeg CMV promotera. Ćelijska linija CHO deficijentna u fukoznom transporteru (WO2005/017155) je transformisana sa ekspresionim vektorom mišjeg IgG2a antitela. Ćelije otporne na lekove su odabrane u prisustvu Geneticina. Klonovi koji su izrazito izražavali mišje IgG2a antitelo su odabrani pomoću metode ELISA, korišćenjem anti-mišjih IgG2a antitela da bi se uspostavile CHO ćelije koje proizvode mišja IgG2a antitela sa niskim sadržajem fukoze. Svaki protein od interesa je prečišćen iz supernatanta kulture ćelijske linije za proizvodnju antitela IgG2a miša deficijentna u fukozi, pomoću afinitetne hromatografije na koloni proteina G i gel filtracione hromatografije. Koncentracija prečišćenog proteina je određena testom DC proteina sa IgG-om poznate koncentracije kao standardom.
[Tabela 2]
[Primer 8] Indukcija ADCC aktivnosti pomoću rekombinantnog anti-DLL3 antitela
[0227] Humana himerna i mišja IgG2a rekombinantna anti-DLL3 antitela su ispitivana za njihovu ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), indukujući aktivnosti protiv DLL3-izražavajućih ćelija obeleženih sa kalceinom. Humane DLL3/BaF3 i ćelijske linije sitnoćelijskog karcinoma pluća NCI-H1184 (ATCC) koje eksprimiraju DLL3 su odvojeno kultivisane tokom 90 minuta u prisustvu 20 μg/ml Kalcein-AM (Dojindo, 349-07201), zatim centrifugirane i isprane kako bi se pripremile ciljne ćelije obeležene sa kalceinom. Ciljne ćelije su zasejane pri 1 x 10<4>ćelija/bazenčiću na ploču sa 96 bazenčića (Coster 3799). Zatim je na ovo dodato antitelo podešeno na odgovarajuću konačnu koncentraciju i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. Efektorske ćelije su dodate na ploču, pri količini od 5 x 10<4>ćelija/bazenčiću. Reakciona ploča je inkubirana na 37 ° C u inkubatoru CO2. Efektorske ćelije korišćene za rekombinantno mišje IgG2a antitelo sa niskim sadržajem fukoze su bile NK92 ćelije koje eksprimiraju mišji FcγR4-humani FcγR3 himerni molekul (WO 2008/093688). Efektorske ćelije korišćene za humano himerno rekombinantno antitelo su bile NK92 ćelije koje eksprimiraju humani FcγR3 molekul. Nakon 4-časovne inkubacije, ploča je centrifugirana i sakupljeno je 100 μl supernatanta kulture iz svakog bazenčića. Intenzitet fluorescencije je meren korišćenjem ARVO SX. Aktivnost koja indukuje ADCC je izračunata pomoću metode opisane u Primeru 4.
[0228] Slika 11 pokazuje da rekombinantna humana himerna antitela DL301, DL306, DL309 i D312 indukuju ADCC protiv DLL3/BaF3 i NCI-H1184 na način koji je dozno zavisan. [0229] Slika 12 pokazuje da rekombinantna mišja nisko-fukozna IgG2a antitela DL301, DL306 i D312 indukuju ADCC protiv DLL3/BaF3 i NCI-H1184 na način koji je dozno zavisan.
LISTING SEKVENCI
[0230]
Claims (7)
1. Farmaceutski preparat, koji sadrži antitelo koje se vezuje za DLL3 protein, kao aktivni sastojak, gde antitelo ima citotoksičnu aktivnost.
2. Farmaceutski preparat prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, da je citotoksična aktivnost ćelijski posredovana citotoksična aktivnost zavisna od antitela (ADCC aktivnost).
3. Farmaceutski preparat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, naznačen time, da antitelo ima aktivnost internalizacije.
4. Farmaceutski preparat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time, da je antitelo konjugovano sa citotoksičnom supstancom.
5. Farmaceutski preparat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time, da antitelo prepoznaje region od aminokiselina 216 do 492 u humanom DLL3 koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 1.
