RO122543B1

RO122543B1 - Anticorp izolat, cu legare specifică la o polipeptidă rg1, imunoconjugat cuprinzând acest anticorp şi utilizarea acestora în cancerul de prostată

Info

Publication number: RO122543B1
Application number: ROA200200857A
Authority: RO
Inventors: Richard Harkins; Deborah Parkes; Gordon Parry; Douglas W. Schneider; Renate Steinbrecher
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 1999-12-16
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2009-08-28
Also published as: NO20022836D0; EE05293B1; US20020004047A1; DE60042836D1; HU229001B1; HRP20020549A2; SI1237915T1; US20040152139A1; SK286384B6; AU784674B2; WO2001044291A2; ES2331106T3; IL150115A0; EP2048157B1; MXPA02005914A; SI21140A; IL150115A; LT2002070A; CN1434832A; EP1237915B1

Abstract

Această invenţie se referă, pe de o parte, la un anticorp izolat sau fragment al acestuia, care se leagă specific la o polipeptidă RG1, la un imunoconjugat cuprinzând acest anticorp şi, pe de altă parte, la utilizarea acestora în diagnosticul, profilaxia şi tratamentul cancerului de prostată.

Description

Această invenție se referă, pe de o parte, la un anticorp izolat sau fragment al acestuia, care se leagă specific la o polipeptidă RG1, la un imunoconjugat cuprinzând acest anticorp și, pe de altă parte, la utilizarea acestora în diagnosticul, profilaxia și tratamentul cancerului de prostată.

Cancerul de prostată este o boală ce apare în mod frecvent la bărbat, fiind identificată la circa al treilea bărbat trecut de vârsta de 45 de ani. Aceasta este o dovadă în sprijinul ambelor cauze, genetice și de mediu înconjurător, majoritatea cazurilor fiind, probabil, rezultatul combinării ambilor factori. Studiile asupra cancerului familial au sugerat că predispoziția genetică joacă un rol de circa 5...10% din totalul cancerelor de prostată și de circa 45% din cazurile de bărbați mai tineri de 55 de ani.

Există dovezi care arată că, cancerul de prostată se dezvoltă ca o boală cu pași multipli, în care una din leziunile precursoare este neoplasmul intra-epitelial prostatic (PIN). Stadiile timpurii ale bolii sunt androgen dependente, în timp ce stadiile târzii sunt independente hormonal. Boala proliferativă a prostatei cunoscută ca hiperplazia prostatică benignă este adesea detectată clinic, dar ea nu este probabil în stadiul dezvoltării cancerului. Ea este, totuși, în mod frecvent asociată cu cancerul de prostată. Cancerele de prostată au adesea focare multiple, cu creștere în general lentă și heterogene. Cancerele în stadii târzii metastazează în mod frecvent în nodulii limfatici și în os.

Cancerul de prostată este diagnosticat de obicei prin examinare fizică și prin nivelele serice ale antigenului specific de prostată (PSA). Prostatectomia radicală este tratamentul de ales pentru bolile localizate. Bolile metastazate avansate sunt tratate în mod curent prin ablația androgenă indusă de orhiectomie sau tratamentul cu GnRH (gonadotrophin releasing hormone) și prin terapie anti-androgen. Totuși, bolile avansate devin aproape invariabil hormon rezistente și nu există tratament pentru boala ce progresează. Mai mult, există serioase efecte colaterale asociate atât cu prostatectomia radicală, cât și cu terapia ablației androgene. Acestea includ un risc crescut de incontinență și impotență, asociate cu prostatectomia radicală și de fracturi osoase și osteoporoză asociate cu terapia ablației androgene.

Prin urmare, există o nevoie considerabilă pentru noi abordări terapeutice pentru ambele stadii, timpuriu și târziu, ale cancerului de prostată. De asemenea, există o nevoie semnificativă de noi agenți de diagnostic, în special de agenți care pot face deosebirea între stadiile bolii, deoarece aceasta influențează semnificativ opțiunile de tratament. De exemplu, dacă boala a progresat dincolo de prostată și a metastazat la nodulii limfatici, prostatectomia radicală nu se practică, deoarece ea nu are nici un efect asupra progresiei bolii, însă poate avea semnificative efecte colaterale nedorite. Un agent care ar putea detecta metastazele in vivo ar avea o valoare considerabilă.

Au fost demonstrate modificări în expresia proteinelor specifice în cancerul de prostată, ce includ expresia anormală p53 în stadiile târzii ale cancerului de prostată, nivele reduse de receptori TGF-β, nivele reduse de E-cadherin, de C-cam (o moleculă de aderență celulară) și de diferite integrine. Expresia oncogenei bcl-2 este remarcabil de crescută în stadiile târzii ale tumorilor androgen independente și prognoza pentru pacienții cu expresie bcl-2 la nivele ridicate este relativ săracă. în timp ce modificările menționate anterior în expresia genei sunt bine documentate, nu au fost identificate modificări în expresie care să demonstreze a fi cauzale pentru această boală. Prin urmare, arfi util să identifici noi proteine a căror expresie să fie legată de prezența sau dezvoltarea tumorilor de prostată, care ar putea servi ca ținte moleculare pentru diagnosticarea și terapia cancerului de prostată.

Această invenție descrie un nou omolog al superfamiliei de proteine ale matricei extracelulare. Acest omolog, denumit RG1, este exprimat în țesutul prostatei și poate fi supra-exprimat în tumorile de prostată.

RO 122543 Β1

Matricea extracelulară este o structură complexă, în rețea de colagen și elastină, 1 încorporată într-o substanță bazală vâsco-elastică compusă din proteoglicani și glicoproteine. Matricea există ca o schelă tridimensională de susținere care izolează compartimentele tisulare, 3 mediază fixarea celulară și determină structura tisulară (Bissel și colab., J. Theor. Biol. 99:31-68, 1982; Carlson și colab., Proc. Natf. Acad. Sci, USA78:2403-2406,1981). Matricea acționează 5 ca un filtru macromolecular(Hay, E.D., Ce// BiologyofExtracellularMatrix, New York, Plenum Press, 1982) și, de asemenea, influențează citodiferențierea, mitogeneza și morfogeneza 7 (Gospodarowiczs, D., CancerRes. 38:4155-171,1978). Interacțiunile biochimice dintre celulele normale și matrice pot fi alterate în neoplazii și acestea pot influența proliferarea tumorii. 9 Celulele tumorale pot interacționa cu matricea pe diferite căi. în primul rând, celulele tumorale se pot fixa la matrice prin receptori specifici membranei plasmatice (Terranova și colab., Cancer 11

Res., 42:2265-2269,1982). în al doilea rând, degradarea matricei este mediată de o cascadă de enzime la care contribuie celula tumorală și gazda (Eisen și colab., Bioch. Biophys. Acta 13 151:637-645,1968). în al treilea rând, în zonele diferențiate ale tumorii, celulele tumorale pot sintetiza și acumula matrice sau induc celulele gazdă spre o acumulare excesivă de matrice 15 (Brownstein și colab., Cancer 40:2979-2986,1977).

RG1 prezintă omologie cu supra-familia de proteine ale matricei extracelulare, codifi- 17 cate de către genele Mindin/F-spondin. Familia de gene este unită prin două domenii spondin conservate, FS1 și FS2, lângă amino terminal și cel puțin o repetiție de thrombospondin tip 1 19 (TSR1) la carboxi terminal (Shimeld, S. M., Mol. Biol. Evol. 15 (9):1218-1223,1998). Motivul TSR a fost inițial găsit în proteinele matricei extracelulare de vertebrate (Bornstein, P., J. Cell 21 Biol., 130:503-506,1995) și, prin urmare, a fost găsit și în diferite alte proteine ale matricei extracelulare. Există câteva trăsături ale dovezii că TSR-urile mediază aderența celulară și 23 joacă un rol cheie în geneza tumorală. De exemplu, s-a demonstrat că fragmentele proteolitice de thrombospondin care conțin TSR-uri și peptidele sintetice având secvențe 25 corespondente regiunii TSR de thrombospondin promovează aderența celulei tumorale și metastaza (Prate și colab., J. Cell Biol., 112:1031-1040, 1991; Tuszynski și Nicosia, 27 BioEssays 18:71-76, 1996), au activitate anti-angiogenică (Tolsma și colab., J.Cell Biol., 122:497-511,1993) și inhibă agregarea plachetară și metastaza melanomului (Tuszynski și 29 colab., J. CellBiol., 116:209-217,1992).

în mod curent, membrii acestei superfamilii includ o genă la Caenorhabditis elegans, 31 o singură genă la Drosophila și gene multiple la vertebrate. La C. elegans, gena F10E7.4 codifică cinci TSR-uri în plus față de domeniile FS1 și FS2 (Higashijima și colab., Dev. Biol. 33 192:211 -227,1997). La Drosophila, un membru al familiei denumit M-spondin (mspo) conține domeniile FS1 și FS2 și un singur TSR (Umemiya și colab., Dev. Biol. 186:165-176,1997). 35

Gena M-spondin codifică o proteină secretată, care este localizată în situsurile de fixare a mușchiului și se pare că funcționează ca o proteină a matricei extracelulare care suportă 37 fixarea mușchi-apodem. La vertebrate, membrii familiei includ gene izolate din penele zebră (Mindin 1 și Mindin 2, F-spondin 1 și F-spondin 2), F - sondin de șobolan, F-spondin de 39 Xenopus și Mindin de șobolan. Mindin 1 și Mindin 2 sunt strâns înrudite una cu alta și au o structură a genei similară cu cea a M-spondin de Drosophila. Ambele gene, Mindin 1 41 și Mindin 2, codifică un singur TSR în plus față de domeniile FS1 și FS2 (Higashijima și colab., Dev. Biol., 192:211-227, 1997). Genele F-spondin1 și F-spondin 2 de la 43 peștele zebră, F-spondin de șobolan (Klar și colab., Cell 69:95-110,1992) și F-spondin de Xenopus (Altaba și colab., Proc. Nati Acad. Sci. USA 90:8268-8272) au toate structuri 45 similare, codificând șase copii de TSR în plus față de domeniile FS1 și FS2. La vertebrate, supra-familia Mindin/F-spondin poate fi clasificată în două grupe: cele cu gene strâns înrudite 47 cu genele originale F-spondin și Mindin de șobolan și cele strâns înrudite cu gena M-spondin

RO 122543 Β1 de Drosophila. Ambele gene, Mindin și F-spondin de vertebrate codifică proteine care sunt pentru prima dată exprimate de placa bazală a tubului neural în timpul dezvoltării embrionare.

Recent, o singură genă înrudită cu F-spondin, AmphiF-spondin, a fost izolată de la amphioxus (Shimeld, S.M., Mol, Biol. Evol. 15 (9):1218-1223,1998). Bazat pe filogenetica moleculară, gena AmphiF-spondin este strâns înrudită cu un subgrup special de gene F-spondin de vertebrate care codifică șase TSR-uri. AmphiF-spondin codifică trei TSR-uri și două repetiții de fibronectin tip III, una dintre ele având o puternică identitate cu repetiția de fibronectin tip III din Deleted” a cancerului colorectal (DCC). Expresia proteinei a fost găsită de-a lungul celei mai mari părți a sistemului nervos central și nu se limitează la linia centrală, așa cum s-a descris pentru proteinele Mindin și F-spondin de vertebrate.

Aceste date sugerează că proteinele matricei extracelulare, ca și noua proteină RG1, care este un omolog al suprafamiliei Mindin/F-spondin, ar putea fi candidate bune pentru utilizare în diagnosticul cancerului și în intervenția terapeutică.

Prezenta invenție furnizează o secvență de polinucleotide care codifică în mod unic o nouă proteină denumită în prezenta ca RG1. Polipeptida RG1 prezintă omologie cu proteina matricei extracelulare Mindin de șobolan. Ea conține o secvență semnal hidrofoba la N-ul terminal, două domenii spondin (FS1 și FS2) și o repetiție thrombospondin de tip 1 la C-ul terminal. RG1 prezintă 89,7% similaritate cu Mindin de șobolan. Secvența de polinucleotide, desemnată în prezenta ca rg1, și descrisă în fig. 1 (SECV. ID. Nr. 1), codifică secvența de aminoacizi pentru RG1, care este prezentată în figura 2 (SECV. ID. Nr. 2).

în legătură cu aceste scopuri și cu altele, un obiectiv al prezentei invenții este, printre altele, acela de a furniza polipeptide care au fost identificate ca proteine noi, cu omologie la familia Mindin de proteine ale matricei extracelulare, prezentate spre compararea secvenței de aminoacizi arătată în fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) cu secvențe cunoscute de aminoacizi ale altor proteine ale matricei extracelulare.

De altfel, celălalt obiectiv al invenției este să furnizeze polinucleotidele care codifică asemenea polipeptide, în special polinucleotidele care codifică polipeptidele desemnate în prezenta ca RG1.

în conformitate cu acest aspect al invenției sunt furnizate polinucleotide izolate codificând RG1, incluzând ARNm-uri, ADNc-uri și, în celelalte realizări ale acestui aspect al invenției, variante utile biologic, în diagnostic, clinic sau terapeutic, analogi sau derivați ale acestora, sau fragmente ale acestora incluzând fragmente ale variantelor, analogilor și derivaților.

Printre realizările în mod special preferate ale acestui aspect al invenției sunt variantele alelice produse în mod natural ale polinucleotideior care codifică variante de polipeptide desemnate în prezenta ca RG1.

în conformitate cu acest aspect al invenției, sunt furnizate noi polipeptide de origine umană raportate în prezenta ca RG1 precum și fragmente utile biologic, în diagnostic sau în terapie, variante și derivați ale acestora, variante și derivați ai fragmentelor și analogi ai precedentelor.

Printre realizările în mod special preferate ale acestui aspect al invenției sunt variantele RG1, codificate de variantele alelice produse în mod natural ale polinucleotideior rg1.

Un alt obiectiv al invenției este furnizarea unei metode de producere a mai sus menționatelor polipeptide, fragmente de polipeptide, variante și derivați, fragmente de variante și derivați și analogi ai precedentelor. într-o realizare preferată a acestui aspect al invenției, sunt furnizate metode de producere a polipeptidelor RG1 mai sus menționate, cuprinzând cultivarea de celule gazdă ce au încorporată în ele, în mod exprimabil, o polinucleotidă codificând RG1, derivată exogen în condiții de expresie a RG1 uman în gazdă și, apoi, recuperarea polipeptidei exprimate.

RO 122543 Β1 în conformitate cu alt obiectiv al invenției, sunt furnizați produși, compoziții, procese 1 și metode care utilizează polipeptidele și polinucleotideie sus-menționate, în scopuri de cercetare, biologice, clinice și terapeutice, printre altele. 3 în conformitate cu anumite realizări preferate ale acestui aspect al invenției, sunt furnizați produs, compoziții și metode, printre altele, pentru evaluarea expresiei RG1 în celule prin5 determinarea polipeptidelor RG1 sau a ARNm codificând RG1; și pentru a determina conținutul variației genetice și aberațiile, cum ar fi defectele, în genele rg1.7 în conformitate cu anumite realizări preferate ale acestui aspect, ca și al altor aspecte ale invenției sunt furnizate sonde care hibridizează la secvențele rg1.9

Un alt obiectiv al invenției este acela de a furniza anticorpi care sunt foarte selectivi la polipeptidele RG1, sau la fragmente ale acestora, și care pot fi utilizate într-o metodă pentru 11 diagnoza și/sau detecția expresiei RG1, care poate fi asociată cu cancerul de prostată. în conformitate cu anumite realizări preferate ale acestui aspect al invenției, anticorpii sunt 13 marcați în așa fel încât să producă un semnal detectabil. Preferat în mod special va fi un anticorp marcat cu un marker radioactiv, cu o enzima, cu un cromofor sau cu o substanță 15 fluorescentă.

într-un alt aspect al invenției sunt furnizați anticorpi care sunt conjugați la un agent 17 terapeutic pentru administrare la celule in vitro, la celule ex vivo și la celule in vivo sau unui organism multicelular. în această privință, preferați în mod special sunt agenții terapeutici 19 citotoxici. Din acest punct de vedere, în anumite realizări preferate se administrează astfel de anticorpi conjugați la pacienți umani pentru tratamentul stărilor de boală caracterizate prin 21 activitate sau expresie RG1, precum cancerul de prostată.

într-un alt aspect al invenției, sunt furnizate peptide și anticorpi anti-idiotipici care pot 23 fi utilizați pentru stimularea răspunsului imun.

în alt aspect al invenției sunt furnizate ribozime și polinucleotide complementare 25 polinucleotidelor rg1 (adică polinucleotide antisens) pentru administrare la celule in vitro, la celule ex vivo și la celule in vivo sau unui organism multicelular. Preferată în mod special, 27 din acest punct de vedere, este administrarea de molecule antisens la pacienți umani pentru tratamentul unei stări de boală precum cancerul de prostată sau hiperplazia benignă 29 prostatică, care este atenuată prin descreșterea nivelului de activitate RG1.

Alte obiective, trăsături, avantaje și aspecte ale prezentei invenții vor deveni evidente 31 celor ce lucrează în domeniu din descrierea ce urmează. Se va înțelege, totuși, că descrierea ce urmează și exemplele specifice, în timp ce indică realizările preferate ale invenției, sunt 33 date numai ca mod de ilustrare. Diferitele schimbări și modificări în spiritul și scopul invenției expuse vor deveni repede evidente celor ce lucrează în domeniu după citirea descrierii urmă- 35 toare și după citirea celorlalte părți ale prezentei descrieri.

Fig. 1: Secvența de polinucleotide rg1 (SECV. ID. Nr. 1), care codifică forma activă 37 biologic sau imunologic a RG1.

Fig. 2: Secvența dedusă de aminoacizi a RG1 (SECV. ID. Nr. 2), cu domeniile F-spondin 39 subliniate o singură dată și cu domeniul trombospondin dublu subliniat.

Fig. 3: Aliniamentul de aminoacizi a RG1 cu secvența Mindin de șobolan. Secvența 41 RG1 este cea de sus.

Fig. 4: Secvențele de polinucleotide și de aminoacizi dedus a RG1. 43

Fig. 5: Expresia ARNm rg1 în țesuturile umane prin analiza Taqman bazată pe PCR.

ARN-ul din țesut uman, atât tumoral cât și normal, a fost izolat prin tehnici standard. Primerii 45 și sonda pentru detecția expresiei ARNm rg1 au fost desemnați folosind software-ul Perkin Elmer's Primer Express și sintetizați prin Synthetic Genetics. ARNm rg1 a fost detectat în 47 țesuturile de prostată umană. O expresie mult mai scăzută a ARNm rg1 a putut fi detectată și în alte țesuturi, de exemplu, ficat. 49

RO 122543 Β1

Fig. 6: Purificarea proteinei native RG1 secretată de celulele LNCaP. Analiza Western blot, folosind antiser generat contra secvenței de peptide sintetice RG1 (3C, SECV. ID. Nr. 10; vezi exemplul 4), pentru a detecta proteina nativă RG1 secretată de celulele LNCaP. Fracțiile de eluție de la cromatografia Q-Sepharose a concentratului de mediu condiționat de celule LNCaP: (L) încărcătura coloanei, (F) fluxul prin coloană; (1-12) fracțiile de eluție față de gradientul de sare. Greutatea moleculară presupusă a RG1 este de ~ 36 kD, totuși, proteinele RG1 exprimate în sistem bacterian, BHK și LNCaP au fost observate a migra toate la - 45 kD prin analiza PAGE (L, fracțiile 6-9).

Fig. 7: Colorația imunohistochimică a expresiei RG1 în țesuturile de prostată umane, Țesuturile de prostată au fost obținute de la Departamentul de Urologie al Stanford University, School of Medicine. Colorarea a fost efectuată folosind kitul Vector ABC-AP (AK5002) și contra-colorarea cu hematoxilină. Rezultatele arată o puternică colorare a membranei peri-luminale din formațiunile glandei.

Așa cum sunt utilizați în specificațiile, exemplele și revendicările anexate, fără o altă specificare contrară, următorii termeni au sensul indicat mai jos.

“RG1” se referă la polipeptida având secvența de aminoacizi expusă în fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2); variante, analogi, derivați și fragmente ale acesteia ca și la fragmente ale variantelor, analogilor și derivaților. Termenii “fragment, “derivat” și “analog” atunci când se referă la polipeptida din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) înseamnă o polipeptida care păstrează în mod esențial aceeași activitate biologică și/sau imunologică cu a polipeptidei din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2).

“rg1” se referă la polinucleotida având secvența stabilită în fig. 1 (SECV. ID. Nr. 1) și la polinucleotidele care conțin codificarea polipeptidelor având secvența de aminoacizi RG1 expusă în fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2); și la polinucleotidele care codifică variante, analogi, derivați și fragmente RG1 ca și fragmente de variante, analogi și derivați. De asemenea, rg1 se referă la astfel de polinucleotide compuse din ARN ca și la polinucleotidele care sunt complementul polinucleotidelor ce codifică secvența de polipeptide expusă în fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2).

