PL207634B1 - Wyizolowane przeciwciało, immunokoniugat i jego zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy wyizolowanych przeciwciał lub ich fragmentów oraz immunokoniugatu obejmującego wyizolowane przeciwciało i jego zastosowania.

Rak prostaty jest chorobą często występującą u mężczyzn, jest spotykany u około jednej trzeciej mężczyzn po 45 roku życia. Są też dowody na istnienie przyczyn genetycznych i środowiskowych, większość przypadków jest prawdopodobnie wynikiem kombinacji obu czynników. Badania nowotworów w rodzinach sugerują, że predyspozycje genetyczne odgrywają rolę w około 5-10% wszystkich przypadków i w około 45% przypadków u mężczyzn w wieku poniżej 55 lat.

Istnieją dowody, że rak prostaty rozwija się jako choroba wieloetapowa a jednym z prekursorowych uszkodzeń jest śródbłonkowe powstawanie nowotworu prostaty (PIN). Wczesne stadia choroby są zależne od androgenu, podczas gdy późniejsze stadia już nie są zależne od hormonów. Klinicznie często wykrywa się proliferacyjne zaburzenie prostaty znane jako łagodny rozrost prostaty ale prawdopodobnie nie jest to stadium rozwojowe raka. Jest jednak często powiązane z rakiem prostaty. Nowotwory prostaty są często wieloogniskowe, na ogół wolno rosnące i heterogenne. Rak w późnych stadiach często daje przerzuty do węzłów chłonnych i do kości.

Rak prostaty jest na ogół diagnozowany przez badania fizyczne i poziom w surowicy antygenu specyficznego dla prostaty (PSA). Radykalna prostatektomia jest leczeniem z wyboru dla choroby zlokalizowanej. Zaawansowana choroba z przerzutami jest obecnie leczona przez usunięcie androgenów indukowane przez wycięcie jąder lub leczenie GnRH (hormonem uwalniającym gonadotropinę) i przez terapię anty-androgenami. Jednak zaawansowana choroba niemal zawsze staje się oporna na hormony i nie ma lekarstwa na postęp choroby. Co więcej, istnieją poważne efekty uboczne związane zarówno z radykalną prostatektomią i terapią usuwania androgenów. Obejmują one wysokie ryzyko nietrzymania moczu i impotencji związane z radykalną prostatektomią, złamania kości i osteoporozę związane z terapią z usuwaniem androgenów.

Istnieje więc istotna potrzeba nowego podejścia do terapii wczesnych i późnych stadiów raka prostaty. Istnieje też potrzeba nowych czynników diagnostycznych, w szczególności czynników, które mogą dyskryminować stadia choroby, jako że to ma znaczący wpływ na wybór terapii.

Na przykład, jeśli choroba występuje poza prostatą i są przerzuty do węzłów chłonnych, nie przeprowadza się radykalnej prostatektomii, bo nie ma to wpływu na progresję a może mieć znaczne niepożądane efekty uboczne. Czynnik, który mógłby wykrywać przerzuty in vivo miałby duże znaczenie.

Wykazano zmiany ekspresji specyficznych białek przy raku prostaty, w tym nieprawidłową ekspresję p53 w późnych stadiach raka prostaty, obniżone poziomy receptorów TGF-β, obniżone poziomy E-kadheryny, C-Cam (cząsteczki adhezji komórek) i kilku integryn. Ekspresja onkogenu bcl-2 jest uderzająco podwyższona w późnych stadiach guzów niezależnych od androgenów, i prognoza dla pacjentów z ekspresją wysokich poziomów bcl-2 jest stosunkowo słaba. Podczas gdy uprzednio wymienione zmiany w ekspresji genów są dobrze udokumentowane, nie zidentyfikowano zmian w ekspresji, które są przyczyną choroby. Byłoby więc użyteczne zidentyfikowanie nowych białek, których ekspresja jest związana z obecnością lub rozwojem raków prostaty, które by mogły posłużyć jako cele molekularne dla diagnozy i terapii raka prostaty.

Wynalazek ujawnia nowy homolog do super-rodziny zewnątrzkomórkowych białek macierzy. Ten homolog zwany RG1 jest wyrażany w tkance prostaty i może ulegać nadekspresji w guzach prostaty.

Macierz zewnątrzkomórkowa jest złożoną siecią kolagenu i elastyny umieszczonych w wiskoelastycznej substancji podstawowej złożonej z proteoglikanów i glikoprotein. Macierz istnieje jako trójwymiarowy szkielet wspierający, który izoluje kompartmenty tkanek, bierze udział w przyczepianiu komórek i określa architekturę tkanek (Bissel i wsp., J. Theor. Biol. 99:31-68, 1982; Carlson i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 787:2403-2406, 1981). Macierz działa jako filtr makromolekularny (Hay, E.D., Cell Biology of Extracellular Matrix, New York, Plenum Press, 1982) i także wpływa na różnicowanie komórek, mitogenezę i morfogenezę (Gospodarowiczs D., Cancer Res., 38:4155-171, 1978). Interakcje biochemiczne między prawidłowymi komórkami i macierzą mogą być zmienione w nowotworach i może to wpływać na proliferację guza. Komórki guza mogą oddziaływać z macierzą na różne sposoby. Po pierwsze komórki guza mogą przyłączać się do macierzy za pomocą specyficznych receptorów błon plazmatycznych (Terranova i wsp., Cancer Res. 42:2265-2269). Po drugie, w degradacji macierzy bierze udział kaskada enzymów, które pochodzą z komórki guza i z gospodarza (Eisen i wsp., Biochim. Biophys. Acta 151:637-645, 1968).

PL 207 634 B1

Po trzecie, w zróż nicowanych obszarach guza komórki guza mogą syntetyzować i akumulować macierz lub indukować komórkę gospodarza do nagromadzania nadmiaru macierzy (Brownstein i wsp., Cancer 40: 2979-2986, 1977).

RG1 wykazuje homologię do nadrodziny białek macierzy zewnątrzkomókowej, kodowanych przez geny Mindyny/F-spodyny. Rodzinę genów łączą dwie konserwatywne domeny spondyny, FS1 i FS2, w pobliż u N-koń ca lub przynajmniej jedno powtórzenie trombospondyny typu 1 (TSR1) na C-końcu (Shimeld, S.M. Mol. Biol. Evol. 15(9): 1218-1223, 1998). Motyw TSR oryginalnie stwierdzono w białkach zewnątrzkomórkowej macierzy kręgowców (Bernstein, P., J. Cell. Biol. 130:503-506, 1995) i następnie został znaleziony w kilku innych białkach macierzy zewnątrzkomórkowej. Istnieje kilka rodzajów dowodów, że TSR biorą udział w adhezji komórek i odgrywają kluczową rolę w kancerogenezie. Na przykład, wykazano, że fragmenty proteolityczne trombospondyny, które zawierają TSR i syntetyczne peptydy mające sekwencje odpowiadające regionowi TSR trombospondyny promują adhezję i przerzuty komórek guza (Prater i wsp., J. Cell. Biol. 112:1031-1040, 1991; Tuszynski i Nicosia, BioEssays 18:71-76, 1996), mają aktywność przeciwangiogenną (Tolsma i wsp., J Cell. Biol. 122:497-511, 1993) i hamują agregację płytek i przerzuty czerniaka (Tuszynski i wsp., J. Cell. Biol. 116:209-217, 1992).

Obecnie członkowie tej nadrodziny obejmują gen Caenorhabditis elegans, pojedynczy gen u Drosophila i wielokrotne geny u krę gowców. U C. elegans gen F10E7.4 koduje pięć FSR oprócz domen FS1 i FS2 (Higashijama i wsp. Dev. Biol. 192:211-227, 1997). U Drosophila członek rodziny określany jako M-spondyna (mspo) zawiera domeny FS1 i FS2 i pojedynczy TSR (Umemiya i wsp., Dev. Biol. 186:165-176, 1997). Gen M-spondyny koduje wydzielane białko, które jest zlokalizowane w miejscach przyczepu mięśni i wydaje się działać jako zewnątrzkomórkowe białko macierzy, które podtrzymuje przyłączenie mięśnie-apodema. Członkowie rodziny u kręgowców obejmują geny izolowane z Brachydanio rerio (Mindyna-1 i Mindyna-2, F-spondyna 1 i F-spondyna 2), F-spondynę szczura (Klar i wsp.. Cell 69:95-110. 1992) i F-spondynę Xenopus i mindynę szczura. Mindyna1 i Mindyna2 są blisko ze sobą spokrewnione i mają strukturę genu podobną do M-spondyny Drosophila. Oba geny Mindyna 1 i Mindyna 2 kodują pojedynczy TSR oprócz domen FS1 i FS2 (Higashijama i wsp., Dev. Biol. 192:211-227, 1997).

Geny F-spondyny 1 i F-spondyny 2 Brachydanio rerio, F-spondyny szczura (Klar i wsp., Cell 69:95-110, 1992) i F-spondyny Xenopus (Altaba i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:8268-8272) wszystkie mają podobne struktury kodując sześć kopii TSR oprócz domen FS1 i FS2. U kręgowców nadrodzina Mindyna/F-spondyna może być podzielona na dwie grupy: geny blisko zbliżone do oryginalnych genów F-spondyny szczura i genu Mindyny i oraz geny blisko spokrewnione z genem M-spondyny Drosophila. Zarówno geny mindyny kręgowców i F-spondyny kodują białka, które są przede wszystkim wyrażane na płytce dolnej cewki nerwowej w czasie rozwoju zarodkowego.

Niedawno wyizolowano pojedynczy gen zbliżony do F-spondyny, Amphi-F spondynę z lancetnika (Shimeld, S.M., Mol. Biol. Evol. 15(9):1218-12234, 1998). W oparciu o molekularną filogenetykę, AmphiF-spondyna jest blisko spokrewniona z konkretną podgrupą genów F-spondyny kręgowców, które kodują sześć TSR. AmphiF-spondyna koduje trzy TSR i dwa powtórzenia fibronektyny typu III, z których jeden ma wysoką identyczność do powtórzenia fibronektyny typu III z Deleted in Colorectal Cancer (wydeletowany w raku jelita grubego = DCC). Ekspresja białka jest spotykana w całym systemie nerwowym i nie jest ograniczona do linii środkowej, jak opisano dla białek Mindyny i F-spondyny.

Te dane sugerują, że białka macierzy zewnątrzkomórkowej takie jak nowe białko RG1, które jest homologiem nadrodziny Mindyna/F-spondyna byłyby dobrymi kandydatami do stosowania w diagnostyce raka i interwencji terapeutycznej.

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowane przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiąże się z fragmentem polipeptydu o sekwencji aminokwasowej, która jest zupełnie taka jak część ale nie cała sekwencja aminokwasowa polipeptydu RG1, przedstawiona na Fig. 2 (SEQ ID NO:2). Wyizolowane przeciwciało lub fragment przeciwciała specyficznie wiąże się z polipeptydem zawierającym aminokwas 28 do aminokwasu 46, jak przedstawia Fig. 2 (SEQ ID NO:2). Przeciwciało specyficznie wiąże się korzystnie z peptydem o sekwencji aminokwasowej PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEQ ID NO:8). Przeciwciało według wynalazku jest przeciwciałem poliklonalnym lub monoklonalnym i jest stosowane do wytwarzania leku.

Immunokoniugat obejmujący wyizolowane przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiąże się fragmentem polipeptydu o sekwencji aminokwasowej, która jest zupełnie taka jak część ale nie cała sekwencja aminokwasowa polipeptydu RG1, przedstawiona na Fig. 2 (SEQ ID

PL 207 634 B1

NO:2), według wynalazku charakteryzuje się tym, że wyizolowane przeciwciało lub fragment przeciwciała specyficznie wiążące się z polipeptydem zawierającym aminokwas 28 do aminokwasu 46, jak przedstawia Fig. 2 (SEQ ID NO:2), jest skoniugowane z czynnikiem terapeutycznym. Czynnik terapeutyczny jest korzystnie czynnikiem cytotoksycznym, przy czym jest on wybrany z grupy złożonej z rycyny, doksorubicyny, daunorubicyny, taksolu, bromku etydyny, mitomycyny, etopozydu, tenopozydu, winkrystyny, winblastyny, kolchicyny, dionu dihydroksyantracyny, aktynomycyny D, toksyny dyfterytu, egzotoksyny z Pseudomonas (PE)A, PE40, rycyny, abryny, glukokortykoidu i radioizotopów. Fragmenty przeciwciał są wybrane z grupy złożonej z fragmentów Fv, F(ab') i F(ab')2.

Taki immunokoniugat jest stosowany do wytwarzania leku.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie immunokoniugatu zawierającego czynnik terapeutyczny i wyizolowane przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiąże się z fragmentem polipeptydu o sekwencji aminokwasowej, która jest zupełnie taka jak część ale nie cała sekwencja aminokwasowa polipeptydu RG1, przedstawiona na Fig. 2 (SEQ ID NO:2), gdzie wyizolowane przeciwciało lub fragment przeciwciała specyficznie wiąże się z aminokwasem od 28 do 46, jak przedstawia Fig. 2 (SEQ ID NO:2), do wytwarzania leku do leczenia raka prostaty.

Przedmiotowy wynalazek ujawnia sekwencję polipeptydu, która unikalnie koduje nowe białko określane tu jako RG1. Polipeptyd RG1 wykazuje homologię do białka macierzy zewnątrzkomórkowej mindyny szczura. Zawiera hydrofobową sekwencję sygnałową na N-końcu, dwie domeny spondyny (FS1 i FS2) i powtórkę typu 1 trombospondyny na C-końcu. RG1 wykazuje 89,7% podobieństwa do mindyny szczura. Sekwencja polinukleotydowa, określana tu jako rg1 i opisana w Fig. 1 (SEQ ID NO:1) koduje sekwencje aminokwasów dla RG1, która jest przedstawiona na Fig. 2 (SEQ ID NO:2).

Wynalazek opisuje polipeptydy, które były zidentyfikowane jako nowe białka z homologią do rodziny mindyn zewnątrzkomórkowych białek macierzy, jak wykazuje porównanie sekwencji aminokwasów przedstawione w Fig. 2 (SEQ ID NO:2) i znanych sekwencji aminokwasów innych białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Opisano polinukleotydy, które kodują takie polinukleotydy, w szczególności polinukleotydy, które kodują polipeptyd określany tu jako RG1.

Wyizolowane polinukleotydy kodujące RG1, obejmują mRNA, cDNA oraz przydatne w biologii, diagnostyce, klinice lub terapii warianty, analogi lub ich pochodne, fragmenty, w tym fragmenty wariantów, analogów i pochodnych.

Szczególnie korzystne są naturalnie występujące warianty alleliczne polinukleotydów, które kodują warianty polipeptydu określanego tu jako RG1.

Ujawniono polipeptydy pochodzenia ludzkiego, określane tu jako RG1 jak i warianty, analogi lub ich pochodne, fragmenty, w tym fragmenty tych wariantów, analogów i pochodnych, przydatne w biologii, diagnostyce, klinicystyce lub terapii.

Wśród szczególnie korzystnych są warianty RG1 kodowane przez naturalnie występujące alleliczne warianty polinukleotydu rg1.

Ujawniono sposoby produkcji polipeptydów, fragmentów, wariantów i pochodnych polipeptydów, fragmentów, wariantów i pochodnych i ich analogów. Sposoby produkcji polipeptydów RG1 obejmują hodowlę komórek gospodarza o włączonym polinukleotydzie kodującym RG1 o pochodzeniu egzogennym w warunkach do ekspresji ludzkiego RG1 u gospodarza i następnie odzyskanie polipeptydu.

Ujawniono produkty, kompozycje i sposoby, między innymi, do oceny ekspresji RG1 w komórkach przez określenie polipeptydów RG1 lub mRNA kodującego RG1 i oznaczenie zmienności genetycznej i aberracji, takich jak defekty, w genach rg1.

Opisano też sondy, które hybrydyzują do sekwencji rg1.

Przeciwciała, wysoce wybiórcze dla polipeptydów RG1 lub ich fragmentów mogą być stosowane w diagnozie i/lub detekcji ekspresji RG1, która może być związana z rakiem prostaty. Przeciwciała są znakowane tak aby miały wykrywalny sygnał. Szczególnie korzystne byłoby przeciwciało znakowane radioaktywnie, enzymem, chromoforem lub fluoroforem.

Ujawniono przeciwciała, które są koniugowane do czynnika terapeutycznego do podania komórkom in vitro, komórkom ex vivo lub organizmowi wielokomórkowemu. Szczególnie korzystne pod tym względem są czynniki terapeutyczne, które są cytotoksyczne. W pewnych sytuacjach, korzystnie pod tym względem, podaje się pacjentowi takie koniugowane przeciwciała do leczenia stanu chorobowego charakteryzowanego aktywnością lub ekspresją RG1 takiego jak rak prostaty.

Opisano peptydy i przeciwciała anty-idiotypowe, które mogą być stosowane do stymulowania odpowiedzi odpornościowej.

PL 207 634 B1

Opisano również rybozymy i polinukleotydy komplementarne do polinukleotydów rg1 (tzn. antysensowne polinukleotydy) do podania komórkom in vitro, komórkom ex vivo i komórkom in vivo lub do organizmu wielokomórkowego. Szczególnie korzystne pod tym względem jest podanie cząsteczek antysensownych pacjentowi do leczenia stanu chorobowego, takiego jak rak prostaty lub łagodny rozrost prostaty, który jest łagodzony przez obniżenie poziomu aktywności RG1.

Specjalista zrozumie, że opis i specyficzne przykłady, choć wskazują korzystne wykonania według wynalazku są przedstawione jedynie tylko jako ilustracja. Różne zmiany i modyfikacje ujawnionego wynalazku staną się łatwo widoczne dla specjalistów czytających opis.

Krótki opis figur

Fig. 1: Sekwencja polinukleotydów rg1 (SEQ ID NO:1), która koduje biologicznie lub immunologicznie czynną formę RG1.

Fig. 2: Wydedukowana sekwencja aminokwasów RG1 (SEQ ID NO:2), domeny F-spondyny podkreślone jeden raz i domena trombospondyny podkreślona dwa razy.

Fig. 3: Porównanie sekwencji aminokwasów RG1 z sekwencją mindyny szczura. Sekwencja RG1 jest u góry.

Fig. 4: Sekwencja polinukleotydów i wydedukowana sekwencja aminokwasowa RG1.

Fig. 5: Ekspresja mRNA rg1 w ludzkich tkankach za pomocą analizy PCR opartej na Taqman. RNA z tkanek ludzkich, nowotworowych i prawidłowych izolowano za pomocą technik standardowych.

Startery i sonda do wykrycia ekspresji mRNA rg1 były zaprojektowane stosując oprogramowanie Primer Express Perkin Elmer i syntetyzowane przez Synthetic Genetics.

mRNA rg1 wykryto w tkankach ludzkiej prostaty. W innych tkankach np. wątrobie wykryto znacznie niższą ekspresję mRNA rg1.

Fig. 6: Oczyszczanie natywnego białka RG1 wydzielonego przez komórki LNCaP. Analiza typu Western, stosując antysurowice generowane przeciwko syntetycznej sekwencji peptydu RG1 (3C, SEQ ID NO:10, patrz Przykład 4) aby wykryć natywne białko RG1 wydzielane przez komórki LNCaP. Frakcje elucji z chromatografii na Q-Sepharose zatężonych podłoży LNCaP kondycjonowanych komórkami. (L) naładowane na kolumnę. (F) przepływ przez kolumnę, (1-12) frakcje elucji przez gradient soli. Przewidywana masa cząsteczkowa RG1 wynosi ok. 36 kDa, jednak zaobserwowano, że wyrażany u bakterii RG1, wyrażany w BHK RG1 i białko RG1 wyrażane w LNCaP migrują przy około 45 kD na PAGE (L, frakcje 6-9).

Fig. 7: Barwienie immunohistochemiczne na obecność ekspresji RG1 w ludzkich tkankach prostaty. Tkanki prostaty uzyskano z wydziału Urologii w Stanford University School of Medicine. Barwienie przeprowadzono stosując zestaw Vector ABC-AP (AK5002). Barwienie wizualizowano za pomocą zestawu substratowego Vector Red (SJK-5100) i przeciwbarwiono hematoksyliną. Wyniki wykazują silne barwienie periluminalne błony w układach gruczołów.

Definicje „RG1 dotyczy polipeptydu mającego sekwencję aminokwasów przedstawioną na Fig. 2 (SEQ ID NO:2), jego wariantów, analogów, pochodnych i fragmentów i fragmentów wariantów, analogów i pochodnych. Okreś lenia „fragment, „pochodna i „analog gdy dotyczą polipeptydu Fig. 2 (SEQ ID NO:2) oznaczają polipeptyd, który zachowuje zasadniczo tę samą aktywność biologiczną i/lub immunologiczną jak polipeptyd Fig. 2 (SEQ ID NO:2).

„rg1 dotyczy polinukleotydu mającego sekwencję przedstawioną w Fig. 1 (SEQ ID NO:1) i polinukleotydów kodujących polipeptydy mające sekwencję aminokwasów RG1 przedstawioną na Fig. 2 (SEQ ID NO:2) i polinukleotydów kodujących warianty, analogi, pochodne i fragmenty RG1, i fragmenty wariantów, analogów lub pochodnych. Rg1 także dotyczy takich polinukleotydów złożonych z RNA jak i polinukleotydów, które są dopełnieniem polinukleotydów, które kodują sekwencję polipeptydu przedstawioną na Fig. 2 (SEQ ID NO:2).