6. Farmaceutski preparat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time, da je antitelo odabrano od antitela koja se vezuju za DLL3 protein, opisana u bilo kojim od sledećih:
(1) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 12, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 13 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 14 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 18, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 19 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 20;
(2) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 24, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 25 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 26 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 30, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 31 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 32;
(3) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 36, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 37 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 42, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 43 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 44;
(4) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 48, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 49 i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 50 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 54, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 55 i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedeno u SEK ID BR: 56; i
(5) antitelo koje se vezuje za isti epitop kao onaj u DLL3 proteinu za koji se vezuje bilo koje od antitela (1) do (4) .
7. Farmaceutski preparat prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, za upotrebu u postupku lečenja raka, naznačen time, da antikancerogeni agens cilja rak pluća.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010019391 | 2010-01-29 | ||
| PCT/JP2011/000485 WO2011093097A1 (ja) | 2010-01-29 | 2011-01-28 | 抗dll3抗体 |
| EP11736812.6A EP2530091B1 (en) | 2010-01-29 | 2011-01-28 | Anti-dll3 antibody |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RS57412B1 true RS57412B1 (sr) | 2018-09-28 |
Family
ID=44319091
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RS20180696A RS57412B1 (sr) | 2010-01-29 | 2011-01-28 | Anti-dll3 antitelo |
| RS20211159A RS62387B1 (sr) | 2010-01-29 | 2011-01-28 | Anti-dll3 antitelo |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RS20211159A RS62387B1 (sr) | 2010-01-29 | 2011-01-28 | Anti-dll3 antitelo |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US9127071B2 (sr) |
| EP (3) | EP3342786B1 (sr) |
| JP (1) | JP5918540B2 (sr) |
| DK (2) | DK2530091T3 (sr) |
| ES (2) | ES2889932T3 (sr) |
| HR (2) | HRP20211444T1 (sr) |
| HU (2) | HUE038962T2 (sr) |
| LT (2) | LT2530091T (sr) |
| PL (2) | PL3342786T3 (sr) |
| PT (2) | PT2530091T (sr) |
| RS (2) | RS57412B1 (sr) |
| SI (2) | SI2530091T1 (sr) |
| TR (1) | TR201806936T4 (sr) |
| WO (1) | WO2011093097A1 (sr) |
Families Citing this family (66)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10611835B2 (en) * | 2008-07-10 | 2020-04-07 | Toray Industries, Inc. | Pharmaceutical composition for treatment and prevention of cancer |
| RS57412B1 (sr) | 2010-01-29 | 2018-09-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-dll3 antitelo |
| EP3093294A1 (en) | 2012-02-24 | 2016-11-16 | Stemcentrx, Inc. | Dll3 modulators and methods of use |
| EP2832856A4 (en) * | 2012-03-29 | 2016-01-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | ANTI-LAMP5 ANTIBODIES AND USE THEREOF |
| GB201302447D0 (en) * | 2013-02-12 | 2013-03-27 | Oxford Biotherapeutics Ltd | Therapeutic and diagnostic target |