în general, “polinucleotida(ele)” se referă la orice poliribonucleotidă sau polidezoxiribonucleotidă, care poate fi ARN sau ADN ne modificat sau ARN sau ADN modificat. Prin urmare, polinucleotidele așa cum sunt utilizate în prezenta se referă, printre altele, de exemplu, la ADN mono sau dublu catenar, la ADN care este un amestec de regiuni mono și dublu catenare, la ARN mono sau dublu catenar și la ARN care este un amestec de regiuni mono și dublu catenare, la molecule hibride conținând ADN și ARN care pot fi mono catenare sau, mai tipic, dublu catenare sau un amestec de regiuni mono și dublu catenare, în plus, polinucleotida așa cum este folosită în prezenta se referă la regiuni triplu catenare conținând ARN sau ADN sau ambele, ARN și ADN. Cafenele din astfel de regiuni pot fi din aceeași moleculă sau din molecule diferite. Regiunile pot include complet una sau mai multe molecule, dar cel mai tipic implică doar o regiune de câteva molecule. Adesea, una din moleculele regiunii triplu elicoidale este o oligonucleotidă.

Așa cum este folosit în prezenta, termenul de “polinucleotida” include ADN-uri sau ARN-uri ca cele descrise mai sus care conțin una sau mai multe baze modificate. Prin urmare, ADN-urile sau ARN-urile cu schelete modificate pentru stabilitate sau din alte motive sunt polinucleotide”, așa cum acest termen este utilizat în prezenta.

Se consideră că o mare varietate de modificări au fost făcute ADN-ului și ARN-ului pentru a servi multor scopuri utile, cunoscute de cei ce lucrează în domeniu. Termenul de “polinucleotida” așa cum este folosit în prezenta îmbrățișează asemenea forme de polinucleotide modificate chimic, enzimatic sau metabolic, la fel ca și formele chimice de ADN și ARN caracteristice virusurilor și celulelor, incluzând, printre altele, celule simple și complexe.

RO 122543 Β1 “Polipeptidele”, așa cum sunt utilizate în prezenta, includ toate polipeptidele descrise 1 mai jos. Structura de bază a polipeptidelor este bine cunoscută și a fost descrisă în nenumărate cărți și alte publicații din domeniu. în acest context, termenul folosit în prezenta se referă 3 la orice peptidă sau proteină conținând doi sau mai mulți aminoacizi uniți unui cu altul într-un lanț linear prin legături peptidice. Așa cum este folosit în prezenta, termenul se referă la 5 ambele tipuri de lanțuri, scurte, cum sunt de obicei denumite de cei ce lucrează în domeniu peptidele de tip oligopeptide și oligomeri, de exemplu, și lanțuri mai lungi, prin care se înțeleg 7 în general proteinele și care sunt de mai multe tipuri.

Se consideră că polipeptidele conțin adesea și alți aminoacizi în afară de cei 20 de 9 aminoacizi, la care ne referim de obicei ca fiind cei 20 de aminoacizi produși natural, și că mulți aminoacizi, inclusiv aminoacizii terminali, pot fi modificați în polipeptide date, fie prin 11 procese naturale cum sunt glicozilarea și alte modificări post-translaționale, fie prin tehnici de modificare chimică, care sunt bine cunoscute în domeniu. Chiar modificările obișinuite, 13 care se produc natural în polipeptide, sunt prea numeroase pentru a fi listate în prezenta în mod exhaustiv, dar ele sunt bine descrise în texte de bază și în multe monografii detaliate, 15 ca și în voluminoasa literatură din cercetare, și ele sunt bine cunoscute de cei ce lucrează în domeniu. Printre modificările cunoscute, care pot fi prezente la polipeptidele acestei invenții, 17 sunt, enumerând pentru ilustrare câteva, acetilarea, acilarea, ADP-ribozitarea, amidarea, atașarea covalentă a flavinei, atașarea covalentă a unei părți heme, atașarea covalentă de 19 polinucleotide sau derivați de polinucteotide, atașarea covalentă de lipide sau derivați de lipide, atașarea covalentă de fosfotidilinozitol, cross-linkare, ciclizare, formarea de legături 21 disulfidice, demetilare, formarea de cross-linkeri covalenți, formarea de cistină, formarea de piroglutamat, formilare, gama-carboxilare, glicationare, glicozilare, formarea de ancoră GPI, 23 hidroxilare, iodinare, metilare, miristoilare, oxidare, procesare proteolitică, fosforilare, prenilare, recemizare, selenoilare, sulfatare, adiția de aminoacizi mediată de ARN-ul de 25 transfer la proteine precum arginilarea și ubicvitarea (ubiquitination).

Astfel de modificări sunt bine cunoscute celor ce lucrează în domeniu și au fost 27 descrise cu multe detalii în literatura șitiințifică. Câteva modificări specifice obișinuite, de exemplu, glicozilarea, atașarea de lipide, sulfatarea, gama-carboxitarea reziduurilor de acid 29 glutamic, hidroxilarea și ADP-ribozilarea sunt descrise în cele mai multe tratate de bază, cum sunt, de exemplu, I.E.Creighton, Proieins-Structure and Molecular Properties, ediția a 2-a, 31

W.H. Freeman and Company, New York, 1993. Multe articole detaliate asupra acestui subiect sunt disponibile, precum, de exemplu, cele ale lui Wold.F. din Postiransiational Covalent 33 Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed. Academic Press, New York, pg. 1-12,1983; Seifter și colab., Meth. Enzymol. 182:626-646,1990 și Rattan și colab., Protein Synthesis: 35 Postiransiational Modifications andAging, Ann. N.Y. Acad. Sci., 663:48-62,1992.

Se consideră, după cum este bine cunoscut și menționat mai sus, că polipeptidele 37 nu sunt întotdeauna în întregime liniare. De exemplu, polipeptidele pot fi ramificate ca rezultat al ubicvitării (ubiquitination) și ele pot fi circulare, cu sau fără ramificări, în general ca rezultat 39 al evenimentelor post-translaționale, incluzând evenimente de procesare naturală și evenimente produse în preajmă prin manipulări ale omului, care nu se petrec în mod natural. 41 Polipeptidele circulare, ramificate și circular ramificate pot fi sintetizate prin procese naturale ne translaționale și, la fel de bine, prin metode sintetice în totalitate. 43

Modificările se pot produce oriunde într-o polipeptidă, inclusiv în scheletul peptidei, în lanțurile laterale de aminoacizi și în grupările amino sau carboxil terminale. De fapt, bloca- 45 rea grupării amino sau carboxil din polipeptidă sau a ambelor, prin modificări covalente, este obișinuită la polipeptidele produse în mod natural și sintetic și astfel de modificări pot fi 47 prezente la fel de bine și în polipeptidele prezentei invenții. De exemplu, reziduul amino terminal al polipeptidelor produse în E. coli, anterior procesării proteolitice, aproape invariabil 49 va fi N-formilmetionina.

RO 122543 Β1

Adesea, modificările care se produc în polipeptide vor fi în funcție de cum au fost produse. Pentru polipeptidele fabricate prin exprimarea unei gene donate într-o gazdă, de exemplu, natura și extinderea modificărilor în mare parte va fi determinată de capacitatea de modificare post-translațională a celulei gazdă și de semnalele de modificare prezente în secvența de aminoacizi a polipeptidei. De exemplu, așa cum bine se știe, adesea glicozilarea nu se produce în gazde bacteriene precum E. coli. în consecință, când glicozilarea este dorită, polipeptidă va fi exprimată într-o gazdă glicozilantă, în general o celulă eucariotă. Celulele de insecte adesea efectuează aceleași glicozilări post-translționale ca celulele de mamifere și, din acest motiv, sisteme de expresie în celulele insectelor au fost dezvoltate pentru exprimarea eficientă a proteinelor de mamifere, care, printre altele, au tipare native de glicozilare. Considerații similare se aplică și la alte modificări.

Se consideră că același tip de modificare poate fi prezent în același grad sau în grade diferite la mai multe situsuri într-o polipeptidă dată. De asemenea, o polipeptidă dată poate conține mai multe tipuri de modificări.

în general, așa cum este utilizat în prezenta, termenul de polipeptidă conține toate astfel de modificări și, în special, pe cele care sunt prezente în polipeptidele sintetizate prin exprimarea unei polinucleotide într-o celulă gazdă.

Așa cum este utilizatîn prezenta, termenul de “polinucleotidă codificând o polipeptidă” cuprinde polinucleotide care includ o secvență codificând o polipeptidă a prezentei invenții, în special polipeptidă RG1 având secvența de aminoacizi expusă în fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2). Termenul conține polinucleotide care includ o singură regiune continuă sau regiuni discontinue codificând polipeptide (de exemplu, întrerupte de introni) împreună cu regiuni adiționale.

“Activitate biologică” se referă la funcțiile structurale, reglatoare sau biochimice ale polipeptidei RG1 produsă natural.

“Activitate imunologică se referă la capacitatea RG1 natural, recombinat sau sintetic sau a oricărui fragment al acestuia de a induce un răspuns imun specific la animale sau celule specifice și de a se lega de anticorpi specifici.

Oligonucleotida(ele)” se referă la polinucleotide relativ scurte. Adesea, termenul se referă la dezoxiribonucleotide mono catenare, dar se poate referi la fel de bine și la ribonucleotide mono sau dublu catenare, hibrizi ARN:ADN și, printre altele, la ADN-uri duble catenare. Oligonucleotidele, la fel ca oligonucleotidele sondă ADN mono catenare sunt, adesea, sintetizate prin metode chimice, precum cele implementate pe sintetizatoare de oligonucleotide automate. Totuși, oligonucleotidele pot fi produse printr-o varietate de alte metode, inclusiv tehnici in vitro mediate de ADN recombinat și prin expresia ADN-urilor în celule și organisme. Oligonucleotidele sau oligomerii” sau fragment, “porțiune” sau “segment” de polinucleotide se referă la secvența de polinucleotide de cel puțin circa 10 nucleotide și cel mult de circa 60 de nucleotide, de preferat 15 la 30 nucleotide și cel mai preferat de circa 20-25 nucleotide.

“RG1 produs în mod natural” se referă la RG1 produs de celule umane care nu au fost manipulate prin inginerie genetică și la variatele forme RG1, în mod specific examinate, provenind din modificări post-translaționale ale polipeptidei incluzând, darfără să se limiteze la, acetilări, carboxilări, glicozilări, fosforifări, atașări de lipide (lipidation), acilări și clivaj.

“Varianta(e)” de polinucleotide sau polipeptide, ca termen utilizat în prezenta, sunt polinucleotidele sau polipeptidele care diferă de polinucleotidă sau, respectiv, polipeptidă de referință. Variantele în acest sens sunt descrise mai jos și în alte părți ale prezentei expuneri cu mai multe detalii.

(1)0 polinucleotidă care diferă în secvența de polinucleotide de o alta, polinucleotidă de referință. în general, diferențele sunt limitate așa că secvențele de polinucleotide ale polinucleotidei de referință și variantei sunt puternic similare peste tot și în multe regiuni identice.

RO 122543 Β1

Așa cum este notat mai jos, modificările din secvența de polinucleotide ale variantei 1 pot fi silențioase. Există, dar ele pot să nu altereze aminoacizii codificați de polinucleotide. Acolo unde alterările sunt limitate la modificările silențioase ale acestui tip, varianta va codifica 3 o polipeptidă cu aceeași secvență de aminoacizi ca și a celei de referință. De asemenea, notat mai jos, modificările din secvența de polinucleotide ale variantei pot altera secvența de 5 aminoacizi a polipeptidei codificată de polinucleotida de referință. Astfel de modificări ale polinucleotidelor pot avea ca rezultat substituții, adiții, deleții (eliminări), fuziuni și retezări 7 (truncations) de aminoacizi în polipeptidă codificată de secvența de referință, așa cum va fi discutat mai jos. 9 (2) O polipeptidă care diferă în secvența de aminoacizi de o alta, polipeptidă de referință. în general, diferențele sunt limitate astfel că secvența de referință și cea a variantei 11 sunt puternic similare peste tot și în multe regiuni identice. Polipeptidă variantă și cea de referință pot diferi în secvența de aminoacizi prin una sau mai multe substituții, adiții, deleții, 13 fuziuni și retezări, care pot fi prezente în orice combinație. Variantele recombinate codificând aceste asemenea polipeptide sau unele similare pot fi sintetizate sau selectate folosind 15 redundanța” codului genetic. Diferitele substituții de codoni, precum modificările silențioase care produc diferite situsuri de restricție, pot fi introduse pentru a optimiza donarea într-o 17 plasmidă sau vector viral sau expresia într-un sistem procariotic sau eucariotic specific. De asemenea, mutații pot fi introduse pentru a modifica proprietățile polipeptidei, pentru a 19 schimba afinitățile cuplării ligandului (ligand-binding), afinitățile dintre lanțuri sau degradarea polipeptidei sau rata de schimb. 21 “Varianta alelică” se referă la o formă alternativă a polinucleotidei rg1. Alelele rezultă dintr-o mutație, adică o modificare în secvența de polinucleotide, și, în general, produce 23 ARNm-uri alterate sau polipeptide a căror structură sau funcție poate fi sau nu alterată. Orice genă dată poate avea una sau mai multe forme alelice sau poate să nu aibă nici o formă 25 alelică. Modificările mutaționale obișinuite care dau naștere la alele sunt atribuite în general delețiilor, adițiiior sau substituțiilor naturale de nucleotide. Fiecare din aceste tipuri de modifi- 27 cări se poate produce singură sau în combinație cu altele, o dată sau de mai multe ori într-o secvență dată. 29 “Derivatul” se referă la polinucleotidele sau polipeptideie derivate din rg1 sau, respectiv, din RG1, obținute în mod natural, prin modificări chimice precum ubicuitare 31 (ubiquitination), marcare (de exemplu, cu radionuclide sau prin variate modificări enzimatice), peg-ilare (producere de derivați cu polietilen glicol) sau prin inserția sau substituția de 33 aminoacizi precum ornitina (sau substituția de nucleotide codificatoare pentru un astfel de aminoacid), modificări care nu se produc în mod normal în proteinele umane. 35 “Deleția” este definită ca o modificare în fiecare secvență de polinucleotide sau de aminoacizi în care unul sau mai multe reziduuri de polinucleotidă sau de, respectiv, aminoacid 37 este absent.

“Inserția” sau “adiția este acea modificare din secvența de polinucleotide sau 39 aminoacizi care a rezultat prin adăugarea a unuia sau a mai multor reziduuri de polinucleotide sau de, respectiv, aminoacizi comparativ cu secvența produsă pe cale naturală de 41 polinucleotide sau aminoacizi.

“Substituția rezultă din înlocuirea a uneia sau a mai multor polinucleotide sau 43 aminoacizi cu diferite polinucleotide sau, respectiv, aminoacizi.

De preferat, substituțiile de aminoacizi sunt rezultatul înlocuirii unui aminoacid cu alt 45 aminoacid având proprietăți structurale și/sau chimice similare, cum ar fi înlocuirea unei leucine cu o izoleucină sau valină, unui aspartat cu un glutamat sau a unei treonine cu o 47 serină, adică o înlocuire de aminoacid conservativă, inserțiile sau delețiile sunt în mod tipic

RO 122543 Β1 în zona de la circa 1 până ia 5 aminoacizi. Variația permisă poate fi determinată experimental prin inserții, deleții sau substituții de aminoacizi făcute sistematic în polipeptidă folosind tehnicile ADN-ului recombinat și analizând variantele recombinate rezultate pentru activitate.

“Fragmentul” este polipeptidă având o secvență de aminoacizi care în întregime este aceeași cu o parte dar nu cu toată secvența polipeptidelor RG1 mai sus menționate și ale variantelor sau derivaților acesteia.

O polipeptidă “fragment, sau “porțiune sau “segment” este o lungime de reziduuri de aminoacizi de cel puțin circa 5 aminoacizi, adesea de cel puțin circa 7 aminoacizi, tipic de cel puțin circa 9 până la 13 aminoacizi și, în diferite realizări, de cel puțin circa 17 sau mai multi aminoacizi.

“Recombinatul” sau “molecula de ADN recombinată se referă la secvența de polinucteotide care nu este produsă pe cale naturală sau care este făcută prin combinarea artificială a două alte segmente separate de secvență. Prin “produs prin recombinare” se înțelege combinarea artificială înfăptuită adesea fie prin metode de sinteză chimică, fie prin manipulări artificiale de segmente izolate ale polinucleotidei, de exemplu, prin tehnici de inginerie genetică. Astfel de manipulări sunt făcute de obicei pentru a înlocui un codon cu un codon redundant codificator pentru același aminoacid sau unul conservativ, introducând sau îndepărtând în mod tipic situsul de recunoaștere al secvenței. Alternativ, se face pentru a aduce împreună segmente de polinucleotide cu funcții dorite, pentru a genera o singură entitate genetică conținând o combinație dorită de funcții care nu sunt găsite împreună în formele naturale. Prin proiectare pot fi încorporate situsuri de recunoaștere ale enzimei de restricție, secvențe reglatoare, secvențe de control sau alte trăsături utile. “Moleculele de ADN recombinat” includ vectori de donare și de expresie. “Recombinatul” poate de asemenea să se refere la o polinucleotidă care codifică o polipeptidă și este preparată folosind tehnicile ADN-ului recombinat.

“Izolat” înseamnă alterat “de mâna omului” din forma sa naturală; adică, acesta, dacă se produce în natură, a fost schimbat sau îndepărtat din mediul său original sau chiar ambele situații. De exemplu, o polinucleotidă produsă natural sau o polipeptidă prezentă natural într-un animal viu în starea ei naturală nu este un “izolat” dar aceeași polinucleotidă sau polipeptidă separată din materialele stării ei naturale este un “izolat”, așa este utilizat termenul în prezenta. De exemplu, cu privire la polinucleotide, termenul izolat înseamnă că el este separat din cromozomul și celula în care el era în mod natural produs.

Polinucleotidele și polipeptideie se pot afla într-o compoziție, formule de mediu, cum arfi soluțiile pentru introducerea de polinucleotide sau polipeptide în celule, de exemplu, sau compozițiile sau soluțiile pentru reacții chimice sau enzimatice, alt exemplu, care nu sunt compoziții produse în mod natural, și aici rămân ca izolate de polinucleotide sau polipeptide în sensul în care acest termen este folosit în prezenta.

“Substanțial pur” și “substanțial omogen” sunt folosite cu posibilitate de substituire reciprocă și descriu polipeptidă RG1 sau fragmente ale acesteia, sau un segment de polinucleotidă codificând același lucru, în care polipeptidă sau polinucleotidă este separată din componentele care în mod natural o acompaniază.

O polipeptidă RG1 sau un fragment al acesteia, sau un segment de ADN codificând același lucru este în mod substanțial liberă de componentele asociate natural când este separată din contaminanții nativi care o acompaniază în starea ei naturală. Prin urmare, o polipeptidă care este sintetizată chimic sau sintetizată într-un sistem celular diferit față de celula din care este ea natural originară va fi substanțial liberă de componentele ei asociate natural. în mod similar, o polinucleotidă care este sintetizată chimic sau sintetizată într-un sistem celular diferit față de celula din care este ea natural originară va fi substanțial liberă de componentele ei asociate natural.

RO 122543 Β1

Omolog”, când este utilizat pentru a descrie o polinucleotidă, indică că două 1 polinucleotide sau secvențe preconizate ale acestora, atunci când sunt optim aliniate și comparate, sunt identice, cu inserții sau deleții specifice de nucleotide, în cel puțin 70% din 3 nucleotide, de obicei, în 75% până la 99% și, cel mai preferabil, în cel puțin circa 98% la 99% din nucleotide. 5

Similaritatea, când este folosită pentru a descrie o polipeptidă, este determinată prin compararea secvenței de aminoacizi și substitutele de aminoacizi conservate ale unei 7 polipeptide cu secvența unei a doua polipeptide.

Reacția de polimerizare în lanț” sau “PCR” se referă la procedeul prin care bucăți 9 specifice de ADN sunt amplificate după descrierea din brevetul US 4683195, eliberat la 28 Iulie 1987. în general, informația secvenței din capetele fragmentului polipeptide! de interes 11 sau dincolo de acestea necesită a fi disponibilă, astfel că primerii oligonucleotidelor pot fi proiectați; acești primeri se vor orienta unul spre altul și vor fi identici sau similari în secvență 13 cu cafenele opuse ale matriței ce va fi amplificată. Nucleotidele terminale 5' ale celor doi primeri vor coincide cu capetele materialului amplificat. PCR poate fi folosit pentru a amplifica 15 secvențe de ADN specifice din ADN-ul genomic total, ADNc transcris din ARN-ul total celular, secvențe de plasmide etc. (Vezi în general, Mullis și colab., Cold Spring HarborSymp. Quant. 17 Biol., 51:263, 1987; PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).