„Polinukleotyd(y) ogólnie dotyczy dowolnego polirybonukleotydu lub polideoksyrybonukleotydu, który może być niezmodyfikowanym RNA lub DNA lub zmodyfikowanym RNA lub DNA. Tak na przykład termin polinukleotydy dotyczy między innymi jedno i dwuniciowego DNA, DNA, który jest mieszaniną regionów jedno i dwuniciowych, jedno i dwuniciowego RNA, i RNA, który jest mieszaniną regionów jedno i dwuniciowych, cząsteczek hybrydowych zawierających DNA i RNA, które mogą być jednoniciowe lub typowo dwuniciowe lub mieszaniną jedno i dwuniciowych regionów. Polinukleotyd dotyczy regionów trójniciowych zawierających RNA lub DNA lub oba RNA i DNA. Nici w takich regionach mogą być z tej samej cząsteczki lub z różnych cząsteczek. Regiony mogą obejmować jedną lub wię6

PL 207 634 B1 cej cząsteczek ale typowo obejmują tylko region niektórych cząsteczek. Jedna z cząsteczek regionu potrójnej helisy często jest oligonukleotydem.

Określenie „polinukleotyd obejmuje DNA lub RNA jak opisano powyżej, które zawierają jedną lub więcej zmodyfikowaną zasadę. Tak więc DNA lub RNA ze szkieletami zmodyfikowanymi dla stabilności lub z innych powodów są „polinukleotydami. Co więcej, DNA lub RNA zawierające niezwykłe zasady, takie jak inozyna lub modyfikowane zasady, takie jak zasady znakowane trytem, aby podać tylko dwa przykłady, są polinukleotydami.

Wprowadzono bardzo liczne i różne modyfikacje do DNA i RNA, które spełniają wiele pożytecznych celów znanych specjalistom. Określenie „polinukleotyd obejmuje takie chemicznie, enzymatycznie lub metabolicznie zmodyfikowane formy polinukleotydów, jak i chemiczne formy DNA i RNA charakterystyczne dla wirusów i komórek, obejmując między innymi komórki proste i złożone.

„Polipeptydy” to wszystkie opisane tu polipeptydy. Podstawowa budowa polipeptydów jest dobrze znana i była opisana w niezliczonych podręcznikach i innych publikacjach w dziedzinie. W tym kontekście określenie odnosi się do dowolnego peptydu lub białka zawierającego dwa lub więcej aminokwasów połączonych ze sobą w liniowym łańcuchu przez wiązania peptydowe. Określenie dotyczy zarówno krótkich łańcuchów, które są popularnie określane w dziedzinie jako peptydy, oligopeptydy i oligomery, na przykład, i dłuższych łańcuchów, które są na ogół okreś lane w dziedzinie jako białka, których jest wiele typów.

Polipeptydy często zawierają aminokwasy inne niż 20 aminokwasów powszechnie określanych jako 20 naturalnie występujących aminokwasów, i wiele aminokwasów, w tym aminokwasy N-końcowe, może być zmodyfikowanych w danym polipeptydzie albo przez naturalne procesy takie jak glikozylacja i inne modyfikacje potranslacyjne albo przez chemiczne techniki modyfikacji, które są dobrze znane w dziedzinie. Nawet powszechne modyfikacje, które występują naturalnie w polipeptydach są zbyt licznie by je tu wyczerpująco wyliczyć ale są dobrze opisane w tekstach podstawowych i bardziej szczegółowych monografiach, jak i w szerokiej literaturze naukowej i są one dobrze znane specjalistom. Wśród znanych modyfikacji, które mogą być obecne w polipeptydach aby wymienić kilka przykładowo, są acetylacja, acylacja, ADP-rybozylacja, amidacja, kowalencyjne przyłączenie flawiny, kowalencyjne przyłączenie reszty hemu, kowalencyjne przyłączenie polinukleotydu lub pochodnej polinukleotydu, kowalencyjne przyłączenie lipidu lub pochodnej lipidu, kowalencyjne przyłączenie fosfatydyloinozytolu, połączenie krzyżowe, cyklizacja, tworzenie wiązań dwusiarczkowych, demetylacja, wytworzenie kowalencyjnych wiązań krzyżowych, tworzenie cystyny, tworzenie piroglutaminianu, formylacja, gamma-karboksylacja, glikacja, glikozylacja, tworzenie kotwicy GPI, hydroksylacja, jodowanie, metylacja, mirystylacja, utlenianie, obróbka proteolityczna, fosforylacja, prenylacja, racemizacja, selenoilacja, sulfonacja, dodanie aminokwasów z udziałem tRNA do białek takie jak arginylacja i ubikwitynylacja.

Takie modyfikacje są dobrze znane specjalistom i były opisane bardzo szczegółowo w literaturze naukowej. Kilka szczególnie częstych modyfikacji, glikozylacja, przyłączenie lipidu, sulfacja, gamma-karboksylacja reszt kwasu glutaminowego, hydroksylacja i ADP rybozylacja, na przykład są opisane w większości tekstów podstawowych, takich jak na przykład I.E. Creighton, Proteins- Structure and Molecular Properties, wyd. 2, W.H. Freeman and Company, New York, 1993. Dostępnych jest wiele szczegółowych prac na ten temat, tak jak na przykład Wold, F. - Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson red., Academic Press, New York str. 1-12, 1983; Sefter i wsp., Meth. Enzymol. 182: 626-646, 1990 i Rattan i wsp., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62, 1992.

Polipeptydy nie zawsze są całkowicie liniowe. Na przykład polipeptydy mogą być rozgałęzione w efekcie ubikwitynylacji, i mogą być kołowe, z lub bez rozgałęzień, na ogół w efekcie zdarzeń potranslacyjnych, obejmując naturalne zdarzenia obróbki i zdarzenia spowodowane przez manipulacje, które nie zachodzą naturalnie. Kołowe, rozgałęzione i rozgałęzione kołowe polipeptydy mogą także być syntetyzowane za pomocą nietranslacyjnych procesów naturalnych lub za pomocą metod całkowicie syntetycznych.

Modyfikacje mogą zachodzić gdziekolwiek w polipeptydzie, w tym w szkielecie polipeptydu, bocznych łańcuchach aminokwasów i na N- lub C-końcu. Faktycznie zablokowanie grupy aminowej lub karboksylowej w peptydzie lub obu przez modyfikację kowalencyjną, jest popularne w naturalnie występujących i syntetycznych polipeptydach i takie modyfikacje mogą być także obecne w polipeptydach.

Na przykład, N-końcowa reszta polipeptydów w E. coli po obróbce proteolitycznej będzie nieomal zawsze N-formylometioniną.

PL 207 634 B1

Modyfikacje, które występują w polipeptydzie często będą zależały od tego jak był on wyprodukowany. Dla polipeptydów produkowanych przez ekspresję sklonowanego genu w gospodarzu, na przykład, natura i stopień modyfikacji będzie w dużym stopniu zależeć od zdolności komórki gospodarza do modyfikacji potranslacyjnych i sygnałów modyfikacji obecnych w sekwencji aminokwasów polipeptydu. Na przykład, dobrze wiadomo, że glikozylacja często nie zachodzi u gospodarzy bakteryjnych takich jak E. coli. Tak więc gdy glikozylacja jest pożądana, polipeptyd powinien być wyrażony w gospodarzu glikozylującym, na ogół komórce eukariotycznej. Komórki owadów często przeprowadzają te same glikozylacje potranslacyjne jak komórki ssaków i z tego powodu systemy komórek owadów były opracowane aby między innymi wydajnie wyrażać białka ssaków mające natywne wzory glikozylacji. Podobne rozważania dotyczą innych modyfikacji.

Ten sam typ modyfikacji może być obecny w tym samym lub różnym stopniu w kilku miejscach w danym polipeptydzie. Takż e dany polipeptyd moż e zawierać wiele typów modyfikacji.

Na ogół określenie polipeptyd obejmuje wszystkie takie modyfikacje, w szczególności takie, które są obecne w polipeptydach syntetyzowanych przez wyrażenie polinukleotydu w komórce gospodarza.

„Polinukleotydy kodujące polipeptyd obejmuje polinukleotydy, które obejmują sekwencję kodującą polipeptyd, szczególnie polipeptyd RG1 mający sekwencję aminokwasów przedstawioną na Fig. 2 (SEQ ID NO:2). Określenie obejmuje polinukleotydy, które zawierają pojedynczy ciągły region lub nieciągłe regiony kodujące polipeptyd (na przykład przerywane przez introny) razem z dodatkowymi regionami.

„Aktywność biologiczna dotyczy strukturalnych, regulacyjnych lub biochemicznych funkcji naturalnie występującego polipeptydu RG1.

„Aktywność immunologiczna dotyczy zdolności naturalnego, syntetycznego lub zrekombinowanego RG1 lub jego dowolnego fragmentu do indukcji specyficznej odpowiedzi odpornościowej u odpowiednich zwierząt lub komórek i do wiązania specyficznych przeciwciał.

Termin „oligonukleotyd(y) dotyczy stosunkowo krótkich polinukleotydów. Często określenie dotyczy jednoniciowych deoksyrybonukleotydów ale może także dotyczyć jedno lub dwuniciowych rybonukleotydów, hybryd RNA:DNA i dwuniciowych DNA, między innymi. Oligonukleotydy takie jak jednoniciowe sondy oligonukleotydowe DNA są często syntetyzowane metodami chemicznymi, takimi jak te stosowane na zautomatyzowanych syntetyzatorach oligonukleotydów. Jednak oligonukleotydy mogą być wytwarzane za pomocą szeregu innych sposobów, w tym techniki in vitro z udziałem zrekombinowanego DNA i przez ekspresję DNA w komórkach i organizmach. „Oligonukleotydy: lub „oligomery lub polinukleotydowy „fragment, „część lub „odcinek dotyczą sekwencji polinukleotydów mającej przynajmniej około 10 nukleotydów i aż około 60 nukleotydów, korzystnie około 15 do 30 nukleotydów, najbardziej korzystnie około 20-25 nukleotydów.

„Naturalnie występujący RG1 dotyczy RG1 produkowanego przez komórki ludzkie, które nie były poddane inżynierii genetycznej i specyficznie rozważa różne formy RG1 powstające z modyfikacji potranslacyjnych polipeptydu obejmujące, ale nieograniczone, acetylację, karboksylację, glikozylację, fosforylację, lipidację, acylację i cięcia.

„Wariant(y) polinukleotydów lub polipeptydów, są polinukleotydami lub polipeptydami, które różnią się od referencyjnego polinukleotydu lub polipeptydu, odpowiednio warianty są szczegółowo opisane poniżej.

(1) Polinukleotyd, który różni się sekwencją od innego referencyjnego polinukleotydu. Ogólnie różnice są tak ograniczone, że sekwencje polinukleotydu referencji i wariantu są bardzo ogólnie podobne a w wielu regionach identyczne.

Jak zanotowano poniżej, zmiany w sekwencji polinukleotydu wariantu mogą być nieme. To znaczy, że mogą nie zmieniać aminokwasów kodowanych przez polinukleotyd. Gdy zmiany są ograniczone do niemych zmian tego typu, wariant będzie kodował polipeptyd z tą samą sekwencją aminokwasów jak referencja. Zmiany w sekwencji polinukleotydów wariantu mogą zmieniać sekwencję aminokwasów polipeptydu kodowanego przez polinukleotyd referencyjny. Takie zmiany polinukleotydu mogą dać w efekcie podstawienia, addycje, delecje aminokwasów i fuzje i obcięcia w polipeptydzie kodowanym przez sekwencję referencyjną jak przedyskutowano poniżej.

(2) Polipeptyd, który różni się sekwencją aminokwasów od innego polipeptydu referencyjnego.

Na ogół różnice są ograniczone, tak że sekwencje odniesienia i wariantu są bardzo ogólnie podobne i w wielu regionach identyczne. Wariant i polipeptyd referencyjny mogą różnić się w sekwencji aminokwasów przez jedną lub więcej substytucji, addycji, delecji, fuzji i skróceń, które mogą być obecne w dowolnej kombinacji. Warianty rekombinantów kodują cych te same lub podobne polipeptydy mogą

PL 207 634 B1 być syntetyzowane lub wybierane wykorzystując „redundancję kodu genetycznego. Różne podstawienia kodonów, takie jak nieme zmiany, które generują różne miejsca restrykcyjne, mogą być wprowadzane dla optymalizacji klonowania do wektora plazmidowego lub wirusowego lub ekspresji w danym systemie prokariotycznym lub eukariotycznym. Mutacje mogą być też wprowadzone w celu modyfikacji właściwości polipeptydu, zmiany powinowactwa wiązania ligandu, powinowactwa między łańcuchami lub tempa degradacji lub obrotu polipeptydu.

„Wariant alleliczny dotyczy alternatywnej formy polinukleotydu rg1. Allele wynikają z mutacji, tzn. zmiany w sekwencji polinukleotydów i na ogół produkują zmienione mRNA lub polipeptydy, których struktura lub funkcja może być zmieniona lub nie. Dowolny dany gen może mieć jedną lub wiele form allelicznych albo wcale. Częste zmiany mutacyjne, które dają allele są ogólnie przypisywane naturalnym delecjom, addycjom lub substytucjom nukleotydów. Każda z tych typów zmian może zachodzić sama lub w kombinacji z innymi lub jeden lub więcej razy w danej sekwencji.

„Pochodna dotyczy polinukleotydów lub polipeptydów pochodzących z naturalnych rg1 lub RG1, odpowiednio, za pomocą modyfikacji chemicznych takich jak ubikwitynacja, znakowanie (np. radionuklidami, różne modyfikacje enzymatyczne), pegylację (podstawienie glikolem polietylenowym) lub przez wstawienie lub podstawienie aminokwasów takich jak ornityna (lub podstawienie nukleotydów, które kodują taki aminokwas), które normalnie nie występują w ludzkich białkach.

„Delecja jest definiowana jako zmiana w sekwencji polinukleotydu lub aminokwasów, w których odpowiednio jeden lub więcej polinukleotyd lub reszta aminokwasu są nieobecne.

„Insercja lub „addycja jest taką zmianą w sekwencji polinukleotydu lub aminokwasów, która w efekcie daje dodanie jednego lub wię cej polinukleotydów lub reszt aminokwasów w porównaniu z naturalnie wystę pują c ą sekwencją polinukleotydu lub aminokwasów.

„Substytucja jest wynikiem zastąpienia jednego lub więcej polinukleotydów lub aminokwasów przez inne polinukleotydy lub aminokwasy, odpowiednio.

Korzystnie substytucje aminokwasów są wynikiem zastąpienia jednego aminokwasu przez inny aminokwas mający podobne właściwości strukturalne i/lub chemiczne takie jak zastąpienie leucyny przez izoleucynę lub walinę, asparaginianu przez glutaminian lub treoniny przez serynę tzn. konserwatywne podstawienie aminokwasów. Insercje lub delecje są typowo w zakresie około 1 do 5 aminokwasów. Dozwolona zmienność może być ustalona eksperymentalnie przez systematyczne robienie insercji, delecji lub substytucji aminokwasów i badanie zrekombinowanych wariantów pod kątem aktywności.

„Fragment jest polipeptydem mającym sekwencję aminokwasów, która jest dokładnie taka sama jak część, ale nie całość, sekwencji aminokwasów wymienionych uprzednio polipeptydów RG1 i ich wariantów lub pochodnych.

„Fragment, „część lub „odcinek polipeptydu jest ciągiem reszt aminokwasów z przynajmniej 5 aminokwasów, często przynajmniej 7 aminokwasów, typowo przynajmniej około 9 do 13 aminokwasów lub przynajmniej około 17 lub więcej aminokwasów.

„Rekombinant lub „zrekombinowana cząsteczka DNA dotyczy sekwencji polinukleotydu, która nie występuje naturalnie lub jest zrobiona przez sztuczne połączenie dwóch normalnie oddzielonych odcinków sekwencji. Przez „wyprodukowany techniką rekombinacji rozumie się sztuczną kombinację często uzyskaną przez albo sposób syntezy chemicznej albo przez sztuczne manipulowanie wyizolowanych odcinków polinukleotydów np. za pomocą technik inżynierii genetycznej. Taka manipulacja jest na ogół przeprowadzana aby zastąpić kodon kodonem redundantnym kodującym ten sam lub konserwatywny aminokwas, zarazem wprowadzając lub usuwając miejsce rozpoznawanej sekwencji. Alternatywnie jest ona przeprowadzana by połączyć razem odcinki polinukleotydów z pożądanymi funkcjami aby wygenerować pojedynczą całość genetyczną zawierającą pożądaną kombinację tych funkcji nie spotykaną w powszechnych formach naturalnych. Miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, miejsca regulacji, sekwencje kontrolne lub inne pożyteczne cechy mogą być włączane poprzez projektowanie. „Zrekombinowane cząsteczki DNA obejmują wektory do klonowania i ekspresji. „Rekombinowany może też dotyczyć polinukleotydu, który koduje polipeptyd i jest przygotowany stosując techniki zrekombinowanego DNA.

„Wyizolowany oznacza zmieniony „ręką ludzką ze stanu naturalnego, tzn. jeśli występuje w naturze, został zmieniony lub usunięty z oryginalnego otoczenia lub razem. Na przykład, naturalnie występujący polinukleotyd lub polipeptyd naturalnie obecny w żywym zwierzęciu w jego naturalnym stanie nie jest „wyizolowany ale ten sam polinukleotyd lub polipeptyd oddzielony od współistniejących materiałów w swoim naturalnym stanie jest „wyizolowany. Na przykład, w odniesieniu do polinuklePL 207 634 B1 otydów, określenie izolowany oznacza, że są oddzielone od chromosomu i komórki, w której występuje naturalnie.

Polinukleotydy i polipeptydy mogą występować w kompozycji, takiej jak formuły pożywek, roztwory do wprowadzania polinukleotydów lub polipeptydów, na przykład do komórek, kompozycjach lub roztworach do reakcji chemicznych i enzymatycznych, na przykład, które nie są naturalnie występującymi kompozycjami i pozostają wyizolowanymi polinukleotydami lub polipeptydami.

„Zasadniczo czyste i „zasadniczo jednorodne są stosowane wymiennie i opisują polipeptyd RG1 lub jego fragmenty lub segment polinukleotydu go kodujący, gdzie taki polipeptyd lub polinukleotyd jest oddzielony od składników, które mu naturalnie towarzyszą. Polipeptyd RG1, jego fragment lub odcinek DNA go kodujący jest zasadniczo wolny od natywnych zanieczyszczeń, które towarzyszą mu w stanie naturalnym. Tak więc polipeptyd, który jest syntetyzowany chemicznie lub syntetyzowany w ukł adzie komórkowym innym niż komórka, w której naturalnie występuje bę dzie zasadniczo wolny od swoich naturalnie zasocjowanych składników. Podobnie polinukleotyd, który jest syntetyzowany chemicznie lub syntetyzowany w systemie komórkowym innym niż komórka, z której naturalnie pochodzi będzie zasadniczo wolny od swoich naturalnie związanych składników.

Termin „homologiczny gdy jest stosowany do opisania polinukleotydu, wskazuje, że dwa polinukleotydy lub ich określone sekwencje, gdy są optymalnie ustawione i porównane, są identyczne z odpowiednimi insercjami i delecjami nukleotydów, w przynajmniej 70% nukleotydów, zazwyczaj od około 75% do 99% i bardziej korzystnie przynajmniej około 98 do 99% nukleotydów.

„Podobieństwo stosowane do opisania polipeptydu jest określane przez porównanie sekwencji aminokwasów i konserwowanych podstawień aminokwasów jednego polipeptydu na sekwencję drugiego polipeptydu.

„Łańcuchowa reakcja polimerazy czyli „PCR dotyczy procedury, w której specyficzne kawałki DNA są amplifikowane jak opisano w US 4,683,195 wydanym 28 lipca 1987. Na ogół informacja o sekwencji z koń ców interesującego fragmentu polipeptydowego lub poza nimi musi być dostę pna, tak, że można zaprojektować startery oligonukleotydowe. Te startery będą skierowane do siebie i bę d ą identyczne lub podobne w sekwencji do przeciwnych nici matrycy, która ma być zamplifikowana. Nukleotydy 5' końcowe obu starterów będą zbieżne z końcami amplifikowanego materiału. PCR może być stosowany do amplifikacji specyficznych sekwencji DNA z całkowitego genomowego DNA, cDNA transkrybowanego z całkowitego komórkowego RNA, sekwencji plazmidów itd. (Mullis i wsp., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, 19871 Erlich, red., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).

Ostrość typowo zachodzi w zakresie od około Tm (temperatura topnienia) -5°C (5°C poniżej Tm sondy). Dla specjalistów będzie zrozumiałe, że ostra hybrydyzacja może być wykorzystana do identyfikacji lub detekcji identycznych sekwencji polinukleotydów lub do identyfikacji lub detekcji podobnych lub pokrewnych sekwencji polinukleotydów. Określenie „ostre warunki oznacza, że hybrydyzacja zajdzie tylko jeśli jest przynajmniej 95% i korzystnie przynajmniej 97% identyczności między sekwencjami.

„Hybrydyzacja obejmuje „dowolny proces za pomocą którego nić polinukleotydu łączy się z komplementarną nicią przez parowanie zasad (Coombs, J. Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y., 1994).