| SMT201900339T1 (it) * | 2013-02-22 | 2019-07-11 | Medimmune Ltd | Coniugati anticorpo anti-dll3/pbd e loro usi |
| CN105189552B (zh) | 2013-03-14 | 2019-08-02 | 基因泰克公司 | 抗b7-h4抗体和免疫缀合物 |
| US9562099B2 (en) * | 2013-03-14 | 2017-02-07 | Genentech, Inc. | Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates |
| JP6824735B2 (ja) * | 2013-06-06 | 2021-02-03 | ピエール、ファーブル、メディカマン | 抗Ｃ１０ｏｒｆ５４抗体およびその使用方法 |
| CA2922529A1 (en) | 2013-08-28 | 2015-03-05 | Stemcentrx, Inc. | Novel sez6 modulators and methods of use |
| CN105873612A (zh) * | 2013-08-28 | 2016-08-17 | 施特姆森特克斯股份有限公司 | 改造的抗-dll3缀合物以及应用方法 |
| WO2015031698A1 (en) * | 2013-08-28 | 2015-03-05 | Stem Centrx, Inc. | Site-specific antibody conjugation methods and compositions |
| WO2015038884A2 (en) | 2013-09-13 | 2015-03-19 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for detecting and quantifying host cell protein in cell lines and recombinant polypeptide products |
| IL320195A (en) | 2013-09-13 | 2025-06-01 | Genentech Inc | Methods and compositions containing purified recombinant polypeptides |
| CN113307873B (zh) | 2013-11-11 | 2025-02-18 | 中外制药株式会社 | 含有改变了抗体可变区的抗原结合分子 |
| KR20170008202A (ko) * | 2014-02-21 | 2017-01-23 | 애브비 스템센트알엑스 엘엘씨 | 흑색종에 사용하기 위한 항-ｄｌｌ3 항체 및 약물 접합체 |
| WO2016014595A2 (en) * | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Bloodworks | Antibodies that recognize red blood cell antigens |
| US11661462B2 (en) | 2014-07-31 | 2023-05-30 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Optimized cross-species specific bispecific single chain antibody contructs |
| CN113698485A (zh) | 2014-09-12 | 2021-11-26 | 基因泰克公司 | 抗-b7-h4抗体及免疫缀合物 |
| TWI831044B (zh) | 2014-11-11 | 2024-02-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 抗原結合分子、包含抗原結合分子的醫藥組合物以及製造及選擇抗原結合分子之方法 |
| MA41613A (fr) * | 2015-02-23 | 2018-01-02 | Abbvie Stemcentrx Llc | Récepteurs antigéniques chimériques anti-dll3 et procédés d'utilisation desdits récepteurs |
| AU2016263808B2 (en) | 2015-05-21 | 2019-01-03 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Trispecific binding proteins and methods of use |
| TW202346349A (zh) | 2015-07-31 | 2023-12-01 | 德商安美基研究（慕尼黑）公司 | Dll3及cd3抗體構築體 |
| KR102530742B1 (ko) | 2016-05-20 | 2023-05-09 | 하푼 테라퓨틱스, 인크. | 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질 |
| ES2776926T3 (es) | 2017-03-29 | 2020-08-03 | Shionogi & Co | Composición medicinal para tratamiento del cáncer |
| KR20260014702A (ko) | 2017-09-07 | 2026-01-30 | 오거스타 유니버시티 리서치 인스티튜트, 인크. | 프로그래밍된 세포사 단백질 1에 대한 항체 |
| CR20200196A (es) | 2017-10-13 | 2020-06-05 | Harpoon Therapeutics Inc | Proteínas trispecìficas y mètodos de uso |
| IL315737A (en) | 2017-10-13 | 2024-11-01 | Harpoon Therapeutics Inc | B-cell maturation antigen-binding proteins |
| US11952422B2 (en) | 2017-12-05 | 2024-04-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137 |
| EP3732195A4 (en) | 2017-12-28 | 2022-02-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | CYTOTOXICITY-INDUCING THERAPEUTIC |
| US12247060B2 (en) | 2018-01-09 | 2025-03-11 | Marengo Therapeutics, Inc. | Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases |
| US12037391B2 (en) | 2018-05-08 | 2024-07-16 | Phanes Therapeutics, Inc. | Anti-DLL3 antibodies and uses thereof |
| SG11202011330PA (en) | 2018-05-14 | 2020-12-30 | Harpoon Therapeutics Inc | Binding moiety for conditional activation of immunoglobulin molecules |
| TWI848953B (zh) | 2018-06-09 | 2024-07-21 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 針對癌症治療之多特異性結合蛋白 |
| AU2019297451A1 (en) | 2018-07-03 | 2021-01-28 | Marengo Therapeutics, Inc. | Anti-TCR antibody molecules and uses thereof |