“Rigoarea” (stringency) se petrece în zona de Tm (temperatura de topire) de circa - 19

5’C (5° sub Tm sondei) până la circa 20“C la 25°C sub Tm. Așa cum va fi înțeles, de cei ce lucrează în domeniu, o hibridizare riguroasă poate fi utilizată pentru a identifica sau detecta 21 secvențele de polinucleotide identice sau pentru a identifica sau detecta secvențe de polinucleotide similare sau înrudite. Așa cum este folosit în prezenta, termenul de “condiții 23 riguroase” înseamnă că hibridizarea se va produce numai dacă există cel puțin 95% și, de preferat, cel puțin 97% identitate între secvențe. 25 “Hibridizarea așa cum este folosită în prezenta, va include “orice proces prin care o catenă de polinucleotidă se unește cu catena complementară prin împerecherea bazelor” 27 (Coombs, J.,Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y., 1994).

“Doza eficientă terapeutic” se referă la acea cantitate de polipeptidă sau de anticorpi 29 ai ei, de antagonici sau inhibitori, incluzând molecule antisens și ribozime, care ameliorează simptomele sau condițiile stării de boală. Eficacitatea terapeutică și toxicitatea unor astfel de 31 compus poate fi determinată prin procedee farmaceutice standard în culturi celulare sau pe animale de laborator, de exemplu ED₅₀ (doza terapeutică eficientă în 50% din populație) și 33 LD (doza letală la 50% din populație). Raportul dozei dintre efectele terapeutice și toxice îl reprezintă indexul terapeutic și poate fi exprimat ca o fracție, ED₅₀/LD₅₀. 35 “Tratare” sau “tratament”, așa cum este utilizat în prezenta, cuprinde tratamentul unei stări de boală la un pacient uman, a cărui stare de boală este asociată cu creșterea tumorii de 37 prostată și include acele stări de boală în care pacientul are nevoie de nivele reduse de RG1.

Prezenta invenție prezintă noile polipeptide RG1, polinucleotide rg1 și anticorpi 39 direcționați spre polipeptidele RG1, printre altele, descrise mai departe cu mai multe detalii, în special, invenția se referă la noile polipeptide RG1 și polinucleotidele care codifică aceste 41 polipeptide, RG1 având secvența de aminoacizi expusă înfig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) și rg1 având secvența de polinucleotide expusă în fig. 1 (SECV. ID. Nr. 1). Prezenta invenție cuprinde, 43 de asemenea, și variantele RG1. O variantă RG1 preferată este cea având cel puțin 70% similaritate (de preferat, cel puțin 70% identitate) cu secvența de polipeptide prezentată în 45 fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) și, mai preferabil, cel puțin 90% similaritate (de preferat, cel puțin 90% identitate) cu polipeptidă prezentată în fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) și, încă și mai preferabil, cel 47 puțin 95% similaritate (încă și mai preferabil, cel puțin 95% identitate) cu polipeptidă prezentată

RO 122543 Β1 în fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) și include, de asemenea, porțiuni din astfel de polipeptide în care o astfel de porțiune de polipeptidă conține, în general, cel puțin 30 aminoacizi și, mai preferabil, cel puțin 50 aminoacizi.

Secvența codificatoare pentru polipeptidă preconizată RG1 începe cu 296 de perechi de baze din capul 5’ al secvenței de nucleotide prezentată în fig. 1 (SECV. ID. Nr. 1). RG1 conține trei domenii structurale caracteristice ale supra-familiei Mindin/F-spondin de proteine ale matricei extracelulare: două domenii spondin (FS1 și FS2), cuprinzând aminoacizii 31 la 103 și, respectiv, 138 la 221 și un domeniu thrombospondin, cuprinzând aminoacizii 278 la 330.

Prezenta invenție se bazează în parte pe omologia de structură prezentată în fig. 3 dintre RG1 și Mindin de șobolan, un alt membru al familiei de proteine ale matricei extracelulare. Secvența de aminoacizi a RG1 este similară cu cea de Mindin de șobolan în aproximativ 89,7%.

De asemenea, prezenta invenție se bazează în parte și pe profilul expresiei RG1, așa cum a fost demonstrat prin expresia ei din băncile de țesut de prostată și prin supra-expresia din băncile de tumori de prostată. Acest profil de țesut este văzut în analizarea expresiei ARNm din probe de țesut de la țesuturi normale și tumorale prin analiza Taqman, bazată pe PCR. Această metodă de analiză a demonstrat că ARNm codificând RG1 este supra-exprimat în țesuturile de prostată comparativ cu alte țesuturi.

Polinucleotide în conformitate cu un aspect al prezentei invenții, sunt furnizate polinucleotide izolate care codifică polipeptidă RG1 având secvența dedusă de aminoacizi din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2).

Utilizând informația furnizată de prezenta, după care secvența de polinucleotide este stabilită în fig. 1 (SECV. ID. Nr. 1), o polinucleotidă a prezentei invenții care codifică polipeptidă RG1 poate fi obținută folosind donarea standard și procedeele de triere, la fel cu cele pentru donarea ADNc-urilor folosind ARNm din celule de țesut uman ca material de pornire. Ilustrând invenția, secvența de polinucleotide din fig. 1 (SECV. ID. Nr. 1) a fost găsită în clonele ADNc obținute din țesut de prostată uman. RG1 a fost identificat ca o genă exprimată în prostată prin explorarea bazei de date Incyte's LifeSeq. Secvența de nucleotide a fost identificată prin căutarea adnotărilor din baza de date, folosind ca instrument Protein Function” furnizat de Incyte în scopul cercetării bazei de date. Secvența de nucleotide a fost găsită la categoria moleculelor de aderență celulară din baza de date explicativă și a fost descrisă ca un omolog de f-spondin. Analiza Electronic Northern a distribuției secvențelor de polinucleotide rg1 din setul bibliotecii din baza de date a arătat că rg1 a fost exprimat la nivele înalte în băncile de prostată și la nivele inferioare într-un număr de alte bănci de țesuturi, incluzându-le pe cele din țesuturi normale și tumorale.

în urma asamblării setului de clone rg1 din baza de date, într-o secvență de polinucleotide contiguă (în contact) și editării secvenței contigue, o secvență codificatoare de lungime completă a fost identificată în preconizata polinucleotidă asamblată. Această secvență a codificat o proteină cu omologie față de mindin-ul de șobolan.

Clonele Incyte 1640796, 1712252 și 1880265 au fost obținute de la Incyte pentru lucrări experimentale și clona 3360733 a fost identificată ca posedând secvența cu cele mai multe nucleotide 5'. Această clonă a fost secvențială în întregime și a conținut întreaga secvență codificatoare pentru preconizata proteină RG1. Această secvență este prezentată în figura 1 (SECV. ID. Nr. 1).

Polinucleotidele prezentei invenții pot fi sub formă de ARN, ca ARNm, sau sub formă de ADN, incluzând, de exemplu, ADNc și ADN-ul genomic obținuți prin donare, sau produși prin tehnici de sinteză chimică, sau prin combinații ale acestora sau prin metode descrise în

RO 122543 Β1 prezenta. ADN-ul poate fi dublu sau mono catenar. ADN-ul mono catenar poate fi o catenă 1 codificatoare, cunoscută și drept catenă sens, sau el poate fi catenă necodificatoare, cunoscută drept catenă antisens. 3

Secvența care conține codificarea polipeptidei poate fi identică cu secvența codificatoare a polinucleotidei prezentată în fig. 1 (SECV. ID. Nr. 1). De asemenea, ea poate fi o 5 polinucleotidă cu o secvență diferită care, ca rezultat al redundanței (degenerării) codului genetic, conține codificarea polipeptidei din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2). 7

Polinucleotidele prezentei invenții care conțin codificarea polipeptidei din fig. 2 (SECV.

ID. Nr. 2) pot include, fără să se limiteze la, secvența codificatoare pentru polipeptida însăși; 9 secvența codificatoare a polipeptidei împreună cu secvențe adiționale, necodificatoare, incluzând, de exemplu, dar fără să se limiteze la, introni și secvențe 5' și 3’ necodificatoare, 11 precum secvențele transcrise, netranslate care joacă un rol în transcripție, secvențe de procesare ARNm (de exemplu, semnale de îmbinare (splicing) și poliadenilare) sau secvențe 13 adiționale codificatoare care codifică aminoacizi adiționali, precum cei care furnizează funcționalități adiționale. Prin urmare, de exemplu, polipeptida poate fi fuzionată cu o secvență 15 marker, cum arfi o peptidă, care facilitează purificarea polipeptidei fuzionate. în anumite realizări preferate ale acestui aspect al invenției, secvența marker este o peptidă hexa-histidină, 17 cum arfi tag-ul furnizat în vectorul pTrcHisB (Invitrogen, Carlsbad, CA) printre alții, mulți dintre aceștia fiind disponibili în comerț. După cum a descris Gentzși colab., (Proc. Natl. Acad. Sci., 19

SUA 86:821-824, 1989) de exemplu, hexa-histidina facilitează purificarea convenabilă a proteinei de fuziune. 21

Polinucleotidele pot conține codificarea unei polipeptide care este de fapt pofipeptida plus aminoacizi adiționali amino sau carboxil terminali, sau aminoacizi interiori polipeptidei 23 (de exemplu, când forma activă are mai mult de un lanț de polipeptide). Astfel de secvențe pot juca un rol în procesarea polipeptidei de la precursor la forma finală, pot facilita comerciali- 25 zarea polipeptidei, pot prelungi sau scurta durata de înjumătățire a vieții polipeptidei sau pot facilita manipularea polipeptidei pentru testare sau producție, printre altele. în general, așa 27 cum este cazul in situ, aminoacizii adiționali pot fi procesați prin eliminare din polipeptidă de către enzime proteolitice. 29

Prezenta invenție se referă mai departe la variantele polinucleotidelor descrise mai sus în prezenta, care codifică fragmente, analogi și derivați ai polipeptidei având secvența 31 dedusă de aminoacizi din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 1). O variantă a polinucleotidei poate fi o variantă produsă natural, cum ar fi o variantă alelică produsă natural sau poate fi o variantă 33 care nu este cunoscută a se produce în mod natural. Astfel de variante produse nenatural ale polinucleotidei pot fi fabricate prin tehnici de mutageneză, incluzând pe cele aplicate 35 polinucleotidelor, celulelor sau organismelor.

Din acest punct de vedere sunt variante care diferă de polinucleotidele mai sus 37 menționate prin substituții, deleții sau adiții de polinucleotide. Substituțiile, delețiile sau adițiile pot implica una sau mai multe polinucleotide. Variantele pot fi alterate în regiunea codifica- 39 toare sau necodificatoare sau în ambele. Alterările din regiunile codificatoare pot produce substituții, deleții sau adiții de aminoacizi conservatoare sau ne conservatoare. 41

Printre realizările în mod special preferate ale invenției din acest punct de vedere sunt polinucleotidele codificând polipeptide având secvența de aminoacizi a RG1 din fig. 2 (SECV. 43

ID. Nr. 2); variante, analogi, derivați și fragmente ale acesteia, ca și fragmente ale variantelor, analogilor și derivaților. 45

Mai mult, preferate în mod special din acest punct de vedere sunt polinucleotidele codificând variantele RG1, analogii, derivații și fragmentele ca și variantele, analogii și derivații 47 fragmentelor, care au secvența de aminoacizi a polipeptidei RG1 din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2)

RO 122543 Β1 în care mai multe, câteva, de la 5 la 10, de la 1 la 5, de la 1 la 3, 2 reziduuri de aminoacizi, 1 sau nici unul sunt substituite, eliminate (delete) sau adăugate, în orice combinație. Preferate în mod special sunt substituțiile, adițiile și delețiile silențioase care nu alterează proprietățile și activitățile polipeptidei RG1. De asemenea, special preferate din acest punct de vedere sunt substituțiile conservative. Cele mai mult preferate sunt polinucleotidele ce codifică polipeptide având secvența de aminoacizi din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) fără substituții.

Alte realizări preferate ale invenției sunt polinucleotidele care sunt cel puțin 70% identice cu polinucleotidele codificând polipeptidă RG1 având secvența de aminoacizi expusă în fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) și polinucleotidele care sunt complementare unor astfel de polinucleotide. Alternativ, cele mai mult preferate sunt polinucleotidele care conțin o regiune ce este cel puțin 80% identică cu polinucleotida codificând polipeptidă RG1 și polinucleotidele complementare la aceasta. Din acest punct de vedere, polinucleotidele identice în cel puțin 90% sunt în special preferate și, dintre aceste polinucleotide cele identice în cel puțin 95% sunt în mod deosebit preferate. în plus, cele identice în cel puțin 97% sunt și mai preferate față de cele cu cel puțin 95%, iar printre acestea, cele cu cel puțin 98% și cel puțin 99% sunt, în special, mai mult preferate; dintre acestea, cele cu cel puțin 99% fiind cele mai preferate.

în plus, realizările în special preferate din acest punct de vedere sunt polinucleotidele care codifică polipeptide ce păstrează în mod substanțial aceeași activitate biologică cu polipeptidă codificată de secvența de polinucleotide din fig. 1 (SECV. ID. Nr. 1).

Prezenta invenție se referă în continuare la polinucleotide care hibridizează cu secvențele descrise mai sus, în prezenta. Din acest punct de vedere, prezenta invenție se referă în mod special la polinucleotidele care hibridizează în condiții riguroase la polinucleotidele descrise mai sus, în prezenta.

Așa cum s-a discutat adițional în prezenta cu privire la testele cu polinucleotidele din invenție, de exemplu, polinucleotidele invenției discutate mai sus pot fi utilizate ca sonde de hibridizare cu ADNc și ADN genomic pentru a izola ADNc-uri de lungime completă și clone genomice codificând RG1 și pentru a izola clone de ADNc și genomice de alte gene care au o înaltă similaritate de secvență cu gena rg 1. în general, astfel de sonde vor conține cel puțin 15 baze. De preferat, asemenea sonde vor avea cel puțin 30 de baze și pot avea cel puțin 50 de baze.

De exemplu, regiunea codificatoare a genei rg1 poate fi izolată prin trierea băncii folosind sonde sintetice de oltgonucleotide care au fost proiectate folosind secvențe cunoscute de ADN. De exemplu, o oligonucleotidă marcată având o complementaritate de secvență cu cea a polinuclotidei din prezenta invenție poate fi utilizată pentru a tria banca de ADNc sau ADN genomic pentru a identifica clonele care hibridizează cu sonda.

Pe scurt, polinucleotida din prezenta invenție poate codifica o polipeptidă, o polipeptidă plus o secvență lider (care poate fi considerată tot ca o prepolipeptidă).

De asemenea, se va considera că invenția se referă, printre altele, la polinucleotide codificând fragmente de polipeptidă, polinucleotide care hibridizează la polinuclotidele codificând fragmente de polipeptidă, în special, la cele care hibridizează în condiții riguroase și la polinucleotide, cum sunt primerii PCR, pentru amplificarea polinucleotidelorcare codifică fragmente de polipeptidă. în aceste privințe, polinucleotidele preferate sunt cele care corespund la fragmentele de polipeptide preferate, așa cum se va discuta mai departe.

Polipeptide

Prezenta invenție se referă în continuare la polipeptidă RG1 care are secvența dedusă de aminoacizi din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2).

Invenția se referă, de asemenea, la fragmentele, analogii și derivații acestor polipeptide. Termenii de fragment, derivat și analog atunci când se referă la polipeptidă din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) înseamnă o polipeptidă care păstrează în mod esențial aceeași activitate biologică cu o astfel de polipeptidă.

RO 122543 Β1

Polipeptidă din prezenta invenție poate fi o polipeptidă recombinată, o polipeptidă 1 naturală sau o polipeptidă sintetică. în anumite realizări preferate, polipeptidă este una recombinată. 3

Fragmentul, derivatul sau analogul polpeptidei din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) poate fi (i) unul în care unul sau mai multe reziduuri de aminoacizi sunt substituiți cu un reziduu de 5 aminoacid conservativ sau ne conservativ (de preferat, un reziduu de aminoacid conservativ) și un astfel de reziduu de aminoacid substituit poate fi sau nu unul codificat de codul genetic 7 sau (ii) unul în care unul sau mai multe reziduuri de aminoacizi includ un grup substituent sau (iii) unul în care polipeptidă este fuzionată cu un alt compus, precum un compus pentru 9 mărirea timpului de înjumătățire a vieții polipeptidei (de exemplu, polietilen glicol) sau (iv) unul în care aminoacizii adiționali sunt fuzionați cu polipeptidă, precum secvența leader sau 11 secretoare, sau o secvență care este folosită pentru purificarea polipeptidei. Astfel de fragmente, derivați sau analogi sunt considerate a fi incluse în scopul invenției, de către cei 13 ce lucrează în domeniu după învățămintele prezentei.

Printre realizările în mod special preferate al invenției din acest punct de vedere se 15 află polipeptidele având secvența de aminoacizi a RG1 expusă în fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2), variante, analogi, derivați și fragmente ale acesteia și variante, analogi și derivați ai 17 fragmentelor.

Printre variantele preferate sunt cele care variază de la cea de referință prin substituții 19 conservative de aminoacid. Astfel de substituții sunt cele care înlocuiesc un aminoacid dat din polipeptidă printr-un alt aminoacid cu caracteristici asemănătoare. Tipice pentru substitu- 21 țiile conservative sunt înlocuirile, unul cu altul, dintre aminoacizii alifatici Ala, Val, Leu și lle, schimburile făcute între reziduurile hidroxil ale Ser și Thr, schimburile de reziduuri acidice de 23 Asp și Glu, substituțiile dintre reziduurile amidice de Asn și Gin, schimbul de reziduuri bazice de Lys și Arg și înlocuirile, unul cu altul, a reziduurilor aromatice de Phe și Tyr. 25

Următoarele preferate în mod special din acest punct de vedere sunt variantele, analogii, derivații și fragmentele ca și variantele, analogii și derivații fragmentelor, având 27 secvența de aminoacizi a polipeptidei RG1 din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) în care mai multe, câteva, de la 5 la 10, de la 1 la 5, de la 1 la 3,2,1 sau niciunul din reziduurile de aminoacizi 29 sunt substituiți, eliminați sau adăugați, în orice combinație. Printre acestea, în special preferate sunt substituțiile, delețrile șl adițiile silențioase, care nu alterează proprietățile și 31 activitățile polipeptidei RG1. De asemenea, preferate în mod special din acest punct de vedere sunt substituțiile conservative. Cele mai mult preferate sunt polipeptidele având 33 secvența de aminoacizi din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) fără substituții.

Polipeptidele și polinucleotidele prezentei invenții suntfurnizate de preferință în formă 35 izolată și, de preferat, sunt purificate pentru omogenitate.

Polipeptidele prezentei invenții includ de asemenea polipeptidă din fig. 2 (SECV. ID. 37 Nr. 2) ca și polipeptide care au o similaritate de cel puțin 70% (de preferat o identitate de cel puțin 70%) cu polipeptidă din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) și, mai preferabil, o similaritate de cel 39 puțin 90% (de preferat o identitate de cel puțin 90%) cu polipeptidă din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) și, încă și mai preferabil, o similaritate de cei puțin 95% (de preferat o identitate de cel puțin 41 95%) cu polipeptidă din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) și include și porțiuni de astfel de polipeptide, în care o asemenea porțiune a polipeptidei conține în general cel puțin 30 de aminoacizi și, 43 mai preferabil, cel puțin 50 de aminoacizi.

După cum se cunoaște în acest domeniu, similaritatea” dintre două polipeptide este 45 determinată prin compararea secvenței de aminoacizi și a substituțiilor ei de aminoacizi conservativi de la o polipeptidă cu secvența unei a doua polipeptide. 47

RO 122543 Β1

Fragmente sau porțiuni ale polipeptidelor din prezenta invenție pot fi folosite pentru producerea de polipeptide corespondente de lungime completă, prin sinteză de peptide; prin urmare, fragmentele pot fi folosite ca intermediari pentru producerea de polipeptide de lungime totală.

Fragmente

De asemenea, printre realizările preferate ale acestui aspect din prezenta invenție sunt polipeptide conținând fragmente de RG1, în special fragmente de RG1 din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) și fragmente de variante și derivați de RG1 din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2).

Din acest punct de vedere, un fragment este o polipeptidă având o secvență de aminoacizi care este în întregime aceeași ca parte, dar nu toată, din secvența de aminoacizi ai polipeptidelor RG1 mai sus menționate și a variantelor sau derivaților acestora.