„Terapeutycznie skuteczna dawka dotyczy takiej ilości polipeptydu lub jego przeciwciał, antagonistów lub inhibitorów, w tym cząsteczek antysensownych i rybozymów, które poprawiają objawy lub warunki stanu chorobowego. Skuteczność terapeutyczna i toksyczność takich związków może być określona za pomocą standardowych procedur farmaceutycznych w hodowlach komórek lub u zwierząt doświadczalnych np. ED50 (dawka skuteczna terapeutycznie w 50% populacji) i LD50 (dawka letalna dla 50% populacji). Stosunek dawki między efektami terapeutycznymi i toksycznymi jest indeksem terapeutycznym i może być wyrażany jako stosunek, ED50/LD50.

„Traktowanie lub „terapia obejmuje leczenie stanu chorobowego u pacjenta, człowieka, który to stan chorobowy jest związany z wzrostem nowotworu prostaty i obejmuje stany chorobowe, w których pacjent potrzebuje obniżonych poziomów RG1.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek dotyczy przeciwciał skierowanych przeciwko polipeptydom RG1, nowych peptydów

RG1 i polinukleotydów rg1. W szczególności wynalazek dotyczy nowych polipeptydów RG1 i polinukleotydów kodujących te peptydy RG1 oraz RG1 mającego sekwencję aminokwasów przedstawioną na Fig. 2 (SEQ ID NO:2) i rg1 mającego sekwencję polinukleotydu przedstawioną na Fig. 1 (SEQ ID

NO:1). Wynalazek obejmuje także warianty RG1. Korzystny wariant RG1 ma przynajmniej 70% podo10

PL 207 634 B1 bieństwa (korzystnie 70% identyczności) do sekwencji polinukleotydu przedstawionej na Fig. 2 (SEQ ID NO:2) i bardziej korzystnie przynajmniej 90% podobieństwa (bardziej korzystnie przynajmniej 90% identyczności) do sekwencji polipeptydu przedstawionego na Fig. 2 (SEQ ID NO:2) i jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej 95% podobieństwa (jeszcze bardziej korzystnie 95% identyczności) do sekwencji polipeptydu przedstawionego na Fig. 2 (SEQ ID NO:2) i także obejmuje części takich polipeptydów z taką częścią polipeptydu na ogół zawierającą przynajmniej 30 aminokwasów i bardziej korzystnie przynajmniej 50 aminokwasów.

Sekwencja kodująca dla przewidywanego polipeptydu RG1 zaczyna się 296 par zasad od końca 5' sekwencji nukleotydów przedstawionej na Fig. 1 (SEQ ID NO:1). RG1 zawiera trzy strukturalne domeny charakterystyczne dla nadrodziny zewnątrzkomórkowych białek macierzy mindyna/F-spondyna: dwie domeny spondyny (FS1 i FS2), obejmujące aminokwasy 31 do 103 i 138 do 221, odpowiednio i domenę trombospondyny zawierającą aminokwasy 278 do 330.

Przedyskutowano częściową homologię strukturalną przedstawioną na Fig. 3 między RG1 i mindyną szczura, innym członkiem rodziny białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Sekwencja aminokwasów RG1 jest około 89,7% podobna do mindyny szczura.

Ujawnienie oparte jest częściowo na profilu ekspresji RG1 jak wykazano przez jego ekspresję w bibliotekach z tkanki prostaty i nadekspresję w bibliotekach z raka prostaty. Ten profil tkankowy jest widoczny w analizie ekspresji mRNA w próbkach tkanek z normalnych i rakowych tkanek za pomocą analizy PCR systemem Taqman. Ta metoda analizy wykazała, że mRNA kodujący RG1 jest nadeksprymowany w tkankach prostaty w porównaniu z innymi tkankami.

Polinukleotydy

Ujawnione są wyizolowane polinukleotydy, które kodują peptyd RG1 mający wydedukowaną sekwencję aminokwasów Fig. 2 (SEQ ID NO:2).

Stosując taką informację jak sekwencja polinukleotydu przedstawiona w Fig. 1 (SEQ ID NO:1), polinukleotyd kodujący polipeptyd RG1 może być uzyskany stosując standardowe procedury klonowania i skriningu, tak jak te do klonowania cDNA stosując mRNA z komórek tkanek ludzkich jako materiał wyjściowy. Sekwencja polinukleotydów na Fig. 1 (SEQ ID NO:1) była znaleziona w klonach cDNA uzyskanych z ludzkich tkanek prostaty. Rg1 zidentyfikowano jako gen wyrażany w prostacie przez badanie bazy danych LifeSeq Incyte. Sekwencję nukleotydów zidentyfikowano przeszukując przypisy w bazie danych stosując narzędzie „Protein Function dostarczone w celu przeszukiwania bazy danych. Sekwencję nukleotydów znaleziono w kategorii cząsteczek adhezji komórkowej w bazie danych z przypisami i była opisana jako homolog f-spondyny. Elektroniczna analiza typu Northern dystrybucji sekwencji polinukleotydów rg1 w zestawie bibliotek w bazie danych wykazała, że rg1 ulegał ekspresji na wysokim poziomie w bibliotekach prostaty i na niższym poziomie w szeregu innych bibliotek tkankowych, w tym z tkanek normalnych i nowotworowych.

Po zmontowaniu zestawu klonów rg1 w bazie danych do ciągłej sekwencji polinukleotydów i redagowaniu ciągłej sekwencji, zidentyfikowano sekwencję kodującą pełnej długości w przewidywanym zmontowanym polinukleotydzie. Sekwencja ta kodowała białko z homologią do mindyny szczura.

Klony Incyte 1640796, 1712252 i 1880265 otrzymano od Incyte w celu pracy eksperymentalnej i stwierdzono, że klon 3360733 ma najwięcej sekwencji nukleotydów 5'. Ten klon poddano sekwencjonowaniu w całości i zawierał pełną sekwencję kodującą dla przewidywanego białka RG1. Ta sekwencja jest przedstawiona na Fig. 1 (SEQ ID NO:1).

Polinukleotydy mogą być w postaci RNA takiego jak mRNA lub w formie DNA, obejmując na przykład cDNA i genomowy DNA otrzymany przez klonowanie lub produkowany przez techniki syntezy chemicznej lub przez ich kombinację lub tam opisane metody. DNA może być dwuniciowy lub jednoniciowy. Jednoniciowy DNA może być nicią kodującą, znaną też jako nić sensowna lub może być nicią niekodującą, określaną także jako nić antysensowna.

Sekwencja, która koduje polipeptyd może być identyczna do sekwencji kodującej polinukleotydu przedstawionego na Fig. 1 (SEQ ID NO:1). Może też być polinukleotydem z inną sekwencją, która jako efekt redundancji (degeneracji) kodu genetycznego koduje polipeptyd Fig. 2 (SEQ ID NO:2).

Polinukleotydy, które kodują polipeptyd z Fig. 2 (SEQ ID NO:2) mogą obejmować, nie ograniczająco, sekwencję kodującą samego polipeptydu, sekwencję kodującą polipeptydu razem z dodatkowymi niekodującymi sekwencjami, w tym na przykład, ale bez ograniczania się, introny i niekodujące sekwencje 5' i 3', takie jak transkrybowane nie ulegające translacji sekwencje, które odgrywają rolę w transkrypcji, obróbce mRNA (na przykład sygnały składania i poliadenylacji) lub dodatkowe sekwencje kodujące, które kodują dodatkowe aminokwasy, takie jak te, które dostarczają dodatkowe funkcje.

PL 207 634 B1

Tak na przykład polipeptyd może być połączony z sekwencją markera, takiego jak peptyd, który ułatwia oczyszczenie fuzji polipeptydu. Sekwencja markera jest peptydem heksahistydynowym, takim jak znacznik dostarczony w wektorze pTrcHisB (Invitrogen, Carlsbad, CA) między innymi, z których wiele jest handlowo dostępnych. Jak opisano w Gentz i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, 1989) na przykład, heksahistydyna daje dogodne oczyszczanie fuzji białkowej.

Polinukleotydy mogą kodować polipeptyd, który jest polipeptydem plus dodatkowe N- lub C-końcowe aminokwasy lub aminokwasy we wnętrzu polipeptydu (na przykład gdy forma aktywna ma więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy). Takie sekwencje mogą odgrywać rolę w obróbce polipeptydu z prekursora do formy końcowej, mogą ułatwiać ruch polipeptydów, mogą przedłużać lub skracać okres półtrwania polipeptydów lub mogą ułatwiać manipulację polipeptydu dla oznaczeń lub produkcji, między innymi. Generalnie jak ma to miejsce w niniejszym przypadku dodatkowe aminokwasy mogą być obrabiane od razu z polipaptydu przez enzymy proteolityczne.

Opisane powyżej polinukleotydy kodują fragmenty, analogi i pochodne polipeptydu mającego wydedukowaną sekwencję aminokwasów Fig. 2 (SEQ ID NO:2). Wariant polinukleotydu może być naturalnie występującym wariantem, takim jak naturalnie występujący wariant alleliczny lub może być wariantem, o którym wiadomo, że nie występuje naturalnie. Takie nie występujące naturalnie warianty polinukleotydu mogą być przygotowane za pomocą technik mutagenezy, obejmując te stosowane do polinukleotydów, komórek lub organizmów.

Wśród wariantów pod tym względem są warianty, które różnią się od wymienionych polinukleotydów przez substytucje, delecje lub addycje polinukleotydów. Substytucje, delecje lub addycje mogą dotyczyć jednego lub więcej polinukleotydów. Te warianty mogą być zmienione w regionach kodujących lub niekodujących lub w obu. Zmiany w regionach kodujących mogą wyprodukować konserwatywne lub niekonserwatywne podstawienia aminokwasów, delecje lub addycje.

Szczególnie korzystne są polinukleotydy kodujące polipeptydy mające sekwencję aminokwasów RG1 przedstawioną na Fig. 2 (SEQ ID NO:2), jej warianty, analogi, pochodne i fragmenty i fragmenty wariantów, analogów i pochodnych.

Dalej szczególnie korzystne pod tym względem są polinukleotydy kodujące warianty RG1, analogi, pochodne lub fragmenty i warianty, analogi i pochodne fragmentów, które mają sekwencję aminokwasów RG1 przedstawioną na Fig. 2 (SEQ ID NO:2), w której parę, kilka, 5 do 20, 1 do 5, 1 do 3, 2, 1 lub żadna reszta aminokwasu są podstawione, wydeletowane lub dodane w dowolnej kombinacji. Szczególnie korzystne wśród nich są podstawienia nieme, addycje i delecje, które nie zmieniają aktywności i właściwości polipeptydu RG1. Szczególnie korzystne pod tym względem są także podstawienia konserwatywne. Najbardziej korzystne są polinukleotydy kodujące polipeptydy mające sekwencję aminokwasów RG1 przedstawioną na Fig. 2 (SEQ ID NO:2) bez substytucji.

Korzystne są polinukleotydy, które są w przynajmniej 70% identyczne do polinukleotydu kodującego polipeptyd RG1 mający sekwencję aminokwasów przedstawioną w Fig. 2 (SEQ ID NO:2) i polinukleotydy, które są komplementarne do takiej sekwencji. Alternatywnie, najbardziej korzystne są polinukleotydy, które zawierają region, który jest w przynajmniej 80% identyczny do polinukleotydu kodującego polipeptyd RG1 i komplementarne do niego polinukleotydy. W tym względzie polinukleotydy identyczne w przynajmniej 90% do tego samego są szczególnie korzystne, i wśród tych szczególnie korzystnych polinukleotydów, te z przynajmniej 95% są szczególnie korzystne. Dalej te z przynajmniej 97% są wysoce korzystne wśród tych z przynajmniej 95%, i wśród nich te z przynajmniej 98% i przynajmniej 99% są najbardziej wysoce korzystne, z przynajmniej 99% bardziej korzystne.

Ponadto szczególnie korzystne są polinukleotydy, które kodują polipeptydy, które zachowują zasadniczo tę samą aktywność biologiczną jak polipeptyd kodowany przez sekwencję nukleotydów Fig. 1 (SEQ ID NO:1).

Ujawniono polinukleotydy, które hybrydyzują do opisanych tu sekwencji. Polinukleotydy, które hybrydyzują w warunkach ostrych do opisanych polinukleotydów są korzystne.

Jak przedyskutowano tu dodatkowo pod względem oznaczeń polinukleotydów, na przykład polinukleotydy, jak opisano powyżej, mogą być stosowane jako sondy do hybrydyzacji do cDNA i genomowego DNA do izolacji pełnej długości cDNA i klonów genomowych kodujących RG1 i do izolacji cDNA i klonów genomowych innych genów, które mają wysokie podobieństwo sekwencji do genu rg1. Takie sondy ogólnie będą zawierały co najmniej 15 zasad. Korzystnie takie sondy będą zawierały przynajmniej 30 zasad i mogą mieć przynajmniej 50 zasad.

Na przykład region kodujący genu rg1 może być wyizolowany przez przeszukiwanie bibliotek stosując syntetyczne sondy oligonukleotydowe, które były zaprojektowane stosując znaną sekwencję

PL 207 634 B1

DNA. Na przykład znakowany oligonukleotyd mający sekwencję komplementarną do sekwencji polinukleotydu może być stosowany do przeszukiwania biblioteki cDNA lub genomowego DNA aby zidentyfikować klony, które hybrydyzują do sondy.

W sumie polinukleotyd moż e kodować polipeptyd, polipeptyd plus sekwencje lidera (który moż e być określany jako prepolipeptyd).

Dyskusja dotyczy także polinukleotydów kodujących fragmenty polipeptydu, polinukleotydów, które hybrydyzują do polinukleotydów kodujących fragmenty polipeptydów, szczególnie tych, które hybrydyzują w warunkach ostrych, i polinukleotydów, takich jak startery do PCR, do amplifikacji polinukleotydów, które kodują fragmenty polipeptydów. Pod tym względem korzystne polinukleotydy to są takie, które odpowiadają korzystnym fragmentom polipeptydów, jak tu przedyskutowano.

Polipeptydy

Wynalazek ujawnia polipeptyd RG1, który ma sekwencję aminokwasów wydedukowaną z Fig. 2 (SEQ ID NO:2).

Wynalazek także ujawnia fragmenty, analogi i pochodne tych polipeptydów. Określenie fragment, pochodna i analog przy odnoszeniu się do polipeptydu z Fig. 2 (SEQ ID NO:2) oznacza polipeptyd, który zachowuje zasadniczo tę samą aktywność biologiczną jak taki polipeptyd.

Fragment, pochodna lub analog polipeptydu z Fig. 2 (SEQ ID NO:2) może być (i) taki, w którym jedna lub więcej z reszt aminokwasowych jest podstawiona konserwatywną lub niekonserwatywną resztą aminokwasu (korzystnie konserwatywną resztą aminokwasową) i taka podstawiona reszta aminokwasu może być kodowana w kodzie genetycznym lub nie, lub (ii) taki, w którym jedna lub więcej z reszt aminokwasów zawiera grupę podstawnika, lub (iii) taki, w którym polipeptyd jest połączony z innym zwią zkiem, takim jak zwią zek do zwię kszania okresu pół trwania polipeptydu (na przykł ad glikol polietylenowy) lub (iv) taki, w którym dodatkowe aminokwasy są połączone z polipeptydem takim jak lider lub sekwencja sekrecyjna lub sekwencja, która jest stosowana do oczyszczenia polipeptydu. Takie fragmenty, analogi i pochodne są uważane za mieszczące się w zakresie możliwości specjalistów na podstawie nauk tu podanych.

Wśród szczególnie korzystnych wykonań opisanych w wynalazku pod tym względem są polipeptydy mające sekwencję aminokwasów RG1 przedstawioną na Fig. 2 (SEQ ID NO:2), warianty, analogi, pochodne i fragmenty i warianty, analogi i pochodne fragmentów.

Wśród korzystnych wariantów są takie, które różnią się od referencji konserwatywnymi podstawieniami aminokwasów. Takie substytucje są to takie, które podstawiają dany aminokwas w polipeptydzie przez aminokwas o podobnych cechach. Typowo widziane jako konserwatywne podstawienia są zastąpienia jednego za drugi wśród alifatycznych aminokwasów Ala, Val, Leu i Ile, zamiana reszt hydroksylowych Ser i Thr, wymiana kwaśnych reszt Asp i Glu, podstawienie między resztami amidów Asn i Gln, zamiana zasadowych reszt Lys i Arg i zastąpienia między aromatycznymi resztami Phe i Tyr.

Szczególnie korzystne pod tym względem są warianty, analogi, pochodne i fragmenty i warianty, analogi i pochodne fragmentów, mających sekwencję aminokwasów polipeptydu Rg1 Fig. 2 (SEQ ID NO:2) w którym kilka, parę, 5 do 10, 1 do 5, 1 do 3, 2, 1 lub żadna reszta aminokwasu nie jest podstawiona, wydeletowana lub dodana, w dowolnej kombinacji. Szczególnie korzystne wśród nich są nieme podstawienia, addycje i delecje, które nie zmieniają właściwości i aktywności polipeptydu RG1. Także szczególnie korzystne pod tym względem są substytucje konserwatywne. Bardziej korzystne są polipeptydy mające sekwencję aminokwasów Fig. 2 (SEQ ID NO:2) bez substytucji.

Polipeptydy i polinukleotydy są korzystnie dostarczone w formie wyizolowanej, i korzystnie są oczyszczone do homogenności.

Polipeptydy obejmują też polipeptyd Fig. 2 (SEQ ID NO:2) jak i polipeptydy, które mają przynajmniej 70% podobieństwa (korzystnie przynajmniej 70% identyczności) do polipeptydu Fig. 2 (SEQ ID NO:2) i bardziej korzystnie przynajmniej 90% podobieństwa (bardziej korzystnie przynajmniej 90% identyczności) do polipeptydu Fig. 2 (SEQ ID NO:2) i jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej 95% podobieństwa (jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej 95% identyczności) do polipeptydu Fig. 2 (SEQ ID NO:2) i także obejmują części takich polipeptydów z taką częścią polipeptydu na ogół zawierającą przynajmniej około 30 aminokwasów i bardziej korzystnie przynajmniej około 50 aminokwasów.

Jak jest wiadomo w dziedzinie „podobieństwo między dwoma polipeptydami określa się przez porównanie sekwencji aminokwasów i konserwatywnych podstawień aminokwasów jednego polipeptydu do sekwencji drugiego polipeptydu.

PL 207 634 B1

Fragmenty lub części polipeptydów mogą być stosowane do produkcji odpowiednich polipeptydów pełnej długości za pomocą syntezy peptydów, tak więc fragmenty mogą być stosowane jako pośredniki do produkcji polipeptydów pełnej długości.

Fragmenty

W korzystnym wykonaniu wynalazek ujawnia polipeptydy zawierające fragmenty RG1, a szczególnie fragmenty RG1 Fig. 2 (SEQ ID NO:2) i fragmenty wariantów i pochodnych RG1 z Fig. 2 (SEQ ID NO:2).

Pod tym względem fragment jest polipeptydem mającym sekwencję aminokwasów, która jest całkowicie taka sama jak część, ale nie całość, sekwencji aminokwasów wymienionych polipeptydów RG1 i ich wariantów lub pochodnych.

Takie fragmenty mogą być „wolne tzn. nie być częścią lub połączone z innymi aminokwasami lub polipeptydami, lub mogą być zawarte w większym polipeptydzie, omawiane fragmenty korzystnie tworzą jeden ciągły region. Jednak kilka fragmentów może być zawartych w obrębie jednego większego polipeptydu. Na przykład, pewne korzystne wykonania dotyczą fragmentu polipeptydu RG1 zawartego w obrębie prekursorowego polipeptydu zaprojektowanego dla ekspresji w gospodarzu i mającego heterologiczne sekwencje pre- i propolipeptydowe w formie fuzji z częścią N-końcową fragmentu RG1 i dodatkowy region w formie fuzji z C-koń cem fragmentu. Tak wię c fragmenty dotyczą jednej części lub kilku części polipeptydu fuzyjnego lub białka fuzyjnego pochodzącego z RG1.

Jako reprezentatywne przykłady fragmentów polipeptydów można wymienić te, które mają od około 25 do około 331 aminokwasów.

W tym kontek ś cie „okoł o obejmuje szczególnie wymieniany zakres i zakresy większe lub mniejsze o parę, kilka, 5, 4, 3, 2, lub 1 aminokwas na dowolnym końcu lub obu końcach. Na przykład, około 331 w tym kontekście oznacza fragment polipeptydu z 25 plus lub minus parę, kilka, 5, 4, 3, 2, lub 1 aminokwas do 331 plus lub minus parę, kilka, 5, 4, 3, 2, lub 1 reszt aminokwasu, to znaczy zakresy tak szerokie jak 25 minus kilka aminokwasów do 331 plus kilka aminokwasów do tak wąskich jak 25 plus kilka aminokwasów do 331 minus kilka aminokwasów.

Wysoce korzystne pod tym względem są zakresy plus lub minus tak wiele jak 5 aminokwasów z jednego lub obu koń ców. Szczególnie korzystne s ą zakresy plus lub minus tak wiele jak 3 aminokwasy na jednym lub obu z końców. Bardzo korzystne są zakresy plus lub minus 1 aminokwas za jednym lub obu końcach lub zakresy bez addycji lub delecji. Najbardziej korzystne pod tym względem są fragmenty od około 25 do około 331 aminokwasów.

Wśród szczególnie korzystnych fragmentów są obcięte mutanty RG1. Obcięte mutanty RG1 obejmują warianty lub pochodne sekwencji Fig. 2 (SEQ ID NO:2) poza delecją ciągłej serii reszt (to znaczy region ciągły, część lub kawałek) która obejmuje N-koniec sekwencji przedstawionej w Fig. 2 (SEQ ID NO:2) lub ciągłej serii reszt, która obejmuje C-koniec, lub, jak w podwójnie obciętych mutantach, delecje dwóch ciągłych serii reszt, jedna obejmuje N-koniec i jedna obejmuje C-koniec. Fragmenty mające zakresy wielkości podane powyżej są też korzystnymi wykonaniami fragmentów obciętych, które są szczególnie korzystne ogólnie wśród fragmentów.