| CN113286824A (zh) | 2018-08-03 | 2021-08-20 | 中外制药株式会社 | 包含两个彼此连接的抗原结合结构域的抗原结合分子 |
| US12195544B2 (en) | 2018-09-21 | 2025-01-14 | Harpoon Therapeutics, Inc. | EGFR binding proteins and methods of use |
| WO2020069028A1 (en) * | 2018-09-25 | 2020-04-02 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Dll3 binding proteins and methods of use |
| AU2019347408A1 (en) | 2018-09-28 | 2021-04-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region |
| SG11202109061YA (en) | 2019-02-21 | 2021-09-29 | Marengo Therapeutics Inc | Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof |
| AU2020224681A1 (en) | 2019-02-21 | 2021-09-16 | Marengo Therapeutics, Inc. | Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof |
| SG11202108759SA (en) * | 2019-04-08 | 2021-10-28 | Phanes Therapeutics Inc | Humanized anti-dll3 chimeric antigen receptors and uses thereof |
| CN114245806A (zh) | 2019-05-14 | 2022-03-25 | 哈普恩治疗公司 | EpCAM结合蛋白及使用方法 |
| CA3146566A1 (en) | 2019-07-11 | 2021-01-14 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Dll3-targeting antibodies and uses thereof |
| US20220281998A1 (en) | 2019-08-28 | 2022-09-08 | Azusapharma Sciences, Inc. | Bifidobacterium spp. expressing and secreting diabody-type bsab |
| EP4084823A4 (en) | 2020-01-03 | 2024-05-15 | Marengo Therapeutics, Inc. | ANTI-TCR ANTIBODY MOLECULES AND THEIR USES |
| AU2021250381A1 (en) | 2020-03-31 | 2022-10-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing multispecific antigen-binding molecules |
| WO2021200898A1 (en) | 2020-03-31 | 2021-10-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Dll3-targeting multispecific antigen-binding molecules and uses thereof |
| EP4217389A4 (en) * | 2020-09-28 | 2025-03-19 | Angitia Incorporated Limited | ANTI-SCLEROSTIN CONSTRUCTS AND USES THEREOF |
| KR20230104233A (ko) * | 2020-11-06 | 2023-07-07 | 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 소세포 폐암의 분류 및 치료를 위한 방법 및 시스템 |
| US20240115720A1 (en) | 2021-01-13 | 2024-04-11 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate |
| EP4277665A1 (en) | 2021-01-13 | 2023-11-22 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Anti-dll3 antibody-drug conjugate |
| CN118159558A (zh) * | 2021-09-02 | 2024-06-07 | 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 | 抗dll3抗体和其用途 |
| WO2023041041A1 (en) * | 2021-09-17 | 2023-03-23 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. | D3-binding molecules and uses thereof |
| WO2023053272A1 (en) | 2021-09-29 | 2023-04-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Uses of dll3-targeting multispecific antigen-binding molecules |
| JP2024542488A (ja) * | 2021-11-18 | 2024-11-15 | サルバアールエックス エルエルシー | 終末糖化産物受容体（ｒａｇｅ）に対する抗体及びその使用 |
| WO2023147470A2 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Georgiamune Inc. | Antibodies to programmed cell death protein 1 that are pd-1 agonists |
| WO2024012523A1 (zh) * | 2022-07-14 | 2024-01-18 | 苏州宜联生物医药有限公司 | 抗体药物偶联物及其制备方法和用途 |
| TW202423979A (zh) | 2022-08-22 | 2024-06-16 | 美商雅博得樂醫療公司 | Dll3結合分子及其用途 |
| IL320881A (en) | 2022-11-25 | 2025-07-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for producing protein |
| CN116813784B (zh) * | 2023-05-17 | 2024-03-01 | 星奕昂(上海)生物科技有限公司 | 靶向dll3的抗体及其应用 |
| WO2025036352A1 (zh) * | 2023-08-14 | 2025-02-20 | 海南先声再明医药股份有限公司 | 特异性识别Delta样配体3的纳米抗体及其应用 |
| TW202530259A (zh) * | 2023-09-21 | 2025-08-01 | 大陸商樂普創一生物科技（上海）有限公司 | 抗ｄｌｌ３抗體及其用途 |
| WO2025085761A1 (en) * | 2023-10-19 | 2025-04-24 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Dll3 targeting trispecific proteins and methods of use |
| WO2025106600A2 (en) * | 2023-11-15 | 2025-05-22 | Systimmune, Inc. | Anti-dll3 antibody and method of making and using thereof |