Astfel de fragmente pot fi “permanent libere” (free standing”), adică, nu sunt parte din sau fuzionate cu alți aminoacizi sau polipeptide, sau ele pot fi conținute în interiorul unor polipeptide mai mari, din care formează o parte sau o regiune. Când sunt cuprinse în interiorul unei polipeptide mai mari, cele mai preferabile fragmente discutate acum formează o regiune unică, continuă. Totuși, câteva fragmente pot fi cuprinse în interiorul unei singure polipeptide mai mari. De exemplu, anumite realizări preferate se referă la un fragmentai polipeptidei RG1 din prezenta invenție conținut în interiorul unei polipeptide precursoare proiectată pentru exprimare în gazdă și având regiuni heterologe pre- și pro-polipeptidă fuzionate la gruparea amino terminală a fragmentului RG1 și o regiune adițională fuzionată la gruparea carboxil terminală a fragmentului. Prin urmare, fragmentele, în aspectul înțelesului intenționat în prezenta, se referă la porțiunea sau la porțiunile unei polipeptide de fuziune sau unei proteine de fuziune derivată din RG1.

Ca exemple reprezentative de fragmente de polipeptide ale invenției, pot fi menționate aici cele care au de la circa 25 la circa 331 aminoacizi.

în acest context “circa” include domeniul citat în mod special și domenii mai mari sau mai mici prin mai mulți, câțiva, 5, 4, 3, 2 aminoacizi sau 1 aminoacid la una sau alta din extreme sau la ambele extreme. De exemplu, circa 331 aminoacizi în acest context înseamnă un fragment de polipeptidă de la 25 plus sau minus mai multe, câteva, 5,4,3,2 reziduuri de aminoacizi sau 1 reziduu de aminoacid până la 331 plus sau minus mai multe, câteva, 5,4, 3, 2 reziduuri de aminoacizi sau 1 reziduu de aminoacid, adică, domenii atât de întinse ca de la 25 minus mai mulți aminoacizi la 331 plus mai mulți aminoacizi până la domenii atât de restrânse ca de la 25 plus mai mulți aminoacizi la 331 minus mai mulți aminoacizi.

Din acest punct de vedere, sunt mai mult preferate domeniile citate cu plus sau minus 5 aminoacizi la una sau alta din extreme sau la ambele. în special, sunt mai preferate domeniile citate cu plus sau minus 3 aminoacizi la una sau alta din extreme sau la ambele. Mai ales, sunt preferate în mod special domeniile citate cu plus sau minus 1 aminoacid la una sau alta din extreme sau la ambele extreme sau domeniile citate fără adiții sau deleții. Cele mai preferate dintre toate din acest punct de vedere sunt fragmentele de la circa 25 aminoacizi la circa 331 aminoacizi.

Printre fragmentele preferate în mod special ale invenției sunt mutantele retezate (truncation) de RG1. Mutantele retezate de RG1 includ variante sau derivați ai secvenței din fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) cu excepția deleției unei serii continue de reziduuri (aceasta este o regiune, parte sau porțiune continuă) care include gruparea amino terminală a secvenței prezentate în fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) sau o serie continuă de reziduuri ce includ gruparea carboxil terminală sau, ca în mutantele dublu retezate, deleția a două serii continue de reziduuri, una incluzând gruparea amino terminală și alta incluzând gruparea carboxil terminală. Fragmentele având domenii de mărimea stabilită mai sus sunt și realizările preferate de fragmente retezate, care, în general, sunt mai ales preferate.

RO 122543 Β1

Preferate mai ales din acest punct de vedere sunt fragmentele caracterizate prin 1 atribuțiile biologice și/sau imunologice ale RG1. Astfel de fragmente includ pe cele conținând domeniile structurale preconizate de Rg1, care conțin cel puțin aminoacizii de la 31 la 103, 3 de la 138 la 221 și de la 278 la 330 sau fragmente ale acestora folosite pentru a genera anticorpi, precum cele descrise în exemplul 4. 5

Anumite regiuni preferate din acest punct de vedere sunt stabilite în fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2) și includ, dar nu se limitează la, regiunile tipurilor mai sus menționate identificate prin 7 analiza secvenței de aminoacizi stabilită în fig. 2 (SECV. ID. Nr. 2).

Printre fragmentele intens preferate din acest punct de vedere sunt cele ce cuprind 9 regiuni de RG1 care combină mai multe trăsături structurale cum ar fi trăsăturile stabilite mai sus. Din acest punct de vedere, cele două domenii spondin și unul thrombospondin, 11 cuprinzând aproximativ aminoacizii de la 31 la 103, de la 138 la 221 și, respectiv, de la 278 la 330, care sunt caracteristice super-familiei Mindin/spondin de proteine ale matricei 13 extracelulare, sunt regiunile cel mai ales preferate. Astfel de regiuni pot fi cuprinse în interiorul unei polipeptide mai mari sau pot fi prin ele însăși un fragment preferat al prezentei invenții, 15 așa cum s-a discutat mai sus. Se va considera că termenul “aproximativ”, așa cum este el folosit în acest paragraf are înțelesul stabilit mai sus cu privire la fragmente în general. 17

Următoarele regiuni preferate sunt cele care mediază activitățile RG1. Cele mai preferate din acest punct de vedere sunt fragmentele care au activități chimice, biologice sau alte 19 activități ale RG1, incluzând pe cele cu activitate similară sau cu activitate ameliorată sau cu o activitate scăzută, nedorită. Foarte preferate din acest punct de vedere sunt fragmentele 21 ce conțin regiuni care sunt omoloage în secvență sau în poziție sau în ambele, în secvență și în poziție, cu regiunile active ale polipeptidelor înrudite, precum alte proteine din familia 23 Mindin, care include RG1.

Vectori, celule gazdă și sisteme de expresie 25

Prezenta invenție se referă și la vectori care includ polinucleotide al prezentei invenții, celule gazdă care sunt modificate prin inginerie genetică cu vectori ai invenției și producerea 27 polipeptidelor invenției prin tehnici de recombinare. Astfel de tehnici sunt descrise de Sambrook și colab., în Molecular Cloning, A Laborator/Manual, Cold Spring Harbor Press, 29 Plainview, NY., 1989 și deAusubel, F.M. și colab., în CurrentProtocolsin MolecularBiology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989. 31

Celulele gazdă pot fi manipulate prin inginerie genetică pentru a încorpora polinucleotide și exprima polipeptide ale prezentei invenții. De exemplu, polinucleotidele pot 33 fi introduse în celulele gazdă folosind tehnicile binecunoscute ale infectării, transducției, transfecției, transvecției și transformării. Polinucleotidele pot fi introduse singure sau cu alte 35 polinucieotide. Astfel de alte polinucleotide pot fi introduse independent, co-introduse sau introduse prin unire cu polinucleotidele invenției. 37

Prin urmare, de exemplu, polinucleotidele invenției pot fi transfectate în celule gazdă cu o altă polinucleotidă separată care codifică un markerde selecție, folosind tehnici standard 39 pentru co-transfecție și selecție în, de exemplu, celule de mamifere. în acest caz, polinucleotidele vor fi, în general, stabil încorporate în genomul celulei gazdă. 41

Alternativ, polinucleotidele pot fi legate la un vector conținând un marker de selecție pentru propagare în gazdă. Vectorul construit poate fi introdus în celula gazdă prin tehnicile 43 mai sus-menționate. în general, un vector plasmidial este introdus ca ADN într-un precipitat, precum precipitatul de fosfat de calciu, sau într-un complex cu o încărcătură de lipide. De 45 asemenea, electroporarea poate fi folosită pentru introducerea polinucleotidelor în gazdă. Dacă vectorul este un virus, el poate fi împachetat in vitro sau introdus într-o celulă împache- 47 tată și virusul împachetat poate fi transdus în celule. O largă varietate de tehnici convenabile

RO 122543 Β1 pentru fabricarea de polinucleotide și pentru introducerea polinucleotidelor în celule, în conformitate cu acest aspect al invenției, sunt binecunoscute și de rutină pentru cei ce lucrează în domeniu. Astfel de tehnici sunt expuse pe larg de Sambrook și colab., citat mai sus, și ilustrat în multe manuale de laborator care detaliază aceste tehnici. în conformitate cu acest aspect al invenției, vectorul poate fi, de exemplu, un vector plasmidial, un vectorfag cu una sau două catene, un vector viral ADN sau ARN cu una sau două catene. Asemenea vectori pot fi introduși în celule ca polinucleotide, de preferat ADN, prin tehnicile binecunoscute pentru introducerea ADN-ului și ARN-ului în celule. Vectorii, în cazul vectorilor tip fag sau viral, pot de asemenea să fie și, de preferat, sunt introduși în celule ca virus împachetat sau încapsulat prin tehnicile binecunoscute de infectare sau transducție. Vectorii virali pot fi replicați în mod competent sau defectuos. în ultimul caz, propagarea virală seva produce, în general, numai în celulele gazdă complementare.

Printre vectorii preferați, în anumite privințe, sunt cei pentru expresia polinucleotideior și polipeptidelor prezentei invenții. în general, astfel de vectori conțin regiuni de control c/s-acting eficiente pentru expresia în gazdă operativ linkate la polinucleotidele ce vor fi exprimate. Unul sau altul dintre factorii specifici trans-acting sunt procurați de către gazdă, printr-un vector complementar sau prin vectorul însuși după introducerea în gazdă.

în anumite realizări preferate din acest punct de vedere, vectorii furnizează expresia specifică. O astfel de expresie specifică poate fi o expresie inductibilă sau o expresie numai în anumite tipuri de celule sau ambele, inductibilă și specific celulară. Printre vectorii inductibili în special preferați sunt vectorii care pot fi indus pentru expresie de către factori ai mediului înconjurător care sunt ușor de manipulat, precum temperatura și aditivii nutritivi. O varietate de vectori convenabili pentru acest aspect al invenției, incluzând vectori de expresie constitutivi și inductibili pentru utilizare în gazde procariote și eucariote, sunt bine cunoscuți și folosiți în mod curent de cei ce lucrează în domeniu.

Celulele gazdă manipulate genetic pot fi cultivate pe medii de cultură convenționale, care pot fi modificate adecvat pentru activarea promotorilor, selectarea transformanților sau amplificarea genelor, printre altele. Condițiile de cultură, precum temperatura, pH-ul și alte asemenea, utilizate anterior pe celule gazdă selectate pentru expresie vor fi, în general, convenabile pentru expresia polipeptidelor prezentei invenții și vor fi evidente celor ce lucrează în domeniu.

O mare varietate de vectori de expresie pot fi folosiți pentru a exprima o polipeptidă a invenției. Astfel de vectori includ vectorii cromozomali, epizomali și vectorii derivați din virusuri, adică, vectori derivați din plasmide bacteriene, din bacteriofagi, din epizomi de drojdii, din elemente cromozomale de drojdii, din virusuri precum baculovirusuri, papova virusuri, precum SV4O, vaccinia virusuri, adenovirusuri, fowl pox virusuri, pseudorabies virusuri, retrovirusuri și alphavirusuri, precum virusul Sindbis, și vectori derivați din combinațiile acestora, precum cei derivați din elemente genetice plasmidiale și ale bacteriofagilor precum cosmidele și fagemideie (phagemids), toți pot fi utilizați pentru expresia conformă cu acest aspect al prezentei invenții. în general, orice vector convenabil pentru a menține, a propaga sau a exprima polinucleotide care să exprime o polipeptidă într-o gazdă poate fi utilizat pentru exprimarea în această privință.

Secvențe specifice ADN pot fi inserate în vector prin oricare din varietatea de tehnici bine cunoscute și de rutină. în general, o secvență ADN pentru expresie este legată la un vector de expresie prin clivarea secvenței ADN și a vectorului de expresie cu una sau mai multe endonucleaze de restricție și, apoi, prin legarea fragmentelor de restricție împreună folosind ADN-ligaza T4. Procedeele pentru restricție și legare care pot fi utilizate în acest scop

RO 122543 Β1 sunt bine cunoscute și de rutină pentru cei ce lucrează în domeniu. Procedee convenabile 1 în această privință și folosirea de tehnici alternative pentru construirea de vectori de expresie, care sunt bine cunoscute și de rutină pentru cei ce lucrează în domeniu, sunt prezentate în 3 detaliu de Sambrook și colab., citat în altă parte în prezenta.

Secvența ADN din vectorul de expresie este în mod operativ linkată la secvența(ele) 5 specifică de control a expresiei, incluzând, de exemplu, un promotor pentru a ghida transcripția ARNm. Astfel de promotori reprezentativi includ promotorul PL lambda fag (phage lambda), 7 promotorii E.coli lac, trp, tac și trc, promotorii SV40 de început (early) și ultim (late) și promotorii LTR retrovirali, pentru a numi doar câțiva dintre cei mai bine cunoscuți promotori. 9 Se va înțelege că numeroșii promotori nemenționați sunt convenabili pentru utilizare în acest aspect al invenției, sunt binecunoscuți și pot fi prompt utilizați de cei ce lucrează în domeniu, 11 în maniera ilustrată de discuțiile și de exemplele din prezenta.

în general, construcțiile de expresie vor conține situsuri pentru inițierea și terminarea 13 transcripției și, în regiunea transcrisă, un situs de legare a ribozomilor pentru translare. Porțiunea codificatoare a transcriptelor exprimate de construcții va include codonul AUG de 15 inițiere a translării la începere și la terminare, codon poziționat specific la capătul polipeptidei ce va fi translată. 17 în plus, construcțiile pot conține regiuni de control care reglează la fel de bine cum generează expresia. în general, în conformitate cu multe procedee practicate în mod obișinuit, 19 astfel de regiuni vor opera prin controlarea transcripției, prin situsurile de legare ale represorilor și intensificatorilor (enhancers), printre alții. 21

Vectorii pentru propagare și expresie vor include, în general, markeri de selecție. Astfel de markeri pot fi, de asemenea, convenabili pentru amplificare sau vectorii pot conține 23 markeri adiționali pentru acest scop. în această privință, vectorii de expresie conțin de preferință una sau mai multe gene marker de selecție pentru furnizarea unei trăsături fenotipice 25 pentru selecția celulelor gazdă transformate. Markerii preferați includ rezistența la dihidrofolat reductază, neomicină, puromicină sau higromicină pentru culturile de celule eucariote și 27 genele de rezistență la tetraciclină, teomicină, kanamicină sau ampicilina pentru culturile de E. coli și alte bacterii. 29

Vectorul conținând secvența ADN specifică, așa cum a fost descrisă în prezenta, ca și promotorul specific și alte secvențe de control specifice, poate fi introdus într-o gazdă 31 specifică folosind o varietate de tehnici convenabile, binecunoscute pentru a exprima aici polipeptidă dorită. Exemple reprezentative de gazde adecvate includ celule bacteriene, 33 precum celule de E. coli, Streptomyces și Salmonella typhimurium; celule de fungi, precum celulele de drojdii; celule de insecte precum celulele de Drosophila S2 și Spodoptera Sf9; 35 celule animale precum celulele CHO, COS și celule de melanom Bowes; ca și celule vegetale și, de preferat, celulele de insecte BTI-TN-5B1-4. Gazdele pentru o mare varietate de con- 37 strucții de expresie sunt bine cunoscute și cei ce lucrează în domeniu vor fi capabili prin prezenta descriere să selecteze prompt o gazdă pentru exprimarea de polipeptide în conformitate 39 cu acest aspect al prezentei invenții.

Diferitele sisteme de culturi de celule de mamifere pot fi folosite la fel de bine pentru 41 expresia polipeptidelor. Exemplele de sisteme de expresie ale celulelor de mamifere includ liniile COS-7 de fibroblaste de rinichi de maimuță (Gluzman și colab., Ce//23:175,1991).AIte 43 linii celulare capabile de exprimarea unui vector compatibil includ, de exemplu, liniile celulare C127, 3T3, CHO, HeLa, linia 293 de rinichi uman și BHK. în celulele gazdă de mamifere, 45 poate fi utilizat un număr de sisteme de expresie bazate pe virusuri. în cazurile în care un adenovirus este folosit ca vector de expresie, secvența de polinuceotide codificatoare pentru 47 RG1 poate fi ligată într-un complex adenovirus de transcripție/translare constând din ultimul

RO 122543 Β1 promotor și secvența lider (leader) tripartită. Inserția în regiunea ne esențială E1 sau E3 a genomului viral va avea ca rezultat un virus viabil, capabil de exprimarea RG1 în celulele gazdă infectate (Logan and Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 81:3655-59,1984). în plus, intensificatorii transcripției, precum cel al virusului sarcomului Rous (RSV), pot fi utilizați pentru a crește expresia în celulele gazdă ale mamiferelor.

într-un mod mai special, prezenta invenție include și construcții recombinate, precum construcțiile de expresie cuprinzând una sau mai multe din secvențele descrise mai sus. Construcția cuprinde un vector, o plasmidă sau un vector viral, în care o astfel de secvență a invenției a fost inserată. Secvența poate fi inserată cu orientare spre înainte sau invers. în anumite realizări preferate din acest punct de vedere, construcția mai cuprinde și secvențe reglatorii, incluzând, de exemplu, un promotor linkat în mod operabil la secvență. Un mare număr de vectori și promotori convenabili sunt cunoscuți celor ce lucrează în domeniu și există mulți vectori disponibili comercial convenabili pentru utilizare în prezenta invenție.

Următorii vectori, disponibili comercial, sunt furnizați pe calea exemplului. Printre vectorii preferați pentru utilizare în bacterii sunt pQE70, pQE60 și pQE-9, disponibili de la Qiagen SUA(Valencia, CA); vectori pBS, vectori Phagescript®, vectori Bluescript®, pNHSA pNHI6a, pNHI8A, pNH46A, disponibili de la Stratagene (LaJolla, CA); și ptrc99a, pK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, disponibili de la Pharmacia Biotech (Piscataway, N.J.). Cel mai preferat este vectorul pTrcHisB, disponibil de la Invitrogen. Printre vectorii eucariotici preferați sunt pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXTI și pSG disponibili de ia Stratagene; și PSVK3, pBPV, pMSG și pSVL, disponibili de la Pharmacia Biotech. Cel mai preferat este vectorul pCIneo, disponibil de la Promega. Acești vectori sunt listați exclusiv pentru a ilustra cât de mulți și binecunoscuți vectori disponibili comercial sunt la îndemâna celor ce lucrează în domeniu pentru utilizare în conformitate cu acest aspect al prezentei invenții. Se consideră că orice alt pasmid sau vector convenabil, de exemplu, pentru introducerea, menținerea, propagarea sau exprimarea polinucleotidelor sau polipeptidelor invenției în gazdă poate fi utilizat în acest aspect al invenției.

Regiunile promotor pot fi selectate de la orice genă dorită folosind vectori care conțin o unitate de transcripție reporter” lipsită de o regiune promotor, cum ar fi unitatea de transcripție (“cat”) a cloramfenicol acetil transferază situată în aval de situsul de restricție sau de situsurile pentru introducerea fragmentului candidat promotor; adică, un fragment care poate conține un promotor. Așa cum bine se știe, introducerea în vector a fragmentului conținând promotorul la situsul de restricție din amonte de gena cât generează producerea de activitate CAT, care poate fi detectată prin testele standard CAT. Vectori convenabili pentru acest scop sunt bine cunoscuți și ușor disponibili. Doi astfel de vectori sunt pKK232-B și pCM7. Deci, promotorii pentru expresia polinucleotidelor prezentei invenții includ nu numai promotori bine cunoscuți și ușor disponibili dar și promotori care pot fi obținuți în mod rapid prin tehnica precedentă, folosind o genă “reporter”.

Printre promotorii bacterieni cunoscuți convenabili pentru expresia polinucleotidelor și polipeptidelor în conformitate cu prezenta invenție sunt promotorii Iaci și lacZ de E. coli, promotorii T3 și T7, promotorulT5 tac, promotorii PL, PRIambda, promotorul trp și promotorul hibrid trc, care este derivat din promotorii trp și lac. Printre promotorii eucariotici cunoscuți convenabili din acest punct de vedere sunt promotorul de început direct CMV (CMV immediate early promoter), promotorul HSV timidin-kinază, promotorii de început și ultim al SV40, promotorii LTR retroviral, precum cei ai virusului sarcomului Rous (RSV”) și promotorii metalotioneinei, precum promotorul metalotioneina-l.

Selecția de vectori și promotori adecvați pentru expresie în celula gazdă este o procedură bine cunoscută și tehnicile necesare pentru construcția vectorului de expresie, introducerea vectorului în gazdă și expresia în gazdă sunt curente în domeniu.

RO 122543 Β1 în general, vectorii de expresie recombinați vor include origini de replicare, un 1 promotor derivat din gena înalt exprimată pentru a ghida transcripția secvenței structurale din aval și un marker de selecție pentru a permite izolarea celulelor conținând vectorul după 3 expunerea la vector.