Szczególnie korzystne są fragmenty charakteryzowane przez biologiczne i/lub immunologiczne atrybuty RG1. Takie fragmenty obejmują te zawierające przewidziane domeny strukturalne RG1, które obejmują przynajmniej aminokwas 31 do 103, 138 do 221 i 278 do 330 lub te fragmenty stosowane do generowania przeciwciał, tak jak te opisane w Przykładzie 4.

Pewne korzystne regiony pod tym względem są przedstawione na Fig. 2 (SEQ ID NO:2) i obejmują, ale nie są ograniczone, regiony wymienionych typów zidentyfikowanych przez analizę sekwencji aminokwasów przedstawionej na Fig. 2 (SEQ ID NO:2).

Wśród wysoce korzystnych fragmentów pod tym względem są te, które zawierają regiony RG1, które kombinują kilka cech strukturalnych, takich jak cechy przedstawione powyżej. Pod tym względem dwie domeny spondyny i jedna trombospondyny, obejmujące około aminokwasy 31 do 103, 138 do 221 i 278 do 330, odpowiednio, które są charakterystyczne dla nadrodziny mindyny/spondyny zewnątrzkomórkowych białek macierzy są regionami szczególnie korzystnymi. Takie regiony mogą być zawarte w obrębie większego polipeptydu lub mogą być same korzystnym fragmentem.

Dalsze korzystne regiony to takie, które przeprowadzają aktywności RG1. Najbardziej korzystne pod tym względem są fragmenty, które mają chemiczną, biologiczną lub inną aktywność RG1, obejmując te z podobną lub polepszoną aktywnością, lub ze zmniejszoną niepożądaną aktywnością. Wysoce korzystne pod tym względem są fragmenty, które zawierają regiony - homologami pod względem

PL 207 634 B1 sekwencji, lub pozycji, lub o sekwencji i pozycji aktywnych regionów spokrewnionych polipeptydów, takich jak inne białka rodziny mindyny, która obejmuje RG1.

Wektory, komórki gospodarza i układu ekspresji

Opisano wektory, które zawierają polinukleotydy, komórki gospodarza, które są uzyskane za pomocą inżynierii genetycznej z wektorami i produkcję polipeptydów za pomocą technik rekombinacji. Takie techniki są opisane w Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989, i Ausubel, F.N. i wsp. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. 1989.

Komórki gospodarza można uzyskać za pomocą technik inżynierii genetycznej by włączały polinukleotydy i wyrażały polipeptydy. Na przykład polinukleotydy mogą być wprowadzane do komórki gospodarza stosując dobrze znane techniki infekcji, transdukcji, transfekcji, transwekcji i transformacji. Polinukleotydy mogą być wprowadzane same lub z innymi polinukleotydami. Takie inne polinukleotydy mogą być wprowadzane niezależnie, wprowadzane równocześnie lub wprowadzane połączone z polinukleotydami.

Tak na przykład polinukleotydy mogą być transfekowane do komórek gospodarza z innym odrębnym polinukleotydem kodującym marker selekcyjny, stosując standardowe techniki do transfekcji i selekcji w na przykł ad komórkach ssaka.

W tym przypadku polinukleotydy na ogół będą stabilnie włączone do genomu gospodarza.

Alternatywnie polinukleotydy mogą być połączone z wektorem zawierającym marker selekcyjny do namnażania w gospodarzu. Konstrukt wektora może być wprowadzony do komórek gospodarza jako DNA w osadzie, takim jak osad fosforanu wapnia lub w kompleksie z naładowanym lipidem. Elektroporacja może być też stosowana do wprowadzania polinukleotydów do gospodarza. Jeśli wektor jest wirusem może być pakowany in vitro lub wprowadzony do komórki pakującej i pakowany wirus może być transdukowany do komórek. Szeroki zakres technik odpowiednich do uzyskania polinukleotydów i do wprowadzania polinukleotydów do komórki jest dobrze znany i rutynowy dla specjalistów. Takie techniki są szeroko opisane w Sambrook i wsp., co ilustruje wiele podręczników laboratoryjnych, które podają te techniki szczegółowo. Wektor może być na przykład wektorem plazmidowym, jedno lub dwuniciowym wektorem fagowym, jedno lub dwuniciowym wektorem wirusowym, RNA lub DNA. Takie wektory mogą być wprowadzane do komórek jako polinukleotydy, korzystnie DNA za pomocą znanych technik do wprowadzania DNA i RNA do komórek. Wektory, w przypadków wektorów fagowych i wirusowych, mogą być też i korzystnie są wprowadzane do komórek jako pakowane lub kapsydowane wirusy za pomocą dobrze znanych technik dla infekcji i transdukcji. Wektory wirusowe mogą być kompetentne pod względem replikacji lub defektywne pod względem replikacji. W tym drugim przypadku replikacja wirusa będzie tylko zachodzić w komplementujących komórkach gospodarza.

Korzystne wśród wektorów pod pewnymi względami są te do ekspresji polinukleotydów i polipeptydów.

Na ogół takie wektory zawierają cis-dzialające regiony kontrolne skuteczne dla ekspresji w gospodarzu funkcjonalnie połączonej do polinukleotydu, który ma ulec ekspresji. Odpowiednie czynniki trans-działające są albo dostarczane przez gospodarza, dostarczane przez komplementujący wektor lub dostarczane przez sam wektor po wprowadzeniu do gospodarza.

W niektórych korzystnych wykonaniach pod tym wzglę dem, wektory wykazują specyficzną ekspresję. Taka specyficzna ekspresja może być ekspresją indukowalną lub ekspresją tylko w pewnych typach komórek lub zarówno indukowalną jak i komórkowo specyficzną. Szczególnie korzystne wśród wektorów indukowalnych są wektory, które mogą być indukowane do ekspresji przez czynniki środowiskowe, którymi można łatwo manipulować, takimi jak temperatura i dodatek składników odżywczych. Różne wektory, w tym konstytutywne i indukowalne wektory ekspresyjne do stosowania u gospodarzy prokariotycznych i eukariotycznych, są dobrze znane i stosowane rutynowo przez specjalistów.

Uzyskane technikami inżynierii genetycznej komórki gospodarza mogą być hodowane w konwencjonalnych podłożach odżywczych, które mogą być zmodyfikowane odpowiednio między innymi dla aktywacji promotorów, selekcji transformantów lub amplifikacji genów. Warunki hodowli takie jak temperatura, pH i tym podobne uprzednio stosowane z komórką gospodarza wybraną dla ekspresji na ogół będą odpowiednie dla ekspresji polipeptydów, co będzie ewidentne dla specjalistów.

Ogromna różnorodność wektorów ekspresyjnych może być stosowana do ekspresji polipeptydu. Takie wektory obejmują chromosomalne, episomalne i pochodzące od wirusów wektory, np. wektory pochodzące z plazmidów bakteryjnych, z bakteriofagów, z episomów drożdży, z elementów chromosomalnych drożdży, z wirusów takich jak bakulowirusy, wirusy papowa takie jak SV40, wirusy

PL 207 634 B1 krowianki, adenowirusy, wirusy ospy ptasiej, wirusy pseudowścieklizny, retrowirusy, i alfawirusy takie jak wirus Sindibs, i wektory pochodzące z ich kombinacji, takie jak te pochodzące z elementów genetycznych plazmidów i bakteriofagów takie jak kosmidy i fagemidy, wszystkie mogą być stosowane do ekspresji. Ogólnie dowolny wektor odpowiedni do utrzymania, namnażania lub wyrażania polinukleotydów aby wyrazić polipeptyd u gospodarza może być pod tym względem stosowany do ekspresji.

Odpowiednia sekwencja DNA może być wstawiona do wektora przez dowolną z szeregu dobrze znanych i rutynowych technik. Ogólnie sekwencja DNA do ekspresji jest łączona z wektorem ekspresyjnym przez przecięcie sekwencji DNA i wektora ekspresyjnego jedną lub więcej endonukleazą restrykcyjną i następnie połączenie fragmentów restrykcyjnych razem stosując ligazę DNA T4. Procedury dla restrykcji i ligacji, które mogą być w tym celu stosowane są dobrze znane i rutynowe dla specjalistów. Odpowiednie procesy pod tym względem i do konstrukcji wektorów ekspresyjnych stosując alternatywne, które także są dobrze znane i rutynowe dla specjalistów, są przedstawione bardzo szczegółowo w Sambrook i wsp..

Sekwencja DNA w wektorze ekspresyjnym jest połączona funkcjonalnie do odpowiedniej sekwencji kontrolnej (kontrolnych) obejmując na przykład promotor do kierowania transkrypcją mRNA. Przedstawiciele takich promotorów obejmują promotor PL faga lambda, promotory lac, trp, tac i trc E. coli, wczesne i późne promotory SV40 i promotory retrowirusowych LTR, by wymienić tylko kilka z dobrze znanych promotorów. Jest oczywiste, że liczne promotory są dobrze znane i mogą łatwo być stosowane przez specjalistów, co zilustrowano w dyskusji i przykładach.

Ogólnie konstrukty ekspresyjne będą zawierały miejsca dla inicjacji transkrypcji i terminacji i w regionie transkrybowanym miejsce wiązania rybosomów do translacji. Część koduj ą ca transkryptów wyrażana przez konstrukty będzie obejmować inicjujący translację AUG na początku i kodon terminacji odpowiednio umieszczony na końcu polipeptydu, który ma ulec translacji.

Dodatkowo konstrukty mogą zawierać regiony, które regulują jak i generują ekspresję. Ogólnie zgodnie z wieloma często stosowanymi procedurami, takie regiony będą działały przez kontrolę transkrypcji, tak jak miejsca wiązania represora i enhancery, między innymi.

Wektory do namnażania i ekspresji na ogół będą zawierały markery selekcyjne. Takie markery mogą też być odpowiednie do amplifikacji lub wektory mogą zawierać dodatkowe markery. Pod tym względem wektory ekspresyjne korzystnie zawierają jeden lub więcej gen selekcyjnego markera aby dostarczać cechę fenotypową do selekcji transformowanych komórek gospodarza. Korzystne markery obejmują reduktazę dihydrofolianu, oporność na neomycynę, puromycynę lub hygromycynę dla hodowli komórek eukariotycznych i geny oporności na tetracyklinę, teomycynę, kanamycynę lub ampicylinę dla hodowli E. coli i innych bakterii.

Wektor zawierający odpowiednie sekwencje DNA, jak opisano, oraz odpowiedni promotor i inne odpowiednie sekwencje kontroli może być wprowadzany do odpowiedniego gospodarza stosując różne dobrze znane techniki odpowiednie do jego ekspresji w nim pożądanych polipeptydów. Reprezentatywne przykłady odpowiednich gospodarzy obejmują komórki bakterii, takie jak komórki E. coli, Streptomyces i Salmonella typhimurium, komórki grzybów takie jak komórki drożdży, komórki owadów takie jak komórki Drosophila S2 i Spodoptera Sf9, komórki zwierząt takie jak CHO, COS i czerniaka Bowes, i komórki roślinne, a najbardziej korzystnie komórki owadów BTI-TN-5B1-4. Gospodarze dla wielu różnych konstruktów ekspresyjnych są dobrze znani i specjalistom obecne ujawnienie umożliwi łatwy wybór gospodarza do ekspresji polipeptydów zgodnie z wynalazkiem.

Do ekspresji mogą być stosowane także różne systemy hodowli komórek ssaków. Przykłady systemów ekspresji ssaków obejmują linie COS-7 fibroblastów nerki małpy (Gluzman i wsp., Cell 23: 175, 1991). Inne linie komórkowe zdolne do ekspresji kompatybilnego wektora obejmują na przykład linie komórkowe C127, 3T3, CHO, HeLa, ludzka nerka 293 i BHK. W komórkach gospodarza ssaka może być stosowany szereg systemów opartych na wirusach. W przypadkach gdy jako wektor ekspresyjny jest stosowany adenowirus, sekwencja polinukleotydów kodująca RG1 może być wligowana do kompleksu transkrypcji/translacji adenowirusa złożonej z sekwencji późnego promotora i trzyczęściowego lidera. Insercja do nie będącego niezbędnym regionu E1 lub E3 genomu wirusa da w efekcie żywotny wirus zdolny do ekspresji RG1 w zakażonych komórkach gospodarza (Logan i Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-59, 1984). Dodatkowo sekwencje wzmagające transkrypcję takie jak enhancer wirusa mięsaka Rousa (RSV) mogą być stosowane do zwiększenia ekspresji w komórkach gospodarza ssaka.

Zrekombinowane konstrukty, takie jak konstrukty ekspresyjne, zawierają jedną lub więcej sekwencji. Konstrukty zawierają wektor, taki jak wektor plazmidowy lub wirusowy, do których taka se16

PL 207 634 B1 kwencja może być wstawiona. Sekwencja może być wstawiona w orientacji do przodu lub odwrócona. W pewnych korzystnych wykonaniach, konstrukt zawiera sekwencje regulatorowe, obejmują ce na przykład promotor połączony funkcjonalnie z sekwencją. Duże ilości odpowiednich wektorów i promotorów są znane specjalistom i jest wiele promotorów dostępnych w handlu, odpowiednich do stosowania.

Następujące wektory, które są handlowo dostępne są dostarczone jako przykład. Wśród wektorów korzystnych do stosowania u bakterii są pQE70, pQE60 i pQE-9 dostępne od Quiagen USA (Valencia, CA), wektory pBS, wektory Phagescript^®, wektory pBluescript^®, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A dostępne od Stratagene (La Jolla, CA); i ptrc99a, pK223-3, pKK233-3, pDR50, pRIT5 dostępne od Pharmacia Biotech (Piscataway, N.J.). Najbardziej korzystny jest wektor pTrcHisB, dostępny od Invitrogen. Wśród najbardziej korzystnych eukariotycznych wektorów są pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXT1 i pSG dostępne od Stratagene, i PEKV3, pBPV, pMSG i pSVL dostępne od Pharmacia Biotech. Najbardziej korzystny jest wektor pCLneo dostępny od Promega. Te wektory są wyliczone wyłącznie jako ilustracja wielu handlowo dostępnych i dobrze znanych wektorów, które są dostępne dla specjalistów do stosowania. Dowolny inny plazmid lub wektor odpowiedni na przykład do wprowadzenia, utrzymywania, namnażania lub ekspresji polinukleotydu lub polipeptydu może być stosowany u gospodarza.

Regiony promotora mogą być wybrane z dowolnego pożądanego genu stosując wektory, które zawierają reporterowy region transkrypcyjny pozbawiony regionu promotora taki jak jednostka transkrypcji acetylotransferazy chloramfenikolu („cat), poniżej miejsca lub miejsc restrykcyjnych do wprowadzania kandydata na fragment promotora, tzn. fragment, który może zawierać promotor. Jak dobrze wiadomo wprowadzenie do wektora fragmentu zawierającego promotor w miejsce restrykcyjne powyżej genu cat powoduje produkcje aktywności CAT, która może być wykryta za pomocą standardowych oznaczeń CAT. Wektory odpowiednie do tego celu są dobrze znane i łatwo dostępne. Dwa takie wektory to pKK232-B o pCM7. Tak więc promotory do ekspresji polinukleotydów obejmują nie tylko dobrze znane i łatwo dostępne promotory ale także promotory, które mogą być łatwo uzyskane przez uprzednią technikę stosując gen reporterowy.

Wśród dobrze znanych promotorów bakterii odpowiednich do ekspresji polinukleotydów są promotory lacI i lacX E. coli, promotory T3 i T7, promotor T5 tac, promotory lambda PR, PL, promotor trp, i hybrydowy promotor trc, który pochodzi z promotorów trp i lac. Wśród znanych promotorów eukariotycznych odpowiednich pod tym względem są bezpośredni wczesny promotor CMV, promotor kinazy tymidynowej HSV, wczesne i późne promotory SV40, promotory retrowirusowych LTR takie jak te z wirusa mięsaka Rousa („RSV) i promotory metalotioneiny, takie jak promotor metalotioneiny-I myszy.

Wybór odpowiednich wektorów i promotorów do ekspresji w komórce gospodarza jest dobrze znaną procedurą i niezbędne techniki do konstrukcji wektora ekspresyjnego, wprowadzania wektora do gospodarza i ekspresji w gospodarzu są rutynowymi umiejętnościami w dziedzinie.

Ogólnie zrekombinowane wektory ekspresyjne będą zawierały początki replikacji, promotor pochodzący od genu wyrażanego na wysokim poziomie do sterowania transkrypcją położonej poniżej sekwencji strukturalnej i marker selekcyjny, aby pozwolić na izolację komórek zawierających wektor po ekspozycji na wektor.

Opisano tu też komórki gospodarza zawierające konstrukty. Komórka gospodarza może być komórką wyższego eukarionta, taką jak komórka ssaka, lub komórką niższego eukarionta, taką jak komórka drożdży, lub komórka może być komórką prokariotyczną, taką jak komórka bakterii. Konstrukty w komórkach gospodarza mogą być stosowane konwencjonalnie do produkcji produktu genu kodowanego przez zrekombinowaną sekwencję.

Polipeptydy mogą być wyrażane w komórkach ssaków, drożdży, bakterii lub innych komórkach pod kontrolą odpowiednich promotorów. Bezkomórkowe systemy translacji mogą być stosowane do produkcji takich białek stosując RNA pochodzące z konstruktów DNA. Odpowiednie wektory do klonowania i ekspresji do stosowania z gospodarzami prokariotycznymi i eukariotycznymi są opisane przez Sambrook i wsp..

Transkrypcja DNA kodującego polipeptydy przez wyższe eukariota może być zwiększona przez wstawienie sekwencji enhancera do wektora. Enhancery są cis działającymi elementami DNA, na ogół około 10 do 300 bp, które działają by zwiększyć aktywność transkrypcyjną promotora w danym typie komórek gospodarza. Przykłady enhancera obejmują enhancer SV40, który jest zlokalizowany ze strony późnej początku replikacji w bp 100 do 270, enhancer wczesnego promotora cytomegalowirusa, enhancer polioma z późnej strony początku replikacji i enhancery adnowirusa.

PL 207 634 B1

Polinukleotydy, kodujące heterologiczną sekwencję strukturalną polipeptydu będą na ogół wstawione do wektora stosując techniki standardowe tak, że miejsce startu transkrypcji jest umieszczone odpowiednio 5' w stosunku do miejsca wiązania rybosomu. Miejsce wiązania rybosomu będzie 5' w stosunku do AUG, które inicjuje translację polipeptydu, który ma ulec ekspresji. Na ogół nie będzie innych otwartych ramek odczytu, które zaczynają się kodonem inicjacyjnym, zazwyczaj AUG, i leżą między miejscem wiązania rybosomu i inicjującym AUG. Także na ogół będzie miejsce stop translacji na końcu polipeptydu i będzie sygnał poliadenylacji i sygnał terminacji transkrypcji, odpowiednio rozmieszczone na końcu 3' regionu transkrybowanego.

Dla sekrecji ulegającego translacji białka do światła reticulum endoplazmatycznego, do przestrzeni peryplazmatycznej lub do otoczenia zewnątrzkomórkowego, odpowiednie sygnały sekrecji mogą być włączone do wyrażanego polipeptydu. Sygnały mogą być endogenne dla polipeptydu lub mogą być sygnałami heterologicznymi. Polipeptyd może być wyrażany w formie zmodyfikowanej, takiej jak fuzja białkowa, i może zawierać nie tylko sygnały sekrecji ale dodatkowe heterologiczne regiony funkcjonalne. Tak na przykład region dodatkowych aminokwasów, szczególnie aminokwasów naładowanych, może być dodany do N-końca polipeptydu aby poprawić stabilność i utrzymywanie się w komórce gospodarza, w czasie oczyszczania lub późniejszej obróbki i przechowywania. Także specjalne regiony mogą być dodane do polipeptydu dla ułatwienia oczyszczania. Takie regiony mogą być usunięte przed ostatecznym przygotowaniem polipeptydu. Dodanie reszt peptydu do polipeptydów aby wygenerować sekrecję lub wydzielanie, poprawić stabilność i ułatwić oczyszczanie, między innymi, są znanymi i rutynowymi technikami w dziedzinie. Na przykład, gdy potrzebne są duże ilości RG1 dla indukcji przeciwciał, wektory, które sterują ekspresją fuzji białkowej na wysokim poziomie, które są łatwe do oczyszczenia mogą być pożądane. Takie wektory obejmują, ale nie są ograniczone do, wielofunkcyjne wektory do klonowania i ekspresji w E. coli takie jak Bluescript^® (Stratagene), w którym region kodujący rg1 może być wligowany do wektora w fazie z sekwencją N-końcowej Met i kolejnych 7 reszt β-galaktozydazy, tak że jest produkowane hybrydowe białko; wektory pIN (Van Heede i Shuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509, 1989) i tym podobne. Wektory PTrcHis (Invitrogen, Carlsbad, CA) mogą być stosowane do ekspresji obcych polipeptydów jako fuzji białkowych zawierających znacznik polihistydynowy (6xHis) do szybkiego oczyszczania. Białka produkowane w takich systemach są zaprojektowane by zawierały miejsca cięcia, takie jak miejsce cięcia enterokinazy, tak, że interesujący sklonowany polipeptyd może być dowolnie uwalniany od przyłączonej w formie fuzji reszty peptydu.