| CN119708238B (zh) * | 2025-02-27 | 2025-07-04 | 昕传生物科技(北京)有限公司 | 靶向dll3的抗体、嵌合抗原受体及其应用 |
Family Cites Families (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| JPS6459878A (en) | 1987-08-31 | 1989-03-07 | Matsushita Electric Industrial Co Ltd | Semiconductor laser protective circuit |
| DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
| DE69127627T2 (de) | 1990-08-29 | 1998-02-19 | Genpharm Int | Produktion und Nützung nicht-menschliche transgentiere zur Produktion heterologe Antikörper |
| WO1993011161A1 (en) | 1991-11-25 | 1993-06-10 | Enzon, Inc. | Multivalent antigen-binding proteins |
| CA2124967C (en) | 1991-12-17 | 2008-04-08 | Nils Lonberg | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| EP0652950B1 (en) | 1992-07-24 | 2007-12-19 | Amgen Fremont Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
| US5648267A (en) | 1992-11-13 | 1997-07-15 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same |
| EP0754225A4 (en) | 1993-04-26 | 2001-01-31 | Genpharm Int | HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS |
| HU221385B1 (en) | 1994-07-13 | 2002-09-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Reconstituted human antibody against human interleukin-8 |
| US20030180784A1 (en) | 1997-04-04 | 2003-09-25 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Novel human Delta3 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor |
| US20060122373A1 (en) | 1997-04-04 | 2006-06-08 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Delta3, FTHMA-070, Tango85, Tango77, SPOIL,NEOKINE, Tango129 and integrin alpha subunit protein and nucleic acid molecules and uses thereof |
| DE69836131T3 (de) | 1997-04-04 | 2017-06-14 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Neue menschliche delta3-zusammensetzung und deren therapeutische und diagnostische verwendungen |
| JP4139508B2 (ja) | 1998-02-19 | 2008-08-27 | 旭化成株式会社 | ヒトデルター３ |
| JP4332581B2 (ja) | 1998-02-19 | 2009-09-16 | 旭化成株式会社 | ヒトデルタ−３ |
| DK2180007T4 (da) | 1998-04-20 | 2017-11-27 | Roche Glycart Ag | Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet |
| JP2002540763A (ja) | 1999-02-10 | 2002-12-03 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド | ３３個のヒト分泌タンパク質 |
| DK1176195T3 (da) | 1999-04-09 | 2013-06-24 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle |
| JP2003507029A (ja) | 1999-08-19 | 2003-02-25 | カイロン コーポレイション | Ｎｏｔｃｈレセプターリガンドおよびその使用 |
| US6436703B1 (en) | 2000-03-31 | 2002-08-20 | Hyseq, Inc. | Nucleic acids and polypeptides |
| EP1309614A2 (en) | 2000-08-11 | 2003-05-14 | Eli Lilly And Company | Novel secreted proteins and their uses |
| EA013224B1 (ru) | 2000-10-06 | 2010-04-30 | Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. | Клетки, продуцирующие композиции антител |
| AU2002307037B2 (en) | 2001-04-02 | 2008-08-07 | Biogen Idec Inc. | Recombinant antibodies coexpressed with GnTIII |
| WO2003025138A2 (en) | 2001-09-17 | 2003-03-27 | Protein Design Labs, Inc. | Methods of diagnosis of cancer compositions and methods of screening for modulators of cancer |
| US20050137130A1 (en) | 2001-11-14 | 2005-06-23 | Bodmer Mark W. | Medical treatment |
| WO2003104453A1 (ja) | 2002-06-05 | 2003-12-18 | 中外製薬株式会社 | 抗体作製方法 |
| JP2006516089A (ja) * | 2002-10-02 | 2006-06-22 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法 |
| US20040115204A1 (en) * | 2002-12-11 | 2004-06-17 | Fanger Gary R. | Antibodies to treat cancer |
| US7863042B2 (en) | 2003-06-18 | 2011-01-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fucose transporter |
| US20050175619A1 (en) | 2004-02-05 | 2005-08-11 | Robert Duffy | Methods of producing antibody conjugates |