Prezenta invenție se referă și la celulele gazdă conținând construcțiile descrise mai 5 sus. Celula gazdă poate fi o celulă eucariotă superioară, precum celulele de mamifere, sau o celulă eucariotă inferioară, precum celula de drojdie, sau celula gazdă poate fi o celulă 1 procariotă, precum o celulă bacteriană. Construcțiile din celulele gazdă pot fi folosite într-un mod convențional pentru a produce gena produsului codificat de către secvența recombinată. 9

Polipeptidele pot fi exprimate în celule de mamifere, drojdii, bacterii sau alte celule sub controlul promotorilor adecvați. Sistemele de translare “cell-free pot fi de asemenea 11 folosite pentru a produce astfel de proteine folosind ARN-uri derivate din construcții ADN ale prezentei invenții. Vectori adecvați de donare și expresie pentru utilizare cu gazde procariote 13 și eucariote sunt descriși de Sambrook și colab., citat în prezenta.

Transcripția ADN-ului codificând polipeptidele prezentei invenții de către eucariotele 15 superioare poate fi crescută prin inserarea unei secvențe intensificatoare în vector. Intensificatorii sunt elemente “cisacting” de ADN, în mod obișinuit de la circa 10 la 300 bp 17 (perechi de baze), care acționează pentru creșterea activității inscripționale a promotorului într-un tip dat de celulă gazdă. Exemplele de intensificatori includ intensificatorul SV40, care 19 este localizat pe ultima latură a originii replicării de la perechea de baze 100 ta 270, intensificatorul promotorului de început al citomegalovirusului, intensificatorul polyoma pe 21 ultima latură a originii replicării și intensificatorii adenovirusurilor.

Polinucleotidele invenției, codificând secvența structurală heterologă a polipeptidei 23 din invenție, vor fi, în general, inserate în vector folosind tehnici standard astfel că aceasta să fie linkată în mod operabil de promotorul pentru expresie. Polinucleotida va fi poziționată 25 astfel încât situsul de începere al transcripției să fie localizat în mod specific la 5’ către situsul de legare a ribozomului. Situsul de legare a ribozomului va fi 5’ pentru AUG care inițiază 27 translarea polipeptidei ce va fi exprimată. în general, nu vor exista alte cadre de citire deschise care să înceapă cu un codon de inițiere, de obicei AUG, și să se întindă între situsul 29 de legare a ribozomului și codonul AUG de inițiere. De asemenea, în general, va fi un codon stop al translării la capătul polipeptidei și vor exista un semnal de poliadeniare și un semnal 31 de terminare a transcripției dispuse specific la capătul 3’ al regiunii transcrise.

Pentru secretarea proteinei translate în lumenul reticulului endoplasmic, în spațiu 33 periplasmic sau în mediul înconjurător extracelular, semnale de secretare proprii pot fi încorporate în polipeptida exprimată. Semnalele pot fi endogene pentru polipeptidă sau ele pot 35 fi semnale heterologe. Polipeptida poate fi exprimată într-o formă modificată, ca o proteină de fuziune, și poate include nu numai semnale de secretare, dar și regiuni adiționale funcțio- 37 nai heterologe. Astfel, de exemplu, o regiune de aminoacizi adiționali, în special încărcată cu aminoacizi, poate fi adăugată la N-terminal al polipeptidei pentru a ameliora stabilitatea și 39 persistența în celula gazdă în timpul purificării sau în timpul manipulării și depozitării ulterioare. De asemenea, regiuni specifice pot fi adăugate polipeptidei pentru a facilita puri- 41 ficarea. Astfel de regiuni pot fi înlăturate anterior preparării finale al polipeptidei. Adiția de părți peptidice la polipeptida pentru a provoca secreția sau excreția, pentru a ameliora stabilitatea 43 și a facilita purificarea, sunt, printre altele, tehnici familiare și de rutină în domeniu. De exemplu, când cantități mari de RG1 sunt necesare pentru inducerea de anticorpi, vor fi de dorit 45 vectori cu expresie directă la nivel înalt a proteinelor de fuziune care sunt purificate cu ușurință. Astfel de vectori includ, dar nu se limitează la, vectorii multifuncționali de donare și 47 expresie de E. coli precum Btuescript® (Statagene), în care secvența codificatoare rg 1 poate

RO 122543 Β1 fi ligată într-un vector în cadrul cu secvența pentru Met amino terminal și următoarele 7 reziduuri de β-galactozidază, astfel ca să se producă o proteină hibridă; vectorii pIN (Van Heede and Shuster, J.Biol. Chem. 264:5503-5509,1989) și alții asemenea. Vectorii PtrcHis (Invitrogen, Carlsbad, CA) pot fi utilizați pentru exprimarea polipeptidelor străine ca proteine de fuziune conținând tag-ul de polihistidină (6xHis) pentru o purificare rapidă. Proteinele fabricate în astfel de sisteme sunt proiectate să includă situsuri de clivaj, precum situsul de clivaj al enterokinazei, astfel ca polipeptidă de interes donată să poată fi eliberată la dorință din peptida de fuziune.

în urma transformării unei sușe de gazdă convenabilă și creșiterii acesteia la densități celulare potrivite, promotorii inductibili, dacă sunt prezenți, pot fi indus prin metode corespunzătoare (de exemplu, schimbarea temperaturii sau expunerea la inductori chimici) și celulele cultivate pentru o perioadă adițională.

Tipic, celulele sunt apoi recoltate prin centrifugare, sparte prin metode chimice sau fizice și extractul brut rezultat, reținut pentru purificări ulterioare.

Celulele microbiene folosite în exprimarea proteinelor pot fi sparte prin orice metodă convențională, incluzând cicluri de înghețare-dezghețare, sonicare, distrugere mecanică sau folosind agenți de liză celulară, astfel de metode fiind bine cunoscute celor ce lucrează în domeniu.

Polipeptidă RG1 poate fi recuperată și purificată din culturile de celule recombinate prin metode bine cunoscute ce includ precipitări cu sulfat de amoniu sau etanol, extracții acide, cromatografia cu schimbători anionici sau cationici, cromatografia pefosfoceluloză, cromatografia de interacțiune hidrofobică, cromatografia de afinitate, cromatografia pe hidroxilapatită și cromatografia pe lecitină. Cea mai preferată, cromatografia lichidă de înaltă performanță (“HPLC”) este folosită pentru purificare. Tehnici bine cunoscute pentru reîmpachetarea proteinei pot fi folosite pentru a regenera conformația activă atunci când proteina este denaturată în timpul izolării și purificării. Diferite alte metode de purificare a proteinei, bine cunoscute în domeniu, includ pe cele descrise de Deutscher, M., Methods in Enzymologyy, Voi. 182, Academic Press, San Diego, 1982; și Scopes. R., Protein Purification: Princip's and Practice Springr-Verlag, New York, 1982.

Alternativ, polipeptidele din prezenta invenție pot fi produse prin sinteza directa a peptidei folosind tehnicile fazei-solide (Stewart și colab., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freman Co., San Francisco, 1969; Merrifield, J., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963). Sinteza proteinei in vitro poate fi efectuată folosind tehnici manuale sau automate. Sinteza automată poate fi realizată, de exemplu, utilizând “Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer” (Perkin Elmer, Poster City, Calif) în conformitate cu instrucțiunile furnizate de producător. Fragmente diferite de RG1 pot fi sintetizate chimic în mod separat și combinate folosind metode chimice pentru producerea unei molecule de lungime completă.

Polipeptidele prezentei invenții includ produs naturali purificați, produși ai procedeelor de sinteză chimică și produși rezultați prin tehnici recombinate în gazde procariote sau eucariote, incluzând, de exemplu, celule bacteriene, de drojdii, de plante superioare, de insecte și de mamifere. Dependent de gazda utilizată în procedeul producerii de recombinați, polipeptidele prezentei invenții pot fi glicozilate sau pot fi neglicozilate. în plus, polipeptidele invenției pot include și un reziduu inițial de metionină modificată, în câteva cazuri ca rezultat al proceselor mediate de gazdă.

Utilizarea polipeptidelor RG1 g a polinucleotidelor ce conțin codificarea acestora

Polinucleotidele rg1 și polipeptidele RG1 pot fi utilizate în conformitate cu prezenta invenție pentru o gamă largă de aplicații, în special acelea care fac uz de proprietățile chimice și biologice a RG1. Aplicațiile adiționale se referă la diagnosticul și tratamentul bolilor de proliferare celulară, cum este cancerul de prostată. Aceste aspecte ale invenției sunt ilustrate mai departe prin discuțiile ce urmează și sunt descrise mai departe în interiorul specificațiilor.

RO 122543 Β1

Rațiunea pentru uzul secvențelorde polinucleotide și polipeptide ale prezentei invenții 1 se bazează în parte pe omologia chimică și structurală dintre RG1, descrisă în prezenta, și alte molecule ale matricei extracelulare și pe expresia preferențială a RG1 în țesutul de 3 prostată comparativ cu alte țesuturi. RG1 poate fi utilizat în diagnosticul și tratamentul condițiilor, tulburărilor sau bolilor asociate cu creșterea necorespunzătoare a țesutului de prostată. 5 Acestea ar include, dar fără să se limiteze la, cancerul și creșterea tumorilor metastazice.

Secvențele polinucleotidelor rg 1 pot fi utilizate ca sonde ADN, ca ținte pentru terapia 7 antisens și terapia cu ribozime sau ca matrițe pentru producerea de polinucleotide antisens.

Polipeptidele RG1 pot fi utilizate pentru a genera anticorpi la RG1 care pot fi utilizați 9 în detectarea nivelului de polipeptide RG1 în celule și țesuturi și în medicamente țintă pentru tumorile primare și metastazice. 11

Polipeptidele RG1 pot fi utilizate pentru a stimula un răspuns imun la celulele conținând RG1. 13

Polinucleotidele codificând RG1 pot fi utilizate în teste de diagnostic pentru detectarea nivelului de polinucleotide codificând Rg1 în celule și țesuturi. 15 în condiții asociate cu expresia RG1, precum cancerul de prostată, poate fi avantajos să suprimi expresia sau activitatea RG1. Expresia RG1 ar putea fi suprimată prin administra- 17 rea de oligonucleotide antisens sau de ribozime. Alternativ, anticorpi specifici în recunoaștereazonelordin polipeptida RG1 care sunt responsabile pentru activitatea ei pot fi administrate 19 pentru a trata bolile sau condițiile asociate cu activitatea RG1.

Teste cu polinucleotide 21

Această invenție se referă și la utilizarea polinucleotidelor înrudite cu rg1 pentru a detecta polinucleotidele complementare ca și, de exemplu, reactiv de diagnostic. Detectarea 23 de polinucleotide rg 1 asociate cu o stare de boală va furniza un instrument pentru dezvoltarea sistemului de diagnostic in vitro și in vivo care poate să se adauge sau să definească un 25 diagnostic de boală sau susceptibilitatea pentru o boală care rezultă din expresia specifică dețesutaRGI. 27

Indivizi purtători de mutații în gena codificând RG1 pot fi detectați la nivel ADN printr-o varietate de tehnici. Probele de polinucleotide pentru diagnostic pot fi obținute de la celulele 29 pacientului, cum arfi din sânge, urină, salivă, biopsie de țesut și material de la autopsie. ADN-ul genomic poate fi utilizat direct pentru detectare sau poate fi amplificat enzimatic prin utilizarea 31 PCR anterior analizei (Saiki și colab., Nature, 324:163-166,1986). ARN-ul sau ADNc-ul pot fi, de asemenea, utilizate în același mod. Ca un exemplu, primerii PCR complementari pentru 33 secvența de polinucleotide codificând RG1 pot fi folosiți pentru a identifica și analiza expresia și mutațiile rg 1. De exemplu, delețiile și inserțiile potfi detectate printr-o modificare în mărimea 35 produsului amplificat în comparație cu genotipul normal. Mutațiile punctuale potfi identificate prin hibridizarea ADN-ului amplificat cu secvențe de ARN rg 1 marcat radioactiv sau, alternativ, 37 cu secvențe de ADN rg1 antisens marcat radioactiv. Secvențele perfect împerecheate pot fi distinse de duplex-urile greșit împerecheate prin digestie cu RN-aza A sau prin diferențele 39 temperaturilor de topire.

Diferențele de secvență dintre gena de referință și genele având mutații pot fi de ase- 41 menea relevate prin secvențierea directă a ADN-ului. în plus, segmente de ADN donate pot fi folosite ca sonde pentru detectarea segmentelor specifice de ADN. Sensi bilitatea unor astfel 43 de metode poate fi mult sporită prin folosirea corespunzătoare a PCR sau a altor metode de amplificare. De exemplu, un primerdesecvențiere est folosit cu produsul PCRdublu-catenar 45 sau cu o moleculă matriță mono-catenară generată de un PCR modificat. Determinarea secvenței este efectuată prin procedee convenționale cu polinucleotide marcate radioactiv 47 sau prin procedee de secvențiere automate cu tag-uri fluorescente.

RO 122543 Β1

Testarea genetică bazată pe diferențele de secvență ADN poate fi realizată prin detectarea alterării în mobilitatea electroforetică a fragmentelor de ADN în gel, cu sau fără agenți de denaturare. Delețiile și inserțiile de mici secvențe pot fi vizualizate prin electroforeza de înaltă rezoluție în gel. Fragmentele de ADN ale diferitelor secvențe pot fi distinse în geluri de denaturare în gradient de formamidă, în care mobilitățile diferitelor fragmente de ADN sunt întârziate în gel la diferite poziții conforme cu temperaturile lor specifice de topire sau de topire parțială (vezi, de exemplu, Meyers și coiab., Science, 230:1242, 1985).

Modificările secvenței în locații specifice pot fi relevate și prin testele de protecție a nucleazei, precum protecția RN-azei și a S1 sau metoda clivajului chimic (Catton și coiab., Proc. Natf. Acad. Sci, SUA 85:4397-4401,1985).

Deci, detectarea secvenței de ADN specific poate fi realizată prin metode precum hibridizarea, protecția RN-azei, clivajul chimic, secvențierea directă a ADN-ului sau utilizarea enzimelor de restricție (de exemplu, polimorfisme de restricție ale lungimii fragmentului (restriction fragment length polymorphisms (“RFLP) și analiza Southern blot a ADN-ului genomic).

în plus față de mai convenționala electroforeza în gel și secvențierea ADN, mutațiile pot fi detectate și prin analiza in situ.

Teste cu polipeptide

Prezenta invenție se referă și la testele de diagnostic, cum sunt testele cantitative și de diagnostic pentru detectarea nivelelor de polipeptidă RG1 în celule, țesuturi și fluide ale corpului, incluzând determinarea nivelelor normale și anormale. Prin urmare, de exemplu, un test de diagnostic în conformitate cu invenția pentru detectarea supraexpresiei polipeptidei RG1 comparativ cu probele de țesut normal poate fi utilizat pentru a detecta prezența neoplaziei, de exemplu, a cancerului de prostată. Astfel de teste de diagnostic pot fi utilizate la fel de bine și pentru a detecta creșterea tumorii metastazice. Tehnicile de testare care sunt utilizate pentru a determina nivelul de polipeptide, precum polipeptidă RG1 din prezenta invenție, într-o probă derivată dintr-o gazdă sunt binecunoscute celor ce lucrează în domeniu. Astfel de metode de testare includ analiza radioimunologică (RIA), testele de legare competitive, analiza Western Blot și testele de imunoabsobanță a enzimei.linkate (enzyme-linkd immunoabsorbant assays, ELISA) și sortarea fluorescentă a celulelor activate (fluorescent activated cell sorting, FACS). Dintre acesta, frecvent sunt preferate testele ELISA. Un test ELISA cuprinde inițial prepararea unui anticorp specific pentru RG1, de preferat un anticorp monoclonal. în plus, se prepară, în general, și un anticorp “reporter”, care se leagă de anticorpul monoclonal. Anticorpul “reporter” este atașat la un reactiv detectabil precum un reactiv radioactiv, fluorescent sau enzimatic, în acest exemplu enzima peroxidaza de hrean.

Pentru a efectua un test ELISA proba este prelevată de la gazdă și incubată pe un suport solid, de exemplu, placă de polistiren, care leagă polipeptidele în probă. Orice situs liber de legare a polipeptidei de pe placă este apoi acoperit cu o proteină nespecifică, precum albumina serică de bovine, pentru incubare. în pasul următor, anticorpul monoclonal este incubat în placă pe durata de timp în care anticorpul monoclonal se atașează la oricare din polipeptidele RG1 atașate de placa de polistiren. Anticorpul monoclanal nelegat este îndepărtat prin spălare cu tampon. Anticorpul “repoter” linkat la peroxidaza de hrean este plasat pe placă rezultând legarea anticorpului “reporter de orice anticorp monoclonal legat de RG1. Anticorpul “reporter” neatașat este apoi eliminat pin spălare. Reactivii pentru activitatea peroxidazei, incluzând un substrat colorimetric sunt apoi adăugați pe placă. Peroxidaza imobilizată, linkată la RG1 prin anticorpii primari și secundari, produce un produs de reacție colorat. Cantitatea de culoare dezvoltată într-o perioadă de timp dată indică cantitatea de polipeptidă RG1 prezentă în probă. Rezultatele cantitative sunt obținute în mod tipic prin referire a curba standard.

RO 122543 Β1

Poate fi folosit și un test competitiv, în care anticorpii specifici la RG1 sunt atașați la 1 un suport solid, RG1 marcat și proba prelevată de la gazdă sunt plasate peste suportul solid și cantitatea de marker detectată și atașată la suportul solid poate fi corelată cu cantitatea 3 de RG1 din probă.

Aceste teste, ca și altele, sunt descrise, printre alții, de Hampton și colab., (Serological 5

Methods, A Laborator/Manual, APS Press, St Paul, Minn, 1990) și Maddoxși colab., (J. Exp. Med. 158:12111,1983). 7

Anticorpii

Mai departe, invenția se referă la anticorpii care se leagă specific de RG1, denumiți 9 în prezenta ca anticorpi RG1. Supraexpresia Rg1 în țesuturile de prostată și localizarea ei pe suprafața celulei reprezintă caracteristicile unui excelent marker pentru triere, diagnoză, 11 prognoză, teste de urmărire și metode de imagine. în plus, aceste caracteristici indică faptul că RG1 poate fi o țintă excelentă pentru metode terapeutice cum sunt terapia cu anticorpi 13 țintă, imunoterapia și terapia genelor. Așa cum este folosit în prezenta, termenul de “în mod specific legat la” se referă la interacțiunea anticorpului și a polipeptidei, în care interacțiunea 15 este dependentă de prezența unei structuri specifice (adică, determinant antigenic sau epitop) pe polipeptidă; cu alte cuvinte, anticorpul este recunoscut și legat la o structură specifică a 17 polipeptidei mai curând decât la proteine în general.

Polipeptidele RG1, fragmentele lor sau alți derivați sau analogi ai acestora sau celule 19 care le exprimă pe acestea pot fi folosite ca un imunogen pentru a produce anticorpi la acestea (Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Acești anticorpi pot fi, 21 de exemplu, anticorpi monoclonali sau policlonali. Prezenta invenție include și anticorpi himerici, cu un lanț unic, umanizați și umani ca și fragmente Fab sau produs ai bibliotecii de 23 expresii Fab. Diferite procedee cunoscute în domeniu pot fi utilizate pentru producerea de astfel de anticorpi sau fragmente. 25

Anticorpii generați contra polipeptidelor corespunzătoare unei secvențe din prezenta invenție pot fi obținuți prin injectarea directă a polipeptidelor în animal sau prin administrarea 27 polipeptidelor la un animal și, de preferat, nu unui om. Anticorpul astfel obținut se va lega apoi de polipeptidele înseși. în acest mod, chiar o secvență codificând numai un fragment de 29 polipeptide poate fi folosită pentru a genera anticorpi de legare a polipeptidelor native întregi. Asemenea anticorpi pot fi apoi utilizați pentru a izola polipeptidă din țesutul ce exprimă acea 31 polipeptidă.

Pentru prepararea de anticorpi monoclonali, orice tehnică prin care sunt furnizați 33 anticorpi produs prin culturi continue de linii celulare poate fi utilizată. Exemplele includ tehnica hibridoma (Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497,1975), tehnica hibridoma de 35 celule-B umane (Kozborși colab., Immunology Today 4:72,1983) și tehnic hibridoma-EBV pentru producerea anticorpilor monocionali umani (Cole și colab., în Monoclonal Antibodies 37 and Cancer, Aian R. Liss, Inc., 77-96, 1985).