Po transformacji odpowiedniego szczepu gospodarza i wzroście szczepu gospodarza do odpowiedniej gęstości, indukowalne promotory o ile są obecne mogą być indukowane za pomocą odpowiednich sposobów (np. zmiana temperatury lub ekspozycja na induktor chemiczny) i komórki hodowane przez dodatkowy czas.

Następnie komórki są typowo zbierane przez wirowanie, rozbijane za pomocą sposobów fizycznych lub chemicznych i powstały surowy ekstrakt zachowuje się dla dalszego oczyszczania.

Komórki mikroorganizmów stosowane do ekspresji białek mogą być rozbite za pomocą dowolnego dogodnego sposobu, obejmując cykle zamrażania-rozmrażania, sonifikację, rozbicie mechaniczne lub zastosowanie czynników lizujących komórki takie sposoby są dobrze znane specjalistom.

Polipeptyd RG1 może być odzyskany i oczyszczony ze zrekombinowanych hodowli komórek przez dobrze znane sposoby obejmujące strącanie siarczanem amonu lub etanolem, ekstrakcję kwasem, chromatografię aniono lub kationowymienną, chromatografię na fosfocelulozie, chromatografię interakcji hydrofobowych, chromatografię powinowactwa, chromatografię na hydroksyapatycie i chromatografię na lektynie. Najbardziej korzystnie do oczyszczania stosowana jest wysoce wydajna chromatografia w cieczy („HPLC”). Dobrze znane techniki składania białek mogą być stosowane do regeneracji aktywnej konformacji gdy polipeptyd jest denaturowany w czasie izolacji i lub oczyszczania. Różne inne sposoby oczyszczania białek dobrze znane w dziedzinie obejmują te opisane w Deutscher, M. Methods in Enzymology, tom 182, Academic Press, San Diego, 1982; i Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, New York, 1982.

Alternatywnie polipeptydy mogą być produkowane przez bezpośrednią syntezę peptydów stosując techniki fazy stałej (Stewart i wsp., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Merrifield, J. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963). Synteza białka in vitro może być przeprowadzona stosując techniki manualne lub automatycznie. Automatyczna synteza może być uzyskana na przykład stosując Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City, Calif) zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta. Różne fragmenty RG1 mogą być

PL 207 634 B1 syntetyzowane oddzielnie i kombinowane stosując metody chemiczne aby wyprodukować cząsteczkę o peł nej dł ugoś ci.

Polipeptydy obejmują naturalnie oczyszczane produkty, produkty procedur syntezy chemicznej i produkty wytworzone za pomocą technik rekombinacji z gospodarza prokariotycznego lub eukariotycznego, obejmując na przykład komórki bakterii, drożdży, wyższych roślin, owadów i ssaków. W zależności od gospodarza stosowanego w procedurze zrekombinowanej produkcji polipeptydy mogą być glikozylowane lub nieglikozylowane. Dodatkowo polipeptydy mogą także obejmować początkową zmodyfikowaną resztę metioniny, w niektórych przypadkach jako wynik procesów z udziałem gospodarza.

Zastosowanie polipeptydów RG1 i polinukleotydów, które je kodują

Polinukleotydy Rg1 i polipeptydy RG1 mogą być stosowane w szeregu zastosowań, szczególnie tych, które wykorzystują chemiczne i biologiczne właściwości RG1. Dodatkowe zastosowania dotyczą diagnozy i terapii chorób proliferacji komórek takich jak rak prostaty.

Uzasadnienie stosowania sekwencji polinukleotydów i polipeptydów jest oparte częściowo na chemicznej i strukturalnej homologii między tu ujawnionym RG1 i innymi cząsteczkami macierzy zewnątrzkomórkowej i do preferencyjnej ekspresji RG1 w tkankach prostaty w porównaniu z innymi tkankami. RG1 może być stosowany w diagnozie i terapii stanów, zaburzeń lub chorób związanych z nieodpowiednim wzrostem tkanki prostaty. To nie ogranicza się do raka i wzrostu guza dającego przerzuty.

Sekwencje polinukleotydów Rg1 mogą być stosowane jako sondy DNA i jako cele dla terapii antysensownej i rybozymowej, lub jako matryce do produkcji antysensownych polinukleotydów.

Polipeptydy RG1 mogą być stosowane do generacji przeciwciał na RG1, które mogą być pożyteczne dla wykrywania poziomów polipeptydu RG1 w komórkach i tkankach i w adresowaniu leków do pierwotnych i metastatycznych guzów.

Polipeptydy RG1 mogą być stosowane do stymulacji odpowiedzi odpornościowej na komórki zawierające RG1.

Polinukleotydy kodujące RG1 mogą być pożyteczne w oznaczeniach diagnostycznych dla wykrycia poziomów polinukleotydów kodujących RG1 w komórkach i tkankach.

W warunkach zwią zanych z ekspresją RG1 takich jak rak prostaty, moż e być korzystne zahamowanie ekspresji lub aktywności RG1. Ekspresja RG1 może być suprymowana przez podanie antysensownych oligonukleotydów lub rybozymów. Alternatywnie, przeciwciała specyficznie rozpoznające regiony polipeptydu RG1, które są odpowiedzialne za jego aktywność mogą być podawane do leczenia chorób lub stanów związanych z aktywnością RG1.

Oznaczenia polinukleotydów

Wynalazek jest także związany z zastosowaniem polinukleotydów związanych z rg1 do wykrywania komplementarnych polinukleotydów, takich jak na przykład odczynnik diagnostyczny. Detekcja polinukleotydów rg1 związanych ze stanem choroby dostarczy narzędzia do opracowania diagnostyki in vitro i in vivo, która może dodać do lub określić diagnozę choroby lub podatności na chorobę, która jest wynikiem tkankowo specyficznej ekspresji RG1.

Osoby niosące mutacje w genie kodującym RG1 mogą być wykryte na poziomie DNA za pomocą szeregu technik. Próbki polinukleotydów do diagnozy mogą być uzyskane z komórek pacjenta, takich jak krew, mocz, ślina, i materiał z biopsji tkanki lub autopsji. DNA genomowy może być zastosowany bezpośrednio do detekcji lub może być amplifikowany enzymatycznie przez stosowanie PCR przed analizą (Saiki i wsp., Nature, 324: 163-166, 1986). RNA lub cDNA może być też stosowany w ten sam sposób. Jako przykł ad startery PCR komplementarne do sekwencji polinukleotydów kodującej RG1 mogą być stosowane do identyfikacji i analizy ekspresji i mutacji rg1. Na przykład delecje i insercje mogą być wykryte przez zmianę wielkości zamplifikowanego produktu w porównaniu z normalnym genotypem. Mutacje punktowe mogą być zidentyfikowane przez hybrydyzację zamplifikowanego DNA do znakowanego radioaktywnie RNA rg1 lub alternatywnie znakowane radioaktywne antysensowne sekwencje DNA rg1. Idealnie dopasowane sekwencje mogą być rozróżnione od niesparowanych dupleksów przez trawienie RNazą A lub przez różnice w temperaturach topnienia.

Różnice sekwencji między genem referencyjnym i genami mającymi mutacje mogą także być ujawnione przez bezpośrednie sekwencjonowanie DNA. Dodatkowo mogą być stosowane sklonowane segmenty DNA jako sondy do wykrycia specyficznych segmentów DNA. Czułość takich metod może być bardzo zwiększona przez odpowiednie zastosowanie PCR lub innej metody amplifikacji. Na przykład, starter do sekwencjonowania jest stosowany z produktem dwuniciowym PCR lub jednoniciową cząsteczką matrycy wygenerowanej przez zmodyfikowany PCR. Oznaczenie sekwencji jest

PL 207 634 B1 przeprowadzane przez konwencjonalne procedury i polinukleotydem znakowanym radioaktywnie lub przez automatyczne procedury sekwencjonowania ze znacznikami fluorescencyjnymi.

Testowanie genetyczne oparte na różnicach sekwencji DNA może być uzyskane przez wykrycie zmian w ruchliwości elektroforetycznej fragmentów DNA w żelu z lub bez czynników denaturujących. Niewielkie delecje i insercje sekwencji mogą być wizualizowane za pomocą wysokorozdzielczej elektroforezy w żelu. Fragmenty DNA o różnych sekwencjach mogą być rozróżnione na denaturujących żelach z gradientem formamidu, w których ruchliwości różnych fragmentów DNA jest opóźniony w żelu w róż nych pozycjach zależnie od ich specyficznych temperatur topnienia lub częściowego topnienia (patrz np. Myers i wsp., Science 230: 1242, 1985).

Zmiany sekwencji w specyficznych lokalizacjach mogą być także ujawnione przez oznaczenia z ochroną przed nukleazą , takie jak ochrona przed RNAzą i S1 lub metoda cię cia chemicznego (np. Catton i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397-4401, 1985).

Tak więc detekcja specyficznej sekwencji DNA może być uzyskana metodami takimi jak hybrydyzacja, ochrona przez RNazą, cięcie chemiczne, bezpośrednie sekwencjonowanie DNA lub stosowanie enzymów restrykcyjnych (np. polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych („RFLP) i blot typu Southern genomowego DNA).

W dodatku do bardziej konwencjonalnej elektroforezy w ż elu i sekwencjonowania DNA, mutacje mogą być też wykrywane przez analizę in situ.

Oznaczenia polipeptydów

Opisano także oznaczenia diagnostyczne takie jak ilościowe i diagnostyczne oznaczenia dla detekcji poziomów polipeptydu RG1 w komórkach i tkankach i płynach ustrojowych, w tym określenie poziomów normalnych i nienormalnych. Tak na przykład oznaczenie diagnostyczne do detekcji nadprodukcji polipeptydu RG1 w porównaniu z normalnymi próbkami tkanek kontrolnych może być stosowane do detekcji obecności nowotworów, na przykład raka prostaty. Takie testy diagnostyczne mogą być także stosowane do detekcji wzrostu metastatycznych nowotworów. Techniki oznaczenia, które mogą być stosowane do określenia poziomów polipeptydu takiego jak polipeptyd RG1 w próbce pochodzącej od gospodarza są dobrze znane specjalistom. Takie sposoby oznaczenia obejmują metody radioimmunologiczne (RIA), oznaczenia współzawodnictwa wiązania, analizę typu Western i oznaczenia enzymatyczne związane z immunoadsorbentem ELISA) i sortowanie komórek aktywowane przez fluorescencję (FACS). Wśród tych często korzystne są ELISA. Oznaczenie ELISA wstępnie obejmuje przygotowanie przeciwciała specyficznego dla RG1, korzystnie przeciwciała monoklonalnego. Dodatkowo na ogół przygotowuje się przeciwciało reporterowe, które wiąże się do przeciwciała monoklonalnego. Przeciwciało reportera jest przyłączone do wykrywalnego odczynnika takiego jak odczynnik radioaktywny, fluorescencyjny lub enzymatyczny, w tym przypadku odczynnik z peroksydazą chrzanową.

Aby przeprowadzić ELISA próbkę usuwa się z gospodarza i inkubuje na nośniku stałym, np. płytce polistyrenowej, która wiąże polipeptydy w próbie. Dowolne wolne miejsca wiążące polipeptydu na szalce są następnie pokrywane przez inkubację z niespecyficznym białkiem takim jak albumina surowicy bydlęcej. Następnie monoklonalne przeciwciało inkubuje się w płytce a monoklonalne przeciwciała przyłączają się do polipeptydów RG1 związanych z szalką polistyrenową. Niezwiązane monoklonalne przeciwciała odpłukuje się buforem. Przeciwciało reporterowe połączone z peroksydazą chrzanową jest umieszczane w szalce, co daje wiązanie przeciwciała reportera do dowolnego monoklonalnego przeciwciała związanego z RG1. Niezwiązane przeciwciało reporterowe jest następnie odpłukiwane. Następnie dodaje się do płytki odczynniki do aktywności peroksydazy, w tym substrat kolorymetryczny. Immobilizowana peroksydaza połączona z RG1 przez pierwotne i wtórne przeciwciała, produkuje barwny produkt reakcji. Ilość barwy rozwinięta w danym czasie wskazuje ilość obecnego polipeptydu RG1 w próbce. Ilościowe wyniki typowo otrzymuje się przez odniesienie do krzywej standardowej.

Można zastosować oznaczenie ze współzawodnictwem gdzie przeciwciała specyficzne na RG1 przyłącza się do stałego nośnika i znakowany RG1 i próbka pochodząca z gospodarza są przepuszczane przez stały nośnik i ilość znaku związanego ze stałym nośnikiem może być korelowana z ilością RG1 w próbie.

Te i inne oznaczenia są opisane między innymi w Hampton i wsp. (Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn, 1990) i Maddox i wsp. (J. Exp. Med. 158:12111, 1983).

Przeciwciała

Wynalazek dotyczy przeciwciał, które specyficznie wiążą RG1, określanych tu jako przeciwciała

RG1. Nadekspresja RG1 w tkankach prostaty i jego lokalizacja na powierzchni komórki stanowią ce20

PL 207 634 B1 chy znakomitego markera do skriningu, diagnostyki, prognozy, dalszych badań i metod obrazowania. Dodatkowo te cechy wskazują, że RG1 może być znakomitym celem do metod terapeutycznych takich jak adresowana terapia przeciwciałami, immunoterapia i terapia genowa. Określenie „specyficznie wiąże do dotyczy interakcji przeciwciała i polipeptydu, w którym interakcja jest zależna od obecności danej struktury (tzn. antygenowego determinantu lub epitopu) na polipeptydzie, inaczej mówiąc przeciwciało rozpoznaje i wiąże specyficzną strukturę polipeptydu raczej niż białka w ogólności.

Polipeptydy RG1, ich fragmenty lub inne pochodne lub ich analogi lub komórki je wyrażające mogą być stosowane jako immunogeny aby na nie wyprodukować przeciwciała (Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Te przeciwciała mogą być na przykład przeciwciałami poliklonalnymi lub monoklonalnymi. Ujawniono przeciwciała chimerowe, jednołańcuchowe, humanizowane i ludzkie, jak i fragmenty Fab, lub produkt biblioteki ekspresyjnej Fab. Róż ne procedury znane w dziedzinie mogą być stosowane do produkcji takich przeciwciał i fragmentów.

Przeciwciała wygenerowane przeciw polipeptydom odpowiadającym sekwencji mogą być uzyskane przez bezpośrednie wstrzyknięcie polipeptydów do zwierzęcia lub przez podanie polipeptydów zwierzęciu, korzystnie nie - człowiekowi. Tak uzyskane przeciwciało będzie samo wiązało polipeptydy. Sekwencja kodująca tylko fragment polipeptydów może być zastosowana do wygenerowania przeciwciał wiążących całe natywne polipeptydy. Takie przeciwciała mogą być stosowane do izolacji polipeptydu z tkanki wyrażającej ten polipeptyd.

Dla przygotowania przeciwciał monoklonalnych, dowolna technika, która dostarcza przeciwciała produkowane przez ciągłe linie komórkowe może być zastosowana. Przykłady obejmują technikę hybrydom (Kohler i Milstein, Nature 256: 495-497, 1975), technikę ludzkich hybrydom komórek B (Kozbor i wsp., Immunology Today 4: 72, 1983) i technikę hybrydomyEBV aby wyprodukować ludzkie przeciwciała monoklonalne (Cole i wsp., w Monoclonal Antibodies and Cancer, Alan R. Liss, Inc., 77-96, 1985).

Dodatkowo, mogą być stosowane techniki opracowane w produkcji „chimerowych przeciwciał, łączenie genów przeciwciał myszy do genów przeciwciał ludzkich aby otrzymać cząsteczkę z odpowiednią specyficznością antygenową i aktywnością biologiczną (Morrison i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855, 1984; Neuberger i wsp., Nature 312: 604-608, 1984; Takeda i wsp.. Nature 314: 452-454, 1985). Alternatywnie, techniki opisane dla produkcji przeciwciał jednołańcuchowych (US 4,946,778) mogą być stosowane do produkcji specyficznych dla RG1 przeciwciał jednołańcuchowych.

Co więcej, przeciwciała „ludzkie mogą być wyprodukowane stosując metody opisane w US 5,877,397 i 5,569,825, które są tu w całości włączone w formie odniesienia.

Przeciwciała mogą być też produkowane przez indukcję produkcji in vivo w populacji limfocytów lub przez skrining zrekombinowanych bibliotek immunoglobulin lub paneli wysoce specyficznych odczynników wiążących, jak ujawniono w Orlandi i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837, 1989) i Winter i Milstein (Nature 349: 293-299, 1991).

Fragmenty przeciwciał, które zawierają specyficzne miejsca wiążące dla RG1 też mogą być wygenerowane. Na przykład takie fragmenty obejmują, ale nie są ograniczone do, fragmentów F(ab')2, które mogą być wyprodukowane przez trawienie pepsyną cząsteczki przeciwciała i fragmentów Fab, które mogą być wygenerowane przez redukcję mostków dwusiarczkowych fragmentów F(ab')2. Alternatywnie, mogą być skonstruowane biblioteki ekspresyjne Fab aby pozwolić na łatwą i szybką identyfikację monoklonalnych fragmentów Fab z pożądaną specyficznością (Huse i wsp.. Science 256:12701281, 1989).

Sekwencja aminokwasów RG1 tu przedstawiona może być stosowana do wyboru specyficznych regionów polipeptydu RG1 dla generacji przeciwciał. Dla specjalistów będzie zrozumiałe, że regiony lub epitopy polipeptydu RG1, na które jest skierowane przeciwciało mogą zmieniać się w zależności od zamierzonego zastosowania. Na przykład, przeciwciała przeznaczone do zastosowania w immunooznaczeniu do detekcji zwią zanego z membraną RG1 na komórkach prostaty powinny być skierowane na dostępne epitopy na polipeptydzie RG1. Regiony polipeptydu RG1, które wykazują strukturę immunogenną jak i inne regiony i domeny mogą być identyfikowane stosując różne inne sposoby znane w dziedzinie takie jak analiza Chou-Fasman, Garnier-RObson lub Jameson-Wolf. Fragmenty zawierające te reszty są szczególnie odpowiednie do generacji przeciwciał anty-RG1. Szczególnie użyteczne fragmenty obejmują, ale nie są ograniczone, sekwencje PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEQ ID NO:8); HSSDYSMWRKNQYVS (SEQ ID NO:10); DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (SEQ ID NO:11); i NEIVDSASVPET (SEQ ID NO:12). Generacja poliklonalnych przeciwciał na te regiony jest opisana w Przykładzie 4.

PL 207 634 B1

Przeciwciała RG1 według wynalazku mogą być szczególnie użyteczne do oznaczeń diagnostycznych, metodologii obrazowych, i metod terapeutycznych dla kontroli raka prostaty. Wynalazek dostarcza różne oznaczenia immunologiczne pożyteczne dla detekcji polipeptydów RG1 i dla diagnozy raka prostaty. Takie oznaczenia na ogół obejmują jedno lub więcej przeciwciał RG1 zdolnych do rozpoznawania i wiązania polipeptydu RG1. Najbardziej korzystne przeciwciała będą selektywnie wiązać RG1 i nie będą wiązać (lub wiązać słabo) polipeptydy nie-RG1. Oznaczenia obejmują różne typy immunooznaczeń znanych w dziedzinie obejmując, ale nie ograniczając się do, różne typy immunooznaczeń, oznaczeń immunoabsorbcyjnych związanych z enzymem, i tym podobne. Dodatkowo metody immunologicznego obrazowania zdolne do detekcji raka prostaty są także opisane i obejmują metody obrazowania radioscyntygraficzne z zastosowaniem oznakowanych przeciwciał RG1. Takie oznaczenia mogą być klinicznie pożyteczne w detekcji, monitorowaniu i prognozowaniu raka prostaty.

Opisane przeciwciała mogą być stosowane do izolacji lub identyfikacji klonów wyrażających polipeptyd lub do oczyszczenia polipeptydu przez wiązanie przeciwciała do stałego nośnika do izolacji i/lub oczyszczenia za pomocą chromatografii powinowactwa. Dodatkowo przeciwciała mogą być stosowane do izolacji komórek RG1 dodatnich stosując techniki sortowania i oczyszczania komórek. W szczególności, przeciwciała RG1 mogą być stosowane do izolacji komórek raka prostaty z komórek ksenoprzeszczepu raka, z komórek w hodowli itd. stosując sortowanie komórek oparte na przeciwciałach lub techniki oczyszczania przez powinowactwo. Inne zastosowania przeciwciał RG1 według wynalazku obejmują generację antyidiotypowych przeciwciał, które imitują polipeptyd RG1.

Przeciwciała RG1 mogą być stosowane do wykrycia obecności przerzutów raka lub guzów prostaty. Obecność takich komórek zawierających RG1 w obrębie różnych próbek biologicznych, w tym surowicy, i w próbkach biopsji prostaty lub innych tkanek może być wykryta z przeciwciałami RG1. Dodatkowo przeciwciała RG1 mogą być stosowane w różnych metodologiach obrazowania takich jak immunoscyntygrafia z przeciwciałem skoniugowanym z Tc99m (lub innym izotopem). Na przykład, protokół obrazowania podobny do tego opisanego, stosując przeciwciało anty-PMSA koniugowane z In-111 moż e być zastosowane do detekcji wznowy i przerzutów raków prostaty (Sodee i wsp. Clin. Nuc. Med. 21: 759-766, 1997).