| JP2009523709A (ja) | 2005-12-16 | 2009-06-25 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 神経膠腫の診断、予後の予測及び治療の方法 |
| CA2637267A1 (en) * | 2006-01-16 | 2007-07-19 | Compugen Ltd. | Novel nucleotide and amino acid sequences, and methods of use thereof for diagnosis |
| WO2008047925A1 (en) | 2006-10-20 | 2008-04-24 | Forerunner Pharma Research Co., Ltd. | Pharmaceutical composition comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient |
| US8946385B2 (en) | 2007-01-30 | 2015-02-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Chimeric Fcγ receptor and method for determination of ADCC activity by using the receptor |
| CN102056945A (zh) * | 2008-04-07 | 2011-05-11 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 针对Notch途径的单可变结构域 |
| JP4787295B2 (ja) | 2008-07-14 | 2011-10-05 | 株式会社トープラ | 高強度セルフフォーミングねじによるねじ締結構造体 |
| RS57412B1 (sr) | 2010-01-29 | 2018-09-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-dll3 antitelo |
| EP3093294A1 (en) * | 2012-02-24 | 2016-11-16 | Stemcentrx, Inc. | Dll3 modulators and methods of use |
| KR20170008202A (ko) * | 2014-02-21 | 2017-01-23 | 애브비 스템센트알엑스 엘엘씨 | 흑색종에 사용하기 위한 항-ｄｌｌ3 항체 및 약물 접합체 |
| TW202346349A (zh) | 2015-07-31 | 2023-12-01 | 德商安美基研究（慕尼黑）公司 | Dll3及cd3抗體構築體 |
-
2011
- 2011-01-28 RS RS20180696A patent/RS57412B1/sr unknown
- 2011-01-28 JP JP2011551775A patent/JP5918540B2/ja active Active
- 2011-01-28 EP EP18156974.0A patent/EP3342786B1/en active Active
- 2011-01-28 DK DK11736812.6T patent/DK2530091T3/en active
- 2011-01-28 EP EP11736812.6A patent/EP2530091B1/en not_active Revoked
- 2011-01-28 LT LTEP11736812.6T patent/LT2530091T/lt unknown
- 2011-01-28 PL PL18156974T patent/PL3342786T3/pl unknown
- 2011-01-28 PT PT117368126T patent/PT2530091T/pt unknown
- 2011-01-28 PL PL11736812T patent/PL2530091T3/pl unknown
- 2011-01-28 WO PCT/JP2011/000485 patent/WO2011093097A1/ja not_active Ceased
- 2011-01-28 ES ES18156974T patent/ES2889932T3/es active Active
- 2011-01-28 HR HRP20211444TT patent/HRP20211444T1/hr unknown
- 2011-01-28 TR TR2018/06936T patent/TR201806936T4/tr unknown
- 2011-01-28 SI SI201131477T patent/SI2530091T1/en unknown
- 2011-01-28 PT PT181569740T patent/PT3342786T/pt unknown
- 2011-01-28 RS RS20211159A patent/RS62387B1/sr unknown
- 2011-01-28 HU HUE11736812A patent/HUE038962T2/hu unknown
- 2011-01-28 HU HUE18156974A patent/HUE056313T2/hu unknown
- 2011-01-28 EP EP21171265.8A patent/EP3907242A1/en active Pending
- 2011-01-28 SI SI201131999T patent/SI3342786T1/sl unknown
- 2011-01-28 HR HRP20180952TT patent/HRP20180952T1/hr unknown
- 2011-01-28 US US13/575,861 patent/US9127071B2/en active Active
- 2011-01-28 ES ES11736812.6T patent/ES2674420T3/es active Active
- 2011-01-28 LT LTEP18156974.0T patent/LT3342786T/lt unknown
- 2011-01-28 DK DK18156974.0T patent/DK3342786T3/da active
-
2015
- 2015-09-04 US US14/846,135 patent/US11111311B2/en active Active
-
2021
- 2021-08-19 US US17/406,504 patent/US20210380715A1/en not_active Abandoned
-
2025
- 2025-03-12 US US19/077,985 patent/US20250236679A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20250236679A1 (en) | Anti-dll3 antibody | |
| KR101493779B1 (ko) | 항 ｅｒｅｇ 항체를 이용하는 암의 진단 및 치료 방법 | |
| US9139647B2 (en) | Diagnosis and treatment of cancer using anti-TM4SF20 antibody | |
| US9920129B2 (en) | Diagnosis and treatment of cancer using anti-ITM2A antibody | |
| JP2015134757A (ja) | 抗ｇｐｒ４９抗体を用いる癌の診断および治療 | |
| US20200157231A1 (en) | Diagnosis and treatment of cancer using anti-lgr7 antibody | |
| US20120321557A1 (en) | Anti-icam3 antibody and use thereof | |
| US9079957B2 (en) | Diagnosis and treatment of cancer using anti-TMPRSS11E antibody | |
| HK1165445A (en) | Diagnosis and treatment of cancer using anti-lgr7 antibody |