în pus, tehnici dezvoltate pentru producția de anticorpi himerici”, de înnădire (splicing) 39 a genelor de anticorpi de șoarece la genele de anticorpi umani pentru a obține o moleculă cu specificitate antigenică și activitate biologică adecvată pot fi folosite (Morrison și colab., 41 Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 81:6851-6855,1984; Neuberger și colab., Nature, 312:604-608, 1984; Takeda și colab., Nature 314:452-454,1985). Alternativ, tehnicile descrise pentru pro- 43 ducerea de anticorpi cu lanț unic (US 4946778) pot fi adaptate pentru a produce anticorpi specific-RG1 cu lanț unic. 45 în afară de acestea, anticorpii “umani” pot fi produși utilizând metodele descrise în

US 5877397 și 5569825, care sunt încorporate în prezenta în totalitate prin trimitere. 47

RO 122543 Β1

Anticorpii pot fi produși și prin inducerea producției in v/vointr-o populație de limfocite sau prin trierea băncilor de imunoglobuline recombinate sau a listelor cu reactivi de legare de înaltă specificitate, prezentate de Orlandiacolab., (Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86:3833-3837, 1989) și de Winterand Mistein (Nature, 349:293-299,1991).

Pot fi de asemenea generate fragmente de anticorpi care conțin situsuri de legare specifice pentru RG1. De exemplu, astfel de fragmente includ, dar nu se limitează la, fragmentele F(ab’)2 care pot fi produse prin digestia cu pepsina a moleculei de anticorp și fragmentele Fab care pot fi generate prin reducerea punților disulfide ale fragmentelor F(ab’)2. Alternativ, bănci de expresie Fab pot fi construite pentru a permite identificarea rapidă și ușoară a fragmentelor monoclonale Fab cu specificitatea dorită (Huse a colab., Science, 256:1270-1281, 1989).

Secvența de aminoacizi a RG1 prezentată în prezenta poate fi folosită pentru a selecta regiuni specifice ale polipeptidei RG1 pentru generarea de anticorpi. Așa cum se va înțelege de către cei ce lucrează în domeniu, regiunile sau epitopurile polipeptidei RG1 spre care un anticorp este condus pot varia în funcție de aplicarea proiectată. De exemplu, anticorpii proiectați pentru utilizare în test imunologic pentru detectarea RG1-ului legat-de membrană de pe celulele prostatei ar fi direcționați spre epitopurile accesibile de pe polipeptidă RG1. Regiunile polipeptidei RG1 care prezintă structură imunogenă, lafel ca alte regiuni sau domenii, pot fi cu ușurință identificate folosind diferite alte metode cunoscute în domeniu, precum analizele Chou-Fasman, Garnier-Robson sau Jameson-Wolf. Fragmentele conținând aceste reziduuri sunt în mod special adecvate în generarea anticorpilor anti-RG1. Fragmentele utile în special includ, dar nu se limitează la, secvențele: PLGGESICSAGAPAKYSIT (Secv. ID. Nr. 8); HSSDYSMWRKNQYVS (Secv. ID. Nr. 10); DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV(Secv. ID. Nr. 11)șiNEIVDSASVPET (Secv. ID. Nr. 12). Generarea anticorpilor policlonali la aceste regiuni este descrisă în exemplul 4.

Anticorpii RG1 ai invenției pot fi în special utili în testele de diagnostic, în metodologiile de imagine și în metodele terapeutice pentru managementul cancerului de prostată. Invenția furnizează variate teste imunologice utile pentru detectarea polipeptidelor RG1 și pentru diagnoza cancerului de prostată. Astfel de teste conțin în general unul sau mai mulți anticorpi RG1 capabili de recunoașterea și legarea polipeptidei RG1. Anticorpii cei mai preferați se vor lega selectiv la RG1 și nu se vor lega (sau se vor lega slab) la polipeptidele ne-RG1. Testele includ formevariate ale testului imunologic, binecunoscute în domeniu incluzând, dar fără să se limiteze la, diferite tipuri de teste radioimunologice, teste de imunoabsorbanță cu enzime-linkate și alte asemenea. în plus, metode imunologice de imagine capabile de detectarea cancerului de prostată sunt de asemenea furnizate de invenție, incluzând, dar fără să se limiteze la, metodele de imagine radioscintigrafice folosind anticorpi RG1 marcați. Astfel de teste pot fi utile clinic în detectarea, monitorizarea și prognoza cancerului de prostată.

Anticorpii descris mai sus pot fi folosiți pentru a izola sau identifica clone exprimând polipeptidă sau pentru a purifica polipeptidă din prezenta invenție prin atașarea anticorpului la un suport solid pentru izolare și/sau purificare prin cromatografia de afinitate.

Suplimentar, anticorpii RG1 pot fi folosiți pentru a izola celule pozitive RG1 utilizând tehnici de sortare a celulelor și de purificare. în special, anticorpii RG1 pot fi folosiți pentru a izola celulele cancerului de prostată din țesutul tumoral al unei grefe străine (xenograft), din celule în cultură etc. folosind tehnica de sortare a celulelor pe anticorpi sau tehnica de purificare prin afinitate. Alte utilizări ale anticorpilor invenției includ generarea de anticorpi anti-idiotipici care mimează polipeptidă RG1.

Anticorpii RG1 pot fi utilizați pentru detectarea prezenței cancerului de prostată sau metastazelor tumorale. Prezența unor astfel de celule conținând RG1 în interiorul diferitelor

RO 122543 Β1 probe biologice, incluzând ser, specimene de biopsii de țesut de prostată și de alte țesuturi, 1 poate fi detectată cu anticorpi RG1. în plus, anticorpii RG1 pot fi utilizați în diferite metodologii de imagine, precum imunoscintigrafia cu anticorp conjugat cuTc-99m (sau alt izotop). De 3 exemplu, un protocol de imagine similar cu cel recent descris folosind un anticorp anti-PSMA conjugat cu In-111 poate fi folosit pentru detectarea carcinoamelor de prostată recurente și 5 metastazice (Sodee și colab., Clin. Nuc. Med., 21:759-766,1997).

Anticorpii RG1 ai invenției pot fi marcați cu un marker detectabil sau conjugat cu o a 7 doua moleculă, precum un agent citotoxic, și folosiți pentru țintirea celei de a doua molecule spre celula pozitivă RG1 (Vitetta, E.S. și colab., Immunotoxin Therapy, din DeVita, Jr.V.T. și 9 colab. editori, “Cancer: Principles and Practice of Oncolog/, a 4-a ediție, J.B. Lippincott Co„ Philadelphia, 2624-2636,1993). Exemplele de agenți citotoxici includ, dar nu se limitează la, 11 ricin, doxorubicin, daunorubicin, taxol, ethidium bromide, mitomicin, etoposide, tenoposide, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxi-antracin diona, actinomicina D, toxina difterică,13 exotoxina Pseudomonas (PE) A, PE40, abrin, glucocorticoizi și alți agenți chemoterapeutici, cum suntradioizotopii. Markerii detectabili adecvați includ, dar nu se limitează la, un radioizo-15 top, un compus fluorescent, un compus bioluminescent, un compus chemoluminescent, un chelator metalic sau o enzimă. Radioizotopii adecvați includ următorii izotopi: Antimoniu-124,17

Antimoniu-125, Arsenic-74, Bariu-103, Bariu-140, Beriliu-7, Bismut-7, Bismut-j206, Bismut207, Cadmiu-109- Cadmiu-115m, Calciu-45, Ceriu-139, Ceriu-141, Ceriu-144, Cesiu-137, 19 Crom-51, Cobalt-56, Cobalt-57, Cobalt-58, Cobalt-60, Cobalt-64, Erbium-169, Europium-152, Gadolinium-153, Aur-195, Aur-199, Hafnium-175, Hafnium-181, lndium-11, lod-123, lod-131, 21 lridiu-192, Fier-55, Fier-59, Kripton-85, Plumb-210, Mangan-54, Mercur-197, Mercur-203, Moilbden-99, Neodymium-147, Neptunium-237, Nichel-63, Niobium-95, Osmiu-185+191, 23

Paladiu-103, Platină-195m, Praseodymium-143, Promethium-147, Protactinium-233, Radiu2226, Rhenium-186, Rubidiu-86, Ruteniu-103, Ruteniu-106, Scandiu-44, Scandiu-46, Seleniu- 25

75, Argint-110m, Argint-11, Sodiu-22, Stronțiu-85, Stronțiu-89, Stronțiu-90, Sulf-35, Tantalum182, Technetium-99m, Teluriu-125, 1-132, Thallium-170, Thallium-204,Toriu-228, Toriu- 27 232, Tin-113, Titaniu-44, Tungstn-185, Vanadiu-48, Vanadiu-49, Ytterbium-169, Yttrium-90, Yttrium-91, Zinc-65 și Zirconiu-95. 29

Imunoterapia pentru cancerul de prostată

Invenția furnizează variate metode imunoterapeutice pentru tratarea cancerului de 31 prostată, incluzând abordări precum terapia cu anticorpi, vaccinurile in vivo o imunoterapia ex vivo, într-una din abordări, invenția furnizează anticorpi RG1 care pot fi folosiți sistematic 33 pentru a trata cancerul de prostată. De exemplu, anticorpii neconjugați RG1 pot fi introduși la pacient, astfel că anticorpul se leagă la RG1 de pe celule, din celule sau asociat cu celulele 35 cancerului de prostată și mediază distrugerea celulelor și a tumorii prin mecanisme care pot include citoliza mediată de complement, citotoxicitatea celulară dependentă de anticorp, 37 alterarea funcției fiziologice a RG1 și/sau inhibarea legării ligandului sau a căilor de transducție ale semnalului. Anticorpii Rg1 conjugați cu agenți toxici ca ricin sau radioizotopi pot fi și 39 ei utilizați terapeutic pentru a distribui agentul toxic direct la celulele tumorii de prostată înzestrate cu RG1 și pentru a distruge în felul acesta celulele tumorale. 41

Imunoterapia cancerului de prostată folosind anticorpi Rg1 poate urma învățămintele generate din diferitele abordări care au fost utilizate cu succes și în alte tipuri de cancer, 43 incluzând, dar fără să se limiteze la, cancerul colonului (Arten și colab., Crit. Rev. Immunol.

18:133-138,1998), mielomul multiplu (Ozaki și colab., Blood90:3179-3186,1997; T sunenari 45 și colab., Blood, 90:2437-2444, 1997), cancerul gastric (Kasprzyk și colab., Cancer Res. 52:2771-2776,1992), limfomul celulei-B (Funakoshi și colab., Immunther. Emphasis Tumor 47 Immunol 19:93-101,1996), leucemia (Zhong și colab., Leuk. Res. 20:581-588,1996), cancerul

RO 122543 Β1 colorectal (Moun și colab., Cancer Res. 54:6160-6166,1994; Veldersși colab., Cancer Res. 55:4398:4403,1995) și cancerul de sân (Shepard și colab., J. Clin. Immunol. 11:117-127, 1991).

Invenția mai furnizează și vaccinuri astfel formulate pentru a conține o polipeptidă RG1 sau un fragment ale acesteia. Utilizarea unui antigen tumoral în vaccin pentru generarea imunității tumorale și mediată-celular pentru folosire în terapia anti-cancer este binecunoscută în domeniu și a fost folosită în cancerul de prostată, utilizând imunogenii PSMA uman și PAP de rozătoare (Hodge și colab., Int. J. Cancer 63:231 -237,1995; Fong și colab., J. Immunol. 159:3113-3117,1997). Astfel de metode pot fi rapid practicate prin folosirea unei polipeptide RG1 sau a unui fragment al acesteia sau a unei molecule de acid nucleic codificând RG1 și a vectorilor recombinați capabili de exprimarea și prezentarea adecvată a imunogenului RG1.

De exemplu, sistemele virale de distribuție de gene pot fi folosite pentru a distribui o moleculă de acid nucleic codificând RG1. Diferitele sisteme virale de distribuiție de gene care pot fi utilizate în practicarea acestui aspect al invenției includ, dar nu se limitează la, virusurile: vaccinia, fowlpox (sifilisul păsărilor), canarypox (sifilisul canarilor) adenovirus, influenza (virusul gripal), poliovirus, adeno-associated virus, lentivirus (virusul lintei) și sindbus virus (Restifo, în Curr. Opin. Immunol. 8:658-663,1996). Sistemele de distribuție nevirale pot fi de asemenea folosite prin utilizarea de naked (dezgolit) ADN codificând o polipeptidă RG1 sau un fragment al acesteia introdus la pacient (de exemplu, intramuscular) pentru a induce un răspuns anti-tumoral. într-una din realizări, ADNc-ul rg1 uman de lungime completă poate fi utilizat. în altă realizare, fragmente de ADNc rg1 umane pot fi folosite. Iar în altă realizare, molecule de acid nucleic rg1 codificând epitopuri ale limfocitelor T specifice (CTL) pot fi utilizate. Epitopurile CTL pot fi determinate folosind algoritmi specifici (de exemplu, Epimer, Brown University) pentru a identifica peptideîn interiorul polipeptidei Rg1 care sunt capabile de legare optimă la alelele specificate HLA.

Diferite strategii ex vivo pot fi de asemenea folosite. O abordare implică utilizarea celulelor dendritice pentru a prezenta polipeptidă RG1 ca antigen pentru sistemul imun al pacientului. Celulele dendritice exprimă clasa I și II a MHC, co-stimulatorul B7, IL-12 și sunt, prin urmare, celule prezentând antigen înalt specializate, în cancerul de prostată, celule “autologous” dendritice, pulsate cu peptide, ale antigenului de membrană specific-prostată (PSMA) au fost utilizate în procesul clinic al fazei I, pentru a stimula sistemele imune ale pacienților cu cancer de prostată (Tjoa și colab., Prostate 28:65-69, 1996; Murphy și colab., Prostate 29:371 -380,1996). Celulele dendritice pot fi folosite pentru a prezenta polipeptidele RG1 celulelor T în contextul moleculelor MHC din clasa I și II. într-o realizare, celulele dendritice autologous sunt pulsate cu polipeptide RG1 capabile de legare la molecule MHC. în altă realizare, celulele dendritice au fost pulsate cu polipeptide RG1 complete. încă o altă realizare a implicat manipularea prin inginerie genetică a supraexpresiei genei rg1 în celulele dendritice folosind diferiți vectori de implementare cunoscuți în domeniu, precum adenovirusul (Arthurși colab., CancergeneTher.4:17-25,1997), retrovirusul(Henderson și colab., Cancer Res. 56:3763-3770, 1996), lentivirus, virusul adeno-asociat, transfecția de ADN (Ribas și colab., Cancer Res. 57:2865-2869,1997) și transfecția de ARN derivat din tumoare (Ashley și colab., J. Exp. Med. 186:1177-1182,1997).

Anticorpi anti-idiotipici anti-RG1 pot fi de asemenea folosiți în terapia anti-cancer ca un vaccin pentru a induce un răspuns imun celulelor exprimând o polipeptidă RG1. în mod specific, generarea de anticorpi anti-idiotipici este bine cunoscută în domeniu și poate fi rapid adaptată pentru a genera anticorpi anti-idiotipici anti-RG1 care mimează un epitop pe polipeptidă RG1 (vezi, de exemplu, Wagner și colab., Hybridoma, 16:33-40, 1997; Foon și colab., J. Clin, invest. 96:334-342, 1995; Herlyn și colab., Cancer Immunol. Immunother. 43:65-76,1996). Astfel de anticorpi anti-idiotipici pot fi utilizați în terapia anti-idiotipică la fel cum se practică în prezent cu alți anticorpi anti-idiotipici direcționați contra antigenilortumorali.

RO 122543 Β1

Metodele de imunizare genetică pot fi folosite pentru a genera răspunsuri imune 1 tumorale și celulare profilactice sau terapeutice îndreptate contra celulelor canceroase exprimând RG1. Folosind moleculele ADN codificând RG1 descrise în prezenta, construcții cuprin- 3 zând ADN codificând o polipeptidă/imunogen RG1 și secvențe reglatoare specifice pot fi injectate direct în mușchiul sau pielea unui individ, astfel ca celulele din mușchi sau piele să 5 absoarbă construcția și să exprime polipeptidă/imunogenul RG1 a cărui codificare este conținută de construcție. Polipeptida/imunogenul RG1 poate fi exprimată ca o polipeptida de 7 suprafață a celulei sau poate fi secretată. Expresia polipeptidei/imunogenului RG1 are ca rezultat generarea de imunitate umorală și celulară, profilactică și terapeutică contra 9 cancerului de prostată. Pot fi folosite diferite tehnici de imunizare genetică profilactică și terapeutică, cunoscute în domeniu (vezi informațiile și referințele publicate pe adresa de 11 internet www.qenweb.com).

Oligonucleotide anti-sens, vectori antisens și ribozime 13

Polinucleotidele anti-sens complementare la rg1 pot fi preparate sintetic. Astfel de oligonucleotide pot fi distribuite în celule cu sau fără lipide, care pot ajuta la pătrunderea 15 oligonucleotidelor anti-sens în celule.

Alternativ, vectorii de expresie derivați din retrovirusuri, adenovirusuri, virusurile 17 herpesului sau vacciniei sau din diferite plasmide bacteriene pot fi de asemenea utilizate pentru construcția și distribuirea de vectori recombinați care vor exprima rg1 anti-sens. Vezi, 19 de exemplu, tehnicile descrise de Sambrook și colab., și Ausubel și colab. (deja menționați mai sus). 21

Polinucleotidele cuprinse în secvența ADNc de lungime completă și/sau elementele ei reglatoare permit cercetătorilor să utilizeze polinucleotidele rg1 ca un instrument de investi- 23 gare în catenele sens (Youssoufian and Lodish, Mol. Cell. Biol. 13:98-104,1993) sau catenele antisens (Eguchi și colab., Annu. Rev. Biochem 60:631-652,1991) pentru reglarea funcției 25 genei. O astfel de tehnologie este acum binecunoscută în domeniu și oligomerii sens și antisens sau fragmente mai mari pot fi proiectate pentru locații diferite de-a lungul regiunilor 27 codificatoare sau de control.

Genele codificând RG1 pot fi oprite prin transfecția celulei sau țesutului cu vectori de 29 expresie care exprimă nivele înalte ale fragmentului dorit de polinucleotida rg1. Astfel de construcții pot inunda celulele cu secvențe netranslabile sens sau antisens. Chiar în absența 31 integrării în ADN, astfel de vectori pot continua să transcrie molecule ARN până când toate copiile sunt scoase din circulație de către nucteazele endogene. Expresia tranzitorie poate 33 dura o lună sau mai mult cu un vector nereplicativ și chiar mai mult dacă elementele de replicare specifice sunt parte din sistemul vectorului. 35

Așa cum s-a menționat mai sus, modificarea expresiei genei poate fi obținută prin proiectarea de molecule anti-sens, ADN sau ARN, pentru regiunile de control ale rg1, adică, 37 promotori, intensificatori și introni. Sunt preferate oligonucleotidele derivate din situsul de inițiere a transcripției, de exemplu, dintre regiunile -10 și +10 ale secvenței lider. Molecule 39 antisens pot fi, de asemenea, proiectate pentru a bloca translarea ARNm prin împiedicarea transcriptului de la legarea de ribozomi. Similar, inhibarea poate fi realizată folosind metodo- 41 logia “triplu helix” a împerecherii bazelor, împerecherea triplu helix compromite abilitatea heixului dublu de a se deschide suficient pentru legarea polimerazelor, factorilor de 43 transcripție sau moleculelor reglatoare. Avansurile recente din terapeutică datorate utilizării de ADN triplex au fost analizate de către Gee, J. E. și colab. (în Huber and Car, Molecular 45 and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY., 1994).

Ribozimele sunt molecule de ARN enzimatic, capabile dea cataliza clivajul scindarea) 47 specific al ARN-ului (US 4987071; WO 93/23057).

RO 122543 Β1

Mecanismul de acțiune al ribozimelor implică hibrdizarea secvență-specific a moleculei de ribozim cu ARN-ul țintă complementar, urmată de scindarea endonucleolitică. în prezenta invenție sunt prezente molecule de ribozime modificate prin inginerie genetică după model “hammerhead” (cap în formă de ciocan) care potîn mod specific și eficient să catalizeze scindarea endonucleolitică a ARN-ului codificând RG1. Situsurile de clivaj specifice unui ribozim din oricare potențial ARN țintă sunt inițial identificate prin scanarea moleculei țintă pentru situsurile de clivaj ale ribozimei, care includ secvențele următoare: GUA, GUU și GUC. Odată identificate, secvențe scurte de ARN, între 15 și 20 de ribonucleotide corespondente cu regiunea genei țintă conținând situsul de clivaj pot fi evaluate pentru trăsăturile structurale secundare care pot faceoligonucleotidele inoperabile. Adaptabilitatea țintelor candidate poate fi de asemenea evaluată prin testarea accesibilității la hibridizarea cu oligonucleotide complementare folosind testele de protecție cu ribonucleaze (Ireie și colab., Advance. Pharmacol. 40:207-257, 1997).