Przeciwciała RG1 według wynalazku mogą być znakowane wykrywalnym markerem lub skoniugowane z drugą cząsteczką taką jak czynnik cytotoksyczny, i stosowane do adresowania drugiej cząsteczki do komórki RG1 dodatniej (Vitetta, E.S> i wsp., Immunotoxin Therapy w DeVita, Jr., V.T. i wsp., red: Cancer: Principles and Practice of Oncology, wyd. 4, red. J.N. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-2636, 1993). Przykłady czynników cytotoksycznych obejmują, ale bez ograniczenia, rycynę, doksorubicynę, daunorubicynę, taksol, bromek etydyny, mitomycynę, etopozyd, tenopozyd, winkrystynę, winblastynę, kolchicynę, dion dihydroksyantracyny, aktynomycynę D, toksynę dyfterytu, eksotoksynę Pseudomonas (PE)A, PE40, abrynę i glukokortykoid i inne czynniki chemoterapeutyczne jak i radioizotopy. Odpowiednie markery do detekcji obejmują , ale nie są ograniczone, radioizotop, zwi ązek fluorescencyjny, związek bioluminescencyjny, związek chemiluminescencyjny, chelator metali lub enzym. Odpowiednie radioizotopy obejmują następujące: antymon-124, antymon-125, arsen-74, bar-103, bar-140, beryl-7, bizmut-j206, bizmut-207, kadm-109, kadm-115m, wapń-45, cer-139, cer-141, cer-144, cez-137, chrom-51, kobalt-56, kobalt-57, kobalt-58, kobalt-60, kobalt-64, erb-169, europ-152, gadolin-153, złoto-195, złoto-199, hafn-175, hafn-181, ind-11, jod-123, jod-131, iryd-192, żelazo-55, żelazo-59, krypton-85, ołów-210, mangan-54, rtęć-197, rtęć-203, molibden-99, neodym-147, neptun-237, nikiel-63, niob-95, osm-185+191, palad-103, platyna-195m, prazeodym-143, promet-147, proaktyn-233, rad-2226, ren-186, rubid-86, ruten-103, ruten-106, skand-44, skand-46, selen-75, srebro-110m, srebro-11, sód-22, stront-85, stront-89, stront-90, siarka-35, tantal-182, technet-99m, telur125, telur-132, tal-170, tal-204, tor-228, tor-232, cyna-113, tytan-44, wolfram-185, wanad-48, wanad49, iterb-169, itr-88, itr-90, itr-91, cynk-65 i cyrkon-95.

Immunoterapia dla raka prostaty

Ujawniono różne sposoby immunoterapii do leczenia raka prostaty, w tym terapię przeciwciałami, szczepionki in vivo i podejścia immunoterapii ex vivo. Wynalazek dostarcza przeciwciała RG1, które mogą być stosowane ogólnoustrojowo do leczenia raka prostaty. Na przykład niekoniugowane przeciwciała RG1 mogą być wprowadzone do pacjenta tak, że przeciwciało wiąże się do RG1 na lub w komórkach związanych z komórkami raka prostaty i bierze udział w niszczeniu komórek i guza przez mechanizmy, które mogą obejmować cytolizę z udziałem dopełniacza, cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał, zmienianie funkcji fizjologicznej RG1 i/lub hamowanie wiązania ligandu lub szlaku sygnału transdukcji. Przeciwciała RG1 koniugowane z toksycznymi czynnikami takimi jak

PL 207 634 B1 rycyna lub radioizotopy mogą być też stosowane terapeutycznie do dostarczania czynnika toksycznego bezpośrednio do komórek prostaty niosących RG1 i tak niszczą komórki guza.

Immunoterapia raka prostaty stosując przeciwciała RG1 może stosować się do nauk wygenerowanych z różnych podejść, które były z powodzeniem stosowane w stosunku do innych typów raka, obejmując, ale nie ograniczone do, rak jelita grubego (Arien i wsp., Crit. Rev. Immunol. 18: 1333-138, 1998), szpiczak mnogi (Ozaki i wsp., Blood 90:3179-3186, 1997; Tsunenari i wsp., Blood 90: 24372444, 1997), rak żołądka (Kasprzyk i wsp., Cancer Res. 52:2771-2776, 1992), chłoniak komórek B (Funakoshi i wsp., Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: 93-101, 1996), białaczkę (Zhong i wsp., Leuk. Res. 20: 581-589, 1996), rak jelita grubego i odbytnicy (Moun i wps., Cancer Res. 54: 6160-6166, 1994; Velders i wsp., Cancer Res. 55: 4398-4403, 1995) i rak piersi (Shepard i wsp., J. Clin. Immunol. 11: 117-127, 1991).

Ujawniono szczepionki formułowane tak aby zawierały polipeptyd RG1 lub jego fragment. Zastosowanie antygenu guza w szczepionce do generacji odporności humoralnej i komórkowej do stosowania w terapii przeciwnowotworowej jest dobrze znane i było stosowane w raku prostaty stosując immunogeny PSMA ludzki i PAP gryzoni (Hodge i wsp., Int. J. Cancer 63: 231-237, 1995; Fong i wsp., J. Immunol. 159:3113-3117. 1997). Takie sposoby mogą być łatwo praktykowane przez stosowanie polipeptydu RG1 lub jego fragmentu, lub cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej RG1 i zrekombinowane wektory zdolne do wyrażania i odpowiedniego prezentowania immunogenu RG1.

Na przykład wirusowe systemy dostarczania genów mogą być stosowane do dostarczania cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej RG1. Różne systemy dostarczania wirusów, które mogą być stosowane w praktyce obejmują, ale nie są ograniczone, wirus krowianki, ospy ptaków, ospy kanarków, adenowirus, grypę, wirus polio, wirus związany z adeno, lentiwirus i wirus sindbis (Restifo, w Curr. Opin. Immunol. 8: 658-663, 1996. Mogą być też stosowane niewirusowe systemy dostarczania przez stosowanie nagiego DNA kodującego polipeptyd RG1 lub jego fragment wprowadzony do pacjenta (np. domięśniowo) do indukcji odpowiedzi przeciw guzowi. Może być stosowany ludzki cDNA rg1 pełnej długości. W innym przypadku mogą być stosowane fragmenty ludzkiego cDNA rg1 lub cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące specyficzne epitopy limfocytów T (CTL). Epitopy CTL można określić stosując specyficzne algorytmy (np. Epimer, Brown University) aby zidentyfikować peptydy w obrę bie polipeptydu RG1, które s ą zdolne do optymalnego wią zania okreś lonych alleli HLA.

Mogą być także stosowane różne strategie ex vivo. Jedna opcja obejmuje stosowanie komórek dendrytycznych do prezentacji polipeptydu RG1 jako antygenu układowi odpornościowemu pacjenta. Komórki dendrytyczne wyrażają MHC klasy I i II, kostymulator B7 i IL-12 i są więc wysoce wyspecjalizowanymi komórkami prezentującymi antygen. W raku prostaty autologiczne komórki dendrytyczne stymulowane peptydami antygenu błonowego specyficznego dla prostaty (PMSA) są stosowane w badaniach klinicznych Fazy I aby stymulowa ć ukł ady odpornoś ciowe pacjentów (Tjoa i wsp.. Prostate 28: 65-69, 1996; Murphy i wsp.. Prostate 29: 371-380). Komórki dendrytyczne mogą być stosowane do prezentacji polipeptydów RG1 komórkom T w kontekście cząsteczek klasy I i II MHC. W pewnym przypadku autologiczne komórki dendrytyczne są pulsowane polipeptydami RG1 zdolnymi do wiązania cząstek MHC, a w innym - komórki dendrytyczne są pulsowane całkowitym polipeptydem RG1. Jeszcze inna opcja obejmuje inżynierię nadekspresji genu rg1 w komórkach dendrytycznych stosując różne wektory do wprowadzania znane w dziedzinie takie jak adenowirus (Arthur i wsp., Cancer Gene Ther. 4:17-25, 1997), retrowirus (Henderson i wsp., Cancer Res. 56: 3763-3770, 1996), lentiwirus, wirus związany z adeno, transfekcja DNA (Ribas i wsp., Cancer Res. 57: 2885-2869, 1997) i transfekcja RNA pochodzącego z guza (Ashley i wsp., J. Exp. Med. 186: 1177-1182, 1997).

Anty-idiotypowe przeciwciała anty-RG1 mogą być też stosowane w terapii przeciwnowotworowej jako szczepionka do indukcji odpowiedzi odpornościowej na komórki eksprymujące polipeptyd RG1. Specyficznie generacja przeciwciał anty-idiotypowych jest dobrze znana w dziedzinie i może być łatwo przystosowana do generacji anty-idiotypowych przeciwciał anty-RG1, które imitują epitop polipeptydu RG1 (patrz na przykład Wagner i wsp., Hybridoma 16: 33-40, 1997; Foon i wsp., J. Clin. Invest. 96: 334-342, 1995; Herlyn i wsp., Cancer Immunol. Immunother 43: 65-76, 1996). Takie przeciwciało anty-idiotypowe może być stosowane w terapii anty-idiotypowej jak obecnie jest praktykowane z innymi przeciwciałami anty-idiotypowymi skierowanymi przeciwko antygenom guza.

Metody immunizacji genetycznej mogą być stosowane do generowania profilaktycznych lub terapeutycznych humoralnych i komórkowych odpowiedzi odpornościowych skierowanych przeciwko komórkom guza wyrażającym RG1. Stosując opisane tu cząsteczki DNA kodujące RG1 można bezpośrednio wstrzykiwać konstrukty zawierające DNA kodujący polipeptyd/immunogen RG1 i odpowiedPL 207 634 B1 nie regulatorowe sekwencje do mięśnia lub skóry osobnika, tak, że komórki skóry lub mięśnia pobiorą konstrukt i wyrażą zakodowany polipeptyd/immunogen RG1.

Polipeptyd/immunogen RG1 może być wyrażany jako polipeptyd powierzchniowy lub wydzielany. Ekspresja polipeptydu/immunogenu RG1 powoduje generację profilaktycznej lub terapeutycznej odporności komórkowej i humoralnej przeciwko rakowi prostaty. Różne profilaktyczne i terapeutyczne techniki immunizacji znane w dziedzinie mogą być stosowane (przegląd, patrz informacja i odnośniki opublikowane pod adresem internetowym www.genweb.com).

Oligonukleotydy antysensowne, wektory antysensowne i rybozymy

Polinukleotydy antysensowne komplementarne do rg1 mogą być przygotowane syntetycznie. Takie oligonukleotydy mogą być dostarczane do komórek z lub bez lipidów, które mogą pomagać w pobieraniu antysensownych oligonukleotydów do komórek.

Alternatywnie wektory ekspresyjne pochodzące z retrowirusów, adenowirusów, wirusów opryszczki lub krowianki lub z różnych plazmidów bakteryjnych mogą być także stosowane do konstrukcji i dostarczenia zrekombinowanych wektorów, które będą wyrażały antysensowny rg1. Patrz na przykład techniki opisane w Sambrook i wsp. (powyżej) i Ausubel i wsp.

Polinukleotydy zawierające sekwencję cDNA pełnej długości i/lub jej elementy regulatorowe pozwalają badaczom na stosowanie polinukleotydów rg1 jako narzędzi badawczych w niciach sensownych (Yossoufian i Lodish, Mol. Cell. Biol. 13:98-104, 1993) lub niciach antysensownych (Eguchi i wsp., Annu. Rev. Biochem. 60:631-652, 1991) dla regulacji funkcji genu. Taka technologia jest obecnie dobrze znana w dziedzinie i oligomery sensowne lub antysensowne lub większe fragmenty, mogą być zaprojektowane z różnych miejsc wzdłuż regionów kodujących lub kontrolnych.

Geny kodujące RG1 mogą być wyłączone przez transfekowanie komórki lub tkanki wektorami ekspresyjnymi, które będą wyrażały wysoki poziom pożądanego fragmentu polinukleotydu rg1. Takie konstrukty mogą zalać komórki niemożliwymi do translacji sekwencjami sensownymi lub antysensownymi. Nawet w nieobecności integracji do DNA takie wektory mogą nadal transkrybować cząsteczki RNA aż wszystkie kopie są unieczynnione przez endogenne nukleazy. Ekspresja przejściowa może trwać do miesiąca lub dłużej z niereplikującym wektorem i jeszcze dłużej jeśli odpowiednie elementy replikacyjne są częścią systemu wektora.

Jak wspomniano powyżej, modyfikację ekspresji genu można uzyskać przez zaprojektowanie cząsteczek antysensownych DNA lub RNA do kontroli regionów rg1 np. promotorów, enhancerów i intronów. Oligonukleotydy pochodzące z miejsca inicjacji trankrypcji np. miejsca między -10 i +10 regionów sekwencji lidera są korzystne. Cząsteczki antysensowne mogą być też zaprojektowane do blokowania translacji mRNA zapobiegając wiązaniu transkryptu do rybosomów. Podobnie hamowanie można uzyskać stosując metodologię parowania zasad „potrójny heliks. Parowanie potrójnego heliksu upośledza zdolność podwójnego heliksu do otwierania się dostatecznie dla wiązania polimeraz, czynników transkrypcyjnych lub cząsteczek regulatorowych. Niedawne postępy terapeutyczne z zastosowaniem tripleksowego DNA omówili Gee, J.E. i wsp. (w Huber i Car, Molecular and Immunologic Approaches,. Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., 1994).

Rybozymy są enzymatycznymi cząsteczkami DNA zdolnymi do katalizowania specyficznego cięcia DNA (US4,987,071; WO 93/23067). Mechanizm działania rybozymów obejmuje hybrydyzację specyficzną w stosunku do sekwencji cząsteczki rybozymu do komplementarnego docelowego RNA, po czym następuje cięcie endonukleolityczne. Konstruuje się cząsteczki rybozymu o motywie hammerhead (główki młotu), które mogą specyficznie i skutecznie katalizować endonukleolityczne cięcia RNA kodującego RG1. Specyficzne miejsca cięcia RNA w obrębie dowolnego potencjalnego celu RNA są na początku identyfikowane przez skanowanie docelowej cząsteczki pod kątem miejsc cięcia rybozymu, które obejmują następujące sekwencje GUA, GUU i GUC. Po identyfikacji krótkie sekwencje RNA między 15 i 20 rybonukleotydów odpowiadające regionowi genu docelowego zawierającemu to miejsce cięcia mogą być oceniane pod kątem cech struktury drugorzędowej, które mogą powodować brak działania oligonukleotydów. Odpowiedniość kandydatów na cele może być też oceniona przez testowanie dostępności dla hybrydyzacji przez komplementarne oligonukleotydy stosując oznaczenia ochrony przed rybonukleazą (Irie i wsp. Advance. Pharmacol. 40:207-257, 1991).

Cząsteczki antysensowne i rybozymy mogą być przygotowane dowolnie w sposób znany w dziedzinie do syntezy cząsteczek RNA. To obejmuje techniki chemicznej syntezy oligonukleotydów tak jak synteza na fazie stałej chemiczna fosforoamidytowa. Alternatywnie cząsteczki RNA można wygenerować za pomocą transkrypcji in vitro i in vivo lub przez sekwencje DNA kodujące RG1. Takie sekwencje DNA mogą być włączone do szerokiego zakresu wektorów z odpowiednimi promotorami

PL 207 634 B1 polimerazy RNA takimi jak T7 lub SP6. Alternatywnie antysensowne cząsteczki cDNA, które syntetyzują antysensowny RNA konstytutywnie lub indukowalnie mogą być wprowadzone do linii komórkowych, komórek lub tkanek.

Cząsteczki RNA mogą być modyfikowane aby zwiększyć stabilność wewnątrzkomórkową i okres półtrwania. Możliwe modyfikacje obejmują, ale nie są ograniczone, dodatek sekwencji flankujących na 5' i/lub 3' końcach cząsteczek lub zastosowanie fosforotioanu lub 2' O-metylu zamiast fosfosdiestrowych wiązań ze szkieletem cząsteczki. Zwiększoną stabilność można także uzyskać przez włączenie nietradycyjnych zasad takich jak inozyna i kueozyna jak i acetylo, metylo, tio i podobnie zmodyfikowanych form adeniny, cytydyny, guaniny, tyminy i urydyny, które nie są równie łatwo rozpoznawane przez endogenne endonukleazy.

Sposoby wprowadzania antysensownych wektorów do komórek lub tkanek obejmują te sposoby przedyskutowane poniżej i które są równie odpowiednie do terapii in vivo, in vitro i ex vivo. Dla terapii ex vivo wektory antysensowne są wprowadzane do komórek pobranych z pacjenta i klonowo namnażanych dla autologicznej transplantacji z powrotem do tego samego pacjenta jak przedstawiono w US 5,399,493 i 5,437,994. Dostarczenie przez transfekcję i liposomy lub inne czynniki oparte na lipidach lub nie oparte na lipidach są dobrze znane w dziedzinie.

Oznaczenia do identyfikacji czynników wiążących się z RG1

Ujawniono oznaczenia i sposoby, które mogą być stosowane do identyfikacji czynników, które wiążą RG1. Specyficznie, czynniki które wiążą RG1 mogą być identyfikowane za pomocą zdolności ligandu RG1 lub innego czynnika lub składnika do wiązania do RG1 i zdolności do hamowania/stymulowania aktywności RG1.

Alternatywnie czynniki, które wiążą polipeptyd RG1 mogą być identyfikowane stosując układ dwuhybrydowy drożdży lub oznaczenie z wychwytem wiązania. W układzie dwuhybrydowym drożdży jednostka ekspresji kodująca białko fuzyjne składające się z jednej podjednostki dwupodjednostkowego czynnika transkrypcyjnego i polipeptydu RG1 jest wprowadzona i wyrażana w komórce drożdży. Komórka jest dalej modyfikowana aby zawierała (1) jednostkę ekspresji kodującą wykrywalny marker, którego ekspresja wymaga dwupodjednostkowego czynnika transkrypcyjnego do ekspresji i (2) jednostkę ekspresji, która koduje białko fuzyjne zrobione z drugiej podjednostki czynnika transkrypcyjnego i sklonowanego odcinka DNA. Jeśli sklonowany odcinek DNA koduje białko, które wiąże się do polipeptydu RG1, ekspresja powoduje interakcję RG1 i kodowanego białka. To umieszcza dwie podjednostki czynnika transkrypcyjnego na tyle blisko, że mogą się wiązać, co pozwala na rekonstytucję czynnika transkrypcyjnego. To powoduje ekspresję wykrywalnego markera. Układ dwuhybrydowy drożdży jest szczególnie pożyteczny do skriningu biblioteki odcinków kodujących cDNA pod kątem komórkowych partnerów do wiązania RG1.

Polipeptydy RG1, które mogą być stosowane w powyższych oznaczeniach obejmują, ale nie są ograniczone do, wyizolowany polipeptyd RG1, fragment polipeptydu RG1, komórkę, która była zmieniona aby wyrażała polipeptyd RG1 lub frakcję komórki, która była zmieniona aby wyrażała polipeptyd RG1. Dalej polipeptyd RG1 może być całym polipeptydem lub określonym fragmentem polipeptydu RG1. Będzie ewidentne dla osoby o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie że tak długo jak polipeptyd RG1 może być badany pod kątem wiązania czynnika, np. przez zmianę w masie cząsteczkowej lub aktywności, może być stosowane obecne oznaczenie.

Sposób stosowany do identyfikacji czy czynnik/składnik komórki wiąże się do polipeptydu RG1 będzie przede wszystkim oparty na naturze stosowanego polipeptydu RG1. Na przykład oznaczenie z opóźnieniem migracji w żelu może być stosowane do określenia czy czynnik wiąże RG1 lub jego fragment. Alternatywnie, immunodetekcja i technologie biochip mogą być przystosowane do użycia z polipeptydem RG1. Specjalista może łatwo zastosować liczne techniki znane w dziedzinie do określenia czy dany czynnik wiąże się z polipeptydem RG1.

Czynniki i składniki komórkowe mogą być dalej testowane pod kątem zdolności do modulacji aktywności polipeptydu RG1 stosując system oznaczeń bezkomórkowych lub system oznaczeń komórkowych. W miarę jak aktywności polipeptydu RG1 stają się bardziej zdefiniowane, mogą być stosowane oznaczenia funkcjonalne oparte na zidentyfikowanej aktywności.

Czynnik określany jest jako antagonizujący aktywność RG1 gdy obniża on aktywność RG1. Korzystny antagonista będzie wybiórczo antagonizował RG1, nie wpływając na jakiekolwiek inne białka komórki. Co więcej, korzystny antagonista będzie obniżał aktywność RG1 o więcej niż 50%, bardziej korzystnie o więcej niż 90%, najbardziej korzystnie usuwając całą aktywność RG1.

PL 207 634 B1

Czynniki, które są oznaczane w tej metodzie mogą być wybrane losowo lub racjonalnie lub zaprojektowane. Czynnik jest losowo wybrany gdy czynnik jest wybrany losowo bez uwzględniania specyficznej sekwencji polipeptydu RG1. Przykładem losowo wybranych czynników jest zastosowanie biblioteki chemicznej lub biblioteki kombinatorycznej peptydów lub bulionu hodowli organizmu lub ekstraktu z roślin.

Mówi się, że czynnik jest zaprojektowany lub wybrany racjonalnie gdy czynnik jest wybrany na zasadzie nielosowej, która uwzględnia sekwencję miejsca docelowego i/lub jego konformację w połączeniu z działaniem czynnika. Czynniki mogą być wybrane racjonalnie lub zaprojektowane racjonalnie przez zastosowanie sekwencji peptydów, które stanowią polipeptyd RG1. Na przykład naturalnie wybrany czynnik peptydowy może być peptydem, którego sekwencja aminokwasów jest identyczna do fragmentu polipeptydu RG1.