Moleculele antisens și ribozimele din invenție pot fi preparate prin orice metodă cunoscută în domeniu pentru sinteza de molecule ARN. Acestea includ tehnici pentru sintetizarea chimică a oligonucleotidelor, precum sinteza chimică tip solid phase phosphoramidite (cu fosforamidită în faza solidă). Alternativ, molecule ARN pot fi generate prin tanscripții in vitro și in vivo sau cu secvențe ADN codificând RG1. Astfel de secvențe ADN pot fi încorporate într-o largă varietate de vectori cu promotori convenabili de ARN polimerază precum T7 sau SP6. Alternativ, construcții ADNc antisens care sintetizează ARN antisens constitutiv sau indus pot fi introduse în linii celulare, celule sau țesuturi.

Moleculele de ARN pot fi modificate pentru creșterea stabilității intracelulare și a duratei de înjumătățire a vieții. Modificările posibile includ, dar nu se limitează la adăugarea de secvențe de flancare la capetele 5' și/sau 3’ al moleculelor sau la folosirea de legături tip fosforotioat (phosphorothioate) sau 2’ O-metil mai degrabă decât de legături tip fosfodiesteraze în scheletul moleculei. O stabilitate crescută poate fi realizată și prin includerea de baze netradiționale ca inosine și queosine, ca și de acetil-, metil-, thio- și forme modificate similar ale adeninei, citidinei, guaninei, timinei și uridinei care nu mai sunt așa de ușor de recunoscut de către endonucleazele endogene.

Metodele pentru introducerea vectorilor antisens în celule și țesuturi includ acele metode discutate mai departe și care sunt la fel de convenabile pentru terapia in vivo, in vitro o ex vivo. Pentru terapia ex vivo, vectorii antisens sunt introduși în celule prelevate de la pacient și propagate prin donare pentru a fi transplantate “autologus înapoi la același pacient, după cum rezultă din brevetele US 5399493 și 5437994, prezentate prin referințe în invenție. Distribuirea prin transfecție sau prin lipozomi sau alți agenți pe bază sau nu de lipide este binecunoscută în domeniu.

Teste pentru identificarea agenților de legare la RG1

Prezenta invenție se referă și la testele și metodele care pot fi utilizate pentru a identifica agenți care se leagă la RG1. în mod specific, agenții care se leagă la Rg1 pot fi identificați prin abilitarea ligandului RG1 sau a unui alt agent sau constituent de a se lega la RG1 și/sau la abilitatea de a inhiba/stimula activitatea RG1.

Agenții care se leagă la polipeptidă RG1 pot fi identificați folosind sistemul drojdiei “two-hibrid” sau testul “binding capture”, de prindere a legăturii. în sistemul two-hibrid al drojdiei, o unitate de expresie codificând o proteină de fuziune, construită dintr-o subunitate cu un factor de transcripție din două subunități și polipeptidă RG1, este introdusă și exprimată în celula de drojdie. Celula este modificată mai departe pentru a conține (1) o unitate de expresie codificând un marker detectabil a cărui exprimare necesită factorul de transcripție cu două subunități pentru expresie și (2) o unitate de expresie care codifică proteina de fuziune

......· · · · · r-.· —.·«·.. >. *r:.î-----.··

RO 122543 Β1 construită dintr-o a doua subunitate a factorului de transcripție și un segment donat al ADN. 1 Dacă segmentul donat al ADN codifică o proteină care se leagă la polipeptidă RG1, expresia rezultă din interacțiunea RG1 și proteina codificată. Aceasta aduce cele două subunități ale 3 factorului de transcripție în proximitate de legare, permițând reconstituirea factorului de transcripție. Aceasta conduce la exprimarea markerului detectabil. Sistemul two-hibrid al 5 drojdiei este în mod particular util la trierea bibliotecii de segmente ce codifică ADNc pentru partenerii de legare a RG1. 7

Polipeptidele RG1 care pot fi folosite în testele de mai sus includ, dar nu se limitează la, o polipeptidă RG1 izolată, un fragment de polipeptidă RG1, o celulă care a fost alterată 9 pentru a exprima polipeptidă RG1 sau o fracție a celulei care a fost alterată pentru a exprima polipeptidă RG1. Mai mult, polipeptidă RG1 poate fi o polipeptidă întreagă sau un fragment 11 definit din polipeptidă RG1. Se va considera de către cineva care lucrează în mod obișnuit în domeniu că atâta timp cât polipeptidă RG1 poate fi testată pentru agentul de legare, de 13 exemplu printr-o variație în greutatea moleculară sau activitate, prezentul test poate fi utilizat.

Metoda utilizată pentru a identifica dacă un agent/component celular se leagă la 15 polipeptidă RG1 se va baza în primul rând pe natura polipeptidei RG1 folosite. De exemplu, un test pe gel retard poate fi folosit pentru a determina dacă un agent se leagă la RG1 sau 17 la un fragment al acesteia. Suplimentar, tehnologii de imunodetecție și biocip pot fi adoptate pentru utilizare cu polipeptidă RG1. Un specialist în domeniu poate folosi cu ușurință nume- 19 roasele tehnici cunoscute în domeniu pentru a determina dacă un agent specific se leagă la polipeptidă RG1. 21

Agenți și componente celulare pot fi testate mai departe pentru abilitatea de a modula activitatea polipeptidei RG1 folosind un sistem de testare cell-free sau un sistem de testare 23 celular. în aceeași măsură în care activitățile polipeptidei RG1 devin mai cunoscute, pot fi folosite teste funcționale bazate pe activitate identificată. 25

Așa cum s-a folosit în prezenta, un agent numit a antagoniza activitatea RG1 este agentul care reduce activitatea RG1. Antagonistul preferat va antagoniza selectiv RG1, 27 neafectând nici o altă proteină celulară. Mai mult antagonistul preferat va reduce activitatea RG1 cu mai mult de 50%, mai preferabil cu mai mult de 90% și cel mai preferabil va elimina 29 de tot activitatea RG1.

Agenții care sunt testați în metoda de mai sus pot fi selectați la întâmplare, selectați 31 rațional sau proiectați. Așa cum este folosit în prezenta, un agent este numit selectat întâmplător când agentul care este ales la întâmplare, fără a lua în considerare secvențele 33 specifice polipeptidei RG1. Un exemplu de agenți selectați întâmplător este folosirea bibliotecii chimice, a bibliotecii de peptide combinatorii, bulionul de creștere al unui organism sau un 35 extract vegetal.

Așa cum este folosit în prezenta, un agent numit a fi selectat sau proiectat rațional 37 este agentul care este ales pe baze neîntâmplătoare, care țin cont de secvența situsului țintă și/sau de conformația lui în legătură cu acțiunea agentului. Agenții pot fi selectați rațional sau 39 proiectați rațional prin utilizarea secvențelor de peptide care formează polipeptidă RG 1. De exemplu, un agent peptidic selectat rațional poate fi o peptidă a cărei secvență de aminoacizi 41 este identică cu a unui fragment din polipeptidă RG1.

Agenții testați în metodele prezentei invenții pot fi, de exemplu, peptide, anticorpi, 43 oligonucleotide, derivați de molecule mici și vitamine ca și carbohidrați. Un specialist în domeniu poate recunoaște cu ușurință că nu există limită la natura structurală a agenților utilizați 45 în metoda prezentă de triere. O clasă de agenți ai prezentei invenții sunt agenți peptidici ale căror secvențe de aminoacizi sunt alese pe baza secvenței de aminoacizi a polipeptidei RG1. 47

RO 122543 Β1

Agenții peptidici pot fi preparați folosind metodele standard de sinteză a peptidei în fază solidă (sau fază lichidă), după cum se cunoaște în domeniu. în plus, ADN-ul codificând aceste peptide poate fi sintetizat folosind instrumentele comercial disponibile pentru sinteza de oligonucleotide și pot fi produs recombinați utilizând sistemele standard de producție recombinată. Producția folosind sinteza peptidelor în faza solidă este necesară dacă au fost inclus aminoacizi necodificați de genă.

O altă clasă de agenți ai prezentei invenții sunt anticorpii imunoreactivi cu poziții decisive ale polipeptidei RG1. Așa cum a fost descris mai sus, anticorpii sunt obținuți prin imunizarea cu peptide a subiecților mamalieni corespunzători, conținând ca regiuni antigenice acele porțiuni ale polipeptidei RG1 intenționate a fi țintite de anticorpi. Astfel de agenți pot fi utilizați în studii de legare competitivă pentru identificarea agenților inhibitori din a doua generație ca și pentru a bloca activitatea RG1.

Extractele celulare testate prin metodele prezentei invenții pot fi, de exemplu, extracte apoase de celule sau țesuturi, extracte organice de celule sau țesuturi sau fracții celulare parțial purificate. Specialistul poate recunoaște cu ușurință că nu există limită în ceea ce privește sursa pentru extractele celulare utilizate în metoda de triere a prezentei invenții.

Agenți care se leagă la polipeptidă RG1, precum anticorpii RG1, pot fi utilizați pentru a modula activitatea RG1 pentru a ținti agenții anticancer spre celulele specifice ale mamiferelor sau pentru a identifica agenți care blochează interacțiunea cu RG1. Celule exprimând RG1 pot fi țintite sau identificate prin folosirea unui agent care se leagă la RG1.

Modul în care agenții care se leagă de RG1 vor fi utilizați depinde de natura agentului de legare la RG1. De exemplu, un agent de legare la RG1 poate fi utilizat pentru: distribuirea de toxine conjugate, precum toxina difterică, toxina holerei, exotoxina din ricin sau Pseudomonas, la celule exprimând RG1; a modula activitatea RG1; ă omorî direct celula exprimând RG1; sau în trieri pentru identificarea agenților de legare competitivi. De exemplu, un agent inhibitor RG1 poate fi folosit pentru a inhiba direct creșterea celulelor care exprimă RG1 în timp ce un agent de legare la RG1 poate fi utilizat ca agent de diagnostic.

Compoziții farmaceutice g pentru administrare

Prezenta invenție se referă și la compozițiile farmaceutice care pot conține polinucleotide rg 1, polipeptide RG1, anticorpi, agoniști, antagoniști sau inhibitori, singuri sau în combinație cu cel puțin un alt agent, cum ar fi un compus de stabilizare, care poate fi administrat într-un purtător steril, biocompatibil farmaceutic, incluzând, dar fără a se limita la, soluție salină, soluție salină tamponată, dextroză și apă. Oricare dintre aceste molecule poate fi administrată pacientului singură sau în combinație cu alți agenți, medicamente sau hormoni, în compoziții farmaceutice în care este amestecat cu excipient(ți) sau putători acceptabili farmaceutic. într-o realizare a prezentei invenții, purtătorul acceptabil farmaceutic este inert farmaceutic.

Prezenta invenție se referă și la administrarea compozițiilor farmaceutice. O astfel de administrare este efectuată oral sau parenteral. Metodele de distribuire parenterală includ administrarea topică: intra-arterial (direct în tumoare), intramuscular, subcutanat, intramedular, intrathecal, intraventricular, intravenos, intraperitoneal sau intranazal. în plus față de ingredientele active, aceste compoziții farmaceutice pot conține purtători convenabili, acceptabili farmaceutic cuprinzând excipienți și auxiliare care facilitează procesarea compușilor activi în preparatele ce pot fi folosite farmaceutic. Mai multe detalii asupra tehnicilor pentru formulare și administrare pot fi găsite în ultima ediție a Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co. Easton, Pa.).

Compozițiile farmaceutice pentru administrare orală pot fi formulate folosind purtătorii acceptabili farmaceutic binecunoscuți în domeniu în doze convenabile administrării orale. Astfel

RO 122543 Β1 de purtători permit compozițiilor farmaceutice să fie formulate ca tablete, pilule, drajeuri, 1 capsule, lichide, geluri, siropuri, emulsii, suspensii și alte asemenea, pentru a fi ingerate de către pacient. 3

Preparatele farmaceutice pentru uz oral pot fi obținute prin combinarea compușilor activi cu un excipient solid, măcinarea opțională a amestecului rezultat și a amestecului în 5 granule, după adăugarea de auxiliari convenabili, după obținerea de miez pentru tablete sau drajeuri. Excipienții convenabili sunt materiale de umplutură de tip carbohidrați sau proteine, 7 precum: zaharurile, incluzând lactoza, sucroza, manitolul sau sorbitolul; amidonul din porumb, grâu, orez, cartof sau alte plante; celuloza ca metil-celuloză, hidroxipropilmetil-celuloză sau 9 carboximetilceluloza de sodiu; gume incluzând guma arabică și tragacanth; proteine precum gelatina și colagenul. Dacă se dorește, pot fi adăugați agenți de dezintegrare sau solubilizare, 11 cum sunt polivinil pi rol idona cross-linked, agarul, acidul alginic sau o sare a acestuia, precum alginatul de sodiu. 13

Miezurile de drajeuri sunt furnizate cu învelișuri convenabile precum soluțiile de zahăr concentrate, care pot conține și gumă arabică, talc, polivinil pirolidona, gel carbopol, 15 polietilenglicol și/sau dioxid de titan, soluții de lac și solvenți organici convenabili sau amestecuri de solvenți. Pot fi adăugate materii colorante sau pigmenți la învelișurile tabletelor sau 17 drajeurilor pentru identificarea produsului sau pentru a caracteriza cantitatea de compus activ, adică doza. 19

Preparatele farmaceutice care pot fi utilizate oral includ capsulele “push-fit” făcute din gelatină ca și capsule moi, închise etanș făcute din gelatină și un înveliș de glicerol sau 21 sorbltol. Capsulele push-fit pot conține ingredienți activi amestecați cu materiale de umplutură sau lianți precum lactoza sau amidonul, lubrifianți precum talcul sau stearatul de magneziu 23 și, opțional, stabilizatori. în capsulele moi, compuși activi pot fi dizolvați sau suspendați în lichide convenabile, precum uleiuri grase, parafină lichidă sau polietilen glicol lichid, cu sau 25 fără stabilizatori.

Formulările farmaceutice pentru administrare parenterală includ soluții apoase ale 27 compușilor activi. Pentru injecții, compozițiile farmaceutice al invenției pot fi formulate în soluții apoase, de preferat în tampoane compatibile fiziologic ca soluția Hank sau Ringer sau ser 29 fiziologic tamponat. Suspensiile apoase injectabile pot conține substanțe care cresc viscozitatea suspensiei, precum carboximetil celuloza de sodiu, sorbitol sau dextran. Suplimentar, 31 suspensiile de compus activi pot fi preparate și ca suspensii injectabile uleioase adecvate. Solvenții lipofilici convenabili sau vehiculele includ uleiuri grase, ca uleiul de susan sau esteri 33 sintetici ai acizilor grași, precum etil oleatul, trigliceridele sau lipozomii. Opțional, suspensiile pot conține și stabilizatori convenabili sau agenți care cresc solubilitatea compușilor pentru 35 a permite prepararea de soluții foarte concentrate.

Pentru administrarea topică sau nazală, sunt utilizați în formule penetranți proprii bari- 37 erei specifice ce va fi traversată. Astfel de penetranți sunt în general cunoscuți în domeniu.

Kituri 39

Invenția se referă, mai departe, la pachetele și kiturile farmaceutice cuprinzând unul sau mai multe containere umplute cu unul sau mai multe ingrediente ale compozițiilor mai 41 sus menționate ale invenției. Asociat cu astfel de containere poate fi o notă scrisă de către agenția guvernamentală ce reglementează fabricarea, folosirea sau vânzarea de produse 43 farmaceutice sau biologice, reflectând aprobarea agenției pentru fabricarea, folosirea sau vânzarea produselor pentru administrare la om. 45

Fabricare și depozitare

Compozițiile farmaceutice ale prezentei invenții pot fi fabricate într-un mod cunoscut 47 în domeniu, adică prin metode convenționale de amestecare, dizolvare, granulare, fabricare de drajeuri, decantare, emulsifiere, încapsulare, captare și liofilizare. 49

RO 122543 Β1

Compozițiile farmaceutice pot fi furnizate și ca o sare ce poate fi formată cu acizi, incluzând dar fără să se limiteze la, acidul clorhidric, sulfuric, lactic, tartric, malic, succinicetc. Sărurile tind a fi mai solubile în soluții apoase sau în alți solvenți protonici care sunt formele bazice libere corespondente. în alte cazuri, preparatul preferat poate fi o pudră liofilizată în 1 mM - 50 mM histidină, 0,1%...2% zaharoză, 2%...7% manitol la un pH situat de la 4,5 la 5,5, pudră care este combinată cu tamponul înainte de utilizare.

După ce compozițiile farmaceutice, conținând un compus al invenției formulat cu un purtător convenabil, au fost preparate, ele pot fi plasate într-un container corespunzător și etichetate pentru tratament în condiția indicată. Pentru administrarea RG1, o astfel de etichetare va include cantitatea, frecvența și metoda de administrare.

Doza eficientă terapeutic

Compozițiile farmaceutic potrivite pentru utilizare în prezenta invenție includ compozițiile în care ingredientele active sunt conținute într-o cantitate eficientă pentru a realiza scopul intenționat, adică tratamentul unei stări specifice de boală, caracterizată prin expresia RG1. Determinarea dozei eficiente se află în grija celor ce lucrează în domeniu.

Pentru oricare compus, doza eficientă terapeutic poate fi estimată inițial fie pe teste de culturi celulare, adică celule neoplazice, fie pe modele animale, de obicei șoareci, iepuri, câini sau porci. Modelul animal este utilizat și pentru a realiza o gamă de concentrații dorite și calea de administrare. O astfel de informație poate fi apoi folosită pentru a determina doza utilă și căile de administrare la om.

Doza eficientă terapeutic se referă la acea cantitate de proteine sau de anticorpi ai acesteia, de antagonici sau inhibitori care ameliorează simptomele sau condiția. Eficacitatea terapeutică și toxicitatea acestor compuși poate fi determinată prin procedee farmaceutice standard pe culturi celulare sau pe animale de laborator, de exemplu, DE₅₀ (doza terapeutică eficientă în 50% din populație) și DL₅₀ (doza letală în 50% din populație). Indexul terapeutic este raportul dintre doza terapeutică și efectele toxice și poate fi exprimat ca raport DE₅₀/DL₅₀. Compozițiile farmaceutice care etalează indici terapeutici mari sunt preferate. Datele obținute din testele de culturi celulare și studiile pe animal sunt utilizate în formularea unei game de doze pentru uz uman. Doza unor asemenea compuși se situează de preferință în interiorul gamei de concentrații circulante care include un DE₅₀ cu toxicitate mică sau fără toxicitate. Doza variază în interiorul acestei game dependent de forma dozei utilizată, sensibilitatea pacientului și calea de administrare.

Doza exactă este aleasă de către medicul pacientului ce va fi tratat. Doza și administrarea sunt ajustate pentru a furniza nivele suficiente de parte activă sau pentru menținerea efectului dorit. Factorii adiționali care pot fi luați în calcul includ severitatea stării de boală, adică, mărimea tumorii și localizarea; vârsta, greutatea și genul pacientului; dieta, timpul și frecvența de administrare, combinația(iile) de medicamente, sensibilitatea de reacție și toleranța/răspunsul la terapie. Compoziții farmaceutice cu acțiune de lungă durată ar putea fi administrate la fiecare 3-4 zile, în fiecare săptămână sau odată la fiecare două săptămâni, dependent de durata de înjumătățire a vieții compusului și de rata de eliminare a formulei specifice.

Cantitățile dozei normale pot varia de la 1 la 100.000 pg până la doza totală de circa 1 g, dependent de calea de administrare. Conducerea spre specifice și metodele de distribuire sunt furnizate de literatură. Vezi brevetele US 4657760; 5206344; sau 5225212. Cei ce lucrează în domeniu vor folosi formulări diferite pentru polinucleotide față de cele pentru proteine sau inhibitorii acestora. Similar, distribuirea de polinucleotide sau polipeptide va fi specifică pentru celule speciale, condiții speciale, localizări speciale etc.

RO 122543 Β1

Prezenta invenție este descrisă mai departe prin următoarele exemple. Exemplele 1 sunt furnizate exclusiv pentru a ilustra invenția prin referire la realizări specifice. Aceste exemplificări, în timp ce ilustrează anumite aspecte specifice ale invenției, nu înfățișează exact 3 limitările sau circumscrierile scopului invenției expuse.

Toate exemplele au fost efectuate folosind tehnici standard, care sunt binecunoscute5 și obișnuite celor ce lucrează în domeniu, în afară de acelea care au fost descrise detaliat altfel. Tehnicile de biologie moleculară de rutină ale exemplelor ce urmează au fost efectuate7 după descrierile din manualele standard de laborator, precum Sambrook și colab.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Ed. II; Cold Sping Harbor Laboratory Press, Cold Spring 9 Harbor, N.Y., 1989.

Exemplul 1. Identificarea polinucleotidei umane rg111 rg1 a fost identificat ca o genă exprimată în prostată prin cercetarea bazei de date

Incyte’s LifeSeq. Secvența de nucleotide a fost identificată prin cercetarea adnotărilor din 13 baza de date, folosind instrumentul “Protein Function” furnizat de către Incyte în scopul cercetării bazei de date. Secvența de nucleotide a fost găsită în categoria moleculelor de aderență 15 celulară în baza de date adnotată și a fost descrisă ca un omolog de f-spondin. Analiza Electronic Northern a distribuției secvențelor de polinucleotide rg1 în setul bibliotecii din baza 17 de date relevă că rg1 a fost exprimat la nivele înalte în biblioteca de prostată și la nivele inferioare într-un număr de bănci de alte țesuturi, incluzând pe cele din țesuturi normale și 19 tumorale.

în urma asamblării setului de clone rg1 din baza de date într-o secvență de 21 polinucleotide contiguă și a editării secvenței contigue, o secvență codificatoare de lungime completă a fost identificată în presupusa polinucleotidă asamblată. Această secvență a 23 codificat o proteină omoloagă cu f-spondin și cu Mindin-2.

Clonele Incyte 1640796,1712252 și 1880265 au fost obținute din Incyte pentru lucrări 25 experimentale și clona 3360733 a fost identificată ca având secvența cu cele mai multe nucleotide 5’. Această clonă a fost secvențială în întregime și a conținut toată secvența de 27 codificare pentru presupusa proteină RG1. Această secvență este prezentată în fig. 1 (SECV. ID. Nr.: 1). 29

Exemplul 2. Expresia ARNm rg1

Expresia ARNm rg1 dintr-o varietate de probe de țesut normal și tumoral și din linii 31 celulare a fost determinată prin PCR semicantitativ folosind testul Taqman (Perkin-Elmer). Probele de țesut normal, benign și tumoral de prostată care au fost clasificate conform cu 33 sistemul de clasificare Gleason modificat, care a fost obținut de la Departamentul de Urologie al Școlii de Medicină de la Universitatea Stanford. ARN a fost izolat din acestea prin proce- 35 dee standard. ARN-ul din alte țesuturi normale și tumorale a fost procurat din surse comerciale incluzând Clonetech și Biochain. Liniile celulare tumorale de prostată (PC-3, LNCaP 37 și DU 145) au fost obținute din American Type Culture Collection și propagate în cultură prin metode standard folosind mediu care conține ser. Tumorile de grefă străină derivate din 39 aceste linii celulare au fost plasate în șoareci lipsiți de păr și recoltate de la șoareci după aproximativ 4-6 săptămâni de la implantare. ARN-ul a fost izolat din tumori prin procedee 41 standard.

Analiza Taqman bazată pe analiza PCR a fost efectuată folosind primerii; CGC GCA 43 TAG CTC CGA CTA C (SECV. ID. Nr.: 3) și GCC GCG TCC GCA AAG (SECV. ID. Nr.: 4) și sonda Taqman: 6-FAM-AGG AAG AAC CAG TAC GTC AGT AAC GGG CTG-Tamra 45 (SECV. ID. Nr.: 5).

Acești primeri și sonda au fost proiectați folosind software Perkin-Elmer's Primer 47 Express și au fost sintetizați prin Synthetic Genetics. Reacțiile PCR au fost efectuate pentru

RO 122543 Β1

30-40 de cicluri și cuantificate folosind ARN de prostată pentru a genera o curbă standard pentru comparație relativă. Această analiză a demonstrat că ARNm de rg1 a fost detectat în cea mai mare cantitate în prostată și la nivele semnificativ mai scăzute în câteva alte țesuturi (vezi fig. 5).

Exemplul 3. donarea și expresia RG1 în celulele BHK

Regiunea codificatoare RG1 a fost obținută cu plasmida Incyte 3360733 codificatoare a fost amplificată PCR cu primerii SST115 (5’-TCCCTCTAGAGCCACCATGGAAAACCCC AGCCCGGC-3') (SECV. ID. Nr.: 6) și SST113 (5-AAGGCATCACGTGTTAGACGCAGTTAT CAGGGACG-3’) (SECV. ID. Nr.: 7) într-o reacție standard PCR (100 μΙ) folosind 1x Pfu tampon polimerază Turbo (Stratagene, La Jolla, CA)/200 μΜ dNTPs/0,2 pM primer de oligonucleotide/2,5 U Pfu polimerază Turbo (Stratagene). Condițiile de amplificare PCR au fost următoarele: 3 min. la 95’C, (15 s la 95°C, 30 s la 60’C, 2 min. la 72’C) x 35,72‘C pentru 7 min. Produsul rezultat din amplificarea PCR a fost purificat folosind o coloană PCR QIAquick (Qiagen, Valencia, CA) și supus digestiei cu enzimele de restricție Xbal și Pmll pentru a rezulta un fragment de 1010 pb care a fost purificat pe gel de agaroză 1% folosind Kitul B1O101 GeneClean (Vista, CA). Fragmentul purificat a fost ligat (folosind Kitul Epicenter Fast Link, (Epicenter, Madison, Wl) la vectorul de expresie noncitopatic Sindbis pSINrep21 (Agapov și colab., 1998, PNAS95:12989-12994) supus digestiei cu Xbal și Pmll și transformat în celule competente alpha DH5 (Life Technologies, Gaithersburg, CA) și selectat pe plăci de agar LB conținând ampicilină (100 pg/ml). O astfel de colonie rezistentă la ampicilină a fost crescută pe mediu LB cu ampicilină și a demonstrat prin analiza de secvență că conține secvența codificatoare inserată RG1. Această plasmidă a fost numită pPEG6.

Două micrograme de pPEG6 au fost utilizate pentru a transfecta 1 -3 x 10⁵ celule renale de hamster baby, celule (BHK) folosind reactivul Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD)în conformitate cu instrucțiunile de fabricație, în urmatransfecției, celulele au fost incubate pe DMEM plus ser de sânge fetal pentru 24 - 48 h, timp după care celulele au fost scindate 1 la 10 și selecția pentru celulele conținând plasmida a fost inițiată prin adăugarea de puromicină (concentrație finală 2,5 pg/ml) și DMEM conținând ser. După ce celulele au devenit confluente (4-5 zile după adăugarea de puromicină), celulele au fost spălate cu PBS, scindate 1 la 10 și a fost adăugat mediu DMEM cu ser și 5 pg/ml puromicină. După 2-3 zile suplimentare, mediul a fost înlocuit cu mediu DMEM și 5 pg/ml puromicină fără ser, celulele crescute pentru 2-3 zile și prezența proteinei RG1 a fost detectată în mediu prin analiza Western folosind anticorpi RG1. Proteina RG1 a fost detectată la un nivel de 1 pg/mL

Exemplul 4. Generarea de anticorpi

Antiser policlonal de iepure a fost testat contra a cinci secvențe sintetice de polipeptide derivate din secvența proteică RG1. Aceste secvențe au fost selectate pentru pozițiile lor preconizate de la suprafața proteinei, în vederea generării de antiser care este mult mai verosimil în a recunoaște epitopuri de suprafață. Reziduurile de cisteină sunt înlocuite cu acid aminobutiric (Abu) pentru a ajuta sinteza. Secvențele de aminoacizi specifice, poziția pe proteina RG1 și desemnarea celor 5 peptide este listată mai jos.

Desemnare	Poziție	Secvența de aminoacizi
C	28-46	PLGGESICSAGAPAKYSIT (SECV. ID. Nr.: 8)
2C	46-64	TFTGKWSQTAFPKQYPLFR(SECV. ID. Nr.; 9)
3C	77-91	HSSDYSMWRKNQYVS (SECV. ID. Nr.: 10)
4C	188-210	DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV(SECV. ID. Nr.: 11)
5C	263-274	NEIVDSASVPET (SECV. ID. Nr.: 12)

RO 122543 Β1

Peptidele au fost cuplate covalent la hemocianină de melc (Patella) (KLH), prin 1 intermediu unei cisteine carboxiterminală, pentru utilizare ca imunogen. Similar, conjugat de albumină serică bovină (BSA) a fost preparat pentru analiza titrurilor de antiser prin ELISA. 3

Două animale au fost imunizate cu fiecare peptidă. Imunizările inițiale au fost făcute în adjuvant complet Freunds (0,5 mg/animal), urmate de întăriri la intervale de 3 săptămâni 5 cu 0,25 mg/animal în adjuvant incomplet Freunds, aplicate intramuscular. Au fost făcute sângerări detestare periodică și titrurile anticorpilor contra conjugatului specific BSA-peptidă 7 a fost măsurate prin ELISA și comparate cu serul preimun. Antiserul contra peptideior 1C și 3C s-a demonstrat a fi activ. Antiserul contra peptidei 2C nu a recunoscut polipeptidă RG1. 9

Antiserul contra peptideior 4C și 5C nu a fost testat.

Anticorpii monoclonali umani contra RG1 au fost generați prin imunizarea de șoareci 11 transgenici contra peptideior RG1 și a proteinei de fuziune RG1 6-histidine-taged exprimată în E. coli. Splenocitele acestor animale au fost fuzionate cu celule de mielom pentru a pro- 13 duce celule hibridoma. Hibridoamele rezultate au fost triate prin ELISA pentru cele care produc anticorpi direcționați contra peptideior și proteinei RG1. 15

Exemplul 5. Analiza Western blot a anticorpilor

Antiserul a fost testat pentru specificitate RG1 cu ajutorul metodei Westen blot. 17 Antiseruri specifice RG1 (cele contra secvențelor 1C și 3C, de mai sus) au fost testate pentru RG1 exprimattranzitoriu în celule COS, pentru RG1 nativ secretat de celulele LNCaP și pentru 19

RG1 produs de celulele de rinichi de hamster baby (BHK) transfectate. Antiserurile specificRG1 au fost, mai departe testate pe lizate preparate din tumori LNCaP, celule LNCaP, tumori 21

PC3, celule PC3 și câteva probe clinice de tumori de prostată umană. Celulele și țesuturile au fost lizate în tampon detergent. După fierbere timp de 5 min. 10 μΙ din fiecare lizat a fost 23 încărcat în gel de poliacrilamină-SDS 12% pentru a separa proteinele. Proteinele separate au fost apoi transferate pe membrane de nitroceluloză. Specificitatea de legare a anticorpilor 25

RG1 a fost verificată prin legare în prezența peptideior omoloage și heterologe. Antiserul specific RG1 a putut detecta proteina în toate probele dar în celulele PC3 și tumorile PC3. 27

Exemplul 6. Purificarea proteinei native RG1 secretată de celulele LNCaP Prin analiza Western blot s-a arătat că celule LNCaP crescute în cultură secretă 29 proteina nativă RG1. în vederea purificării proteinei native, celulele au fost crescute pentru 48 h pe mediu lipsit de ser. Acest mediu condiționat prin lipsa serului (serum free) a fost 31 recoltat, centrifugat pentru a îndepărta orice celulă și concentrat de aproximativ 50 de ori prin ultrafiltrare. Mediul concentrat a fost apoi diluat de 10 ori cu 20 mM tampon acetat de sodiu, 33 pH 6,5 și încărcat într-o coloană cu schimbători anionici Q-Sepharose. Eluția coloanei a constat într-un gradient de clorură de sodiu (0,5% pe minut) cu colectarea de fracții de 2,0 ml. 35

Proteina RG1 a fost eluată la aproximativ 75mM Na CI așa cum a fost determinata prin Western blot și SDS-PAGE. Proteina nativă RG1 a migrat la greutate moleculară ușor mai 37 scăzută față de proteina de fuziune RG1 -6 histidină exprimată în bacterie probabil pentru că îi lipsește proteina de fuziune. 39

Exemplul 7. Colorația imunohistochimică a expresiei RG1

Expresia proteinei RG1 a fost determinată prin LifeSpan Biosciences, Inc. într-o 41 varietate de țesuturi umane, incluzând rinichi, plămân, pancreas, mușchi, creier și prostată. Suplimentar, țesuturi de prostată au fost obținute de la Departamentul de Urologie de la 43 Stanford University Schoot din Stanford și testate la Berlex. Secțiunile de țesut au fost deparafinate folosind procedee standard. Anticorpul policlonal RG1-3C a fost folosit ca 45 anticorp primar și sistemul de detecție a constat din folosirea kitului Vector ABC-AP (AK5002) cu kit Vector Red Substrate (Sk5002). Ca martor negativ, colorația a fost efectuată în absența 47 anticorpului primar.

RO 122543 Β1

Toate publicațiile și brevetele menționate în specificația de mai sus sunt încorporate în prezenta prin trimiteri. în timp ce prezenta invenție a fost descrisă cu referire la realizările specifice ale acesteia, se va considera de cei ce lucrează în domeniu că diferite modificări pot fi făcute și echivalenții pot fi substituiți fără îndepărtare de la adevăratul spirit și scop al acestei invenții. în plus, multe modificări pot fi făcute pentru a adapta o situație specială, material, compoziții ale materialelor, procese, pas procesual sau pași la obiectivul, spiritul și scopul prezentei invenții. Se va considera că astfel de modificări sunt cuprinse în scopul revendicărilor anexate la aceasta.

Claims

Revendicări

1. Anticorp izolat sau fragment de anticorp, care se leagă specific la o polipeptidă, caracterizat prin aceea că polipeptidă menționată este un membru selectat dintr-un grup care constă din:

a) o polipeptidă care cuprinde de la aminoacidul 28 la aminoacidul 46 așa cum este reprezentat în SECV. ID. Nr.: 2;

b) o polipeptidă care cuprinde de la aminoacidul 77 la aminoacidul 91 așa cum este reprezentat în SECV. ID. Nr.: 2;

c) o polipeptidă care cuprinde de la aminoacidul 188 la aminoacidul 210 așa cum este reprezentat în SECV. ID. Nr.: 2;

d) o polipeptidă care cuprinde de la aminoacidul 263 la aminoacidul 274 așa cum este reprezentat în SECV. ID. Nr.: 2; și
2. Anticorp în conformitate cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea că acesta se leagă specific la secvența de aminoacizi PLGGESICSAGAPAKYSIT (SECV. ID. Nr.: 8).
3. Anticorp în conformitate cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea că acesta se leagă specific la secvența de aminoacizi HSSDYSMWRKNQYVS (SECV. ID. Nr.: 10).
4. Anticorp în conformitate cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea că acesta se leagă specific la secvența de aminoacizi DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (SECV. ID. Nr.: 11).
5. Anticorp în conformitate cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea că acesta se leagă specific la secvența de aminoacizi NEIVDSASVPET (SECV. ID. Nr.: 12).
6. Anticorp în conformitate cu oricare din revendicările de la 1 la 5, caracterizat prin aceea că anticorpul este un anticorp policlonal.
7. Anticorp în conformitate cu oricare din revendicările de la 1 la 5, caracterizat prin aceea că anticorpul este un anticorp monoclonal.
8. Imunoconjugat care cuprinde un anticorp izolat sau un fragment de anticorp definit în revendicarea 1, conjugat la un agent terapeutic.
9. Imunoconjugat în conformitate cu revendicarea 8, caracterizat prin aceea că anticorpul sau fragmentul de anticorp se leagă specific la secvența de aminoacizi PLGGESICSAGAPAKYSIT (SECV. ID. Nr.: 8).
10. Imunoconjugat în conformitate cu revendicarea 8, caracterizat prin aceea că anticorpul sau fragmentul de anticorp se leagă specific la secvența de aminoacizi HSSDYSMWRKNQYVS (SECV. ID. Nr.: 10).
11. Imunoconjugat în conformitate cu revendicarea 8, caracterizat prin aceea că anticorpul sau fragmentul de anticorp se leagă specific la secvența de aminoacizi DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (SECV. ID. Nr.: 11).

RO 122543 Β1
12. Imunoconjugat în conformitate cu revendicarea 8, caracterizat prin aceea că 1 anticorpul sau fragmentul de anticorp se leagă specific la secvența de aminoacizi NEIVDSASVPET (SECV. ID. Nr.: 12). ’3
13. Imunoconjugat în conformitate cu oricare dintre revendicările 8-12, caracterizat prin aceea că anticorpul este un anticorp policlonal.5
14. Imunoconjugat în conformitate cu oricare dintre revendicările 8-12, caracterizat prin aceea că anticorpul este un anticorp monoclonal.7
15. Imunoconjugat în conformitate cu oricare dintre revendicările 8-14, caracterizat prin aceea că agentul terapeutic este un agent citotoxic.9
16. Imunoconjugat în conformitate cu revendicarea 15, caracterizat prin aceea că agentul citotoxic este selectat din grupul care constă din ulei de ricin, doxorubicin, 11 daunorubicin, taxol, bromură de etidiu, mitomicină, etopozid, tenopozid, vincristină, vinblastină, colchicină, dihidroxiantracen-dionă, actinomicină D, toxina difterică, exotoxina 13 Pseudomonas (PE) A, PE40, abrin, glucocorticoid și radioizotopi.
17. Imunoconjugat în conformitate cu revendicarea 8, caracterizat prin aceea că 15 fragmentele de anticorpi sunt selectate dintr-un grup care constă din fragmente Fv și F(ab’).
18. Utilizarea unui imunoconjugat definitîn revendicarea 8 pentru fabricarea unei corn- 17 poziții pentru distrugerea selectivă a celulei care exprimă polipeptidă în SECV. ID. Nr.: 2, prin reacția imunoconjugatului cu celula, astfel încât agentul terapeutic din imunoconjugat poate 19 distruge celula.
19. Utilizarea unei cantități eficiente terapeutic din imunoconjugatul definitîn revendi- 21 carea 8 pentru fabricarea unei compoziții pentru tratamentul unei stări de boală la un pacient uman, în care starea de boală este asociată cu expresia RG1. 23
20. Utilizarea unui anticorp sau fragment de anticorp definit în revendicarea 1, pentru detectarea metastazei cancerului de prostată la un pacient, caracterizată prin aceea că 25 utilizarea cuprinde:

a) obținerea unei probe biologice de la un pacient,27

b) punerea în contact a probei cu anticorpul sau fragmentul de anticorp definit în revendicarea 1,29

c) detectarea anticorpului sau a fragmentului de anticorp care se leagă la polipeptidă RG1 umană din probă, și31

d) determinarea nivelului de legare la pacientul respectiv față de nivelul normal, o creștere în nivelul de legare fiind un indicator al metastazei de cancer de prostată.33
21. Utilizare în conformitate cu revendicarea 19, în care starea de boală este cancerul de prostată.35
22. Utilizarea unui anticorp sau fragment de anticorp definit în revendicarea 1 pentru diagnosticarea cancerului de prostată la un pacient, caracterizată prin aceea că utilizarea 37 cuprinde:

a) obținerea unei probe biologice de la un pacient,39

b) punerea în contact a probei cu anticorpul sau fragmentul de anticorp definit în revendicarea 1,41

c) detectarea anticorpului sau fragmentului de anticorp care se leagă la polipeptidă RG1 umană din probă, și43

d) determinarea nivelului de legare la pacientul respectiv față de nivelul normal, o creștere în nivelul de legare fiind un indicator al cancerului de prostată.45
23. Utilizarea unui anticorp sau fragment de anticorp definit în revendicarea 1 pentru diagnosticarea metastazei cancerului de prostată la un pacient, caracterizată prin aceea 47 că utilizarea cuprinde:

RO 122543 Β1

a) introducerea, la un pacient, a unui anticorp sau fragment de anticorp radiomarcat, care se leagă în mod specific la unul sau mai mulți epitopi prezenți într-o polipeptidă RG1 umană care are secvența de aminoacizi SECV. ID. Nr.: 2,

b) detectarea legăturii anticorpului sau fragmentului de anticorp radiomarcat la unul sau mai mulți epitopi prezenți în polipeptidă RG1 umană la pacientul respectiv, și

c) determinarea nivelului de legare la pacient față de martorii normali, o creștere în nivelul de legare, la pacientul respectiv, peste nivelurile din martorii normali fiind un indicator al cancerului de prostată.
24. Utilizare în conformitate cu revendicarea 23, în care radiomarkerul este selectat dintr-un grup care constă din ⁴³Sc, ⁴⁴Sc, ⁵²Fe, ⁵⁵Co, ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu, ⁸⁶Y, ^Tc, ¹¹¹ln și “Y.
25. Utilizare în conformitate cu revendicarea 23, în care legarea anticorpului sau a fragmentului de anticorp radiomarcat este detectată prin imunoscintigrafie.
26. Utilizare în conformitate cu revendicările 20 sau 22, în care anticorpul sau fragmentul de anticorp este marcat cu un compus selectat dintr-un grup care constă dintr-un radiomarker, oenzimă, un cromoforși un agent fluorescent, astfel încât să se producă în mod direct sau indirect, un semnal detectabil.
27. Anticorp conform revendicărilor 1,2,3,4,5,6 sau 7, pentru utilizare ca medicament.
28. Imunoconjugat conform revendicărilor8,9,10,11,12,13,14,15,16 sau 17, pentru utilizare ca medicament.