Czynnikami badanymi mogą być, na przykład, peptydy, przeciwciała, oligonukleotydy, małe cząsteczki i pochodne witamin, jak i węglowodany. Specjalista łatwo rozpozna, że nie ma ograniczenia co do natury strukturalnej czynników stosowanych w skriningu. Jedna klasa czynników to czynniki peptydowe, których sekwencje aminokwasów są wybrane w oparciu o sekwencję aminokwasów polipeptydu RG1.

Czynniki peptydowe mogą być przygotowane stosując standardowe metody syntezy peptydów fazy stałej (lub w roztworze) jak wiadomo w dziedzinie. Dodatkowo DNA kodujący te peptydy może być syntetyzowany stosując handlowo dostępne instrumenty syntezy oligonukleotydów i produkowany w sposób zrekombinowany stosują c standardowe systemy zrekombinowanej produkcji. Produkcja z zastosowaniem syntezy peptydów fazy sta łej jest konieczna jeśli mają być włączone aminokwasy nie kodowane przez geny.

Inną klasą czynników są przeciwciała immunoreaktywne z krytycznymi pozycjami polipeptydu RG1. Jak opisano powyżej, przeciwciała uzyskuje się przez immunizację odpowiednich osobników ssaków peptydami zawierającymi jako regiony antygenowe te części polipeptydu RG1, na które mają być adresowane przeciwciała. Takie czynniki mogą być stosowane w kompetycyjnych badaniach wiązania aby zidentyfikować czynniki hamujące drugiej generacji jak i do blokowania aktywności RG1.

Ekstrakty komórkowe mogą być wodnymi ekstraktami komórek lub tkanek lub częściowo oczyszczonymi frakcjami komórkowymi. Specjalista łatwo rozpozna, że nie ma ograniczenia co do źródła ekstraktu komórkowego stosowanego w skriningu.

Czynniki, które wiążą polipeptyd RG1 takie jak przeciwciało RG1 mogą być stosowane do modulacji aktywności RG1, do adresowania czynników przeciwnowotworowych do odpowiednich komórek ssaka lub do identyfikacji czynników, które blokują interakcje z RG1. Komórki wyrażające RG1 mogą być adresowane lub identyfikowane przez stosowanie czynnika, który wiąże się z RG1.

Jak czynniki wiążące RG1 powinny być stosowane zależy od natury czynnika wiążącego RG1. Na przykład czynnik wiążący RG1 może być stosowany do dostarczania koniugowanych toksyn, takich jak toksyna dyfterytu, toksyna cholery, rycyna lub eksotoksyna Pseudomonas, do komórki wyrażającej RG1, modulacji aktywności Rg1, bezpośrednio zabić komórkę wyrażającą RG1, lub w skriningach do identyfikacji czynników wiążących kompetycyjnie. Na przykład, czynnik hamowania RG1 może być stosowany do bezpośredniego hamowania wzrostu komórek wyrażających RG1 podczas gdy czynnik wiążący RG1 może być stosowany jako czynnik diagnostyczny.

Kompozycje farmaceutyczne i podawanie

Opisano kompozycje farmaceutyczne, które mogą zawierać polinukleotydy rg1, polipeptydy RG1, przeciwciała, agonistów, antagonistów lub inhibitory, same lub w kombinacji z przynajmniej jednym innym czynnikiem takim jak stabilizujący związek, który może być podany w dowolnym sterylnym biokompatybilnym nośniku farmaceutycznym, obejmującym, ale nie ograniczonym, sól fizjologiczną, buforowaną sól fizjologiczną dekstrozę i wodę. Dowolne z tych cząsteczek mogą być podawane pacjentowi same lub w kombinacji z innymi czynnikami, lekami lub hormonami, w kompozycjach farmaceutycznych gdy są zmieszane z zaróbką (ami) lub farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami. Dopuszczalny farmaceutycznie nośnik jest bierny farmaceutycznie.

Ujawniono także podawanie kompozycji farmaceutycznych, ustnie lub pozajelitowo. Metody dostarczania pozajelitowego obejmują podawanie miejscowe, dotętnicze (bezpośrednio do guza), domięśniowe, podskórne, dordzeniowe, dooponowe, dokomorowe, dożylne, dootrzewnowe lub donosowe. Oprócz składników czynnych te kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać odpowiednie dopuszczalne farmaceutycznie nośniki obejmujące zaróbki i czynniki pomocnicze, które ułatwiają obróbkę składników czynnych do preparatów, które mogą być stosowane farmaceutycznie. Dalsze szczegóły do technik formułowania i podawania można znaleźć w ostatnim wydaniu Remington's Pharmaceutical Sciences (red. Maack Publishing Co., Easton, Pa).

PL 207 634 B1

Kompozycje farmaceutyczne do podawania doustnego mogą być formułowane stosując farmaceutycznie dopuszczalne nośniki dobrze znane w dziedzinie w dawkach odpowiednich do podawania doustnego. Takie nośniki umożliwiają formułowanie kompozycji farmaceutycznych jako tabletki, pigułki, drażetki, kapsułki, płyny, żele, syropy, papki, zawiesiny i tym podobne dla konsumpcji przez pacjenta.

Preparaty farmaceutyczne do stosowania doustnie mogą być uzyskane przez kombinację czynnych związków ze stałą zaróbką, dowolnie rozcierając powstałą mieszaninę i obrabianie mieszaniny granulek po dodaniu odpowiednich czynników dodatkowych, jeśli jest to potrzebne by uzyskać tabletki lub rdzenie drażetek. Odpowiednie zaróbki są wypełniaczami węglowodanowymi lub białkowymi takimi jak cukry, w tym laktoza, sacharoza, mannitol lub sorbitol, skrobia z kukurydzy, pszenicy, ryżu, ziemniaka lub innych roślin, celuloza - metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza lub karboksymetyloceluloza sodowa i gumy obejmując arabską i tragakant, i białka takie jak żelatyna i kolagen. Jeśli jest to pożądane mogą być dodane czynniki dezintegrujące lub rozpuszczające takie jak połączony krzyżowo poliwinylopyrrolidon, agar, kwas algininowy, lub jego sól taka jak alginian sodu.

Rdzenie drażetek są przygotowywane z odpowiednimi powleczeniami, takimi jak stężone roztwory cukru, które mogą także zawierać gumę arabską, talk, poliwinylopyrolidon, żel karbopol, glikol polietylenowy i/lub dwutlenek tytanu, roztwory lakierów, i odpowiednie rozpuszczalniki organiczne lub mieszaniny rozpuszczalników. Barwniki lub pigmenty mogą być dodane do tabletek lub powleczeń drażetek dla identyfikacji produktu lub by określić ilość związku czynnego, tzn. dawkę.

Preparaty farmaceutyczne, które mogą być stosowane doustnie obejmują kapsułki pchaj-dopasuj [push-fit capsules] zrobione z żelatyny, jak i miękkie zasklepione kapsułki zrobione z żelatyny i powleczenia takiego jak glicerol lub sorbitol. Kapsułki pchaj-dopasuj mogą zawierać składniki czynne zmieszane z wypełniaczem lub czynnikami wiążącymi takimi jak laktoza lub skrobie, środki poślizgowe takie jak talk lub stearynian magnezu, i dowolnie stabilizatory. W miękkich kapsułkach składniki czynne mogą być rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich płynach takich jak tłuste olejki, ciekła parafina lub płynny glikol polietylenowy ze stabilizatorami.

Formuły farmaceutyczne do podawania pozajelitowego obejmują roztwory wodne związków czynnych. Dla wstrzyknięcia, kompozycje farmaceutyczne mogą być formułowane w roztworach wodnych, korzystnie w odpowiednich fizjologicznie buforach takich jak roztwór Hanka, roztwór Ringera lub sól fizjologiczna. Wodne zawiesiny do iniekcji mogą zawierać substancje, które zwiększają lepkość zawiesiny, takie jak karboksymetyloceluloza sodowa, sorbitol lub dekstran. Dodatkowo zawiesiny składników czynnych mogą być przygotowane jako odpowiednie oleiste zawiesiny do iniekcji. Odpowiednie lipofilowe rozpuszczalniki lub nośniki obejmują tłuste oleje takie jak olej sezamowy, lub syntetyczne estry kwasów tłuszczowych takie jak oleinian etylu lub triglicerydy lub liposomy. Dowolnie zawiesina może też zawierać odpowiednie stabilizatory lub czynniki, które zwiększają rozpuszczalność związków by pozwolić na przygotowanie wysoce stężonych roztworów.

Dla podawania miejscowego lub do nosa, penetranty odpowiednie dla danej bariery do przejścia są stosowane w preparatach. Takie penetranty są ogólnie znane w dziedzinie.

Zestawy

Ujawniono farmaceutyczne opakowania i zestawy zawierające jeden lub więcej pojemników wypełnionych jednym lub więcej składnikami kompozycji. Z takim pojemnikiem (pojemnikami) może razem być ulotka w formie przepisanej przez agendę rządową regulującą produkcję, stosowanie lub sprzedawanie farmaceutyków lub produktów biologicznych, stanowiąca odbicie przyzwolenia agendy dla produkcji, stosowania lub sprzedaży produktu dla podawania ludziom.

Produkcja i przechowywanie

Kompozycje farmaceutyczne mogą być produkowane znanym sposobem, tzn. za pomocą konwencjonalnego mieszania, rozpuszczania, granulowania, robienia drażetek, proszkowania, emulgowania, wyłapywania lub liofilizacji.

Kompozycja farmaceutyczna może być dostarczona jako sól i może być robiona z wieloma kwasami, obejmując, bez ograniczania, kwas solny, siarkowy, octowy, mlekowy, winowy, jabłkowy, bursztynowy, itd. Sole mają skłonność do bycia lepiej rozpuszczalnymi w rozpuszczalnikach wodnych lub innych protonowych, niż odpowiednie formy wolnej zasady. W innych przypadkach korzystny preparat może być liofilizowanym proszkiem w 1mM-50 mM histydynie, 0,1% - 0,2% sacharozie, 2% - 7% mannitolu w zakresie pH od 4,5 do 5,5, które jest łączone z buforem przed użyciem.

Po przygotowaniu kompozycji farmaceutycznych zawierających opisany związek w dopuszczalnym nośniku mogą być umieszczone w odpowiednim pojemniku i oznakowane do leczenia wskazanego stanu.

Dla podawania RG1 takie oznakowanie by wskazywało ilość, częstość i sposób podawania.

PL 207 634 B1

Terapeutycznie skuteczna dawka

Kompozycje farmaceutyczne odpowiednie do stosowania obejmują kompozycje farmaceutyczne gdzie składniki czynne są zawarte w skutecznej ilości aby osiągnąć zamierzony cel, tzn. leczenie danego stanu chorobowego charakteryzowanego przez ekspresję RG1. Określenie skutecznej dawki mieści się w umiejętnościach specjalistów.

Dla dowolnego związku terapeutycznie skuteczna dawka może być wstępnie oszacowana albo w oznaczeniach komórek w hodowli np. w komórkach nowotworowych albo w modelach zwierzę cych, na ogół myszy, królików, psów lub świń. Model zwierzęcy jest też stosowany do uzyskania pożądanego zakresu stężeń i drogi podania. Taka informacja może wówczas być stosowana do określenia pożytecznych dawek i dróg podawania u ludzi.

Terapeutycznie skuteczna dawka dotyczy takiej ilości białka lub jego przeciwciał, antagonistów lub inhibitorów, które poprawiają objawy lub stan. Skuteczność terapeutyczna i toksyczność takich związków może być określona za pomocą standardowych procedur farmaceutycznych w hodowlach komórek lub zwierzętach doświadczalnych, np. ED50 (dawka skuteczna u 50% populacji) i LD50 (dawka letalna dla 50% populacji). Stosunek dawki między efektami terapeutycznymi i toksycznymi to indeks terapeutyczny i może być wyrażany jako stosunek ED50/LD50. Kompozycje farmaceutyczne, które wykazują duże indeksy farmaceutyczne są korzystne. Dane uzyskane z oznaczeń w hodowlach komórek i badań nad zwierzętami są stosowane do formułowania zakresu dawek do stosowania u ludzi. Dawki takich związków leżą korzystnie w zakresie krążących stężeń co obejmuje ED50 z niewielką toksycznością lub jej brakiem. Dawka zmienia się w tym zakresie w zależności od stosowanej formy dawki, wrażliwości pacjenta i drogi podania.

Dokładna dawka jest wybrana przez danego lekarza pod kątem pacjenta, który ma być leczony. Dawka i podawanie są dopasowywane aby dostarczyć dostateczne poziomy czynnej reszty lub aby utrzymać pożądany efekt. Dodatkowe czynniki, które mogą być brane pod uwagę obejmują ostrość objawów stanu chorobowego np. wielkość i położenie guza; wiek, waga i płeć pacjenta; dieta, czas i częstość podawania, kombinacja (kombinacje) leków, reakcje wrażliwoś ci, i tolerancja/odpowiedź na terapię. Kompozycje farmaceutyczne długo działające mogłyby być podawane co 3 do 4 dni, co tydzień lub co dwa tygodnie w zależności od okresu półtrwania i tempa kliransu danego preparatu.

Normalne ilości dawki wahają się od 0,1 do 100000 mikrogramów do całkowitej dawki około 1 g, w zależ noś ci od drogi podania. Wytyczne co do poszczególnych dawek i sposobów podawania są podane w literaturze [US 4,657,760, US 5,206,344 lub US 5,225,212]. Specjaliści zastosują inne preparaty dla polinukleotydów niż dla białek lub ich inhibitorów. Podobnie dostarczanie polinukleotydów lub polipeptydów będzie specyficzne dla danych komórek, miejsc, warunków, położenia itd.

Wynalazek jest zilustrowany w przykładach wykonania.

Wszystkie przykłady przeprowadzono stosując techniki standardowe, które są dobrze znane i rutynowe dla specjalistów z wyją tkiem tego gdzie podano szczegół owy opis. Rutynowe techniki biologii molekularnej w następujących przykładach mogą być przeprowadzone jak opisano w standardowych podręcznikach laboratoryjnych, takich jak Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989.

P r z y k ł a d 1:

Identyfikacja ludzkiego polipeptydu rg1

Rg1 zidentyfikowano jako gen wyrażany w prostacie przez przeszukanie bazy danych Incyte LiefSeq. Sekwencję nukleotydów zidentyfikowano przy przeszukaniu bazy danych z przypisami, stosując narzędzie „Protein Function dostarczone przez Incyte w celu przeszukiwania bazy danych. Sekwencja nukleotydów była znaleziona w kategorii cząsteczek adhezyjnych komórek w bazie danych z przypisami i był a opisana jako homolog f-spondyny. Elektroniczna analiza typu Northern rozmieszczenia sekwencji polinukleotydów rg1 w zestawie bibliotek i bazie danych wykazała, że rg1 był wyrażany na wyższym poziomie w bibliotekach prostaty i niższych poziomach w szeregu bibliotek innych tkanek obejmując te z tkanek normalnych i nowotworowych.

Po zmontowaniu zestawu klonów rg1 w bazie danych w ciągłą sekwencję polinukleotydów i zredagowaniu ciągłej sekwencji, zidentyfikowano sekwencję kodującą pełnej długości w przewidywanym zmontowanym polipeptydzie. Ta sekwencja kodowała białko homologiczne do F-spondyny i do Mindyny-2.

Klony Incyte 1640796, 1712252 i 1880265 uzyskano od Incyte do pracy eksperymentalnej i klon 3360733 zidentyfikowano jako niosący najwięcej sekwencji 5'. Ten klon zsekwencjonowano w całości

PL 207 634 B1 i zawierał on pełną sekwencję kodującą przewidywanego białka RG1. Ta sekwencja jest przedstawiona na Figurze 1 (SEQ ID NO:1).

P r z y k ł a d 2:

Ekspresja mRNA rg1

Ekspresja mRNA rg1 w szeregu próbek z tkanek normalnych i nowotworowych i liniach komórkowych była określona w półilościowym PCR stosując oznaczenie Taqman (Perkin-Elmer). Próbki z normalnej prostaty, guzów ł agodnych i nowotworów, poddanych skalowaniu wedł ug zmodyfikowanego systemu gradacji Gleasona uzyskano z wydziału Urologii w Stanford University School of Medicine. Z nich izolowano RNA za pomocą standardowych procedur. RNA z innych tkanek rakowych i normalnych nabyto z różnych ź ródeł na rynku, w tym od Clontech i Biochain. Linie komórek raka prostaty (PC-3, LNCaP i DU145) otrzymano z American Type Culture Collection i namnażano w hodowli sposobami standardowymi stosując podłoże zawierające surowicę. Guzy ksenoprzeszczepów pochodzące z tych linii komórkowych ustalono w nagich myszach i zebrano z myszy około 4-6 tygodni po implantacji. RNA izolowano z guzów za pomocą standardowych procedur.

Przeprowadzono analizę PCR opartą na Taqman stosując sondy: CGC GCA TAG CTC CGA CTA C (SEQ ID NO:3) i GCC GCG TCC GCA AAG (SEQ ID NO:4) i sondę Taqman: 6-FAM-AGG AAG AAC CAG TAC GTC AGT AAC GGG CTG-Tamra (SEQ ID NO:5).

Te startery i sondy zaprojektowano stosując oprogramowanie Primer Express Perkin Elmer i były syntetyzowane przez Synthetic Genetics. Reakcje PCR przeprowadzono przez 30-40 cykli i określono ilościowo stosując RNA prostaty aby wygenerować krzywą standardową dla porównania względnego. Analiza ta wykazała, że mRNA rg1 było produkowane na najwyższym poziomie w prostacie i na znacznie niższych poziomach w kilku innych tkankach (Patrz Figura 5).

P r z y k ł a d 3:

Klonowanie i ekspresja RG1 w komórkach BHK

Region kodujący RG1 uzyskano z plazmidu Incyte 3360733. Sekwencja kodująca została zamplifikowana za pomocą PCR ze starterami SST115 (5' -TCCCTCTAGAGCCACCATGGAAAACCCCAGCCCGGC3') (SEQ ID NO:6) i SST113 (5' - AAGGCATCACGTGTTAGACGCAGTTATCAGGGACG-3') (SEQ ID

NO:7) w standardowej reakcji PCR (100 μΐ) stosując 1x bufor do polimerazy Turbo (Stratagene, La Jolla, CA)/200 uM dNTP/0,2 uM startery oligonukleotydowe/2,5U polimerazy Turbo (Stratagene). Warunki amplifikacji PCR były następujące: 3 min w 95°C (15 sek w 95°C, 30 sek w 60°C, 2 minuty w 72°C)x35, 72°C przez 7 minut. Powstały namnożony produkt PCR oczyszczono stosując kolumnę QIAquick PCR (Quiagen, Valencia, CA) i strawiono enzymami restrykcyjnymi Xbal i Pmll aby dać fragment 1010 bp, który oczyszczono z 1% żelu agarozowego stosując zestaw GeneClean BIO101 (Vista, CA). Oczyszczony fragment zligowano (stosując zestaw Epicientre Fast Link Kit (Epicenter, Madison, WI) do niecytopatycznego wektora ekspresyjnego Sindbis pSINrep212 (Agapov i wsp., 1998, PNAS 95: 1298912994) strawionego Xbal i Pmll i transformowano do kompetentnych komórek DH5 alpha (Life Technologies, Gaithersburg, CA) i wybrane na płytkach LB zawierających ampicylinę (100 ug/ml). Jedną taką kolonię oporną na ampicylinę hodowano na podłożu LB z ampicyliną i wykazano za pomocą analizy sekwencji, że zawiera wstawioną sekwencję kodującą RG1. Ten plazmid nazwano pPEG6.

Dwa mikrogramy pPEG6 zastosowano do transfekcji 1-3 x 10⁵ komórek nerki noworodków chomika (BHK) stosując odczynnik Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) według instrukcji producenta. Po transfekcji komórki inkubowano w DMEM plus płodowa surowica cielęca przez 24 do 48 godzin, w którym to momencie komórki rozcieńczono 1 do 10 i rozpoczęto selekcję komórek zawierających plazmid przez dodanie DMEM zawierającego puromycynę (końcowe stężenie 2,5 ug/ml) i surowicę. Po osiągnięciu konfluencji przez komórki (4-5 dni po dodaniu puromycyny) komórki przepłukano PBS, rozcieńczono 1 do 10, i dodano podłoże DMEM z surowicą i 5 ug/ml puromycyny. Po dodatkowych 2-3 dniach podłoże zastąpiono DMEM i 5 ug/ml puromycyny bez surowicy, hodowano 2-3 dni i wykrywano obecność białka RG1 w podłożu przez analizę typu Western stosując przeciwciała RG1. Białko RG1 wykrywano na poziomie 1 ug/ml.

P r z y k ł a d 4:

Generowanie przeciwciał

Wywołano poliklonalne przeciwciała królika przeciwko pięciu syntetycznym sekwencjom polipeptydów pochodzącym z sekwencji biała RG1. Te sekwencje wybrano ze względu na ich przewidywane pozycje na powierzchni białka, aby wytworzyć antysurowice, które mają większą szansę na rozpoznawanie epitopów powierzchniowych. Reszty cysteiny zastąpiono kwasem aminomasłowym

PL 207 634 B1 (Abu) aby pomóc syntezie. Specyficzne sekwencje aminokwasów, pozycje na białku RG1 i określenia dla pięciu peptydów podano poniżej.

Określenie Pozycja Sekwencja aminokwasów

C 28-46 PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEQ ID NO:8)

2C 46-64 TFTGKWSQTAFPKQYPLFR (SEQ ID NO:9)

3C 77-91 HSSDYSMWRKNQYVS (SEQ ID NO:10)

4C 188-210 DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (SEQ ID NO:11)

5C 263-274 NEIVDSASVPET (SEQ ID NO:12)

Peptydy łączono kowalencyjnie z hemocyjaniną skałoczepu (KLH) poprzez dodatkową C-końcową cysteinę do stosowania jako immunogen. Podobnie, przygotowano koniugat bydlęcej albuminy surowiczej (BSA) dla analizy miana przeciwciał poprzez ELISA.

Dwa zwierzęta immunizowano każdym peptydem. Wstępne immunizacje przeprowadzono w cał kowitym adiuwancie Freunda (0,5 mg/zwierzę) a nastę pnie w okresach co trzy tygodnie dawki przypominające z 0,25 mg/zwierzę w niecałkowitym adiuwancie Freunda podawane domięśniowo. Pobierano okresowo krew do testów i określano miano przeciwciał przeciwko specyficznemu koniugatowi BSA-peptyd za pomocą ELISA i porównywano z surowicami preimmunizacyjnymi. Wykazano, że antysurowice przeciwko peptydom 1C i 3C są aktywne. Antysurowice przeciwko peptydowi 2C nie rozpoznawały polipeptydu RG1. Antysurowice przeciw peptydom 4C i 5C nie były badane.

Wygenerowano ludzkie monoklonalne przeciwciała przeciwko RG1 przez immunizację transgenicznych myszy peptyami RG1 i fuzyjnym białkiem RG1 znakowanym 6-histydynami wyrażanym w E. coli. Splenocyty tych zwierzą t poddano fuzji z komórkami szpiczaka aby wyprodukować komórki hybrydomy. Powstałe hybrydomy badano techniką ELISA pod kątem produkujących przeciwciała skierowane przeciwko peptydom i białku RG1.

P r z y k ł a d 5:

Analiza przeciwciał techniką Western

Antysurowice badano pod kątem specyficzności na RG1 techniką Western blot. Antysurowice specyficzne dla RG1 (wytworzone przeciwko sekwencjom 1C i 3C, powyżej) testowano na RG1 wyprodukowanym z transfekowanych komórek nerki noworodka chomika (BHK). Antysurowice specyficzne dla RG1 dalej badano na lizatach przygotowanych z: guzów LNCaP, komórek LNCaP, guzów

PC3, komórek PC3 i kilku klinicznych próbek ludzkich guzów prostaty. Komórki i tkanki lizowano w buforze detergentowym. Po gotowaniu przez 5 min, 10 μΐ każdego lizatu naładowano na 12% żel poliakryloamidowy aby rozdzielić białka. Rozdzielone białka następnie przenoszono na błony nitrocelulozowe. Specyficzność wiązania RG1 sprawdzono przez wiązanie w obecności peptydów homologicznych i heterologicznych. Surowice specyficzne dla RG1 wykrywały białko we wszystkich próbkach z wyjątkiem komórek PC-3 i guzach PC-3.

P r z y k ł a d 6:

Oczyszczanie natywnego białka RG1 wydzielanego z komórek LNCaP

Stosując technikę Western blot wykazano, że komórki LNCap rosnące w hodowli wydzielają natywne białko RG1. Aby oczyścić natywne białko komórki hodowano 48 godzin w podłożach pozbawionych surowicy. To wolne od surowicy kondycjonowane podłoże zebrano, odwirowano by usunąć komórki i zatężono około pięćdziesiąt razy przez ultrasączenie. Zatężone podłoże następnie rozcieńczono dziesięciokrotnie 20 mM buforem octan sodu, pH 6,5 i naładowano na kolumnę anionowymienną Q-Sepharose. Kolumnę eluowano stosując gradient chlorku sodu, (0,5% na minutę) i zbierano frakcje 2,0 ml. Białko RG1 eluowano przy około 75 mM NaCl jak określono za pomocą Western blot i SDS PAGE. Natywne białko RG1 migruje z nieco niższą masą cząsteczkową niż białko fuzyjne 6 histydyn-RG1 wyrażane u bakterii, prawdopodobnie ponieważ nie ma peptydu fuzyjnego.

P r z y k ł a d 7:

Immunohistochemiczne barwienie na obecność ekspresji RG1

Ekspresję białka RG1 badano w LifeSpan Biosciences, Inc., w różnych tkankach ludzkich, w tym nerkach, płucu, trzustce, mięśniach, mózgu i prostacie. Dodatkowe tkanki prostaty uzyskano od Wydziału Urologii w Stanford University School w Stanford i były badane w Berlex. Skrawki tkanek odparafinowywano stosując standardowe procedury. Poliklonalne przeciwciało RG1-3C stosowano jako pierwotne przeciwciało i system detekcji polegał na stosowaniu zestawu Vector ABC-AP (AK5002) z zestawem substratu czerwieni Vector (Sk5002). Jako kontrolę negatywną przeprowadzono barwienie w nieobecności pierwotnego przeciwciała.

PL 207 634 B1

Lista sekwencji <110> Harkrns, Richard Parkes, Deborah Parry, Gordon Schneider, Douglas Ste mbrecher, Renate <12O> DNA kodujący nowy polipeptyd RG-1 <13O> 51791AUSM1 <140>

<14 1>

<150> 60/172,370 <151> 1999-12-16 <160> 12 <l70> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <21l> 1785 <212> DNA <213> Homo sapiens <22O>

<221> CDS <222> (296) . . ( 1291 ) <400> 1

agaaaggggt	gcggcagcac	tgccagggga	agagggtgat	ccgacccggg	gaaggtcgct	60
gggcagggcg	agttgggaaa	gcggcagccc	ccgccgcccc	cgcagcccct	tctcctcct t	120
tctcccacgt	cctatctgcc	tctcgctgga	ggccaggccg	tgcagcatcg	aagacaggag	180
gaactggagc	ctcattggcc	ggcccggggc	gccggcctcg	ggcttaaata	ggagctccgg	240
gctctggctg	ggacccgacc	gctgccggcc	gcgctcccgc	tgctcctgcc	gggtg atg	298

Met

gaa Glu

aac Asn

ccc Pro

agc Ser 5

ccg Pro

gcc Ala

gcc Ala

gcc Ala

ctg Leu 10

ggc Gly

aag Lys

gcc Ala

ctc Leu

tgc Cys 15

gct Ala

ctc Leu

346

ccc

Ctg

gcc

act

ctc

ggc

gcc

gcc

ggc

cag

cct

ctt

ggg

gga

gag

tcc

394

Leu

Leu

Ala 20

Thr

Leu

Gly

Ala

Ala 25

Gly

Gin

Pro

Leu

Gly 30

Gly

Glu

Ser

atc

tgt

tcc

gcc

gga

gcc

ccg

gcc

aaa

tac

agc

atc

acc

t tc

acg

ggc

442

Ile

Cys 35

Ser

Ala

G ly

Ala

Pro 40

Ala

Lys

Tyr

Ser

Ile 45

Thr

Phe

Thr

Gly

PL 207 634 B1

aag Lys 50

tgg Trp

agc Ser

cag Gin

acg Thr

gee Ala 55

t tc Phe

ccc Pro

aag Lys

cag Gin

tac Tyr 60

ccc Pro

ctg Leu

ttc Phe

ege Arg

ccc Pro 65

490

ccc

gcg

cag

tgg

t ct

teg

ctg

ctg

ggg

gee

gcg

ca t

agc

tcc

gac

tac

538

Pro

Ala

Gin

Trp

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Ala

Ala

His

Se r

Ser

Asp

Tyr

70

75

80

agc

a tg

tgg

agg

aag

aac

cag

tac

gtc

agt

aac

ggg

ctg

ege

gac

ttt

586

Ser

Met

Trp

Arg

Lys

Asn

Gin

Tyr

Val

Ser

Asn

Gly

Leu

Arg

Asp

Phe

85

90

95

gcg

gag

ege

ggc

gag

gee

tgg

gcg

ctg

a tg

aag

gag

atc

gag

gcg

gcg

634

Ala

Glu

Arg

Gly

Glu

Ala

Trp

Ala

Leu

Met

Lys

Glu

Ile

Glu

Ala

Ala

100

105

110

ggg

gag

gcg

ctg

cag

agc

gtg

cac

gcg

gtg

ttt

teg

gcg

ccc

gee

gtc

682

Gly

Glu

Ala

Leu

Gin

Ser

Val

His

Ala

Val

Phe

Se r

Ala

Pro

Ala

Val

115

120

125

ccc

agc

ggc

acc

ggg

cag

acg

teg

gcg

gag

ctg

gag

gtg

cag

ege

agg

730

Pro

Ser

Gly

Thr

Gly

Gin

Thr

Ser

Ala

Glu

Leu

Glu

Val

Gin

Arg

Arg

130

135

140

145

cac

teg

ctg

gtc

teg

ttt

gtg

gtg

ege

a tc

gtg

ccc

agc

ccc

gac

tgg

778

His

Ser

Leu

Val

Ser

Phe

Val

Val

Arg

Ile

Val

Pro

Ser

Pro

Asp

Trp

150

155

160

t te

gtg

ggc

gtg

gac

agc

ctg

gac

ctg

tgc

gac

ggg

gac

cgt

tgg

cgg

826

Phe

Val

Gly

Val

Asp

Ser

Leu

Asp

Leu

Cys

Asp

Gly

Asp

Arg

Trp

Arg

165

170

175

gaa

cag

gcg

gcg

ctg

gac

ctg

tac

ccc

tac

gac

gee

ggg

acg

gac

agc

874

Glu

Gin

Ala

Ala

Leu

Asp

Leu

Tyr

Pro

Tyr

Asp

Ala

Gly

Thr

Asp

Ser

180

185

190

ggc

t tc

acc

t tc

tcc

tcc

ccc

aac

ttc

gee

acc

atc

ccg

cag

gac

acg

922

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Pro

Asn

Phe

Ala

Thr

Ile

Pro

Gin

Asp

Thr

195

200

205

gtg

acc

gag

ata

acg

tcc

tcc

tet

ccc

agc

cac

ccg

gee

aac

tcc

ttc

970

Val

Thr

Glu

Ile

Thr

Ser

Ser

Ser

Pro

Ser

His

Pro

Ala

Asn

Ser

Phe

210

215

220

225

tac

tac

cca

cgg

ctg

aag

gee

ctg

cct

ccc

atc

gee

agg

gtg

aca

ctg

1018

Tyr

Tyr

Pro

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Pro

Pro

Ile

Ala

Arg

Val

Thr

Leu

230

235

240

gtg

cgg

ctg

ega

cag

agc

ccc

agg

gee

ttc

atc

cct

ccc

gee

cca

gtc

1066

Val

Arg

Leu

Arg

Gin

Ser

Pro

Arg

Ala

Phe

Ile

Pro

Pro

Ala

Pro

Val

245

250

255

ct g

ccc

agc

agg

gac

aat

gag

at t

g ta

gac

agc

gee

tea

gtt

cca

gaa

1114

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Asn

Glu

Ile

Val

Asp

Ser

Ala

Ser

Val

Pro

Glu

260

265

270

PL 207 634 B1

acg

ccg

ctg

gac

tgc

gag

gt c

tcc

ctg

tgg

t cg

tcc

tgg

gga

ctg

tgc

1

1

62

Thr

Pro

Leo

Asp

Cys

Glu

Val

Se r

Leu

Trp

Ser

Se r

Trp

Gly

Leu

Cys

275

280

285

gga

ggc

cac

tgt

agg

ct c

ggg

acc

aag

agc

agg

act

cgc

tac

gtc

1

2

10

Gly

Gly

His

Cys

Gly

Arg

Leu

Gly

Thr

Lys

Ser

Arg

Thr

Arg

Tyr

Val

290

295

300

305

cgg

gtc

cag

ccc

gcc

aac

aac

ggg

agc

ccc

tgc

ccc

gag

ct c

gaa

gaa

1

2

58

Arg

Val

Gin

Pro

Ala

Asn

Asn

Gly

Se r

Pro

Cys

Pro

Glu

Leu

Glu

Glu

310

315

320

gag

gct

gag

t gc

gt c

cct

ga t

aac

tgc

gtc

taa

gaccagagcc <

ccgca gcccc

1

3

11

Glu

Ala

Glu

Cys

Val

Pro

Asp

Asn

Cys

Val

325

330

tggggccccc	cggagccatg	gggtgtcggg	ggctcctgtg	caggctcatg	ctgcaggcgg	1371
ccgagggcac	agggggt t tc	gcgctgctcc	tgaccgcggt	gaggccgcgc	cgaccatctc	1431
tgcactgaag	ggccctctgg	tggccggcac	gggcattggg	aaacagcctc	ctcct ttccc	1491
aacct tgct t	ct taggggcc	cccgtgtccc	gtctgctctc	agcctcctcc	tcctgcagga	1551
taaagtcatc	cccaaggct c	cagctactct	aaattatgtc	tcct tataag	ttat tgętgc	1611
tccaggagat	tgtcct tcat	cgtccagggg	cctggctccc	acgtggttgc	agatacctca	1671
gacctggtgc	tctaggctgt	gctgagccca	ctctcccgag	ggcgca tcca	agcgggggcc	1731
acttgagaag	tgaataaatg	gggcggtttc	ggaagcgtca	aaaaaaaaaa	aaaa	1785

<210> 2 <211> 331 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met 1

Glu

Asn

Pro

Ser 5

Pro

Ala

Ala

Ala

Leu 10

Gly

Lys

Ala

Leu

Cys 15

Ala

Leu

Leu

Leu

Ala 20

Thr

Leu

Gly

Ala

Ala 25

Gly

Gin

Pro

Leu

Gly 30

Gly

Glu

Ser

Ile

Cys 35

Ser

Ala

Gly

Ala

Pro 40

Ala

Lys

Tyr

Se r

Ile 45

Thr

Phe

Thr

Gly

Lys 50

Trp

Se r

Gin

Thr

Ala 55

Phe

Pro

Lys

Gin

Tyr 60

Pro

Leu

Phe

Arg

Pro 65

Pro

Ala

Gin

Trp

Ser 70

Ser

Leu

Leu

Gly

Ala 75

Ala

His

Ser

Ser

Asp 80

Tyr

Ser

Met

Trp

Arg

Lys

Asn

Gin

Tyr

Val

Ser

Asn

Gly

Leu

Arg

Asp

90 95

PL 207 634 B1

Phe

Ala

Glu

Arg 100

Gly

Glu

Ala

Trp

Ala 105

Leu

Me t

Lys

Glu

Ile 110

Glu

Ala

Ala

Gly

Glu

Ala

Leu

Gin

Se r

Val

His

Ala

Val

Phe

Ser

Ala

Pro

Ala

115

120

125

Val

Pro

Se r

Gly

Thr

Gly

Gin

Thr

Ser

Ala

Glu

Leu

Glu

Val

Gin

Arg

130

135

140

Arg

His

Ser

Leu

Val

Ser

Phe

Val

Val

Arg

Ile

Val

Pro

Ser

Pro

Asp

145

150

155

160

Trp

Phe

Val

Gly

Val

Asp

Ser

Leu

Asp

Leu

Cys

Asp

Gly

Asp

Arg

Trp

165

170

175

Arg

Glu

Gin

Ala

Ala

Leu

Asp

Leu

Tyr

Pro

Tyr

Asp

Ala

Gly

Thr

Asp

180

185

190

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Pro

Asn

Phe

Ala

Thr

Ile

Pro

Gin

Asp

195

200

205

Thr

Val

Thr

Glu

Ile

Thr

Ser

Se r

Ser

Pro

Ser

His

Pro

Ala

Asn

Ser

210

215

220

Phe

Tyr

Tyr

Pro

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Pro

Pro

Ile

Ala

Arg

Val

Thr

225

230

235

240

Leu

Val

Arg

Leu

Arg

Gin

Ser

Pro

Arg

Ala

Phe

Ile

Pro

Pro

Ala

Pro

245

250

255

Val

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Asn

Glu

Ile

Val

Asp

Ser

Ala

Ser

Val

Pro

260

265

270

Glu

Thr

Pro

Leu

Asp

Cys

Glu

Val

Ser

Leu

Trp

Ser

Ser

Trp

Gly

Leu

275

280

285

Cys

Gly

Gly

His

Cys

Gly

Arg

Leu

Gly

Thr

Lys

Ser

Arg

Thr

Arg

Tyr

290

295

300

Val

Arg

Val

Gin

Pro

Ala

Asn

Asn

Gly

Ser

Pro

Cys

Pro

Glu

Leu

Glu

305

310

315

32 0

Glu

Glu

Ala

Glu

Cys

Val

Pro

Asp

Asn

Cys

Val

325

330

<210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220> . .

<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter <400> 3 cgcgcatagc tccgactac

PL 207 634 B1 <2iO> 4 <21ί> 15 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220> ..

<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter <400> 4 gccgcgcccg caaag <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: sonda <400> 5 aggaagaacc agtacgtcag taacgggctg <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter <400> 6

Lccctctaga gccaccatgg aaaaccccag cccggc 36 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <2i3> sekwencja syntetyczna <220> ..

<223> Opis sekwencji syntetycznej: starter <400> 7 aaggcatcac gtgttagacg cagttatcag ggacg <210> 8 <21l> 19 <212> PRT <213> sekwencja syntetyczna

PL 207 634 B1 <220> , <223> Opis sekwencji syntetycznej: peptyd <400> 8

Pro Leu Gly Gly Glu Ser Ile Cys Ser Ala Gly Ala Pro Ala Lys Tyr 1 5 10 15

Ser Ile Thr <21O> 9 <211> 19 <212> PRT <213> sekwencja syntetyczna <22O> _ .

<2 2 3> Opis sekwencji syntetycznej: peptyd2 <400> 9

Thr Phe Thr Gly Lys Trp Ser Gin Thr Ala Phe Pro Lys Gin Tyr Pro 15 10 15

Leu Phe Arg <210> 10 <21l> 15 <212> PRT <2i3> sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: peptyd <400> 10

His Ser Ser Asp Tyr Ser Met Trp Arg Lys Asn Gin Tyr Val Ser 15 10 15 <210> 11 <211> 23 <212> PRT < 213 > sekwencj a syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: peptyd <400> 11

Asp 1	Ala	Gly	Thr	Asp 5	Ser	Gly Phe Thr	Phe Ser Ser Pro Asn 10	Phe Ala 15
Thr	He	Pro	Gly 20	Asp	Thr	Val

PL 207 634 B1 < 2 10 > <21l> < 2 12 > <2 1 3>

<22O>

<223>

PRT sekwencja syntetyczna

Opis sekwencji syntetycznej: peptyd <4ΟΟ> 12

Asn Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Val Pro Glu Thr

Claims (11)

1. Wyizolowane przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiąże się z fragmentem polipeptydu o sekwencji aminokwasowej, która jest zupełnie taka jak część ale nie cała sekwencja aminokwasowa polipeptydu RG1, przedstawiona na Fig. 2 (SEQ ID NO:2), znamienne tym, że wyizolowane przeciwciało lub fragment przeciwciała specyficznie wiąże się z polipeptydem zawierającym aminokwas 28 do aminokwasu 46, jak przedstawia Fig. 2 (SEQ ID NO:2).

2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że specyficznie wiąże się z peptydem o sekwencji aminokwasowej PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEQ ID NO:8).

3. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem poliklonalnym.

4. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym.

5. Przeciwciało określone w jednym z zastrz. 1-4, stosowane do wytwarzania leku.

6. Immunokoniugat obejmujący wyizolowane przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiąże się z fragmentem polipeptydu o sekwencji aminokwasowej, która jest zupełnie taka jak część ale nie cała sekwencja aminokwasowa polipeptydu RG1, przedstawiona na Fig. 2 (SEQ ID NO:2), znamienny tym, że wyizolowane przeciwciało lub fragment przeciwciała specyficznie wiążące się z polipeptydem zawierającym aminokwas 28 do aminokwasu 46, jak przedstawia Fig. 2 (SEQ ID NO:2), jest skoniugowane z czynnikiem terapeutycznym.

7. Immunokoniugat według zastrz. 6, znamienny tym, że czynnik terapeutyczny jest czynnikiem cytotoksycznym.

8. Immunokoniugat według zastrz. 7, znamienny tym, że czynnik cytotoksyczny jest wybrany z grupy złożonej z rycyny, doksorubicyny, daunorubicyny, taksolu, bromku etydyny, mitomycyny, etopozydu, tenopozydu, winkrystyny, winblastyny, kolchicyny, dionu dihydrosyantracyny, aktynomycyny D, toksyny dyfterytu, egzotoksyny z Pseudomonas (PE)A, PE40, rycyny, abryny, glukokortykoidu i radioizotopów.

9. Immunokoniugat według zastrz. 6, znamienny tym, że fragmenty przeciwciał są wybrane z grupy złożonej z fragmentów Fv, F(ab') i F(ab')2.

10. Immunokoniugat określony w jednym z zastrz. 6-9, stosowany do wytwarzania leku.

11. Zastosowanie immunokoniugatu zawierającego czynnik terapeutyczny i wyizolowane przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiąże się z fragmentem polipeptydu o sekwencji aminokwasowej, która jest zupełnie taka jak część ale nie cała sekwencja aminokwasowa polipeptydu RG1 przedstawiona na Fig. 2 (SEQ ID NO:2), znamienne tym, że wyizolowane przeciwciało lub fragment przeciwciała specyficznie wiąże się z aminokwasem od 28 do 46, jak przedstawia Fig. 2 (SEQ ID NO:2), do wytwarzania leku do leczenia raka prostaty.